WO2009103898A1 - Peptide derive du recepteur 3 de la neurotensine et utilisation dans le traitement de maladies psychiatriques - Google Patents

Peptide derive du recepteur 3 de la neurotensine et utilisation dans le traitement de maladies psychiatriques Download PDF

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WO2009103898A1
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peptide
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mice
depression
fragment
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PCT/FR2008/001784
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Jean Mazella
Olivier Petrault
Marc Borsotto
Catherine Heurteaux
Catherine Widmann
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Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs
Université de Nice Sophia Antipolis
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a peptide derived from neurotensin receptor 3 (NTSR3) and its use in the treatment of psychiatric diseases.
  • NTSR3 neurotensin receptor 3
  • the present invention relates in particular to the use of this peptide for the manufacture of a medicament, for example an antidepressant.
  • the present invention finds application in the pharmaceutical industry and in particular in the fields of drug development used in the treatment of psychiatric diseases.
  • SSRI selective serotonin reuptake inhibitors
  • SNRI serotonin norepinephrine reuptake inhibitors
  • TCAs tricyclic antidepressants
  • MAOIs irreversible and non-reversible monoamine oxidase inhibitors
  • glucocorticoids are generally associated with a negative effect of mood, as well as structural alterations of the hippocampus, via a decrease in BDNF synthesis ("brain- derivated neurotrophic factor "), excessive secretion of glutamic acid and / or decreased glucose uptake as described in Manji HK, Gottesman II, Gould TD. "Signal transduction and genes-to-behavioral pathways in psychiatric diseases” Sci STKE; 207: pe49 (2003) (6). 7] In accordance with these observations, inhibitors of glucocorticoid synthesis and glucocorticoid receptor antagonists exert AD-like effects as described in Reus Vl, Wolkowitz OM. "Antiglucocorticoid drugs in the treatment of depression” Expert Opin Investig Drugs; 10: 1789-1796 (2001) (7).
  • Antagonists acting on the substance P receptors, in particular NK1, or the CRF receptor ("corticotropin-releasing factor"), as well as NMDA receptor antagonists have been developed with some effectiveness (see Griebel G, Simiand J, Steinberg R, et al., "4- (2-Chloro-4-methoxy-5-methylphenyl) -N - [(1S) -2-cyclopropyl-1- (3-fluoro)
  • AD Alzheimer's disease
  • CREB CREB
  • Bcl2 MAP kinases
  • MAP kinases a factor involved in the survival and growth of cells
  • the functional importance of these neoformed neurons in the pathophysiology of mood disorders remains controversial (see Henn FA, Vollmayr B. "Neurogenesis and depression: etiology or epiphenomenon?” Biol Psychiatry, 56: 146-50 (2004) (14)).
  • All of these indications show that depression is a complex disease whose pathophysiology is multifactorial and, consequently, the treatment of such a pathology remains a challenge.
  • monoaminergic neurotransmitters are indisputably implicated, the number of hypotheses about the pathophysiology of depression and the mechanisms of action of ADs has continued to evolve.
  • antidepressants may induce tachycardia, weight gain, decreased libido, decreased access, decreased appetite, and neurological changes, such as headache, stroke, and stroke. epileptic seizures.
  • AD drugs used today produce a range of side effects, including dry mouth, blurred vision and impaired bowel function (diarrhea or constipation).
  • side effects are transient (such as nausea), some appear to be constant over time (such as sexual effects) and may to affect attendance at long-term treatment. This is why the search for new molecules acting on newly identified receptors or channels in depression is crucial.
  • Certain proteins have been implicated in the molecular mechanisms of depression.
  • NTSR3 neurotensin receptor 3
  • TREK-1 the inactivation of which in the mouse produces a phenotype of resistance to depression
  • the present invention is precisely to respond to the need and to solve the disadvantages of the prior art.
  • the maturation of NTSR3 releases a peptide, called propeptide, which becomes a ligand of this same type of receptor.
  • propeptide is also able to block the activity of the TREK-1 channel.
  • NTSR3 is synthesized in the form of a precursor
  • This peptide is capable of binding to the mature (NTSR3) receptor. Structure-function relationships studies show that a 17-acid part Amines of this peptide carry all the binding activity on the receptor. This part of the peptide is as follows:
  • This sequence SEQ ID No. 2 corresponds to the underlined part of the large peptide. It is this peptide (which we have named propeptide) which has been used in the experiments described below. [032]
  • the present invention thus relates to the peptide of sequence ID
  • fragments are such that they retain the ligand property of the neurotensin receptor 3 (NTSR3) that the peptide of the present invention possesses.
  • NTSR3 neurotensin receptor 3
  • the peptide of the invention will be called “peptide” or “propeptide”.
  • derivatives or fragments can also be considered as analogs of the peptide of the present invention.
  • the present invention also relates to a nucleic acid sequence encoding a peptide or a fragment or a derivative of this peptide.
  • GenBank Accession Numbers for Sortin SORT Messaging RNAs GenBank Accession Numbers for Sortin SORT Messaging RNAs
  • the present invention also relates to a vector comprising a nucleic acid sequence according to the invention. It may be any suitable vector for the transformation of a host cell for making by said cell, by a genetic recombination technique, the peptide of the present invention, or fragment or derivative thereof.
  • the vector can be obtained from a vector chosen, for example, from the group consisting of pIRES and pRES2 and their derivatives, pcDNA3 and its derivatives, pGEX and its derivatives.
  • the present invention thus also relates to a host cell comprising a peptide or a fragment or a derivative of this peptide according to the present invention and / or a nucleic acid sequence according to the present invention and / or a vector according to the invention.
  • the host cell may be any cell suitable for transformation and manufacture of said peptide of the invention or fragment or derivative thereof. It may be, for example, COS-7, HEK 293 and derived, N1 E1 and related cells.
  • the present invention therefore also relates to a process for producing a peptide or fragment or derivative thereof comprising the following steps: transfecting a host cell with a nucleic acid of the invention or transforming a host cell with a vector of the invention; cultivating said host cell under conditions permitting the expression of the peptide of sequence ID No. 2 or fragment or derivative of this peptide; and
  • transfection and transformation techniques used to manufacture the peptide of the present invention or fragment or derivative thereof are those known to those skilled in the art, for example those described in Krieger DE, Erickson BW, Merrifield RB . "Affinity Purification of Synthetic Peptides” Proc Natl Acad Sci U S A .; 73: 3160-3164 (1976) (16).
  • the preferred method of manufacture of the peptide is chemical synthesis, for example in the solid phase. Any technique known to those skilled in the art can be used.
  • the peptide can be synthesized according to the solid phase technique of Krieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. Proc Natl Acad Sci Affinity purification of synthetic peptides
  • the molecule of the present invention opens a new way in the establishment of a new class of antidepressants and new therapeutic strategies for psychiatric diseases.
  • the present invention thus also relates to the use of a peptide or fragment or derivative of this peptide according to the invention as a medicament.
  • the present invention relates to the use of a peptide or fragment or derivative thereof for the manufacture of a medicament for the treatment of psychiatric disorders, for example for the manufacture of an antidepressant and / or an anti-pain.
  • the peptide of the present invention or fragment or derivative thereof, as defined above is a natural product which constitutes a new type of antidepressant. It avoids all undesirable side effects of drugs currently used for the treatment of psychiatric disorders.
  • the side effects of the drugs used in the prior art come from their chemical nature. These drugs of the prior art are molecules that often have the property of passing the Passive cellular membranes, resulting in non-specific interactions with intracellular effectors.
  • the peptide or pseudo-peptide character of the peptide of the present invention makes it possible to avoid this problem.
  • the direct action of the peptide of the present invention on the potassium channel TREK-1 could well reduce the time of action, often long of a conventional antidepressant (see prior art above).
  • the TREK-1 channel is sensitive to stretching, osmolarity and temperature. The inventors have demonstrated that TREK-1 is one of the molecular censors involved in the perception of pain.
  • KO knock-out mice are more sensitive to pain and heat sensations. This phenotype is localized on polymodal C-fibers, which are more sensitive to heat. KO mice are also more sensitive to low threshold mechanical stimuli and show increased thermal and mechanical hyperalgesia under ignition conditions.
  • TREK-1 a K + channel involved in polymodal pain perception
  • EMBO J; 25: 2368-2376 (2006) (17) refers to the TREK-1 channel as a very attractive target for the development of new analgesics. Therefore any molecule active on these TREK-1 channels can have significant therapeutic benefits in the field of nociception.
  • NTSR3 is involved in inflammation.
  • the inventors have demonstrated that NTSR3 was responsible for the effects of neurotensin (NT) on the migration and release of inflammatory cytokines from microglial cells (see Martin S, JP Vincent, Mazella J. "Involvement of the neurotensin receptor-3 in the Neurotensin-induced migration of human microglia J Neurosci 23: 1198-1205 (2003) (18) and Martin S, Dicou E, Vincent JP, Mazella J. "Neurotensin and the neurotensin receptor-3 in microglial cells” J Neurosci Res .; 81: 322-326 (2005) (19).
  • the peptide of the present invention has the property of antagonizing the effects of NT. Therefore, any molecule capable of blocking the pro-inflammatory effects of NT can have significant therapeutic benefits in the field of brain inflammation. [050] Other advantages may appear to those skilled in the art on reading the examples which follow, given of course by way of illustration and non-limiting with reference to the appended figures.
  • FIG. 1 represents a Western blot prepared from membrane extracts of COS-7 cells transfected with the TREK-1 channel with or without the NTSR3 receptor, immunoprecipitated by an anti-TREK-1 antibody and where the NTSR3 receptors / sortilin are revealed using an anti-sortilin antibody.
  • FIG. 2 represents curves reporting experimental results of measurements of inhibition of TREK-1 channel activity.
  • A on the abscissa, is represented the density of the current I (pA / pF) and on the ordinate, the applied voltage (V), expressed in mV.
  • V applied voltage
  • the traces representing the amplitude of the current to the different values of the potentials.
  • Control reference conditions, AA, activation of the current with 10 ⁇ M of arachidonic acid, AA + PE, activation of the current with 10 ⁇ M of arachidonic acid in the presence of 10 ⁇ M of PE.
  • Figure 4 shows histograms reporting experimental results of also resignation tests (Conditioned Suppression of Motility) and TST (Tail Suspension Test) with different substances injected.
  • CMST graph On the abscissa, the number of passages from one cell to another and the number of adjustments and on the ordinate, the different substances tested.
  • TST graph On the x-axis, the time during which the animal remains immobile (in seconds - sec) and on the ordinate, the various substances tested.
  • Figure 5 shows a graph of neurogenesis measurement in the presence of physiological saline, fluoxetine or the peptide of the present invention injected for 2 weeks. On the abscissa, the number of BrdU-positive cells.
  • Figure 6 shows histograms reporting pain sensitivity tests (left: hot plate test (right tail flick test).) On histograms A and B, on the y-axis, the time that the mouse reacts in seconds and abscissa, the injected solutions in the mice [057]
  • Figure 7 represents a histogram reporting epileptic seizures in mice On the histogram, the ordinate represents the number of The measurement is made according to the kainate injection at 30 mg / kg in mice treated with 100 ⁇ l of physiological saline or with 100 ⁇ l of a 10 '5 M solution of mice and on the x-axis of the epilepsy.
  • FIG. 8 shows a histogram of quantification of infarct size caused by focal ischemia (cerebral stroke model) in mice. the ordinate represents the volume of the infarct and the abscess isse the solution injected: either a saline solution (“SERUM PHY”) or a propeptide solution (“PE 10 " 5 M ").
  • Figure 9 shows a histogram showing the intake of beverages and food at 6 h and 72 h after the last treatment in mice injected daily for 15 days. On the histogram, the ordinate represents the weight in grams and abscissa the injected solutions: saline solution ("SERUM PHY”) or a solution of propeptide at a concentration of 10 '5 M (“PE 10 " 5 M ").
  • Figure 10 shows a histogram representing neurogenesis in mice after 4 days of treatment. On the histogram, the ordinate represents the number of Bromodeoxyuridine-positive cells (BrdU) and on the abscissa the injected solutions: saline solution ("SERUM").
  • the inventors have undertaken electrophysiology experiments to demonstrate the inhibition of the activity of the TREK-1 channels by the propeptide of the present invention and various so-called behavioral tests aimed at validating the antidepressant property of the propeptide. Indeed, the team of Dr. C. Heurteaux has demonstrated that the invalidation in the mouse of the TREK-1 channel gene (TREK-1 ⁇ or KO-TREK-1) conferred on animals a phenotype of resistance to depression. measured through behavior tests recognized as being related to depression (15). Therefore, any molecule capable of either inhibiting TREK-1 channels or reproducing TREK-1 " -7-like behavior may be considered potentially antidepressant. [062] The inventors have also performed colocalization experiments between TREK-1 and the sortilin on sections of the brainstem of mice.
  • Example 1 Tests on TREK-1 [063] The team of Catherine Heurteaux has shown that the potassium channel TREK-1 could be a target for the treatment of depression and that antagonists of this channel could have the property of be powerful antidepressants. [064] TREK-1 is regulated by neurotransmitters that modulate the level of cAMP via receptors that activate the Gq protein pathway such as the 5-HT (serotonin) receptor. The deletion of TREK-1 results in an anti-depression phenotype with an effective increase in 5-HT neurotransmission. KO-TREK-1 mice develop a behavior similar to that of naive mice treated with conventional antidepressants (15).
  • NTSR3 also called sortilin.
  • This multifunctional protein can indeed act as a receptor or co-receptor and has several ligands such as neurotensin, lipoprotein lipase and the propeptide released during the maturation of the precursor of NTSR3 / sortiline.
  • This propeptide is a specific antagonist of the effects of neurotensin.
  • NTSR3 / sortiline also plays a role in addressing other proteins on the cell surface.
  • the proteins thus precipitated are deposited on an SDS-PAGE gel and then transferred to nitrocellulose.
  • the NTSR3 / sortilin protein is detected using an anti-NTSR3 / sortiline antibody.
  • COS-7 cells cell line derived from African green monkey kidney fibroblasts Cercopithecus aethiops. These cells are seeded at a density of 20,000 cells / dish of 35 mm diameter, 24 hours before being transfected by the DEAE-dextran method with 1 ⁇ g of plRES-EGFP-TREK-1 plasmid. Current measurements are performed 48 to 72 hours after transfection.
  • COS-7 cells ATCC reference:
  • CRL-1651 are cultured in DMEM (Gibco) / 10% fetal calf serum (FCS) at 37 ° C in the presence of 5% CO 2.
  • Electrophysiological measurements all measurements are made at room temperature, that is, at 21-22 ° C. The cells that were transfected with the plasmid are identified by the fluorescence emitted by the EGFP after excitation at 480 nm.
  • the cell culture medium is replaced by a 150 mM NaCl solution, 5 mM KCl, 3 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 , 10 HEPES / NaOH pH 7.4 containing 10 mM tetraethyl ammonium chloride, 3 mM 4 - Aminopyridine.
  • the cells are perfused continuously with this solution.
  • the resting potential of the membrane of the measured cell is set at -80 mV.
  • the voltage variations are obtained either by continuous ramp (from -100 to + 50mV) or by potential jump of 1OmV (from -100 to +40mV, 1.5 seconds per jump).
  • the inventors have performed three types of behavioral experiments considered as conventional for determining the antidepressant activity of a substance (Nestler EJ., Gould E., Manji H., Buncan M., Duman R. S.,
  • the propeptide is dissolved in a 0.9% NaCl saline solution at the desired concentrations: 10 -5 M, 10 -6 M, 10 -7 M and 10 -8 M.
  • Various volumes are injected according to the technique used. :
  • FST Forced swimming Test
  • the experiment consists, 30 min after injection of the substance to be tested, to immerse the mouse for 6 minutes in a container 15 cm in diameter, 30 cm in height containing 11 cm of water at 22 ° C and measure the time of immobility during the last 4 minutes. Mice treated with antidepressants have lower immobility times than control mice.
  • the inventors have tested different injection routes for the peptide and the saline solution: intra-cerebroventricular (ICV), intravenous (IV) or intraperitoneal (IP). Only IP injections were used to administer fluoxetine. A control with an injection of physiological saline was performed.
  • mice treated with the propeptide have the same behavior as mice
  • the propeptide of the present invention was administered IV at 100 ⁇ l to 1 ⁇ M per animal.
  • mice treated with antidepressants have decreased immobility times compared with the control mice.
  • C Conditioned Motility Suppression Test (CMST) (see Daugé, V., Sebret, A., Beslot, F., Matsui, T., & Roques B. "Behavorial profile of CCK2 receptor-deficient mice Neuropsychopharmacol 25: 690-698 (2001) (23) [094] The experiment consists of conditioning the mouse on day 1 and, on day 2, measuring the effects of the substances.
  • CMST Conditioned Motility Suppression Test
  • each mouse is placed in a box where the floor is a metal grid connected to an electrical stimulator.
  • the conditioning consists in generating 30 sequences consisting of an electric shock (200ms to 1, 8 mA) followed by 12 seconds of latency (total conditioning time: 6 minutes)
  • the mice are then caged and allowed to recover for 24 hours
  • Day 2 the mice are injected with the various substances tested and after 30 minutes, they are placed in the box that was used for packing and where the floor was divided into 6 identical boxes No electric shock is delivered.
  • the measurement is made by manually counting for 6 minutes the number of times each mouse changes box or stands up.
  • propeptide of the present invention acts intravenously or intraperitoneally as well as intracisternally indicates that it easily passes the blood-brain barrier (BBB) to exert its effects. This property opens the possibility of chronic and easily transposable treatments for clinical tests.
  • BBB blood-brain barrier
  • Antidepressant treatments are known to increase neurogenesis in the hippocampus (Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O,
  • the animals are injected IP with 300 .mu.l of an aqueous solution of 10mM BrdU, and then caged.
  • the animals are euthanized and the tissues are fixed thanks to the intracardiac infusion of a cold solution of 4% paraformaldehyde.
  • the brains are removed and frozen at -20 ° C.
  • 40 ⁇ m serial sections are prepared, so as to cover the entire hippocampus structure, using a vibratome (Leica).
  • One in six sections is used to measure BrdU incorporation using a mouse monoclonal anti-BrdU antibody (Becton Dickinson). This primary antibody is revealed by a secondary antibody coupled with biotin and avidin-peroxidase.
  • Peroxidase activity is visualized by hydrolysis of DAB. The cells thus marked are counted on each section. For each group, saline solution, propeptide or fluoxetine, the numbers of BrdU labeled cells of each section are added and multiplied by six so as to consider the entire structure. Each group consists of 3 mice, the results expressed are the average of the three animals.
  • FIG. 5 shows the measurement of neurogenesis.
  • the physiological serum (“SERUM PHY”) and the propeptide 10 ⁇ M (“PE 10 " 5 M ”) were injected for 2 weeks, fluoxetine was also administered by the drinking water, solution at 80 mg / l for 2 weeks, demonstrated period necessary to obtain efficacy of fluoxetine. ** p ⁇ 0.01, * p ⁇ 0.05 These results clearly demonstrate that the propeptide induces significant neurogenesis comparable to that induced by fluoxetine. There is no significant difference between the measurements obtained with the propeptide and those obtained with fluoxetine (one-way ANOVA test followed by the post-hoc test).
  • Example 5 Effects of Propeptide on Pain 09]
  • the peptide of the invention inhibits the activity of TREK-1 channels.
  • the main possible side effects are those induced by blocking the activity of TREK-1 channels. Indeed, the work of the team of C. Heurteaux (C Heurteaux, Guy, N., Laigle, C.Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann , C. et al., TREK-1, K (+) channel involved in neuroprotection and anterhesia "EMBO J, 23: 2684-2695 (2004) (25) and Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Christmas J,
  • the sensitivity to pain was measured with two tests: the hot plate test and the tail flick test.
  • This test is to measure the time that puts a mouse to lick the hind legs when it is placed on a plate maintained at a given temperature. Two temperatures were used: 50 and 56 ° C. The mice used were C57BL6 / J mice. Each group consisted of 10 mice.
  • mice received no injection
  • the second group of mice received an intravenous injection of 100 ⁇ l of physiological saline ("SERUM PHY")
  • the third group received an injection of 100 ⁇ l of solution comprising the peptide of the invention at a concentration of 10 ⁇ 6 M (“PE 10 " 6 M ").
  • the measurement of the statistical difference was performed using the ANOVA test, a factor followed by the post-hoc test.
  • mice 48 ° C and to measure the time it takes to remove it from the bath.
  • a habituation test was performed on the mice. It consists of immersing the tail of each animal twice in the bath so as to have homogeneous groups before any treatment (obtaining a reaction time of less than 12 seconds). Then 100 ⁇ l of physiological saline
  • mice SERUM PHY
  • PE 10 -6 M 100 ⁇ l of peptide of sequence ID No. 2 at a concentration of 10 -6 M
  • the mice used were C57BL6 / J mice. Each group consisted of 10 mice. The measurements were made 30 minutes after injection.
  • the results presented in Figure 6B indicate that there is no significant difference between the two groups of mice: saline: 7.0 +/- 0.6 sec and PE: 8.3 +/- 0, 7 sec.
  • the evaluation of the difference was carried out using the Student t test. This test confirmed that there was no significant difference between the two groups.
  • mice used were C57BL6 / J at the rate of 10 mice per experimental group: a "Physiological Serum” group, which received an intraperitoneal injection of 100 ⁇ l of physiological saline and a "PE 10 ⁇ " group. 5 M ", in which the mice received a intraperitoneal injection of 100 ⁇ l of a solution comprising the peptide of the invention at a concentration of 10 5 M.
  • epileptic seizures were induced by intraperitoneal injection of 100 ⁇ l of kainate at a rate of 30 mg / ml. kg. The observation of the epileptic seizure stage was made 90 minutes after the injection of
  • Stage 1 stillness
  • Stage 2 movements of the head and neck Stage 3 unilateral clone activity
  • Stage 4 Bilateral Clonal Activity
  • Stage 5 Generalized Convulsions
  • Stage 6 Animal Death [0128]
  • the results presented in Figure 7 show that not only does the peptide of the invention not worsen kainate-induced seizures but that contrary it can have a beneficial effect since only 2 animals injected with peptide reached stage 5 against 5 in the group "Physiological serum”. In addition the only dead animal was in the group "Physiological Serum”.
  • the model used to induce stroke is that of focal ischemia, which consists of occlusion by a filament of the middle cerebral artery.
  • Mouse brains the C57BL6 / J (at 10 mice per experimental group) were treated for a week with a daily intraperitoneal injection of 100 .mu.l of a solution comprising either the peptide of sequence ID No. 2 at a concentration of 10 "5 M (PE group
  • SERUM PHY physiological saline
  • Example 9 Measurement of the Propeptide Action Time [0139]
  • the effectiveness of the peptide of the invention is very fast. Indeed, one of the experimental ways to demonstrate the effectiveness of antidepressants is to measure neoneurogenesis (Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee , J, Duman, R, Arancio, O, Belzung, C, Hen, R et al., "Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants" Science, 301: 805-809 (2003) (24).
  • antidepressants such as fluoxetine
  • depression is associated with atrophy of pyramidal cells.
  • FIG. 10 indicate a high rate of action of the peptide in the induction of neurogenesis.
  • the neurogenesis induced by fluoxetine (“FLUOXETINE, 3 mg / kg") is identical to that induced by the injection of physiological saline ("SERUM
  • the peptide of the invention can be used to treat psychiatric diseases, inflammatory and / or painful phenomena.
  • the peptide of the invention does not induce the known side effects of the antidepressants of the state of the art and has a delay in action less than the antidepressants of the state of the art, that is to say to say a superior speed of action.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un peptide dérivé du récepteur 3 de la neurotensine (NTSR3) et à son utilisation dans le traitement de maladies psychiatriques. La présente invention se rapporte en particulier à l'utilisation de ce peptide pour la fabrication d'un médicament, par exemple un antidépresseur. Le peptide de l'invention est caractérisé en ce que sa séquence est la SEQ ID n°2 annexée. La présente invention trouve une application dans les secteurs de l'industrie pharmaceutique et notamment dans les domaines de développement du médicament dans le traitement des maladies psychiatriques. La présente invention trouve en particulier une application dans le développement d'un nouvel antidépresseur. Elle trouve par exemple également une application dans le traitement de la douleur et des processus inflammatoires.

Description

Description
PEPTIDE DERIVE DU RECEPTEUR 3 DE LA NEUROTENSINE ET UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DE MALADIES PSYCHIATRIQUES
Domaine technique de l'invention
[001] La présente invention se rapporte à un peptide dérivé du récepteur 3 de la neurotensine (NTSR3) et à son utilisation dans le traitement de maladies psychiatriques. La présente invention se rapporte en particulier à l'utilisation de ce peptide pour la fabrication d'un médicament, par exemple un antidépresseur.
[002] La présente invention trouve une application dans les secteurs de l'industrie pharmaceutique et notamment dans les domaines de développement du médicament utilisé dans le traitement des maladies psychiatriques.
[003] La présente invention trouve en particulier une application dans le développement d'un nouvel antidépresseur. Elle trouve également une application dans le traitement de la douleur. [004] Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses (x) renvoient à la liste des références à la fin des exemples.
Art antérieur
[005] Les maladies psychiatriques représentent un réel problème de Santé
Publique. Les travaux les plus récents ont confirmé la forte prévalence de la dépression : sur leur vie entière, 20% des femmes et 10% des hommes ont fait, font ou feront un épisode dépressif comme décrit dans ,Wong, M. & Licinio, J. «Research and treatment approaches to dépression » Nat Rev Neurosci. 2, 343-351 (2001) (1). De tels chiffres sont à l'évidence marquants; ils le sont plus encore lorsqu'on s'intéresse à la complication majeure de la dépression, le suicide, qui se chiffre à 12000 décès par an dans des pays comme la France comme décrit dans Moller HJ. «Suicide, suicidality and suicide prévention in affective disorders » Acta Psychiatr Scand 418 (suppl) : 73-80 (2003) (2). [006] La dépression est une maladie très fréquente et souvent handicapante. Elle peut toucher jusqu'à 20% de la population dans les pays industrialisés. Ses origines sont diverses et multiples. Cette pathologie affecte aussi bien le psychisme que le comportement et la physiologie des patients. Les traitements de la dépression sont également multiples et les mécanismes d'action des médicaments utilisés ne sont pas clairement établis. [007] L'organisation mondiale de la santé (OMS) prévoit que la dépression unipolaire sera la deuxième cause de handicap en 2020. A la souffrance personnelle et familiale que représente la dépression s'ajoute le poids social important de cette pathologie. La dépression représente déjà l'une des premières causes d'arrêt du travail, avec une charge économique qui s'élève à plus de 30 milliards d'euros par an. Malgré l'arsenal thérapeutique mis à disposition du corps médical, en particulier les SSRI («sélective serotonin reuptake inhibitors ») et SNRI («serotonin norepinephrine reuptake inhibitors »), 30% de la population dépressive n'a pas de traitement. Par ailleurs, le délai d'action des antidépresseurs est de l'ordre de 3 à 6 semaines et les effets secondaires sont souvent importants.
[008] D'une façon générale, on estime que 15% des patients déprimés décèdent par suicide. Chez la plupart des malades, la dépression est due à l'interaction entre une prédisposition génétique et des facteurs environnementaux comme le stress ou les traumatismes émotionnels comme décrit dans Nestler E. Barrot M., DiLeone R. J.,Eisch A. J. ,GoId S. J.,Monteggia, L. M. «Neurobiology of dépression » Neuron 34, 13-25 (2002)
(3). [009] La maladie est fréquente et le marché des antidépresseurs (AD) est immense (au moins 10 milliards d'euros par an).
[010] Néanmoins, si ces antidépresseurs améliorent l'état des patients dans environ 70% des cas, ils n'entraînent une rémission complète de la maladie que chez 30 à 40% d'entre eux. De plus, près d'un tiers des sujets traités résiste aux traitements existants. Cet état de fait oblige donc à envisager de nouveaux traitements, capables de prendre en compte les mécanismes de la dépression (3). [011] Dans l'arsenal thérapeutique mis à disposition du corps médical, les antidépresseurs tricycliques (TCA) avec l'amitriptyline et l'imipramine ont été les premiers découverts, suivis par les inhibiteurs de la monoamine oxydase (IMAO), irréversibles et non sélectifs comme la phénelzine et la pargyline. Les effets indésirables, en particulier la cardiotoxicité des TCA (surtout en cas de surdosage) et les crises hypertensives des IMAO (interactions avec la tyramine alimentaire, le fameux « cheese effect ») ont poussé la recherche vers de nouvelles molécules d'efficacité thérapeutique identique mais de meilleure acceptabilité. [012] La notion de sélectivité est alors apparue avec les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la noradrénaline (NA) ou de la sérotonine (5- hydroxytryptamine ou 5-HT). Les essais cliniques de phase III ont démontré pour ces nouvelles molécules une efficacité équivalente aux antidépresseurs de première génération et une meilleure sécurité, notamment en cas de surdosage.
[013] Les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la sérotonine (ISRS) et les inhibiteurs spécifiques de la recapture de la noradrénaline (ISRN) sont actuellement les molécules les plus utilisées comme décrit dans Baghai TC, VoIz HP, Moller HJ. « Drug treatment of dépression in the 2000s: An overview of achievements in the last 10 years and future possibilities » World J Biol
Psychiatry; 7: 198-222 (2006) (4) et dans Weilburg JB. «An overview of SSRI and SNRI thérapies for dépression » Manag Care, 13 (6 Suppl Dépression): 25-33 (2004) (5). Les AD sont ainsi le plus souvent associés à une facilitation de la transmission des systèmes monoaminergiques. [014] Bien que la sérotonine, la noradrénaline et la dopamine sont impliquées de façon certaine, il est admis aujourd'hui que les modifications des taux de monoamines produites par les AD et les processus adaptatifs qui en découlent, en particulier l'altération de la sensibilité de certains de leurs récepteurs, ne peuvent expliquer à eux seuls le mécanisme d'action des antidépresseurs.
[015] Ainsi, il est difficile de corréler le délai de 3 à 6 semaines nécessaire à l'obtention des AD avec l'augmentation des taux synaptiques de monoamines, qui intervient dès la première administration du produit. En près d'un demi- siècle, le nombre d'hypothèses sur la pathogénèse de la dépression et son traitement n'a cessé d'évoluer.
[016] Par exemple, des concentrations élevées de glucocorticoïdes sont généralement associées à un effet négatif de l'humeur, ainsi que des altérations structurelles de l'hippocampe, par l'intermédiaire d'une diminution de la synthèse de BDNF (« brain-derivated neurotrophic factor »), d'une sécrétion excessive d'acide glutamique et/ou d'une diminution de la capture du glucose comme décrit dans Manji HK, Gottesman II, Gould TD. «Signal transduction and genes-to-behaviors pathways in psychiatrie diseases« Sci STKE; 207 : pe49 (2003) (6). 7] Conformément à ces observations, des inhibiteurs de la synthèse des glucocorticoïdes et des antagonistes des récepteurs de glucocorticoïdes exercent des effets de type AD comme décrit dans Reus Vl, Wolkowitz OM. «Antiglucocorticoid drugs in the treatment of depression« Expert Opin Investig Drugs ; 10 : 1789-1796 (2001 ) (7).
[018] Des antagonistes agissant sur les récepteurs de la substance P, en particulier le NK1 , ou le récepteur CRF (« corticotropin-releasing factor »), ainsi que des antagonistes des récepteurs du NMDA ont été développés avec une certaine efficacité (voir Griebel G, Simiand J, Steinberg R, et al. «4-(2- Chloro-4-methoxy-5-methylphenyl)-N-[(1 S)-2-cyclopropyl-1-(3-fluoro-
4methylphenyl)ethyl]5-methyl-N-(2-propynyl)-1 , 3- thiazol-2-amine hydrochloride (SSR125543A), a potent and sélective corticotrophin-releasing factor (1 ) receptor antagonist. II. Characterization in rodent models of stress- related disorders » J Pharmacol Exp Ther ; 301 : 333-345 (2002) (8); Kramer MS, Cutler N, Feighner J, et al. «Distinct mechanism for antidepressant activity by blockade of central substance P receptors » Science ; 281 : 1640- 1645 (1998) (9) et Skolnick P. «Antidepressants for the new millennium » Eur J Pharmacol ; 375 : 31 -40 (1999) (10). [019] Diverses études récentes réalisées dans des situations de stress et des modèles de dépression ont impliqué la neurogenèse dans l'étiologie des troubles dépressifs majeurs comme décrit dans Kempermann G, Kronenberg G. «Depressed new neurons : Adult hippocampal neurogenesis and a cellular plasticity hypothesis of major dépression» Biol Psychiatry; 54: 499-503 (2003) (11) ; Malberg JE, Schecter LE. Increasing hippocampal neurogenesis: a novel mechanism for antidepressant drugs » Curr Pharm Des; 11 : 145-155 (2005) (12) et Duman, R. & Monteggia, L. «A neurotrophic model for stress- related mood disorders » Biol Psychiatry ; 9 : 1116-1127 (2006) (13). Il a été démontré que tous les traitements chroniques AD1 y compris l'électrochoc, stimulent la prolifération des cellules progénitrices à l'origine des neurones de la couche granulaire de l'hippocampe.
[02O]On sait également que les AD modulent l'expression de différents facteurs impliqués dans la survie et la croissance des cellules, tels que la CREB, le Bcl2 ou les MAP-kinases. Toutefois, l'importance fonctionnelle de ces neurones néoformés dans la physiopathologie des troubles de l'humeur reste controversée (voir Henn FA, Vollmayr B. «Neurogenesis and dépression: etiology or epiphenomenon? » Biol Psychiatry, 56 : 146-50 (2004) (14)). [021] L'ensemble de ces indications montrent que la dépression est une maladie complexe dont la physiopathologie est multifactorielle et, en conséquence, le traitement d'une telle pathologie reste un challenge. [022] Depuis plus de quarante ans, la recherche sur la dépression et le développement de médicaments efficaces ont été dominés par l'hypothèse monoaminergique. Bien que les neurotransmetteurs monoaminergiques (sérotonine, noradrénaline et dopamine) sont impliqués de façon indiscutable, le nombre d'hypothèses sur la physiopathologie de la dépression et les mécanismes d'action des AD n'a cessé d'évoluer.
[023] Les effets secondaires connus des antidépresseurs sont liés aux modes d'action de ceux-ci. Par exemple, les antidépresseurs peuvent induire de la tachycardie, une prise de poids, une baisse de la libido, des accès sudatifs, une baisse de l'appétit et des altérations neurologiques, telles que des céphalées, des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et des crises d'épilepsie. [024] Les médicaments AD utilisés aujourd'hui produisent une gamme d'effets indésirables, parmi lesquels la sécheresse de la bouche, la vision floue et l'altération de la fonction intestinale (diarrhée ou constipation)._Même si beaucoup d'effets secondaires sont passagers (comme la nausée), certains semblent être constants au fil du temps (comme les effets sexuels) et risquent d'affecter l'assiduité au traitement à long terme. C'est la raison pour laquelle la recherche de nouvelles molécules agissant sur des récepteurs ou canaux nouvellement identifiés dans la dépression est cruciale. [025] Certaines protéines (récepteurs et canaux) ont été impliquées dans les mécanismes moléculaires de la dépression. C'est notamment le cas du récepteur 3 de la neurotensine (NTSR3), originellement appelé sortiline et du canal potassique de fond TREK-1 dont l'inactivation chez la souris produit un phénotype de résistance à la dépression (Heurteaux, Lucas, Guy, El Yacoubi, Thϋmmler, Peng, Noble, Blondeau, Widmann et al. «Deletion of TREK-1 , a background potassium channel, results in a dépression-résistant phénotype »
Nature Neurosci.,9, 1134-1141 (2006) (15)). Aucune molécule interagissant efficacement avec ces canaux n'a été identifiée à ce jour. [026] II existe donc un réel besoin de nouvelles molécules utilisables pour le traitement des troubles psychiatriques, notamment de la dépression, molécules plus efficaces, mieux tolérées et ayant une action plus rapide.
Exposé de l'invention
[027] La présente invention a précisément pour rôle de répondre au besoin et de résoudre les inconvénients de l'art antérieur. [028] La maturation du NTSR3 libère un peptide, appelé propeptide, qui devient un ligand de ce même type de récepteur. De façon intéressante, ce propeptide est également capable de bloquer l'activité du canal TREK-1.
[029] En effet, le NTSR3 est synthétisé sous la forme d'un précurseur
(proNTR3-sortiline). La maturation de ce précurseur, effectuée par la furine, libère un peptide (propeptide) de 44 acides aminés dont la séquence est la suivante :
QDRLDAPPPPAAPLPRWSGPIGVSWGLRAAAAGGAFPRGGRWRR
SEQ ID N°1
[030] Ce peptide est capable de se lier au récepteur (NTSR3) mature. Des études de relations structure-fonction montrent qu'une partie de 17 acides aminés de ce peptide porte toute l'activité de liaison sur le récepteur. Cette partie du peptide est la suivante :
APLPRWSGPIGVSWGLR SEQ ID N°2
[031] Cette séquence SEQ ID N°2 correspond à la partie soulignée du grand peptide. C'est ce peptide (que nous avons nommé propeptide) qui a été utilisé dans les expérimentations décrites ci-après. [032] La présente invention se rapporte donc au peptide de séquence ID
N°2 ou à un fragment ou à un dérivé de ce peptide qui est un ligand du récepteur 3 de la neurotensine (NTSR3). Les «fragments» et «dérivés« de ce peptide sont ceux que l'homme du métier peut aisément déduire des séquences ID n°1 ou 2 annexées, par exemple en remplaçant des acides aminés par leur(s) équivalent(s) ou en raccourcissant le peptide sans que son activité en soit modifiée.
[033] Ces «fragments » ou «dérivés » sont tels qu'ils conservent la propriété de ligand du récepteur 3 de la neurotensine (NTSR3) que possède le peptide de la présente invention. Dans la description qui suit, le peptide de l'invention sera appelé « peptide » ou « propeptide ». Les «dérivés ou fragments» peuvent également être considérés comme étant des analogues du peptide de la présente invention.
[034] Le temps de demi-vie in vivo de ce peptide n'est pas encore établi, cependant afin d'améliorer la stabilité ou la biodisponibilité de ce peptide, les inventeurs ont déjà envisagé des modifications sur chacun des acides aminés ainsi que sur la nature des liaisons entre chaque acide aminé. Les modifications sont par exemple les suivantes :
- remplacement d'au moins un acide aminé par un autre de la même famille (aromatique, hydrophobe, basique, etc..) ; - remplacement d'un acide aminé naturel (amino acide L) par le même acide aminé sous forme D ;
- remplacement d'une liaison peptidique entre deux acides aminés par une liaison pseudo-peptidique. [035] Ces modifications génèrent en effet des peptides qui sont résistants à l'attaque protéolytique des peptidases et protéases.
[036] La présente invention se rapporte également à une séquence d'acide nucléique codant un peptide ou un fragment ou un dérivé de ce peptide. Numéros d'accession GenBank pour les ARNmessagers de la sortiline SORT
1 , chez la souris : NM_019972, chez l'Homme : NM_002959. Cette séquence peptidique est par exemple la séquence référencée SEQ ID N°2 sur la liste des séquences annexée. Il peut s'agir de toute séquence appropriée codant le peptide de la présente invention, fragment ou dérivé de celui-ci. Cette séquence est de préférence utilisable pour fabriquer le peptide de la présente invention ou un fragment ou dérivé de celui-ci par transfection. [037] La présente invention se rapporte également à un vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention. Il peut s'agir de tout vecteur approprié pour la transformation d'une cellule hôte en vue de faire fabriquer par ladite cellule, par une technique de recombinaison génétique, le peptide de la présente invention, ou fragment ou dérivé de celui-ci. Le vecteur peut être obtenu à partir d'un vecteur choisi, par exemple, dans le groupe comprenant pIRES et plRES2 et leurs dérivés, pcDNA3 et ses dérivés, pGEX et ses dérivés. [038] La présente invention se rapporte donc également à une cellule hôte comprenant un peptide ou un fragment ou un dérivé de ce peptide selon la présente invention et/ou une séquence d'acide nucléique selon la présente invention et/ou un vecteur selon la présente invention. La cellule hôte peut être toute cellule appropriée pour être transformée et fabriquer ledit peptide de l'invention ou fragment ou dérivé de celui-ci. Il peut s'agir par exemple de cellules COS-7, HEK 293 et dérivées, N1 E1 15 et apparentées. [039] La présente invention se rapporte donc également à un procédé de production d'un peptide ou fragment ou dérivé de celui-ci comprenant les étapes suivantes : - transfecter une cellule hôte avec un acide nucléique de l'invention ou transformer une cellule hôte avec un vecteur de l'invention ; - cultiver ladite cellule hôte dans des conditions permettant l'expression du peptide de séquence ID N°2 ou fragment ou dérivé de ce peptide ; et
- récupérer ledit peptide de séquence ID N°2 ou fragment ou dérivé de ce peptide.
[040] Les techniques de transfection et de transformation utilisables pour fabriquer le peptide de la présente invention ou fragment ou dérivé de celui-ci sont celles connues de l'homme du métier, par exemple celles décrites dans Krieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. «Affinity purification of synthetic peptides » Proc Natl Acad Sci U S A.; 73: 3160-3164 (1976) (16).
[041] Selon l'invention, le procédé de fabrication préféré du peptide est la synthèse chimique, par exemple en phase solide. Toute technique connue de l'homme du métier peut être utilisée. Par exemple, le peptide peut être synthétisé selon la technique en phase solide de Krieger DE, Erickson BW, Merrifield RB. «Affinity purification of synthetic peptides » Proc Natl Acad Sci
U S A; 73: 3160-3164 (1976) (16).
[042] La molécule de la présente invention ouvre une nouvelle voie dans la mise en place d'une nouvelle classe d'antidépresseurs et de nouvelles stratégies thérapeutiques des maladies psychiatriques. [043] La présente invention se rapporte donc également à l'utilisation d'un peptide ou fragment ou dérivé de ce peptide selon l'invention comme médicament.
[044] En particulier, la présente invention se rapporte à l'utilisation d'un peptide ou fragment ou dérivé de ce peptide pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de troubles psychiatriques, par exemple pour la fabrication d'un antidépresseur et/ou d'un anti-douleur. [045] Le peptide de la présente invention ou fragment ou dérivé de celui-ci, tel que défini ci-dessus, est un produit naturel qui constitue un nouveau type d'antidépresseur. Il permet d'éviter tous les effets secondaires non désirables des médicaments actuellement utilisées pour le traitement des troubles psychiatriques. Les effets secondaires des médicaments utilisés dans l'art antérieur proviennent de leur nature chimique. Ces médicaments de l'art antérieur sont des molécules qui ont souvent la propriété de passer les membranes plasmiques cellulaires de manière passive, ce qui entraîne des interactions non spécifiques avec des effecteurs intracellulaires. Le caractère peptidique ou pseudo-peptidique du peptide de la présente invention permet d'éviter ce problème. [046] Par ailleurs, l'action directe du peptide de la présente invention sur le canal potassique TREK-1 pourrait bien diminuer les délais d'action, souvent longs d'un antidépresseur classique (voir art antérieur ci-dessus). [047] En outre, le canal TREK-1 est sensible à l'étirement, à l'osmolarité et à la température. Les inventeurs ont démontré que TREK-1 est l'un des censeurs moléculaires impliqués dans la perception de la douleur. Il est très exprimé dans les neurones sensoriels de petites tailles des ganglions de la racine dorsale de la moelle épinière, il est présent à la fois dans les neurones peptidergiques et non peptidergiques et est colocalisé avec TRPV1 , un canal ionique non sélectif activé par la capsaïne et impliqué dans l'hyperalgésie thermique. Les souris KO (« knock-out ») sont plus sensibles aux sensations de douleur et à la chaleur. Ce phénotype est localisé sur les fibres-C polymodales, qui sont plus sensibles à la chaleur. Les souris KO sont aussi plus sensibles à des stimuli mécaniques de bas seuil et montrent une hyperalgésie thermique et mécanique accrue en conditions d'inflammation. Ce travail, publié dans Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noël J,
Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. «TREK-1 , a K+ channel involved in polymodal pain perception » EMBO J ; 25 : 2368-2376 (2006) (17) désigne le canal TREK-1 comme une cible très intéressante pour le développement de nouveaux analgésiques. Par conséquent toute molécule active sur ces canaux TREK-1 peut avoir des retombées thérapeutiques importantes dans le domaine de la nociception.
[048] En outre le NTSR3 est impliqué dans l'inflammation. Les inventeurs ont démontré que le NTSR3 était responsable des effets de la neurotensine (NT) sur la migration et la libération de cytokines inflammatoires des cellules microgliales (voir Martin S, Vincent JP, Mazella J. «Involvement of the neurotensin receptor-3 in the neurotensin-induced migration of human microglia » J Neurosci. 23 : 1198-1205 (2003) (18) et Martin S, Dicou E, Vincent JP, Mazella J. «Neurotensin and the neurotensin receptor-3 in microglial cells » J Neurosci Res.; 81: 322-326 (2005) (19). [049] Le peptide de la présente invention possède la propriété d'antagoniser les effets de la NT. Par conséquent, toute molécule capable de bloquer les effets pro-inflammatoires de la NT peut avoir des retombées thérapeutiques importantes dans le domaine de l'inflammation cérébrale. [050] D'autres avantages pourront apparaître à l'homme du métier à la lecture des exemples qui suivent, donnés bien entendu à titre illustratif et non- limitatif en référence aux figures annexées.
Brève description des figures
[051] La figure 1 représente un Western blot préparé à partir d'extraits membranaires de cellules COS-7 transfectées avec le canal TREK-1 avec ou sans le récepteur NTSR3, immunoprécipités par un anticorps anti-TREK-1 et où les récepteurs NTSR3/sortiline sont révélés à l'aide d'un anticorps anti- sortiline.
[052] La figure 2 représente des courbes rapportant des résultats expérimentaux de mesures de l'inhibition de l'activité de canaux TREK-1. Sur le graphique A, en abscisse, est représentée la densité du courant I (pA/pF) et en ordonnée, la tension appliquée (V), exprimée en mV. En insert, les traces représentant l'amplitude du courant aux différentes valeurs des potentiels. Control : conditions de référence, AA, activation du courant par 10μM d'acide arachidonique, AA + PE, activation du courant par 10μM d'acide arachidonique en présence de 10OnM de PE. Sur le graphique B, en abscisse, est représenté le pourcentage d'inhibition du courant TREK-1 activé par 10μM d'AA (% inhibition mesuré à 0 mV) et en ordonnée, la concentration du PE, exprimée en nM. Sur ces figures, pA = picoAmpère et pF = picoFarad. [053] La figure 3 représente des histogrammes rapportant des résultats expérimentaux du test de la nage forcée effectués avec trois modes d'injection différents et avec différentes substances injectées. Il s'agit ici d'un test de résignation. Sur les trois graphiques, en abscisse, le temps pendant lequel l'animal reste immobile (en secondes - sec) et en ordonnée, les différentes substances testées. [054] La figure 4 représente des histogrammes rapportant des résultats expérimentaux de tests également de résignation CSMT (Conditioned Suppression of Motility : «conditionnement de suppression de mobilité ») et TST (Tail Suspension Test :«test de suspension par la queue ») avec différentes substances injectées. Sur le graphique CMST, en abscisse, le nombre de passages d'une case à l'autre et le nombre de redressements et en ordonnée, les différentes substances testées. Sur le graphique TST, en abscisse le temps pendant lequel l'animal reste immobile (en secondes - sec) et en ordonnée, les différentes substances testées. [055] La figure 5 représente un graphique de mesure de la neurogenèse en présence de sérum physiologique, de fluoxétine ou du peptide de la présente invention injecté pendant 2 semaines. En abscisse, le nombre de cellules positives au marquage BrdU. En ordonnée, les substances testées. [056] La figure 6 représente des histogrammes rapportant des tests de sensibilité à la douleur (à gauche: test de la plaque chaude (Hot plate - à droite test du «tail flick »). Sur les histogrammes A et B, en ordonnée, le temps que la souris met à réagir en secondes et en abscisse, les solutions injectées chez les souris. [057] La figure 7 représente un histogramme rapportant les crises épileptiques chez des souris. Sur l'histogramme, l'ordonnée représente le nombre de souris et en abscisse les stades de l'épilepsie. La mesure est faite en fonction de l'injection de kaïnate à 30mg/kg sur des souris traitées avec 100 μl de sérum physiologique ou avec 100 μl d'une solution 10'5M de peptide («PE 10"5 M ») [058] La figure 8 représente un histogramme de quantification de la taille de l'infarctus provoqué par une ischémie focale (modèle d'accident vasculaire cérébral) sur des souris. Sur l'histogramme, l'ordonné représente le volume de l'infarctus et l'abscisse la solution injectée : soit une solution de sérum physiologique («SERUM PHY ») soit une solution de propeptide («PE 10" 5M »).
[059] La figure 9 montre un histogramme représentant les prises de boisson et de nourriture à 6 h et 72 h après le dernier traitement chez des souris ayant subi une injection journalière pendant 15 jours. Sur l'histogramme, l'ordonnée représente le poids en gramme et en abscisse les solutions injectées : solution de sérum physiologique («SERUM PHY ») ou une solution de propeptide à une concentration de 10'5M («PE 10"5M »).
[060] La figure 10 montre un histogramme représentant la neurogenèse chez des souris après 4 jours de traitement. Sur l'histogramme, l'ordonné représente le nombre de cellules positives au Bromodeoxyuridine (BrdU) et en abscisse les solutions injectées : solution de sérum physiologique («SERUM
PHY »), une solution de propeptide à une concentration de 10"5M («PE 10"
5M ») ou une solution comprenant de la fluoxétine à une concentration de 3 mg/kg («FLUOXETINE (3 mg/kg) »).
EXEMPLES
[061] Les inventeurs ont entrepris des expériences d'électrophysiologie pour démontrer l'inhibition de l'activité des canaux TREK-1 par le propeptide de la présente invention et différents tests dits de comportement visant à valider la propriété antidépresseur du propeptide. En effet, l'équipe du Dr C. Heurteaux a démontré que l'invalidation chez la souris du gène du canal TREK-1 (TREK- 1~Λ ou KO-TREK-1) conférait aux animaux un phénotype de résistance à la dépression mesuré au travers de tests de comportement reconnus comme étant liés à la dépression (15). Par conséquent, toute molécule capable soit d'inhiber les canaux TREK-1 soit de reproduire un comportement de type TREK-1"7", peut être considérée comme étant potentiellement antidépressive. [062] Les inventeurs ont également réalisé des expériences de colocalisation entre TREK-1 et la sortiline sur des coupes de tronc cérébral de souris.
Exemple 1 : Essais sur TREK-1 [063] L'équipe de Catherine Heurteaux a mis en évidence que le canal potassique TREK-1 pouvait être une cible pour le traitement de la dépression et que des antagonistes de ce canal pouvaient avoir la propriété d'être des antidépresseurs puissants. [064] TREK-1 est régulé par les neurotransmetteurs qui modulent le niveau d'AMPc via des récepteurs qui activent la voie des protéines Gq comme le récepteur 5-HT (sérotonine). La délétion de TREK-1 résulte en un phénotype anti-dépression avec une augmentation effective de la neurotransmission 5- HT. Les souris KO-TREK-1 développent un comportement similaire à celui de souris naïves traitées avec les antidépresseurs classiques (15). Ces données suggèrent que des bloqueurs du canal TREK-1 , qui n'existent pas aujourd'hui, peuvent mener à une nouvelle génération d'antidépresseurs. Tout ce qui peut affecter le trafic, l'adressage et la fonction du canal TREK-1 est donc important à identifier. Il s'agit de découvrir des partenaires qui modulent ces propriétés.
[065] Les inventeurs de la présente invention démontrent ici qu'un bon candidat est le récepteur-3 de la neurotensine, le NTSR3 également nommé sortiline. Cette protéine multifonctionnelle (NTSR3/sortiline) peut en effet jouer le rôle de récepteur ou de co-récepteur et elle possède plusieurs ligands tels que la neurotensine, la lipoprotéine lipase et le propeptide libéré lors de la maturation du précurseur du NTSR3/sortiline. Ce propeptide est un antagoniste spécifique des effets de la neurotensine. Le NTSR3/sortiline joue également un rôle dans l'adressage d'autres protéines à la surface cellulaire. [066] Dans le but de voir si le NTSR3/sortiline joue un rôle dans le trafic du canal TREK-1 , les inventeurs ont entrepris des expériences visant à rechercher l'existence d'interactions entre les deux protéines. Pour cela, ils ont réalisé des transfections dans les cellules COS-7 avec les deux protéines NTSR3/sortiline et TREK-1. [067] Les résultats montrent que l'immuno-précipitation des extraits cellulaires avec un anticorps anti-TREK-1 co-précipite le NTSR3/sortiline
(Figure 1 annexée). En outre les inventeurs ont démontré une interaction fonctionnelle entre TREK-1 et le NTSR3/sortiline au moyen d'expériences d'électrophysiologie : l'activation de TREK-1 par l'acide arachidonique est bloquée par le propeptide, un inhibiteur spécifique et sélectif du NTSR3/sortiline (Figure 2).
[068] Pour obtenir le gel représenté sur la figure 1 , lès cellules COS-7 transfectées avec TREK-1 et NTSR3/sortiline ont été lysées. Le surnageant a été incubé avec un anticorps anti-TREK-1 (IP : α-TREK-1 ) en présence de protéine-A sépharose pendant 16 heures à 4°C.
[069] Les protéines ainsi précipitées sont déposées sur un gel SDS-PAGE puis transférées sur nitrocellulose. La protéine NTSR3/sortiline est détectée à l'aide d'un anticorps anti-NTSR3/sortiline.
Exemple 2 : Action du propeptide sur l'activité du canal TREK-1
[070] Toutes les expériences de mesure de l'effet du propeptide ont été réalisées sur des cellules COS-7 (lignée cellulaire issue de fibroblastes de rein de singe vert africain Cercopithecus aethiops). Ces cellules sont ensemencées à une densité de 20 000 cellules/boîte de 35mm de diamètre, 24 heures avant d'être transfectées par la méthode du DEAE-dextran avec 1 μg de plasmide plRES-EGFP-TREK-1. Les mesures de courant sont réalisées 48 à 72 heures après la transfection. [071] Culture des cellules COS-7. Les cellules COS-7 (référence ATCC :
CRL-1651 ) sont cultivées dans un milieu DMEM (Gibco) / 10% sérum de veau fétal (SVF, ICN), à 37°C en présence de 5% de CO2.
[072] Transfection au DEAE dextran. Au jour 1 , les cellules COS-7 sont ensemencées à 20 000 cellules par boîte de diamètre 35mm contenant 2 ml de milieu de culture. Au jour 2, le milieu est éliminé et les cellules sont recouvertes par 200 μl de PBS (Gibco) contenant 1 μg de plasmide pIRES- EGFP-TREK-1 et 100 μg de DEAE-dextran (Sigma) puis placées à 37°C/5% CO2. Après 30 minutes d'incubation, on ajoute 2 ml d'un milieu DMEM/ 10% NuSérum/ 80μM chloroquine. Après 3 heures, le milieu est remplacé par 2 ml de DMEM/10% SVF et les cellules sont incubées 48 à 72 heures avant d'être mesurées par des méthodes électrophysiologiques
[073] Mesures électrophysiologiques : toutes les mesures sont faites à température ambiante, c'est-à-dire à 21 - 22°C. Les cellules ayant été transfectées par le plasmide sont repérées grâce à la fluorescence émise par la EGFP après excitation à 480nm.
[074] La technique du patch clamp sur cellule entière a été utilisée pour mesurer l'activité des canaux TREK-1. L'appareillage utilisé est le RK 400 patch-clamp amplifier (Axon Instruments, U. S.A.). Les pipettes de patch de résistance 1 ,3 à 8 MΩ sont préparées à partir de capillaires en verre borosilicate et sont remplies avec une solution 155 mM KCI1 3 mM MgCb, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES/KOH pH 7,2.
[075] Le mileu de culture cellulaire est remplacé par une solution 150 mM NaCI, 5 mM KCI, 3 mM MgCI2, 1mM CaCI2, 10 HEPES/ NaOH pH 7,4 contenant 10 mM Chlorure de TétraEthyl Ammonium, 3 mM de 4- Aminopyridine. Les cellules sont perfusées en continu avec cette solution. Le potentiel de repos de la membrane de la cellule mesurée est fixé à -8OmV. [076] Les variations de voltage sont obtenues soit par rampe continue (de - 100 à + 5OmV) soit par saut de potentiel de 1OmV (de -100 à + 4OmV, 1 ,5 seconde par saut).
[077] Les données obtenues ont été analysées avec le logiciel Pclamp. Les courants décrits dans la figure 2B annexée ont été obtenus à 0 mV, les résultats exprimés sont les moyennes ± la déviation standard. La valeur de riCδo a été obtenue en traçant les données expérimentales à l'aide d'une fonction sigmoïdale.
[078] L'activité du canal est ensuite mesurée par la technique de « patch- clamp » en configuration cellule entière comme décrit ci-dessus. [079] Dans des conditions basales, c'est-à-dire en absence d'activation par l'acide arachidonique (connu pour être un activateur puissant du canal TREK-
1), 100 μM de propeptide inhibent 25% de l'activité canal mesurée à 0 mV (31 pA/pF contre 23 pA/pF).
[080] Dans les conditions où le canal est activé par 10 μM d'acide arachidonique (31 pA/pF contre 130 pA/pF), 100 μM de propeptide inhibent 67% de l'activité du canal mesurée à 0 mV (130 pA/pF contre 56 pA/pF).
[081] Dans les mêmes conditions expérimentales, une courbe dose-réponse de l'inhibition de l'activité des canaux TREK-1 mesurée à 0 mV a été réalisée et est représentée sur la figure 2B annexée. Elle indique une concentration de demi-effet (IC5o) de 70.7 nM. Exemple 3 : Tests de comportement
[082] Les inventeurs ont réalisé trois types d'expériences de comportement considérés comme classiques pour déterminer l'activité antidépresseur d'une substance (Nestler EJ. , Gould E., Manji H., Buncan M., Duman R. S.,
Greshenfeld H. K., Hen, R. et al. «Preclinical models: status of basic research in dépression» Biol Psychiatry. 15, 503-528 (2002) (20) et Cryan, J. & Holmes, A. «The ascent of mouse: advances in modeling human dépression and anxiety » Nat Rev Drug Discov. 4, 775-790 (2005) (21)). Les effets du propeptide de la présente invention ont été comparés à ceux de la solution saline dans laquelle il est dissous et à ceux de la fluoxétine, un antidépresseur des plus utilisés en clinique. La souche de souris utilisée est la souche C57Black/J. Des souris TREK-1"'" ont également été mesurées dans ces différents tests. [083] Le propeptide est dissous dans une solution saline 0,9% NaCI aux concentrations désirées : 10~5 M, 10"6 M, 10'7 M et 10"8 M. Différents volumes sont injectés en fonction de la technique utilisée :
- en intra cérébro ventriculaire : 5 μl
- en intraveineuse : 100 μl - en intrapéritonéale : 100 μl
[084] Pour les injections ICV une seringue Hamilton (Fisher Bioblock)(marque de commerce) de 10 μl est utilisée, et dans le cas des injections IV ou IP c'est une aiguille de 0,45 x 12 mm qui est utilisée.
A. Test de la nage forcée (ou Forced Swimming Test, FST) (Cryan &
Holmes, 2005 (21))
[085] L'expérience consiste, 30 min après injection de la substance à tester, à plonger la souris pendant 6 minutes dans un récipient de 15 cm de diamètre, de 30 cm de hauteur contenant 11 cm d'une eau à 22°C et de mesurer le temps d'immobilité lors des 4 dernières minutes. Les souris traitées avec des antidépresseurs ont des temps d'immobilité inférieurs à ceux des souris contrôle. Les inventeurs ont testé différentes voies d'injection du peptide et de la solution saline : intra-cérébro-ventriculaire (ICV), intraveineuse (IV) ou intrapéritonéale (IP). Seules des injections IP ont été utilisées pour administrer la fluoxétine. Un contrôle avec une injection de sérum physiologique a été réalisé.
[086] Les résultats de ces tests sont représentés sur la figure 3 annexée : Tests FST, les valeurs ± SEM sont statistiquement comparées à la condition contrôle (sérum physiologique) *** p< 0,001 , (Test «ANOVA« à 2 facteurs = test d'analyse de variances suivi d'un test post-hoc).
[087] Quelle que soit la voie d'administration, les effets du propeptide de la présente invention sont comparables à ceux provoqués par la fluoxétine. Les souris traitées par le propeptide ont un comportement identique aux souris
KO-TREK- 1.
[088] Dans les deux tests suivants, le propeptide de la présente invention a été administré par voie IV à raison de 100μl à 1μM par animal.
B. Test de la suspension par la queue (ou « Tail Suspension Test », TST)
(voir Cryan, J. & Holmes, A. (2005) (21) et Ripoll, N., David, D., Dailly, E., Hascoet, M. & Bourin, M. «Antidepressant-like effects in various mice strains in the tail suspension« Behav Brain Res. 143(2:193-200 (2003) (22).) [089] L'expérience consiste, 30 min après injection de la substance testée à la souris, à suspendre la souris par la queue à l'aide d'un ruban adhésif et à mesurer le temps d'immobilité pendant 6 min.
[090] Comme indiqué sur le graphique de la figure 4 annexée (TST), les souris traitées par des antidépresseurs ont des temps d'immobilité diminués par rapport aux souris contrôles.
[091] Dans cette expérimentation encore, les effets du propeptide de la présente invention sont comparables à ceux provoqués par la fluoxétine, et les souris traitées par le propeptide ont un comportement identique aux souris TREK- V'- (figure 4, TST)). [092] Le propeptide est dissous dans une solution saline 0,9% NaCI aux concentrations désirées : 10~5 M, 10"6 M, 10"7 M et 10"8 M. Différents volumes sont injectés en fonction de la technique utilisée : - en intra cérébro ventriculaire : 5 μl - en intraveineuse : 100 μl
- en intrapéritonéale : 100 μl
[093] Pour les injections ICV une seringue Hamilton (Fisher Bioblock)(marque de commerce) de 10 μl est utilisée, et dans le cas des injections IV ou IP c'est une aiguille de 0,45 x 12 mm qui est utilisée.
C. Test de suppression de mobilité conditionnée (ou « Conditioned Motility Suppression Test », CMST) (voir Daugé, V., Sebret, A., Beslot, F., Matsui, T., & Roques B. «Behavorial profile of CCK2 receptor-deficient mice »Neuropsychopharmacol; 25: 690-698 (2001) (23). [094] L'expérience consiste à conditionner, au jour 1 , la souris et, au jour 2, mesurer les effets des substances. [095] Jour 1 , chaque souris est placée dans une boîte où le plancher est une grille métallique reliée à un stimulateur électrique. Le conditionnement consiste à générer 30 séquences constituées d'un choc électrique (200ms à 1 ,8 mA) suivi de 12 secondes de latence (temps total de conditionnement : 6 minutes). Les souris sont ensuite remises en cage et laisser à récupérer sur 24 heures. [096] Jour 2, les souris sont injectées avec les différentes substances testées puis après 30 minutes, elles sont replacées dans la boîte qui a servi au conditionnement et où le plancher a été divisé en 6 cases identiques. Aucun choc électrique n'est délivré. [097] La mesure s'effectue en comptant manuellement pendant 6 minutes le nombre de fois où chaque souris change de case ou se redresse.
[098] Les souris choquées non traitées (sérum physiologique) ne bougent pratiquement pas («freezing »), les souris choquées traitées récupèrent une mobilité importante par rapport à ces dernières : 5 fois supérieure avec la fluoxétine (à raison d'une injection de 3 mg/kg) et 7 fois supérieure avec le propeptide de la présente invention.
[099] Les résultats expérimentaux de ce test sont représentés sur la figure 4 annexée. Les souris TREK-1"'" ont une mobilité 6 fois supérieure au contrôle (CSMT sur la figure 4). [0100] L'ensemble de ces résultats expérimentaux démontrent clairement que le propeptide de la présente invention possède des propriétés d'antidépresseur au moins aussi efficaces que celles de la fluoxétine voire supérieures dans le cas du test «conditionnement de suppression de mobilité ».
[0101] De plus, le fait que le propeptide de la présente invention agisse par voies intraveineuse ou intrapéritonéale aussi bien que par voie intracisternale indique qu'il passe facilement la barrière hémato-méningée (BHE) pour exercer ses effets. Cette propriété ouvre la possibilité de traitements chroniques et facilement transposables pour des tests cliniques.
Exemple 4 : Effets du propeptide sur la neurogenèse
[0102] Les traitements par les antidépresseurs sont connus pour augmenter la neurogenèse dans l'hippocampe (Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O,
Belzung, C, Hen, R et al «Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants » Science, 301 : 805-809 (2003) (24). Cette prolifération cellulaire est mesurée par l'augmentation de cellules «progénétrices » qui incorporent un marqueur le 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) et se transforment en neurones matures. La détection du BrdU se fait par immunohistochimie.
[0103] Au jour 1 , les animaux sont injectés en IP avec 300 μl d'une solution aqueuse de 1OmM de BrdU, puis remis en cage. [0104] Au jour 2, les animaux sont euthanasiés puis les tissus sont fixés grâce à la perfusion intracardiaque d'une solution froide de 4% paraformaldéhyde. Les cerveaux sont prélevés puis congelés à -200C. [0105] Des coupes sériées de 40μm sont préparées, de façon à recouvrir la totalité de la structure hippocampe, à l'aide d'un vibratome (Leica). Une coupe sur six est retenue pour mesurer l'incorporation de BrdU à l'aide d'un anticorps anti-BrdU monoclonal de souris (Becton Dickinson). Cet anticorps primaire est révélé grâce à un anticorps secondaire couplé à la biotine et à de l'avidine- peroxidase. L'activité peroxidase est visualisée par hydrolyse du DAB. Les cellules ainsi marquées sont comptées sur chaque coupe. [0106] Pour chaque groupe, solution saline, propeptide ou fluoxétine, les nombres de cellules marquées au BrdU de chaque coupe sont additionnés et multipliés par six de façon à considérer l'ensemble de la structure. Chaque groupe est constitué de 3 souris, les résultats exprimés sont la moyenne des trois animaux.
[0107] Les résultats obtenus sont représentés sur l'histogramme de la figure 5 annexée. Ce graphique indique la mesure de la neurogenèse. Le sérum physiologique («SERUM PHY ») et le propeptide 10μM («PE 10"5M ») ont été injectés pendant 2 semaines, la fluoxétine a également été administrée par l'eau de boisson, solution à 80 mg/l pendant 2 semaines, période démontrée nécessaire pour obtenir une efficacité de la fluoxétine . ** p< 0,01 , * p< 0,05. [0108] Ces résultats démontrent clairement que le propeptide induit une neurogenèse importante comparable à celle induite par la fluoxétine. Il n'y aucune différence significative entre les mesures obtenues avec le propeptide et celles obtenues avec la fluoxétine (Test ANOVA à un facteur suivi du test post-hoc).
Exemple 5 : Effets du propeptide sur la douleur 09] Le peptide de l'invention inhibe l'activité des canaux TREK-1. Les principaux effets secondaires envisageables sont ceux induits par le blocage de l'activité des canaux TREK-1. En effet, des travaux de l'équipe de C. Heurteaux (Heurteaux C, Guy, N.,Laigle, C..Blondeau, N.,Duprat, F.,Mazzuca, M.,Lang-Lazdunski, L.,Widmann, C. et al «TREK-1 , a K(+) channel involved in neuroprotection and gênerai anesthesia » EMBO J, 23 : 2684-2695 (2004) (25) et Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noël J,
Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. «TREK-1 , a K+ channel involved in polymodal pain perception » EMBO J ; 25 : 2368-2376 (2006)) (17) ont montré que les souris invalidées pour le canal TREK-1 (TREK-1 "'") étaient :
- plus sensibles à la douleur que les souris sauvages (Alloui A, Zimmermann K, Mamet J, Duprat F, Noël J, Chemin J, Guy N, Blondeau N, Voilley N, Rubat-Coudert C, Borsotto M, Romey G, Heurteaux C, Reeh P, Eschalier A, Lazdunski M. «TREK-1 , a K+ channel involved in polymodal pain perception » EMBO J ; 25 : 2368-2376 (2006)) (17).
- les effets neuroprotecteurs des acides gras polyinsaturés, comme l'acide alpha linolénique, dans le cas d'une ischémie cérébrale disparaissaient chez les souris KO, et
- que les crises d'épilepsie induites par une injection de kaïnate étaient beaucoup plus sévères et conduisaient beaucoup plus souvent à la mort chez les souris TREK-1 ~'~ (Heurteaux C, Guy, N., Laigle, C, Blondeau, N., Duprat, F., Mazzuca, M., Lang-Lazdunski, L., Widmann, C. et a/ «TREK-1 , a K(+) channel involved in neuroprotection and gênerai anesthesia » EMBO J,
23 : 2684-2695 (2004)) (25).
[0110] La sensibilité à la douleur a été mesurée avec deux tests: le test de la plaque chaude et le test de «tail flick ».
1. La plaque chaude (hot plate).
[0111] Ce test consiste à mesurer le temps que met une souris pour se lécher les pattes arrières lorsqu 'elle est posée sur une plaque maintenue à une température donnée. Deux températures ont été utilisées : 50 et 56°C. [0112] Les souris utilisées étaient des souris C57BL6/J. Chaque groupe était constitué de 10 souris.
[0113] Le premier groupe de souris «naïves » n'a reçu aucune injection, le second groupe de souris a reçu une injection intraveineuse de 100 μl de sérum physiologique («SERUM PHY »), enfin le troisième groupe a reçu une injection de 100 μl de solution comprenant le peptide de l'invention à une concentration de 10~6 M («PE 10"6M »).
[0114] Une mesure de la sensibilité à la chaleur a ensuite été effectuée sur les trois groupes de souris et une comparaison des résultats obtenus a été effectuée. [0115] Les mesures ont été effectuées 30 minutes après injection. [0116] Les résultats sont présentés dans la Figure 6A. [0117] Ces résultats démontrent clairement qu'il n'y aucune différence statistique entre les trois groupes d'animaux à 500C: naïves : 19,4 +/- 1 ,6 sec, injectées sérum physiologique : 21 ,3 +/- 2,1 sec et injectées PE : 21 ,1+/- 1 ,5 sec. A 56°C, naïves : 5,3 +/- 1 ,6 sec, injectées sérum physiologique : 3,8 +/- 0,7 sec et injectées PE : 4,6 +/- 0,9 sec.
[0118] La mesure de la différence statistique a été effectuée en utilisant le test ANOVA un facteur suivi du test post-hoc.
[0119] Cet exemple démontre clairement que le peptide de l'invention n'induit pas d'hyperalgésie.
2. 2. Le « tail flick » [0120] Ce test consiste à faire tremper la queue d'une souris dans un bain à
48°C et à mesurer le temps qu'elle met à la retirer du bain. Avant toute injection, un test d'habituation a été effectué sur les souris. Il consiste à plonger la queue de chaque animal deux fois dans le bain de façon à avoir des groupes homogènes avant tout traitement (obtention d'un temps de réaction inférieur à 12 secondes). Puis 100 μl de sérum physiologique
(«SERUM PHY ») ou 100 μl de peptide de séquence ID N°2 à une concentration de 10"6 M («PE 10"6M ») ont été injectés chez des souris. [0121] Les souris utilisées étaient des souris C57BL6/J. Chaque groupe était constitué de 10 souris. [0122] Les mesures ont été effectuées 30 minutes après injection. Les résultats présentés dans la Figure 6B indiquent qu'il n'y a pas de différence significative entre les deux groupes de souris : sérum physiologique : 7,0+/- 0,6 sec et PE : 8,3 +/- 0,7 sec. [0123] L'évaluation de la différence a été effectuée en utilisant le Student t test. Ce test a confirmé qu'il n'y avait pas de différence significative entre les deux groupes.
[0124] Le test de la plaque chaude et du «tail flick » démontrent clairement que l'injection du peptide de séquence ID N°2 n'induit pas d'hyperalgésie.
Exemple 6 : Effets du propeptide sur l'épilepsie
[0125] Dans cette expérience, les souris utilisées étaient des C57BL6/J à raison de 10 souris par groupe expérimental : un groupe «Sérum Physiologique », qui a reçu une injection intrapéritonéale de 100 μl de sérum physiologique et un groupe « PE 10~5 M », dans lequel les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 100 μl d'une solution comprenant le peptide de l'invention à une concentration de 10'5M. Dans chacun des groupes expérimentaux, les crises épileptiques ont été induites par injection intrapéritonéale de 100 μl de kaïnate à raison de 30mg/kg. L'observation du stade de la crise d'épilepsie a été effectuée 90 minutes après l'injection de
Kaïnate. Cette observation a été faite par observation du comportement des souris.
[0126] Les différents stades de la crise épileptique sont exposés dans le document Tsirka S. E., Gualandris, A., Amaral, D. G., Strickland, S. «Excitotoxin-induced neuronal degeneration and seizure are mediated by tissue plasminogen activator », Nature,377 : 340-344 (1995) (26). [0127] 6 stades sont définis pour décrire l'intensité de la crise épileptique :
Stade 1 immobilité Stade 2 mouvements de la tête et de la nuque Stade 3 activité clonique unilatérale
Stade 4 activité clonique bilatérale Stade 5 convulsions généralisées Stade 6 mort de l'animal [0128] Les résultats présentés dans la Figure 7 montrent que non seulement le peptide de l'invention n'aggrave pas les crises induites par le kaïnate mais qu'au contraire il peut avoir un effet bénéfique puisque seuls 2 animaux injectés avec du peptide ont atteint le stade 5 contre 5 dans le groupe «Sérum Physiologique ». De plus le seul animal mort était dans le groupe «Sérum Physiologique ».
[0129] L'analyse statistique a été faite par un test ANOVA à 2 facteurs suivi du test post-hoc.
[0130] Cet exemple démontre donc clairement que le propeptide n'induit pas de crises épileptiques et qu'au contraire il présente un effet protecteur vis- à- vis de l'épilepsie.
Exemple 7 : Effets du propeptide sur les risques d'Accident Vasculaire Cérébral (AVC)
[0131] Le modèle utilisé pour induire un AVC est celui de l'ischémie focale, qui consiste en l'occlusion par un filament de l'artère cérébrale moyenne
(Heurteaux C, Laigle, C, Blondeau, N., Jarretou, G., Lazdunski, M. «Alpha- linolenic acid and riluzole treatment confer cérébral protection and improve survival after focal brain ischemia » Neuroscience, 137 : 241-251 (2006) (27). La taille des infarctus provoqués par cette ischémie focale a été mesurée après coloration au crésyl violet des coupes de cerveaux. La mesure de l'infarctus se fait en traçant le contour de la zone infarcie par un système d'analyse d'image (Olympus DP Soft) selon la méthode décrite dans Heurteaux et al, 2006 (27). Les cerveaux de souris C57BL6/J (à raison de 10 souris par groupe expérimental) sont traitées pendant une semaine avec une injection intrapéritonéale journalière de 100μl d'une solution comprenant soit le peptide de séquence ID N°2 à une concentration de 10"5M (groupe «PE
10"5M »), soit avec d'une solution de sérum physiologique (groupe «SERUM PHY »). Les valeurs ont été comparées entre les deux groupes. [0132] Les résultats présentés dans Figure 8 démontrent clairement qu'il n'y a pas de différence significative entre les deux groupes d'animaux. [0133] L'évaluation de la différence a été effectuée en utilisant le test t de
Student Ce test a confirmé qu'il n'y avait pas de différence significative entre les deux groupes.
[0134] Cet exemple démontre clairement que le peptide n'a pas d'effet significatif sur la taille des infarctus provoqués par une ischémie focale. Cet exemple démontre donc clairement que le peptide de séquence ID N°2 n'induit pas une augmentation des dégâts neuronaux et n'augmente pas le risque d'accident vasculaire cérébral.
Exemple 8 : Effets du propeptide sur la prise alimentaire [0135] La prise de nourriture et de boisson a également été mesurée. Deux groupes expérimentaux de souris C57BL6/J (n=10 par groupe) ont été utilisés : le premier groupe recevant une injection intrapéritonéale journalière pendant 15 jours de 100μl de sérum physiologique («SERUM PHY »), le second groupe recevant une injection intrapéritonéale journalière pendant 15 jours de 100 μl d'une solution comprenant le peptide de séquence ID N°2 à une concentration de 10"5M («PE 10~5 M »).
[0136] Ces mesures ont été effectuées 6 et 72 heures après la fin du traitement chronique. Il n'y a aucune différence significative entre les animaux traités et les non traités aussi bien pour la prise de nourriture que pour celle de la boisson (Figure 9).
[0137] L'évaluation de la différence a été effectuée en utilisant le test t de Student. Ce test a confirmé qu'il n'y avait pas de différence significative sur la prise de nourriture et de boisson entre les deux groupes.
[0138] Cet exemple démontre clairement que le peptide de séquence ID N°2 n'a pas d'effet significatif sur la prise alimentaire des animaux.
Exemple 9 : Mesure du délai d'action du propeptide [0139] A l'inverse de nombreux antidépresseurs couramment utilisés aujourd'hui, l'efficacité d'action du peptide de l'invention est très rapide. En effet, un des moyens expérimentaux pour démontrer l'efficacité des antidépresseurs est de mesurer la néoneurogenèse (Santarelli, L., Saxe, M, Gross, C, Surget, A, Battaglia, F, Dulawa, S, Weisstaub, N, Lee, J, Duman, R, Arancio, O, Belzung, C, Hen, R et al «Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants » Science, 301 : 805-809 (2003) (24). En effet, les antidépresseurs tels que la fluoxétine, induisent une neurogenèse au bout d'environ deux semaines. Cette neurogenèse est un élément clé dans le mécanisme d'action des antidépresseurs. En clinique, il est démontré que la dépression est associée à une atrophie des cellules pyramidales de l'hippocampe Sheline, Y. I. , Wang, P. W., Gado, M. H., Csernaπsky, J. G..Vannier, M. W. «Hippocampal atrophy in récurrent major dépression » Proc NatlAcad Sci U S A. 9Z : 3908-3913 (1996) (28) et à une forte diminution de la neurogenèse dans le dentate gyrus (Gould, E., Tanapat, P., McEwen, B. S.,Flugge, G., Fuchs, E. «Prolifération of granule cell precursors in the dentate gyrus of adult monkeys is diminished by stress » Proc NatlAcad Sci U S A, 95: 3168-3171 (1998)) (29). [0140] Le protocole expérimental est celui décrit dans le matériel et méthodes (Supplément) de la publication Santarelli et al, «Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants » Science, 301 :
805-809 (2003) (24) à l'exception de la durée de traitement, qui est de quatre jours. [0141] Les résultats de la Figure 10 annexée indiquent une grande rapidité d'action du peptide dans l'induction de la neurogenèse. Il y a une augmentation significative de la neurogenèse qu'avec le peptide («PE 10~5 M »). La neurogenèse induite par la fluoxétine («FLUOXETINE, 3 mg/kg ») est identique à celle induite par l'injection de sérum physiologique («SERUM
PHY ») durant cette période de 4 jours.
[0142] L'évaluation de l'augmentation a été effectuée en utilisant le test ANOVA à un facteur suivi du test post-hoc). Ce test a confirmé que par rapport au groupe «Sérum Phy » il y avait une augmentation significative de la neurogenèse induite par le peptide de l'invention mais pas par la fluoxétine.
[0143] Les exemples démontrent donc clairement que le peptide de l'invention peut être utilisé pour soigner les maladies psychiatriques, les phénomènes inflammatoires et/ou douloureux. De plus, le peptide de l'invention n'induit pas les effets secondaires connus des antidépresseurs de l'état de la technique et a un délai d'action inférieur aux antidépresseurs de l'état de la technique, c'est-à-dire une rapidité supérieure d'action.
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Claims

Revendications
1. Peptide de séquences ID N°2 ou un fragment ou un dérivé de ce peptide qui est un ligand du récepteur 3 de la neurotensine (NTSR3).
2. Séquence d'acide nucléique codant un peptide ou un fragment ou un dérivé de ce peptide selon la revendication 1.
3. Vecteur comprenant une séquence d'acide nucléique selon la revendication 2.
4. Cellule hôte comprenant un peptide ou un fragment ou un dérivé de ce peptide selon la revendication 1 et/ou une séquence d'acide nucléique selon la revendication 2 et/ou un vecteur selon la revendication 3.
5. Procédé de production d'un peptide ou fragment ou dérivé de celui-ci selon la revendication 1 comprenant les étapes suivantes :
- transfecter une cellule hôte avec un acide nucléique selon la revendication 2 ou transformer une cellule hôte avec un vecteur selon la revendication 3 ;
- cultiver ladite cellule hôte dans des conditions permettant l'expression du peptide ou fragment ou dérivé de ce peptide selon la revendication 1 ; et
- récupérer ledit peptide ou fragment ou dérivé de ce peptide.
6. Utilisation d'un peptide ou fragment ou dérivé de ce peptide selon la revendication 1 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement de troubles psychiatriques, de phénomènes inflammatoires et/ou douloureux.
7. Utilisation selon la revendication 6, pour la fabrication d'un antidépresseur.
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