WO2009050321A1 - Laforin-based cancer diagnosis and treatment method, biological elements for implementing same and use thereof - Google Patents

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Abstract

The invention relates to a cancer diagnosis method based on identifying the absence of, or a reduction in the expression of the protein laforin, intended preferably for colon cancer, breast cancer and kidney cancer. With the role of proteins malin and laforin in the regulation of oncogenic proteins established, the invention thus describes multiple therapeutic approaches based on the use of same in order to develop pharmaceutical compositions.

Description

PROCEDIMIENTO DE DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DEL CÁNCER BASADO EN LA LAFORINA, ELEMENTOS BIOLÓGICOS PARA LLEVARLOS A CABO Y SUS APLICACIONES. PROCEDURE FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER BASED ON LAFORINE, BIOLOGICAL ELEMENTS TO CARRY OUT THEM, AND ITS APPLICATIONS.
SECTOR DE LA TÉCNICASECTOR OF THE TECHNIQUE
La presente invención se circunscribe al sector de Ia biomedicina y, concretamente, al sector del diagnóstico y tratamiento de pacientes con cáncer, y más concretamente, al diagnóstico mediante herramientas biotecnológicas.The present invention is limited to the biomedicine sector and, specifically, to the sector of diagnosis and treatment of cancer patients, and more specifically, to the diagnosis by means of biotechnological tools.
ESTADO DE LA TÉCNICASTATE OF THE TECHNIQUE
La proteína laforina está codificada por el gen EPM2A situado en el cromosoma 6q24 y fue identificada a finales de los 90 en dos estudios independientes como una proteína cuya ausencia causaba Ia epilepsia mioclónica progresiva (PME) del tipo Lafora (LD, MIM 254780) (1 , 2, 3, 4). LD es una enfermedad grave caracterizada por un deterioro progresivo neurológico, mioclonía y epilepsia que se inicia durante Ia adolescencia (normalmente entre los 10 y 17 años de edad) y lleva al paciente a un estado vegetativo terminal en los 10 años siguientes al comienzo de Ia enfermedad (5). LD se caracteriza por Ia presencia de depósitos intracelulares de poliglucosanos en todos los tejidos, pero fundamentalmente en el sistema nervioso central y en el corazón (6, 7, 8, 9, 10, 11 ). La acumulación intracelular de poliglucosanos llevó a considerar Ia enfermedad como una alteración en los procesos de almacenaje celular. Datos recientes indican que LD es consecuencia de defectos en Ia regulación de proteínas implicadas en el metabolismo del glucógeno que llevan a una acumulación anormal de poliglucosanos en las neuronas alterando Ia fisiología celular y desencadenando procesos de muerte celular programada (apoptosis) (12). Se han identificado dos genes asociados a esta enfermedad. Así, además de EPM2A, que codifica para Ia laforina y que se encuentra mutado en un 50-60% de los casos de LD, se ha identificado un segundo gen en el cromosoma 6p22.3 denominado EPM2B que codifica para Ia proteína malina (13) y que está mutado en el 30-40% de los enfermos con LD. La eliminación del gen EPM2A en ratones produce un fenotipo similar al que se observa en los pacientes de LD, incluyendo Ia presencia de cuerpos de Lafora, neurodegeneración y trastornos neurológicos graves (14). Se ha descrito una forma de LD en perros que está causada por mutaciones en EPM2B (15).Laforin protein is encoded by the EPM2A gene located on chromosome 6q24 and was identified in the late 1990s in two independent studies as a protein whose absence caused progressive myoclonic epilepsy (PME) of the Lafora type (LD, MIM 254780) (1 , 2. 3. 4). LD is a serious disease characterized by a progressive neurological deterioration, myoclonus and epilepsy that begins during adolescence (usually between 10 and 17 years of age) and takes the patient to a terminal vegetative state in the 10 years following the beginning of Ia disease (5). LD is characterized by the presence of intracellular deposits of polyglucosan in all tissues, but mainly in the central nervous system and in the heart (6, 7, 8, 9, 10, 11). The intracellular accumulation of polyglucosanos led to consider the disease as an alteration in the processes of cellular storage. Recent data indicate that LD is a consequence of defects in the regulation of proteins involved in glycogen metabolism that lead to an abnormal accumulation of polyglucosan in neurons, altering cellular physiology and triggering processes of programmed cell death (apoptosis) (12). Two genes associated with this disease have been identified. Thus, in addition to EPM2A, which codes for laforin and that is mutated in 50-60% of cases of LD, a second gene has been identified on chromosome 6p22.3 called EPM2B that codes for the maline protein (13 ) and that it is mutated in 30-40% of patients with LD. The elimination of the EPM2A gene in mice produces a phenotype similar to that observed in LD patients, including the presence of Lafora bodies, neurodegeneration and serious neurological disorders (14). A form of LD has been described in dogs that is caused by mutations in EPM2B (15).
La laforina es una proteína de 331 aminoácidos con actividad fosfatasa de especificidad dual, que presenta un dominio funcional de unión a carbohidratos en el extremo amino-terminal (16, 17) e interacciona con varias proteínas, alguna de ellas implicada en el metabolismo del glucógeno como PTG (18), que es una de las subunidades reguladoras de Ia proteína fosfatasa 1 (PP1 ). La malina es una E3-ubicuitin ligasa de 395 aminoácidos que posee un dominio RING finger y seis dominios NHL (13, 19, 20).Laforin is a 331-amino acid protein with dual-specific phosphatase activity, which has a functional carbohydrate binding domain at the amino-terminal end (16, 17) and interacts with several proteins, some of them involved in glycogen metabolism. as PTG (18), which is one of the regulatory subunits of the protein phosphatase 1 (PP1). Maline is an E3-ubicuitin ligase of 395 amino acids that has a RING finger domain and six NHL domains (13, 19, 20).
Malina interacciona con laforina (19, 20) Io que indica que ambas proteínas actúan a través de una vía común y explica por qué los pacientes con mutaciones en laforina o malina son neurológica e histológicamente indistinguibles (21 , 22).Maline interacts with laforin (19, 20), which indicates that both proteins act through a common pathway and explains why patients with mutations in laforin or maline are neurologically and histologically indistinguishable (21, 22).
Inicialmente, se sugirió que Ia interacción entre malina y laforina regulaba negativamente laforina mediante degradación vía proteosoma (20). Similarmente, se ha sugerido que laforina es una fosfatasa de GSK3 y que es a través de Ia activación de GSK3 (defosforilación) como laforina inactiva a Ia glucógeno sintasa y Ia síntesis de glucógeno (19). Sin embargo, otros resultados han cuestionado el papel de laforina en Ia regulación de GSK3 (23, 24). En este sentido, se ha demostrado que laforina y malina regulan Ia actividad de Ia glucógeno sintasa y de otras proteínas importantes en Ia síntesis del glucógeno, como PTG, mediante un mecanismo novedoso que implica Ia degradación vía proteosoma de estas proteínas (12). Este mecanismo es particularmente importante en el caso de las neuronas porque estas células disponen de Ia maquinaria enzimática para sintetizar glucógeno pero no pueden degradarlo ya que no expresan Ia glucógeno fosfatasa (12). Laforina y malina se encargan de silenciar Ia síntesis de glucógeno en neuronas, evitando Ia acumulación de poliglucosanos y Ia activación de mecanismos apoptóticos en las neuronas (12).Initially, it was suggested that the interaction between maline and laforin negatively regulated laforin by degradation via proteasome (20). Similarly, it has been suggested that laforin is a GSK3 phosphatase and that it is through the activation of GSK3 (dephosphorylation) as inactive laforin to glycogen synthase and glycogen synthesis (19). However, other results have questioned the role of laforin in the regulation of GSK3 (23, 24). In this sense, it has been shown that laforin and maline regulate the activity of glycogen synthase and other proteins important in glycogen synthesis, such as PTG, by a novel mechanism that involves the degradation via proteasome of these proteins (12). This mechanism is particularly important in the case of neurons because these cells have the enzymatic machinery to synthesize glycogen but cannot degrade it since they do not express glycogen phosphatase (12). Laforin and maline are responsible for silencing glycogen synthesis in neurons, preventing the accumulation of polyglucosan and the activation of apoptotic mechanisms in neurons (12).
Recientemente, se ha descrito que el gen Epm2a es un gen que actuaría como supresor de tumores en una cepa de ratones inmunocomprometidos (línea TG-B de transgénicos para el receptor de células T) y se ha proporcionado evidencia experimental, utilizando líneas celulares de linfomas B y T humanas y murinas, de que el silenciamiento de Laforina juega un papel en el aumento de señalización a través de Ia vía de Wnt Io que es esencial para el desarrollo de tumores en un huésped inmunocomprometido (25). Además, Ia función de laforina como gen supresor de tumores se ha relacionado con Ia actividad de laforina de actuar como fosfatasa de GSK-3β (25). La relevancia de estos estudios en linfomas T humanos se ha extrapolado del estudio de un panel de líneas humanas de linfomas T en los que se analizó Ia expresión de laforina y Ia relación que existe entre niveles de expresión de laforina y acumulación de beta-catenina en el núcleo como un indicador de activación de Ia vía de señalización de Wnt. Así, en Ia las líneas CCRE-CEM, Jurkat y J45.01 no se detectó mRNA de Epm2a. En contraste, las líneas HH, H9 y MJ tienen mRNA de Epm2a y niveles muy bajos de beta-catenina nuclear. Estudios adicionales muestran una correlación entre Ia expresión del gen Epm2a y Ia reducción de beta-catenina, Io que sugiere que Ia represión epigenética de Emp2a podría jugar un papel en Ia activación de Ia vía de señalización de Wnt en linfomas T humanos. Sin embargo, estos resultados contrastan con el hecho de que los pacientes con LD, los portadores de mutaciones en EPM2A en heterocigosis, o los ratones genéticamente modificados que carecen de laforina o en los que se sopreexpresa una forma inactiva de laforina (14, 26), no muestran una mayor predisposición a tumores. Por todo ello, aunque los datos generados en el modelo de ratón y en las líneas de linfomas son sugerentes, está todavía por establecer si el silenciamiento de Laforina se asocia a Ia aparición de tumores en humanos y si es así, si el papel de laforina como supresor de tumores es extensible a otros cánceres ademas de los linfomas de células T o B o a individuos que no estén inmunocomprometidos.Recently, it has been described that the Epm2a gene is a gene that would act as a tumor suppressor in a strain of immunocompromised mice (TG-B transgenic line for the T cell receptor) and experimental evidence has been provided, using lymphoma cell lines Human and murine B and T, that Laforin silencing plays a role in increasing signaling through the Wnt Io pathway that is essential for the development of tumors in an immunocompromised host (25). In addition, the role of laforin as a tumor suppressor gene has been related to the activity of laforin to act as a GSK-3β phosphatase (25). The relevance of these studies in human T lymphomas has been extrapolated from the study of a panel of human T-lymphoma lines in which the expression of laforin was analyzed and the relationship between levels of laforin expression and accumulation of beta-catenin in the core as an indicator of activation of the Wnt signaling pathway. Thus, in the lines CCRE-CEM, Jurkat and J45.01 no mRNA of Epm2a was detected. In contrast, the HH, H9 and MJ lines have Epm2a mRNA and very low levels of nuclear beta-catenin. Additional studies show a correlation between the expression of the Epm2a gene and the reduction of beta-catenin, which suggests that the epigenetic repression of Emp2a could play a role in the activation of the Wnt signaling pathway in human T lymphomas. However, these results contrast with the fact that patients with LD, carriers of mutations in EPM2A in heterozygosis, or genetically modified mice that they lack laforin or in which an inactive form of laforin is overexpressed (14, 26), they do not show a greater predisposition to tumors. Therefore, although the data generated in the mouse model and lymphoma lines are suggestive, it remains to be established whether Laforin silencing is associated with the appearance of tumors in humans and if so, if the role of laforin As a tumor suppressor it is extensible to other cancers in addition to T or B cell lymphomas or to individuals who are not immunocompromised.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción BreveDESCRIPTION OF THE INVENTION Brief Description
Un objeto de Ia invención Io constituye un procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una muestra biológica tumoral, en adelante procedimiento de diagnóstico de Ia invención, basado en Ia determinación de los niveles de Ia presencia de laforina y que comprende las siguientes etapas: a) identificación de los niveles de expresión de laforina, b) comparación de los niveles de laforina observados en a) con una muestra biológica control, e c) identificación de una muestra como tumoral cuando los niveles de laforina disminuyen con respecto a los obtenidos en Ia muestra control.An object of the invention constitutes a diagnostic and prognostic procedure for a tumor biological sample, hereinafter diagnostic procedure of the invention, based on the determination of the levels of the presence of laforin and comprising the following steps: a) identification of the laforin expression levels, b) comparison of the laforin levels observed in a) with a control biological sample, ec) identification of a sample as a tumor when the laforin levels decrease with respect to those obtained in the control sample.
Un objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente con cáncer en el que Ia identificación de laforina se realiza conjuntamente con Ia identificación de malina en Ia misma muestra biológica. En este caso el término malina se refiere tanto al gen como a Ia proteína malina.A particular object of the invention constitutes the identification procedure of a cancer patient in which the identification of laforin is carried out in conjunction with the identification of maline in the same biological sample. In this case the term maline refers to both the gene and the maline protein.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente con cáncer en el que Ia identificación de laforina de se refiere a Ia forma proteica de Ia laforina humana (SEQ ID NO 2) y se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo específico de Ia proteína laforina en técnicas inmunológicas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, fragmentos o derivados de los mismos.Another particular object of the invention constitutes the identification procedure of a cancer patient in which the identification of laforin refers to the protein form of human laforin (SEQ ID NO 2) and is carried out through the use of a specific antibody of Ia Laforin protein in immunological techniques. The antibodies can be monoclonal or polyclonal, fragments or derivatives thereof.
Así, otro objeto de Ia invención Io constituye el hibridoma LAF-A7Thus, another object of the invention constitutes the LAF-A7 hybridoma.
(depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 18 de octubre de 2007 con Ia referencia Q7394) y el anticuerpo monoclonal LAF-A7, producido por dicho hibridoma, y desarrollados en Ia presente invención.(deposited in the ECACC culture collection -European Collection of Animal CeII Culture- on October 18, 2007 with reference Q7394) and the LAF-A7 monoclonal antibody, produced by said hybridoma, and developed in the present invention.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente humano con cáncer en el que Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante Ia amplificación génica de un precursor génico de laforina perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: PCR cuantitativa o en una PCR semi-cuantitativa con unos cebadores específicos de laforina humana. Otra realización particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de Ia invención basado en Ia técnica de Northern blot con sondas de polinucleótidos específicas de laforina.Another particular object of the invention constitutes the identification procedure of a human patient with cancer in which the identification of laforin is carried out by means of the gene amplification of a laforin gene precursor belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: quantitative PCR or in a semi-quantitative PCR with specific primers of human laforin. Another particular embodiment of the invention constitutes the process of the invention based on the Northern blot technique with laforin specific polynucleotide probes.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un cáncer en el que Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de laforina.Another particular object of the invention constitutes the method of identifying a cancer in which the identification of laforin is carried out by in situ hybridization with a laforin precursor.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente con cáncer de Ia invención en el que el tipo de cáncer pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: colon, mama y riñon. Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto o agente activador, inductor o agonista de Ia actividad antitumoral de Ia laforina/malina, en adelante uso de un compuesto de Ia presente invención, en Ia elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para Ia profilaxis y tratamiento de tumores en mamíferos, preferentemente seres humanos, preferentemente tumores de colon, mama y riñon. Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto de Ia presente invención en el que el compuesto está constituido por una proteína o péptido laforina/malina con actividad antitumoral en el interior de las células de un mamífero, preferentemente humanas, y que comprende una o varias proteína o péptidos laforina/malina pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de aminoácidos (aá.) constituida por Ia secuencia de aá. de Ia proteína laforina, malina o ambas, b) una secuencia de aá. análoga a una cualquiera de las secuencias de a), c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) una secuencia de aá. que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c). Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto de Ia presente invención en el que el compuesto está constituido por una construcción genética, en adelante construcción génica laforina/malina de Ia presente invención, que permite Ia expresión de una proteína o péptido con actividad antitumoral en el interior de las células de un mamífero, preferentemente humanas, de forma similar a las construcciones genéticas elaboradas en Ia presente invención (ver Ejemplo 1 ) y que comprende una o varias secuencias de nucleótidos laforina/malina pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por una secuencia de nucleótidos codificante de Ia proteína laforina, malina o ambas, b) una secuencia de nucleótidos análoga a una cualquiera de las secuencias de a), c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).Another particular object of the invention constitutes the identification procedure of a cancer patient of the invention in which the type of cancer belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: colon, breast and kidney. Another object of the present invention constitutes the use of a compound or activating agent, inducer or agonist of the antitumor activity of laforin / maline, hereinafter use of a compound of the present invention, in the preparation of drugs or pharmaceutical compositions for Ia prophylaxis and treatment of tumors in mammals, preferably human beings, preferably tumors of the colon, breast and kidney. Another particular object of the present invention constitutes the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a protein or peptide laforin / maline with antitumor activity inside the cells of a mammal, preferably human, and comprising one or several laforin / maline proteins or peptides belonging to the following group: a) an amino acid sequence (aá.) constituted by the aá sequence. of the protein laforin, maline or both, b) a sequence of aá. analogous to any one of the sequences of a), c) a fragment of any one of the sequences of a) and b), and d) a sequence of aá. comprising any sequence belonging to a), b) and c). Another particular object of the present invention constitutes the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a genetic construction, hereinafter laforin / maline gene construction of the present invention, which allows the expression of a protein or peptide with antitumor activity inside the cells of a mammal, preferably human, similar to the genetic constructs elaborated in the present invention (see Example 1) and comprising one or several laforin / maline nucleotide sequences belonging to the following group : a) a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence encoding the protein laforin, maline or both, b) a nucleotide sequence analogous to any one of the sequences of a), c) a fragment of any one of the sequences of a) and b), and d) a nucleotide sequence comprising any sequence belonging to a), b) and c).
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de nucleótidos de a) es Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia laforina humana (SEQ ID NO1 ).Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence encoding human laforin (SEQ ID NO1).
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de nucleótidos de a) es Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia malina humana (SEQ ID NO4).Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence encoding human maline (SEQ ID NO4).
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de nucleótidos de a) comprende Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia laforina y malina humanas (SEQ ID NO1 y SEQ ID NO4). Finalmente, otro aspecto de Ia invención Io constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento del cáncer, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, basada en que comprende un agente inductor agonista de Ia actividad antitumoral de Ia laforina/malina, ya sean formas genómicas o proteicas de las proteínas laforina y malina, ya sean por separado o de forma conjunta (ver SEQ ID NO1 y 2, y SEQ ID 4 y 5, respectivamente), tal como se ha descrito anteriormente.Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the nucleotide sequence of a) comprises the nucleotide sequence encoding human laforin and maline (SEQ ID NO1 and SEQ ID NO4). Finally, another aspect of the invention constitutes a pharmaceutical composition useful for the treatment of cancer, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, based on the fact that it comprises an agonist inducing agent for the antitumor activity of laforin / maline, either genomic or protein proteins laforin and maline, either separately or together (see SEQ ID NO1 and 2, and SEQ ID 4 and 5, respectively), as described above.
Descripción DetalladaDetailed description
La presente invención se basa en que los inventores han observado que, sorprendentemente, las células tumorales humanas, y de forma especial en unos determinados tipos de tumores humanos, por ejemplo cáncer de colon, riñon o mama, presentan una disminución de Ia expresión de Ia proteína laforina e incluso su ausencia (Ejemplo 2), y que cuando se inducía Ia expresión de Laforina junto a Ia de Ia proteína Malina en Ia línea de neuroblastoma SH-SY5Y se provocó Ia degradación de p73, una proteina con actividad oncogenica (Ejemplo 3). En este sentido, es correcto afirmar que Ia ausencia o disminución de Ia laforina, o incluso de Ia Malina, o de ambas, resultaría en un aumento de proteínas oncogenicas, incluido el encogen p73, y permitir así Ia progresión tumoral. Estos datos permiten postular que Ia ausencia o disminución de Ia proteína laforina, malina o ambas representan una variable etiopatogénica en Ia aparición y progresión tumoral, Io que permite por un lado, el desarrollo de nuevas aproximaciones de diagnóstico y pronóstico de tumores en seres humanos y por otro lado, el desarrollo de nuevas terapias frente al cáncer basadas en Ia administración de composiciones farmacéuticas que comprendan Ia proteína laforina y malina, ya sea por separado o conjuntamente, o compuestos de induzcan o mimeticen Ia actividad de estas proteínas.The present invention is based on the fact that the inventors have observed that, surprisingly, human tumor cells, and especially in certain types of human tumors, for example colon, kidney or breast cancer, have a decrease in the expression of Ia laforin protein and even its absence (Example 2), and that when the expression of Laforin was induced next to that of the Maline protein in the SH-SY5Y neuroblastoma line, degradation of p73, a protein with oncogenic activity (Example 3), was induced ). In this sense, it is It is correct to state that the absence or decrease of the laforin, or even of the Maline, or of both, would result in an increase of oncogenic proteins, including the p73 shrinkage, and thus allow tumor progression. These data allow us to postulate that the absence or decrease of the protein laforin, maline or both represent an etiopathogenic variable in the appearance and tumor progression, which allows, on the one hand, the development of new approaches to diagnosis and prognosis of tumors in humans and on the other hand, the development of new therapies against cancer based on the administration of pharmaceutical compositions comprising the protein laforin and maline, either separately or together, or compounds that induce or mimic the activity of these proteins.
La ausencia de laforina podría ser causa del proceso tumoral por un mecanismo no descrito previamente y diferente de Ia regulación de Ia vía Wnt, que regula Ia expresión de oncogenes vía degradación a través de proteosoma (12), de modo similar a como induce, en combinación con Malina, Ia degradación del oncogen p73 (Ejemplo 3, Figura 8). En este sentido, se ha observado que Ia sobreexpresión de p73 está asociada al pronóstico del cáncer de colon (28), tipo de cáncer que en Ia presente invención presenta niveles disminuidos, e incluso Ia ausencia, de expresión de Ia proteína laforina.The absence of laforin could be a cause of the tumor process by a mechanism not previously described and different from the regulation of the Wnt pathway, which regulates the expression of oncogenes via degradation through proteasome (12), similarly as it induces, in combination with Malina, the degradation of the oncogene p73 (Example 3, Figure 8). In this sense, it has been observed that the overexpression of p73 is associated with the prognosis of colon cancer (28), a type of cancer that in the present invention has decreased levels, and even the absence, of laforin protein expression.
Hay que destacar que al contrario que los resultados descritos previamente para las líneas celulares de linfomas humanos (25) las líneas celulares analizadas en Ia presente invención no muestran diferencias en su expresión de laforina respecto del control de cerebro (Ejemplo 3.4), indicando que el uso único de líneas celulares y/o de modelos animales no siempre son aproximaciones experimentales correctas para mimetizar y estudiar los procesos biológicos que tienen lugar en seres humanos o en muestras patológicas correctamente seleccionadas. Por otro lado, Ia presente invención describe el anticuerpo monoclonal LAF-A7 que reconoce específicamente laforina, de forma cuantitativa y que no presenta reactividades adicionales que podrían resultar en falsos positivos (Ejemplo 1 ). En este sentido, es importante señalar el potencial valor que tiene el anticuerpo monoclonal LAF-A7, en relación a anticuerpos generados contra péptidos o frente a anticuerpos policlonales anti-laforina en general, y por tanto el hibridoma que Io produce representa una herramienta biotecnología de gran valor técnico, el cual ha sido depositado en Ia colección de cultivos ECACC (European Collection of Animal CeII Culture) el 18 de octubre de 2007 con Ia referencia Q7394. Por tanto, un objeto de Ia invención Io constituye un procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una muestra biológica tumoral, en adelante procedimiento de diagnóstico de Ia invención, basado en Ia determinación de los niveles de Ia presencia de laforina y que comprende las siguientes etapas: a) identificación de los niveles de expresión de laforina, b) comparación de los niveles de laforina observados en a) con una muestra biológica control, e c) identificación de una muestra como tumoral cuando los niveles de laforina disminuyen con respecto a los obtenidos en Ia muestra control. Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "laforina" se refiere tanto al gen o proteína laforina (SEQ ID NO 1 y NO 2, respectivamente) así como a cualquier secuencia de nucleótidos o de aminoácidos (aás.) análoga a éstas. En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos o aminoácidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias de nucleótidos o aás. mostradas en Ia presente memoria, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de nucleótidos o aás. conservativas o no conservativas, incluyendo Ia inserción de uno o más nucleótidos o aás, Ia adición de uno o más nucleótidos o aás. en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más nucleótidos o aás. en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia, y que constituya una secuencia codificante o péptido con actividad similar a Ia secuencia de Ia laforina humana.It should be noted that unlike the results previously described for human lymphoma cell lines (25) the cell lines analyzed in the present invention do not show differences in their expression of laforin with respect to brain control (Example 3.4), indicating that the Unique use of cell lines and / or animal models are not always correct experimental approaches to mimic and study the biological processes that take place in humans or in correctly selected pathological samples. On the other hand, the present invention describes the LAF-A7 monoclonal antibody that specifically recognizes laforin, so quantitative and that does not present additional reactivities that could result in false positives (Example 1). In this sense, it is important to point out the potential value of the LAF-A7 monoclonal antibody, in relation to antibodies generated against peptides or against polyclonal anti-laforin antibodies in general, and therefore the hybridoma that produces it represents a biotechnology tool for great technical value, which has been deposited in the ECACC (European Collection of Animal CeII Culture) crop collection on October 18, 2007 with reference Q7394. Therefore, an object of the invention constitutes a diagnostic and prognostic procedure of a tumor biological sample, hereinafter diagnostic procedure of the invention, based on the determination of the levels of the presence of laforin and comprising the following steps: a) identification of laforin expression levels, b) comparison of laforin levels observed in a) with a biological control sample, ec) identification of a sample as a tumor when laforin levels decrease with respect to those obtained in Ia Show control. As used in the present invention the term "laforin" refers to both the laforin gene or protein (SEQ ID NO 1 and NO 2, respectively) as well as any nucleotide or amino acid sequence (aás.) Analogous to these. In the sense used in this description, the term "analogous" is intended to include any nucleotide or amino acid sequence that can be isolated or constructed based on nucleotide sequences or more. shown herein, for example, by introducing nucleotide substitutions or aás. conservative or non-conservative, including the insertion of one or more nucleotides or more, the addition of one or more nucleotides or more. at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides or more. at any end or inside the sequence, and that constitutes a coding sequence or peptide with activity similar to the sequence of human laforin.
En general, una secuencia de nucleótidos o de aminoácidos análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de aminoácidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos o aás. en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 40%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%. El grupo o muestras biológicas control puede obtenerse a partir de muestras de personas sanas, o incluso desarrollarse artificialmente una muestra biológica control como por ejemplo un plásmido que contiene el ADNc de laforina.In general, an analogous nucleotide or amino acid sequence is substantially homologous to the amino acid sequence discussed above. In the sense used in this description, the expression "substantially homologous" means that the nucleotide sequences or aás. in question they have a degree of identity of at least 40%, preferably of at least 85%, or more preferably of at least 95%. The control group or biological samples can be obtained from samples of healthy people, or even a control biological sample such as a plasmid containing the laforin cDNA can be developed artificially.
Un objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente con cáncer en el que Ia identificación de laforina se realiza conjuntamente con Ia identificación de malina en Ia misma muestra biológica. En este caso el término malina se refiere tanto al gen como a Ia proteína malina.A particular object of the invention constitutes the identification procedure of a cancer patient in which the identification of laforin is carried out in conjunction with the identification of maline in the same biological sample. In this case the term maline refers to both the gene and the maline protein.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente con cáncer en el que Ia identificación de laforina de se refiere a Ia forma proteica de Ia laforina humana (SEQ ID NO 2) y se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo específico de Ia proteína laforina en técnicas inmunológicas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales, fragmentos o derivados de los mismos. Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "anticuerpo específico" se refiere a un anticuerpo recombinante o minianticuerpo que mantiene su capacidad de unión a antígeno, que se define como fragmentos derivados de anticuerpos construidos por tecnología de ADN recombinante, que, pese a su menor tamaño, conservan Ia capacidad de unión al antígeno ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina donde residen las zonas de unión a antígenos, y que pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio (dAbs). En el marco de Ia presente invención, se entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de cadena pesada (VH), a los dominios variables de cadena ligera (VL), a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH), los anticuerpos recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos recombinantes de otras especies camelizados, los anticuerpos monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, que se incluyen tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e IgNAR), como anticuerpos que por ingeniería se han alterado para que por sí solos sean capaces de interaccionar con el antígeno y mejorar sus propiedades de estabilidad y solubilidad. Se incluye en esta definición cualquier modificación de los anticuerpos recombinantes como su multimerización o Ia fusión a cualquier molécula (p.ej. toxinas, enzimas, antígenos, otros fragmentos de anticuerpos, etc.).Another particular object of the invention constitutes the identification procedure of a cancer patient in which the identification of laforin refers to the protein form of human laforin (SEQ ID NO 2) and is carried out through the use of a specific antibody to laforin protein in immunological techniques. The antibodies can be monoclonal or polyclonal, fragments or derivatives thereof. As used in the present invention, the term "specific antibody" refers to a recombinant antibody or mini-antibody that maintains its antigen binding capacity, which is defined as fragments derived from antibodies constructed by recombinant DNA technology, which, despite their smaller size, they retain the antigen binding capacity since they maintain at least one variable immunoglobulin domain where the antigen binding zones reside, and that It belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: Fab, F (ab ') 2, scFv, and recombinant monodomain antibodies (dAbs). Within the framework of the present invention, recombinant monodomain antibodies and / or immunoglobulin-like domains with independent binding and recognition capacity are understood, both to the heavy chain variable domains (VH), to the light chain variable domains (VL) , to recombinant camelid (VHH) antibodies, recombinant humanized camelid antibodies, recombinant antibodies of other camelized species, IgNAR monodomain antibodies of cartilaginous fish; that is, that both domains that are naturally monodomain (case of VHH and IgNAR) are included, as well as engineering antibodies that have been altered so that by themselves they are able to interact with the antigen and improve its stability and solubility properties . Any modification of the recombinant antibodies such as their multimerization or fusion to any molecule (eg toxins, enzymes, antigens, other antibody fragments, etc.) is included in this definition.
El anticuerpo funcionalmente activo puede ser obtenido de un ser humano o un animal (p.ej. camellos, llamas, vicuñas, ratones, ratas, conejos, caballos, tiburones nodriza, etc.) o mediante técnicas de DNA recombinante o síntesis química de genes.The functionally active antibody can be obtained from a human being or an animal (eg camels, llamas, vicuñas, mice, rats, rabbits, horses, nurse sharks, etc.) or by recombinant DNA techniques or chemical gene synthesis .
El análisis mediante inmunohistoquímica, a título ilustrativo, se realizaría sobre cortes de tejido (ya sea congelado o incluido en parafina) procedente de muestras tumorales o de tejidos control, con anticuerpos anti-laforina generados en distintas especies de animales. Por otro lado, el análisis mediante western blot o inmunoblot se podría llevar a cabo como se ha descrito en Ia presente invención.The analysis by immunohistochemistry, by way of illustration, would be performed on tissue sections (either frozen or included in paraffin) from tumor or control tissue samples, with anti-laforin antibodies generated in different species of animals. On the other hand, the analysis by western blot or immunoblot could be carried out as described in the present invention.
Una realización particular Io constituye el procedimiento de Ia invención en el que el anticuerpo utilizado es el anticuerpo monoclonal LAF-A7 desarrollado en Ia presente invención y producido por el hibridoma LAF-A7 depositado en ACECC Q7394.A particular embodiment constitutes the method of the invention in which the antibody used is the monoclonal antibody. LAF-A7 developed in the present invention and produced by the LAF-A7 hybridoma deposited in ACECC Q7394.
Los anticuerpos que se pueden utilizar, por separado o de forma conjunta, pueden estar acoplados a fluorocromos que emitan energía a longitudes de onda no solapantes o no estar conjugados y emplear, entonces, anticuerpos secundarios acoplados a este tipo de fluorocromos. La señal emitida por los anticuerpos es directamente proporcional a Ia cantidad de proteína expresada en las células y se medirá con equipos de detección. Así, otro objeto de Ia invención Io constituye el hibridoma LAF-A7The antibodies that can be used, separately or together, can be coupled to fluorochromes that emit energy at non-overlapping wavelengths or not be conjugated and then employ secondary antibodies coupled to this type of fluorochromes. The signal emitted by the antibodies is directly proportional to the amount of protein expressed in the cells and will be measured with detection equipment. Thus, another object of the invention constitutes the LAF-A7 hybridoma.
(depositado en Ia colección de cultivos ECACC -European Collection of Animal CeII Culture- el 18 de octubre de 2007 con Ia referencia Q7394) y el anticuerpo monoclonal LAF-A7, producido por dicho hibridoma, y desarrollados en Ia presente invención. El uso de cualquier otro anticuerpo, monoclonal o policlonal, específico de Ia laforina para el diagnóstico del cáncer forma parte de Ia presente invención perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: Anticuerpo monoclonal de ratón frente EPM2A (laforina) de Ia casa comercial Abcam, o el propio anticuerpo policlonal desarrollado en Ia presente invención generado contra el péptido de SEQ ID NO3 (Ejemplo 1.2.)(deposited in the ECACC culture collection -European Collection of Animal CeII Culture- on October 18, 2007 with reference Q7394) and the LAF-A7 monoclonal antibody, produced by said hybridoma, and developed in the present invention. The use of any other antibody, monoclonal or polyclonal, specific to laforin for the diagnosis of cancer is part of the present invention belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: Mouse monoclonal antibody versus EPM2A (laforin) of the Abcam commercial house, or the polyclonal antibody itself developed in the present invention generated against the peptide of SEQ ID NO3 (Example 1.2.)
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "anticuerpo funcionalmente activo" se refiere a un anticuerpo recombinante o minianticuerpo que mantiene su capacidad de unión a antígeno perteneciente, que se define como fragmentos derivados de anticuerpos construidos por tecnología de ADN recombinante, que, pese a su menor tamaño, conservan Ia capacidad de unión al antígeno ya que mantienen al menos un dominio variable de inmunoglobulina donde residen las zonas de unión a antígenos, y que pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: Fab, F(ab')2, scFv, y anticuerpos recombinantes monodominio (dAbs). En el marco de Ia presente invención, se entiende por anticuerpos recombinantes monodominio y/o dominios tipo inmunoglobulina con capacidad de unión y reconocimiento independiente, tanto a los dominios variables de cadena pesada (VH), a los dominios variables de cadena ligera (VL), a los anticuerpos recombinantes de camélidos (VHH), los anticuerpos recombinantes de camélidos humanizados, los anticuerpos recombinantes de otras especies camelizados, los anticuerpos monodominio IgNAR de peces cartilaginosos; es decir, que se incluyen tanto dominios que de forma natural son monodominio (caso de VHH e IgNAR), como anticuerpos que por ingeniería se han alterado para que por sí solos sean capaces de interaccionar con el antígeno y mejorar sus propiedades de estabilidad y solubilidad. Se incluye en esta definición cualquier modificación de los anticuerpos recombinantes como su multimerización o Ia fusión a cualquier molécula (p.ej. toxinas, enzimas, antígenos, otros fragmentos de anticuerpos, etc.).As used in the present invention, the term "functionally active antibody" refers to a recombinant antibody or mini-antibody that maintains its ability to bind to a corresponding antigen, which is defined as fragments derived from antibodies constructed by recombinant DNA technology, which, despite their smaller size, they retain the antigen binding capacity since they maintain at least one variable immunoglobulin domain where the antigen binding zones reside, and which belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to following group: Fab, F (ab ') 2, scFv, and recombinant monodomain antibodies (dAbs). Within the framework of Ia In the present invention, recombinant monodomain antibodies and / or immunoglobulin-like domains with independent binding and recognition capability are understood, both the heavy chain variable domains (VH), the light chain variable domains (VL), the recombinant antibodies of camelids (VHH), recombinant antibodies of humanized camelids, recombinant antibodies of other camelized species, monodomain antibodies IgNAR of cartilaginous fish; that is, that both domains that are naturally monodomain (case of VHH and IgNAR) are included, as well as engineering antibodies that have been altered so that by themselves they are able to interact with the antigen and improve its stability and solubility properties . Any modification of the recombinant antibodies such as their multimerization or fusion to any molecule (eg toxins, enzymes, antigens, other antibody fragments, etc.) is included in this definition.
El anticuerpo funcionalmente activo puede ser obtenido de un ser humano o un animal (p.ej. camellos, llamas, vicuñas, ratones, ratas, conejos, caballos, tiburones nodriza, etc.) o mediante técnicas de DNA recombinante o síntesis química de genes. Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente humano con cáncer en el que Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante Ia amplificación génica de un precursor génico de laforina perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: PCR cuantitativa o en una PCR semi-cuantitativa con unos cebadores específicos de laforina humana. Estos procedimientos están basados en Ia extracción de RNA, ya sea RNA polyA+ o RNA total o RNA polyA+, de una muestra biológica sospechosa de cáncer y de un tejido control y Ia amplificación de Ia secuencia, codificantes o no codificantes (por ejemplo, frente a las regiones 5' o 3' no traducidas del RNA) del gen laborina (SEQ ID NO1 ) con adecuados oligonucleótidos o cebadores específicos. Otra realización particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de Ia invención basado en Ia técnica de Northern blot con sondas de polinucleótidos específicas de laforina.The functionally active antibody can be obtained from a human being or an animal (eg camels, llamas, vicuñas, mice, rats, rabbits, horses, nurse sharks, etc.) or by recombinant DNA techniques or chemical gene synthesis . Another particular object of the invention constitutes the identification procedure of a human patient with cancer in which the identification of laforin is carried out by means of the gene amplification of a laforin gene precursor belonging, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: quantitative PCR or in a semi-quantitative PCR with specific primers of human laforin. These procedures are based on the extraction of RNA, either RNA polyA + or total RNA or RNA polyA +, from a biological sample suspected of cancer and from a control tissue and the amplification of the sequence, coding or non-coding (for example, against the 5 'or 3' untranslated regions of the RNA) of the labor gene (SEQ ID NO1) with suitable oligonucleotides or specific primers. Another particular embodiment of the invention constitutes the process of the invention based on the Northern blot technique with laforin specific polynucleotide probes.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un cáncer en el que Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de laforina.Another particular object of the invention constitutes the method of identifying a cancer in which the identification of laforin is carried out by in situ hybridization with a laforin precursor.
La realización de estos análisis de identificación de los niveles de expresión de laforina puede ser llevado a cabo por un experto medio del área de Ia biomedicina gracias a Ia información descrita en Ia presente invención y en el estado de Ia técnica por distintas técnicas (Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N.Y.).The performance of these analysis of identification of laforin expression levels can be carried out by an expert in the area of biomedicine thanks to the information described in the present invention and in the state of the art by different techniques (Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY).
Por otro lado, este procedimiento de diagnóstico del cáncer puede realizarse utilizándose a laforina como único marcador o de forma conjunta con otros marcadores de cáncer o de otras enfermedades, por ejemplo formando parte de un microarray de expresión biológica, ya sea en forma génica -a partir de RNAm- o en forma de proteína, entre los que podría incluirse, entre otros, Ia malina y el p73.On the other hand, this cancer diagnosis procedure can be performed using laforin as the sole marker or in conjunction with other markers of cancer or other diseases, for example as part of a biological expression microarray, either in gene form -a starting from mRNA- or in the form of a protein, which could include, among others, the maline and p73.
Otro objeto particular de Ia invención Io constituye el procedimiento de identificación de un paciente con cáncer de Ia invención en el que el tipo de cáncer pertenece, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia invención, al siguiente grupo: colon, mama y riñon.Another particular object of the invention constitutes the identification procedure of a cancer patient of the invention in which the type of cancer belongs, by way of illustration and without limiting the scope of the invention, to the following group: colon, breast and kidney.
Por otro lado, los distintos elementos biológicos descritos anteriormente como necesarios para llevar a cabo el procedimiento de identificación de Ia invención - anticuerpos, oligonucleótidos para PCR, sondas polinucleotídicas, etc - pueden usarse para Ia elaboración de composiciones farmacéuticas de diagnóstico útiles para el diagnóstico del cáncer en seres humanos. Por Io que el uso de dichas composiciones farmacéuticas para el diagnóstico del cáncer forma parte de Ia presente invención. Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto o agente activador, inductor o agonista de Ia actividad antitumoral de Ia laforina/malina, en adelante uso de un compuesto de Ia presente invención, en Ia elaboración de medicamentos o composiciones farmacéuticas para Ia profilaxis y tratamiento de tumores en mamíferos, preferentemente seres humanos, preferentemente tumores de colon, mama y riñon.On the other hand, the different biological elements described above as necessary to carry out the identification procedure of the invention - antibodies, oligonucleotides for PCR, polynucleotide probes, etc. - can be used for the elaboration of diagnostic pharmaceutical compositions useful for the diagnosis of Cancer in humans. Therefore, the use of said pharmaceutical compositions for the diagnosis of cancer is part of the present invention. Another object of the present invention constitutes the use of a compound or activating agent, inducer or agonist of the antitumor activity of laforin / maline, hereinafter use of a compound of the present invention, in the preparation of drugs or pharmaceutical compositions for Ia prophylaxis and treatment of tumors in mammals, preferably human beings, preferably tumors of the colon, breast and kidney.
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "compuesto/agente activador o agonista" se refiere a una molécula que cuando se une o interactúa con Ia proteína laforina/malina, ambas por separado de forma conjunta, o con fragmentos funcionales de Ia misma, incrementa Ia intensidad o prolonga Ia duración de Ia actividad biológica antitumoral de dicha/ proteína/s. En esta definición se incluye además aquellos compuestos o moléculas que permiten incrementar Ia expresión de un gen/es codificante/s de ambas proteínas laforina/malina, ya sea Ia forma endógena existente de forma natural en una célula o una forma exógena que se introduce artificialmente en dicha célula. Un agente activador puede estar constituido por un péptido, una proteína, un ácido nucleico, un carbohidrato, un anticuerpo, un compuesto químico, o cualquier otro tipo de molécula que incremente el efecto y/o Ia duración de Ia actividad antitumoral del complejo laforina/malina.As used in the present invention the term "compound / activating agent or agonist" refers to a molecule that when bound or interacts with the protein laforin / maline, both separately together, or with functional fragments thereof , increases the intensity or prolongs the duration of the biological antitumor activity of said / protein / s. This definition also includes those compounds or molecules that allow increasing the expression of a gene / s encoding / s of both laforin / maline proteins, either the endogenous form that exists naturally in a cell or an exogenous form that is artificially introduced in said cell. An activating agent can be constituted by a peptide, a protein, a nucleic acid, a carbohydrate, an antibody, a chemical compound, or any other type of molecule that increases the effect and / or the duration of the anti-tumor activity of the laforin / Maline
Tal como se utiliza en Ia presente invención el término "proteína laforina/malina" se refiere a una de ambas proteínas o ambas conjuntamente capaz de disminuir total o parcialmente un fenotipo tumoral y que pertenece, entre otras, al siguiente grupo: laforina, malina o el conjunto laforina/malina.As used in the present invention the term "laforin / maline protein" refers to one of both proteins or both together capable of totally or partially decreasing a tumor phenotype and belonging, among others, to the following group: laforin, maline or the laforin / maline set.
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto de Ia presente invención en el que el compuesto está constituido por una proteína o péptido laforina/malina con actividad antitumoral en el interior de las células de un mamífero, preferentemente humanas, y que comprende una o varias proteína o péptidos laforina/malina pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de aminoácidos (aá.) constituida por Ia secuencia de aá. de Ia proteína laforina, malina o ambas, b) una secuencia de aá. análoga a una cualquiera de las secuencias de a), c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) una secuencia de aá. que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).Another particular object of the present invention constitutes the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a protein or peptide laforin / maline with antitumor activity inside the cells of a mammal, preferably human, and comprising one or several laforin / maline proteins or peptides belonging to the following group: a) an amino acid sequence (aá.) constituted by the aá sequence. of the protein laforin, maline or both, b) a sequence of aá. analogous to any one of the sequences of a), c) a fragment of any one of the sequences of a) and b), and d) a sequence of aá. comprising any sequence belonging to a), b) and c).
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de a) es Ia secuencia de aá. de Ia laforina humana (SEQ ID NO2).Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the sequence of a) is the sequence of aá. of human laforin (SEQ ID NO2).
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de a) es Ia secuencia de aá. de Ia malina humana (SEQ ID NO5).Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the sequence of a) is the sequence of aá. of the human maline (SEQ ID NO5).
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de a) comprende Ia secuencia de aá. de Ia laforina y malina humanas (SEQ ID NO2 y SEQ ID NO5).Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the sequence of a) comprises the sequence of aá. of human laforin and maline (SEQ ID NO2 and SEQ ID NO5).
Otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto de Ia presente invención en el que el compuesto está constituido por una construcción genética, en adelante construcción génica laforina/malina de Ia presente invención, que permite Ia expresión de una proteína o péptido con actividad antitumoral en el interior de las células de un mamífero, preferentemente humanas, de forma similar a las construcciones genéticas elaboradas en Ia presente invención (ver Ejemplo 1 ) y que comprende una o varias secuencias de nucleótidos laforina/malina pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por una secuencia de nucleótidos codificante de Ia proteína laforina, malina o ambas b) una secuencia de nucleótidos análoga a una cualquiera de las secuencias de a), c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c). En el sentido utilizado en esta descripción, el término "análoga" pretende incluir cualquier secuencia de nucleótidos que pueda ser aislada o construida en base a las secuencias mostradas en Ia presente memoria, por ejemplo, mediante Ia introducción de sustituciones de nucleótidos conservativas o no conservativas, incluyendo Ia inserción de uno o más nucleótidos, Ia adición de uno o más nucleótidos en cualquiera de los extremos de Ia molécula o Ia deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o en el interior de Ia secuencia, y que permita Ia codificación de un péptido o proteína capaz de disminuir Ia actividad tumoral. En general, una secuencia de nucleótidos análoga es sustancialmente homologa a Ia secuencia de nucleótidos comentada anteriormente. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "sustancialmente homologa" significa que las secuencias de nucleótidos en cuestión tienen un grado de identidad de, al menos, un 30%, preferentemente de, al menos, un 85%, o más preferentemente de, al menos, un 95%.Another particular object of the present invention constitutes the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a genetic construction, hereinafter laforin / maline gene construction of the present invention, which allows the expression of a protein or peptide with antitumor activity inside the cells of a mammal, preferably human, similar to the genetic constructs elaborated in the present invention (see Example 1) and comprising one or several laforin / maline nucleotide sequences belonging to the following group : a) a nucleotide sequence constituted by a nucleotide sequence encoding the protein laforin, maline or both b) a nucleotide sequence analogous to any one of the sequences of a), c) a fragment of any one of the sequences of a ) and b), and d) a nucleotide sequence comprising any sequence belonging to a), b) and c). In the sense used in this description, the term "analogous" is intended to include any nucleotide sequence that can be isolated or constructed based on the sequences shown herein, for example, by introducing conservative or non-conservative nucleotide substitutions. , including the insertion of one or more nucleotides, the addition of one or more nucleotides at any of the ends of the molecule or the deletion of one or more nucleotides at any end or inside the sequence, and allowing the coding of a peptide or protein capable of decreasing tumor activity. In general, an analogous nucleotide sequence is substantially homologous to the nucleotide sequence discussed above. In the sense used in this description, the expression "substantially homologous" means that the nucleotide sequences in question have an identity degree of at least 30%, preferably of at least 85%, or more preferably of At least 95%.
Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de nucleótidos de a) es Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia laforina humana (SEQ ID NO1 ). Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de nucleótidos de a) es Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia malina humana (SEQ ID NO4). Otra realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso del compuesto de Ia presente invención en el que Ia secuencia de nucleótidos de a) comprende Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia laforina y malina humanas (SEQ ID NO1 y SEQ ID NO4).Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence encoding human laforin (SEQ ID NO1). Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence encoding human maline (SEQ ID NO4). Another particular embodiment of the present invention constitutes the use of the compound of the present invention in which the nucleotide sequence of a) comprises the nucleotide sequence encoding human laforin and maline (SEQ ID NO1 and SEQ ID NO4).
La secuencia de nucleótidos laforina/malina y Ia construcción genética laforina/malina descritas previamente pueden obtenerse por un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de Ia técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2nd ed., CoId Sping Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3). Dichas secuencias de nucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión génica que permite Ia regulación de Ia expresión de Ia misma en condiciones adecuadas.The laforin / maline nucleotide sequence and the laforin / maline genetic construction described previously can be obtained by an expert by employing techniques widely known in the state of the art (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual 2 nd ed. , CoId Sping Harbor Laboratory Press, NY, 1989 vol 1-3) Said nucleotide sequences can be integrated into a gene expression vector that allows the regulation of the expression thereof under suitable conditions.
Por tanto, otro objeto particular de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto de Ia presente invención en que el compuesto está constituido por un vector de expresión génica, en adelante vector de expresión laforina/malina, que comprende una secuencia de nucleótidos laforina o malina o ambas o una construcción genética laforina que las comprenda y que permite Ia expresión de una proteína o péptido con actividad antitumoral.Therefore, another particular object of the present invention constitutes the use of a compound of the present invention in which the compound is constituted by a gene expression vector, hereinafter laforin / maline expression vector, which comprises a nucleotide sequence laforin or maline or both or a laforin genetic construct that comprises them and that allows the expression of a protein or peptide with antitumor activity.
En general, un vector de expresión comprende, además de Ia secuencia de nucleótidos laforina/malina o de Ia construcción genética laforina/malina descritos en Ia invención, un promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ret, etc), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, Ia traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2, etc), señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes de reguladores transcripcionales, (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión, vectores virales (DNA o RNA), cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La elección del vector dependerá de Ia célula huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización particular de Ia presente invención dicho vector es un plásmido o un vector viral. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en Ia materia al igual que para Ia transformación de microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidas - transformación química, electroporación, microinyección, etc - descritos en diversos manuales [Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, N.Y.]. Los sistemas de expresión génica pueden permitir o no Ia integración del nuevo material genético en el genoma de Ia célula huésped. De esta forma, tanto Ia secuencia de nucleótidos, construcción génica o el vector de expresión laforina/malina pueden utilizarse como un medicamento para proteger células huésped, preferentemente células tumorales, en un procedimiento de tratamiento y profilaxis de terapia génica de un ser humano afectado de cáncer. Las herramientas biofarmacéuticas y los procedimientos de terapia génica son suficientemente conocidas por un experto del sector de Ia técnica.In general, an expression vector comprises, in addition to the laforin / maline nucleotide sequence or the laforin / maline genetic construct described in the invention, a promoter that directs its transcription (for example, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD , ret, etc.), to which it is operatively linked, and other necessary or appropriate sequences that control and regulate said transcription and, where appropriate, the translation of the product of interest, for example, transcription initiation and termination signals (tlt2, etc), polyadenylation signal, origin of replication, ribosome binding sequences (RBS), coding sequences of transcriptional regulators, (enhancers), transcriptional silencers (silencers), repressors, etc. Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among expression plasmids, viral vectors (DNA or RNA), cosmids, artificial chromosomes, etc. which may also contain markers that can be used to select cells transfected or transformed with the gene or genes of interest. The choice of the vector will depend on the host cell and the type of use to be performed. Therefore, according to a particular embodiment of the present invention said vector is a plasmid or a viral vector. The obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known by those skilled in the art as well as for the transformation of microorganisms and eukaryotic cells different widely known methods can be used - chemical transformation, electroporation, microinjection, etc - described in various manuals [ Sambrook, J., Fritsch, EF, and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2 nd ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY]. Gene expression systems may or may not allow the integration of the new genetic material into the genome of the host cell. Thus, both the nucleotide sequence, gene construct or laforin / maline expression vector can be used as a medicament to protect host cells, preferably tumor cells, in a method of treatment and prophylaxis of gene therapy of a human being affected by Cancer. Biopharmaceutical tools and gene therapy procedures are sufficiently known by an expert in the field of technology.
Finalmente, otro aspecto de Ia invención Io constituye una composición farmacéutica útil para el tratamiento del cáncer, en adelante composición farmacéutica de Ia invención, basada en que comprende un agente inductor agonista de Ia actividad antitumoral de Ia laforina/malina, ya sean formas genómicas o proteicas de las proteínas laforina y malina, ya sean por separado o de forma conjunta (ver SEQ ID NO1 y 2, y SEQ ID 4 y 5, respectivamente), tal como se ha descrito anteriormente.Finally, another aspect of the invention constitutes a pharmaceutical composition useful for the treatment of cancer, hereinafter pharmaceutical composition of the invention, based on that it comprises a agonist inducing agent of the antitumor activity of laforin / maline, either genomic or protein forms of laforin and maline proteins, either separately or together (see SEQ ID NO1 and 2, and SEQ ID 4 and 5, respectively ), as described above.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASDESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Generación y caracterización de Ia proteína de fusión GST:: laforina. Se muestra un gel teñido con Coomassie (izquierda) en el que se cargaron, por el siguiente orden de izquierda a derecha: marcadores de peso molecular de Biorad, proteína GST y proteína GST::laforina, ambas purificadas por el método descrito en el texto. Se observa una banda con un MW de aproximadamente 90 kDa que corresponde a Ia proteína de fusión GST::laforina y GST que tiene un MW de 33 kDa. En Ia parte derecha se muestra el resultado de un western blot de estas misma muestras revelado con un anticuerpo policlonal de conejo generado contra el péptido de laforina humana QEDFFQKFGKVRSSV que demuestra que Ia proteína de fusión GST::laforina es reconocida por este anticuerpo. Figura 2. El anticuerpo LAF-A7 reconoce laforina humana de forma específica y cuantitativa. La figura muestra un western blot utilizando LAF-A7 sobre mioblastos de ratón C2C12 no infectadas e infectadas con cantidades crecientes de AdCMV-laf que expresa laforina humana. Los resultados ilustran que el anticuerpo LAF-A7 no reconoce Ia laforina endógena en las células C2C12 de ratón y que identifica cantidades crecientes de laforina humana sobreexpresada que correlacionan con las cantidades de virus utilizadas en Ia infección de estas células. Figura 3. El anticuerpo LAF-A7 reconoce exclusivamente laforina en muestras de tejidos humanos. La figura muestra un western blot utilizando LAF-A7 sobre usados preparados a partir de muestras de tres tejidos diferentes (corazón, cerebro y músculo esquelético) obtenidos de un individuo control y un paciente con Enfermedad de Lafora que no expresa laforina debido a mutaciones en el gen EPM2A. El experimento demuestra que LAF-A7 reconoce laforina en todos estos tejidos en Ia muestra control y que no da falsos positivos en Ia muestra del paciente con LD. Figura 4. Análisis de Ia expresión de Laforina en carcinoma de colon humano con el anticuerpo LAF-A7. La figura muestra un ejemplo representativo de 6 casos de cáncer de colon en los que se compara Ia expresión de laforina en parejas de tejido sano y tejido tumoral del mismo individuo. En estos experimentos Se utilizó D-actina como un control de carga.Figure 1. Generation and characterization of the GST :: laforin fusion protein. A Coomassie stained gel (left) is shown on which they were loaded, in the following order from left to right: Biorad molecular weight markers, GST protein and GST protein :: laforin, both purified by the method described in the text . A band with a MW of approximately 90 kDa is observed that corresponds to the GST :: laforin and GST fusion protein that has a MW of 33 kDa. On the right side, the result of a western blot of these same samples is shown, revealed with a rabbit polyclonal antibody generated against the human laforin peptide QEDFFQKFGKVRSSV that demonstrates that the GST :: laforin fusion protein is recognized by this antibody. Figure 2. The LAF-A7 antibody recognizes human laforin specifically and quantitatively. The figure shows a western blot using LAF-A7 on uninfected and infected C2C12 mouse myoblasts with increasing amounts of AdCMV-laf expressing human laforin. The results illustrate that the LAF-A7 antibody does not recognize endogenous laforin in mouse C2C12 cells and that it identifies increasing amounts of overexpressed human laforin that correlate with the amounts of virus used in the infection of these cells. Figure 3. The LAF-A7 antibody exclusively recognizes laforin in human tissue samples. The figure shows a western blot using LAF-A7 on used prepared from samples of three different tissues (heart, brain and skeletal muscle) obtained from a control individual and a patient with Lafora Disease who does not expresses laforin due to mutations in the EPM2A gene. The experiment demonstrates that LAF-A7 recognizes laforin in all these tissues in the control sample and that it does not give false positives in the sample of the patient with LD. Figure 4. Analysis of the expression of Laforin in human colon carcinoma with the LAF-A7 antibody. The figure shows a representative example of 6 cases of colon cancer in which the expression of laforin in pairs of healthy tissue and tumor tissue of the same individual is compared. In these experiments D-actin was used as a load control.
Figura 5. Análisis de Ia expresión de Laforina en tumores de mama con el anticuerpo de Ia invención LAf-A7. La figura muestra un ejemplo representativo de 5 casos de cáncer de mama en los que se compara Ia expresión de laforina en los tumores con Ia expresión en una muestra de cerebro, utilizado en este caso como tejido sano de referencia al carecer en estos casos de parejas de tejido sano y tejido tumoral del mismo individuo. En estos experimentos Se utilizo D-actina como un control de carga. Figura 6. Análisis de Ia expresión de Laforina en tumores de riñon con el anticuerpo de Ia invención LAf-A7. La figura muestra un ejemplo representativo de 3 casos de cáncer de riñon. En dos de los casos, en los que se pudo comparar Ia expresión de laforina en parejas de tejido sano y tejido tumoral del mismo individuo, se observo disminución en Ia expresión de laforina en el tumor. Lo mismo se observo en un caso de tumor de Ewing al comparar Ia expresión de laforina con Ia de una muestra de cerebro, utilizado como tejido sano de referencia. En estos experimentos Se utilizo D-actina como un control de carga.Figure 5. Analysis of the expression of Laforin in breast tumors with the antibody of the invention LAf-A7. The figure shows a representative example of 5 cases of breast cancer in which the expression of laforin in tumors is compared with the expression in a brain sample, used in this case as a healthy reference tissue when lacking in these cases of couples of healthy tissue and tumor tissue of the same individual. In these experiments D-actin was used as a load control. Figure 6. Analysis of the expression of Laforin in kidney tumors with the antibody of the invention LAf-A7. The figure shows a representative example of 3 cases of kidney cancer. In two of the cases, in which the expression of laforin could be compared in pairs of healthy tissue and tumor tissue of the same individual, a decrease in the expression of laforin in the tumor was observed. The same was observed in a case of Ewing's tumor when comparing the expression of laforin with that of a brain sample, used as a healthy reference tissue. In these experiments D-actin was used as a load control.
Figura 7. Análisis de Ia expresión de Laforina en líneas celulares de tumores humanos con el anticuerpo de Ia invención LAf-A7. En Ia figura se compara Ia expresión de laforina en cinco líneas tumorales humanas respecto de Ia presenta un tejido humano sano (cerebro) para ilustrar que en estas líneas no hay disminución en Ia expresión de laforina. Las líneas utilizadas fueron MDA-231 y MDA-435S, carcinoma de mama; HTC116p53+/+ y HTC116p53-/-, líneas de cáncer de colon; y Hela, adenocarcinoma de cervix. Se utilizó D-actina como un control de carga. Figura 8.- El complejo Laforina-Malina degrada p73 endógena en células humanas SH-SY5Y. Células SH-SY5Y se infectaron con Adenovirus expresando Laforina, Malina o el complejo de ambas. Los usados celulares fueron sometidos a ensayos de western blot con anticuerpos comerciales anti p73 y anti D-actina. Se observa que el complejo Laforina-Malina degrada p73. Como control de carga se empleó D-actina.Figure 7. Analysis of the expression of Laforin in human tumor cell lines with the antibody of the invention LAf-A7. In the figure, the expression of laforin in five human tumor lines is compared with respect to Ia presents a healthy human tissue (brain) for illustrate that in these lines there is no decrease in the expression of laforin. The lines used were MDA-231 and MDA-435S, breast carcinoma; HTC116p53 + / + and HTC116p53 - / -, colon cancer lines; and Hela, cervix adenocarcinoma. D-actin was used as a load control. Figure 8.- The Laforin-Maline complex degrades endogenous p73 in human SH-SY5Y cells. SH-SY5Y cells were infected with Adenovirus expressing Laforin, Maline or the complex of both. The used cell phones were subjected to western blot assays with commercial antibodies anti p73 and anti D-actin. It is observed that the Laforin-Maline complex degrades p73. D-actin was used as load control.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓNEXAMPLES OF REALIZATION
Ejemplo 1.- Inmunización y generación de un anticuerpo monoclonal frente a laforinaExample 1.- Immunization and generation of a monoclonal antibody against laforin
1.1.- Generación de proteínas de fusión GST::laforina en E coli para usarlas como inmunógeno en Ia producción de anticuerpos monoclonales.1.1.- Generation of GST :: laforin fusion proteins in E coli for use as an immunogen in the production of monoclonal antibodies.
Se generó una proteína de fusión entre GST (glutathione S- transferase) y Ia proteína laforina humana completa, insertando en el vector de expresión en procariotas pGEX-A (Pharmacia Biotech) el cDNA completo de Laforina obtenido de una librería de cDNA humano adquirida al RZPD (Deutsches Ressourcenzentrum fuer Genomforschung, GmbH) (ver SEQ ID NO1 ). Para Ia transferencia del cDNA de laforina al vector de expresión se diseñaron oligonucleótidos que incorporaban Ia diana de restricción correcta para mantener Ia fase de lectura de Ia proteína laforina a continuación de Ia de GST. Los plásmidos resultantes de Ia ligación del fragmento codificando laforina y del vector de expresión se secuenciaron para confirmar Ia integridad de Ia secuencia de Ia proteína de fusión GST:: laforina. Para la expresión de Ia proteína de fusión GST::laforina se usó Ia cepa bacteriana DHδα'F [genotipo: φ80d/acZ/? M15, recA1 , endkλ , gyrA96, thi-1, hsdRM (rk ", mk +), supEΛΛ, re/A1 , deoR, p (/acZYA-argF)]. Una vez transformada esta cepa con el plásmido correspondiente, Ia expresión de Ia proteína de fusión GST::laforina se inicia con un preinóculo en 15 mi de medio LB+ampicilina (100 μg/ml) enriquecido con glucosa al 2% que se deja creciendo toda Ia noche a 370C en agitación (200 rpm). Al día siguiente se diluye dicho preinóculo diez veces en un volumen final de 150 mi de LB+ampicilina+glucosa 2% y se deja creciendo dos o tres horas más en las mismas condiciones, hasta que Ia densidad óptica a 600 nm del inoculo alcance un valor comprendido entre 0.9 y 1.0. Una vez alcanzado el cultivo esta densidad de bacterias se centrifuga y resuspende el precipitado en otros 150 mi de medio LB+ampicilina (sin glucosa). Posteriormente se Ie añade IPTG 0.1 mM (isopropylthio-β-D-galactoside - Invitrogen) y se incuba durante una hora a 250C en agitación. Transcurrido este tiempo se centrifuga el cultivo, se hace un lavado del precipitado en 30 mi de PBS {Phosphate-buffered saline - NaCI 137 mM, KCI 2.7 mM, Na2HPθ4 4.3 mM, KH2PO4 1.4 mM, pH 7.3) y se vuelve a resuspender en 10 mi de PBS frío más inhibidores de proteasas [benzamidina 3 μg/ml (SIGMA), aprotinina 10 μg/ml (SIGMA), leupeptina 5 μg/ml (SIGMA) y PMSF 2mM {phenylmethylsulfonyl fluoride - PIERCE)]. Para lisar las células se pasa Ia muestra dos veces por una French Press y para solubilizar las proteínas se incuba con Tritón X-100 0.1 % (SIGMA) una hora a 40C en un orbital. Tras una última centrifugación de diez minutos a 40C y 9000 g se recoge el sobrenadante (fracción con Ia proteína soluble). El análisis de Ia eficacia del proceso de inducción y de Ia solubilidad de Ia proteína inducida se realiza por electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% cargando una pequeña muestra de cada uno de los pasos en condiciones de reducción. Después de comprobar el estado de Ia proteína en Ia fracción soluble del lisado bacteriano mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10%, se procede a su purificación. En primer lugar se filtra el lisado pasándolo por un filtro de 0.45 μm. Posteriormente, este lisado se mezcla con una columna de 500 μl de agarosa S-GST (Glutathione-agarose - SIGMA) y se incuba en un orbital durante toda Ia noche a 40C. Al día siguiente se centrifuga y se lava Ia columna tres veces con PBS (5 minutos a 40C y 1000 g), guardando todos los sobrenadantes para su posterior análisis. Finalmente, se resuspende en 1 mi de tampón de elución (glutatión reducido 50 mM (glutathione reduced form - SIGMA) y Tris HCI pH 8.0 250 mM) y se incuba durante toda Ia noche a 40C en un orbital. Al día siguiente se centrifuga y se recoge el sobrenadante, donde se encuentra Ia proteína eluida de Ia columna. Por último, se Ie añade DTT 2 mM (Cleland's Reagent - Calbiochem) y glicerol 15% y se guarda a - 8O0C. Para su posterior análisis y cuantificación, el eluido se dializa frente a Tris HCI pH 8.0 50 mM, NaCI 150 mM, DTT 2 mM y glicerol 15%. La cuantificación de Ia proteína se realiza con un ensayo de Bradford siguiendo las indicaciones del kit de Bio-Rad Protein Assay.A fusion protein between GST (glutathione S-transferase) and the complete human laforin protein was generated, inserting in the expression vector in prokaryotes pGEX-A (Pharmacia Biotech) the complete Laforin cDNA obtained from a human cDNA library acquired at RZPD (Deutsches Ressourcenzentrum fuer Genomforschung, GmbH) (see SEQ ID NO1). For the transfer of the laforin cDNA to the expression vector, oligonucleotides were designed that incorporated the correct restriction target to maintain the reading phase of the laforin protein following that of GST. The plasmids resulting from the ligation of the fragment encoding laforin and the expression vector were sequenced to confirm the integrity of the sequence of the GST :: laforin fusion protein. For the expression of the GST :: laforin fusion protein, the bacterial strain DHδα ' F [genotype: φ80d / acZ /? M15, recA1, endkλ, gyrA96, thi-1, hsdRM (r k " , m k + ), supEΛΛ, re / A1, deoR, p (/ acZYA-argF)]. Once this strain has been transformed with the corresponding plasmid, the expression of the fusion protein GST :: laforina starts with a pre - inoculum in 15 ml of LB + ampicillin (100 .mu.g / ml) supplemented with 2% glucose is left to grow at 37 place overnight 0 C under stirring ( 200 rpm) The next day, said pre-circle is diluted tenfold in a final volume of 150 ml of LB + ampicillin + 2% glucose and allowed to grow two or three hours more under the same conditions, until the optical density at 600 nm from the inoculum it reaches a value between 0.9 and 1.0 Once this culture is reached, this density of bacteria is centrifuged and the precipitate is resuspended in another 150 ml of LB medium + ampicillin (without glucose), subsequently 0.1 mM IPTG (isopropylthio- is added) β-D-galactoside - Invitrogen) and incubated for one hour at 25 0 C under stirring After this time cen. the crop is triturated, the precipitate is washed in 30 ml of PBS {Phosphate-buffered saline - 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na2HPθ4, KH 2 PO 4 1.4 mM, pH 7.3) and resuspended again in 10 my cold PBS plus protease inhibitors [benzamidine 3 μg / ml (SIGMA), aprotinin 10 μg / ml (SIGMA), leupeptin 5 μg / ml (SIGMA) and PMSF 2mM {phenylmethylsulfonyl fluoride - PIERCE)]. To lyse the cells, the sample is passed twice through a French Press and to solubilize the proteins, incubate with 0.1% Triton X-100 (SIGMA) one hour at 4 0 C in an orbital. After a last centrifugation of ten minutes at 4 0 C and 9000 g, the supernatant (fraction with the soluble protein) is collected. The analysis of the efficiency of the induction process and of the solubility of the induced protein is carried out by electrophoresis in a 10% polyacrylamide gel by loading a small sample of each of the steps under reduction conditions. After checking the state of the protein in the soluble fraction of the bacterial lysate by electrophoresis in a 10% polyacrylamide gel, its purification is carried out. First the lysate is filtered through a 0.45 μm filter. Subsequently, this lysate is mixed with a 500 μl column of S-GST agarose (Glutathione-agarose - SIGMA) and incubated in an orbital overnight at 4 0 C. The next day, column three is centrifuged and washed times with PBS (5 minutes at 4 0 C and 1000 g), saving all supernatants for later analysis. Finally, it is resuspended in 1 ml of elution buffer (50 mM reduced glutathione (glutathione reduced form - SIGMA) and Tris HCI pH 8.0 250 mM) and incubated overnight at 4 0 C in an orbital. The next day, the supernatant is centrifuged and collected, where the eluted protein of the column is found. Finally, 2 mM DTT (Cleland ' s Reagent - Calbiochem) and glycerol 15% are added and stored at - 8O 0 C. For subsequent analysis and quantification, the eluate is dialyzed against 50 mM Tris HCI pH 8.0, 150 mM NaCI, 2 mM DTT and 15% glycerol. The quantification of the protein is carried out with a Bradford assay following the indications of the Bio-Rad Protein Assay kit.
Para determinar que Ia proteína de fusión purificada contenía Ia proteína laforina humana se realizaron "western blots" (Figura 1 ) utilizando un anticuerpo policlonal de conejo generado contra un péptido (QEDFFQKFGKVRSSV, SEQ ID NO3) dentro de Ia región carboxilo terminal de Ia proteína laforina humana, que comprendía los aminoácidos 314 hasta 328, ambos incluidos. Este péptido, con una cisteína añadida en el extremo amino terminal, se conjugó a KLH (Hemocyanin - SIGMA) utilizando protocolos standard y se utilizó para inmunizar un conejo hembra (New Zealand blanco de orejas grandes) según procedimientos habituales, del que posteriormente se obtuvo el anticuerpo.To determine that the purified fusion protein contained the human laforin protein, western blots were performed (Figure 1) using a rabbit polyclonal antibody generated against a peptide (QEDFFQKFGKVRSSV, SEQ ID NO3) within the carboxyl terminal region of the laforin protein human, which included amino acids 314 to 328, both included. This peptide, with a cysteine added at the amino terminal end, was conjugated to KLH (Hemocyanin-SIGMA) using standard protocols and was used to immunize a female rabbit (New Zealand white large-eared) according to usual procedures, from which it was subsequently obtained the antibody
1.2.- Inmunización y generación de anticuerpos monoclonales1.2.- Immunization and generation of monoclonal antibodies
Hembras de ratones BALB/c se inmunizaron intraperitonealmente una vez cada dos semanas, hasta completar un total de tres veces, con 20 μg de GST::laforina en adyuvante de SIGMA (MPL + TDM emulsión), según protocolos standard. Después de Ia última inmunización, a los ratones que, según un ELISA anti gst::laforina, poseían título de anticuerpos anti GST::laforina, se les dio un boost con 20 μg de GST::laforina en PBS. Tres días después se les extrajo el bazo, se purificaron los esplenocitos y se fusionaron con Ia línea X63AG8 de mieloma de ratón según protocolos previamente descritos (26). Los clones de hibridoma se seleccionaron y analizaron mediante ELISA para Ia producción de anticuerpos anti GST::laforina. Los hibridomas que producían mAB que reconocían GST::laforina se ensayaron ahora mediante "western blot" frente a GST::laforina y GST sola y se seleccionaron aquellos que solo reconocían Ia GST::laforina. Los hibridomas seleccionados se clonaron mediante dilución límite y se expandieron. Uno de estos anticuerpos, denominado LAF-A7 se purificó utilizando cromatografía de afinidad con proteína G (HiTrap protein G, GE Healthcare). El isotipo IgGi kappa del anticuerpo monoclonal LAF-A7 se determinó usando el IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche Applied Science) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El hibridoma productor del anticuerpo LAF-A7 se ha depositado en Ia colección de cultivos ECACC (European Collection of Animal CeII Culture) el 18 de Octubre de 2007 con el n° de referencia ECACC Q7394.Female BALB / c mice were immunized intraperitoneally once every two weeks, to complete a total of three times, with 20 μg of GST :: laforin in SIGMA adjuvant (MPL + TDM emulsion), according to standard protocols. After the last immunization, at mice that, according to an anti-gst :: laforin ELISA, possessed anti-GST :: laforin antibody titer, were given a boost with 20 μg of GST :: laforin in PBS. Three days later the spleen was removed, the splenocytes were purified and fused with the X63AG8 line of mouse myeloma according to previously described protocols (26). The hybridoma clones were selected and analyzed by ELISA for the production of anti GST :: laforin antibodies. Hybridomas that produced mAB that recognized GST :: laforin were now tested by "western blot" versus GST :: laforin and GST alone and those that only recognized GST :: laforin were selected. Selected hybridomas were cloned by limit dilution and expanded. One of these antibodies, called LAF-A7 was purified using G protein affinity chromatography (HiTrap protein G, GE Healthcare). The IgGi kappa isotype of the LAF-A7 monoclonal antibody was determined using the IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche Applied Science) according to the manufacturer's instructions. The hybridoma producing the LAF-A7 antibody was deposited in the ECACC (European Collection of Animal CeII Culture) crop collection on October 18, 2007 with ECACC reference number Q7394.
1.3.- Confirmación de Ia especificidad del anticuerpo monoclonal LAF-A7.1.3.- Confirmation of the specificity of the LAF-A7 monoclonal antibody.
La especificidad del anticuerpo monoclonal anti-laforina humana LAF-A7 se confirmó mediante western blot utilizando dos aproximaciones diferentes. En una primera serie de experimentos, usados de mioblastos de ratón C2C12 infectados o no con cantidades crecientes de un adenovirus que expresa laforina humana (AdCMV-Laf, 12) se ensayaron en western blot con el anticuerpo monoclonal LAF-A7 (Figura 2). Estos experimentos ilustran que el monoclonal LAF-A7 reconoce específicamente laforina. El hecho de que Ia intensidad de Ia banda reconocida por LAF-A7 se correlacione con Ia cantidad de AdCMV-laf utilizado en Ia infección de las células C2C12, indica que LAF-A7 es un reactivo útil para valorar Ia expresión de laforina de forma cuantitativa. En una segunda tanda de experimentos se valoró si el anticuerpo LAF-A7 era útil en Ia identificación por western blot de laforina en usados de distintos tejidos humanos. Para estos experimentos se utilizaron muestras de tejidos humanos obtenidas de necropsias de un individuo control (c) y de un paciente con enfermedad de Lafora (LD) que no expresa laforina debido a mutaciones en el gen EPM2A. El experimento mostrado en Ia Figura 3 ilustra que el anticuerpo LAF-A7 reconoce laforina en muestras de músculo esquelético, cerebro y corazón en el control pero no en el paciente con LD, ilustrando que el monoclonal LAF-A7 no tiene reactividades adicionales que podrían resultar en falsos positivos. En este sentido, es importante señalar el potencial valor que tiene el anticuerpo monoclonal LAF-A7, en relación a anticuerpos generados contra péptidos o frente a anticuerpos policlonales anti-laforina en general.The specificity of the LAF-A7 human anti-laforin monoclonal antibody was confirmed by western blot using two different approaches. In a first series of experiments, used of C2C12 mouse myoblasts infected or not infected with increasing amounts of an adenovirus expressing human laforin (AdCMV-Laf, 12) were tested in western blot with the monoclonal antibody LAF-A7 (Figure 2). These experiments illustrate that the monoclonal LAF-A7 specifically recognizes laforin. The fact that the intensity of the band recognized by LAF-A7 correlates with the amount of AdCMV-laf used in the infection of C2C12 cells, indicates that LAF-A7 is a useful reagent to assess the expression of laforin quantitatively. In a second round of experiments it was assessed whether the LAF-A7 antibody was useful in the identification by western blot of laforin in used from different human tissues. For these experiments, human tissue samples obtained from necropsies of a control individual (c) and a patient with Lafora disease (LD) who do not express laforin due to mutations in the EPM2A gene were used. The experiment shown in Figure 3 illustrates that the LAF-A7 antibody recognizes laforin in skeletal muscle, brain and heart samples in the control but not in the patient with LD, illustrating that the LAF-A7 monoclonal has no additional reactivities that could result in false positives. In this regard, it is important to point out the potential value of the LAF-A7 monoclonal antibody, in relation to antibodies generated against peptides or against polyclonal anti-laforin antibodies in general.
Ejemplo 2.- Análisis tumores y muestras controlExample 2.- Tumor analysis and control samples
Posteriormente, se procedió a valorar Ia presencia o no de Ia proteína laforina en muestras humanas provenientes de pacientes con distintos tipos de cáncer.Subsequently, the presence or absence of the laforin protein in human samples from patients with different types of cancer was assessed.
2.1. Cáncer de colon.2.1. Colon cancer.
Se han analizado 21 casos de carcinoma de colon en los que se disponía de tejido tumoral y mucosa sana del mismo paciente mediante western blot utilizando el anticuerpo monoclonal de Ia invención LAF-A7. Para ello, usados de estos tejidos conteniendo 75 Dg de proteína total se corrieron en geles de SDS-acrilamida y se transfirieron a una membrana que se revelo con este anticuerpo LAF-A7 (1 Dg/ml) según los protocolos habituales para realizar western blot. En el 90% de los casos con tumor de colon analizados (19/21 ) se observó una perdida total o una disminución muy significativa de Ia expresión de laforina en tejido tumoral respecto al tejido sano (Figura 4).21 cases of colon carcinoma were analyzed in which healthy tumor and mucous tissue was available from the same patient by western blot using the monoclonal antibody of the invention LAF-A7. To do this, used of these tissues containing 75 Dg of total protein were run on SDS-acrylamide gels and transferred to a membrane that was revealed with this LAF-A7 antibody (1 Dg / ml) according to the usual protocols for performing western blot . In 90% of cases with colon tumor analyzed (19/21) a total loss or decrease was observed Very significant expression of laforin in tumor tissue with respect to healthy tissue (Figure 4).
2.2. Cáncer de mama. Utilizando el mismo procedimiento descrito para los tumores de colon se estudiaron varios tumores de mama (Figura 5), encontrándose una perdida de expresión de laforina en 2 de los 5 casos analizados (40%). En estos casos no se disponía de tejido sano y se utilizó como referencia para Ia expresión de laforina una muestra de tejido sano de cerebro humano.2.2. Breast cancer Using the same procedure described for colon tumors, several breast tumors were studied (Figure 5), finding a loss of laforin expression in 2 of the 5 cases analyzed (40%). In these cases, healthy tissue was not available and a sample of healthy human brain tissue was used as a reference for the expression of laforin.
2.3. Cáncer de riñon.2.3. Kidney cancer.
Utilizando el mismo procedimiento se han analizado dos casos con tumores de riñon y un tumor de Edwing, observándose en los tres una disminución parcial de Ia expresión de laforina respecto del control de cerebro. (Figura 6).Using the same procedure, two cases with kidney tumors and an Edwing tumor have been analyzed, with a partial decrease in the expression of laforin in relation to brain control. (Figure 6).
2.4 Análisis de líneas celulares de tumores humanos no linfomas.2.4 Cell line analysis of human tumors not lymphomas.
Con objeto de determinar Ia expresión de laforina en líneas celulares derivadas de tumores humanos se han estudiado cinco líneas utilizando el mismo procedimiento descrito para el análisis de las biopsias de tumores. Las líneas utilizadas fueron MDA-231 y MDA-435S, provenientes de carcinoma de mama; HTC116p53+/+ y HTC116p53-/-, líneas provenientes de cáncer de colon; y Hela, adenocarcinoma de cervix. En contraste con los resultados descritos previamente para las líneas celulares de linfomas humanos las líneas analizadas no muestran diferencias en su expresión de laforina respecto del control de cerebro.In order to determine the expression of laforin in cell lines derived from human tumors, five lines have been studied using the same procedure described for the analysis of tumor biopsies. The lines used were MDA-231 and MDA-435S, from breast carcinoma; HTC116p53 + / + and HTC116p53 - / -, lines from colon cancer; and Hela, cervix adenocarcinoma. In contrast to the results previously described for human lymphoma cell lines, the analyzed lines do not show differences in their laforin expression with respect to brain control.
Ejemplo 3.- Implicación etiopatogénica de Ia ausencia o disminución de los niveles de laforina en el cáncer a través de su inducción de oncogenes Con objeto de determinar si Ia disminución de Ia proteína laforina representaba una asociación casual con el cáncer o realmente pudiera estar implicada en Ia causa de un proceso tumoral se estudió el efecto de Ia misma sobre un determinado oncogén, concretamente Ia proteína p73 (28). Así, células humanas SH-SY5Y (línea celular proveniente de un neuroblastoma) se infectaron con Adenovirus expresando Laforina (que comprende Ia secuencia de nucleótidos de laforina humana, SEQ ID NO1 , codificante de Ia proteína de SEQ ID NO2), Malina (que comprende Ia secuencia de nucleótidos de malina humana, SEQ ID NO4, codificante de Ia proteína de SEQ ID NO5) o Ia combinación de ambas proteínas (SEQ ID NO2 y 5) según se describe en detalle en Ia referencia 12. Posteriormente, los usados celulares fueron sometidos a ensayos de western blot con anticuerpos comerciales anti p73 y anti D-actina (control de carga). El resultado que se observó es que Ia expresión de laforina y malina por separado inducían Ia disminución de los niveles de p73, y que Ia expresión de ambas proteínas, Laforina-Malina, provocó Ia degradación completa de Ia proteína p73 endógena en estas células. En este sentido, es correcto afirmar que Ia ausencia o disminución de Ia laforina, o incluso de Ia Malina, podría permitir o incrementar Ia actividad del encogen p73 y permitir así Ia progresión tumoral.Example 3.- Ethiopathogenic implication of the absence or decrease of laforin levels in cancer through its induction of oncogenes In order to determine if the decrease in laforin protein represented a casual association with cancer or could actually be involved in the cause of a tumor process, the effect of the same on a particular oncogene was studied, specifically p73 protein (28). Thus, human SH-SY5Y cells (cell line from a neuroblastoma) were infected with Adenovirus expressing Laforin (which comprises the nucleotide sequence of human laforin, SEQ ID NO1, coding for the protein of SEQ ID NO2), Maline (comprising The nucleotide sequence of human maline, SEQ ID NO4, coding for the protein of SEQ ID NO5) or the combination of both proteins (SEQ ID NO2 and 5) as described in detail in reference 12. Subsequently, the used cell phones were subjected to western blot assays with commercial anti-p73 and anti-D-actin antibodies (load control). The result that was observed is that the expression of laforin and maline separately induced the decrease in p73 levels, and that the expression of both proteins, Laforin-Maline, caused the complete degradation of the endogenous p73 protein in these cells. In this sense, it is correct to affirm that the absence or decrease of laforin, or even of Malina, could allow or increase the activity of the p73 shrink and thus allow tumor progression.
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Claims

REIVINDICACIONES
1.- Procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una muestra biológica tumoral caracterizado porque se basa en Ia determinación de los niveles de Ia presencia de laforina y que comprende las siguientes etapas: a) identificación de los niveles de expresión de laforina, b) comparación de los niveles de laforina observados en a) con una muestra biológica control, e c) identificación de una muestra como tumoral cuando los niveles de laforina disminuyen con respecto a los obtenidos en Ia muestra control.1.- Diagnostic and prognostic procedure of a tumor biological sample characterized in that it is based on the determination of the levels of the presence of laforin and which comprises the following stages: a) identification of laforin expression levels, b) comparison of the laforin levels observed in a) with a biological control sample, ec) identification of a sample as a tumor when the laforin levels decrease with respect to those obtained in the control sample.
2.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 1 caracterizado porque Ia identificación de laforina se realiza conjuntamente con Ia identificación de malina en Ia misma muestra biológica.2. Identification procedure according to claim 1 characterized in that the identification of laforin is carried out together with the identification of maline in the same biological sample.
3.- Procedimiento de identificación según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque Ia identificación de laforina se refiere a Ia forma proteica de Ia laforina humana, preferentemente de SEQ ID NO 2 y se lleva a cabo mediante el uso de un anticuerpo específico de Ia proteína laforina en técnicas inmunológicas.3. Identification procedure according to claims 1 and 2 characterized in that the identification of laforin refers to the protein form of human laforin, preferably of SEQ ID NO 2 and is carried out through the use of a specific antibody of the protein Laforin in immunological techniques.
A - Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 3 caracterizado porque el anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal, fragmentos o derivados de los mismos.A - Identification procedure according to claim 3, characterized in that the antibody can be monoclonal or polyclonal, fragments or derivatives thereof.
5.- Procedimiento de identificación según Ia reivindicación 3 caracterizado porque Ia técnica inmunológica pertenece al siguiente grupo: inmunohistoquímica y western blot o inmunoblot. 5. Identification procedure according to claim 3 characterized in that the immunological technique belongs to the following group: immunohistochemistry and western blot or immunoblot.
6.- Procedimiento de identificación según las reivindicaciones 1 a Ia 5 caracterizado porque anticuerpo utilizado es el anticuerpo monoclonal LAF-A7 producido por el hibridoma LAF-A7 depositado en ACECC Q7394.6. Identification procedure according to claims 1 to 5, characterized in that the antibody used is the LAF-A7 monoclonal antibody produced by the LAF-A7 hybridoma deposited in ACECC Q7394.
7.- Hibridoma LAF-A7 caracterizado porque produce el anticuerpo LAF-A7 y porque se encuentra depositado en Ia colección de cultivos ECACC - European Collection of Animal CeII Culture- el 18 de octubre de 2007 con Ia referencia Q7394.7.- LAF-A7 hybridoma characterized in that it produces the LAF-A7 antibody and because it is deposited in the ECACC culture collection - European Collection of Animal CeII Culture- on October 18, 2007 with reference Q7394.
8.- Anticuerpo monoclonal LAF-A7 caracterizado porque es producido por el hibridoma según Ia reivindicación 7.8. LAF-A7 monoclonal antibody characterized in that it is produced by the hybridoma according to claim 7.
9.- Uso de cualquier otro anticuerpo, monoclonal o policlonal, específico de Ia laforina para el diagnóstico del cáncer o para Ia elaboración de composiciones farmacéuticas de diagnóstico contra el cáncer.9.- Use of any other antibody, monoclonal or polyclonal, specific to laforin for the diagnosis of cancer or for the preparation of pharmaceutical diagnostic compositions against cancer.
10.- Procedimiento de identificación según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante Ia amplificación génica de un precursor génico de laforina, perteneciente al siguiente grupo: PCR cuantitativa o en una PCR semi-cuantitativa con unos cebadores específicos de laforina humana.10. Identification procedure according to claims 1 and 2 characterized in that the identification of laforin is carried out by means of the gene amplification of a laforin gene precursor, belonging to the following group: quantitative PCR or in a semi-quantitative PCR with primers specific for human laforin.
11.- Procedimiento de identificación según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante Ia técnica de Northern blot con sondas de polinucleótidos específicas de laforina.11. Identification procedure according to claims 1 and 2 characterized in that the identification of laforin is carried out by means of the Northern blot technique with laforin specific polynucleotide probes.
12.- Procedimiento de identificación según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque Ia identificación de laforina se lleva a cabo mediante hibridación in situ con un precursor de laforina. 12. Identification procedure according to claims 1 and 2 characterized in that the identification of laforin is carried out by in situ hybridization with a precursor of laforin.
13.- Procedimiento de identificación según las reivindicaciones 1 a Ia 6 y 10 a Ia 12 caracterizado porque el tipo de cáncer que se diagnóstica pertenece al siguiente grupo: colon, mama y riñon.13.- Identification procedure according to claims 1 to 6 and 10 to 12, characterized in that the type of cancer that is diagnosed belongs to the following group: colon, breast and kidney.
14.- Uso de un compuesto o agente activador, inductor o agonista de Ia actividad antitumoral de Ia laforina/malina, en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para Ia profilaxis y tratamiento de tumores en mamíferos, preferentemente seres humanos, y más preferentemente para el cáncer de colon, mama y riñon.14.- Use of a compound or activating agent, inducer or agonist of the antitumor activity of laforin / maline, in the preparation of a medicament or pharmaceutical composition for the prophylaxis and treatment of tumors in mammals, preferably humans, and more preferably for colon, breast and kidney cancer.
15.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 14 caracterizado porque el compuesto está constituido por una proteína o péptido laforina/malina con actividad antitumoral en el interior de las células de un mamífero, preferentemente humanas, y que comprende una o varias proteínas o péptidos laforina/malina pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de aminoácidos (aá.) constituida por Ia secuencia de aá. de Ia proteína laforina humana (SEQ ID NO2), malina humana (SEQ ID NO5) o ambas, b) una secuencia de aá. análoga a una cualquiera de las secuencias de a), c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y e). d) una secuencia de aá. que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).15. Use of a compound according to claim 14 characterized in that the compound is constituted by a protein or peptide laforin / maline with antitumor activity inside the cells of a mammal, preferably human, and comprising one or several proteins or peptides laforin / maline belonging to the following group: a) an amino acid sequence (aá.) constituted by the aá sequence. of the human laforin protein (SEQ ID NO2), human maline (SEQ ID NO5) or both, b) an aa sequence. analogous to any one of the sequences of a), c) a fragment of any one of the sequences of a) and b), and e). d) a sequence of aá. comprising any sequence belonging to a), b) and c).
16.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 15 caracterizado porque Ia secuencia de a) es Ia secuencia de aá. de Ia laforina humana (SEQ ID NO2). 16. Use of a compound according to claim 15 characterized in that the sequence of a) is the sequence of aá. of human laforin (SEQ ID NO2).
17.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 15 caracterizado porque Ia secuencia de a) es Ia secuencia de aá. de Ia malina humana (SEQ ID NO5).17. Use of a compound according to claim 15 characterized in that the sequence of a) is the sequence of aá. of the human maline (SEQ ID NO5).
18.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 15 caracterizado porque Ia secuencia de a) comprende Ia secuencia de aá. de Ia laforina y malina humanas (SEQ ID NO2 y SEQ ID NO5).18. Use of a compound according to claim 15 characterized in that the sequence of a) comprises the sequence of aá. of human laforin and maline (SEQ ID NO2 and SEQ ID NO5).
19.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 14 caracterizado porque el compuesto está constituido por una construcción genética que comprende una o varias secuencias de nucleótidos laforina o malina pertenecientes al siguiente grupo: a) una secuencia de nucleótidos constituida por una secuencia de nucleótidos codificante de Ia proteína laforina, malina o ambas b) una secuencia de nucleótidos análoga a una cualquiera de las secuencias de a), c) un fragmento de una cualquiera de las secuencias de a) y b), y d) una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia cualquiera perteneciente de a), b) y c).19. Use of a compound according to claim 14 characterized in that the compound is constituted by a genetic construction comprising one or several laforin or maline nucleotide sequences belonging to the following group: a) a nucleotide sequence consisting of a coding nucleotide sequence of the protein laforin, maline or both b) a nucleotide sequence analogous to any one of the sequences of a), c) a fragment of any one of the sequences of a) and b), and d) a nucleotide sequence comprising a any sequence belonging to a), b) and c).
20.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 19 caracterizado porque Ia secuencia de nucleótidos de a) es Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia laforina humana (SEQ ID NO1 ).20. Use of a compound according to claim 19, characterized in that the nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence coding for human laforin (SEQ ID NO1).
21.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 19 caracterizado porque Ia secuencia de nucleótidos de a) es Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia malina humana (SEQ ID NO4). 21. Use of a compound according to claim 19, characterized in that the nucleotide sequence of a) is the nucleotide sequence encoding human maline (SEQ ID NO4).
22.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 19 caracterizado porque Ia secuencia de nucleótidos de a) comprende Ia secuencia de nucleótidos codificante de Ia laforina y malina humanas (SEQ ID NO1 y SEQ ID NO4).22. Use of a compound according to claim 19 characterized in that the nucleotide sequence of a) comprises the nucleotide sequence encoding human laforin and maline (SEQ ID NO1 and SEQ ID NO4).
23.- Uso de un compuesto según Ia reivindicación 19 caracterizado porque el compuesto está constituido un vector de expresión génica que comprende una secuencia de nucleótidos laforina/malina (SEQ ID NO1 ó 4, o ambas) o una construcción genética laforina/malina que las comprenda (SEQ ID NO1 ó 4, o ambas) y que permite Ia expresión de una proteína o péptido con actividad antitumoral.23. Use of a compound according to claim 19 characterized in that the compound is constituted by a gene expression vector comprising a nucleotide sequence laforin / maline (SEQ ID NO1 or 4, or both) or a laforin / maline genetic construct that understand (SEQ ID NO1 or 4, or both) and that allows the expression of a protein or peptide with antitumor activity.
24.- Composición farmacéutica útil para el tratamiento del cáncer caracterizada porque se ha obtenido según las reivindicaciones 14 a Ia 23. 24.- Pharmaceutical composition useful for the treatment of cancer characterized in that it has been obtained according to claims 14 to 23.
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