WO2009133642A1 - 抗腫瘍作用の評価方法、およびこれを用いた抗腫瘍物質のスクリーニング方法 - Google Patents

抗腫瘍作用の評価方法、およびこれを用いた抗腫瘍物質のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2009133642A1
WO2009133642A1 PCT/JP2008/070315 JP2008070315W WO2009133642A1 WO 2009133642 A1 WO2009133642 A1 WO 2009133642A1 JP 2008070315 W JP2008070315 W JP 2008070315W WO 2009133642 A1 WO2009133642 A1 WO 2009133642A1
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activity
antitumor
sympathetic nerve
tumor
substance
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PCT/JP2008/070315
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克也 永井
ジアオ シェン
裕子 堀井
芳幸 藤崎
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株式会社Anbas
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the antitumor action of a test substance.
  • the present invention also relates to a method (screening method) for searching for and obtaining a substance that can be an active ingredient of an antitumor agent using the method.
  • this invention relates to the antitumor agent which uses the substance acquired by the said method as an active ingredient.
  • Cancer is one of the diseases with high morbidity and mortality. Recently, advances in medicine have resulted in an overall decrease in cancer mortality from early detection, but there are no universally effective cancer prevention and treatment methods. Also, due to various recent reasons (increased elderly, environmental pollution, etc.), the number of cancer cases is expected to increase further.
  • cancer treatment is performed by combining one or more aggressive treatments (including surgery, chemotherapy, radiation therapy, or hormone therapy) in addition to early detection.
  • aggressive treatments including surgery, chemotherapy, radiation therapy, or hormone therapy
  • many of these aggressive treatments are invasive and systemic toxicity is unavoidable, so the patient's physical and mental burden is significant, and side effects greatly impair the patient's quality of life. It will be.
  • Some cancer cells or tumor cells are inherently resistant to cytotoxic drugs used in cancer treatment, while others respond initially but remain resistant during treatment.
  • radiotherapy is relatively ineffective at eradicating cancer cells within a solid tumor mass. This is because oxygen-derived free radicals are necessary for cell destruction by radiotherapy (Non-Patent Document 1), but the oxygen level in the tumor mass is low due to the lack of blood supply. Because it is general. It is also known that many chemotherapeutic drugs require oxygen to exert their effectiveness (Non-patent Document 2).
  • cancer The cause of cancer is still unknown. However, it is generally thought that carcinogenesis or carcinogenesis involves a complex process involving multiple genetic and environmental factors. Given the complex interaction of multiple carcinogenic factors, cancer can develop in a specific and universal way to induce cancer cell death or to block tumor growth (cancer cell proliferation). Developing a method is considered a very difficult task.
  • Non-Patent Documents 3 and 4 Recently, methods for enhancing the immune function of a living body through activation of natural killer cells have been proposed for cancer treatment and prevention. It is considered that activating natural killer cells to enhance the immune function of the living body can universally combat cancer regardless of the type of cancer. Gray et al., Brit. J. Radiol. 26: 6: 683 (1953) Giatromanolaki and Harris., Anticancer Res. 21: 4317 (2001) Andre and Anfossi, Methods Mol. Biol. 415: 291-300 (2008) Malmberg et al. Cancer Immunol. Immunother. 2008 Mar 4 [Epubaheat of print] Zea at al. Cancer Res. 65: 3044-3048 (2005)
  • An object of the present invention is to provide a method for evaluating the antitumor action of a test substance. It is another object of the present invention to provide a method for searching for and obtaining a substance that can be an active ingredient of an antitumor agent by using such an evaluation method, that is, a method for screening a new antitumor agent.
  • an object of the present invention is to provide an antitumor agent comprising as an active ingredient a substance having an antitumor action obtained by using the screening method.
  • the present inventors orally administer a mixture of arginine and other amino acids to a test animal transplanted with tumor cells, and determine the size of the tumor (proliferation rate of tumor cells). At the same time, we measured changes in the electrical activity of the centrifugal branch of the sympathetic nerve (splenic sympathetic nerve) that controls the spleen.
  • the present inventor can evaluate the antitumor action of a test substance by using a decrease in splenic sympathetic nerve activity as an index, that is, by using such an evaluation system, It was confirmed that a substance useful as an active ingredient of a tumor agent, or a substance useful as an active ingredient of food or pet food having antitumor activity can be easily searched and found, and the present invention has been completed.
  • the present invention has the following aspects.
  • Method for evaluating the antitumor action of a test substance (I-1) A method for evaluating the antitumor action of a test substance, comprising the following steps: (1) A step of administering a test substance to a non-human animal and measuring splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal.
  • (I-2) The method for evaluating antitumor activity according to (I-1), further comprising the following steps: (2) When the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal administered with the test substance is lower than the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal not administered with the test substance, the test substance has an antitumor effect. The process of judging.
  • (I-3) The method for evaluating antitumor activity according to (I-1) or (I-2), wherein the measurement of splenic sympathetic nerve activity is performed by measuring the electrical activity of the distal branch of the splenic sympathetic nerve.
  • the “method for evaluating the antitumor effect of a test substance” of the present invention can be rephrased as “a method for measuring the antitumor action of a test substance”.
  • Screening method for substance having antitumor action (antitumor substance) (II-1) A method for screening substance having antitumor action from test substances, comprising the following steps: (1) A step of administering a test substance to a non-human animal and measuring the activity of the spleen sympathetic nerve of the non-human animal, and (2) The activity of the splenic sympathetic nerve obtained above is compared with the activity (control) of the spleen sympathetic nerve of a non-human animal not administered with the test substance, and the test substance whose activity is lower than the control is treated with an antitumor A step of selecting as a candidate substance having an action.
  • test substance selected as a candidate substance having an antitumor action in step (2) as an active ingredient of a food, animal feed, or fragrance having an antitumor action, (II-1 ) Or (II-2).
  • Antitumor agent (III-1) A mixture of arginine and lysine, or myrcene, which was evaluated to have antitumor activity by the evaluation method described in any of (I-1) to (I-3) above An antitumor agent containing as an active ingredient.
  • (III-2) The antitumor agent described in (III-1), which is used for treating tumors of human or non-human animals, particularly malignant tumors (cancer).
  • Anti-tumor method An antitumor method in which the antitumor agent described in (III-1) or (III-2) is applied to a human or animal having a tumor.
  • V-1 A mixture of arginine and lysine evaluated as having antitumor activity by the method described in any of (I-1) to (I-3), or myrcene antitumor agent Use as.
  • V-2 For the production of an antitumor agent of arginine and lysine, or myrcene, which is evaluated to have antitumor activity by the method described in any of (I-1) to (I-3) Use of.
  • the presence or absence of the antitumor action of the test substance can be easily determined by administering the test substance and observing the presence or absence of a decrease in the electrical activity of the sympathetic nerve that governs the spleen. it can. That is, according to the present invention, the antitumor action of a test substance can be easily evaluated.
  • the evaluation method of the present invention is useful as a method for evaluating the antitumor action of a conventionally known antitumor agent, particularly an antitumor action based on an immunopotentiating action, and no antitumor action has been known so far.
  • a method for finding a new anti-tumor effect for a new substance including edible substances and fragrance components
  • a method for searching for and acquiring a substance having an anti-tumor action from many substances and It can be effectively used as a method for identifying an active ingredient having an antitumor action from a composition comprising a plurality of ingredients.
  • Newly obtained antitumor substances obtained by such methods include antitumor agents (including human drugs and veterinary drugs), foods, animal feeds, or aromatherapy that have antitumor effects. It can be used effectively as an active ingredient of a fragrance or a fragrance used in the present invention.
  • the method for evaluating antitumor action of the present invention comprises administering a test substance to be evaluated to a non-human animal and measuring the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal. Can be implemented.
  • the non-human animal used for the measurement is not particularly limited as long as it is a non-human mammal or a constant temperature animal such as a bird, and examples thereof include rats, mice, guinea pigs, rabbits, monkeys, dogs and cats.
  • Examples of the administration method of the test substance include transdermal administration, oral administration, enteral administration, intravenous administration and nasal administration.
  • Such an administration method can be appropriately selected depending on the purpose of use and the form of use of the test substance.
  • the test substance is a composition for external use (including topical medicine) or its components or is used for the purpose
  • the antitumor action is evaluated by transdermally administering the test substance to a non-human animal. It is preferable.
  • the test substance is an enteral preparation (including those that pass through the intestine, such as oral administration and suppositories) or its components, or if it is used for that purpose, the test substance should be administered to a non-human animal.
  • test substance is an intravenously administered agent (including injections and infusions) or its components, or when it is used for that purpose, the test substance is administered intravenously to a non-human animal, thereby providing an antitumor effect. Is preferably evaluated.
  • test substance is a nasal preparation or a component thereof, or is to be used nasally, such as a fragrance, the test substance is administered to a non-human animal via nasal administration. It is preferable to evaluate the antitumor effect by ingesting the nose.
  • test substance when the test substance is an oral composition (including food, oral medicine, animal feed) or its components, or when it is used for its use, the test substance is administered orally to a non-human animal, It is preferable to evaluate the tumor action. In this case, after the test substance is orally administered, it takes some time until it is absorbed in the body or exerts its effect in the intestine and reflected in the activity of the splenic sympathetic nerve. For this reason, first, the test substance is enterally administered to a non-human animal (enteral small intestine), the antitumor action is evaluated in advance (primary evaluation), and then the test substance whose antitumor action has been confirmed in the primary evaluation is obtained. It can also be administered orally to non-human animals to evaluate the antitumor effect by oral administration (secondary evaluation).
  • Examples of the method of transdermal administration to non-human animals include a method of applying a test substance to the skin of a non-human animal, a method of attaching a sheet impregnated with or carrying a test substance, and the like. Can be appropriately set according to the preparation form (for example, lotion, aerosol, foam, emulsion, cream, ointment, gel, patch, etc.).
  • the site of the non-human animal to be administered transdermally is not limited, but is preferably an area where there is little influence of body hair, specifically a skin area where there is no hair or little hair (eg, abdomen, inside of thigh, tail, etc.) It is.
  • the influence of body hair can be avoided by shaving the test area, the above-mentioned part is not particularly restricted. Moreover, in order to avoid the influence of body hair, an animal having no hair (for example, a hairless mouse, a hairless rat, etc.) can also be used.
  • an animal having no hair for example, a hairless mouse, a hairless rat, etc.
  • a method for intravenous administration to a non-human animal a method of administering a test substance into the vein of a non-human animal using injection or infusion can be used.
  • a test substance is forcibly administered from the nose of the non-human animal using a spray or an inhaler, or in the air of a breeding room
  • a method of spraying a test substance and ingesting the test substance from the nose with breathing can be used.
  • non-human animals are laparotomized under anesthesia, a test substance is administered by placing a cannula in the intestine, or a test substance is administered into the rectum via the anus
  • a method can be mentioned.
  • a method for oral administration to non-human animals a method of forcibly ingesting the test substance by installing a cannula in the oral cavity, or mixing the test animal with food or water and feeding the non-human animal with food or water Can be mentioned.
  • the activity of the sympathetic nerve (spleen sympathetic nerve) that controls the spleen is measured for the non-human animal administered the test substance.
  • the nerve activity can be measured by measuring the electrical activity of the distal branch of the splenic sympathetic nerve.
  • Measurement of electrical activity of splenic sympathetic nerves is specifically performed under anesthesia by detaching a centrifugal branch of splenic sympathetic nerves of a non-human animal under a stereomicroscope and placing it on a silver electrode. This can be done by recording the potential.
  • the silver electrode is preferably sufficiently immersed in a mixture of liquid paraffin and petrolatum in advance.
  • the obtained nerve electrical activity is amplified by a differential amplifier and monitored by an oscilloscope.
  • the noise signal is separated by a window discriminator.
  • the signal is subjected to spike conversion, and the obtained spike is counted as the number of spikes for 5 seconds by a late meter. This is A / D (analog / digital) converted and then recorded on a personal computer (see FIG. 1).
  • the electrical activity of the distal branch of the splenic sympathetic nerve can be measured as the number of spikes. That is, when the number of spikes measured before administration of the test substance is decreased by administration of the test substance, it can be determined that the electrical activity of the splenic sympathetic nerve has been reduced by administration of the test substance.
  • Such a decrease in the electrical activity of the splenic sympathetic nerve correlates accurately with a decrease in the growth rate of the tumor, that is, the antitumor effect, as shown in the experimental examples. For this reason, when the number of spikes measured before administration of the test substance is decreased by administration of the test substance, it can be determined that the electrical activity of the splenic sympathetic nerve has been reduced by administration of the test substance. It can be evaluated that the test substance has an antitumor effect. On the other hand, when the number of spikes measured before administration of the test substance does not vary or increases due to the administration of the test substance, it can be determined that the electrical activity of the splenic sympathetic nerve does not vary or has increased due to the administration of the test substance. In this case, the test substance can be evaluated as having no antitumor action.
  • the antitumor action evaluation method of the present invention can be carried out by performing the following step (1):
  • the method for evaluating an antitumor action of the present invention can be carried out by performing the following step (2) following the above step (1): (2) In the above step (1), the splenic sympathetic nerve activity of the non-human animal administered with the test substance is more than the splenic sympathetic nerve activity (control) of the non-human animal (control non-human animal) not administered with the test substance. A step of determining that the test substance has an antitumor action when the test substance also decreases.
  • the non-human animal used as a control in step (2) may be the same animal as the non-human animal administered the test substance in step (1) or may be a different animal.
  • the activity of the splenic sympathetic nerve measured for the non-human animal before administration of the test substance is used for comparison, and the activity of the splenic sympathetic nerve measured there is used as the control described above.
  • the animal when an animal different from the non-human animal administered with the test substance is used as the control non-human animal, the animal is preferably the same animal as the non-human animal administered with the test substance.
  • the antitumor effect of transdermal administration, intravenous administration, nasal administration, oral administration or enteral administration can be evaluated for the test substance.
  • the test substance to be evaluated for anti-tumor effect can be arbitrarily selected by the measurer.
  • anti-tumor substances and compositions already known for anti-tumor action including pharmaceuticals, foods and fragrances
  • a substance or composition including pharmaceuticals, foods and fragrances
  • the antitumor effect can be reconfirmed by the evaluation method of the present invention, or it can be evaluated that the effect is caused by the activation of natural killer cells (NK cells), and the antitumor effect thereof.
  • NK cells natural killer cells
  • NK cells do not have specificity, it is considered that any tumor can be combated if NK activity is increased. In the latter case, a new antitumor effect can be found for substances and compositions that have not been known to have an antitumor effect until now by the evaluation method of the present invention.
  • the present invention also provides a method for screening a substance having an antitumor action (antitumor substance).
  • the method can be performed by selecting a substance having an action of reducing the activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal when administered to the non-human animal from many test substances.
  • screening for an antitumor substance can be carried out by performing the following step (1) (i) according to the method for evaluating the antitumor action of the test substance described above.
  • the screening method of the present invention can be carried out by performing the following step (2) following the above step (1): (2) The activity of the splenic sympathetic nerve of the non-human animal administered with the test substance obtained in the above step (1) is compared with the activity (control) of the spleen sympathetic nerve of the non-human animal not administered with the test substance, A step of selecting a test substance whose activity is lower than that of a control as a candidate substance having an antitumor effect.
  • the animal employed in the above-described evaluation method of the present invention can be used in the same manner.
  • the method for measuring the activity of the splenic sympathetic nerve can be performed by measuring the electrical activity of the centrifugal branch of the splenic sympathetic nerve, as in the method employed in the evaluation method of the present invention described above.
  • test substance that is confirmed to have reduced splenic sympathetic nerve activity when administered to a non-human animal can be determined and acquired as a candidate substance (antitumor substance) having antitumor activity. it can.
  • examples of the administration method to non-human animals include transdermal administration, intravenous administration, nasal administration, oral administration and enteral administration, as in the evaluation method of the present invention described above.
  • a test substance that exhibits an antitumor action by skin administration including application and patching
  • enteral administration including small intestine administration and rectal administration
  • test substance that exerts an antitumor action when taken orally it is preferable to administer the test substance orally.
  • a test substance that exerts an antitumor effect by oral first, a test substance that exhibits an antitumor effect by enteral administration is selected in advance by first screening using enteral administration, Subsequently, a secondary screening using oral administration may be performed on the test substance selected here, and a test substance that exhibits an antitumor action by oral administration may be selected.
  • the antitumor substance selected by the screening method of the present invention may be further used for efficacy tests, safety tests, and tests for humans using pathological model animals transplanted with tumor cells. By carrying out these tests, more practical antitumor substances can be selected and obtained.
  • the substances selected in this way are subjected to structural analysis as necessary, and then, depending on the type of the substance, chemical synthesis, biological synthesis (including fermentation), or genetic manipulation, It can be manufactured industrially and can be used as an active ingredient of an antitumor agent, an external composition having an antitumor effect, an oral composition (including food and animal feed), or a fragrance or a fragrance.
  • the present invention also provides an antitumor agent comprising, as an active ingredient, an antitumor substance that is judged to have an antitumor action by the evaluation method of the present invention.
  • the anti-tumor agent includes not only an anti-tumor agent as a human drug but also an anti-tumor agent as a drug for animals (for example, pets such as dogs and cats).
  • Examples of such an antitumor substance include a mixture of arginine and lysine as shown in Experimental Examples 1 and 2. It has been confirmed that the mixture exhibits a decrease in splenic sympathetic nerve activity and a decrease in tumor growth rate (antitumor effect) when administered to a non-human animal at a ratio of 50 mM (preferably orally). ing.
  • the mixture of arginine and lysine can be effectively used as an active ingredient for antitumor, particularly as an antitumor active ingredient that exhibits an antitumor effect by oral administration or enteral administration.
  • a mixture of arginine and lysine can be used as an active ingredient of an antitumor agent having an antitumor effect / efficacy, a food or animal feed, particularly an antitumor agent for oral or enteral administration. That is, according to the present invention, an antitumor agent having an oral or enteral administration form having a mixture of arginine and lysine as an active ingredient and having antitumor efficacy / effect can be provided.
  • the blending amount of arginine and lysine contained in the antitumor agent is not particularly limited as long as the antitumor agent has an antitumor effect, and can be appropriately selected from the range of usually 1 to 100% by weight. Preferably, 50 to 100% by weight can be mentioned.
  • the form of the antitumor agent is not particularly limited as long as it is an oral or enteral administration form. For example, a drink form (drink form), a gel or syrup form, a tablet form, a pill form, a capsule form, a powder or a granular form.
  • enteral dosage forms having general suppository forms such as creams, solids, or capsules.
  • the dose of the mixture of arginine and lysine is not limited, but is preferably 25 mmole or more per dose from the results of experimental examples described later.
  • myrcene can be mentioned as shown in Experimental Examples 3 to 4. It has been confirmed that when the myrcene is ingested nasally by a non-human animal, the splenic sympathetic nerve activity is reduced and the growth rate of the tumor is reduced (antitumor effect).
  • myrcene, especially ⁇ -myrcene (7-methyl-3-methyleneocta-1,6-diene) is contained in plants such as Laurier, Verbena, Caraway, Fennel, Tarragon, Inond, Scarlet Artemisia, Prunus japonica Natural monoterpene hydrocarbon.
  • myrcene can be effectively used as an antitumor active ingredient, particularly as an antitumor active ingredient that exerts an antitumor action when administered nasally or taken nasally. Therefore, myrcene is an antitumor agent that has antitumor effects / efficacy, especially anti-tumor agents for nasal administration, or fragrances that have antitumor effects / efficacy (including aromatherapy agents used for aromatherapy). It can be used as an active ingredient. That is, according to the present invention, it is possible to provide an antitumor agent, a fragrance, and a fragrance that have a nasal administration form that uses myrcene as an active ingredient and has an antitumor effect.
  • the amount of myrcene contained in the antitumor agent and the like is not particularly limited as long as the antitumor agent has an antitumor effect, and can be appropriately selected from the range of usually 1 to 100% by weight.
  • the form of the antitumor agent is not particularly limited as long as it is a nasal administration form. For example, a drop, a spray (a liquid sprayed using a sprayer, an aerosol, etc.), a cleaning agent, an injection, etc. Can do. From the viewpoint of ease of handling, it is preferable to use a push-type container that has a function of releasing a fixed amount of an active ingredient with a single push.
  • the dose of myrcene is not limited, but from the results of experimental examples described later, it should be an amount that evaporates from a 100-fold to 10,000-fold myrcene water dilution suspension at room temperature of 25 ° C and humidity of 60%. Is preferred.
  • the antitumor agent is used by applying once or a plurality of times a day to a human or animal having a tumor, particularly a malignant tumor, for the purpose of antitumor, according to the above form.
  • test sample administration group 2 mM administration group, 10 mM administration group, 50 mM administration group.
  • size of the tumor three times a week is the maximum diameter (the length of the longest part of the tumor, L) and the width of the tumor (W) on the line perpendicular to it is mm. Measured in units and the tumor volume was determined according to the following formula (Gonzalez et al. J. Biol. Chem. 281: 20851-20864 (2006)).
  • mice of all groups (2 mM test sample administration group, 10 mM test sample administration group, 50 mM test sample administration group, water administration control group: 4 mice each), the appearance of the tumor was photographed after the experiment was completed, and then the tumor Was taken out and its weight (g) was measured. All data are shown as mean ⁇ standard error. Statistical tests were performed using analysis of variance (analysis variance, NOVA, with repeated measures) and Mann-Whitney U-test.
  • FIG. 2 shows changes over time in the tumor volume (mm 3 ) of each group (2 mM test sample administration group, 10 mM test sample administration group, 50 mM test sample administration group, water administration control group).
  • formation of a tumor mass exceeding the tumor volume of 400 mm 3 was observed 28 days after human colon cancer cell transplantation (--- ⁇ ---).
  • the tumor volume of the mice in the 10 mM test sample administration group was small until the 18th day after transplantation compared to the tumor volume of the mice in the water administration control group, but rather the mice in the water administration control group by the 28th day. There was no significant difference in the tumor volume between the two groups (--- ⁇ ---).
  • mice in each group were sacrificed by administration of a large amount of urethane anesthetic 28 days after tumor implantation.
  • a photograph of the appearance of the tumor at the time of sacrifice is shown in FIG. 3, and a photograph of the excised tumor mass is shown in FIG. 3 and 4 also show that the tumor mass of the mouse in the 2 mM test sample administration group is larger than the tumor mass of the mouse in the water administration control group, while the tumor mass of the mouse in the 50 mM test sample administration group is large. Was confirmed to be smaller.
  • FIG. 5 shows the weight of the excised tumor mass.
  • the statistical calculation by Mann-Whitney U-test showed no significant difference at a 5% risk rate, but compared to the weight of the tumor mass in the water-administered control group, the tumor mass of the mouse in the 2 mM test sample-administered group On the other hand, the tumor mass weight of mice in the 50 mM test sample administration group tended to decrease (FIG. 5).
  • the tumor increased significantly, and at 10 mM concentration, there was almost no change from the water-treated control group, and at 50 mM concentration, the tumor size decreased significantly.
  • the same tendency was recognized also in the weight of the tumor mass extracted after completion
  • Experimental example 2 (I) Measurement of electrical activity of splenic sympathetic nerve (centrifugal branch) (1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample A mixture of arginine and lysine was dissolved in water so as to have respective concentrations of 2 mM, 10 mM, and 50 mM, and this was used as a test sample. Moreover, water was used as a control sample.
  • the test sample prepared above (2 mM, 10 mM, 50 mM Arg + Lys), or only water as a control, 1 ml each was orally administered, and the change in the nerve activity (electric activity) of the distal branch of the splenic sympathetic nerve was measured for 40 minutes immediately after administration.
  • the abdomen was opened under urethane anesthesia in the middle of the light period, and the splenic sympathetic nerve was lifted with a silver electrode, and the method described above (Tanida et al. Am. J. Physiol.
  • changes in splenic sympathetic nerves were measured. Changes in splenic sympathetic nerve activity by oral administration of 1 ml of various test samples (2 mM, 10 mM and 50 mM aqueous solutions) at the time when this measured value settled (around 13:00) was measured electrophysiologically. Specifically, the electrical activity of the splenic sympathetic nerve (centrifugal branch) was measured by lifting the splenic sympathetic nerve branch of the rat onto a silver electrode under a stereomicroscope. In order to prevent drying, the electrode was previously sufficiently immersed in a mixture of liquid paraffin and petrolatum. The obtained nerve electrical activity was amplified with a differential amplifier and monitored with an oscilloscope.
  • the noise signal was separated by a window discriminator and converted into a spike signal.
  • the obtained spike signal was counted as the number of spikes for 5 seconds by a late meter, and was recorded on a personal computer after A / D (analog / digital) conversion (see FIG. 1). Electrical activity was recorded for 40 minutes (see FIG. 6B).
  • the oral administration of the test sample was performed by using a polyethylene tube inserted into the oral cavity and setting the administration rate to 1 ml / min. A tube was inserted into the trachea from the start of the operation to the end of the measurement to secure the airway, and the body temperature (rat rectal temperature) was maintained at 36.0 ⁇ 0.5 ° C. with a heat retaining device. As a control experiment, 1 ml of a control sample (water) was administered into the duodenum under the same conditions.
  • the data of splenic sympathetic nerve activity was analyzed by the average value of the firing frequency (pulse / 5 pulses) per 5 seconds every 5 minutes, and expressed as a percentage with the value before administration as 100%.
  • FIG. 6A shows actual measurement data
  • FIG. 6B is a graph of this actual measurement data, with the actual measurement data before administration (number of spikes) taken as 100%, with an average value every 5 minutes. (0-40 minutes).
  • the top of FIG. 6 (A) is measured data of a rat administered with water as a control (water-treated control rat) [FIG. 6 (B):- ⁇ -], and the second is a 2 mM test sample administered.
  • Measured data of rat (2 mM test sample-administered rat) [FIG. 6B: --- ⁇ -]
  • the splenic sympathetic nerve activity (electrical activity) of water-treated control rats and 10 mM test sample-treated rats was almost the same as that before the administration, The splenic sympathetic nerve activity of the rats treated with 2 mM test sample increased, and the splenic sympathetic nerve activity of the rats treated with 50 mM test sample decreased markedly.
  • the activity of the sympathetic nerve that controls the spleen is controlled in a concentration-dependent manner by the oral administration of the test sample, and the activity of the splenic sympathetic nerve is significantly increased at the concentration of 2 mM, and the splenic sympathetic nerve is increased at the concentration of 50 mM. Activity decreased significantly.
  • Tumor growth rate (%) is 28 days after transplantation in each test sample administration group (2 mM test sample administration group, 10 mM test sample administration group, 50 mM test sample administration group).
  • the tumor volume of the mice was calculated by converting the tumor volume of the mice 28 days after transplantation in the water-administered control group to 100% as a percentage.
  • spleen sympathetic nerve activity inhibition rate (%) was determined based on the graph shown in FIG. Rats, rats treated with 10 mM test sample, rats treated with 50 mM test sample) from 0 to 40 minutes splenic sympathetic nerve activity (Splenic-SNA) -time curve area, spleen from 0 to 40 minutes of water-treated control rats The sympathetic nerve activity value (Splenic-SNA) -calculated by converting the percentage under the time curve to 100%.
  • FIG. 6 (B) is printed on homogeneous paper, and the splenic sympathetic nerve activity value (Splenic-SNA) -time curve from 0 to 40 minutes for each test sample-administered rat and water-administered control rat.
  • the lower area was cut out, the respective weights were measured, and when the weight cut out for the water-administered control rats was taken as 100%, the weight for each test sample-administered rat was converted to a percentage, and the decrease in area was calculated as the inhibition rate.
  • Splenic-SNA splenic sympathetic nerve activity value
  • FIG. 7 shows the results obtained above and graphed with the inhibition rate (%) of splenic sympathetic nerve activity on the horizontal axis and the tumor growth rate (%) on the vertical axis.
  • the numerical formula in the figure of FIG. 7 shows a linear approximation formula and a correlation coefficient.
  • FIG. 7 shows that the suppression rate of splenic sympathetic nerve activity and the growth rate of tumor are in a good correlation, and that the decrease in splenic sympathetic nerve activity reflects the decrease in tumor growth. From this, it is considered that the antitumor wet action of the test substance can be evaluated by measuring the activity (electric activity) of the spleen sympathetic nerve and using the decrease as an index. Moreover, it is thought that the substance which suppresses the activity of a spleen sympathetic nerve suppresses the growth of a tumor by raising NK cells and exhibits an anticancer effect.
  • Experimental example 3 (1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample ⁇ -Myrcene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was suspended in 10,000 times water to prepare a spray solution, which was used as a test sample. Moreover, water was used as a control sample.
  • test animals were bred for 21 days after colon cancer cell transplantation under conditions where the test sample (myrcene diluted suspension) or the control sample (water) was sprayed every day for 30 minutes.
  • the size and weight were measured according to the method described in Experimental Example 1 (Myrcene administration group, Water administration group: 5 mice in each group).
  • Myrcene administration group, Water administration group the appearance of the tumor was photographed after completion of the experiment, and then the tumor was taken out and its weight (g) was measured. All data are shown as mean ⁇ standard error.
  • Statistical tests were performed by analysis of variance (analysis variance, NOVA, with repeated measures) and two-samples t-test.
  • mice in each group were sacrificed 21 days after tumor implantation by administration of a large amount of urethane anesthetic.
  • a photograph of the appearance of the tumor at the time of sacrifice is shown in FIG. 9, and a photograph of the excised tumor mass is shown in FIG. 9 and 10 also confirmed that the tumor mass in the Myrcene administration group was smaller than the size of the tumor mass in the Water administration group.
  • FIG. 11 shows the weight of the extracted tumor mass. It was confirmed that the weight of the tumor mass in the Myrcene administration group was significantly reduced compared to the weight of the tumor mass in the Water administration group (P ⁇ 0.05 ⁇ two-samples t-test).
  • Experimental Example 4 (I) Measurement of electrical activity of splenic sympathetic nerve (centrifugal branch) (1) Experimental method (1-1) Preparation of test sample ⁇ -Myrcene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was suspended in 100 times water and used as a test sample. Water was used as a control sample.
  • the test sample prepared above Myrcene diluted suspension
  • the control sample water
  • the change in the nerve activity (electric activity) of the distal branch of the splenic sympathetic nerve was measured (three mice in each group).
  • the abdomen was opened under urethane anesthesia in the middle of the light period, and the splenic sympathetic nerve was lifted with a silver electrode, and the method described above (Tanida et al. Am. J. Physiol.
  • the data of splenic sympathetic nerve activity was analyzed by the average value of the firing frequency (pulse / 5 pulses) per 5 seconds every 5 minutes, and expressed as a percentage with the value before administration as 100%.
  • FIG. 12 (A) is actual measurement data, and (B) is a graph of this actual measurement data, with the actual measurement data (number of spikes) before administration taken as 100%, with an average value every 5 minutes. (0-60 minutes).
  • the left column of FIG. 12 (A) is the actual measurement data [FIG. 12 (B): -------] of the rat (Water administration group) which administered water as a control, and the right column administered the test sample.
  • Measured data [Figure 12 (B):- ⁇ -] of rats (Myrcene administration group) is shown.
  • the activity of the splenic sympathetic nerve of the Water administration group was almost the same as that before the administration of water, and the activity of the spleen sympathetic nerve was hardly changed by water stimulation.
  • FIG. 1 It is the schematic which shows the measuring method of the electrical activity of the spleen sympathetic nerve used by this invention.
  • the result of measuring the magnitude of proliferation) over time is shown.
  • Each value represents the average value of 4 mice in each group.
  • (A) is a figure which shows the time-dependent change (actual measurement data) of the activity (electric activity) of the centrifugal branch of a spleen sympathetic nerve when water or a mixture (2 mM, 10 mM, 50 mM) of arginine and lysine is orally administered.
  • (B) is a graph of this (Experimental Example 1).
  • shaft of (B) means the electrical activity of a spleen sympathetic nerve, It graphed by making the electrical activity before oral administration (0 minute) of each test substance into 100%. It is a figure which shows correlation with the suppression rate of a spleen sympathetic nerve activity, and the growth rate (%) of a tumor cell.
  • Tumor formed by HCT116 human colon cancer cell transplantation when water or myrcene (10,000-fold diluted suspension) is ingested nasally into BALB / C mice transplanted with HCT116 human colon cancer cells Shows the result of measurement over time. Each value represents the average value of 5 mice in each group.
  • (A) is a figure which shows the time-dependent change (measurement data) of the activity (electric activity) of the centrifugal branch of the spleen sympathetic nerve when water or myrcene (100-fold diluted suspension) is ingested nasally.
  • (B) is a graph of this (Experimental Example 4).
  • shaft of (B) means the electrical activity of a spleen sympathetic nerve, It graphed by making the electrical activity before ingesting each test substance nasally (0 minute) into 100%.

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Abstract

　本発明は、被験物質について抗腫瘍作用を評価する方法を提供する。また本発明は、当該方法を用いて抗腫瘍作用を有する候補物質（抗腫瘍物質）をスクリーニングする方法を提供する。さらに本発明は、上記評価方法で抗腫瘍作用があると判断された物質を抗腫瘍剤として提供するものである。 　本発明の評価方法は、次の工程を有することと特徴とする： (1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程、必要に応じてさらに、(2)被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。

Description

抗腫瘍作用の評価方法、およびこれを用いた抗腫瘍物質のスクリーニング方法
　本発明は、被験物質について抗腫瘍作用を評価する方法に関する。また本発明は、当該方法を用いて抗腫瘍剤の有効成分となりえる物質を探索し取得する方法（スクリーニング方法）に関する。さらに本発明は、当該方法によって取得された物質を有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
　がんは、罹患率および死亡率の高い疾患の一つである。最近では、医学の進歩によって、早期発見によるがんの死亡率は全体的に減少しているが、普遍的に有効ながんの防止策および治療方法は存在しない。また昨今の種々の理由（高齢者の増加、環境汚染など）により、がんの症例数は、これからますます増加すると予想される。
　現在、がん治療は、一般に、早期発見に加えて、積極的な治療（手術、化学療法、放射線療法、またはホルモン療法を含む）が１乃至複数組み合わせて行われる。しかし、このような積極的な治療の多くは侵襲的であり、しかも全身的な毒性を免れないので、患者の肉体的および精神的な負担は大きく、また副作用によって患者の生活の質が大きく損なわれてしまう。また、がん細胞または腫瘍細胞は、本質的にがん治療で使用される細胞傷害薬に耐性を示すものもあれば、最初は応答するものの治療中に耐性を示すものもある。また、放射性療法は固形性腫瘍塊内のがん細胞の根絶には比較的効果がないことも認識されている。これは、放射性療法による細胞破壊には酸素由来のフリーラジカルが必要であるのに対して（非特許文献１）、腫瘍塊内の酸素レベルは、血液供給が欠如していることから低いのが一般的だからである。また多くの化学療法薬は、その有効性を発揮するのに酸素を必要とすることも知られている（非特許文献２）。
　がんの原因は依然としてほとんど知られていない。しかし、一般に、がん形成または発がんには、複数の遺伝的および環境的要素を含む複雑なプロセスが関係していると考えられている。複数の発がん要因が複雑に相互作用してがんが発生することを考えると、特異的かつ普遍的に、がん細胞を死に誘導する方法、または腫瘍成長（がん細胞の増殖）を阻止する方法を開発することは極めて難しい課題であると考えられる。
　最近、がん治療や予防のため、特にナチュラルキラー細胞の活性化を介して生体の免疫機能を高める方法が提案されている（非特許文献３、４）。ナチュラルキラー細胞を活性化して生体の免疫機能そのものを高めることは、がんの種類に関係なく普遍的にがんに対抗できるものと考えられる。
Gray et al., Brit. J. Radiol. 26:6:683 (1953) Giatromanolaki and Harris., Anticancer Res．21：4317（2001） Andre and Anfossi, Methods Mol.Biol.415: 291-300 (2008) Malmberg et al. Cancer Immunol. Immunother. 2008 Mar 4 [Epubaheat of print] Zea at al. Cancer Res. 65: 3044-3048 (2005)
　本発明は、被験物質の抗腫瘍作用を評価する方法を提供することを目的とする。また、本発明は、かかる評価方法を利用して、抗腫瘍剤の有効成分となり得る物質を探索し取得するための方法、すなわち新しい抗腫瘍剤をスクリーニングする方法を提供することを目的とする。
　さらに本発明は、当該スクリーニング方法を用いて取得された抗腫瘍作用を有する物質を有効成分とする抗腫瘍剤を提供することを目的とする。
　腎臓癌の患者では、血中単核球のアルギニン分解酵素の活性が高く、また血中のアルギニン濃度が低下している。このため、これらの条件が腫瘍免疫を低下させると考えられている（非特許文献５）。このことから、上記課題を解決するために、本発明者らは、アルギニンとその他のアミノ酸の混合物を腫瘍細胞を移植した被験動物に経口投与し、腫瘍の大きさ（腫瘍細胞の増殖率）を経時的に測定すると同時に、脾臓を支配する交感神経（脾臓交感神経）の遠心枝の電気活動の変化を経時的に測定してみたところ、アルギニンとリジンの混合物の経口投与が腫瘍細胞の増殖と脾臓交感神経の電気活動との間に良好な相関関係があること、具体的には脾臓交感神経の活動低下に対応して腫瘍細胞の増殖率が低下することを見出した。また、本発明者らは、芳香成分であるミルセンに、匂い刺激によって脾臓交感神経の活動を低下させる作用があることを確認し、さらに当該ミルセンを、腫瘍細胞を移植した被験動物に嗅がして経鼻摂取させることによって、上記アルギニンとリジンの混合物と同様に、腫瘍の大きさ（腫瘍細胞の増殖率）が小さくなることを確認した。
　これらの知見に基づいて、本発明者は、脾臓交感神経の活動の低下を指標とすることによって、被験物質の抗腫瘍作用を評価することができること、すなわち、かかる評価系を用いることで、抗腫瘍剤の有効成分として有用な物質、または抗腫瘍作用を有する食品やペット餌料の有効成分として有用な物質を簡便に探索し見出すことができることを確認し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、下記の態様を備えるものである。
　（Ｉ）被験物質についてその抗腫瘍作用を評価する方法
（I-1）下記の工程を有することを特徴とする、被験物質の抗腫瘍作用を評価する方法：
(1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
　（I-2）さらに下記の工程を有する、（I-1）に記載する抗腫瘍作用の評価方法：
(2)被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。
　（I-3）脾臓交感神経活動の測定を、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行う（I-1）または（I-2）に記載する抗腫瘍作用の評価方法。
　なお、本発明の「被験物質の抗腫瘍作用を評価する方法」は、「被験物質の抗腫瘍作用を測定する方法」と言い換えることもできる。
　（II）抗腫瘍作用を有する物質（抗腫瘍物質）のスクリーニング方法
（II-1）下記の工程を有することを特徴とする、被験物質の中から抗腫瘍作用を有する物質をスクリーニングする方法：
(1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程、
および
(2)上記で得られた脾臓交感神経の活動を、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動（コントロール）と対比し、上記活動がコントロールよりも低くなる被験物質を、抗腫瘍作用を有する候補物質として選抜する工程。
　（II-2）脾臓交感神経活動の測定を、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行う、（II-1）に記載するスクリーニング方法。
　（II-3）工程(2)で抗腫瘍作用を有する候補物質として選抜された被験物質を、抗腫瘍作用を有する食品、動物の餌料、または芳香剤の有効成分として取得する、（II-1）または（II-2）に記載するスクリーニング方法。
　（III）抗腫瘍剤
（III-1）上記（I-1）乃至（I-3）のいずれかに記載する評価方法によって抗腫瘍作用があると評価された、アルギニンおよびリジンの混合物、またはミルセンを有効成分とする抗腫瘍剤。
　（III-2）ヒトまたは非ヒト動物の腫瘍、特に悪性腫瘍（がん）を治療するために使用される（III-1）に記載する抗腫瘍剤。
　（IV）抗腫瘍方法
(IV-1)（III-1）または（III-2）に記載する抗腫瘍剤を、腫瘍を有するヒトまたは動物に適用する、抗腫瘍方法。
　（IV-2）腫瘍が悪性腫瘍（がん）である（IV-1）に記載する抗腫瘍方法。
　（V）使用
（V-1）（I-1）～（I-3）のいずれかに記載する方法によって抗腫瘍作用があると評価されるアルギニンとリジンの混合物、またはミルセンの、抗腫瘍剤としての使用。
　（V-2）（I-1）～（I-3）のいずれかに記載する方法によって抗腫瘍作用があると評価されるアルギニンとリジンの混合物、またはミルセンの、抗腫瘍剤の製造のための使用。
　本発明の評価方法によれば、被験物質を投与して、脾臓を支配する交感神経の電気活動の低下の有無を観察することによって、簡単に被験物質の抗腫瘍作用の有無を判断することができる。すなわち、本発明によれば、簡単に被験物質の抗腫瘍作用を評価することができる。
　このため、本発明の評価方法は、従来公知の抗腫瘍剤の抗腫瘍作用、特に免疫増強作用に基づく抗腫瘍作用を評価する方法として有用であるほか、いままで抗腫瘍作用が知られていなかった物質（可食性物質や芳香成分を含む）について新たに抗腫瘍作用を見出すための方法として、さらに、多くの物質の中から抗腫瘍作用を有する物質を探索し取得するための方法として、また、複数の成分からなる組成物の中から抗腫瘍作用を有する有効成分を同定する方法として、有効に使用することができる。
　そしてかかる方法によって新たに取得された抗腫瘍作用を有する物質は、抗腫瘍作用を効果・効能とする抗腫瘍剤（ヒト用医薬品および動物用医薬品を含む）、食品、動物餌料、またはアロマセラピーなどに使用される芳香剤や香料の有効成分として有効に使用することができる。
（Ｉ）抗腫瘍作用の評価方法
　本発明の抗腫瘍作用の評価方法は、評価対象とする被験物質を非ヒト動物に投与して、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定することによって実施することができる。
　測定に使用する非ヒト動物は、ヒト以外の哺乳動物または鳥類などの恒温動物であれば特に制限されず、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、サル、イヌおよびネコなどを挙げることができる。
　被験物質の投与方法としては、経皮投与、経口投与、経腸投与、静脈投与および経鼻投与を挙げることができる。かかる投与方法は、被験物質の使用目的や使用形態に応じて適宜選択することができる。例えば、被験物質が、外用組成物（外用医薬品を含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経皮投与することによって抗腫瘍作用を評価することが好ましい。また、被験物質が、経腸投与剤（経口投与や坐薬などその物質が腸を通過するものを含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経腸投与（直腸投与を含む）することによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。さらに、被験物質が、静脈投与剤（注射剤や点滴剤を含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に静脈投与することによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。さらにまた、被験物質が、経鼻投与剤やその成分である場合または芳香剤などのように経鼻的に使用されるものである場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経鼻投与または経鼻摂取させることによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。
　また、被験物質が、経口組成物（食品や経口医薬品、動物餌料を含む）やその成分である場合またはその用途で使用する場合は、当該被験物質を非ヒト動物に経口投与することによって、抗腫瘍作用を評価することが好ましい。なお、この場合、被験物質を経口投与してから、体内吸収されるか、或は、腸内にて効果を発揮して脾臓交感神経の活動に反映されるまでに、多少の時間を要する。このため、まず被験物質を非ヒト動物に経腸投与（経小腸投与）して、予め抗腫瘍作用を評価し（一次評価）、次いで、当該一次評価で抗腫瘍作用が確認された被験物質を非ヒト動物に経口投与して、経口投与による抗腫瘍作用を評価することもできる（二次評価）。
　非ヒト動物に経皮投与する方法としては、被験物質を非ヒト動物の皮膚に塗布する方法、および被験物質を含浸または担持させたシートを貼付する方法などを挙げることができ、投与する被験物質の調製形態（例えば、ローション、エアゾール剤、フォーム剤、乳液、クリーム、軟膏、ゲル剤、貼付剤など）に応じて適宜設定することができる。経皮投与する非ヒト動物の部位は、制限はされないが、好ましくは体毛の影響が少ない領域、具体的には毛がないか若しくは毛の少ない皮膚領域（例えば腹部、太ももの内側、尻尾など）である。但し、試験領域を剃毛することによって体毛の影響を回避することができるため、上記部位に特に拘泥はされない。また、体毛の影響を回避するために、遺伝的に毛のない動物（例えばヘアレスマウス、ヘアレスラットなど）を使用することもできる。
　非ヒト動物に静脈投与する方法としては、注射または点滴を用いて、非ヒト動物の静脈内に被験物質を投与する方法を用いることができる。
　非ヒト動物に経鼻投与する方法（または経鼻摂取させる方法）としては、スプレーや吸入器などを用いて非ヒト動物の鼻から被験物質を強制的に投与する方法、飼育室の大気中に被験物質を散布して呼吸とともに鼻から被験物質を摂取させる方法などを用いることができる。
　非ヒト動物に経腸投与する方法としては、非ヒト動物を麻酔下で開腹し、腸内にカニューレを設置して被験物質を投与する方法、または肛門を介して直腸内に被験物質を投与する方法を挙げることができる。また非ヒト動物に経口投与する方法としては、口腔内にカニューレを設置して被験物質を強制摂取させる方法、または被験動物を食餌または水に混ぜて、非ヒト動物に食餌や水と一緒に飲食させる方法を挙げることができる。
　斯くして被験物質を投与した非ヒト動物について、その脾臓を支配する交感神経（脾臓交感神経）の活動を測定する。当該神経活動の測定は、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行うことができる。
　脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定は、具体的には、麻酔下で、非ヒト動物の脾臓交感神経の遠心枝を、実体顕微鏡下で剥離し、それを銀電極にのせて活動電位を記録することによって行うことができる。なお、銀電極は、乾燥を防ぐために、予め液体パラフィンとワセリンの混合物に十分浸しておくことが好ましい。得られた神経の電気活動は、差動増幅器にて増幅し、オシロスコープにてモニターする。ここでノイズ信号はウィンドウ・ディスクリミネーターにより分離する。信号をスパイク変換し、得られたスパイクをレイトメーターにより５秒間のスパイク数としてカウントする。これをＡ／Ｄ(アナログ／デジタル)変換した後、パソコンに記録する（図１参照）。
　かかる方法により脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を、スパイク数として測定することができる。すなわち、被験物質投与前に測定したスパイク数が、被験物質投与によって減少した場合には、被験物質投与によって脾臓交感神経の電気活動が低下したと判断することができる。
　かかる脾臓交感神経の電気活動の低下は、実験例に示すように腫瘍の増殖率の低下、すなわち抗腫瘍効果と精度良く相関する。このため、被験物質投与前に測定した上記スパイク数が、被験物質の投与によって減少した場合には、被験物質の投与によって脾臓交感神経の電気活動が低下したと判断することができ、この場合、当該被験物質に抗腫瘍作用があると評価することができる。一方、被験物質投与前に測定した上記スパイク数が、被験物質の投与によって変動しないか増加した場合には、被験物質の投与によって脾臓交感神経の電気活動が変動しないか上昇したと判断することができ、この場合、当該被験物質には抗腫瘍作用がないと評価することができる。
　以上のことを総合するに、本発明の抗腫瘍作用の評価方法は、下記の工程(1)を行うことによって実施することができる：
(1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
　好ましくは本発明の抗腫瘍作用の評価方法は、上記工程(1)に続いて、下記の工程(2)を行うことによって実施することができる：
(2)上記工程(1)において、被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物（対照非ヒト動物）の脾臓交感神経の活動（コントロール）よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。
　なお、工程(2)において対照とする非ヒト動物は、工程(1)で被験物質を投与した非ヒト動物と同一の動物であっても、また異なる動物であってもよい。前者の場合は、被験物質を投与する前に当該非ヒト動物について測定された脾臓交感神経の活動が比較の対象とされ、そこで測定された脾臓交感神経の活動が上記でいうコントロールとなる。また、後者において、対照非ヒト動物として被験物質を投与した非ヒト動物と異なる動物を使用する場合、当該動物は、被験物質を投与した非ヒト動物と同種の動物を用いることが好ましい。
　斯くして本発明によれば、被験物質について、経皮投与、静脈投与、経鼻投与、経口投与または経腸投与による抗腫瘍効果を評価することができる。なお、抗腫瘍効果を評価する対象の被験物質は、測定者が任意に選択することができ、例えば既に抗腫瘍作用が知られている抗腫瘍物質や組成物（医薬品、食品および芳香剤を含む）であってもよいし、また抗腫瘍作用が知られていない物質や組成物（医薬品、食品および芳香剤を含む）であってもよい。前者の場合は、本発明の評価方法により、抗腫瘍作用を再確認またはその作用がナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の活性化に起因するものであることを評価することができ、またその抗腫瘍作用を、他の物質の抗腫瘍作用と比較評価をすることができる。なお、ＮＫ細胞には特異性がないので、ＮＫ活性が高まればどのような腫瘍にも対抗することできると考えられる。また、後者の場合は、本発明の評価方法により、今まで抗腫瘍作用が知られていない物質や組成物について新たに抗腫瘍作用を見出すことができる。
　（II）抗腫瘍物質のスクリーニング方法
　本発明はまた、抗腫瘍作用を有する物質（抗腫瘍物質）をスクリーニングする方法を提供する。当該方法は、多くの被験物質のなかから、非ヒト動物に投与した場合に、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を低下させる作用を有する物質を選別することによって実施することができる。
　具体的には、抗腫瘍物質のスクリーニングは、前述する被験物質の抗腫瘍作用の評価方法に従って、下記の工程(1) を行うことによって実施することができる。
(1)被験物質を非ヒト動物に投与して、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
　好ましくは本発明のスクリーニング方法は、上記工程(1)に続いて、下記の工程(2)を行うことによって実施することができる：
(2) 上記工程(1)で得られた、被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動（コントロール）と対比し、上記活動がコントロールよりも低下する被験物質を、抗腫瘍作用を有する候補物質として選抜する工程。
　ここで非ヒト動物の種類は、前述する本発明の評価方法で採用する動物を同様に使用することができる。また脾臓交感神経の活動の測定方法も、前述する本発明の評価方法で採用する方法と同様に、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行うことができる。
　斯くして、非ヒト動物に投与した場合に当該動物の脾臓交感神経の活動が低下することが確認された被験物質は、抗腫瘍作用を有する候補物質（抗腫瘍物質）として判断取得することができる。
　なお、非ヒト動物への投与方法としては、前述する本発明の評価方法と同様に、経皮投与、静脈投与、経鼻投与、経口投与および経腸投与を挙げることができる。皮膚投与（塗布および貼付を含む）によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経皮投与することが好ましい。経腸投与（小腸投与および直腸投与を含む）によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経腸投与することが好ましく、また経鼻投与または匂い刺激によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経鼻投与または経鼻摂取させることが好ましい。
　また経口的に摂取させることによって抗腫瘍作用を発揮する被験物質をスクリーニングするためには、被験物質を経口投与することが好ましい。なお、経口によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質を選別する場合は、まず経腸投与を用いて第一次スクリーニングすることで、予め経腸投与によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質を選別し、次いで、ここで選別された被験物質について経口投与を用いた第二次スクリーニングを行って、経口投与によって抗腫瘍作用を発揮する被験物質を選別する方法を採用してもよい。
　斯くして本発明のスクリーニング方法によって選別された抗腫瘍物質は、さらに腫瘍細胞を移植した病態モデル動物などを用いた有効性試験、安全性試験、さらにヒトを対象とした試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な抗腫瘍物質を選別取得することができる。
　またこのようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、抗腫瘍剤、抗腫瘍効果を有する外用組成物、経口組成物（食品、動物餌料を含む）または芳香剤や香料の有効成分として使用することができる。
　（III）抗腫瘍剤
　本発明はまた、上記本発明の評価方法で抗腫瘍作用があると判断される抗腫瘍物質を有効成分とする抗腫瘍剤を提供する。なお当該抗腫瘍剤には、ヒト医薬品としての抗腫瘍剤のみならず、動物（例えば、イヌやネコなどのペット）用医薬品としての抗腫瘍剤が含まれる。
　かかる抗腫瘍物質として、実験例１～２で示すように、アルギニンとリジンの混合物を挙げることができる。当該混合物は、非ヒト動物に50mMの割合で投与（好ましくは経口投与）したときに、脾臓交感神経活動の低下を示すとともに、腫瘍の増殖率の低下（抗腫瘍作用）を示すことが確認されている。
　このため当該アルギニンとリジンの混合物は、抗腫瘍のための有効成分、特に経口投与または経腸投与することで抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍有効成分として、有効に用いることができる。このためアルギニンとリジンの混合物は、抗腫瘍を効果・効能とする抗腫瘍剤、食品または動物餌料、特に経口または経腸投与用の抗腫瘍剤の有効成分として使用することができる。すなわち、本発明によれば、アルギニンとリジンの混合物を有効成分とし、抗腫瘍を効能・効果とする経口または経腸投与形態を有する抗腫瘍剤を提供することができる。
　当該抗腫瘍剤に含まれるアルギニンとリジンの配合量は、抗腫瘍剤が抗腫瘍効果を備える限り、特に制限されず、通常１～１００重量％の範囲から適宜選択して用いることができる。好ましくは５０～１００重量％を挙げることができる。当該抗腫瘍剤の形態は、経口または経腸投与形態であれば特に制限されず、例えば飲料形態（ドリンク形態）、ゲルまたはシロップ形態、錠剤形態、丸剤形態、カプセル形態、粉末または顆粒状形態などの経口投与形態、ならびにクリーム、固形、またはカプセルなどの汎用の坐剤形態を有する経腸投与形態を挙げることができる。
　アルギニンとリジンの混合物の投与量としては、制限はされないが、後述する実験例の結果から、１回投与あたりそれぞれ25mmole以上であることが好ましい。
　また抗腫瘍物質として、実験例３～４で示すように、ミルセンを挙げることができる。当該ミルセンを、非ヒト動物に経鼻的に摂取させると、脾臓交感神経活動の低下を示すとともに、腫瘍の増殖率の低下（抗腫瘍作用）を示すことが確認されている。なお、ミルセン、特にβ－ミルセン（7-メチル-3-メチレンオクタ-1,6-ジエン）は、ローリエ、バーベナ、キャラウェイ、フェンネル、タラゴン、イノンド、オウシュウヨモギ、セイヨウトウキなどの植物に含まれている天然のモノテルペン炭化水素である。
　このため当該ミルセンは、抗腫瘍のための有効成分、特に経鼻投与するか、または経鼻的に摂取させることで抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍有効成分として、有効に用いることができる。このためミルセンは、抗腫瘍を効果・効能とする抗腫瘍剤、特に経鼻投与用の抗腫瘍剤、または抗腫瘍を効果・効能とする芳香剤（アロマセラピーに使用するアロマ剤を含む）の有効成分として使用することができる。すなわち、本発明によれば、ミルセンを有効成分とし、抗腫瘍を効能・効果とする経鼻投与形態を有する抗腫瘍剤、香料や芳香剤を提供することができる。
　当該抗腫瘍剤などに含まれるミルセンの配合量は、抗腫瘍剤が抗腫瘍効果を備える限り、特に制限されず、通常１～１００重量％の範囲から適宜選択して用いることができる。当該抗腫瘍剤の形態は、経鼻投与形態であれば特に制限されず、例えば、滴剤、噴霧剤（噴霧器を用いて噴霧する液剤、エアゾール剤など）、洗浄剤、注入剤などとすることができる。取り扱いの簡便性の点では、プッシュ式容器で一回のプッシュで定量の有効成分が放出する機能を有するものが好ましい。
　ミルセンの投与量としては、制限はされないが、後述する実験例の結果から、室温25℃、湿度60％の条件下で100倍から10,000倍のミルセン水稀釈懸濁液から蒸発する量であることが好ましい。
　当該抗腫瘍剤は、抗腫瘍を目的として、上記形態に応じて、腫瘍、特に悪性腫瘍を有するヒトまたは動物に、１日に１回または複数回、適用することにより使用される。
　以下、本発明を実験例によって更に詳細に説明する。但し、これらの実験例は本発明を何ら限定するものではない。なお、下記の実験例において、特に言及しない限り、％は重量％を意味するものとする。
　実験例１
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
　アルギニン（Arg）とリジン（Lys）の混合物を、それぞれの濃度が2mM、10mM、および50mMとなるように水に溶解し、これを被験試料とした。また、対照試料として、水を用いた。
　（1-2）被験動物
　実験には、4週令の雌BALB/c slc nu/nuヌードマウスを、12時間毎の明暗周期（8時～20時まで点灯）下に24℃の恒温動物室にて１週間以上飼育したマウスを使用した。飼育には餌（オリエンタル酵母、MF）及び水を自由摂取させた。斯くして飼育した体重約20gの雌ヌードマウスに、無麻酔下に皮下注射によりヒト大腸癌細胞（HCT116、2.5x106cells/mouse）を移植して、癌細胞移植マウスを作製し、これを被験動物とした。
　（1-3）実験方法
　被験動物（各群４匹ずつ）に、唯一の飲料水として被験試料（アルギニンとリジンをそれぞれ2mMずつ、10mMずつおよび50mMずつを含む水）自由摂取させながら28日間飼育し、経時的に腫瘍細胞の大きさおよび重量を測定した（被験試料投与群：2mM投与群、10mM投与群、50mM投与群）。具体的には、大腸癌細胞移植後、週３回腫瘍の大きさを最大径（腫瘍の最も長い部位の長さ、L）とそれに直角に交わる線上の腫瘍の幅（W）のそれぞれをmm単位で測定し、腫瘍体積を下式に従って求めた(Gonzalez et al. J. Biol. Chem. 281: 20851-20864 (2006))。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　対照実験は、雌ヌードマウスにヒト大腸癌細胞を移植した後、唯一の飲料水として水を自由摂取させながら28日間飼育し、同様に経時的に腫瘍細胞の大きさおよび重量を測定した（水投与対照群、n=4）。
　全ての群（2mM被験試料投与群、10mM被験試料投与群、50mM被験試料投与群、水投与対照群：各群４匹ずつ）のマウスについて、実験終了後に腫瘍の外観を写真撮影し、次いで腫瘍を取り出してその重量（g）を測定した。データは全て平均値±標準誤差で示す。また統計検定は分散分析法（analysis of variance, NOVA, with repeated measures）および Mann-Whitney U-testにて行った。
　（２）実験結果
　図２に各群（2mM被験試料投与群、10mM被験試料投与群、50mM被験試料投与群、水投与対照群）の腫瘍体積（mm3）の経時的変化を示す。水投与対照群のマウスではヒト大腸癌細胞移植28日後に、腫瘍体積が400mm３を越える腫瘍塊の形成が認められた（---●---）。これと比較して2mM被験試料投与群のマウスでは、腫瘍体積が500mm３を越えるまでに大きく腫瘍塊が形成された（P<0.01、F=7.85 by ANOVA；ANOVA法により５分から40分までの値を群として比較した）（－●－）。ところが、10mM被験試料投与群のマウスの腫瘍体積は、水投与対照群のマウスの腫瘍体積と比較して、移植18日後までは小さかったが、28日目までにはむしろ水投与対照群のマウスの腫瘍体積を追い越す程で、両群間の腫瘍体積には有意差が認められなかった（---▲---）。これに対して50mM被験試料投与群のマウスの腫瘍体積は、水投与対照群のマウスの腫瘍体積よりも著しくかつ有意に小さかった（P<0.05、F=4.31 by ANOVA）（―▲―）。
　各群のマウスは、腫瘍移植28日後にすべて大量ウレタン麻酔薬投与によって屠殺した。屠殺時の腫瘍の外観写真を図３に、摘出した腫瘍塊の写真を図４に、それぞれ示す。図３と図４からも、水投与対照群のマウスの腫瘍塊の大きさと比較して、2mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊は大きくなり、一方、50mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊は小さくなっていることが確認された。
　図５には摘出した腫瘍塊の重量を示す。Mann-Whitney U-testによる統計計算では５％の危険率では有意な差違が認められなかったが、水投与対照群の腫瘍塊の重量と比較して、2mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊の重量は増加し、一方、50mM被験試料投与群のマウスの腫瘍塊の重量は低下する傾向が認められた（図５）。
　これらの結果からわかるように、被験試料（アルギニンとリジンの混合物）の経口投与によって、濃度依存的にヌードマウスに移植したヒト大腸癌細胞によって形成される腫瘍は、その増殖が制御され、2mM濃度で腫瘍は有意に増加し、10mM濃度では殆ど水投与対照群と変化なく、50mM濃度では腫瘍の大きさは有意に低下した。また、実験終了後に摘出した腫瘍塊の重量にも同じ傾向が認められた。
　実験例２
（Ｉ）脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定　　
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
　アルギニンとリジンの混合物を、それぞれの濃度が2mM、10mM、および50mMとなるように水に溶解し、これを被験試料とした。また、対照試料として、水を用いた。
　（1-2）被験動物
　予め１週間、24±1℃、12時間周期の明期（照明80lx、7:00-19:00）及び暗期（19:00-7:00）の環境下で飼育したラット（雄、Wistar rat、250～300g）を被験動物（非ヒト動物）として用いた。なお、実験前、ラットには飼料（MF type; Oriental Yeast）と水を自由に摂取させた。
　上記ラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔下（1g/kgのウレタン水溶液を腹腔内投与内）で、上記で調製した被験試料（2mM、10mM、50mM Arg＋Lys）、またはコントロールとして水のみを、それぞれ1mlずつ経口投与して、投与直後から40分間、脾臓交感神経の遠心枝の神経活動（電気活動）の変化を測定した。具体的には、3時間絶食後、明期の中間期にウレタン麻酔下に開腹し、脾臓交感神経を銀電極で吊り上げ、既述の方法(Tanida et al. Am. J. Physiol. 288: R447-R455 (2005))にて、脾臓交感神経の変化を測定した。この測定値が落ち着いた時期(13時頃)に、各種の被験試料（アルギニンとリジンを、それぞれ、2mMずつ、10mMずつおよび50mMずつを含む水溶液) １mlを経口投与して脾臓交感神経活動の変化を電気生理学的に測定した。脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定は、具体的には、ラットの脾臓交感神経の遠心枝を、実体顕微鏡下で、銀電極に釣り上げて行った。乾燥を防ぐ為に電極は予め液体パラフィンとワセリンの混合物に十分浸しておいた。得られた神経の電気活動は、差動増幅器にて増幅し、オシロスコープにてモニターした。脾臓交感神経の神経活動を検出するために、ノイズ信号をウィンドウ・ディスクリミネーターにより分離し、スパイク信号に変換した。得られたスパイク信号はレイトメーターにより５秒間のスパイク数としてカウントし、A／D(アナログ／デジタル)変換後、パソコンに記録した（図１参照）。電気活動の記録は40分間行った（図６Ｂ参照）。なお、被験試料の経口投与は、口腔内に挿入したポリエチレンチューブを使用し、投与速度を1 ml/minに設定して行った。手術開始から測定終了までチューブを気管に挿入して気道を確保し、保温装置にて体温(ラット直腸温)を36.0±0.5℃に保つようにした。対照実験としては、対照試料（水）を1ml、同様の条件で十二指腸内投与することで行った。
　脾臓交感神経の活動のデータは5分間毎の5秒あたりの発火頻度(pulse/5 s)の平均値にて解析し投与前の値を100％として百分率で表した。
　（２）実験結果
　結果を図６に示す。なお、図６の（Ａ）は実測データであり、（Ｂ）はこの実測データを、投与前の実測データ（スパイク数）を100％として、5分毎の平均値でグラフ化したものである（0－40分間）。なお、図６（Ａ）の一番上は対照として水を投与したラット（水投与対照ラット）の実測データ〔図６（Ｂ）：―●―〕、２番目は2mMの被験試料を投与したラット（2mM被験試料投与ラット）の実測データ〔図６（Ｂ）：---●--〕、３番目は10mMの被験試料を投与したラット（10mM被験試料投与ラット）の実測データ（図６（Ｂ）：---▲---）、一番下は50mMの被験試料を投与したラット（50mM被験試料投与ラット）の実測データ〔図６（Ｂ）：---◆---〕を示す。
　図６（Ａ）および（Ｂ）からわかるように、水投与対照ラットおよび10mM被験試料投与ラットの脾臓交感神経の活動（電気活動）は、それらの投与前と殆ど変わらなかったのに対して、2mM被験試料投与ラットの脾臓交感神経の活動は増加し、また50mM被験試料投与ラットの脾臓交感神経の活動は著明に低下した。
　この結果からわかるように、被験試料の経口投与によって、濃度依存的に脾臓を支配する交感神経の活動が制御され、2mM濃度で脾臓交感神経の活動は有意に増加し、50mM濃度で脾臓交感神経の活動は有意に低下した。
　（II）脾臓交感神経の活動と腫瘍の増殖率との相関関係
　実験例１および２で得られた結果から、下記の方法に従って腫瘍の増殖率（％）および脾臓交感神経活動の抑制率（％）を求めた。
　(1) 腫瘍の増殖率（％）の求め方
　腫瘍の増殖率（％）は、各被験試料投与群（2mM被験試料投与群、10mM被験試料投与群、50mM被験試料投与群）の移植28日後のマウスの腫瘍体積を、水投与対照群の移植28日後のマウスの腫瘍体積を100％として、百分率に換算することによって算出した。
　(2)脾臓交感神経活動の抑制率（％）の求め方
　脾臓交感神経活動の抑制率（％）は、図６（Ｂ）に示すグラフを元に、各被験試料投与ラット（2mM被験試料投与ラット、10mM被験試料投与ラット、50mM被験試料投与ラット）の0～40分までの脾臓交感神経活動値（Splenic-SNA）－時間曲線下面積を、水投与対照ラットの0～40分までの脾臓交感神経活動値（Splenic-SNA）－時間曲線下面積を100％として、百分率に換算することによって算出した。
　但し、実際には、均質な紙に図６（Ｂ）を印刷し、各被験試料投与ラットおよび水投与対照ラットの、0分から40分までの脾臓交感神経活動値（Splenic-SNA）－時間曲線下面積を切りとり、それぞれ重量を測定し、水投与対照ラットについて切り取った重量を100％した時の、各被験試料投与ラットに関する重量を百分率に換算して面積の低下を抑制率として算出した。
　上記で得られた結果を、脾臓交感神経活動の抑制率（％）を横軸、腫瘍の増殖率（％）を縦軸にしてグラフにした結果を図７に示す。図７の図中の数式は直線の近似式と相関係数を示す。
　図７から、脾臓交感神経活動の抑制率と腫瘍の増殖率とは良好な相関関係にあり、脾臓交感神経活動の低下は、腫瘍の増殖低下を反映することが判明した。このことから、脾臓交感神経の活動（電気活動）を測定しその低下を指標とすることによって、被験物質の抗腫瘍湿作用を評価することができると考えられる。また、脾臓交感神経の活動を抑制する物質は、ＮＫ細胞を高めることにより腫瘍の増殖を抑制し、抗がん作用を発揮すると考えられる。
　実験例３
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
　β－ミルセン（和光純薬工業（株）製）を10,000倍の水に懸濁して噴霧液として調製し、これを被験試料とした。また、対照試料として、水を用いた。
　（1-2）被験動物
　実験には、4週令の雌BALB/c slc nu/nuヌードマウスを、12時間毎の明暗周期（8時～20時まで点灯）下に24℃の恒温動物室にて１週間以上飼育したマウスを使用した。飼育には餌（オリエンタル酵母、MF）及び水を自由摂取させた。斯くして飼育した体重約20gの雌ヌードマウスに、無麻酔下に皮下注射によりヒト大腸癌細胞（HCT116、2.5x106cells/mouse）を移植して、癌細胞移植マウスを作製し、これを被験動物とした。
　（1-3）実験方法
　被験動物（各群５匹ずつ）に、ヒト大腸癌細胞移植後、毎日13時から13時半までの30分間、β－ミルセンを10,000倍の水に懸濁した被験試料を噴霧した。実際には、ヌードマウスを入れた飼育箱に、被験試料（ミルセン希釈懸濁液）または対照試料（水）を散布する装置をセットした。毎日、定時に被験試料または対照試料を散布するように、散布装置に24時間繰り返しタイマーをとりつけた。
　このように毎日30分間、被験試料（ミルセン希釈懸濁液）または対照試料（水）を散布する条件下で、被験動物を、大腸癌細胞移植後21日間飼育して、経時的に腫瘍細胞の大きさおよび重量を、実験例１に記載する方法に準じて測定した（Myrcene投与群、Water投与群：各群５匹ずつ）。　全ての群（Myrcene投与群、Water投与群）のマウスについて、実験終了後に腫瘍の外観を写真撮影し、次いで腫瘍を取り出してその重量（g）を測定した。データは全て平均値±標準誤差で示す。また統計検定は分散分析法（analysis of variance, NOVA, with repeated measures）および two-samples t-testにて行った。
　（２）実験結果
　図８に各群（Myrcene投与群、Water投与群）の腫瘍体積（mm3）の経時的変化を示す。ヒト大腸癌細胞移植11日後から、Myrcene投与群（―■―）は、Water投与群（―●―）と比較して、腫瘍体積の増加が抑制され、移植後4日目から21日目までの値を群として分散分析法（ANOVA）にて比較するとMyrcene投与群のヒト大腸癌細胞の形成する腫瘍の体積はWater投与群のそれよりも有意に小さかった（P<0.05, F=5.05 by ANOVA）。
　各群のマウスは、腫瘍移植21日後にすべて大量ウレタン麻酔薬投与によって屠殺した。屠殺時の腫瘍の外観写真を図９に、摘出した腫瘍塊の写真を図１０に、それぞれ示す。図９と図１０からも、Water投与群の腫瘍塊の大きさと比較して、Myrcene投与群の腫瘍塊は小さくなっていることが確認された。
　図１１に摘出した腫瘍塊の重量を示す。Water投与群の腫瘍塊の重量と比較して、Myrcene投与群の腫瘍塊の重量は有意に低下することが確認された（P<0.05 by two-samples t-test）。
　これらの結果から、被験試料（ミルセン希釈懸濁液）を経鼻的に摂取させることによって、ヌードマウスに移植したヒト大腸癌細胞から形成される腫瘍は、その増殖が有意に抑制されることが確認できた。
　実験例４
（Ｉ）脾臓交感神経（遠心枝）の電気活動の測定　　
（１）実験方法
（1-1）被験試料の調製
　β－ミルセン（和光純薬工業（株）製）を100倍の水に懸濁して、これを被験試料とした。また、対照試料として水を用いた。
　（1-2）被験動物
　予め１週間、24±1℃、12時間周期の明期（照明80lx、7:00-19:00）及び暗期（19:00-7:00）の環境下で飼育したラット（雄、Wistar rat、250～300g）を被験動物（非ヒト動物）として用いた。なお、実験前、ラットには飼料（MF type; Oriental Yeast）と水を自由に摂取させた。
　上記ラットを3時間絶食させた後、ウレタン麻酔下（1g/kgのウレタン水溶液を腹腔内投与内）で、上記で調製した被験試料（ミルセン希釈懸濁液）、またはコントロールとして対照試料（水）を経鼻的に摂取させて、脾臓交感神経の遠心枝の神経活動（電気活動）の変化を測定した（各群３匹ずつ）。具体的には、3時間絶食後、明期の中間期にウレタン麻酔下に開腹し、脾臓交感神経を銀電極で吊り上げ、既述の方法(Tanida et al. Am. J. Physiol. 288: R447-R455 (2005))にて、脾臓交感神経の変化を測定した。この測定値が落ち着いた時期(13時頃)に、ウレタン麻酔ラットの鼻先に被験試料または対照試料を染みこませた綿花をいれたビーカーを配置し、既述の方法(Shen et al. Neurosci. Lett. 380:289-294 (2005))にて10分間、匂い刺激して、脾臓交感神経活動（splenic sympathetic nerve activity、Splenic-SNA）の変化を、実験例２の方法と同様にして電気生理学的に測定した。
　脾臓交感神経の活動のデータは5分間毎の5秒あたりの発火頻度(pulse/5 s)の平均値にて解析し投与前の値を100％として百分率で表した。
　（２）実験結果
　結果を図１２に示す。なお、図１２の（Ａ）は実測データであり、（Ｂ）はこの実測データを、投与前の実測データ（スパイク数）を100％として、5分毎の平均値でグラフ化したものである（0－60分間）。なお、図１２（Ａ）の左欄は対照として水を投与したラット（Water投与群）の実測データ〔図１２（Ｂ）：---●---〕、右欄は被験試料を投与したラット（Myrcene投与群）の実測データ〔図１２（Ｂ）：―●―〕を示す。
　図１２（Ａ）および（Ｂ）からわかるように、Water投与群の脾臓交感神経の活動は、水投与前と殆ど変わらず、水刺激によっては脾臓交感神経の活動を殆ど変化しなかったが、Myrcene投与群の脾臓交感神経の活動は著明に低下した（P<0.005, F=127 by ANOVA）。
　これらの結果からわかるように、被験試料（ミルセン希釈混濁液）の経鼻投与によって、脾臓交感神経の活動は有意に低下し、またヌードマウスに移植した腫瘍は、その増殖が有意に抑制されることが確認できた。すなわち、実験例３と４の結果からも、実験例１と２で示すように、脾臓交感神経活動の抑制と腫瘍の増殖率とは良好な相関関係にあり、脾臓交感神経活動の低下は、腫瘍の増殖低下を反映することが確認された。
本発明で使用する脾臓交感神経の電気活動の測定方法を示す概略図である。 水またはアルギニンとリジンの混合物（2mM、10mM、50mM）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウスに経口投与した場合に、HCT116ヒト大腸癌細胞移植によって形成される腫瘍（腫瘍細胞の増殖）の大きさを、経時的に測定した結果を示す。各値は、各群４匹のマウスの平均値を示す。 水またはアルギニンとリジンの混合物（2mM、10mM、50mM）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウス（n=4）に経口投与した後、28日目の腫瘍形成の様子を示す。 水またはアルギニンとリジンの混合物（2mM、10mM、50mM）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウス（n=4）に経口投与した後、28日目に摘出した腫瘍を示す。 水またはアルギニンとリジンの混合物（2mM、10mM、50mM）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウス（n=4）に経口投与した後、28日目に摘出した腫瘍の重量を測定した結果を示す。 （Ａ）は水またはアルギニンとリジンの混合物（2mM、10mM、50mM）を経口投与した場合の脾臓交感神経の遠心枝の活動（電気活動）の経時的変化（実測データ）を示す図である。（Ｂ）はそれをグラフ化したものである（実験例１）。なお、（Ｂ）の縦軸は脾臓交感神経の電気活動を意味し、各被験物質を経口投与する前（０分）の電気活動を100％としてグラフ化した。 脾臓交感神経活動の抑制率と腫瘍細胞の増殖率（％）との相関関係を示す図である。 水またはミルセン（10,000倍希釈懸濁液）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウスに経鼻摂取させた場合に、HCT116ヒト大腸癌細胞移植によって形成される腫瘍（腫瘍細胞の増殖）の大きさを、経時的に測定した結果を示す。各値は、各群５匹のマウスの平均値を示す。 水またはミルセン（10,000倍希釈懸濁液）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウス（n=5）に経鼻摂取させた後、21日目の腫瘍形成の様子を示す。 水またはミルセン（10,000倍希釈懸濁液）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウス（n=5）に経鼻摂取させた後、21日目に摘出した腫瘍を示す。 水またはミルセン（10,000倍希釈懸濁液）を、HCT116ヒト大腸癌細胞を移植したBALB/Cマウス（n=5）に経鼻摂取させた後、21日目に摘出した腫瘍の重量を測定した結果を示す。 （Ａ）は水またはミルセン（100倍希釈懸濁液）を経鼻摂取させた場合の脾臓交感神経の遠心枝の活動（電気活動）の経時的変化（実測データ）を示す図である。（Ｂ）はそれをグラフ化したものである（実験例４）。なお、（Ｂ）の縦軸は脾臓交感神経の電気活動を意味し、各被験物質を経鼻摂取させる前（0分）の電気活動を100％としてグラフ化した。

Claims (8)

  1. 　下記の工程を有することを特徴とする、被験物質の抗腫瘍作用を評価する方法：
    (1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程。
  2. 　さらに下記の工程を有する、請求項１に記載する抗腫瘍作用の評価方法：
    (2)被験物質を投与した非ヒト動物の脾臓交感神経の活動が、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動よりも低下する場合に、当該被験物質について抗腫瘍作用があると判断する工程。
  3. 　脾臓交感神経活動の測定を、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行う、請求項１または２に記載する抗腫瘍作用の評価方法。
  4. 　下記の工程を有することを特徴とする、被験物質の中から抗腫瘍作用を有する物質をスクリーニングする方法：
    (1)被験物質を非ヒト動物に投与し、当該非ヒト動物の脾臓交感神経の活動を測定する工程、
    および
    (2)上記で得られた脾臓交感神経の活動を、被験物質を投与しない非ヒト動物の脾臓交感神経の活動（コントロール）と対比し、上記活動がコントロールよりも低くなる被験物質を、抗腫瘍作用を有する候補物質として選抜する工程。
  5. 　脾臓交感神経活動の測定を、脾臓交感神経の遠心枝の電気活動を測定することによって行う、請求項４に記載するスクリーニング方法。
  6. 　請求項１乃至３のいずれかに記載する評価方法によって腫瘍に対して抗腫瘍作用があると判断された、アルギニンとリジンの混合物、またはミルセンを有効成分とする抗腫瘍剤。
  7. 　請求項６に記載する抗腫瘍剤を、腫瘍を有するヒトまたは動物に適用する、抗腫瘍方法。
  8. 　請求項１に記載する方法によって抗腫瘍作用があると評価されるアルギニンとリジンの混合物、またはミルセンの、抗腫瘍剤としての使用。
PCT/JP2008/070315 2008-04-30 2008-11-07 抗腫瘍作用の評価方法、およびこれを用いた抗腫瘍物質のスクリーニング方法 WO2009133642A1 (ja)

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