WO2009026892A1 - Oligonucleotides for the inhibition of mouse major satellite sequences - Google Patents
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Abstract
Disclosed is the use of an oligonucleotide having the sequence represented in SEQ ID:NO 1, SEQ ID:NO 2, or SEQ ID:NO3 for reducing the number of mouse major satellite transcripts.
Description
OLIGONUKLEOTIDE ZUR HEMMUNG VON "MOUSE MAJOR SATELLITE" SEQUENZEN OLIGONUCLEOTIDES FOR INHIBITING "MOUSE MAJOR SATELLITE" SEQUENCES
Die Erfindung betrifft Oligonukleotide und deren Verwendung zur Hemmung von „major satellite repeaf'-Transkripten.The invention relates to oligonucleotides and their use for inhibiting major satellite repeaf transcripts.
Das die Zentromere aller Chromosomen der Maus (mit Ausnahme des Y-Chromosoms) umgebende (perizentromere) Heterocliromatin ist in langen Folgen von repetitiven DNA- Sequenzen („major satellite repeats") organisiert, die jeweils 234 Basenpaare (bp) umfassen und dabei insgesamt rund 3 % des Maus-Genoms ausmachen. Obwohl diese Region eine hochgradig kompakte Struktur aufweist, ist sie transkriptioneil aktiv. Die hierbei entstehenden RNA-Transkripte scheinen an der Aufrechterhaltung der perizentromeren Integrität beteiligt zu sein. Diese Situation ist in höheren Säugern und beim Menschen vergleichbar. Inwieweit die biologische Funktion von „major satellite repeat"-Transkripten bei fehlgesteuerten zellulären Prozessen, die mit Erkrankungen des Menschen begleitend oder kausal verknüpft sind, korreliert ist, kann gegenwärtig nicht beantwortet werden. Das Wissen über die biologische Bedeutung der „major satellite repeaf-Transkripte ist derzeit noch völlig unzureichend, wenngleich bekannt ist, dass Methylierung dieser DNA- Abschnitte einen Einfluss auf die Transkriptionsrate hat (Lehnertz, B. u.a.: SwvJP/z-Mediated Histone H3 Ly sine 9 Methylation directs DNA Methylation to Major Satellite Repeats at Pericentric Heterochromatin. Current Biology (2003 13 (14) 1192-1200 und Supplemental Data zu dieser Veröffentlichung, abrufbar unter http://download.current-biology.eom/supplementarydata/curbio/13/14/l 192/DC1 /Lehnertz.pdf [recherchiert am 06.03.2008]). Aus der zuvor zitierten Veröffentlichung ist auch ein Verfahren zur Klonierung von mouse major und mouse minor satellites bekannt.The (pericentromeric) heterocliromatin surrounding the centromeres of all mouse chromosomes (with the exception of the Y chromosome) is organized in long sequences of repetitive DNA sequences ("major satellite repeats"), each comprising 234 base pairs (bp), totaling approximately Although this region has a highly compact structure, it is transcriptionally active, and the resulting RNA transcripts appear to be involved in maintaining pericentromeric integrity, a situation that is comparable in higher mammalian and human populations. To what extent the biological function of "major satellite repeat" transcripts is correlated with aberrant cellular processes that are concomitantly or causally linked to human diseases can not currently be answered. The knowledge about the biological significance of the major satellite repeaf transcripts is currently completely insufficient, although it is known that methylation of these DNA sections has an influence on the transcription rate (Lehnertz, B. et al .: SwvJP / z-Mediated Histone H3 Ly sine 9 Methylation directs DNA Methylation to Major Satellite Repeats at Pericentric Heterochromatin Current Biology (2003 13 (14) 1192-1200 and Supplemental Data to this publication, available at http: //download.current-biology.eom/supplementarydata/curbio/ 13/14 / l 192 / DC1 /Lehnertz.pdf [researched 06.03.2008]). From the previously cited publication, a method for the cloning of mouse major and mouse minor satellites is also known.
Eine in der Molekularbiologie weit verbreitete Methode, die biologische Funktion eines bestimmten Gens zu untersuchen, besteht in dessen gezielter Ausschaltung unter Beobachtung des sich hieraus ergebenden Phänotyps. Neben der Verwendung von kurzer doppelsträngiger „small interfering" (si)RNA hat sich hierbei in der Vergangenheit der Einsatz von Antisense- Oligonukleotiden als besonders wirkungsvoll erwiesen. Hierbei handelt es sich um ein-
zelsträngige DNA- oder RNA-Moleküle, die sequenzspezifϊsch gegen die RNA-Transkripte der jeweiligen Gene gerichtet sind, mit diesen interagieren und dabei z. B. deren Translation in Proteine sterisch inhibieren („steric block") oder zu einem beschleunigten Abbau der Transkripte führen.A widely used method in molecular biology to study the biological function of a particular gene consists in its targeted elimination under observation of the resulting phenotype. In addition to the use of short double-stranded "small interfering" (si) RNA, the use of antisense oligonucleotides has proved to be particularly effective in the past. single-stranded DNA or RNA molecules that are directed in sequence-specific manner against the RNA transcripts of the respective genes, interact with these and thereby z. B. their translation into proteins sterically inhibit ("steric block") or lead to an accelerated degradation of the transcripts.
Bis heute sind entsprechende Untersuchungen zur biologischen Funktion der „major satellite repeaf'-Transkripte in geeigneten Versuchsmodellen, z. B. in der Maus, mangels geeigneter „molekularer Werkzeuge" für deren Hemmung nicht möglich. Auch die erwartungsvolle Entwicklung von siRNA lieferte bis heute keine wirksamen Konstrukte gegen „major satellite repeaf'-Transkripte.To date, appropriate studies on the biological function of the "major satellite repeaf" transcripts in suitable experimental models, eg. Due to the lack of suitable "molecular tools" for their inhibition, the development of siRNA did not provide effective constructs against major satellite repeaf transcripts.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, spezifische Inhibitoren für „major satellite repeaf'- Transkripte bereitzustellen.The object of the invention is therefore to provide specific inhibitors for "major satellite repeaf" transcripts.
Die Aufgabe wird gemäß Anspruch 1 gelöst. Die Unteransprüche geben vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung an.The problem is solved according to claim 1. The subclaims indicate advantageous embodiments of the invention.
Der Erfindung liegt die Entwicklung und Erprobung hochwirksamer inhibitorisch aktiver Oli- gonukleotide gegen „major satellite repeaf'-Transkripte der Maus (sog. „mouse major satelli- te"-Transkripte) zu Grunde. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind in Teilbereichen gegen offene Sekundärstrukturen der „mouse major satellite"-Transkripte gerichtet, die in dem in Fig. 1 als I bezeichneten Repeat-Abschnitt lokalisiert sind. Bei der unter der SEQ ID:NO 1 dargestellten Sequenz handelt es sich um ein Oligonukleotid, das gegen das „sense"- Transkript des „mouse major satellites" gerichtet ist (dies würde bei gewöhnlichen, für Prote- ine codierenden Genen der Sequenz der mRNA entsprechen). Das gleiche gilt für das unter der SEQ ID:NO 2 angegebene Oligonukleotid. Dieses ist jedoch gegen eine Sequenz des „mouse major satellite" gerichtet, die etwas weiter Zentromerwärts liegt und sich nur in fünf Nukleotiden mit dem unter der SEQ ID:NO 1 dargestellten Oligonukleotid überschneidet. Das unter der SEQ ID:NO 3 angegebene Oligonukleotid entspricht in seiner Zielregion der des unter der SEQ ID:NO 1 aufgeführten Oligonukleotids, ist jedoch im Gegensatz hierzu gegen das „antisense"-Transkript des „mouse major satellite" gerichtet.
Nach einem Hitzeschock wird in Mäusezellen fast ausschließlich das „sense" Transkript des „mouse major satellite" Bereiches hergestellt (wie in Fig. 4 dargestellt). Diese Erhöhung kann durch Transfektion mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID:NO 1 auf 10 % gehemmt werden, im Vergleich zu mit Kontrolloligonukleotid transfizierten Zellen. Mit dem Oligonukleotid gemäß SEQ ID:NO 3 transfizierten Zellen weisen einen Rückgang der Transkriptmenge um knapp 20% auf (wie in Fig. 5 dargestellt).The invention is based on the development and testing of highly effective inhibitor-active oligonucleotides against mouse major satellite transcripts (so-called "mouse major satellite" transcripts) .The oligonucleotides according to the invention are in some areas resistant to open secondary structures of the mouse. directed to mouse major satellite "transcripts, which are located in the Repeat section designated in Fig. 1 as I. The sequence represented by SEQ ID: NO 1 is an oligonucleotide which is directed against the "sense" transcript of the "mouse major satellite" (this would be the case in the case of common genes coding for proteins of the sequence of the mRNA correspond). The same applies to the oligonucleotide indicated under SEQ ID: NO 2. However, this is directed against a sequence of the "mouse major satellite" which lies somewhat further centromerically and intersects in only five nucleotides with the oligonucleotide shown under SEQ ID: NO 1. The oligonucleotide indicated under SEQ ID: NO 3 corresponds to US Pat its target region of the oligonucleotide listed under SEQ ID: NO 1, however, is in contrast directed against the "antisense" transcript of the "mouse major satellite". After a heat shock, almost exclusively the "sense" transcript of the "mouse major satellite" region is produced in mouse cells (as shown in FIG. 4). This increase can be inhibited by transfection with the oligonucleotide according to SEQ ID: NO 1 to 10%, compared to cells transfected with control oligonucleotide. Cells transfected with the oligonucleotide according to SEQ ID: NO 3 show a decrease in the amount of transcript by almost 20% (as shown in FIG. 5).
Wie aus Fig. 2 hervorgeht, weisen sowohl das gegen die Zielregion Tl des „sense"- Transkriptes als auch das gegen die Zielregion T2 gerichtete Oligonukleotid eine deutliche Dosis-abhängige Hemmung des „mouse major satellite"-Transkriptes auf. Dabei hat sich das gegen die Zielregion Tl gerichtete Oligonukleotid bei niedrigeren Konzentrationen als geringfügig effektiver erwiesen.As can be seen from FIG. 2, both the oligonucleotide directed against the target region T1 of the "sense" transcript and the target region T2 have a marked dose-dependent inhibition of the "mouse major satellite" transcript. In this case, the directed against the target region Tl oligonucleotide has been found at lower concentrations to be slightly effective.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide bestehen bevorzugt aus einzelsträngiger DNA. Diese einzelsträngigen DNA-Moleküle können entweder unmodifiziert oder bevorzugt chemisch modifiziert eingesetzt werden. Bezüglich der verwendeten „Chemie" der Oligonukleotide kommen zum Beispiel (i) jede Form von „Gapmer-Chemie", (ii) LNA, (iii) PNA, (iv) T- alkyl-Derivate, (v) 2'-fluoro-Derivate, etc. in Frage. Besonders bevorzugt handelt es sich da- bei jedoch um Phosphorothioat-modifizierte DNA. Durch die Phosphorothioat-Modifikation wird die Stabilität der Oligonukleotide erhöht und deren zelluläre Aufnahme erleichtert. Das Phosphatrückgrad der Oligonukleotide kann dabei nur an einer Stelle, bevorzugt jedoch an mehreren, besonders bevorzugt vollständig Phosphorothioat-modifiziert sein.The oligonucleotides according to the invention preferably consist of single-stranded DNA. These single-stranded DNA molecules can be used either unmodified or preferably chemically modified. With regard to the "chemistry" of the oligonucleotides used, for example, (i) any form of "gapmer chemistry", (ii) LNA, (iii) PNA, (iv) T-alkyl derivatives, (v) 2'-fluoro Derivatives, etc. in question. However, these are particularly preferably phosphorothioate-modified DNA. The phosphorothioate modification increases the stability of the oligonucleotides and facilitates their cellular uptake. The phosphate backbone of the oligonucleotides can only be phosphorothioate-modified at one point, but preferably at several, particularly preferably completely.
Neben ihrem bevorzugten Einsatz als effektive Inhibitoren von „mouse major satellite"- Transkripten können die erfindungsgemäßen Oligonukleotide darüber hinaus auch zu deren Detektion, z. B. über einen Northern-Blot, eingesetzt werden, bzw. zur Markierung von genomischen „mouse major satellite"-Sequenzen> z. B. über einen Southern-Blot, dienen.In addition to their preferred use as effective inhibitors of "mouse major satellite" transcripts, the oligonucleotides according to the invention can moreover also be used for their detection, for example via a Northern blot, or for the labeling of genomic mouse major satellite. Sequences > z. B. via a Southern Blot serve.
Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide stellen somit molekulare Werkzeuge dar, die einzeln oder als Teil von Kits vermarktet werden können.
- A -The oligonucleotides of the invention thus represent molecular tools that can be marketed individually or as part of kits. - A -
Die Erfindung wird anhand von Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen:The invention will be explained in more detail with reference to drawings. Showing:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Struktur von „mouse major satellites", der erfindungsgemäßen Oligonukleotide sowie der Zielsequenzen des „mouse major satellite"-Transkriptes gegen die diese gerichtet sind;Figure 1 is a schematic representation of the structure of "mouse major satellites", the oligonucleotides of the invention and the target sequences of the "mouse major satellite" transcript against which they are directed;
Fig. 2 die konzentrationsabhängige Hemmung von „mouse major satellite"-2 shows the concentration-dependent inhibition of "mouse major satellite"
Transkripten durch Transfektion von NIH3T3-Zellen mit gegen die Zielse- quenzen Tl bzw. T2 von „sense"-Transkripten gerichteten Oligonukleotiden;Transcripts by transfection of NIH3T3 cells with oligonucleotides directed against the target sequences T1 or T2 of "sense" transcripts;
Fig. 3 die zeitabhängige Hemmung von „mouse major satellite"-Transkripten durch gegen die Zielsequenz Tl in „sense"- und „antisense"-Transkripten gerichtete Oligonukleotide;3 shows the time-dependent inhibition of "mouse major satellite" transcripts by oligonucleotides directed against the target sequence T1 in "sense" and "antisense" transcripts;
Fig. 4 die Hitzeschock- vermittelte Induktion von „sense"-„mouse major satellite"- Transkripten; undFIG. 4 shows the heat shock-mediated induction of "sense" mouse major satellite transcripts; FIG. and
Fig. 5 die Blockierung der Hitzeschock-vermittelte Induktion von „sense"-„mouse major satellite"-Transkripten durch gegen diese bzw. durch gegen „antisense"-FIG. 5 shows the blocking of the heat-shock-mediated induction of "sense" - "mouse major satellite" transcripts by against or against "antisense" -
Transkripte gerichtete Oligonukleotide.Transcripts directed oligonucleotides.
Wie aus Fig. 1 zu ersehen ist, bestehen „mouse major satellites" aus einer Vielzahl sich wiederholender DNA-Sequenzen (Repeats) von jeweils 234 bp Länge. Diese sind chromosomal zwischen den codierenden Bereichen und dem Zentromer lokalisiert. Die einzelnen Repeats werden wiederum in 4 Bereiche unterteilt (in der Abbildung als römische Ziffern I bis IV dargestellt). In dem Repeat-Bereich I existieren zwei Sequenzabschnitte, die in den entsprechenden Transkripten offene RNA-Sekundärstrukturen ausbilden. Diese offenen Sequenzabschnitte sind in den entsprechenden „sense"- bzw. „antisense"-RNA-Sequenzen jeweils unterstri- chen dargestellt. Als Zielregionen wurden daher Transkriptsequenzen ausgewählt, die zumindest in Teilbereichen mit diesen offenen RNA-Sekundärstrukturen übereinstimmen und hier
als Tl und als T2 bezeichnet und in der Abbildung als dunkelgrauer bzw. hellgrauer Balken dargestellt sind. Die Oligonukleotide 3'-TACCGCTCTTTTGACTTTTA-S' (entspricht SEQ IDrNO 1) und 3'-TTTTAGTGCCTTTTACTCTT-S' (entspricht SEQ IDrNO 2) sind dabei komplementär zu ihren jeweiligen Zielregionen Tl bzw. T2 auf dem „sense"-Transkript, das Oligonukleotid 5'-ATGGCGAGAAAACTGAAAAT-S' (entspricht SEQ IDrNO 3) hingegen ist komplementär zu der Zielsequenz Tl auf dem „antisense" -Transkript.As can be seen from Fig. 1, "mouse major satellites" consist of a multiplicity of repeating DNA sequences (repeats) of 234 bp each, which are located chromosomally between the coding regions and the centromere 4 regions (represented in the figure as Roman numerals I to IV) .There are two sequence segments in the repeat region I, which form open RNA secondary structures in the corresponding transcripts. In each case, transcript sequences which correspond at least in part to these open RNA secondary structures and here are selected as target regions referred to as T1 and as T2 and shown in the figure as a dark gray or light gray bar. The oligonucleotides 3'-TACCGCTCTTTGGTTTTA-S '(corresponding to SEQ ID NO: 1) and 3'-TTTTAGTGCCTTTTACTCTT-S' (corresponding to SEQ ID NO: 2) are in this case complementary to their respective target regions T1 or T2 on the "sense" transcript, the oligonucleotide 5'-ATGGCGAGAAAACTGAAAAT-S '(corresponds to SEQ ID NO: 3), however, is complementary to the target sequence TI on the "antisense" transcript.
In Fig. 2 ist gezeigt, dass in NIH3T3-Zellen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von gegen die „sense"-Zielsequenzen Tl bzw. T2 gerichteten Oligonukleotiden (siehe SEQ IDrNO 1 bzw. SEQ IDrNO 2, hier nur als Tl bzw. T2 bezeichnet) transfiziert wurden, ein deutlicher konzentrationsabhängiger Rückgang der Menge an „mouse major satellite"- Transkript nachweisbar ist. So reduziert eine Oligonukleotidkonzentration von 200 nmol/1 die Menge an „mouse major satellite"-Transkript um 60 % (Tl) bzw. 50 % (T2), die Erhöhung der Konzentration auf 500 nmol/1 bewirkte für beide Oligonukleotide eine Transkript- Hemmung um 75 % (bezogen auf das Kontroll-Oligonukleotid 5'-FIG. 2 shows that in NIH3T3 cells which have different concentrations of oligonucleotides directed against the "sense" target sequences T1 or T2 (see SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, referred to here only as T1 or T2 ) were transfected, a significant concentration - dependent decrease in the amount of "mouse major satellite" transcript is detectable. Thus, an oligonucleotide concentration of 200 nmol / 1 reduced the amount of "mouse major satellite" transcript by 60% (T1) and 50% (T2), increasing the concentration to 500 nmol / 1 caused transcript inhibition for both oligonucleotides by 75% (based on the control oligonucleotide 5'-
ATCAGATGCGTGGCCTAGTG-3'). Die Transfektion der Zellen erfolgte wie in den Ausführungsbeispielen angegeben. Die Bestimmung der jeweiligen Transkriptmengen erfolgte 40 Stunden nach Transfektion über quantitative RT-PCR, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben.ATCAGATGCGTGGCCTAGTG-3 '). The transfection of the cells was carried out as indicated in the embodiments. The determination of the respective transcript levels was carried out 40 hours after transfection by quantitative RT-PCR, as described in the embodiments.
Fig. 3 beschreibt den zeitlichen Verlauf der Hemmung von „mouse major satellite"- Transkripten in NIH3T3 -Zellen, die mit gegen die Zielsequenz Tl gerichteten Oligonukleotiden (200 nmol/1) transfiziert worden sind. Dabei handelt es sich zum einen um das gegen das „sense"-Transkript gerichtete Oligonukleotid gemäß der SEQ IDrNO 1 (hier als Tl -antisense bezeichnet) und zum anderen um das gegen das „antisense"-Transkript gerichtete Oligonukleotid gemäß der SEQ IDrNO 3 (hier entsprechend als Tl-sense bezeichnet). Während die „mouse major satellite"-Transkriptmenge in mit dem Oligonukleotid Tl-sense transfizierten Zellen zunächst ansteigt und dann allmählich auf ca. 60 % der Transkriptmenge in den Kontrollzellen sinkt, ist für Zellen, die mit dem Oligonukleotid Tl -antisense transfiziert wurden, innerhalb von 24 Stunden eine starke Hemmung der „mouse major satellite"-Transkriptmenge um ca. 90 % zu verzeichnen. In der Folgezeit schwächt sich der inhibierende Effekt wieder
etwas ab: 72 Stunden nach Transfektion liegt die „mouse major satellite"-Transkriptmenge bei ca. 30 % (bezogen auf das Kontroll-Oligonukleotid 5'-ATCAGATGCGTGGCCTAGTG- 3'). Die Bestimmung der jeweiligen Transkriptmengen erfolgte über quantitative RT-PCR, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben.3 describes the time course of the inhibition of "mouse major satellite" transcripts in NIH3T3 cells which have been transfected with oligonucleotides (200 nmol / l) directed against the target sequence T1, on the one hand against the The "sense" transcript directed oligonucleotide according to SEQ IDNO 1 (here referred to as Tl-antisense) and on the other to the directed against the "antisense" transcript oligonucleotide according to SEQ IDNO 3 (here correspondingly referred to as Tl-sense) the mouse major satellite transcript level initially increases in cells transfected with the oligonucleotide Tl-sense and then gradually decreases to about 60% of the transcript level in the control cells is within cells transfected with the oligonucleotide Tl antisense within There was a strong inhibition of the "mouse major satellite" transcript level by about 90% in the 24-hour period, with the inhibiting effect weakening again in the ensuing period slightly above: 72 hours after transfection, the "mouse major satellite" transcript amount is about 30% (based on the control oligonucleotide 5'-ATCAGATGCGTGGCCTAGTG-3 ') The determination of the respective transcript amounts was carried out by quantitative RT-PCR, such as described in the embodiments.
Wie in Fig. 4 dargestellt ist, reagieren NIH3T3-Zellen auf einen Hitzeschock (siehe Ausfüh- rungsbeispiele) innerhalb kurzer Zeit mit einer verstärkten Expression der perizentromeren „mouse major satellite" Sequenzen. So konnte über quantitative RT-PCR z. B. innerhalb von 2 Stunden nach einem Hitzeschock ein Anstieg der entsprechenden Transkriptmenge auf mehr als das Fünffache nachgewiesen werden (Fig. 4a). Wie aus dem in Fig. 4b dargestellten Northern-Blot ersichtlich ist, ist dieser Anstieg fast ausschließlich strangspezifisch auf die verstärkte Bildung von „sense"-Transkripten zurückzuführen. Als Kontrolle dienten hierbei Zellen, die weiter bei 37 0C inkubiert und somit keinem Hitzeschock ausgesetzt worden sind.As shown in Figure 4, NIH3T3 cells respond to heat shock (see Examples) within a short time with increased expression of the pericentromeric mouse major satellite sequences, eg, by quantitative RT-PCR, for example, within As shown by the Northern blot shown in Fig. 4b, this increase is almost exclusively strand-specific to the enhanced formation of sense, 2 hours after heat shock Attributed to "transcripts. In this case, cells which continued to be incubated at 37 ° C. and thus not exposed to heat shock served as controls.
Zellen hingegen, die 24 Stunden vor dem Hitzeschock mit dem Oligonukleotid Tl -antisense (200 nmol/1) transfiziert worden sind, zeigten keinen Anstieg der „mouse major satellite"- Transkriptmenge, wie aus Fig. 5 ersichtlich ist. Der Einsatz von gegen das „antisense"- Transkript gerichteten Oligonukleotiden (Tl-sense) zeigte hierbei keinen signifikanten inhibitorischen Effekt, wie sowohl die quantitativen RT-PCR-Daten in Fig. 5 a, als auch die strang- spezifische Northern-Blot- Analyse in Fig. 5b zeigen.On the other hand, cells transfected 24 hours before the heat shock with the oligonucleotide Tl antisense (200 nmol / l) showed no increase in the "mouse major satellite" transcript amount, as can be seen from Fig. 5. The use of against "Antisense" transcript-directed oligonucleotides (Tl-sense) showed no significant inhibitory effect, as shown both by the quantitative RT-PCR data in FIG. 5 a and by the strand-specific Northern blot analysis in FIG. 5 b ,
AUSFÜHRUNGSBEISPIELEmbodiment
1) Herstellung der Oligonukleotide:1) Preparation of oligonucleotides:
Die verwendeten Oligonukleotide wurden bezogen von der Firma biomers.net GmbH Sedanstr. 14; D-89077 Ulm; Deutschland.The oligonucleotides used were obtained from the company biomers.net GmbH Sedanstr. 14; D-89077 Ulm; Germany.
2) Transfektion von Zellen mit Oligos:
Die Maus-Zelllinie NIH3T3 (DSMZ no.: ACC 59) wurde in DMEM+ GlutaMAX™-I (GIBCO Invtrogen Cell Culture, Invitrogen LTD; 3 Fountain Drive; Inchinnan Buis- mess Park Paisley PA4 9RF; UK) + 10 % FKS (PAA Laboratories GmbH; Haid- mannweg 9; A-4061 Pasching; Austria) bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Der Hitze- schock wurde für eine Stunde bei 42 0C und 5 % CO2 induziert. Die Transfektion erfolgte mittels Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen LTD; 3 Fountain Drive; Inchinnan Buismess Park Paisley PA4 9RF; UK) und den angegebenen Konzentrationen an OH- gonukleotiden nach dem Protokoll des Herstellers.2) Transfection of cells with oligos: The mouse cell line NIH3T3 (DSMZ no .: ACC 59) was digested in DMEM + GlutaMAX ™ -I (GIBCO Invtrogen Cell Culture, Invitrogen LTD; 3 Fountain Drive; Inchinnan Buismess Park Paisley PA4 9RF; UK) + 10% FCS ( PAA Laboratories GmbH; Haidmannweg 9, A-4061 Pasching, Austria) at 37 ° C. and 5% CO 2 . The heat shock was induced for one hour at 42 ° C. and 5% CO 2 . Transfection was by Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen LTD, 3 Fountain Drive, Inchinnan Buismess Park Paisley PA4 9RF, UK) and the indicated concentrations of OH gonucleotides according to the manufacturer's protocol.
3) RT-qPCR:3) RT-qPCR:
Die Isolierung von RNA erfolgte mittles RNeasy® mini Kit (Quiagen, QIAGEN GmbH; QIAGEN Strasse 1; 40724 Hilden; Deutschland) und angeschlossener DNase Verdauung (TURBO DNase™ Ambion, An Applied Biosystems Business; 2130 Woodward St.; Austin, TX 78744-1832; USA). Isolierte RNA wurde unter Verwen-Isolation of RNA was performed using the RNeasy® mini Kit (Qiagen, QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, 40724 Hilden, Germany) and attached DNase digestion (TURBO DNase ™ Ambion, An Applied Biosystems Business, 2130 Woodward St., Austin, TX 78744- 1832, USA). Isolated RNA was purified using
TM dung von SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen LTD; 3 Fountain Drive; Inchinnan Buismess Park Paisley PA4 9RF; UK) in cDNA umgeschrieben und mittels quantitativer-PCR (qPCR Core kit for S YBR® Green I, Eurogentec, Eurogentec Deutschland GmbH; Cäcilienstrasse 46; 50667 Köln; Deutschland) analysiert. Die Se- quenzen der verwendeten Primer für „mouse major satellite" waren: forward: 5'-Translation of SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen LTD; 3 Fountain Drive; Inchinnan Buismess Park Paisley PA4 9RF; UK) into cDNA and using quantitative PCR (qPCR Core kit for S YBR® Green I, Eurogentec, Eurogentec Deutschland GmbH; Cäcilienstr 46; 50667 Cologne, Germany). The sequences of the primers used for "mouse major satellite" were: forward: 5'-
GACGACTTGAAAAATGACGAAATC-3'; reverse: 5'-GACGACTTGAAAAATGACGAAATC-3 '; reverse: 5'-
CATATTCCAGGTCCTTCAGTGTGC-3' [I]. Das Primerpaar für ß-Aktin war: forward: 5'-ATGGAATCCTGTGGCATCCAT-S'; reverse: 5'- TTCTGC ATCCTGTCAGC AATG-3 'CATATTCCAGGTCCTTCAGTGTGC-3 '[I]. The primer pair for β-actin was: forward: 5'-ATGGAATCCTGTGGCATCCAT-S '; reverse: 5'-TTCTGC ATCCTGTCAGC AATG-3 '
4) Northern-Blot:4) Northern blot:
Die gelelektrophoretisch getrennte und auf eine Nylon-Membran übertragene RNA wurde mit radioaktiv markierten Primern spezifisch für „mouse major satellite" Tran-
Transkripte [1] und 7SK RNA [2] nach Standardprotokoll von Sambrook & Rüssel [3] hybridisiert.
The gel electrophoretically separated RNA transferred to a nylon membrane was labeled with radioactively labeled primers specific for mouse major satellite transplantation. Transcripts [1] and 7SK RNA [2] hybridized according to standard protocol of Sambrook & Russel [3].
Literatur:Literature:
[ 1] : Lehnertz et al., Current Biology 13, 1192-2000, 2003 [2] : Robb et al., Nature Structural & Molecular Biology 12(2), 1 -5, 2005 Sambrook & Rüssel, Molecular cloning, a laboratory manual. 3. Auflage (1), CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, 2001
[1]: Lehnertz et al., Current Biology 13, 1192-2000, 2003 [2]: Robb et al., Nature Structural & Molecular Biology 12 (2), 1-5, 2005 Sambrook & Russel, Molecular cloning, a laboratory manual. 3rd Edition (1), CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York, 2001
Claims
1. Verwendung eines Oligonukleotids mit der unter SEQ ID:NO 1 , SEQ ID:NO 2 oder1. Use of an oligonucleotide with the SEQ ID: NO 1, SEQ ID: NO 2 or
SEQ DD:NO 3 dargestellten Sequenz zur Reduktion der „mouse major satellite"- Transkriptmenge .SEQ DD: NO 3 sequence for the reduction of the "mouse major satellite" transcript amount.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Oligonukleotid Phosphorothioat-modifiziert ist. 2. Use according to claim 1, characterized in that the oligonucleotide is phosphorothioate-modified.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102007040718.3 | 2007-08-29 | ||
| DE200710040718 DE102007040718B3 (en) | 2007-08-29 | 2007-08-29 | Use of oligonucleotides with defined sequences to reduce mouse major satellite transcription |
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Non-Patent Citations (3)
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| GUENATRI MOUNIA ET AL: "Mouse centric and pericentric satellite repeats form distinct functional heterochromatin", JOURNAL OF CELL BIOLOGY, vol. 166, no. 4, 16 August 2004 (2004-08-16), pages 493 - 505, XP002509875, ISSN: 0021-9525 * |
| LEHNERTZ B ET AL: "Suv39h-Mediated Histone H3 Lysine 9 Methylation Directs DNA Methylation to Major Satellite Repeats at Pericentric Heterochromatin", CURRENT BIOLOGY, CURRENT SCIENCE, GB, vol. 13, no. 14, 15 July 2003 (2003-07-15), pages 1192 - 1200, XP004535132, ISSN: 0960-9822 * |
| PLOHL ET AL: "Satellite DNAs between selfishness and functionality: Structure, genomics and evolution of tandem repeats in centromeric (hetero)chromatin", GENE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 409, no. 1-2, 4 December 2007 (2007-12-04), pages 72 - 82, XP022422497, ISSN: 0378-1119 * |
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