WO2009017255A1 - 変異導入MyD88蛋白によるToll様受容体／インターロイキン18シグナルの特異的制御法 - Google Patents

変異導入MyD88蛋白によるToll様受容体／インターロイキン18シグナルの特異的制御法 Download PDF

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Definitions

  • Mutagenesis MyD88 protein specifically controls Toll-like receptor / interleukin 18 signal
  • the present invention provides a Toll / Interleukin-1 receptor (TIR) domain variant of MyD88 that enables specific control of Toll-like receptor Z interleukin 18 signal and use thereof About. .
  • TIR Toll / Interleukin-1 receptor
  • Interleukin l is a major pro-inflammatory site force-in that rapidly activates the innate immune response and is a potent inducer of the acquired immune system 1 (Non-patent Document 1) ).
  • Interleukin 18 was first found as one of the IL-1 homologues and was identified as an interferon- y (IFN-Y) inducer 2 (Non-patent Document 2).
  • IFN-Y interferon- y
  • IL-18 plays an important role in innate and acquired immune responses.
  • IL-18 and -1 ⁇ have moderate sequence homology (17% amino acids are identical) .
  • the present inventors have similar structure of IL-18 to that of IL-1, 3 (Non-Patent Document 3).
  • the ligand-receptor complex structure of IL-1 and 1L-18 is expected to be similar. These signal transductions are initiated by the formation of a high-affinity complex consisting of a cytoforce-in ligand and its receptor power. When these ligands bind to the receptor complex on the cell surface, the cytoplasmic end of the receptor molecule is linked to Toll, an interleukin 1 receptor homology (TIR) domain, and myeloid differentiation 88 (Myeloid Differentiation 88). 88: MyD88) 4 (Non-patent document 4). Signaling through MyD88 generally results in activation of NF- ⁇ and ⁇ -1 transcription factors.
  • TIR interleukin 1 receptor homology
  • Myeloid differentiation 88 Myeloid Differentiation 88
  • MyD88 MyD88
  • TIR domains are found in the IL-1 receptor, IL-18 receptor, Toll and Toll-like receptor (TLR) and several intracellular proteins exemplified by MyD88.
  • the Drosophila Toll family and the mammalian TLR family are known as recognition receptors on the cell membrane for a diverse group of microbial ligands, including bacteria, fungi and viruses. Recently, one member of the TLR family is an important sensor for microbial infection. Was proved. The power to discover at least 13 TLRs to date Each of them is specialized to respond to different types of ligands (eg, double-stranded RNA, LPS, peptide darlicans, etc.) from foreign bodies 5 (Non-patent Document 5). For example, TLR2 recognizes gram positive bacterial peptidoglycan and TLR4 recognizes gram negative bacterial lipopolysaccharide (LPS).
  • LPS gram negative bacterial lipopolysaccharide
  • Non-patent Document 7 Five intracellular protein molecules containing the TIR domain have been identified: MyD88, TI RAP (Mai), TRIF (TICAM-1), TRAM (TICAM-II), and S-ARM 6 (Non-patent document 6). These intracellular “adapter-one” proteins are recruited to the cellular domain of TLR and have been shown to mediate signaling pathways within the cell. Regarding the diversity of adapter proteins, it is believed that different combinations of adapter molecules recruited to separate TLRs determine the downstream signaling cascade 7 (Non-patent Document 7).
  • MyD88 was first identified as one of 12 different mRNA transcripts induced in Ml myeloblastic leukemia cells after activation with pulmonary conditioned medium or recombinant IL-6 8 (Non-Patent Document 8). The human homologue of MyD88 was isolated and cloned in 1997 9 (Non-patent document 9). Amino acid sequence analysis revealed that MyD88 has a modular structure consisting of an N-terminal death domain (approximately 90 amino acid residues) separated from the C-terminal TIR domain (approximately 150 amino acid residues) by a short linker. Predicted.
  • Each of IL-1R / IL-18R / TLR has a single TIR domain known to bind to the TIR domain of MyD88 at their cytoplasmic tail. This is where TIR-TIR heterodimerization occurs. MyD88 also binds to IRAK, a downstream factor containing the death domain, through death domain-death domain heterodimerization 10 (Non-Patent Document 10). Two crystal structures of the TIR domain (TLR2 and IL-1RAPL) have been determined as homodimeric structures 11,12 (Non-Patent Documents 11 and 12). These probably indicate the oligomeric nature of the TIR domain.
  • Non-patent text fel Sims, J. E. IL-1 ana iL-18 receptors, and their extended family.
  • Non-Patent Document 2 Okamura, H. et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamm a production by T cells. Nature 378, 88-91 (1995).
  • Non-Patent Document 3 Kato, Z. et al. The structure and binding mode of interleukin- 18. Nat Struct Biol 10, 966-71 (2003).
  • Non-Patent Document 4 O'Neill, LA & Greene, C. Signal transduction pathways activated by the IL-1 receptor family: ancient signaling machinery in mammals, insects, and pla nts.J Leukoc Biol 63, 650-7 (1998) .
  • Non-Patent Document B ⁇ 5 Underhill, D.. & Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology 14, 103—110 (2002)
  • Non-Patent Document 6 McGettrick, A. F. & O'Neill, A. The expanding family of MyD88- li ke adaptors in Toll-like receptor signal transduction. Mol Immunol 41, 577-82 (200
  • Non-Patent Document 7 Kaisho, T. & Akira, S. Toll-like receptor function and signaling. J Allegy Clin Immunol 117, 979-87; quiz 988 (2006)
  • Non-Patent Document 8 Lord, K. ⁇ ⁇ , Hoffrnan-Liebermann, ⁇ . & Liebemann, DA Nucleotid e sequence and expression of a cDNA encoding MyD88, a novel myeloid differentiati on primary response gene induced by I 6. Oncogene 5, 1095-7 (1990)
  • Non-Patent Document 9 Bonnert, T.P. et al. The cloning and characterization of human yD
  • Non-Patent Document 10 Wesche, ⁇ ., Henzel, W. J "Shillinglaw, W” Li, S. & Cao , Z. MyD88
  • Non-Patent Document 11 Tao, X., Xu, Y., Zheng, ⁇ ., Beg, AA & Tong, An extensively a ssociated dimer in the structure of the C713 mutant of the TIR domain of human T LR2. Biochem Biophys Res Commun 299, 216-21 (2002).
  • Non-Patent Document 12 Khan, JA, Brint, EK, O'Neill, A. & Tong, L. Crystal structure of the Toll / interleukin-1 receptor domain or human IL-1RAPL. J Biol Chem 279, 31664- 70 (2004)
  • Non-Patent Document 13 Dunne, A., Ejdeback, M., Ludidi, P., O'Neill, A. & Gay, NJ Structural complementarity of Toll / interleukin-l receptor domains in oil-like recep tors and the adaptors Mai and MyD88. J Biol Chem 278, 41443-51 (2003).
  • Non-Special Reference 14 Li, C "Zienkiewicz, J. & Hawiger, J. Interactive sites in the MyD88 Toll / interleukin (IL) 1 receptor domain responsible for coupling to the ILlbeta signa ling pathway. J Biol Chem 280, 26152-9 (2005).
  • Non-patent document; i5 Jiang, Z. et al. Details of Toll-like receptor: adapter interaction reve aled by germ-line mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA 103, 10961-6 (2006).
  • Non-patent document 16 Biol Chem. 1996 Nov 29; 271 (48): 30517-23.
  • Non-Patent Document 17 J. Biochem (Tokyo). 2005 Oct; 138 (4): 433-42
  • Non-Patent Document 18 Biochem. Pharmacol. 2006 Jun 28; 72 (1): 62-9
  • Non-Patent Document 19 J. Biol. Chem. 2005 Apr 22; 280 (16): 15809-14
  • the present invention relates to a technique for signal-specifically controlling the function of the intracellular factor adapter molecule MyD88 used for signal transduction common to the TLR family such as LPS and the IL-1 receptor family.
  • the purpose is to provide.
  • This structure provides the necessary basis for further study of the biological function of TIR-containing adapter proteins in IL-1R / IL-18R / TLR signaling.
  • the present inventors conducted a series of functional analysis of MyD88 TIR using cultured cells. These analyzes made it possible to determine several amino acid residues that are critical for MyD88 to function in the IL-18 and TLR4 signaling pathways. Interestingly, three common interaction sites in MyD88 TIR were identified, and one additional site functioned only for IL-18 signaling.
  • MyD88 is a two-domain protein consisting of a death domain and a Toll Interleukin-1 Receptor homology (TIR) domain.
  • TIR Toll Interleukin-1 Receptor homology
  • S and death domains are deleted and only the TIR domain (148-296) is expressed in cells, IL It is known to act as a signal non-specific dominant inhibitor of the IL-1 family including T-18 and TLR.
  • Mutants MyD88 TIR K214A, MyD88 TI R K238A and MyD88 TIR R269A in which MyD88 TIR domain lysine 214, lysine 238, and algin 269 were replaced with alanine were prepared and their functions were expressed on NF- ⁇ .
  • Luciferase reporter gene assay revealed that the signal from LPS via TLR4 could be blocked, but the signal from IL-18 could not be blocked.
  • the present invention has been completed based on these findings. After the priority date of this application (August 1, 2007), it was registered in the PROTEIN DATA BANK of human MyD88TIR analyzed by Rossi et al. (Registration date: June 29, 2007, release date: 2007) On October 23, 2013, registration number: 2js7), the release was after the priority date of this application.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • the MyD88 TIR mutant protein or a salt thereof according to (1) or (2) which is a mutant of a wild-type MyD88 TIR protein derived from a non-human animal.
  • the MyD88 TIR mutant protein or a salt thereof according to (1) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or 6.
  • a transformant comprising the recombinant vector according to (7).
  • a method for producing a MyD88 TIR mutant protein comprising culturing a host transformed with the DNA according to (6) and collecting the culture ability MyD88 TIR mutant protein.
  • a pharmaceutical composition comprising, as an active ingredient, the MyD88 TIR mutant protein or a salt thereof according to (1) or a DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein according to (1).
  • a method for screening a drug that specifically modifies the action of interleukin-18 which has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, MyD88 TIR 214th lysine, 238th lysine and 269th arginine
  • the method comprising examining the presence or absence of binding between at least one amino acid selected from the group and a candidate substance of the drug.
  • the present invention provides information on the site of functional mutation introduction of an intracellular signaling protein.
  • IL-18 is an important molecule in cell-mediated immune functions, such as inducing IFN- ⁇ production. Its signal transduction pathway is a receptor that recognizes LPS as shown in Fig. 8. Common with some TLR4 etc.
  • LPS is a substance derived from the cell membrane of Gram-negative bacteria, but is a substance that exhibits toxicity, such as inducing endotoxin shock in vivo.
  • the MyD88 TIR K214A, K238A, and R269A mutants prepared by the present inventors do not inhibit IL-18 signal transduction, but inhibit LPS TLR4 signaling. Therefore, this mutant molecule can be expected to suppress pathological conditions such as direct endotoxin shock caused by LPS while maintaining the cellular immune function of IL-18.
  • small molecules and peptides that target K214A, K238, and R269 of this MyD88 TIR domain may have specific effects on IL-18.
  • FIG. 1 Amino acid sequence alignment between TIR domain proteins of human MyD88, IL-IRs, and TLRs.
  • FIG. 2A Solution structure of TIR domain of human MyD88. 2A) A three-dimensional diagram that superimposes the most converged main chains of the 20 calculated final structures. Superimpose the main chain atoms of residues 157-185, 188-194 and 203-295.
  • FIG. 2B Solution structure of the TIR domain of human MyD88. 2B) Representative ribbon diagram of NMR structure of MyD88, drawn using Molmol. Secondary structure representations (/ 3 A- / 3 E, ⁇ ⁇ - a C and a E) follow T LR TIR.
  • FIG. 2D Solution structure of TIR domain of human MyD88. 2C) and 2D) MyD88 TIR and crystal structure (1FYW) of TLR2 TIR domain superimposed.
  • the BB loop is close up.
  • FIG. 3 Surface electrostatic potential of TIR domain. A representation of the electrostatic potential of the four TIR domains. Red indicates a negatively charged region and blue indicates a positively charged region. Arrows indicate BB-loops for each TIR domain. Each figure on the left side of the TIR domain has the same orientation as Figure 2A.
  • FIG. 4A Report of the report of the MyD88 TIR domain wild type opi mutant group.
  • 4A I L-18R J3 with simultaneous transflector Ekushi HEK293FT cells Yung the IL-18 when stimulated with (100 ng / mL) NF- ⁇ B reporter gene Atsusi.
  • each bar graph shows the relative luciferase luminescence unit of stimulated cells per stimulated cell.
  • Significant differences between the wild type and each mutant group were analyzed by Dunnett's multiple comparison test. Color code on the graph: black bar graph with black NF- ⁇ B activity compared to wild type group is statistically significant; white bar graph indicates that mutagenesis did not show any significant effect.
  • FIG. 4B MyD88 TIR domain wild type and mutant reporter assembly results.
  • 4B NF- ⁇ B reporter gene assembly when 293-hTLR4A-HA cells co-transfected with the auxiliary molecule MD2 were stimulated with LPS (1.0 ⁇ g / mL).
  • LPS 1.0 ⁇ g / mL
  • each bar graph shows the relative luciferase luminescence units of stimulated cells per stimulated cell.
  • Significant differences between the wild type and each mutant group were analyzed by Dunnett's multiple comparison test.
  • Color code Black bar graph with black NF- ⁇ B activity compared to wild type group is statistically significant; white bar graph indicates that mutagenesis did not show any significant effect.
  • FIG. 5A Structural mapping of the MyD88 TIR domain. Only polar amino acids used for functional analysis by IL-18 stimulation are reflected. The orange amino acid residue is luciferase g
  • FIG. 5B Structural mapping of the MyD88 TIR domain. Only polar amino acids used for functional analysis by LPS stimulation are reflected. The red amino acid residue was determined to be important as a result of Lucifera zeatsusei. The brown amino acid residue indicates that the dominant negative action has not been inactivated. In particular, the three residues K214A, K238A, and R269A are particularly important in the IL-18 stimulation system compared to LPS stimulation.
  • FIG. 7 Detection of interaction between TIRAP with FLAG tag and My D88 protein with myc tag transiently expressed in cells by immunoprecipitation experiments.
  • MyD88 showed interaction with TIRAP, and MyD88 TIR K214A, K238A, and R269A mutants were also able to interact with TIRAP.
  • FIG. 8 shows intracellular signaling pathways involving IL-18 and LPS, respectively.
  • the present invention provides the following MyD88 TIR mutant protein or salt thereof (a), (b) or (c):
  • (b) It consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids other than amino acid 238 and amino acid 269 are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein of (a), and lipopolysaccharide Stimulation signal is inhibited, but interleukin 18 stimulation Null does not inhibit, protein
  • the protein of (a) is at least one amino acid selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the 214th lysine, the 238th lysine and the 269th arginine force.
  • Is another amino acid e.g. Examples thereof include those substituted with an acid or the like.
  • the 214th lysine, the 238th lysine and the 269th arginine may be substituted with other amino acids that do not destroy the three-dimensional structure of MyD88 TIR. For example, substitution with serine, glycine, glutamine, asparagine or threonine in addition to alanine is preferable.
  • the protein (b) has one or several (preferably 2 or more and 20 or less) amino acids other than the 214th amino acid, the 238th amino acid and the 269th amino acid in the amino acid sequence of the protein (a) (More preferably, 2 to 10 amino acids) have an amino acid sequence that is deleted, substituted or added, and the ability to inhibit lipopolysaccharide-stimulated signoleles, and the signal to interleukin-18-stimulated It is protein.
  • “inhibiting a lipopolysaccharide-stimulated signal” means activation of a transcription factor by lipopolysaccharide stimulation and production of cytoforce-in as a result, etc. in mammalian cells. It means suppression of the cellular response.
  • Whether or not to inhibit the lipopolysaccharide stimulation signal is introduced by transformation into a mammalian cell with a receptor that recognizes lipopolysaccharide by introducing a reporter gene vector incorporating a sequence of the binding recognition site of a transcription factor. Thereafter, lipopolysaccharide stimulation is added, and the expression level of the reporter gene can be compared and examined.
  • a mammalian cell with a receptor that recognizes lipopolysaccharide introduces a reporter gene vector that incorporates a sequence that encodes the protein of interest and the sequence of the binding recognition site of a transcription factor by transformation. Then, stimulate the lipopolysaccharide, measure the expression level of the reporter gene, and do not incorporate the sequence encoding the protein of interest. If the expression level is reduced as compared with the expression level of the reporter gene in, it can be determined that the lipopolysaccharide stimulation signal is inhibited.
  • inhibiting interleukin 18-stimulated signal means activation of transcription factor by interleukin 18 and resultant production of cytodynamic force in mammal cells (especially interferon ;). It means suppression of cellular responses such as.
  • the ability to inhibit interleukin 18 stimulation signals is determined by transformation by introducing a reporter gene vector incorporating a transcription factor binding recognition site sequence into a mammalian cell with a receptor that recognizes interleukin 18. Then, it can be examined by adding lipopolysaccharide stimulation and comparing the expression level of the reporter gene.
  • a mammalian cell having a receptor that recognizes interleukin 18 was introduced by transformation with a reporter gene vector incorporating a sequence encoding the protein of interest and a binding recognition site sequence of a transcription factor, and then transformed. Apply lipopolysaccharide stimulation, measure the expression level of the reporter gene, incorporate the sequence encoding the target protein, and compare with the expression level of the reporter gene in transformed cells. If the amount is decreased, it can be determined that the interleukin-18 stimulation signal is inhibited.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, 5, or 7 is the nucleotide of SEQ ID NO: 3, 5, or 7.
  • the DNA should have at least 80% identity (preferably at least 95%, more preferably at least 98%) with all or part of the DNA complementary to the DNA having sequence power. No, the hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of a nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA). This melting temperature is used to define stringent conditions.
  • the final wash temperature of the hybridization reaction must be lowered. For example, if a sequence with 95% or more identity to the probe is desired, the final wash temperature should be 5 ° C lower. In fact, 1% mismatch is observed, and 13 ⁇ 4 changes between 0.5 and 1.5.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature. Examples of moderately stringent conditions include 3x Wash at 42 ° C in SSC. The salt concentration and temperature can be varied to achieve an optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid.
  • the MyD88 TIR mutant protein of the present invention includes a protein consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 8 (MyD88 TIR K214A), a protein consisting of the amino acid of SEQ ID NO: 4 (MyD88 TIR K 238 ⁇ ), and the amino acid of SEQ ID NO: 6.
  • the MyD88 TIR mutant protein of the present invention is preferably a human-derived wild-type MyD88 TIR protein mutant or a wild-type MyD88 TIR protein-derived mutation derived from a non-human animal. Even the body.
  • the salt of the MyD88 TIR mutant protein of the present invention is preferably a pharmacologically acceptable salt, and particularly preferably a pharmacologically acceptable acid addition salt.
  • Pharmacologically acceptable acid addition salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, Examples thereof include salts with maleic acid, succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, and benzenesulfonic acid.
  • the MyD88 TIR mutant protein and its salt of the present invention can specifically block the action of LPS without blocking the action of IL-18. Therefore, the MyD88 TIR variant protein and salts thereof of the present invention are toll-like receptors and diseases involved in IL-1 / 18 signaling, specifically LPS-induced diseases (eg, endotoxin shock, SIRS ( It can be used for the prevention and / or treatment of systemic inflammatory response syndrome, etc. It can also be used as a reagent for the purpose of studying Toll-like receptors and IL- 1/18 signaling.
  • LPS-induced diseases eg, endotoxin shock, SIRS ( It can be used for the prevention and / or treatment of systemic inflammatory response syndrome, etc. It can also be used as a reagent for the purpose of studying Toll-like receptors and IL- 1/18 signaling.
  • the MyD88 TIR mutant protein and salts thereof of the present invention can be produced by known methods. For example, as described in 2 below, DNA encoding MyD88 TIR mutant protein is obtained, and the obtained DNA is incorporated into an appropriate expression vector, The yD88 TIR mutant protein can be produced by introducing it into a host and producing it as a recombinant protein (for example, ISHI, Yoko Sano, CURRENT PROTO COLS compact version, molecular biology experiment protocol) Le, I, II, III, Maruzen Co., Ltd .: See original work, Ausubel, FM, etc., Short Protocols in Molecular Biology, Third Definition, John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • a recombinant protein for example, ISHI, Yoko Sano, CURRENT PROTO COLS compact version, molecular biology experiment protocol
  • the MyD88 TIR mutant protein of the present invention and a salt thereof can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • a functional protein eg, MyD88, TIRAP (Mal), TRIF (TICAM-1), TRA (TICAM-I1), SARM, etc.
  • a functional protein eg, MyD88, TIRAP (Mal), TRIF (TICAM-1), TRA (TICAM-I1), SARM, etc.
  • a functional protein eg, MyD88, TIRAP (Mal), TRIF (TICAM-1), TRA (TICAM-I1), SARM, etc.
  • the isolated DNA encoding the MyD88 TIR variant of the present invention may be any DNA containing a nucleotide sequence encoding the MyD88 TIR variant of the present invention.
  • the DNA encoding the MyD88 TIR variant of the present invention includes a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (the 214th lysine is the same as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2).
  • a DNA encoding a MyD88 TIR variant having an alanine-substituted amino acid sequence eg, a DNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7
  • amino acid sequence IJ of SEQ ID No. 6 amino acid sequence in which the 269th arginine is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID No. 2
  • DNA complementary to the DNA encoding DNA e.g., the nucleotide of SEQ ID NO: 5
  • Interleukin 18 stimulation signals are Examples thereof include DNA encoding a protein that does not inhibit.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA complementary to the DNA encoding the MyD88 TIR variant having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6 or 8 is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, 6 or 8 At least 80% (preferably, all or part of the DNA complementary to DNA encoding a MyD88 TIR variant having a nucleotide sequence (e.g., DNA consisting of nucleotide sequence IJ of SEQ ID NO: 3, 5, or 7) At least 95%, more preferably at least 98%).
  • the hybridization is performed under stringent conditions.
  • the stability of a nucleic acid duplex or hybrid is expressed by the melting temperature Tm (the temperature at which the probe dissociates from the target DNA).
  • This melting temperature is used to define stringent conditions. Assuming a Tm force Sl ° C drop due to a 1% mismatch, the final wash temperature of the hybridization reaction must be lowered. For example, if a sequence with 95% or more identity to the probe is desired, the final wash temperature must be reduced by 5 ° C. In fact, the Tm changes between 0.5 and 1.5 ° C with 1% mismatch.
  • An example of stringent conditions is to hybridize in 5x SSC / 5x Denhardt solution / 1.0% SDS at 68 ° C and wash in 0.2x SSC / 0.1% SDS at room temperature.
  • An example of moderately stringent conditions is a 3x SSC wash at 42 ° C.
  • the salt concentration and temperature can be varied to achieve the optimal level of identity between the probe and the target nucleic acid. Further information on these conditions, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY; and Ausubel et al. (Eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. NY)
  • the isolated DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein of the present invention can be produced, for example, as follows.
  • Healthy human blood lymphocytes also extract mRNA and synthesize cDNA using reverse transcriptase and oligo dT primers.
  • the coding region (447 base) of the TIR domain (148-296) of human MyD88 is amplified by PCR.
  • the resulting PCR product is the wild type MyD88 TIR protein.
  • It DNA. Examples of the amino acid sequence and nucleotide sequence of DNA encoding the wild-type MyD88 TIR protein are shown in SEQ ID NOs: 2 and 1, respectively.
  • DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein can be prepared by mutating the coding region (447 base) of MyD88 TIR by point mutagenesis.
  • the mutated MyD88 TIR coding region (447 bases) is amplified by PCR.
  • the obtained PCR product is DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein.
  • at least one amino acid selected from the group consisting of 214th lysine, 238th lysine and 269th arginine is substituted with another amino acid.
  • MyD88 TIR Examples of the nucleotide sequence of the DNA encoding the mutant protein are shown in SEQ ID NOs: 7, 3 and 5.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 encodes the MyD88 TIR variant protein that has the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, and the 214th lysine is replaced with alanine. To do.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 encodes the MyD88 TIR mutant protein having the amino acid sequence of 238 by replacing the 238th lysine with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 encodes the MyD88 TIR mutant protein consisting of the amino acid sequence IJ in which the 269th arginine is substituted with alanine in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • a recombinant vector containing DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein of the present invention can be obtained by a known method (for example, described in Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Method), the DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein of the present invention is inserted into an appropriate expression vector.
  • Expression vectors include plasmids derived from E.
  • coli eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, pUBllO, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids eg, PSH19, pSH15
  • Pacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses, animal viruses such as vaccinia virus, and insect pathogenic viruses such as baculovirus Can be used.
  • a promoter an enhancer, a splicing signal, a poly A addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin, and the like may be added.
  • the expression vector may be a fusion protein expression vector.
  • Various fusion protein expression vectors are commercially available, including pGEX series (Amersham Pharmacia Biotech), ET CBD Fusion System 34b-38b (Novagen), pET Dsb Fusion Systems 39b and 40b (Novagen) And pET GST Fusion System 41 and 42 (Novagen).
  • a recombinant vector is used as a gene vaccine (plasmid vaccine 'virus vector vaccine)
  • a plasmid vector or a quinoresvector (RetroNectinTM, Adenovirus Expression Vector Kit already developed for gene vaccines) Etc .: ViroMe dica Pacific Limited) is recommended to introduce a target gene into a vaccine.
  • a transformant can be obtained by introducing a recombinant vector containing DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein of the present invention into a host.
  • Hosts include bacterial cells (eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus), fungal cells (eg, yeast, Aspergillus, etc.), insect cells (eg, S2 cells, S cysts, etc.), animal cells Examples thereof include plant cells (eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells).
  • bacterial cells eg, Escherichia, Bacillus, Bacillus
  • fungal cells eg, yeast, Aspergillus, etc.
  • insect cells eg, S2 cells, S cysts, etc.
  • animal cells examples thereof include plant cells (eg, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, 3T3 cells, BHK cells, HEK293 cells).
  • the transformant can be cultured in a medium, and the MyD88 TIR mutant protein can be collected from the culture.
  • the medium can be collected, and the medium power can be separated and purified from MyD88 TIR mutant protein. If MyD88 TIR mutant protein is produced in transformed cells, Once dissolved, the lysate MyD88 TIR mutant protein may be separated and purified.
  • the MyD88 TIR mutant protein is expressed in the form of a fusion protein with another protein (functioning as a tag), the fusion protein is isolated and purified, and then treated with FactrXa or an enzyme (enterokinase) As a result, another protein can be cleaved to obtain the desired MyD88 TIR mutant protein.
  • Separation and purification of the yD88 TIR mutant protein can be performed by a known method.
  • Known separation and purification methods include differences in solubility, such as salting-out solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS_polyacrylamide gel electrophoresis. Differences in hydrophobicity such as methods using differences, methods using differences in charge such as ion exchange chromatography, methods using specific affinity such as affinity chromatography, and reversed-phase high-performance liquid chromatography Methods to be used, isoelectric points, etc. Methods that utilize differences in isoelectric points such as electrophoresis are used.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, MyD88 TIR mutant protein or a salt thereof or DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used for diseases associated with Toll-like receptors and IL-1 / 18 signaling, specifically, LPS-induced diseases (eg, endotoxin shock, SIRS (systemic inflammatory response syndrome)).
  • LPS-induced diseases eg, endotoxin shock, SIRS (systemic inflammatory response syndrome)
  • the MyD88 TIR mutant protein of the present invention does not inhibit IL-18 signaling, but can inhibit TLR4 signaling by LPS.
  • the pharmaceutical composition of the invention is effective in suppressing the onset of pathological conditions such as direct endotoxin shock by LPS while maintaining the cellular immune function by IL-18.
  • the DNA encoding the MyD88 TIR mutant protein may be integrated into a vector.
  • the MyD88 TIR mutant and its salt, the DNA encoding the MyD88 TIR mutant, and the vector containing the DNA are as described above.
  • MyD88 TIR mutant or a salt thereof, DNA encoding the MyD88 TIR mutant, or a vector containing the DNA includes, for example, a buffer solution such as PBS, physiological saline, and sterilized water. It can be dissolved in a filter, etc., sterilized with a filter if necessary, and then administered to a subject by injection. In addition, additives such as inactivators, preservatives, adjuvants, emulsifiers, etc. may be added to this solution.
  • the yD88 TIR mutant, the DNA encoding the MyD88 TIR mutant, or the vector containing the DNA can be administered intravenously, muscle, abdominal cavity, subcutaneous, intracutaneous, etc. Also good.
  • a formulation form suitable for administration of a gene vaccine for example, an aqueous solution, ribosome, microparticle, microforce capsule, etc.
  • introduction method for example, using a syringe, syringe, catheter, gene gun, etc.
  • the dosage, frequency and frequency of administration of MyD88 TIR mutant, DNA encoding the MyD88 TIR mutant or a vector containing the DNA are the subject's symptom, age, body weight, administration method, mode of administration, etc. For example, usually, 0.001 to 1 mg / kg body weight per adult, preferably 0.01 to 0.1 mg / kg body weight MyD88 TIR variant is administered at least once with the frequency that the desired effect is sustained. Good.
  • When administering a DNA encoding the MyD88 TIR variant or a vector containing the DNA for example, it is usually at least 1 to 100 mg, preferably 1 to 10 mg per adult.
  • the dose should be administered at a frequency that maintains the desired effect. If the vector is a virus, per adult 109 10 1 4 virus particles, yo preferably 10 "to 10 12 at least once at a dose of viral particles, when administered at a frequency desired effect lasts les, The above dose can be appropriately changed.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft turnips). Cell agents), syrups, emulsions, suspensions and the like. Strong compositions can be prepared by conventional methods and may contain carriers, diluents or excipients commonly used in the pharmaceutical field.
  • examples of the carrier and excipient for tablets include lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate.
  • compositions for parenteral administration include injections and suppositories, and injections include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like.
  • the dosage form is good.
  • Such injections are conventional methods, ie MyD88 TIR mutant protein or its It is prepared by dissolving, suspending or emulsifying the salt in a sterile aqueous or oily liquid usually used for injections.
  • Aqueous solutions for injection include isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, Polyethylene glycol) and nonionic surfactants (for example, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) may be used in combination.
  • suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, Polyethylene glycol) and nonionic surfactants (for example, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, propylene glycol, Polyethylene glycol) and nonionic surfactants (for example, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol)
  • the above oral or parenteral pharmaceutical composition may be prepared in a dosage unit form suitable for the dosage of the active ingredient.
  • the content of the active ingredient in the preparation of the dosage unit varies depending on the kind of the preparation, and is usually 1 to 100% by weight, preferably 50 to 100% by weight.
  • the above-mentioned pharmaceutical composition preferably contains MyD88 TIR mutant or a salt thereof, DNA encoding the MyD88 TIR mutant, or a vector containing the DNA. As long as it contains other active ingredients.
  • the antibody against the MyD88 TIR variant protein of the present invention or a salt thereof can be used for detection and Z or quantification of the MyD88 TIR variant protein of the present invention or a salt thereof.
  • MyD88 TIR variant protein of the present invention or a salt thereof The antibody against can be obtained by administering to the animal a fragment containing the MyD88 TIR mutant protein of the present invention or a salt thereof or an epitope thereof using a conventional protocol.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a chimeric antibody, a single chain antibody, or a humanized antibody.
  • Polyclonal antibodies can be produced according to known methods or modifications thereof.
  • a complex of immune antigen (protein antigen) and carrier protein can be produced by preparing a combination, administering (immunizing) the animal, collecting an antibody-containing substance against the protein of the present invention from the immunized animal, and performing separation and purification of the antibody.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production at the time of administration. The administration is usually about once every 2 to 6 weeks, about 3 to 10 times.
  • Polyclonal antibodies can be collected from blood, ascites, etc. of immunized animals, preferably blood force.
  • Polyclonal antibodies can be separated and purified by immunoglobulin separation and purification methods (e.g., salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger, ultracentrifugation method, gel filtration method, A specific purification method in which only the antibody is collected with an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the binding is dissociated to obtain the antibody.
  • immunoglobulin separation and purification methods e.g., salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, adsorption / desorption method using ion exchanger, ultracentrifugation method, gel filtration method, A specific purification method in which only the antibody is collected with an antigen-binding solid phase or an active adsorbent such as protein A or protein G, and the binding is dissociated to obtain the antibody.
  • Monoclonal antibodies can be prepared by the hybridoma method of G. Koehler and C. Milstein described in Nature (1975) 256: 495, Science (1980) 208: 692-. That is, after immunizing an animal, spleen antibody-producing cells of the immunized animal are isolated and fused with myeloma cells to prepare monoclonal antibody-producing cells. In addition, the ability to specifically react with MyD88 TIR mutant proteins or salts thereof does not substantially cross-react with other antigenic proteins, or isolate cell lines that produce antibodies. By culturing this cell line, the desired monoclonal antibody can be obtained with a culture strength. Monoclonal antibodies can be purified according to the immunoglobulin separation and purification method described above.
  • the present invention is a method for screening for a drug that specifically modifies interleukin 18 action, comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at the 214th lysine, 238th lysine and 269th arginine of MyD88 TIR.
  • a drug that specifically modifies interleukin 18 action comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 at the 214th lysine, 238th lysine and 269th arginine of MyD88 TIR.
  • the above method which comprises examining the presence or absence of binding between at least one amino acid selected from the group of potential and a candidate substance of the drug.
  • “specifically altering interleukin 18 action” means expression of interleukin 18 receptor, repression in mammalian cells, and interleukin 18 It means the increase or decrease in the amount of cellular reaction such as activation of transcription factors and the resulting production of cytodynamic force (especially interferon ).
  • interleukin 18 is added to the cell culture medium to stimulate the cells.
  • transcription factor NF- ⁇ ⁇ is obtained by adding interleukin-18 and a drug candidate substance to the cell culture medium and stimulating the cells.
  • the activation of transcription factor NF- ⁇ and the amount of production of interferon ⁇ were changed compared to the case where no drug candidate substance was added.
  • the candidate substance specifically modifies interleukin-18 action.
  • Binding of at least one amino acid selected from the group consisting of the 214th lysine, the 238th lysine, and the 269th arginine force of the MyD88 TIR of the amino acid sequence power of SEQ ID NO: 2 and the drug candidate substance In order to investigate the presence or absence of X-ray crystal structure analysis, nuclear magnetic resonance (NMR), three-dimensional structure analysis such as neutron diffraction, methods of observing the shape of the complex such as electron microscope and atomic force microscope, and Methods such as a docking study that simulates a stable binding mode with a test substance of any structure for the three-dimensional structure of MyD88 TIR consisting of an amino acid sequence can be used.
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • three-dimensional structure analysis such as neutron diffraction
  • methods of observing the shape of the complex such as electron microscope and atomic force microscope
  • Methods such as a docking study that simulates a stable binding mode with a test substance of any structure for the three-dimensional structure of MyD88
  • the candidate substance may be any substance, such as protein, peptide, polysaccharide, oligosaccharide, monosaccharide, low molecular weight compound, nucleic acid (DNA, RNA, oligonucleotide, mononucleotide, etc.) Can do.
  • Drugs that specifically modify interleukin-18 action can be used for the prevention and / or treatment of diseases such as Crohn's disease, rheumatoid arthritis, bronchial asthma, atopic dermatitis, and fulminant hepatitis.
  • the gene encoding the TIR domain (148-296) of human MyD88 was extracted from mRNA from human lymphocytes, synthesized with reverse transcriptase, and further amplified using PCR. This was cloned into the pGE X-5X-3 (Amersham) plasmid vector. This plasmid was transformed into E. coli B L-21 (DE3) strain (Novagen). This single colony of E. coli was selected and inoculated into a nutrient rich growth medium (Silantes) labeled with stable isotopes. E. coli was cultured at 37 ° C until A600 force -0.5 was reached.
  • the TIR domain of MyD88 expressed as a dartathione-S-transferase (GST) fusion protein was first purified by affinity chromatography and the GST tag was removed by digestion with Factor Xa protease (Pharmacia). Next, the proteins separated into the GST tag and MyD88 TIR domain were separated into Sephacryl S-100 HR 26/60 column (Pharmacia) and 20 mM potassium phosphate buffer (pH: 6.0) (150 mM KC1, 0.1 raM EDTA and 10 mM). Gel filtration using DTT).
  • GST dartathione-S-transferase
  • the monomeric TIR domain of MyD88 protein was pooled and concentrated by ultrafiltration using a 10 kDa Microsep microconcentrator (Amicon). Further purification was performed by ion exchange chromatography using a MonoS column (Pharmacia). Using this purification protocol Ichiru were labeled with 15 N, and 13 C, 15 were double labeled with N, to prepare a wild-type TIR domain of MyD88 protein. Protein yields ranged from 1 liter of nutrient-rich growth medium to about 1.0 mg. Since these protein sumnoles seemed to have a tendency to form aggregates, the sample buffer for these proteins was 20 m.
  • NMR spectra were recorded at 25 ° C using a Bruker DRX500 or DRX800 spectrometer equipped with a CryoProbe. Triple resonance NMR was performed to determine the assignment of protein main and side chain 1 H, 13 C and 15 N resonances. Distance constraints for structural calculations were obtained from 3D 15 N edited NOESY and 3D 13 C edited NOESY experiments (mixing time 150 msec). NMR spectra were processed using NMRPipe. Software package (Reference # 2 for Bow I) and analyzed using Sparky (Reference # 3). ⁇ - ⁇ The pulse sequence used to obtain the steady state hetero NOE value has been described previously (reference # 4).
  • Human embryonic kidney ( ⁇ ) cells 293FT were purchased from Invitrogen, and 293-hTLR4A_HA cells were purchased from Invivogen. These cells were treated with Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose-containing D-MEM; Invitrogen) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Sigma), penicillin (100 U / mL) and streptomycin (100 pg / mL). ). All cells were incubated at 37 ° C in a mixture of 5% CO. My with N-terminal c-myc tag
  • the gene encoding the T88 domain (146-296) of D88 was cloned into a pcDNA3.1 + plasmid (Invitrogen) vector.
  • the mutated sequence of MyD88's TIR domain was generated by GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega) 3 and was subjected to “ 1 J analysis” to confirm the presence of the mutation.
  • NF- ⁇ ⁇ Lucifera reporter vector 1 and pcDNA3-Rluc for controlling the number of cells Luciferaise vector 1 were donated by Dr. Sewon Ki and Prof. Tetsuro Kokubo (Yokohama City University) Received [0065]
  • the mutation of the produced MyD88 TIR is described as follows. Polar residue to alan: All charged amino acids (Thr, Ser, Glu, Arg and His) were replaced with alanine, respectively.
  • Phe285, Trp286 to Ala: Phe285 and Trp286 are present in the conserved Box 3 sequence and have been suggested to be functionally important (cited references # 10, 11), thus replacing alanine did.
  • MyD88 Pro200 to His A point mutation in this position of the TIR domain of mouse TLR4 (Pro712His: Lps d mutation) has been shown to be critical for the immune response to the host lipopolysaccharide (LPS) (Cited document # 12), this replacement was made. The importance of proline at this site in the TIR domain of TLR2 has also been pointed out (reference # 13).
  • HE K293FT cells or 293-hTLR4A-HA cells were seeded on 6-well plate SUMILON CELLTIGHT C-1 (SUMITOMO BAKELITE) at a density of 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the method of use, 1.0 ⁇ g pcDNA3.1 + control vector or 1.0 ⁇ g P cDNA3.1 + myc-MyD88 TIR domain wild type or abrupt mutant, 1.0 / ig PCDNA3.1 + IL-18R j3 -AUl or 1.0 ⁇ g pcDNA3.1 + MD2-A Ul, 0.5; ig NF- (c B luciferase reporter vector, and 0.1 ⁇ g (pcDN A3- Rluc was transfected and all plasmid vectors were purified using EndoFree Plasmid axi Kit (QIAGEN) After 12 hours, each culture medium was recombined with IL-18 (100 ng AnL: self-made in our laboratory).
  • NF- ⁇ B reporter gene activation assay was performed using the Dua Luciferase Reporter Assay System (Promega). These Luciferase activities were then measured using a TECAN INFINIT 200 multiwell plate reader. Normalization was performed with respect to the control activity (Renilla luciferase activity) to correct the NF- ⁇ B-dependent firefly reluciferase activity by the number of cells.
  • the isoelectric point (pi) of MyD88 protein was calculated using acVector ver. 9.0 (Accerlys).
  • MyD88, IL obtained using ClustalW ver.1.4 program included in MacVector Figure 1 shows the sequence alignment between the -1 receptor family and the TLR family. Homology and identity scores were also calculated using this program.
  • 6-well plates were seeded at a density of 1.0 ⁇ 10 5 HEK293FT cells / mL.
  • 1.0 / xg pcDNA3.1 + control vector or 1.0 ⁇ g pcD NA3.1 + mycy-D88 TIR domain wild type or mutant was transfected using Lipofectamine 2000. After 24 hours, replace each culture medium with fresh medium containing 25 ⁇ 1 / ⁇ cycloheximide and incubate for 0 or 48 hours at 37 ° C in a mixture of 5% CO.
  • the root mean square deviation (rmsd) of the 20 main chain heavy atoms (N, C c and C,) above is 0.45 angstroms (residues 157-185, 188-194 and 203-295 Used to superimpose).
  • N-terminal 9 amino acids (148-156) showed a random coil tendency as indicated by the lack of a moderate to long range NOESY cross peak in this region. So these residues are Excluded.
  • amide cross peaks are deleted for residues from D195 except G201 to C 203, which corresponds with BB- loop ( Figure 1).
  • MyD88 TIR (157-296) is a parallel sheet (/ 3 A-) consisting of five central strands surrounded by four ⁇ helices (a A- ct C and ⁇ ⁇ ). ] S ⁇ ).
  • PDB codes: 1FYV, 1FYW and 1T3G Figure 2B.
  • MyD88 TIR is most homologous to the amino acid sequence of TLR2 TIR compared to other TIR proteins (identity score between MyD88 TIR and TLR2 TIR is 22% and homology score is 48%) .
  • Figures 2C and 2D are overlays of MyD88 TIR and TLR2 TIR (PDB code: 1FYW). ] 3
  • the structure of the sheet core is similar to each other (the rmsd value for the main chain N, C a and C is 0.90 angstroms) force, notable dissimilarity in some areas Sex was shown.
  • the BB-loop differs greatly in the direction in which the force loop exposed to the solution is pointing.
  • This extended ⁇ -strand is a cross peak in 15 N edited 3D NOSEY spectrum. Is fully supported by the pattern. In this 3D NOSEY spectrum, the intensity of a series of NOE cross peaks (H a (i) to HNG + 1)) is significantly stronger than the intraresidue intensity (H ⁇ (i) to HN (i)). It was. The chemical shift values of C ⁇ and C ⁇ also supported this secondary structure.
  • MyD88 has a long loop (DD-DE long loop) instead of the a D helix present in TLR2.
  • deletion of a D was predicted because numerous gaps were found in the region where D was present. ( Figure 1).
  • FIG. 3 shows the surface electrostatic potential of the TIR domain.
  • Box 3 of MyD88 TIR has a large positive potential area.
  • the calculated isoelectric point (pi) of MyD88 (148-296) TIR domain is 9.25 (5.79 for full length MyD88), so this domain itself is positively charged.
  • MyD88 is present in the cytoplasm of the cell (cited reference # 21).
  • the large positive potential region of the yD88 TIR will make it easier for this domain to target negatively charged cell membranes.
  • the Box 2 region containing the BB-loop forms a region covered by a narrow negative potential.
  • NF- ⁇ B reporter gene assembly After stimulation with IL-18 and LPS. Based on previously published data, the inventors systematically introduced single amino acid substitutions in myc_MyD88 TIR and quantified luciferase activity after IL-18 or LPS stimulation. NF- ⁇ B activity will reflect the effect of mutations on the function of MyD88 in cells. Alanine substitution mutants with 25 selected charged polar amino acids and 3 hydrophobic amino acids were evaluated (Table 2). The results of the NF- ⁇ B luciferase reporter assay using IL-18 are shown in FIG. 4A. As shown in this figure, a control cell that did not transfect the dominant negative gene.
  • IL-18 stimulation resulted in an approximately 3-fold increase in luciferase activity.
  • myc-MyD88 TIR When wild-type myc-MyD88 TIR is overexpressed in cells, there is no significant increase in NF- ⁇ activity, indicating a dominant negative inhibitory effect of the protein.
  • Some mutants eg, R196A, ⁇ 238 ⁇ , R288A
  • the dominant negative inhibitory effect of the mutant was judged to be significant after comparing the wild type and each mutant by statistical analysis.
  • MyD88 is generally recruited to IL-1R / IL-18R / TLR signaling and more types of molecules (except for IRF family-like receptors that can bind to MyD88, etc.) (references) # 22, 23, 24).
  • Boxl The conserved Boxl region does not play an important role in both IL-18 and TLR4 signaling. This is because no significant changes were detected in the reporter assembly. Recently, an interaction force with IRF-1 / 4/5 has been reported for a portion of MyD88 that includes this region (references # 22, 23, 24). This region may not contribute to the signal transduction system for interferon production, which is not possible with NF- ⁇ B. Also adjacent to the Boxl region, R217A exhibits a significant loss of dominant negative inhibition and is functionally important. [0078] Box2 (BB-loop and Pro200): Early studies showed the importance of the conserved proline present in the BB-loop of the TIR domain of TLR (references # 12, 18).
  • ⁇ B and BC loop The importance of several amino acids present in this region has also been proposed for TLR4 TIR by Ronni et al. (Ref. 20). In this area, the detailed structure of MyD88 is characteristic compared to other TIR structures. The ⁇ ⁇ helix is short compared to other TIR structures (see structure description), and the BC-loop following this helix is longer.
  • ⁇ 3 ( ⁇ E helix): a E has also been reported to mediate adapter-adapter- and receptor-receptor oligomerization between TIR domains (Reference # 10, 11).
  • polar residues contained in ⁇ ⁇ were replaced by alanine ( ⁇ 282 ⁇ and R288A)
  • both IL-18 stimulation and LPS stimulation had significant effects in our study (Fig. 5).
  • F285 and I W286 exist between the TIR domains and are called FW motifs. It is noteworthy that alanine substitution in this FW motif has been previously reported as critical for dimer formation. However, F285A did not show any effect on dominant negative action in reporter assembly (R ⁇ . U.
  • the present inventors have been unable to obtain any information about W286. Because the W286A mutant protein is a very unstable force in the cell. The present inventors confirmed the expression level and stability of W286A protein using the cycloheximide method (FIG. 6).
  • the TIR domain is typically composed of 135 to 160 amino acids. Sequence conservation between TIR domains is generally between 20-30%, and most of the conserved residues are present in a hydrophobic core composed of a parallel i3 sheet of 5 strands. The difference in length and considerable changes in amino acid sequence between TIR domains suggests the structural and functional diversity of this domain.
  • TLRl TLRl
  • TLR2 TLR2
  • IL-1RAPL IL-1RAPL
  • MyD88 is commonly used for IL-1R / IL-18R / TLR-mediated signaling pathways in cells. However, the cellular response depends on which receptor is stimulated. Therefore, there must be a certain mechanism of action that separates cell fate under MyD88.
  • the present inventors performed functional analysis of MyD88 using cultured cells. as a result Based on this, we have been able to identify several residues that are important for both IL-18 and LPS stimulation. In FIG. 5, the reporter assembly results are mapped to the surface of the yD88 TIR structure. In this figure, it was noted that only charged residues were mapped.
  • IL-18 extensive immunoregulatory functions (IFN- ⁇ induction and Thl differentiation enhancement, as well as IgE antibody induction and allergic response) (Cited references # 29, 30, 31, 32, 33)).
  • IFN- ⁇ induction and Thl differentiation enhancement as well as IgE antibody induction and allergic response
  • MyD88 The structural and functional information obtained for MyD88 through this study will contribute to the development of drugs for immunodeficiency diseases that can regulate the interaction between the receptor and MyD88. Further research is expected in the future regarding the structure determination of various TIR domain complexes.
  • Rectification limit (A) 0.0109 ⁇ 0.0002
  • Average rm.sd is the calculated deviation of the average structure and 20 refined structures.
  • TLR2 Toll-like receptor 2
  • H. et al. IL-18 contributes to the spontaneous development of atopi c dermatitis-like inflammatory skin lesion independently of IgE / stat6 under specinc pathogen-free conditions.Proc Natl Acad Sci USA 99, 11340-5 (2002 ).
  • the present invention has potential for clinical application as one of anti-endotoxin shock therapies.
  • the present invention is also useful for studying ToU-like receptors and IL-1 / 18 signal transduction as gene reagents for research purposes.
  • SEQ ID NO: 1 shows the nucleotide sequence of human MyD88 TIR domain.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the human MyD88 TIR domain.
  • SEQ ID NO: 3 shows the nucleotide sequence of yD88 TIR K238A.
  • SEQ ID NO: 4 shows the amino acid sequence of yD88 TIR K238A.
  • SEQ ID NO: 5 shows the nucleotide sequence of yD88 TIR R269A.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of MyD88 TIR R269A.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence of MyD88 TIR K214A.
  • SEQ ID NO: 8 shows the amino acid sequence of MyD88 TIR K214A.

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Abstract

LPS等のTLRファミリーとIL-1受容体ファミリーに共通のシグナル伝達に使用される細胞内因子アダプター分子MyD88の機能を細胞内でシグナル特異的に制御する手法を提供する。　以下の(a)、(b)若しくは(c)のMyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩。(a)配列番号２のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のリシン及び２６９番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、２１４番目のリシン、２３８番目のアミノ酸及び２６９番目のアミノ酸以外の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質(c)配列番号３、５又は７のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン１８刺激のシグナルは阻害しないタンパク質

Description

. . 明 細 書
変異導入 MyD88蛋白による Toll様受容体/インターロイキン 18シグナ ルの特異的制御法
技術分野
[0001] 本発明は、 Toll様受容体 Zインターロイキン 18シグナルの特異的制御を可能とする MyD88の Toll/インタ一ロイキン 1受容体（Toll/Interleukin-1 receptor: TIR)ドメイン変 異体及びその利用に関する。 .
背景技術
[0002] インターロイキン l(IL-l)は、自然免疫反応を迅速に活性化する主要な炎症誘発性 サイト力インであり、そして獲得免疫系の強力な誘導物質である 1 (非特許文献 1)。ま たインターロイキン 18(IL - 18)は最初 IL-1ホモログの 1つとして見い出され、そしてイン ターフェロン - y (IFN- Y )誘導因子として同定された 2 (非特許文献 2)。 IL - 1同様， IL- 18も自然および獲得免疫反応において重要な役割を果たす。 IL-18およひ -1 βは 、中程度の配列相同性 (17%のアミノ酸が同一)を示す力 本発明者らは IL- 18の立体 構造が IL-1 のそれに類似してレ、ることを明らかにしてレ、る 3 (非特許文献 3)。 IL-1 および 1L- 18のリガンド受容体複合体構造は、類似してレ、るものと予測される。これら のシグナル伝達は、サイト力インリガンドおよびその受容体力 なる高親和性複合体 の形成によって開始される。細胞表面でこれらのリガンドがその受容体複合体に結合 したとき、受容体分子の細胞質側末端が、 Toll,インタ一ロイキン 1受容体ホモロジ一 (TIR)ドメインを介して、ミエロイド分化 88(Myeloid Differentiation 88: MyD88)に結合 する 4 (非特許文献 4)。 MyD88を介するシグナル伝達は、一般に、 NF- κ Βおよび ΑΡ - 1転写因子の活性化をもたらす。
[0003] TIRドメインは、 IL-1受容体、 IL-18受容体、 Tollおよび Toll様受容体 (TLR)、ならび に MyD88によって例示されるいくつかの細胞内タンパク質に見い出される。ショウジョ ゥバエの Tollファミリ一および哺乳動物 TLRファミリ一は、細菌、真菌およびウィルスを 含む多様な微生物リガンドの群に対する細胞膜上の認識受容体として知られている 。最近、それらの TLRファミリ一メンバ一は、微生物感染の重要なセンサーであること が立証された。今日までに少なくとも 13個の TLRが発見されている力 それらのそれ ぞれは異物に由来する異なる種類のリガンド (例えば、二本鎖 RNA、 LPS、ペプチド ダリカン、等）に応答するように特殊化されている 5 (非特許文献 5)。例えば、 TLR2は グラム陽性細菌ペプチドグリカンを認識し、また TLR4はグラム陰性細菌リポ多糖 (LPS )を認識する。
[0004] 今日までに TIRドメインを含む細胞内蛋白分子が 5個同定され、それらは MyD88、 TI RAP (Mai), TRIF (TICAM- 1)、 TRAM (TICAM- II)および S- ARMである 6 (非特許文 献 6)。これらの細胞内「アダプタ一」タンパク質は、 TLRの細胞ドメインへリクルートさ れ、細胞内でシグナル伝達経路を媒介することが明らかになっている。アダプタ一タ ンパク質の多様性に関しては、別個の TLRにリクルートされるアダプタ一分子の異な る組合せが下流シグナル伝達カスケードを決定すると考えられてレ、る 7 (非特許文献 7)。
[0005] MyD88は最初、肺条件培地または組換え IL- 6による活性化後、 Ml骨髄芽球性白 血病細胞中に誘導された 12個の異なる mRNA転写物の 1つとして同定された 8 (非特 許文献 8)。 MyD88のヒトホモログは、 1997年に単離クローン化された 9 (非特許文献 9 )。アミノ酸配列分析は、 MyD88が短レ、リンカ一によって C末端 TIRドメイン (約 150アミ ノ酸残基）と隔てられた N末端 deathドメイン (約 90アミノ酸残基)からなるモジュール構 成を有することを予測した。 IL- 1R/IL- 18R/TLRのそれぞれは、それらの細胞質側末 端に、 MyD88の TIRドメインと結合することが公知である 1個の TIRドメインを有する。こ こで TIR-TIRヘテロ二量体化が起こる。 MyD88はさらに、 deathドメインを含む下流因 子である IRAKと、 deathドメイン - deathドメインヘテロ二量体化により結合する 10 (非特 許文献 10)。 TIRドメインの 2つの結晶構造 (TLR2および IL-1RAPL)がホモ二量体構 造として決定されている 11，12 (非特許文献 11、 12)。これらは、 TIRドメインのオリゴマ —的性質をおそらく示している。これらのホモ二量体構造に基づいて、コンピュータ での（in silico)ドッキングシミュレーションを含むレ、くつかの実験を行って、 MyD88と T LRの間の TI R- TIR相互作用が特徴付けられた 13- 15 (非特許文献 13〜： 15)。しかし、 そのようなオリゴマー性相互作用の実際のところの詳細はまだ十分理解されていない [0006] IL-18を含む IL-1ファミリ一や病原体構成成分認識受容体である Toll様受容体 (TLR )のシグナル伝達経路のシグナルを修飾するような物質の開発がなされてレ、る (非特 許文献 16〜： 19)。しかし、この経路の細胞内因子であるアダプター分子 MyD88の機 能を制御することでシグナルの一部を遮断する手法は現在まで試みられてレ、なレ、。
[0007] 非特許文 fel : Sims， J. E. IL-1 ana iL-18 receptors, and their extended family. し urr
Opin Immunol 14, 117-22 (2002)
非特許文献 2 : Okamura, H. et al. Cloning of a new cytokine that induces IFN-gamm a production by T cells. Nature 378， 88—91 (1995).
非特許文 3 : Kato, Z. et al. The structure and binding mode of interleukin- 18. Nat Struct Biol 10， 966—71 (2003).
非特許文 4 : O'Neill, L. A. & Greene, C. Signal transduction pathways activated b y the IL-1 receptor family: ancient signaling machinery in mammals, insects, and pla nts. J Leukoc Biol 63, 650-7 (1998).
非特許文 B^5 : Underhill, D. . & Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Current Opinion in Immunology 14, 103—110 (2002)
非特許文献 6 : McGettrick， A. F. & O'Neill,し A. The expanding family of MyD88- li ke adaptors in Toll-like receptor signal transduction. Mol Immunol 41, 577-82 (200
4).
非特許文献 7 : Kaisho， T. & Akira, S. Toll-like receptor function and signaling. J Alle rgy Clin Immunol 117， 979-87; quiz 988 (2006)
非特許文献 8 : Lord, K. Α·， Hoffrnan-Liebermann, Β. & Liebemann, D. A. Nucleotid e sequence and expression of a cDNA encoding MyD88, a novel myeloid differentiati on primary response gene induced by Iし 6. Oncogene 5， 1095 - 7 (1990)
非特許文献 9 : Bonnert， T. P. et al. The cloning and characterization of human yD
88: a member of an IL-1 receptor related family. FEBS Lett 402, 81-4 (1997). 非特許文献 10 :Wesche， Η·， Henzel, W. J" Shillinglaw, W" Li, S. & Cao, Z. MyD88
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非特許文献 13 : Dunne, A., Ejdeback, M.， Ludidi, P.し， O'Neill,し A. & Gay， N. J. Structural complementarity of Toll/interleukin-l receptor domains in oil-like recep tors and the adaptors Mai and MyD88. J Biol Chem 278， 41443-51 (2003).
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非特許文 ;i5 :Jiang, Z. et al. Details of Toll-like receptor:adapter interaction reve aled by germ-line mutagenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 103， 10961-6 (2006). 非特許文献 16 : Biol. Chem. 1996 Nov 29;271(48):30517-23.
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非特許文献 19 : J. Biol. Chem. 2005 Apr 22;280(16):15809-14
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008] 本発明は、 LPS等の TLRファミリ一と IL-1受容体ファミリ一に共通のシグナル伝達に 使用される細胞内因子アダプター分子 MyD88の機能を細胞内でシグナル特異的に 制御する手法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009] IL- 1/1い 18/TLRシグナル伝達における TIRドメインの重要な役割にもかかわらず、 本願の優先日（2007年 8月 1日）の時点で、構造データは受容体の TIRに関するものし 力利用できなかった。細胞内アダプタ一分子の TIRについては、そのいずれについ ても原子構造の決定はなされていな力つた。したがって、これらのアダプターの TIRド メインの構造情報は、相互作用機構をより正確に理解するために必須である。そこで 、 IL-1R/IL-18R/TLRシグナル伝達のより良い理解への一歩として、本発明者らは、 溶液 NMR分光法を用いてヒト MyD88の TIRドメインの溶液構造を決定した。この構造 は、 IL-1R/IL-18R/TLRシグナル伝達における TIR含有アダプタ一タンパク質の生物 学的機能をさらに研究するために必要な基礎を提供する。また、本発明者らは、培養 細胞を用いて MyD88 TIRの一連の機能分析を実施した。これらの分析は、 MyD88が I L- 18および TLR4シグナル伝達経路で機能するために決定的な数個のアミノ酸残基 を決定することを可能とした。興味深いことに、 MyD88 TIRの 3つの共通な相互作用 部位が同定され、そして 1つのさらなる部位は IL- 18シグナル伝達にのみ機能した。
[0010] MyD88は deathドメインと Toll Interleukin - 1 Receptor homology (TIR)ドメインからな る 2ドメイン蛋白である力 S、 deathドメインを欠失させ TIRドメイン (148- 296)のみ細胞に 発現させると、 IL-18を含む IL- 1ファミリ一や TLRのシグナル非特異的ドミナントネガテ イブインヒビタ一として働くことが知られている。この MyD88 TIRドメインのリシン 214とリ シン 238とアルギ-ン 269をァラニンに置換した変異体 MyD88 TIR K214Aと MyD88 TI R K238Aと MyD88 TIR R269Aを作製し、その機能を培養細胞上において、 NF- κ Β Luciferase reporter gene assayで検討した結果、 TLR4を介する LPSからのシグナルは 遮断できるが、 IL-18からのシグナルは遮断できないことがわ力 た。本発明は、これ らの知見に基づいて、完成されたものである。なお、本願の優先日（2007年 8月 1日） 以降に、 Rossiらにより解析されたヒト MyD88TIRの構造力 PROTEIN DATA BANKに 登録された（登録日： 2007年 6月 29日、公開日： 2007年 10月 23日、登録番号： 2js7)が 、その公開は本願の優先日の後であった。
本発明の要旨は以下の通りである。
[0011] ( 1 )以下の (a)、（b)若しくは (c)の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩。
(a)配列番号 2のアミノ酸配列において、 214番目のリシン、 238番目のリシン及び 26 9番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸 に置換されているアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b) (a)のタンパク質のアミノ酸配列において、 214番目のアミノ酸、 238番目のアミノ酸 及び 269番目のアミノ酸以外の 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列力 なり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイ キン 18刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
(c)配列番号 3、 5又は 7のヌクレオチド配列力 なる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグ ナルは阻害する力 インタ一ロイキン 18刺激のシグナルは阻害しなレ、タンパク質 [0012] (2) (a)の他のアミノ酸がァラユンである（1)記載の MyD88 TIR変異体タンパク質又は その塩。
(3)ヒト由来の野生型 MyD88 TIRタンパク質の変異体である（1)又は（2)記載の MyD 88 TIR変異体タンパク質又はその塩。
(4)ヒト以外の動物由来の野生型 MyD88 TIRタンパク質の変異体である（1)又は（2) 記載の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩。
(5)配列番号 4又は 6のアミノ酸配列からなる（1)記載の MyD88 TIR変異体蛋白質又 はその塩。
[0013] (6) (1)記載のタンパク質をコードする単離された DNA。
(7) (6)記載の DNAを含有する組換えベクター。
(8) (7)記載の組換えベクターを含む形質 換体。
(9) (6)記載の DNAで形質転換した宿主を培養し、培養物力 MyD88 TIR変異体タ ンパク質を採取することを含む MyD88 TIR変異体タンパク質の製造方法。
(10) (1)記載の MyD88 TIR変異体タンパク質若しくはその塩又は（1)記載の MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAを有効成分として含有する医薬組成物。
[0014] (11) (1)記載の MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAがべクタ一に組み込 まれてレ、る（ 10)記載の医薬組成物。
(12) (1)記載の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
(13)インタ一ロイキン 18作用を特異的に修飾する薬剤をスクリーニングする方法で あって、配列番号 2のアミノ酸配列力 なる MyD88 TIRの 214番目のリシン、 238番目 のリシン及び 269番目のアルギニン力 なる群より選択される少なくとも一つのァミノ 酸と前記薬剤の候補物質との結合の有無を調べることを含む前記方法。
[0015] 本発明は、細胞内シグナル伝達タンパクの機能的変異導入箇所の情報を提供する IL-18は、 IFN- γの産生を誘発する等、細胞性免疫機能において重要な分子であ ることがわ力つている力 そのシグナル伝達経路は図 8のように LPSを認識する受容 体である TLR4等と共通している。 LPSは、グラム陰性菌の細胞膜に由来する物質で あるが、生体内においてエンドトキシンショックを誘発する等、毒性を発揮する物質で ある。本発明者らが作製した MyD88 TIR K214A、 K238A、 R269A変異体は、 IL-18シ グナル伝達は阻害しないが、 LPSによる TLR4シグナル伝達は阻害する。従って、この 変異体分子は、 IL- 18による細胞性免疫機能を保持したまま、 LPSによる直接のェン ドトキシンショック等の病態発症を抑えることが期待できる。
発明の効果
[0016] 従来では、 LPSによる毒性の治療には、エンドトキシン除去ゃ抗炎症薬等での治療 が行われていたが、新たな治療アプローチとして、遺伝子レベルで細胞に組換え蛋 白を発現させることで、 IL - 18による細胞性免疫機能を維持したまま LPSによる炎症性 サイト力インの産生を制御することが可能となった。
また、逆に、この MyD88 TIRドメインの K214A、 K238及び R269を標的とする低分子 やペプチドは、 IL-18に特異的な作用をもたらす可能性がある。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願 2007-200776の明 細書おょぴ Zまたは図面に記載される内容を包含する。
図面の簡単な説明
[0017] [図 1]ヒト MyD88、 IL-IR類、および TLR類の TIRドメインタンパク間のアミノ酸配列ァラ ィメント。
[図 2A]ヒト MyD88の TIRドメインの溶液構造。 2A)計算された 20個の最終構造の最もよ く収束した主鎖を重ね合わせた立体図。残基 157-185, 188- 194および 203-295の主 鎖原子を重ね合わせてレ、る。
[図 2B]ヒト MyD88の TIRドメインの溶液構造。 2B) Molmolを用いて描いた、 MyD88の N MR構造の代表的リボン図。二次構造の表示（ /3 A- /3 E， α Α- a Cおよび a E)は、 T LR TIRに従う。
[図 2C]ヒト MyD88の TIRドメインの溶液構造。 2C)および 2D) MyD88 TIRと、 TLR2の T IRドメインの結晶構造（1FYW)を重ね合わせて示したもの。 βシートコアは類似して いるが（RMSD = 0.90オングストローム）、レ、くつかの領域に相違がある。
[図 2D]ヒト MyD88の TIRドメインの溶液構造。 2C)および 2D) MyD88 TIRと、 TLR2の T IRドメインの結晶構造（1FYW)を重ね合わせて示したもの。 BBループ部分をクローズ アップしている。 ）3シートコアは類似しているが（RMSD = 0.90オングストローム）、この 領域において両者は大きく相違がある。
[図 3]TIRドメインの表面静電ポテンシャル。 4つの TIRドメインの静電ポテンシャルを表 したもの。赤は陰性荷電領域を示し、青は陽性荷電領域を示す。矢印は、各 TIRドメ インの BB -ループを示す。 TIRドメインの左側の図は、それぞれ図 2Aと同一の配向で ある。
[図 4A]MyD88 TIRドメイン野生型おょぴ変異体群のレポ一タ一アツセィの結果。 4A : I L-18R J3を同時トランスフエクシヨンした HEK293FT細胞を用いて IL-18 (100 ng/mL) で刺激した際の NF- κ Bレポーター遺伝子アツセィ。このグラフにおいて、各棒グラフ は刺激されてレ、なレ、細胞あたりの刺激された細胞の相対的ルシフェラ一ゼ発光単位 を示す。野生型と各変異体グループの間の有意差は、ダネットの多重比較検定によ り分析した。グラフ上のカラーコード：野生型群と比較した NF- κ B活性が黒の棒ダラ フは統計的に有意なもの；白の棒グラフは、変異導入が重大な影響をなんら示さなか つたことを示す。
[図 4B]MyD88 TIRドメイン野生型および突然変異体のレポーターアツセィの結果。 4B ：補助分子 MD2を同時トランスフエクシヨンした 293 - hTLR4A- HA細胞を用レ、て LPS (1. 0 μ g/mL)で刺激した際の NF- κ Bレポーター遺伝子アツセィ。このグラフにおいて、 各棒グラフは刺激されてレ、なレヽ細胞あたりの刺激された細胞の相対的ルシフェラー ゼ発光単位を示す。野生型と各変異体グループの間の有意差は、ダネットの多重比 較検定により分析した。カラ一コード：野生型群と比較した NF- κ B活性が黒の棒ダラ フは統計的に有意なもの；白の棒グラフは、変異導入が重大な影響をなんら示さなか つたことを示す。
[図 5A]MyD88 TIRドメインの構造表面のマッピング。 IL-18刺激による機能分析に用 いた極性アミノ酸のみを反映する。オレンジ色のアミノ酸残基は、ルシフェラーゼアツ g
セィの結果、重要であると判断されたもの。茶色のアミノ酸残基は、ドミナントネガティ ブ作用が不活性化しなかったものを示す
[図 5B]MyD88 TIRドメインの構造表面のマッピング。 LPS刺激による機能分析に用い た極性アミノ酸のみを反映する。赤色のアミノ酸残基は、ルシフェラ一ゼアツセィの結 果、重要であると判断されたもの。茶色のアミノ酸残基は、ドミナントネガティブ作用が 不活性化しなかったものを示す。特に LPS刺激と比較して IL- 18刺激系では、 K214A, K238A, R269Aの 3つの残基が特異的に重要である。
[図 6]MyD88 TIRドメインに含まれる、保存性の高い残基に対するァラニンあるいはヒ スチジン置換変異体の HEK293FT細胞における発現レベルの評価。 P200H、 F285A の発現レベルは、野生型や K238Aと同等であつたが、 W286Aは他のものより有意に 低ぐかつシクロへキシミド (25 μ mol/L)と共にインキュベートしたところ、 48時間のィ ンキュベ一シヨン後、 W286Aのタンパク質発現はほぼ完全に消失した。
[図 7]細胞に一過性発現させた、 FLAGタグを付加した TIRAPと mycタグを付加した My D88タンパク質の免疫沈降実験による相互作用の検出。 MyD88は、 TIRAPと相互作 用を示し、かつ MyD88 TIRの K214A、 K238A、 R269A変異体も TIRAPと相互作用可 能であった。
[図 8]IL- 18と LPSがそれぞれ関与する細胞内シグナル伝達経路を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。
1. MyD88 TIR変異体タンパク質
本発明は、以下の (a)、（b)若しくは (c)の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩を 提供する。
[0019] (a)配列番号 2のアミノ酸配列にぉレ、て、 214番目のリシン、 238番目のリシン及び 26 9番目のアルギニン力 なる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸 に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)(a)のタンパク質のアミノ酸配列において、 238番目のアミノ酸及び 269番目のアミ ノ酸以外の 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列か らなり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害するが、インターロイキン 18刺激のシグ ナルは阻害しなレ、タンパク質
(c)配列番号 3、 5又は 7のヌクレオチド配列力 なる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグ ナルは阻害する力 インタ一ロイキン 18刺激のシグナルは阻害しなレ、タンパク質
[0020] (a)のタンパク質としては、配列番号 2のアミノ酸配列にぉレ、て、 214番目のリシン、 2 38番目のリシン及び 269番目のアルギニン力 なる群より選択される少なくとも一つ のアミノ酸が他のアミノ酸 (例えば、ァラユン、セリン、ノくリン、ロイシン、イソロイシン、 プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、メチォニン、グリシン、トレオニン、グノレタミ ン、ァスパラギン、チロシン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、ァスパラギン酸、グノレタミ ン酸など）に置換されたものを例示することができる。 214番目のリシン、 238番目のリ シン及び 269番目のアルギニンと置換する他のアミノ酸は、 MyD88 TIRの立体構造 を破壊しないものであるとよい。例えば、ァラニンの他、セリン、グリシン、グルタミン、 ァスパラギン、トレオニンで置換することが好ましい。
[0021] (b)のタンパク質は、（a)のタンパク質のアミノ酸配列において、 214番目のアミノ酸、 238番目のアミノ酸及び 269番目のアミノ酸以外の 1若しくは数個（好ましくは、 2個 以上 20個以下、より好ましくは 2個以上 10個以下）のアミノ酸が欠失、置換若しくは 付加されたアミノ酸配列を有し、かつリポ多糖刺激のシグナノレは阻害する力、インタ 一ロイキン 18刺激のシグナルは阻害しなレ、タンパク質である。
[0022] 本明細書において、「リポ多糖刺激のシグナルを阻害する」とは、ほ乳類細胞にお レ、て、リポ多糖刺激による転写因子の活性化及び、その結果としてのサイト力イン産 生等の細胞の反応の抑制を意味する。リポ多糖刺激のシグナルを阻害するか否かは 、リポ多糖を認識する受容体を持ったほ乳類細胞に転写因子の結合認識部位の配 列を組み込んだレポ一ター遺伝子べクタ一を形質転換により導入した後、リポ多糖刺 激を加え、レポ一ター遺伝子の発現量を比較検討することにより、調べることができる 。例えば、リポ多糖を認識する受容体を持ったほ乳類細胞に、目的のタンパク質をコ —ドする配列と転写因子の結合認識部位の配列を組み込んだレポ一タ一遺伝子べ クタ一を形質転換により導入した後、リポ多糖刺激を加え、レポ一ター遺伝子の発現 量を測定し、目的のタンパク質をコードする配列を組み込んでいない形質転換細胞 におけるレポーター遺伝子の発現畺と比較して、発現量が減少していれば、リポ多糖 刺激のシグナルを阻害すると判定することができる。
[0023] また、「インタ一ロイキン 18刺激のシグナルを阻害する」とは、ほ乳類細胞において 、インターロイキン 18による転写因子の活性化及び、その結果としてのサイト力イン産 生 (特にインターフェロン Ί；)等の細胞の反応の抑制を意味する。インターロイキン 18 刺激のシグナルを阻害する力否かは、インタ一ロイキン 18を認識する受容体を持った ほ乳類細胞に転写因子の結合認識部位の配列を組み込んだレポーター遺伝子べク ターを形質転換により導入した後、リポ多糖刺激を加え、レポ一ター遺伝子の発現量 を比較検討することにより、.調べることができる。例えば、インタ一ロイキン 18を認識す る受容体を持ったほ乳類細胞に、目的のタンパク質をコードする配列と転写因子の 結合認識部位の配列を組み込んだレポーター遺伝子ベクターを形質転換により導 入した後、リポ多糖刺激を加え、レポーター遺伝子の発現量を測定し、目的のタンパ ク質をコードする配列を組み込んでレ、なレ、形質転換細胞におけるレポ一タ一遺伝子 の発現量と比較して、発現量が減少していれば、インターロイキン 18刺激のシグナル を阻害すると判定することができる。
[0024] (c)のタンパク質について、配列番号 3、 5又は 7のヌクレオチド配列力 なる DNAに 相補的な DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DNAは、配列番号 3、 5 又は 7のヌクレオチド配列力 なる DNAに相補的な DNAの全部又は一部と少なくとも 8 0% (好ましくは、少なくとも 95%、より好ましくは、少なくとも 98%)の同一性があるとよい。 ノ、イブリダィゼ一シヨンはストリンジェン卜な条件下で行われる。核酸二本鎖又はハイ プリッドの安定性は、融解温度 Tm (プローブが標的 DNA^ら解離する温度)で表され る。この融解温度はストリンジェントな条件を定義するために用いられる。 1%のミスマツ チにより Tm力 S1°C低下すると仮定すると、ハイブリダィゼーシヨン反応の最終洗浄の 温度を低くしなければならない。例えば、プローブと 95%以上の同一性を有する配列 を求める場合には、最終洗浄温度を 5°C低くしなければならない。実際、 1%のミスマツ チにっき、 0.5〜1.5での間で1¾が変ゎることになる。ストリンジェン卜な条件の例として は、 5x SSC/5xデンハルト溶液 /1.0% SDS中 68°Cでハイブリダィズさせ、 0.2x SSC/0.1 %SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例としては、 3x SSC中 42°Cで洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸との同一性 の最適なレベルを達成するために変更されうる。このような条件に関するさらなる指針 として、 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,し old Spnn g Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.)， 1995, Current Protocols in Molecul ar Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.) at Unit 2.10を参照されたい。
[0025] 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質としては、配列番号 8のアミノ酸からなるタン パク質 (MyD88 TIR K214A)、配列番号 4のアミノ酸からなるタンパク質 (MyD88 TIR K 238Α)、配列番号 6のアミノ酸からなるタンパク質 (MyD88 TIR R269A)などが好ましい 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質は、ヒト由来の野生型 MyD88 TIRタンパク質 の変異体であっても、ヒト以外の動物由来の野生型 MyD88 TIRタンパク質の変異体 であってもよレ、。
[0026] 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質の塩は、薬理学的に許容される塩であるとよ ぐ特に、薬理学的に許容される酸付加塩が好ましい。薬理学的に許容される酸付 加塩としては、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、有機酸 (例 えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クェン酸 、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などを例 示することができる。
[0027] 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質及ぴその塩は、 IL-18の作用は遮断せずに 、 LPSの作用を特異的に遮断することが可能である。従って、本発明の MyD88 TIR変 異体タンパク質及びその塩は、 Toll様受容体及び IL-1/18シグナル伝達に関与する 疾患、具体的には、 LPSが誘発する疾患（例えば、エンドトキシンショック、 SIRS (syste mic inflammatory response syndrome)等の予防及び/又は治療に用いることができ る。また、 Toll様受容体及び IL- 1/18シグナル伝達の研究などを目的とする試薬とし て利用することもできる。
[0028] 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質及ぴその塩は、公知の方法によって製造す ることができる。例えば、後述の 2に記載のようにして MyD88 TIR変異体タンパク質を コードする DNAを得、得られた DNAを適当な発現ベクターに組み込んだ後、適当な 宿主に導入し、組換え蛋白質として生産させることにより、 yD88 TIR変異体タンパク 質を製造することができる（例えば、西鄉薰、佐野弓子共訳、 CURRENT PROTO COLSコンパクト版、分子生物学実験プロトコ一ル、 I、 II、 III、丸善株式会社:原著、 Ausubel, F. M.等， Short Protocols in Molecular Biology, Third ition, John Wiley & Sons, Inc. , New Yorkを参照のこと）。
[0029] あるいはまた、本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質及びその塩は、公知のぺプ チド合成法に従って製造することもできる。
また、当業者であれば、本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質をドメインとして含む 機能性タンパク質（例えば、 MyD88、 TIRAP(Mal), TRIF(TICAM - 1)、 TRA (TICAM-I 1)、 SARMなど)を製造することが可能であり、このようなタンパク質も本発明の範囲に 含まれるものとする。
[0030] 2. MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする単離された DNA
本発明の MyD88 TIR変異体をコードする単離された DNAは、本発明の MyD88 TIR 変異体をコードするヌクレオチド配列を含有するものであればいかなるものであっても よレ、。本発明の MyD88 TIR変異体をコードする DNAとしては、配列番号 7のヌクレオ チド配列力ちなる DNA、配列番号 8のアミノ酸配列（配列番号 2のアミノ酸配列にぉレ、 て、 214番目のリシンがァラニンに置換されてレ、るアミノ酸配列）を有する MyD88 TIR 変異体をコードする DNA (例えば、配列番号 7のヌクレオチド配列力 なる DNA)に相 補的な DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつリポ多糖刺激のシグ ナルは阻害する力 インターロイキン 18刺激のシグナルは阻害しなレ、タンパク質をコ —ドする DNA、配列番号 3のヌクレオチド配列力 なる DNA、配列番号 4のアミノ酸配 列 (配列番号 2のアミノ酸配列において、 238番目のリシンがァラニンに置換されてい るアミノ酸配列）を有する MyD88 TIR変異体をコードする DNA (例えば、配列番号 3の ヌクレオチド配列力 なる DNA)に相補的な DNAとストリンジェントな条件下でハイブリ ダイズし、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害する力 インタ一ロイキン 18刺激のシ グナルは阻害しないタンパク質をコードする DNA、配列番号 5のヌクレオチド配列から なる DNA、配列番号 6のアミノ酸配歹 IJ (配列番号 2のアミノ酸配列において、 269番目 のアルギニンがァラニンに置換されてレ、るアミノ酸配列）を有する MyD88 TIR変異体 をコードする DNA (例えば、配列番号 5のヌクレオチ 配列力 なる DNA)に相補的な DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつリポ多糖刺激のシグナルは 阻害する力 インタ一ロイキン 18刺激のシグナルは阻害しないタンパク質をコードす る DNAなどを例示することができる。
[0031] 配列番号 4、 6又は 8のアミノ酸配列を有する MyD88 TIR変異体をコードする DNAに 相補的な DNAとストリンジヱン卜な条件下でハイブリダィズする DNAは、配列番号 4、 6 又は 8のアミノ酸配列を有する MyD88 TIR変異体をコードする DNA (例えば、配列番 号 3、 5又は 7のヌクレオチド配歹 IJからなる DNA)に相補的な DNAの全部又は一部と少 なくとも 80% (好ましくは、少なくとも 95%、より好ましくは、少なくとも 98%)の同一性がある とよレ、。ノ、イブリダィゼーシヨンはストリンジェントな条件下で行われる。核酸二本鎖又 はハイブリッドの安定性は、融解温度 Tm (プローブが標的 DNAから解離する温度）で 表される。この融解温度はストリンジェン卜な条件を定義するために用いられる。 1%の ミスマッチにより Tm力 Sl°C低下すると仮定すると、ハイブリダィゼーシヨン反応の最終 洗浄の温度を低くしなければならない。例えば、プローブと 95%以上の同一性を有す る配列を求める場合には、最終洗浄温度を 5°C低くしなければならない。実際、 1%の ミスマッチにっき、 0.5〜1.5°Cの間で Tmが変わることになる。ストリンジェントな条件の 例としては、 5x SSC/5xデンハルト溶液 /1.0% SDS中 68°Cでハイブリダィズさせ、 0.2x SSC/0.1%SDS中室温で洗浄することである。中程度にストリンジェントな条件の例とし ては、 3x SSC中 42°Cで洗浄することである。塩濃度や温度は、プローブと標的核酸と の同一性の最適なレべノレを達成するために変更されうる。このような条件に関するさ らなる指十とし飞、 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons. N.Y.) at Unit 2.10を参照されたレヽ。
[0032] 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする単離された DNAは、例えば、以 下のようにして製造することができる。
健常なヒトの血液リンパ球力も mRNAを抽出し、逆転写酵素およびオリゴ dTプライマ 一を用いて cDNAを合成する。ヒト MyD88の TIRドメイン (148- 296)のコード領域（447塩 基）を PCRによって増幅する。得られた PCR産物が野生型 MyD88 TIRタンパク質をコ —ドする DNAである。野生型 MyD88 TIRタンパク質をコードする DNAのアミノ酸配列 およびヌクレオチド配列の一例をそれぞれ配列番号 2および 1に示す。
[0033] MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAは、 MyD88 TIRのコード領域（447塩 基)を点突然変異誘発法により変異させることにより作製することができる。変異させ た MyD88 TIRのコード領域（447塩基）を PCRによって増幅する。得られた PCR産物が MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAである。配列番号 2のアミノ酸配列に おいて、 214番目のリシン、 238番目のリシン及び 269番目のアルギニンからなる群 より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換されているアミノ酸配列 力 なる MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAのヌクレオチド配列の一例を 配列番号 7、 3及び 5に示す。
[0034] 配列番号 7のヌクレオチド配列力 なる DNAは、配列番号 8のアミノ酸配列にぉレ、て 、 214番目のリシンがァラニンに置換されてレ、るアミノ酸配列力もなる MyD88 TIR変異 体タンパク質をコードする。
配列番号 3のヌクレオチド配列力 なる DNAは、配列番号 2のアミノ酸配列にぉレ、て 、 238番目のリシンがァラニンに置換されてレ、るアミノ酸配列力 なる MyD88 TIR変異 体タンパク質をコードする。
配列番号 5のヌクレオチド配列力 なる DNAは、配列番号 2のアミノ酸配列において 、 269番目のアルギニンがァラニンに置換されてレ、るアミノ酸配歹 IJからなる MyD88 TI R変異体タンパク質をコードする。
[0035] 3.組換えべクタ一
本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAを含有する組換えべクタ —は、公知の方法（例えば、 Molecular Cloning2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法）により、本発明の MyD88 TIR変異体 タンパク質をコードする DNAを適当な発現べクタ一に挿入することにより得られる。 発現べクタ一としては、大腸菌由来のプラスミド（例、 pBR322， pBR325, pUC12 , pUC13)、枯草菌由来のプラスミド（例、 pUBl lO, pTP5， pC194)、酵母由来プ ラスミド（例、 PSH19, pSH15)、 λファージなどのパクテリオファージ、レトロウイノレス ,ワクシニアウィルスなどの動物ウィルス、バキュロウィルスなどの昆虫病原ウィルスな どを用いることができる。
[0036] 発現べクタ一には、プロモータ一、ェンハンサ一、スプライシングシグナル、ポリ A付 加シグナル、選択マーカ一、 SV40複製オリジンなどを付加してもよい。
また、発現べクタ一は、融合タンパク質発現べクタ一であってもよい。種々の融合タ ンパク質発現ベクターが市販されており、 pGEXシリーズ (アマシャムフアルマシアバイ ォテク社）、 ET CBD Fusion System 34b- 38b (Novagen社）、 pET Dsb Fusion Syste ms 39b and 40b (Novagen社）、 pET GST Fusion System 41 and 42 (Novagen社）など を例示することができる。
[0037] 組換えベクターを遺伝子ワクチン（プラスミドワクチン 'ウィルスベクタ一ワクチン）とし て使用する場合には、すでに遺伝子ワクチン用に開発されているプラスミドベクタ一 又はゥイノレスべクタ— (RetroNectinTM、 Adenovirus Expression Vector Kit等: ViroMe dica Pacific Limited)に標的遺伝子を導入してワクチンを作製するとよい。
[0038] 4.形質転換体
本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAを含有する組換えべクタ —を宿主に導入することにより、形質転換体を得ることができる。
宿主としては、細菌細胞（例えば、エシ リヒア属菌、バチルス属菌、枯草菌など）、 真菌細胞 (例えば、酵母、ァスペルギルスなど）、昆虫細胞 (例えば、 S2細胞、 S咖胞 など）、動物細胞（例えば、 CHO細胞、 COS細胞、 HeLa細胞、 C127細胞、 3T3細胞、 BHK細胞、 HEK293細胞など）、植物細胞などを例示することができる。
[0039] 組換えベクターを宿主に導入するには、 Molecular Cloning2nd Edition, J. Sambroo k et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989に記載の方法（例えば、リン酸カルシゥ ム法、 DEAE-デキストラン法、トランスフエクシヨン法、マイクロインジェクション法、リポ フエクシヨン法、エレクロトポレ一シヨン法、形質導入法、スクレープローデイング法、シ ヨットガン法など）または感染により行うことができる。
[0040] 形質転換体を培地で培養し、培養物カゝら MyD88 TIR変異体タンパク質を採取する ことができる。 MyD88 TIR変異体タンパク質が培地に分泌される場合には、培地を回 収し、その培地力も MyD88 TIR変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。 MyD88 TIR変異体タンパク質が形質転換された細胞内に産生される場合には、その細胞を 溶解し、その溶解物力 MyD88 TIR変異体タンパク質を分離し、精製すればよい。
MyD88 TIR変異体タンパク質が別のタンパク質（タグとして機能する）との融合タン パク質の形態で発現される場合には、融合タンパク質を分離及び精製した後に、 Fac torXaや酵素（ェンテロキナーゼ）処理をすることにより、別のタンパク質を切断し、目 的とする MyD88 TIR変異体タンパク質を得ることができる。
[0041] yD88 TIR変異体タンパク質の分離及び精製は、公知の方法により行うことができ る。公知の分離、精製法としては、塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用する 方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および SDS_ポリアクリルアミドゲル電気 泳動法などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電 の差を利用する方法、ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用す る方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点 電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
[0042] 5.医薬組成物
本発明は、 MyD88 TIR変異体タンパク質若しくはその塩又は前記 MyD88 TIR変異 体タンパク質をコードする DNAを有効成分として含有する医薬組成物も提供する。本 発明の医薬組成物は、 Toll様受容体及び IL-1/18シグナル伝達に関与する疾患、具 体的には、 LPSが誘発する疾患（例えば、エンドトキシンショック、 SIRS (systemic infla ramatory response syndrome)の予防及びノ又は治療に用レ、ることができる。本発明 の MyD88 TIR変異体タンパク質は、 IL-18シグナル伝達は阻害しないが、 LPSによる T LR4シグナル伝達は阻害することができるので、本発明の医薬組成物は、 IL-18によ る細胞性免疫機能を保持したまま、 LPSによる直接のエンドトキシンショック等の病態 発症を抑えるのに効果的である。
[0043] MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAはべクタ一に組み込まれていてもよ い。
MyD88 TIR変異体及びその塩、前記 MyD88 TIR変異体をコードする DNA、並びに 前記 DNAを含有するベクターは前述の通りである。
[0044] MyD88 TIR変異体若しくはその塩、前記 MyD88 TIR変異体をコードする DNA又は 前記 DNAを含有するべクタ一は、例えば、 PBSなどの緩衝液、生理食塩水、滅菌水 などに溶解し、必要に応じてフィルタ一などで濾過滅菌した後、注射により被験者に 投与されるとよレヽ。また、この溶液には、添加剤 (例えば、不活化剤、保存剤、アジュ バント、乳化剤など）などを添加してもよレ、。 yD88 TIR変異体、前記 MyD88 TIR変 異体をコードする DNA又は前記 DNAを含有するベクターは、静脈、筋肉、腹腔、皮下 、皮内などに投与することができ、また、経鼻、経口投与してもよい。 yD88 TIR変異 体をコードする DNA又は前記 DNAを含有するべクタ一を投与する場合には、遺伝子 ワクチンの投与に適した製剤形態 (例えば、水溶液、リボソーム、微粒子、マイクロ力 プセルなど)や導入方法 (例えば、注射器、シリンジ、カテーテル、遺伝子銃などを用 レ、る方法)などを採用するとよレ、。
[0045] MyD88 TIR変異体、前記 MyD88 TIR変異体をコードする DNA又は前記 DNAを含有 するベクターの投与量、投与の回数及び頻度は、被験者の症状、年齢、体重、投与 .方法、投与形態などにより異なるが、例えば、通常、成人一人当たり 0.001〜1 mg/kg 体重、好ましくは、 0.01〜0.1 mg/kg体重の MyD88 TIR変異体を、少なくとも 1回、所 望の効果が持続する頻度で投与するとよい。 MyD88 TIR変異体をコードする DNA又 は前記 DNAを含有するベクターを投与する場合には、例えば、通常、成人一人当た り 0.1〜 100 mg、好ましくは、 1〜10 mgの投与量で少なくとも 1回、所望の効果が持続 する頻度で投与するとよい。ベクターがウィルスの場合には、成人一人当たり 109〜10 14ウィルス粒子、好ましくは 10"〜1012ウィルス粒子の投与量で少なくとも 1回、所望の 効果が持続する頻度で投与するとよレ、。上記の投与量は適宜変更しうる。
[0046] 経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖 衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカブ セル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。力かる組成物は常法 により製造することができ、製剤分野において通常用レ、られる担体、希釈剤もしくは 賦形剤を含有してもよい。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん 、庶糖、ステアリン酸マグネシウムなどがあげられる。
[0047] 非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などがあげられ、注射 剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤型 であるとよい。かかる注射剤は常法、すなわち MyD88 TIR変異体タンパク質又はその 塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化す ることによって調製される。注射用の水性液としては生理食塩水、ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（ 例えば、エタノール）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレング リコ一ル）、非イオン界面活性剤（例えば、ポリソルベート 80、 HCO-50 (polyoxyethyl ene (50mol) adduct of hydrogenated castor oil) )などと併用してもよい。油性液として はゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルァ ルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は通常適当なアンプノレに充填さ れる。直腸投与に用いられる坐剤は、 MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩を通 常の坐薬用基剤に混合することによって調製することができる。
[0048] 上記の経口用または非経口用医薬組成物は、有効成分の投与量に適合するような 投薬単位の剤形に調製されるとよい。投薬単位の製剤中における有効成分の含量 は、製剤の種類により異なる力 通常 1〜100重量％であり、好ましくは 50〜100重量 %である。
また、上記の医薬組成物は、 MyD88 TIR変異体若しくはその塩、前記 MyD88 TIR 変異体をコードする DNA又は前記 DNAを含有するべクタ一との配合により好ましくな レ、相互作用を生じなレ、限り、他の有効成分を含有してもよ 、。
[0049] 6.抗体
本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、本発明の MyD 88 TIR変異体タンパク質又はその塩の検出及び Z又は定量に利用することができる 本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩に対する抗体は、慣用のプロト コールを用いて、本発明の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩またはそのェピ トープを含む断片を動物に投与することにより得られる。
本発明の抗体は、ポリクロ一ナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗 体、ヒト化抗体のいずれであってもよレ、。
[0050] ポリクロ一ナル抗体を作製するには、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって 製造することができる。例えば、免疫抗原 (タンパク質抗原）とキャリアー蛋白質との複 合体をつくり、動物に投与 (免疫)を行ない、該免疫動物から本発明のタンパク質に 対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。投与 に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントァ ジュバントを投与してもよい。投与は、通常約 2〜6週毎に 1回ずつ、計約 3〜： 10回程 度行なわれる。ポリクロ一ナル抗体は、免疫動物の血液、腹水など、好ましくは血液 力 採取することができる。ポリクローナル抗体の分離精製は、免疫グロブリンの分離 精製法 (例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交 換体による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテイン Aあ るいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗 体を得る特異的精製法）に従って行なうことができる。
[0051] モノクローナル抗体は、 Nature (1975) 256: 495、 Science (1980) 208: 692-に記載さ れている、 G. Koehler及び C. Milsteinのハイブリドーマ法により作製することができる 。すなわち、動物を免疫した後、免疫動物の脾臓力 抗体産生細胞を単離し、これを 骨髄腫細胞と融合させることによりモノクローナル抗体産生細胞を調製する。さらに、 MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩と特異的に反応する力 他の抗原タンパク 質とは実質的に交差反応しなレ、抗体を産生する細胞系を単離するとよレ、。この細胞 系を培養し、培養物力も所望のモノクローナル抗体を取得することができる。モノクロ —ナル抗体の精製は、上記の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができ る。
[0052] 一本鎖抗体を作製する技法は、米国特許第 4，946，778号に記載されている。
ヒト化抗体を作製する技法は、 Biotechnology 10, 1121-, 1992; Biotechnology 10, 1 69-, 1992に記載されている。
[0053] 7.スクリーニング方法
本発明は、インタ一ロイキン 18作用を特異的に修飾する薬剤をスクリーニングする 方法であって、配列番号 2のアミノ酸配列力 なる MyD88 TIRの 214番目のリシン、 2 38番目のリシン及び 269番目のアルギニン力 なる群より選択される少なくとも一つ のアミノ酸と前記薬剤の候補物質との結合の有無を調べることを含む前記方法も提 供する。 [0054] 本明細書において、「インタ一ロイキン 18作用を特異的に修飾する」とは、 インタ一ロイキン 18受容体の発現してレ、るほ乳類細胞にぉレ、て、インタ一ロイキン 18 による転写因子の活性化及び、その結果としてのサイト力イン産生 (特にインタ一フエ ロン Ί )等の細胞の反応量の増減を意味する。インターロイキン 18作用を特異的に修 飾するか否かは、インタ一ロイキン 18受容体の発現してレ、るほ乳類細胞において、細 胞培養培地中にインタ一ロイキン 18を添加し、細胞を刺激することによる転写因子 NF - κ Βの活性化やインタ一フエロン γの産生量を測定することにより、調べることができ る。例えば、インタ一ロイキン 18受容体の発現しているほ乳類細胞において、細胞培 養培地中にインタ一ロイキン 18と薬剤の候補物質を添加し、細胞を刺激することによ る転写因子 NF- κ Βの活性化やインターフェロン Ίの産生量を測定し、薬剤の候補 物質を添加しなかった場合と比較して、転写因子 NF- κ Βの活性化やインターフエ口 ン γの産生量が変化していれば、その候補物質はインターロイキン 18作用を特異的 に修飾すると判定することができる。
[0055] 配列番号 2のアミノ酸配列力 なる MyD88 TIRの 214番目のリシン、 238番目のリシ ン及び 269番目のアルギニン力 なる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と前 記薬剤の候補物質との結合の有無を調べるには、 X線結晶構造解析、核磁気共鳴（ NMR)、中性子回折などの立体構造解析、電子顕微鏡や原子間力顕微鏡などの複 合体の形状を観察する方法や配列番号 2のアミノ酸配列からなる MyD88 TIRの立体 構造に対する任意の構造の被験物質との安定な結合様式をコンピュータでシミュレ —卜するドッキングスタディなどの手法などを用いることができる。
[0056] 候補物質は、いかなる物質であってもよぐタンパク質、ペプチド、多糖、オリゴ糖、 単糖、低分子化合物、核酸 (DNA、 RNA、オリゴヌクレオチド、モノヌクレオチド等）な どを例示することができる。
インターロイキン 18作用を特異的に修飾する薬剤は、クローン病や関節リウマチ、 気管支喘息、アトピー性皮膚炎、劇症肝炎などの疾患の予防及び/又は治療に利 用することがでさる。
実施例
[0057] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。
〔実施例 1〕
材料および方法
サンプルの調製
ヒト MyD88の TIRドメイン (148- 296)をコードする遺伝子は、ヒトリンパ球から mRNAを 抽出し、逆転写酵素で cDNAを合成し、さらに PCR法を利用して増幅した。これを pGE X-5X-3 (Amersham)プラスミドベクター中にクローン化した。このプラスミドを大腸菌 B L-21 (DE3)株（Novagen)に形質転換した。この大腸菌のシングルコロュ一を選択し、 安定同位体元素で標識した栄養豊富な増殖培地 (Silantes)に接種した。 A600力 -0.5に達するまで大腸菌を 37°Cで培養した。次に培養物の温度を 25°Cまで下げ、ィ ソプロピル- β _D-チォガラクトシド (IPTG)を最終濃度が 1 mMとなるように添加すること によりタンパク質発現を誘導した。誘導 16時間後に 4°Cで 6,000 X gで 10分間遠心して 集菌し、細胞ペレットを精製まで- 80°Cで保存した。この細胞ペレットを溶菌バッファ —[20 mM Tris HC1; 0.4 M C1, 1 mM EDTA (pH 8.0)， 0.05% 2—メルカプトェタノ一 ルおよび 1 mM Pefabloc (Roche)]に再懸濁し、超音波処理によって溶菌した。細胞 破砕物および不溶物を遠心（4°C、 6,000 X g、 10分間）により除去した。ダルタチオン - S-トランスフェラーゼ (GST)融合タンパク質として発現した MyD88の TIRドメインをまず ァフィ二ティークロマトグラフィーにより精製し、そして Factor Xaプロテアーゼ (Pharma cia)を用いた消化により GSTタグを除去した。次に、 GSTタグと MyD88の TIRドメインに 分離したタンパク質を Sephacryl S-100 HR 26/60カラム（Pharmacia)および 20 mM リン酸カリウムバッファー（pH: 6.0) (150 mM KC1, 0.1 raM EDTAおよび 10 mM DTT 含有)を用いてゲル濾過した。 MyD88タンパク質の単量体性 TIRドメインをプールし、 1 0 kDa Microsep microconcentrator (Amicon)を用いた限外濾過により濃縮した。 Mon o-Sカラム (Pharmacia)を用いたイオン交換クロマトグラフィーにより、さらに精製を行つ た。この精製プロトコ一ルを用いて、 15Nで標識した、および 13C、 15Nで二重標識した、 MyD88タンパク質の野生型 TIRドメインを調製した。タンパク質収量は、栄養豊富な増 殖培地 1リットルから約 1.0 mgであった。これらのタンパク質サンプノレは凝集体を形成 する傾向があるように思われたので、これらのタンパク質のサンプルバッファ一を 20 m リン酸カリウムバッファー（pH: 6.0) (0.1 mM EDTA, 10 mM DTT, 50 mM重水素 化 L-アルギニンおよび 50 mM重水素化 L-グノレタミン酸含有)と置換した (引用文献 # 1)。最終的に NMR実験に用いたタンパク質サンプルの最終濃度は、約 0.3 mMであつ た。
[0059] NMR分光法
全ての NMRスペクトルは、 CryoProbeを備えた Bruker DRX500または DRX800分光 計を用いて 25°Cで記録した。タンパク質の主鎖および側鎖1 H, 13Cおよび 15N共鳴の 帰属を決定するため、三重共鳴 NMRを実施した。構造計算のための距離拘束は、 3 D 15N edited NOESYおよび 3D 13C edited NOESY実験 (混合時間 150 msec)より得た。 NMRPipe.ソフトウエアパッケージ (弓 I用文献 #2)を用レ、て NMRスぺクトルをプロセシング し、 Sparky (引用文献 #3)を用いて分析した。 ^- Ν定常状態ヘテロ NOE値を得るため に用いたパルスシーケンスは、以前に記述されている (引用文献 #4)。
[0060] 定常状態の1 Η- 15Νヘテロ ΝΟΕ値は、実験開始に先立って、 3秒間の1 Η飽和 (a three- second 'Η saturation)を有する及び有しなレ、スぺクトノレを記録することにより決定した 。 NOE測定のため、合計 64のスキャンを行レ、、データを積算した。全てのデータは N MRPipeを用いてプロセシングし、 Sparkyを用いてピーク強度を計測した。定常状態 N OE値ほ、プロトン飽和を有するピーク強度と有しないピーク強度の比より決定した: N OE = Isat/Iunsat。
[0061] 構造計算
自動化された NOESYクロスピーク帰属および反復構造計算は、 CYANAバージョン 2.1を用いて実施した (弓 I用文献 #5)。 13C edited NOESYおよび15 N edited NOESYスぺ クトノレのピークピッキング (peak-picking)は、 Sparkyを用いて実施した。ぁレヽまレ、でなレヽ NOESYクロスピークを手作業で帰属し、距離拘束として CYANAによる構造計算に含 めた。手作業で帰属決定した NOE値は、強レ、、中程度の、および弱い NOEクロスピ —ク強度にそれぞれ対応する 3つの距離範囲 1.8-2.7オングストローム（NHプロトン を含む NOEについては、 1.8-2.9オングストローム)、 1.8-3.3オングストローム（NHプ 口トンを含む NOEについては、 1.8-3.5オングストローム)、および 1.8-5.0オングスト ロームに分類された。水素結合拘束および二面角拘束もまた CYANAによる構造計 算に含めた。水素結合拘束（r = 1.8-2.2オングストロームおよび r = 2.2-3.3
NH-O N-0
オングストロームである場合は、水素結合 1個あたり 2)は、 NOESYパターンに基づくタ ンパク質の標準的二次構造および主鎖の二次ケミカルシフトから作製された。主鎖 二面角拘束（Φ および φ 角度)は、 3D HNHA実験から得た3 J 結合定数および主
ΗΝ α
鎖ケミカルシフト分析プログラム TALOSに由来する (引用文献 #6)。
[0062] ΝΟΕ帰属および構造計算手順の各サイクルにおいて、 200個のランダムな配座異 性体を 30,000ステップでアニーリングし、最も低レ、標的関数を有する 20個の配座異性 体を次の ΝΟΕ帰属サイクルに選択した。最後に、 CYANAプログラムにより作製された 距離拘束を用いて、 CNSバージョン 1.1による構造精密化計算を行った（引用文献 #7) 。作製した 200個の配座異性体のうち、全エネルギーが最も低い 20個の配座異性体 を統計分析に用いた (表 1)。
[0063] ラマチャンドランプロットは、プログラム PROCHECK-NMR (引用文献 #8)を用いて計 算した。 表面静電ポテンシャノレは、ソフトウェア MOLMOL 2Κ.2 (引用文献 #9)を用い て計算した。
[0064] 細胞およびべクタ一の調製
ヒト胎児由来腎臓 (ΗΕΚ)細胞 293FTを Invitrogenより購入し、また 293-hTLR4A_HA 細胞を Invivogenより購入した。これらの細胞を、 10%熱不活性化ゥシ胎児血清 (Sigma )、ペニシリン（100 U/mL)およびストレプトマイシン (100 pg/mL)を添加したダルベッコ 改変イーグル培地（高グルコース含有 D- MEM； Invitrogen)で培養した。全ての細胞 は 37°Cで 5% COの混合気下でインキュベートした。 N末端に c-mycタグを付加した My
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D88の TIRドメイン (146-296)をコードする遺伝子を pcDNA3.1+plasmid (Invitrogen)べク ターにクローン化した。 MyD88の TIRドメインの突然変異させた配列は、 GeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis System (Promega)¾ レヽて作製し、酉己歹1 J分 ¾Π"をして 突然変異の存在を確認した。 C末端に AU1タグを付加した IL-18R ]3および MD2をコ —ドする遺伝子を、 pcDNA3.1+plasmidベクタ一にクローン化した。 4個の kB結合部位 を含む pGL3-Basic Vector (Promega)である NF- κ Βルシフェラ一セレポーターベクタ 一、および pcDNA3-Rlucである細胞数を補正するためのコント口一ルルシフェラ一ゼ ベクタ一は、 Sewon Ki博士およぴ古久保哲朗教授 (横浜市立大学)から寄贈を受けた [0065] 作製した MyD88 TIRの突然変異の説明は以下の通りである。極性残基からァラ- ンへ：全ての荷電アミノ酸 (Thr， Ser, Glu, Argおよび His)をそれぞれァラニンに置換 した。 Phe285， Trp286から Alaへ： Phe285および Trp286は保存された Box (ボックス） 3 配列中に存在し、機能的に重要であることが示唆されているので (引用文献 #10、 11) 、ァラニンに置換した。 MyD88の Pro200から Hisへ：マウス TLR4の TIRドメインのこの 位置における点突然変異 (Pro712His： Lps d突然変異)は宿主のリポ多糖 (LPS)への 免疫応答にとって決定的であることが示されたので (引用文献 #12)、この置換体を作 製した。 TLR2の TIRドメインにおけるこの部位のプロリンの重要性もまた指摘されてレヽ る (引用文献 #13)。
[0066] 一過性トランスフエクシヨンおよび NF - κ Bレポ一タ一遺伝子ルシフェラ一ゼアツセィ MyD88 TIRの機能的アミノ酸を検索するため、本発明者らは HEK293細胞系を用い て、 NF- κ Bの活性化がレポ一タータンパク質ルシフェラ一ゼの発現と結びついてい るアツセィ系を設計した。 IL- 18または LPSを用いた刺激の結果、細胞中の NF- κ Βは MyD88の下流で活性化され、これは細胞中にルシフェラ一ゼの発現をもたらす。 My D88は、 N末端 deathドメインおよび C末端 TIRドメインを含んでなる。 MyD88の TIRドメ インのみが単独で外因性に発現されると、それは内因性 MyD88と競合して IL - 1R、 IL -18Rおよび TLRと相互作用することが可能であり、細胞中でドミナントネガティブな阻 害剤として働くことが知られている (引用文献 #14)。トランスフエクシヨンの 1日前に、 HE K293FT細胞または 293- hTLR4A- HA細胞を 1.0 X 105個/ mLの密度で 6-ゥエルプ レート SUMILON CELLTIGHT C— 1 (SUMITOMO BAKELITE)に播レ、た。 Lipofectami ne 2000 (Invitrogen)を使用方法に従って用いて、 1.0 μ gの pcDNA3.1+コントロール ベクタ一または 1.0 μ gの PcDNA3.1+ myc-MyD88 TIRドメイン野生型または突然変 異体、 1.0 /i gの PCDNA3.1+ IL-18R j3 -AUlまたは 1.0 μ gの pcDNA3.1+ MD2-A Ul、 0.5 ;i gの NF- (c Bルシフェラ一ゼレポ一ターべクタ一、および 0.1 μ g ( pcDN A3-Rlucをトランスフエクシヨンした。全てのプラスミドベクタ一は、 EndoFree Plasmid axi Kit (QIAGEN)を用いて精製した。 12時間後、各培養培地を組換え IL-18 (100 ng AnL :本研究室で自作したもの (引用文献 #15))または LPS 0127 (1.0 μ g/mL, SIGM A)を含有する新鮮な培地と交換し、 6時間インキュベートした。次に、細胞を PBSで洗 浄し、受動的溶菌バッファー (Promega)を用レ、て集菌した。 Dua卜 Luciferase Reporter Assay System (Promega)を用いて、 NF- κ Bレポ一ター遺伝子活性化アツセィを実施 した。そして、 TECAN INFINIT 200マルチウエルプレートリーダ一を用いて、これらの ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 NF- κ B依存性ホタルリレシフェラーゼ活性を細胞 数で補正するためのコントロールの活性 (ゥミシィタケ 'ルシフェラ一ゼ活性)に対して 規準化した。コントロール、野生型おょぴ MyD88の全て突然変異体について、これら の各アツセィを 4回以上実施した。このレポ一ターアツセィにおレ、て観察されたドミナ ントネガティブ抑制作用の喪失は、ァラニンまたはヒスチジン置換によって引き起こさ れたタンパク質の不安定性によるものでも起こりうる。これらの可能性を除外するため 、本発明者らは次に突然変異体タンパク質の発現レベルをチェックした。同量のタン パク質を含む細胞抽出物を Lowry法によってチェックし、そして MyD88 TIRタンパク質 の全突然変異体は培養細胞中におけるそれらの発現レベルを、抗 myc抗体（Invitrog en)を用いたウェスタンブロッテイングによって確認した。 ECL-plus (Amersham)およ び発光撮影機 AE6970CP (ATTO)によって検出を実施した。 mycタグを付加した MyD 88タンパク質の定量には、濃度測定スキャニングを用いた。そして、細胞中で発現が 乏しいものはこれらのアツセイカも除外した。また、決定された構造情報から考えて側 鎖力 Sこのタンパク質表面に露出され得ないアミノ酸残基もこれらのアツセイカも除外し た。これらの実験に用いた全ての試薬およびサンプルは、 Endospecy ES-24S (生化 学工業）を用いてエンドトキシン汚染をチェックした。これらの実験に用いた全ての装 置は、パイロジェンを含んでいな力つた。
[0067] 統計学的分析
NF- κ Bレポ一ター遺伝子ルシフヱラーゼアツセィにおける野生型と各突然変異体 群との間の有意差は、ダネットの多重比較検定によって分析した。 P〈0.05で統計学 的に有意と推定した。
[0068] アミノ酸配列分析
MyD88タンパク質の等電点 (pi)は、 acVector ver. 9.0 (Accerlys)を用いて計算した 。 MacVectorに含まれている ClustalW ver.1.4プログラムをを用いて得た、 MyD88、 IL -1受容体ファミリ一および TLRファミリ一間の配列ァライメントを図 1に示す。相同性お - よび同一性スコアもまた、このプログラムを用いて計算した。
[0069] シクロへキシミドを用いた、 MyD88 TIRドメイン突然変異体のタンパク質発現および安 定性の評価
トランスフエクシヨンの 1日前に、 HEK293FT細胞 1.0 X 105個/ mLの密度で 6-ゥエル プレートに播いた。 1.0 /x gの pcDNA3.1+コントロールベクターまたは 1.0 μ gの pcD NA3.1+ myc- yD88 TIRドメイン野生型または突然変異体を、 Lipofectamine 2000を 用いてトランスフエクシヨンした。 24時間後、各培養培地を 25 μ πιο1/ίシクロへキシミド を含有する新鮮な培地と交換し、 37°Cで、 5% COの混合気下で、 0または 48時間イン
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キュべ一卜した (引用文献 #16)。これらの細胞を、 CytoBuster Protein Extraction Reag ent (Novagen)を用いて溶解した。細胞抽出物の全タンパク質濃度を Lowry法によつ て決定した。同量のタンパク質を含む細胞抽出物を、抗 myc抗体 (Invitrogen)を用い たウェスタンブロッテイングでチェックした。 ECL- plus (Amersham)および発光撮影 機 AE6970CP (ATTO)を用いて検出を実施し、 Mycタグを付加した MyD88タンパク質 の発現量を評価した。
[0070] 結果
溶液 NMRを用いた MyD88 TIRドメインの構造決定
TIRドメイン間の配列保存は、 3個の短いモチーフ（図 1の Boxl、 2および 3 29)に絞ら れ、そしてこれらのモチーフに焦点をあてた機能研究が各 TIRドメインについて行わ れている (引用文献 #10、 11、 17、 18、 19、 20)。 TIRドメインの構造的コアは、保存され た (F/Y) DAアミノ酸モチーフ力も始まる (引用文献 #19)。本研究においては、溶液 NM Rによる構造決定のために、ヒト MyD88の残基 148- 296からなる構築物が作製された。 ヒト MyD88の TIRドメイン (残基 157- 296)の立体構造を図 2に示す。最も低い全ェネル ギーを有する 20個の構造の統計値を表 1に要約する。上記 20個の構造の主鎖重原 子（N、 C cおよび C，）の距離二乗平均根偏差値 (rmsd)は 0.45オングストロームである (残基 157- 185、 188- 194および 203- 295を用いて重ね合わせた）。 N末端の 9個のァ ミノ酸 (148 - 156)は、この領域における中程度〜長距離範囲の NOESYクロスピークの 欠失によって示される、ランダムコイル傾向を示した。よって、これらの残基は図から 除外した。 2D Ή-1δΝ HSQCスペルトルにおいて、 G201を除く D195から C203までの残 基についてアミドクロスピークが欠失しており、これは BB-ループと対応している（図 1) 。側鎖プロトンの一部が観察され、この BB-ループ領域に帰属された力 NOESYクロ スピークの数は不十分で、この領域にっレ、ては構造収束 (convergence)が比較的悪 かった。 15Nヘテロ核 NOE実験は、これらの欠失した残基 G201、 V204および S206 の近くに存在する残基のアミド基が比較的低い NOE値を示す（それぞれ 0.67、 0.55お よび 0.67)ことを示した。これは、 BB-ループがおそらく堅固なコンホメ一シヨンをとつて おらず、溶液状態では緩やかに構造が保たれてレ、ることを意味する（図 2A)。
[0071] MyD88 TIRドメインの構造説明および他の TIRとの比較
MyD88 TIR(157-296)の構造は、 4本の αヘリックス（ a A- ct C、および α Ε)に囲ま れた、中心部に位置する 5本のストランドからなるパラレル シート（ /3 A- ]S Ε)を構成 する。予測されたように、全体的な折りたたみは、以前に決定された TIRドメインの結 晶構造と本質的に同一であった (PDBコード： 1FYV, 1FYWおよび 1T3G) (図 2B)。 MyD88 TIRは、他の TIRタンパク質と比較して、 TLR2 TIRのアミノ酸配列と最も相同 性が高い（MyD88 TIRおよび TLR2 TIR間の同一性スコアは 22%で、相同性スコアは 4 8%である）。図 2Cおよび 2Dは、 MyD88 TIRおよび TLR2 TIRを重ね合わせて表したも のである（PDBコード： 1FYW)。 ]3シートコアの構造は、相互に類似している（この部 分の主鎖 N、 C aおよび C，に対する rmsd値は 0.90オングストロームである）力 レ、くつ かの領域では注目すべき非類似性が示された。 BB-ループ（MyD88 TIRの Serl94_C ys203)およびそれに続く α Βまでの残基には、大きな構造的不一致が存在する（図 2 D)。 MyD88および TLR2の両方において BB-ループは溶液に露出されている力 ル —プが向いている方向は大きく異なる。これは、 MyD88の α Βに先行する残基 (MyD8 8の Trp205-Ser209)の構造的相違によって主として引き起こされる。これらの残基は、 MyD88において伸長された βストランド様構造をとっている力 他方 TLR2において対 応する残基は αヘリックス（ α Β)内に存在し、 MyD88の α Βを有意に短くしてレ、る。こ の βストランドは、 ΒΒ -ノレ一プを TLR2 TIRにおいて見られる方向とは全く異なる方向 へ向けることになる。
[0072] この伸長された βストランドは、 15N edited 3D NOSEYスぺクトノレにおけるクロスピーク のパターンによって十分支持される。この 3D NOSEYスペクトルにおいて、一連の NO Eクロスピークの強度（H a (i)から HNG+1))は、残基内強度（H α (i)から HN(i))よりも有 意に強かった。 C αおよび C βのケミカルシフト値もまた、この二次構造を支持した。
[0073] MyD88は TLR2に存在する a Dヘリックスの代わりに長いループ（DD- DEロングル一 プ)を有する。配列ァライメントにおいて、ひ Dが存在する領域に多数のギャップが見 い出されたため、 a Dの欠失は予測された。（図 1)。しかし、この長いループには、 α ヘリックスに類似した短いヘリックスコイルコンホメーシヨン (Ρ265- 1271)が存在する。
[0074] TIRドメインの表面特性の比較： MyD88 TIRおよび他の TIR
図 3は、 TIRドメインの表面静電ポテンシャルを示す。 MyD88 TIRの全体的な蛋白構 造の折りたたみは他の TLR TIRドメインに類似しているにも力かわらず、表面静電ポ テンシャルには顕著な相違が見られる。特に、 MyD88 TIRの Box3には大きな陽性ポ テンシャル領域が認められる。実際、 MyD88 (148-296) TIRドメインの計算された等 電点 (pi)は 9.25 (全長 MyD88では 5.79)なので、このドメイン自体が陽性に荷電されて いる。 MyD88は細胞の細胞質に存在する (引用文献 #21)。 yD88 TIRの大きい陽性 ポテンシャル領域は、このドメインが陰性に荷電された細胞膜を標的とするのを容易 にするであろう。それは、シグナルリガンドが IL- 1R/IL-18R/TLR等の膜受容体と結合 したときに、このドメインがそれら膜受容体と結合するのを促進するであろう。 Box3とは 対照的に、 BB-ループを含む Box2領域は、狭い陰性ポテンシャルに覆われる領域を 形成している。
[0075] NF- c B活性化アツセィ
MyD88 TIRの機能に関する洞察を得るため、本発明者らは IL - 18および LPSで刺激 した後に NF- κ Bレポーター遺伝子アツセィを実施した。本発明者らは、以前に刊行 されたデータに基づいて、 myc_MyD88 TIRに単一アミノ酸置換を組織的に導入し、 I L-18または LPS刺激後のルシフェラ一ゼ活性を定量した。 NF- κ B活性は、細胞中の MyD88の機能に対する突然変異の作用を反映するであろう。選択された 25個の荷電 極性アミノ酸と 3個の疎水性アミノ酸力 なるァラニン置換突然変異体を評価した (表 2)。 IL-18を用いた NF- κ Bルシフェラーゼレポ一タ一アツセィの結果を図 4Aに示す。 この図に示すように、ドミナントネガティブ遺伝子をトランスフエクトしな力 た対照細 胞では、 IL-18刺激の結果、ルシフェラーゼ活性が約 3倍に増大した。対照的に、野 生型 myc-MyD88 TIRを細胞中で過剰発現させると、 NF- κ Β活性の重大な増加は見 られず、これは当該タンパク質のドミナントネガティブ阻害作用を示している。レ、くつ かの突然変異体（例えば、 R196A, Κ238Α, R288A)は、 NF- κ Β活性の重大な増加を 示した。これは、ドミナントネガティブ阻害作用の喪失を意味し、突然変異させた残基 のタンパク質-タンパク質相互作用における重要性を示している。突然変異体のドミ ナントネガティブ阻害作用は、統計学的分析により野生型と各変異体とを比較してか ら有意と判定された。 MyD88は一般に、 IL-1R/IL-18R/TLRシグナル伝達およびさら に多種類の分子（ただし、 MyD88に結合可能な IRFファミリ一等の TIRドメイン含有受 容体を除く）にリクルートされる (引用文献 #22、 23、 24)。
[0076] ひとつの分子が複数の蛋白と相互作用可能であることおよびそのようなシグナル多 様性の土台をなす機構は、非常に興味深い。 IL-18の場合と同様に、 LPS/TLR4シグ . ナル伝達もまた MyD88によって媒介され、 NF- κ Β活性化をもたらす。それゆえ、本 発明者らのレポーターアツセィ系を TLR4シグナル伝達の研究に適用することができ る。レポ一ターアツセィの結果を図 4Βに示す。ドミナントネガティブ阻害作用は、 IL-1 8で刺激した場合も LPSで刺激した場合も、突然変異体 R196A、 D197A (BB -ループ の突然変異)、 R217A (BC -ループ)および K282A、 R288A ( α E)において共通して 消失した。さらに、 IL-18に特異的なドミナントネガティブ阻害作用の消失は、 K214A ( BC-ループ）、 238Α ( a C，）および R269A (DD-DE長ループ)に観察された。これ らのレポーターアツセィの結果および TIRタンパク質の機能に関する以前のリポートを 以下に要約する。
[0077] Boxl :保存された Boxl領域は、 IL-18および TLR4シグナル伝達の両方において 重要な役割を果たすものではなレ、。なぜなら、レポ一タ一アツセィにおいて何ら重要 な変化が検出されなかったからである。最近、 IRF-1/4/5とのある相互作用力 この 領域を含む MyD88の一部分について報告された (引用文献 #22、 23、 24)。この領域 は NF- κ Bではなぐインタ一フエロン産生のシグナル伝達系に寄与しているの力もし れない。また、 Boxl領域に隣接して、 R217Aは顕著なドミナントネガティブ阻害作用 の喪失を示し、機能的に重要である。 [0078] Box2 (BB-ループおよび Pro200):初期の研究は、 TLRの TIRドメインの BB-ループに 存在する保存されたプロリンの重要性を示した (引用文献 #12、 18)。 Liらもまた、 MyD 88の Box2における突然変異力 TIRドメインを介する同型な MyD88オリゴマー化を阻 止したと報告してレ、る (引用文献 #10)。 BB -ループの重要性は、本発明者らのレポ一 タ一アツセィで確認された。なぜなら、 R196Aおよび D197Aにおいて重大な効果が観 察された力もである（図 5A：)。また、この領域力TIRドメイン蛋白の機能に重要であるこ とを示唆する情報として、 TLR2の Arg677 (MyD88の R196に対応する）は、ハンセン病 患者において Trpに変わることが見い出された力もである (引用文献 #13)。 yD88 TIR の BB-ループ領域の構造は、 TLR1および TLR2の TIRドメインの結晶構造に見られる ものとは全く異なっていた（図 2Cおよび 2D)。 NMR実験は、 MyD88 TIRドメインの BB- ループにおけるフレキシビリティーの存在を提案した。このことが当該ドメインに機能 的多様性をもたらすのカ^しれなレ、。なぜなら、フレキシブルな構造は、相互作用の パートナーに比較的広い特異性を許すからである。実際、 MyD88 TIRは多数の異な る TIRドメインと相互作用することが知られている。 P200H突然変異の効果もまた、わ れわれの研究で試験した。爽味深レ、ことに、この突然変異は IL-18シグナル伝達に特 異的に影響するが (R丄. U.値： mean土 s.d.， 1.79±0.21)、 TLR4シグナル伝達には影 響しなレ、 (R丄. U.値： mean土 s.d.， 1.24±0.26)。このことは、この保存されたプロリンが 、 TIRタンパク質間の相互作用に必要ではあるが十分ではなレ、ことを意味する。 Brow nおよび Dunneは、このプロリンカ ^IR相互作用に常に必須な訳ではないと述べた（ 引用文献 #17、 25)。
[0079] α B and BC loop:この領域に存在する数個のアミノ酸の重要性もまた Ronni et al. ( 引用文献 #20)によって TLR4 TIRについて提案されている。 この領域では、 MyD88の 詳細な構造は、他の TIR構造と比較して特徴的である。 α Βヘリックスは他の TIR構造 と比較して短く（構造説明の項を参照）、そしてこのへリックスに続く BC-ループはより 長レ、。本発明者らは BC-ループ領域で、 K214A、 R215Aおよび R217Aについてァラ ニン置換変異体を作製した。この領域で、 K214Aは IL- 18シグナル伝達に特異的な 効果を示した。 R217Aは、上記刺激の両方に対して重大な効果を示した。古典的に は、 Boxl、 Βοχ2および Βοχ3と呼ばれる TIRドメインの間で保存されたアミノ酸配列は、 TIRドメインの機能的に重要な部位であると言われていた。 R217は、 Boxlの F/YDAモ チーフを構成する D162の隣接アミノ酸である力 本発明者らはこの BC-ループ領域 力 MyD88 TIRの新しい相互作用部位の 1つであることを決定した。さらに、この領域 におけるこれらのアミノ酸の選択性は、 MyD88と直接相互作用する膜受容体におけ るアミノ酸残基の違いに由来する力もしれない。
[0080] a C : TLR2の BB-ループ、 a C 'および DD-ループに突然変異を数個導入すると、 ペプチドダリカンによって刺激された NF- κ B活性が失われると報告されている (引用 文献 #26)。さらに、ヒト IL-1RAPLの TIRドメインの二量体構造において、 TLR2の Cys7 13に対応する Ser488は、二量体界面の中心に位置する他の一量体の等価な Ser488 'と堅固な水素結合を形成する (引用文献 #27)。本発明者らの研究において、 a C 'に おける K238から Alaへの置換の効果は、 IL- 18シグナル伝達に特異的な効果を示し 、 LPSシグナル伝達には影響しなかった（図 5)。ただし、 K231A、 E232Aおよび D234 Aは NF- κ B活性の重大な効果を示すことが出来なかった。
[0081] a D:他の TIRドメインの a Dに対応する αヘリックスは、 MyD88 TIRには認められなか つた。このへリックスの欠如は、 TIRドメインの配列ァライメント（図 1 )によれば驚くにあ たらない。このァライメントでは、 i3 Dと J3 E間の領域の多数のギャップが見い出される 。 DD-DEロングループの Arg269を Alaに置換した場合、ドミナントネガティブ作用の喪 失が IL-18刺激に特異的に観察されたが、 LPS刺激に対しては観察されな力つた（図 5B)。 TLR2において同じ部分に相当する Argが Ginに置換された突然変異は、ブドウ 球菌感染に対する免疫不全を弓 Iき起こすことが報告されている (引用文献 #28)。
[0082] Βοχ3 ( α E helix): a Eもまた、 TIRドメインの間でアダプタ一-アダプタ一および受容 体-受容体オリゴマー化を媒介することが報告されてレ、る (引用文献 #10、 11)。 α Εに 含まれる極性残基をァラニンに置換させた場合 (Κ282Αおよび R288A)、本発明者ら の研究では IL-18刺激および LPS刺激の両方とも重大な効果をきたした（図 5)。 F285 およ I W286は TIRドメインの間で 存されており、 FWモチーフと呼ばれている。この FWモチーフにおけるァラニン置換は二量体形成にとって決定的であると以前に報告 されてレ、ることは注目に値する。しかし、 F285Aはレポーターアツセィにおいて、ドミナ ントネガティブ作用に対して何ら影響を示さなかった (R丄. U.値： mean土 s.d., IL-18: 1.04±0.10, LPS: 1.17±0.13)。そして、本発明者らは W286について全く情報を得る ことができな力つた。なぜなら、 W286A変異体タンパクは細胞中で非常に不安定だつ た力 である。本発明者らは、シクロへキシミド法を用いて、 W286Aタンパク質発現レ ベルおよび安定性を確認した（図 6)。
[0083] 考察
TLR TIRおよび MyD88 TIRの構造
TIRドメインは、典型的には 135〜160アミノ酸によって構成される。 TIRドメイン間の 配列保存は一般に 20から 30%の間であり、そして保存された残基のほとんどは、 5本の ストランドからなるパラレル i3シートによって構成される疎水性コア内に存在する。そ の長さの違い、および TIRドメイン間のアミノ酸配列におけるかなりの変化は、このドメ インの構造的および機能的多様性を示唆する。現在、 TIRドメインについて 3つの構 造 (TLRl, TLR2および IL- 1RAPL)が入手可能である力 これらはすべて受容体の ものである。本研究は、細胞アダプタ一タンパク質由来の TIRドメインの最初の構造決 定である。 MyD88 TIRは、受容体 TIRに対しかなりの類似性を示す（図 2Cおよび 2D) 。しかし、「結果」の項に記述したように、構造には相違点が認められる。 BB -ループ に認められる構造上の不一致は、顕著でかつ興味深レ、（図 2D)。これは TIRドメインの 機能的多様性を意味する。なぜなら、多数の研究力 Sこれらの領域 (Box2に対応する（ 引用文献 #10、 11、 18、 19、 20))の機能的重要性を提案してレ、る力もである。他の構 造不一致領域 ( c B, BC-ノレ一プおよび DD- DE長ループ)もまた、機能的に重要であ る。さらに、 MyD88 TIRの表面における大きい陽性荷電領域の存在は興味をそそるも のであり、これは MyD88の機能と関連してレ、るの力もしれなレ、。
[0084] MyD88のマルチ相互作用部位および MyD88 TIR: IL- 18 vs LPS/TLR4 MyD88に関 して示された受容体特異的シグナル伝達
MyD88は、細胞中の IL- 1R/IL-18R/TLR媒介シグナル伝達経路に通常使用されて いる。しかし、細胞の応答はどの受容体が刺激されたかによって異なる。したがって、 MyD88のもとで細胞の運命を分ける、ある種の作用機構が存在するはずである。 IL- 1R/IL-18R/TLR媒介シグナル伝達における MyD88のシグナル伝達機構を解明する 目的で、本発明者らは培養細胞を用いて MyD88の機能分析を実施した。その結果 に基づいて、本発明者らは IL-18刺激おょぴ LPS刺激の両方にとって重要な数個の 残基を同定することができた。図 5においては、 yD88 TIR構造の表面にレポーター アツセィの結果がマッピングされている。この図には荷電残基のみをマッピングしたこ とに注意されたレ、。緑色に着色したアミノ酸残基は、 IL- 18および LPSシグナル伝達に 重要であると判断された。茶色に着色したアミノ酸残基は、活性に何ら影響を及ぼさ ない残基を示す。 3つの相互作用部位（保存された Box2、 Box3および BC -ループの 終末）は、 IL- 18および LPS/TLR4経路の両方で同定された。さらに、 IL- 18シグナル 伝達において 1つの特異的な表面が同定された。 BC-ループの一部、ひ C 'ヘリック スおよび DD- DEロングループは、 MyD88 TIRドメインの分子表面でごく近位に存在し た。 TLR2 TIRに関する別の研究もまた、 C713S、 L717E (これらは a Cに存在する） および R748E、 R748S (これらは DDループに存在する）カ NF- κ Β活性をダウンレギ ユレーシヨンすることを示した。その著者らは、このダウンレギュレーションは変異導入 によって引き起こされるこの領域での TLR2ホモ二量体化の抑制によるものであると提 案した (引用文献 #26)。本発明者らのレポーターアツセィは、これらの報告とよく一致 した。 c C '近傍に群がる 3個の塩基性残基（Lys214, Lys238,および Arg269)は、 IL -18シグナルに対して重大な効果を示した。しかし、これらの残基は LPS-TLR4シグナ ノレ伝達には関与しない。本発明者らは、 IL-18または LPSに対する特定の細胞応答 は、 MyD88 TIRドメインの異なる相互作用表面と関連しているらしレ、と推定する。 MyD 88下のシグナル多様性の理由の一部は、この表面パッチに帰する力もしれない。 本研究において、本発明者らは溶液 NMR分光法を用いて、ヒト MyD88 TIRドメイン の溶液構造を決定した。これは、細胞アダプタ一分子の TIRドメインとして初めて明ら かにされた構造である。本発明者らはまた、培養細胞系を用いて MyD88 TIRドメイン の機能アツセィを実施した。これらのデータは、このドメインの保存された Boxl、 Box2 および Box3領域は、 IL-18および LPS経路の両方にとって重要な相互作用部位であ ることを明ら力 4こするものである。さらに、 a C 'およびその近傍に群がる 3個の塩基性 残基からなる 1つの表面は、もっぱら IL-18シグナル伝達のために機能しており、 TLR 4シグナル伝達のためには機能しない。最近、 IL-18の広範な免疫調節機能 (IFN - γ の誘導および Thl分化の増強のみならず、 IgE抗体の誘導およびアレルギー性反応 との関連を含む (引用文献 #29、 30、 31、 32、 33))が報告されている。特に興味深いの は、 IL-18シグナル伝達を正確にコントロールすることである。なぜなら、それは慢性 炎症性疾患およびアレルギー性疾患の治療に寄与すると考えられるからである。本 研究により MyD88について得られた構造情報および機能情報は、受容体と MyD88と の相互作用を調節することができる、免疫不全疾患のための薬剤の開発に寄与する 。種々の TIRドメインの複合体の構造決定に関して今後さらなる研究が期待される。さ らに、 MyD88 TIRドメインと他の分子（IRF-1, IRF-4, IRF- 5および IFN- y Rl)との相 互作用が最近報告されている (引用文献 #22、 23、 24、 34)。これらの相互作用の解明 もまた将来期待されてレ、る。
[表 1] 表 1 MyD88の TIRドメインの NMR及び統計的精密化パラメ一ター
タンパク質
NMR拒離及び二面角制眼
距離制限
全 NOE 3119
残基内 773
残基間
連鎖 (I I - 1) 937
中位 (|i-j 4) 663
遠位 (|i-j > 5) 746
水素結合 66
全二面角制限 172
phi 84
psi 88
構 ϊβίΚΐΤ
バイオレーション (平均及び s.d.)
矩離制限値 (A) 0.0109 ± 0.0002
二面角制限値 (°) 0.1089 ± 0.0162
最大二面角制限値 O < 3.0
最大距離制限値 (A) < 0.3
理想的ジオメトリーからの逸脱
結合長 (A) 0.0018 ± 0.00004
結合角 (°) 0.3436 ± 0.0039
不適切角 (°) 0.2116 ± 0.0055
平均構造からの平均 r.m.s.d.** (A)
残基 157-296
重原子 1.34
主鎖 0.71
残基 157-185, 188-194, 203-295
重原子 1.02
主鎖 0.45
"平均 rm.s.d.は、 平均構造と 20個の精密化構造の逸脱度合いを計算したもの。
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s 〔s〕0087
表 2 MyD88 TIRドメイン内のアミノ酸置換を行った 28種類のアミノ酸一覧
Figure imgf000038_0002
8933-9 (2004).
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産業上の利用可能性
[0088] 本発明は、抗エンドトキシンショック療法の一つとしての臨床応用の可能性がある。
また、本発明は、研究目的の遺伝子試薬として、 ToU様受容体及び IL-1/18シグナ ノレ伝達の研究を行う上で有益である。
さらに、タンパク立体構造に基づいた変異導入部分の情報は、 IL-18作用を特異的 に修飾する創薬ターゲットとしても有用である。
配列表フリーテキスト
[0089] <配列番号 1〉
配列番号 1は、ヒト MyD88 TIRドメインのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号 2 >
配列番号 2は、ヒト MyD88 TIRドメインのアミノ酸配列を示す。
ぐ配列番号 3 >
配列番号 3は、 yD88 TIR K238Aのヌクレオチド配列を示す。
ぐ配列番号 4 >
配列番号 4は、 yD88 TIR K238Aのアミノ酸配列を示す。
<配列番号 5 >
配列番号 5は、 yD88 TIR R269Aのヌクレオチド配列を示す。
ぐ配列番号 6 >
配列番号 6は、 MyD88 TIR R269Aのアミノ酸配列を示す。
ぐ配列番号 7 >
配列番号 7は、 MyD88 TIR K214Aのヌクレオチド配列を示す。
<配列番号 8 >
配列番号 8は、 MyD88 TIR K214Aのアミノ酸配列を示す。

Claims

請求の範囲
[I] 以下の (a)、（b)若しくは (c)の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩。
(a)酉己歹 IJ番号 2のアミノ酸酉己歹 IJにおいて、 214番目のリシン、 238番目のリシン及び 26 9番目のアルギニン力 なる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸が他のアミノ酸 に置換されているアミノ酸配列力 なるタンパク質
(b) (a)のタンパク質のアミノ酸配列において、 214番目のアミノ酸、 238番目のアミノ酸 及び 269番目のアミノ酸以外の 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたアミノ酸配列力 なり、かつリポ多糖刺激のシグナルは阻害する力、インタ一ロイ キン 18刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
(c)配列番号 3、 5又は 7のヌクレオチド配列力 なる DNAに相補的な DNAとストリンジ ェントな条件下でハイブリダィズする DNAによりコードされ、かつリポ多糖刺激のシグ ナルは阻害する力 インターロイキン 18刺激のシグナルは阻害しないタンパク質
[2] (a)の他のアミノ酸がァラニンである請求項 1記載の MyD88 TIR変異体タンパク質又は その塩。
[3] ヒト由来の野生型 MyD88 TIRタンパク質の変異体である請求項 1又は 2記載の MyD8
8 TIR変異体タンパク質又はその塩。
[4] ヒト以外の動物由来の野生型 MyD88 TIRタンパク質の変異体である請求項 1又は 2 記載の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩。
[5] 配列番号 4又は 6のアミノ酸配列からなる請求項 1記載の MyD88 TIR変異体蛋白質 又はその塩。
[6] 請求項 1記載のタンパク質をコードする単離された DNA。
[7] 請求項 6記載の DNAを含有する組換えベクター。
[8] 請求項 7記載の組換えベクターを含む形質転換体。
[9] 請求項 6記載の DNAで形質転換した宿主を培養し、培養物力も MyD88 TIR変異体タ ンパク質を採取することを含む MyD88 TIR変異体タンパク質の製造方法。
[10] 請求項 1記載の MyD88 TIR変異体タンパク質若しくはその塩又は請求項 1記載の My D88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAを有効成分として含有する医薬組成物。
[II] 請求項 1記載の MyD88 TIR変異体タンパク質をコードする DNAがべクタ一に組み込 まれている請求項 10記載の医薬組成物。
[12] 請求項 1記載の MyD88 TIR変異体タンパク質又はその塩に対する抗体。
[13] インタ一ロイキン 18作用を特異的に修飾する薬剤をスクリーニングする方法であって 、配列番号 2のアミノ酸配列からなる MyD88 TIRの 214番目のリシン、 238番目のリシ ン及び 269番目のアルギニンからなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸と前 記薬剤の候補物質との結合の有無を調べることを含む前記方法。
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