WO2009068211A1 - Method for determining the presence and/or absence of a plurality of target sequences in a biological sample - Google Patents

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WO2009068211A1 PCT/EP2008/009782 EP2008009782W WO2009068211A1 WO 2009068211 A1 WO2009068211 A1 WO 2009068211A1 EP 2008009782 W EP2008009782 W EP 2008009782W WO 2009068211 A1 WO2009068211 A1 WO 2009068211A1
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

The present invention relates to a method for determining the presence and/or absence of at least two different target sequences in a biological sample, comprising: i) carrying out at least one amplification reaction, wherein the at least one amplification reaction is a PCR or an LCR, wherein per target sequence to the determined at least three different primer pairs are used, and then ii) detecting the amplified products obtained in the at least one amplification reaction, comprising the execution of an electrophoreses method, wherein the primer pairs are selected for each of the at least two target sequences to be determined such that all the amplified products that can be obtained with the primer pairs during the amplification reaction per target sequence to be determined differ with respect to the length thereof by a maximum of x base pairs, and that all amplified products that can be obtained with the primer pairs during the amplification reaction per target sequence to be determined differ with respect to the length thereof from the amplified products that can be obtained with the primer pairs during the amplification reaction for each other target sequence by at least y base pairs, where x ≤ z and y > z, where z is the resolution of the electrophoreses method carried out in step (ii).

Description

Verfahren zur Bestimmung der An- und/ oder Abwesenheit von mehreren Zielsequenzen in einer biologischen Probe Method for determining the presence and / or absence of several target sequences in a biological sample
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels wenigstens einer Amplifikationsreaktion, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz wenigstens 3 Primerpaare eingesetzt werden, und anschließendem Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate durch ein Elektrophoreseverfahren.The present invention relates to a method for the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample by means of at least one amplification reaction in which at least 3 primer pairs are used for each target sequence to be determined, and subsequent detection of the in the at least one amplification reaction obtained amplificates by an electrophoresis method.
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von Zielsequenzen in einer biologischen Probe, d.h. beispielsweise der Nachweis des Vorliegens bzw. der Abwesenheit einer vorbestimmten Nuklein- säuresequenz, wie beispielsweise eines bestimmten Chromosoms, Gens oder Genabschnitts, werden in vielen technischen Gebieten eingesetzt. Lediglich beispielsweise seien Anwendungen in der medizinischen Diagnostik, in der Forensik oder in der Gentechnik genannt.Method for determining the presence and / or absence of target sequences in a biological sample, i. For example, the detection of the presence or absence of a predetermined nucleic acid sequence, such as a particular chromosome, gene or gene segment are used in many technical fields. Only for example applications in medical diagnostics, in forensics or in genetic engineering are mentioned.
Bei den derzeit bekannten Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von Zielsequenzen in einer biologischen Probe wird zumeist eine PCR ("Polymerase Chain Reaction" bzw. "Polymeraseketten- reaktion") durchgeführt, bei der wenigstens ein Primerpaar eingesetzt wird, welches daran angepasst ist, dass bei der PCR eine in der Zielsequenz vorhandene Nukleinsäuresequenz mit einer vorbestimmten Länge amplifiziert wird. Durch den anschließenden Nachweis, welcher beispiels- weise mittels Gelelektrophorese oder Kapillarelektrophorese erfolgen kann, dass das in der PCR erhaltene PCR-Produkt die vorgegebene Länge aufweist, kann dann die Anwesenheit oder Abwesenheit der Zielsequenz in der biologischen Probe festgestellt werden. Um dieses Ergebnis zu validie- ren, kann das PCR-Produkt auch weitergehend, beispielsweise durch Sequenzierung, charakterisiert werden.In the currently known methods for determining the presence and / or absence of target sequences in a biological sample, a PCR ("polymerase chain reaction" or "polymerase chain reaction") is usually carried out in which at least one primer pair is used, which is adapted thereto in that in the PCR, a nucleic acid sequence present in the target sequence is amplified with a predetermined length. By the subsequent proof, which way can be done by gel electrophoresis or capillary electrophoresis that the PCR product obtained in the PCR has the predetermined length, then the presence or absence of the target sequence can be detected in the biological sample. In order to validate this result, the PCR product can also be further characterized, for example by sequencing.
Sofern in solchen Verfahren als Ausgangsmaterial wenige Zellen eingesetzt werden oder gar eine Einzelzelle eingesetzt wird, müssen in der PCR in der Regel mehrere unterschiedliche Primerpaare, in der Praxis bis zu 25 verschiedene Primerpaare, eingesetzt werden, um mit der geforderten Sicherheit auf die Anwesenheit bzw. Abwesenheit einer Zielsequenz in der Einzelzelle schließen zu können. Dies liegt daran, dass in einer Einzelzelle nur ein Genom, d.h. eine sehr geringe Menge an Nukleinsäure, enthalten ist, so dass bei der Durchführung einer PCR mit einem Primerpaar statistisch gesehen nicht in jedem Fall ein PCR-Produkt erhalten wird, selbst wenn die Zielsequenz in dem Genom der Einzelzelle vorhanden ist. Bei der Durchführung der PCR mit nur einem Primerpaar wäre in dem Fall der Abwesenheit eines PCR-Produktes die Schlussfolgerung, dass die Zielse- quenz in dem Genom der Einzelzelle nicht enthalten ist, mit einem hohen Fehlerrisiko verbunden. Durch den Einsatz mehrerer Primerpaare, welche daran angepasst sind, jeweils unterschiedliche Sequenzen aus der Zielsequenz zu amplifizieren, kann die Aussagekraft des an der Einzelzelle erhaltenen Ergebnisses erheblich erhöht werden. Liegt beispielsweise die Wahrscheinlichkeit für die Amplifikation einer Sequenz aus der Zielsequenz bei der mit der Einzelzelle durchgeführten PCR pro Primerpaar bei 50 %, liegt die Wahrscheinlichkeit dafür, in einer PCR mit 5 verschiedenen Primerpaaren kein einziges Amplifikationsprodukt zu erhalten, obwohl die entsprechenden Zielsequenzen in dem Genom der Einzelzelle vorliegen, bei etwa 3 %. Werden hingegen 10 oder gar 100 verschiedene Primerpaare eingesetzt, liegt die Wahrscheinlichkeit bei etwa 0, 1 % bzw. 10-29 %.If only few cells are used as starting material in such processes or even a single cell is used, usually several different primer pairs, in practice up to 25 different primer pairs, must be used in order to provide the required safety for the presence or absence of cells. Absence of a target sequence in the single cell to be able to conclude. This is because in a single cell, only one genome, ie, a very small amount of nucleic acid, is included, so when performing a PCR with a primer pair, statistically not a PCR product is obtained in each case, even if the target sequence is present in the genome of the single cell. In carrying out the PCR with only one primer pair, in the case of the absence of a PCR product, the conclusion that the target sequence is not contained in the genome of the single cell would be associated with a high risk of error. By using a plurality of primer pairs, which are adapted to each amplify different sequences from the target sequence, the validity of the result obtained at the single cell can be significantly increased. For example, if the probability of amplification of a sequence from the target sequence in the single-cell PCR per primer pair is 50%, then the likelihood of not obtaining a single amplification product in a PCR with 5 different primer pairs, although the corresponding target sequences in the genome the single cell, at about 3%. If, however, 10 or even 100 different primer pairs used, the probability at about 0, 1% and 10- 29%.
Grundsätzlich können für die vorgenannte Untersuchung mit beispiels- weise 10 verschiedenen Primerpaaren 10 verschiedene PCR's durchgeführt werden, wobei pro PCR jeweils ein Primerpaar eingesetzt wird. Allerdings müssen dann 10 verschiedene Reaktionsansätze gehandhabt und nach der PCR analysiert werden, was sehr zeit- und kostenintensiv ist. Aus diesem Grund wird in diesem Fall häufig nur eine (Multiplex-) PCR durch- geführt, in der die 10 verschiedenen Primerpaare eingesetzt werden. In diesem Fall liegen nach der Durchführung der PCR die verschiedenen PCR-Produkte in einer Probe vor, so dass diese, beispielsweise durch Gelelektrophorese, parallel charakterisiert werden können. Um die PCR- Produkte einfach zuordnen zu können, werden die verschiedenen Primer- paare in der Praxis so ausgewählt, dass jedes Primerpaar ein PCR- Produkt bestimmter, aber von der jedes anderen PCR-Produkts verschiedener Länge ergibt. Bei der Durchführung einer PCR mit 10 verschiedenen Primerpaaren ergeben sich somit bis zu 10 verschiedene PCR-Produkte jeweils unterschiedlicher Länge, welche nach der PCR durch Gelelektrophorese oder durch Kapillarelektrophorese aufgetrennt und nachfolgend hinsichtlich ihrer Länge charakterisiert werden müssen. Dies ist jedoch aufgrund der vielen in einer Probe vorliegenden PCR-Produkte sehr arbeits- und daher auch kostenintensiv.In principle, 10 different PCRs can be carried out for the abovementioned examination with, for example, 10 different primer pairs, wherein in each case one primer pair is used per PCR. However, then 10 different reaction mixtures must be handled and analyzed after the PCR, which is very time consuming and costly. For this reason, in this case often only a (multiplex) PCR is performed, in which the 10 different primer pairs are used. In this case, after carrying out the PCR, the various PCR products are present in a sample, so that they can be characterized in parallel, for example by gel electrophoresis. In order to be able to easily assign the PCR products, the different primer pairs are in practice selected such that each primer pair yields a PCR product of a certain length but different from that of any other PCR product. When carrying out a PCR with 10 different primer pairs, this results in up to 10 different PCR products of different lengths, which must be separated after the PCR by gel electrophoresis or by capillary electrophoresis and subsequently characterized in terms of their length. However, this is due to the many present in a sample PCR products very laborious and therefore costly.
In der Praxis werden in einer biologischen Probe häufig mehrere Zielsequenzen gleichzeitig charakterisiert, also beispielsweise parallel bestimmt, ob eine Einzelzelle, wie ein Polkörper, drei bestimmte Chromosomen aufweist oder nicht. Für eine solche Untersuchung sind dann in der Multip- lex-PCR entsprechend mehr Primerpaare einzusetzen und folglich nach der Durchführung der PCR entsprechend mehr verschiedene PCR- Produkte in einem Probenansatz voneinander zu trennen und hinsichtlich ihrer Länge zu charakterisieren, was mit einem noch höheren Zeit- und Arbeitsaufwand verbunden ist.In practice, several target sequences are often simultaneously characterized in a biological sample, ie, for example, it is determined in parallel whether an individual cell, such as a polar body, has three specific chromosomes or not. For such a test, accordingly, more pairs of primers are to be used in the multiplexex PCR, and accordingly more PCR PCR amplifiers are required after the PCR has been carried out. To separate products in a sample approach and to characterize in terms of their length, which is associated with an even higher time and effort.
Die gleichen Probleme ergeben sich, wenn die Charakterisierung von Zielsequenzen in einer biologischen Probe mit einer LCR ("Ligase Chain Reac- tion" bzw. " Ligasekettenreaktion") erfolgt.The same problems arise when the characterization of target sequences in a biological sample with an LCR ("Ligase Chain Reaction" or "ligase chain reaction") takes place.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels einer Amplifikationsreaktion, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz mehrere verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, welches selbst bei Einsatz einer Einzelzelle einfach, schnell und kostengünstig durchgeführt werden kann.The object of the present invention is therefore to provide a method for the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample by means of an amplification reaction in which several different primer pairs are used per target sequence to be determined, which even when using a single cell can be done easily, quickly and inexpensively.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe umfassend:According to the invention, this object is achieved by a method for determining the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample comprising:
i) die Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR oder eine LCR ist, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz wenigstens 3 verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, und anschließend ii) den Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate umfassend die Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens,i) carrying out at least one amplification reaction, wherein the at least one amplification reaction is a PCR or an LCR in which at least 3 different primer pairs are used per target sequence to be determined, and then ii) the detection of the amplicons obtained in the at least one amplification reaction comprising the implementation an electrophoresis method,
wobei die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Ziel- Sequenzen so ausgewählt werden, dass - sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge um maximal x Basenpaare unterscheiden und dasswherein the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are selected such that all of the amplificates obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ in their length by a maximum of x base pairs and in that
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare unterscheiden, wobei x < z und y > z ist, wobei z das Auflösungsvermögen des in dem Schritt ii) durchgeführten Elektrophoreseverfahrens ist.all amplicons obtainable from the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ in their length from the amplicons obtainable with the primer pairs for each other target sequence by at least y base pairs, where x <z and y> z, z is the resolving power of the electrophoresis method performed in step ii).
Unter dem Begriff Auflösungsvermögen des in dem Verfahrensschritt ii) durchgeführten Elektrophoreseverfahrens wird im Sinne der vorliegenden Erfindung die Anzahl der Basenpaare bzw. Basen verstanden, um welche sich zwei verschiedene Nukleinsäurefragmente mindestens unterscheiden müssen, damit diese beiden Nukleinsäurefragmente in dem konkret durchgeführten Elektrophoreseverfahren so voneinander getrennt werden, dass diese nach Abschluss der Elektrophorese als unterscheidbare Banden vorliegen. Die Einheit des Auflösungsvermögens ist Basenpaare bzw. Basen, je nachdem ob doppelsträngige Nukleinsäure in einem nicht denaturierenden Gel elektrophoretisch aufgetrennt wird (Basenpaare) oder ob einzelsträngige Nukleinsäure in einem nicht denaturierenden Gel oder Nukleinsäure in einem denaturierenden Gel elektrophoretisch aufgetrennt wird (Basen).For the purposes of the present invention, the term resolving power of the electrophoresis method carried out in method step ii) is understood to mean the number of base pairs or bases around which at least two different nucleic acid fragments must differ, so that these two nucleic acid fragments are separated from one another in the specifically performed electrophoresis method in that these are present as distinguishable bands after completion of the electrophoresis. The resolution unit is base pairs or bases, depending on whether double-stranded nucleic acid is electrophoretically separated in a non-denaturing gel (base pairs) or whether single-stranded nucleic acid is electrophoresed in a non-denaturing gel or nucleic acid in a denaturing gel (bases).
Es ist bekannt, dass das Auflösungsvermögen eines Elektrophoreseverfahrens von vielen Faktoren, insbesondere von der Art des eingesetzten Gels, abhängt. So ist beispielsweise das Auflösungsvermögen einer Polyacryla- midgelelektrophorese größer als das einer Agarosegelelektrophorese. Fer- ner hängt das Auflösungsvermögen auch maßgeblich von der (Vernet- zungs)dichte des Gels ab, wobei gilt, dass je größer die (Vernet- zungs)dichte des Gels ist, umso größer das Auflösungsvermögen ist. Abgesehen davon hängt das Auflösungsvermögen auch von den konkreten Verfahrensparametern ab, wie der bei der Elektrophorese angelegten Spannung und insbesondere der Dauer der Elektrophorese. Je länger die Dauer der Elektrophorese, d.h. die Zeit, für welche an das Gel Spannung angelegt wird, ist, desto größer ist das Auflösungsvermögen. Wird bei der Elektrophorese die Spannung zu gering eingestellt, kann es aufgrund der zu niedrigen Spannung zu Diffusionseffekten in andere Richtungen als die Auftrennungsrichtung kommen, so dass unscharfe Banden erhalten werden, welche zu einer Verringerung des Auflösungsvermögens führen. Mit einem denaturierenden Gel werden üblicherweise exaktere Größenauf- trennungen erreicht als mit einem nicht denaturierenden Gel. Ferner hängt das Auflösungsvermögen in geringem Ausmaß auch von der Art der Visualisierung der einzelnen bei der Elektrophorese erhaltenen Banden ab. Mithin wird das Auflösungsvermögen z durch die Summe aller der vorgenannten Parameter, welche bei dem in dem erfindungsgemäßen Verfahren konkret eingesetzten Elektrophoreseverfahren eingestellt werden, bestimmt.It is known that the resolution of an electrophoresis process depends on many factors, in particular the type of gel used. For example, the resolution of polyacrylamide gel electrophoresis is greater than that of agarose gel electrophoresis. Furthermore, the resolving power also depends significantly on the (crosslinking) The greater the (crosslinking) density of the gel, the greater the resolution. Apart from that, the resolving power also depends on the concrete process parameters, such as the voltage applied in the electrophoresis and in particular the duration of the electrophoresis. The longer the duration of the electrophoresis, ie the time for which tension is applied to the gel, the greater the resolution. If the voltage is set too low in the electrophoresis, diffusion effects in directions other than the separation direction may be caused due to the too low voltage, so that fuzzy bands are obtained, which leads to a reduction of the resolution. With a denaturing gel, more exact size separations are usually achieved than with a non-denaturing gel. Furthermore, the resolution capacity also depends to a small extent on the type of visualization of the individual bands obtained in the electrophoresis. Thus, the resolution z is determined by the sum of all of the aforementioned parameters, which are set in the electrophoresis method actually used in the method according to the invention.
Bei üblicher, dem Fachmann bekannter Verfahrensführung der Elektrophorese ergeben sich für die drei bekanntesten Elektrophorese verfahren beispielsweise folgende maximale Auflösungsvermögen:In conventional, known in the art process control of electrophoresis, for example, the following maximum resolving power results for the three best-known electrophoresis method:
Polyacrylamidgelelektrophorese: bis zu 1 b bzw. bp,Polyacrylamide gel electrophoresis: up to 1 b or bp,
Agarosegelelektrophorese: ca. 10 bis 20 b bzw. bp,Agarose gel electrophoresis: approx. 10 to 20 b or bp,
Kapillargelelektrophorese: bis zu 1 b bzw. bp.Capillary gel electrophoresis: up to 1 b or bp.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Abwesenheit einer Zielsequenz umfasst im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl die Bestimmung, ob die Zielsequenz vorhanden ist oder nicht, als auch die Bestimmung, in welcher Anzahl die Zielsequenz vorhanden ist, also ob eine Monosomie, Disomie oder Trisomie vorliegt.A method for determining the presence and / or absence of a target sequence in the context of the present invention comprises both Determining whether or not the target sequence is present, as well as determining the number of target sequences present, whether monosomy, disomy, or trisomy.
Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass sich erstens alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge um maximal x Basenpaare, also um weniger als das Auflösungsvermögen z des in dem Verfahrensschritt ii) eingesetztenSince in the method according to the invention the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are selected so that, firstly, all of the amplificates obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs are maximally x base pairs in length, ie less than the resolution z of the used in the process step ii)
Elektrophoreseverfahrens, unterscheiden, werden für alle pro zu bestimmender Zielsequenz eingesetzten Primerpaare Amplifikate mit durch das Elektrophoreseverfahren nicht unterscheidbarer Länge erhalten. Indem bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Primerpaare für jede der we- nigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass sich zweitens alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um we- nigstens y Basenpaare, also um mehr als das Auflösungsvermögen z des in dem Verfahrensschritt ii) eingesetzten Elektrophoreseverfahrens, unterscheiden, sind alle pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhaltenen Amplifikate in dem eingesetzten Elektrophoreseverfahren von den für die jeweils anderen Zielsequenzen erhaltenen Amplifikaten unterscheidbar. Mithin werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels PCR bzw. LCR erheblich weniger Amplifikate mit in der E- lektrophorese unterscheidbarer Länge, nämlich eine der Anzahl der zu bestimmenden Zielsequenzen entsprechende Anzahl an Amplifikaten un- terscheidbarer Länge, erhalten als mit den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren. Während beispielsweise bei den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren für die Charakterisierung von 5 unterschiedlichen Zielsequenzen in einer Einzelzelle mittels PCR bei Einsatz von 10 verschiedenen Primerpaaren pro Zielsequenz bis zu 50 PCR-Electrophoresis method are distinguished, are obtained for each primer pairs used for each target sequence to be determined amplificates with indistinguishable by the electrophoresis method length. In the method according to the invention, the primer pairs are selected for each of the at least two target sequences to be determined such that, secondly, all of the amplicons obtainable with the primer pairs in the amplification reaction per amplification reaction are different in length from those in the amplification reaction for any other target sequence amplicons available with the primer pairs differ by at least y base pairs, ie by more than the resolution z of the electrophoresis method used in method step ii), all amplificates to be determined with the primer pairs obtained in the electrophoresis method used are from those for each distinguishable from other target sequences. Thus, in the method according to the invention for the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample by means of PCR or LCR considerably less amplificates with in E- lektrophorese distinguishable length, namely one of the number of target sequences to be determined Number of amplificates distinguishable length, obtained as with the known from the prior art method. For example, while the methods known from the prior art for the characterization of 5 different target sequences in a single cell by PCR when using 10 different primer pairs per target sequence up to 50 PCR
Produkte mit sich unterscheidender und auch in dem zwecks Nachweis der Amplifikate eingesetzten Elektrophoreseverfahren unterscheidbarer Länge erhalten werden, werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bei dem Einsatz derselben Menge an unterschiedlichen Primerpaaren 5 PCR- Produkte mit in dem Elektrophoreseverfahren unterscheidbarer Länge erhalten, welche wesentlich einfacher und schneller hinsichtlich ihrer Länge charakterisiert werden können als 50 PCR-Produkte mit unterscheidbarer Länge. Mithin ist das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich weniger arbeits-, zeit- und kostenintensiv als die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren.In the method according to the invention, when using the same amount of different primer pairs, 5 PCR products having a length which can be differentiated in the electrophoresis method are obtained in the method according to the invention which are much simpler and faster with respect to the electrophoresis method of differing length which is also used in the detection of the amplified products Their length can be characterized as 50 PCR products with distinguishable length. Thus, the inventive method is much less labor, time and cost intensive than the known from the prior art method.
Dies sei an einem Gedankenexperiment erläutert. Es soll anhand eines Polkörpers bestimmt werden, ob dieser die Chromosomen 13, 18 und 21 enthält. Da in einem Polkörper nur ein haploider Chromosomensatz, also eine sehr geringe Menge an Nukleinsäure vorliegt, liegt die Wahrscheinlichkeit, bei einer PCR mit einem Primerpaar gemäß dem Stand der Technik ein entsprechendes PCR-Produkt zu erhalten bei erfahrungsgemäß deutlich unterhalb von 100 %. Aus diesem Grund werden in der PCR für jedes zu charakterisierende Chromosom 10 verschiedene Primerpaare eingesetzt. Aufgrund der großen Anzahl an pro Zielsequenz eingesetzter Primerpaare kann mit nahezu 100 %-iger Sicherheit auf die Anwesenheit des Zielchromosoms geschlossen werden, wenn in der PCR wenigstens ein PCR-Produkt für ein Primerpaar erhalten wird, welches für einen Sequenzabschnitt in dem Zielchromosom spezifisch ist. Alle Primerpaare für das Chromosom 13 werden so entworfen, dass alle diese Primerpaare bei der Amplifikation ein PCR-Produkt mit einer Länge von 100 Basenpaaren ergeben. Ferner werden alle Primerpaare für das Chromosom 18 so entworfen, dass alle diese Primerpaare bei der Amplifikation ein PCR-Produkt mit einer Länge von 300 Basenpaaren ergeben, wohingegen alle Primer- paare für das Chromosom 21 so entworfen werden, dass alle diese Primerpaare bei der Amplifikation ein PCR-Produkt mit einer Länge von 500 Basenpaaren ergeben. Nach der Durchführung der PCR wird der PCR- Ansatz auf ein Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt, bevor das Agarosegel mit Ethidiumbromid gefärbt und die Anzahl der er- haltenen Banden bestimmt wird. Bei diesem Experiment können in dem Agarosegel maximal drei verschiedene DNA-Banden erhalten werden, nämlich Banden bei 100, 300 und 500 Basenpaaren, wenn die Chromosomen 13, 18 und 21 in dem Polkörper vorliegen. Mithin ist die Anforderung an die Trennleistung des Gels sehr gering. Ferner muss lediglich die An- bzw. Abwesenheit von PCR- Produkten mit drei spezifischen Längen festgestellt werden, so dass das Verfahren sehr schnell und mit wenig Arbeitsaufwand durchgeführt werden kann.This is explained by a thought experiment. It should be determined on the basis of a polar body whether it contains chromosomes 13, 18 and 21. Since there is only one haploid set of chromosomes in a polar body, ie a very small amount of nucleic acid, the probability of obtaining a corresponding PCR product in a PCR with a primer pair according to the prior art is clearly below 100% in experience. For this reason, 10 different primer pairs are used in the PCR for each chromosome to be characterized. Due to the large number of primer pairs used per target sequence, the presence of the target chromosome can be concluded with almost 100% certainty if at least one PCR product for a primer pair which is specific for a sequence segment in the target chromosome is obtained in the PCR. All primer pairs for chromosome 13 are designed to include all of these primer pairs the amplification yield a PCR product with a length of 100 base pairs. Further, all primer pairs for chromosome 18 are designed so that all of these primer pairs will yield a 300 base pair PCR product upon amplification, whereas all primer pairs for chromosome 21 will be designed so that all of these primer pairs will be amplified give a PCR product with a length of 500 base pairs. After carrying out the PCR, the PCR batch is applied to an agarose gel and electrophoretically separated before the agarose gel is stained with ethidium bromide and the number of bands obtained is determined. In this experiment, a maximum of three different DNA bands can be obtained in the agarose gel, namely bands at 100, 300 and 500 base pairs when chromosomes 13, 18 and 21 are present in the polar body. Thus, the requirement for the separation efficiency of the gel is very low. Furthermore, only the presence or absence of PCR products with three specific lengths has to be determined, so that the process can be carried out very quickly and with little work.
Unter Zielsequenz wird im Sinne der vorliegenden Erfindung eine beliebige Nukleinsäuresequenz verstanden, wohingegen unter einer biologischen Probe eine Probe verstanden wird, in der Nukleinsäure von wenigstens einem Individuum enthalten ist. Mithin kann die biologische Probe auch Nukleinsäure von zwei oder mehr Individuen enthalten, also ein Mischprobe sein.For the purposes of the present invention, the term target sequence is understood to mean any nucleic acid sequence, whereas a biological sample is understood as meaning a sample in which nucleic acid from at least one individual is contained. Thus, the biological sample may also contain nucleic acid from two or more individuals, so be a mixed sample.
Erfindungsgemäß werden die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu charakterisierenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate im Wesentlichen die gleiche Länge aufwei- sen, nämlich sich hinsichtlich ihrer Länge um maximal x Basenpaare unterscheiden, wobei x kleiner als das Auflösungsvermögen des eingesetzten Elektrophoreseverfahrens ist, d.h. alle der bei der Amplifϊkationsreak- tion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifϊkate mit dem eingesetzten Elektrophoreseverfahren hinsichtlich ihrer Länge nicht unterscheidbar sind. Indem sich die Amplifikate für eine Zielsequenz in ihrer Länge um bis zu dem Auflösungsvermögen des Elektrophoreseverfahrens unterscheiden können, wird eine gewisse Freiheit bezüglich der Konstruktion der Primer gewonnen. Andererseits weisen die einzelnen, für jede Zielsequenz erhaltenen Amplifϊkate im Wesentli- chen die gleiche Länge auf, so dass bei einer entsprechend durchgeführten Elektrophorese immer noch eine scharfe DNA-Bande erhalten wird.According to the invention, the primer pairs are selected for each of the at least two target sequences to be characterized in such a way that all of the amplificates obtainable with the primer pairs in the amplification reaction have essentially the same length, namely a maximum of x base pairs in length where x is smaller than the resolution of the electrophoresis method used, ie all of the Amplifϊkate available in the Amplifϊkationsreak- tion per target sequence to be determined with the primer pairs with the electrophoresis method used in terms of their length are indistinguishable. By allowing the amplificates for a target sequence to differ in length by as much as the resolution of the electrophoresis technique, some freedom in the design of the primers is gained. On the other hand, the individual amplifcates obtained for each target sequence have essentially the same length, so that, when electrophoresis is carried out appropriately, a sharp DNA band is still obtained.
In dem Schritt ii) des erfindungsgemäßen Verfahrens können alle dem Fachmann bekannten Elektrophoreseverfahren eingesetzt werden. Ledig- lieh beispielsweise seien in diesen Zusammenhang Agarosegelelektropho- rese, Polyacrylamidgelelektrophorese und Kapillarelektrophorese genannt. Die Art der eingesetzten Methode zur Bestimmung der Länge der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifϊkate kann in Abhängigkeit von dem Unterschied der Länge zwischen Amplifϊkaten un- terschiedlicher Zielsequenzen und in Abhängigkeit des geringfügigen Unterschieds der Länge der einzelnen, pro Zielsequenz erhaltenen Amplifϊkate ausgewählt werden. Ist der Unterscheid in der Längen der Amplifϊkate unterschiedlicher Zielsequenzen vergleichsweise groß, beträgt dieser beispielsweise 100 Basenpaare, kann für diesen Zweck beispielsweise ein Agarosegel, eingesetzt werden, wohingegen andernfalls ein hochauflösendes Polyacrylamidgel eingesetzt werden sollte.In step ii) of the process according to the invention, it is possible to use all electrophoresis processes known to the person skilled in the art. For example, in this context, agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis and capillary electrophoresis may be mentioned. The type of method used to determine the length of the amplified cells obtained in the at least one amplification reaction can be selected as a function of the difference in length between amplifications of different target sequences and in dependence on the slight difference in the length of the individual amplicons obtained per target sequence. If the difference in the lengths of the amplifications of different target sequences is comparatively large, this amounts to, for example, 100 base pairs, an agarose gel, for example, may be used for this purpose, whereas otherwise a high-resolution polyacrylamide gel should be used.
Vorzugsweise werden die Primerpaare für alle der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primer- paaren erhältlichen Amplifϊkate in ihrer Länge um maximal 10 Basenpaare, weiter bevorzugt um maximal 5 Basenpaare, ferner bevorzugt um maximal 4 Basenpaare, insbesondere bevorzugt um maximal 3 Basenpaare, besonders bevorzugt um maximal 2 Basenpaare und ganz besonders be- vorzugt um maximal 1 Basenpaar unterscheiden. Höchst bevorzugt werden die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu charakterisierenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu charakterisierender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifϊkate bezüglich ihrer Länge identisch sind, sich also in ihrer Länge um 0 Basenpaare unterscheiden.Preferably, the primer pairs for all of the at least two target sequences to be determined are selected so that all of the target sequence to be determined in the amplification reaction per target sequence pairable Amplifϊkate available in their length by a maximum of 10 base pairs, more preferably by a maximum of 5 base pairs, further preferably by a maximum of 4 base pairs, more preferably by a maximum of 3 base pairs, more preferably by a maximum of 2 base pairs and most preferably distinguished by a maximum of 1 base pair. Most preferably, the primer pairs for each of the at least two target sequences to be characterized are selected so that all of the amplifcates obtainable with the primer pairs for each amplification reaction are identical in length, ie differ in their length by 0 base pairs.
Um eine einfache Detektion der einzelnen bei der Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate zu ermöglichen, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so auszuwählen, dass sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um mehr als 10 Basenpaare unter- scheiden. Vorzugsweise werden die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Prim- erpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt um wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 100 Basenpaare unterscheiden.In order to enable a simple detection of the individual amplification products obtained in the amplification reaction, it is proposed in a development of the invention to select the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined so that all of the amplicons obtainable with the primer pairs in the amplification reaction per target sequence to be determined differ in their length from the amplicons available in the amplification reaction for each other target sequence with the primer pairs by more than 10 base pairs. Preferably, the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are selected such that all of the amplicons obtainable from the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs are identical in length to the amplicons obtainable from the amplification reaction for each other target sequence with the primer pairs differ by at least 25 base pairs, more preferably by at least 50 base pairs, and most preferably by at least 100 base pairs.
Erfϊndungsgemäß umfasst das Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und /oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiede- nen Zielsequenzen in einer biologischen Probe den Verfahrensschritt der Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion, also einer PCR, einer LCR, mehrerer PCR's oder mehrerer LCR's. Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine (Multiplex-) PCR oder eine (Multip- lex-)LCR durchgeführt, in der alle für die zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit der wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen erforderlichen Primerpaare eingesetzt werden, wenn die Anzahl der eingesetzten Primerpaare eine Multiplex-PCR oder eine (Multip- lex-)LCR zulassen. Alternativ dazu ist es insbesondere in dem Fall, dass die Anzahl der eingesetzten Primer für eine einzelne Multiplex-PCR bzw. (Multiplex-) LCR zu groß ist, auch möglich, mehrere Multiplex-PCR' s bzw. (Multiplex-)PCR's durchzuführen, in denen jeweils ein Teil der für die zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit der wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen erforderlichen Primerpaare eingesetzt wer- den. Nach der PCR bzw. LCR können die Einzelproben dann einzeln bezüglich der vorhandenen PCR-Produkte bzw. LCR-Produkte untersucht werden oder vorzugsweise zunächst miteinander vermischt werden, bevor die Länge der erhaltenen PCR-Produkte bzw. LCR-Produkte bestimmt wird. Diese Ausführungsform kann beispielsweise angewendet werden, wenn Zielsequenzen aus unterschiedlichen Individuen charakterisiert werden sollen, wobei zunächst mit der Nukleinsäure eines jeden Individuums eine PCR bzw. LCR durchgeführt wird, bevor die einzelnen PCR- Ansätze bzw. LCR-Ansätze miteinander vermischt werden und dann die Länge der erhaltenen PCR-Produkte bzw. LCR-Produkte bestimmt wird.According to the invention, the method comprises the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least two different NEN target sequences in a biological sample, the process step of performing at least one amplification reaction, ie a PCR, an LCR, multiple PCR's or multiple LCR's. Preferably, in the method according to the invention, a (multiplex) PCR or a (multiplex) LCR is carried out, in which all the primer pairs required for determining the presence and / or absence of the at least two different target sequences are used, if the number of primers used primer pairs a multiplex PCR or a (multi-lex) LCR allow. Alternatively, in particular in the case where the number of primers used is too large for a single multiplex PCR or (multiplex) LCR, it is also possible to carry out a plurality of multiplex PCRs or (multiplex) PCRs, in which in each case a part of the primer pairs required for determining the presence and / or absence of the at least two different target sequences are used. After the PCR or LCR, the individual samples can then be examined individually with respect to the existing PCR products or LCR products or, preferably, first mixed together before the length of the resulting PCR products or LCR products is determined. This embodiment can be used, for example, when target sequences from different individuals are to be characterized, wherein initially with the nucleic acid of each individual a PCR or LCR is performed before the individual PCR approaches or LCR approaches are mixed together and then the length the PCR products or LCR products obtained is determined.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe, welche nur wenig Nukleinsäure enthält. Daher eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer Einzelzelle oder in einem Polkörper.The method according to the invention is particularly suitable for determining the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample which contains only a small amount of nucleic acid. Therefore, the method according to the invention is particularly suitable for determining the presence and / or absence of at least two different target sequences in a single cell or in a polar body.
Bei den wenigstens zwei zu charakterisierenden Zielsequenzen kann es sich jeweils um eine beliebige Nukleinsäuresequenz handeln. Beispielsweise kann es sich bei den wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen jeweils, unabhängig voneinander, um ein Chromosom, um ein Gen, um einen Genabschnitt oder um eine nicht-kodierende Nukleinsäuresequenz handeln. Zum Beispiel können mit dem erfindungsgemäßen Verfah- ren drei unterschiedliche Zielsequenzen bezüglich ihrer Anwesenheit bzw. Abwesenheit charakterisiert werden, von denen jede ein Chromosom ist.The at least two target sequences to be characterized may each be any nucleic acid sequence. For example, the at least two target sequences to be determined may each independently, be a chromosome, a gene, a gene segment or a non-coding nucleic acid sequence. For example, with the method of the invention, three different target sequences can be characterized for their presence or absence, each of which is a chromosome.
Da sich das erfindungsgemäße Verfahren insbesondere für den Einsatz vieler Primerpaare eignet, wird in Weiterbildung des Erfindungsgedankens vorgeschlagen, bei diesem gleichzeitig 3 bis 50 verschiedene Zielsequenzen, vorzugsweise 5 bis 25 verschiedene Zielsequenzen und besonders bevorzugt 7 bis 15 verschiedene Zielsequenzen bezüglich ihrer Anwesenheit bzw. Abwesenheit zu bestimmen.Since the method according to the invention is particularly suitable for the use of many pairs of primers, it is proposed in the invention that 3 to 50 different target sequences, preferably 5 to 25 different target sequences and particularly preferably 7 to 15 different target sequences with regard to their presence or absence be added determine.
Die Anzahl der pro zu bestimmender Zielsequenz einzusetzenden Primerpaare hängt zum einen von der gewünschten statistischen Sicherheit des Ergebnisses und zum anderen von der in der biologischen Probe enthaltenen Menge an Nukleinsäure ab. Je größer die eingesetzte Nukleinsäure- menge ist, desto weniger Primerpaare pro zu charakterisierender Zielse- quenz reichen aus, um zu einem aussagekräftigen Ergebnis zu kommen. Hingegen müssen umso mehr Primerpaare eingesetzt werden, desto größer die statistische Sicherheit des Ergebnisses sein soll. Unter Berücksichtigung der beiden vorgenannten Tendenzen werden in der Amplifikati- onsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz vorzugsweise 3 bis 50 Pri- merpaare, besonders bevorzugt 4 bis 25 Primerpaare, ganz besonders bevorzugt 5 bis 20 Primerpaare und höchst bevorzugt, insbesondere in dem Fall des Einsatzes einer Einzelzelle als biologische Probe, 10 bis 15 Primerpaare eingesetzt.The number of primer pairs to be used per target sequence to be determined depends on the one hand on the desired statistical certainty of the result and on the other hand on the amount of nucleic acid contained in the biological sample. The larger the amount of nucleic acid used, the fewer primer pairs per target sequence to be characterized suffice to obtain a meaningful result. On the other hand, the more primer pairs must be used, the greater the statistical reliability of the result should be. Taking into account the two above-mentioned tendencies, in the amplification reaction per target sequence to be determined preferably 3 to 50 primer pairs, more preferably 4 to 25 primer pairs, are very particular preferably 5 to 20 primer pairs and most preferably, in particular in the case of the use of a single cell as a biological sample, 10 to 15 primer pairs used.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die wenigstens 3 pro zu bestimmender Zielsequenz einzusetzenden Primerpaare daran angepasst, in einer Amplifikationsreak- tion nicht überlappende Bereiche der zu charakterisierender Zielsequenz zu amplifizieren. Dabei können die wenigstens 3 pro zu bestimmender Zielsequenz einzusetzenden Primerpaare Bindungsstellen in dem kodierenden Bereich der Zielsequenz oder in dem nicht kodierenden Bereich der Zielsequenz aufweisen.According to a further preferred embodiment of the present invention, the at least 3 primer pairs to be used for each target sequence to be determined are adapted to amplify non-overlapping regions of the target sequence to be characterized in an amplification reaction. The at least 3 primer pairs to be used for each target sequence to be determined may have binding sites in the coding region of the target sequence or in the non-coding region of the target sequence.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegen- de Erfindung ein Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens drei verschiedenen Zielsequenzen in einer Einzelzelle umfassend:According to a further preferred embodiment, the present invention relates to a method for the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least three different target sequences in a single cell comprising:
i) die Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR oder eine LCR ist, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz wenigstens 3 verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, und anschließend ii) den Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate umfassend die Durchführung eines E- lektrophoreseverfahrens,i) carrying out at least one amplification reaction, wherein the at least one amplification reaction is a PCR or an LCR in which at least 3 different primer pairs are used per target sequence to be determined, and then ii) the detection of the amplicons obtained in the at least one amplification reaction comprising the implementation an electrophoresis method,
wobei die Primerpaare für jede der wenigstens drei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass - alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate die gleiche Länge aufweisen und dasswherein the primer pairs for each of the at least three target sequences to be determined are selected such that all of the amplificates obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs have the same length and
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten unterscheiden.all amplicons obtainable from the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ in their length from the amplicons obtainable in the amplification reaction for each other target sequence with the primer pairs.
Vorzugsweise werden die Primerpaare für jede der wenigstens drei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt, dass sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens 1 Basenpaar, bevorzugt um wenigstens 3 Basenpaare, besonders bevorzugt um wenigstens 5 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 10 Basenpaare unterscheiden. Um eine noch einfachere Unterscheidung zwischen den einzelnen Amplifikaten zu erhalten, werden die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen bevorzugt so ausgewählt, dass sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens 25 Basenpaa- re, besonders bevorzugt um wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 100 Basenpaare unterscheiden.Preferably, the primer pairs for each of the at least three target sequences to be determined are selected such that all of the amplicons obtainable with the primer pairs in the amplification reaction for each amplification reaction are at least equal in length to the amplicons obtainable from the amplification reaction for each other target sequence with the primer pairs 1 base pair, preferably by at least 3 base pairs, more preferably by at least 5 base pairs, and most preferably by at least 10 base pairs. In order to obtain an even simpler distinction between the individual amplicons, the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are preferably selected so that all of the amplicons obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs are of the same length as in the Amplification reaction for each other target sequence with the primer pairs available amplificates differ by at least 25 base pairs, more preferably by at least 50 base pairs and most preferably by at least 100 base pairs.
Dieses Verfahren eignet sich insbesondere zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit aller 46 Chromosomen in einer diploiden hu- manen Einzelzelle bzw. aller 23 Chromosomen in einer haploiden humanen Einzelzelle.This method is particularly suitable for determining the presence and / or absence of all 46 chromosomes in a diploid human body. single cell or all 23 chromosomes in a haploid human single cell.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur gleich- zeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels wenigstens einer Amplifikationsreaktion, enthaltend:A further subject of the present invention is a kit for the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample by means of at least one amplification reaction, comprising:
i) ein Protokoll zur Durchführung einer PCR oder einer LCR als Ampli- fikationsreaktion, ii) ein Protokoll zur Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens, wobei das Auflösungsvermögen des in dem Protokoll beschriebenen Elektrophoreseverfahrens z Basenpaare bzw. Basen beträgt, sowie iii) jeweils wenigstens drei voneinander verschiedene Primerpaare für jede der wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen, wobeii) a protocol for carrying out a PCR or an LCR as amplification reaction, ii) a protocol for carrying out an electrophoresis method, wherein the resolving power of the electrophoresis method described in the protocol is z base pairs or bases, and iii) in each case at least three mutually different primer pairs for each of the at least two different target sequences, wherein
die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt sind, dassthe primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are selected such that
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge um maximal x Basenpaare unterscheiden und dassall of the amplificates obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ in their length by a maximum of x base pairs and in that
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede an- dere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare unterscheiden, wobei x < z und y > z ist.in terms of their length, all of the amplicons obtainable from the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ by at least y base pairs from the amplicons obtainable with the primer pairs for each other target sequence in the amplification reaction, where x <z and y> z ,
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, dass die in dem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Primerpaare so ausgewählt sind, dass die sich ergebende Längendifferenz x der Amplifikate kleiner gleich 10 Basenpaare, bevorzugt kleiner gleich 5 Basenpaare, weiter bevorzugt kleiner gleich 4 Basenpaare, insbesondere bevorzugt kleiner gleich 3 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner gleich 2 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner gleich 1 Basenpaar und höchst bevorzugt 0 Basenpaare beträgt.In a further development of the inventive concept, it is proposed that the primer pairs contained in the kit according to the invention are selected in this way in that the resulting difference in length x of the amplificates is less than or equal to 10 base pairs, more preferably less than or equal to 4 base pairs, more preferably less than or equal to 3 base pairs, more preferably less than or equal to 2 base pairs, most preferably less than or equal to 1 base pair most preferably 0 base pairs.
Ferner ist es bevorzugt, dass die in dem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Primerpaare so ausgewählt sind, dass die sich ergebende Längendiffe- renz y wenigstens 10 Basenpaare, besonders bevorzugt wenigstens 25 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt wenigstens 50 Basenpaare und höchst bevorzugt wenigstens 100 Basenpaare beträgt.Furthermore, it is preferred that the primer pairs contained in the kit according to the invention are selected such that the resulting length difference y is at least 10 base pairs, more preferably at least 25 base pairs, most preferably at least 50 base pairs, and most preferably at least 100 base pairs.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das erfin- dungsgemäße Kit so viele und derart ausgewählte Primerpaare, dass es dazu geeignet ist, die An- oder Abwesenheit aller in der biologischen Probe vorliegenden humanen Chromosomen, d.h. von 23 oder 46 humanen Chromosomen, zu bestimmen. According to a further preferred embodiment, the kit according to the invention contains so many and so selected primer pairs that it is suitable for determining the presence or absence of all human chromosomes present in the biological sample, i. of 23 or 46 human chromosomes.

Claims

Patentansprüche; claims;
1. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe umfassend: i) die Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR oder eine LCR ist, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz wenigstens 3 verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, und anschließend ii) den Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate umfassend die Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dassA method for determining the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample comprising: i) performing at least one amplification reaction, wherein the at least one amplification reaction is a PCR or an LCR, wherein at least 3 ii) detecting the amplicons obtained in the at least one amplification reaction, comprising carrying out an electrophoresis method, characterized in that the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are selected such that
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge um maximal x Basenpaare unterscheiden und dassall of the amplificates obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ in their length by a maximum of x base pairs and in that
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare unterscheiden, wobei x ≤ z und y > z ist, wobei z das Auflösungsvermögen des in dem Schritt ii) durchgeführten Elektrophoreseverfahrens ist.all of the amplicons obtainable with the primer pairs in the amplification reaction for each target sequence to be determined differ in their length from the amplicons obtainable with the primer pairs for the amplification reaction for each other target sequence by at least y base pairs, where x ≦ z and y> z, z is the resolving power of the electrophoresis method performed in step ii).
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass das als Elektrophoreseverfahren eine Agarosegelelektrophorese, eine Polyacrylamidgelelektrophorese oder eine Kapillarelektrophorese durchgeführt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the electrophoresis method is an agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis or capillary electrophoresis.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Längendifferenz x kleiner gleich 10 Basenpaare, bevorzugt kleiner gleich 5 Basenpaare, weiter bevorzugt kleiner gleich 4 Basenpaare, insbesondere bevorzugt kleiner gleich 3 Basenpaare, beson- ders bevorzugt kleiner gleich 2 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner gleich 1 Basenpaar und höchst bevorzugt 0 Basenpaare beträgt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the length difference x is less than or equal to 10 base pairs, preferably less than or equal to 5 base pairs, more preferably less than or equal to 4 base pairs, particularly preferably less than or equal to 3 base pairs, particularly preferably less than or equal to 2 base pairs. most preferably less than or equal to 1 base pair and most preferably 0 base pairs.
4. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Längendifferenz y wenigstens 10 Basenpaare, bevorzugt wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt wenigstens 100 Basenpaare beträgt.4. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the length difference y is at least 10 base pairs, preferably at least 25 base pairs, more preferably at least 50 base pairs and most preferably at least 100 base pairs.
5. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt i) mehrere Multiplex-PCR's durchgeführt werden und die entsprechenden Proben nach der Durchführung der PCR's mit- einander vermischt werden, bevor der Schritt ii) durchgeführt wird.5. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that in step i) several multiplex PCR's are performed and the corresponding samples are mixed together after performing the PCR's before step ii) is performed.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Schritt i) mehrere Multiplex-LCR's durchgeführt werden und die entsprechenden Proben nach der Durchführung der LCR's miteinander vermischt werden, bevor der Schritt ii) durchgeführt wird.6. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that in step i) a plurality of multiplex LCRs are carried out and the corresponding samples are mixed together after the LCRs have been carried out before the step ii) is carried out.
7. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe eine Einzelzelle oder ein Polkörper ist.7. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that the biological sample is a single cell or a polar body.
8. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass jede der wenigstens zwei Zielsequenzen, unabhängig voneinander, ein Chromosom, ein Gen, ein Genabschnitt oder eine nicht- kodierende Nukleinsäuresequenz ist.8. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that each of the at least two target sequences, independently of each other, a chromosome, a gene, a gene portion or a non-coding nucleic acid sequence.
9. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei diesem gleichzeitig 3 bis 50 verschiedene Zielsequenzen, vorzugsweise 5 bis 25 verschiedene Zielsequenzen und besonders bevorzugt 7 bis 15 verschiedene Zielsequenzen bestimmt werden.9. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that at the same time 3 to 50 different target sequences, preferably 5 to 25 different target sequences and more preferably 7 to 15 different target sequences are determined.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass bei diesem wenigstens drei unterschiedliche Zielsequenzen bestimmt werden und jede der wenigstens drei Zielsequenzen ein Chromosom ist.10. The method according to claim 9, characterized in that in this at least three different target sequences are determined and each of the at least three target sequences is a chromosome.
11. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz 3 bis 50 Primerpaare, vorzugsweise 4 bis 25 Primerpaare, besonders bevorzugt 5 bis 20 Primerpaare und ganz besonders bevorzugt 10 bis 15 Primerpaare eingesetzt werden.11. The method according to at least one of the preceding claims, characterized in that in the amplification reaction per target sequence to be determined 3 to 50 primer pairs, preferably 4 to 25 primer pairs, especially preferably 5 to 20 primer pairs and very particularly preferably 10 to 15 primer pairs are used.
12. Verfahren nach zumindest einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die wenigstens 3 pro zu bestimmender Zielsequenz einzusetzenden Primerpaare daran angepasst sind, in einer Amplifikationsreaktion nicht überlappende Bereiche der zu bestimmenden Zielsequenz zu amplifizieren.12. The method according to claim 1, characterized in that the at least three primer pairs to be used for each target sequence to be determined are adapted to amplify non-overlapping regions of the target sequence to be determined in an amplification reaction.
13. Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit und/ oder Abwesenheit von wenigstens drei verschiedenen Zielsequenzen in einer Einzelzelle umfassend: i) die Durchführung wenigstens einer Amplifikationsreaktion, wo- bei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR oder eine LCR ist, bei der pro zu bestimmender Zielsequenz wenigstens 3 verschiedene Primerpaare eingesetzt werden, und anschließend ii) den Nachweis der in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion erhaltenen Amplifikate umfassend die Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die Primerpaare für jede der wenigstens drei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass13. A method for the simultaneous determination of the presence and / or absence of at least three different target sequences in a single cell comprising: i) carrying out at least one amplification reaction, wherein the at least one amplification reaction is a PCR or an LCR, for each target sequence to be determined at least 3 different primer pairs are used, and then ii) the detection of the amplificates obtained in the at least one amplification reaction comprising carrying out an electrophoresis method, characterized in that the primer pairs for each of the at least three target sequences to be determined are selected such that
- alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate die gleiche Länge aufweisen und dassall of the amplificates obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs have the same length and
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten unterscheiden.all of the amplicons obtainable in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs have the same length as in the amplification reaction for distinguish each other target sequence with amplicons available from the primer pairs.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die Primerpaare für jede der wenigstens drei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt werden, dass sich alle der bei der Amplifi- kationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den14. The method according to claim 13, characterized in that the primer pairs are selected for each of the at least three target sequences to be determined so that all of the amplification in the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs available amplificates with respect to their length from those in the Amplification reaction for each other target sequence with the
Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens 1 Basenpaar, bevorzugt um wenigstens 3 Basenpaare, besonders bevorzugt um wenigstens 5 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt um wenigstens 10 Basenpaare unterscheiden.Amplifier pairs available at least 1 base pair, preferably by at least 3 base pairs, more preferably differ by at least 5 base pairs and most preferably by at least 10 base pairs.
15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass mit diesem die Anwesenheit und/ oder Abwesenheit aller 23 oder 46 Chromosomen in einer humanen Einzelzelle bestimmt wird.15. Method according to claim 13 or 14, characterized in that the presence and / or absence of all 23 or 46 chromosomes in a single human cell is determined therewith.
16. Kit zur Bestimmung der Anwesenheit und /oder Abwesenheit von wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen in einer biologischen Probe mittels wenigstens einer Amplifikationsreaktion, enthaltend: i) ein Protokoll zur Durchführung einer PCR oder einer LCR als Amplifikationsreaktion, ii) ein Protokoll zur Durchführung eines Elektrophoreseverfahrens, wobei das Auflösungsvermögen des in dem Protokoll beschriebenen Elektrophoreseverfahrens z Basenpaare bzw. Basen beträgt, sowie iii) jeweils wenigstens drei voneinander verschiedene Primerpaare für jede der wenigstens zwei verschiedenen Zielsequenzen, wobei die Primerpaare für jede der wenigstens zwei zu bestimmenden Zielsequenzen so ausgewählt sind, dass - sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender16. Kit for determining the presence and / or absence of at least two different target sequences in a biological sample by means of at least one amplification reaction, comprising: i) a protocol for carrying out a PCR or an LCR as amplification reaction, ii) a protocol for carrying out an electrophoresis method, wherein the resolving power of the electrophoresis method described in the protocol is z base pairs or bases, respectively iii) each having at least three mutually different primer pairs for each of the at least two different target sequences, wherein the primer pairs for each of the at least two target sequences to be determined are selected such that - all of those to be determined in the amplification reaction per
Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge um maximal x Basenpaare unterscheiden und dassTarget sequence with the primer pairs available amplificates differ in length by a maximum of x base pairs and that
- sich alle der bei der Amplifikationsreaktion pro zu bestimmender Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikate hinsichtlich ihrer Länge von den bei der Amplifikationsreaktion für jede andere Zielsequenz mit den Primerpaaren erhältlichen Amplifikaten um wenigstens y Basenpaare unterscheiden, wobei x < z und y > z ist.all amplicons obtainable from the amplification reaction per target sequence to be determined with the primer pairs differ in their length from the amplicons obtainable with the primer pairs for each other target sequence by at least y base pairs, where x <z and y> z.
17. Kit nach Anspruch 16, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die Längendifferenz x kleiner gleich 10 Basenpaare, bevorzugt kleiner gleich 5 Basenpaare, weiter bevorzugt kleiner gleich 4 Basen- paare, insbesondere bevorzugt kleiner gleich 3 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner gleich 2 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner gleich 1 Basenpaar und höchst bevorzugt 0 Basenpaare beträgt.17. Kit according to claim 16, characterized in that the difference in length x is less than or equal to 10 base pairs, preferably less than or equal to 5 base pairs, more preferably less than or equal to 4 base pairs, more preferably less than or equal to 3 base pairs, most preferably less than or equal to 2 base pairs, more particularly preferably less than or equal to 1 base pair and most preferably 0 base pairs.
18. Kit nach Anspruch 16 oder 17, dadurch g e k e n n z e i c h n e t, dass die Längendifferenz y wenigstens 10 Basenpaare, bevorzugt wenigstens 25 Basenpaare, besonders bevorzugt wenigstens 50 Basenpaare und ganz besonders bevorzugt wenigstens 100 Basenpaare be- trägt. 18. Kit according to claim 16 or 17, characterized in that the length difference y is at least 10 base pairs, preferably at least 25 base pairs, particularly preferably at least 50 base pairs and very particularly preferably at least 100 base pairs.
19. Kit nach zumindest einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass dieses so viele und derart ausgewählte Primerpaare enthält, dass es dazu geeignet ist, die An- oder Abwesenheit aller in der biologischen19. Kit according to at least one of claims 16 to 18, characterized in that it contains so many and so selected primer pairs that it is suitable for the presence or absence of all in the biological
Probe vorliegenden humanen Chromosomen zu bestimmen.Sample to determine present human chromosomes.
20. Kit nach zumindest einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass dieses so viele und derart ausgewählte Primerpaare enthält, dass es dazu geeignet ist, die An- oder Abwesenheit von 23 oder 46 humanen Chromosomen zu bestimmen. 20. Kit according to at least one of claims 16 to 18, characterized in that it contains so many and so selected primer pairs that it is suitable for determining the presence or absence of 23 or 46 human chromosomes.
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