WO2009016326A2 - Vecteurs viraux adéno-associés pour l'expression de la dysferline - Google Patents

Vecteurs viraux adéno-associés pour l'expression de la dysferline Download PDF

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WO2009016326A2
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to the treatment of dysferlinopathies.
  • the dysferlinopathies are due to mutations in the DYSF gene encoding the dysferlin protein and correspond to three clinically distinct diseases (9) (17): type 2B belt dystrophy (Limb-Girdle Muscular Dystrophy, LGMD2B, OMIM 253601); distal myopathy of Miyoshi (Miyoshi Myopathy, MM, OMIM 254130); and - myopathy of the distal anterior compartment (Distal Anterior Compartment
  • the first two phenotypes are characterized by high levels of creatine kinase and slow progression of muscle weakness.
  • LGMD2B the proximal muscles of the limbs and trunk are the most affected, while in the MM, the distal muscles of the lower limbs are affected.
  • the DACM is initially distal, with involvement of the muscles of the anterior part. The disease is rapidly progressive, leading to severe weakness of the proximal muscles.
  • DYSF is located in the chromosomal region 2p13 and belongs to the category of large genes since it is composed of 55 exons extending over 150 kb of genomic DNA and is transcribed into a messenger of 6.5 kb (5) (11).
  • the DYSF gene although expressed in various tissues such as the brain and lungs, is primarily expressed in skeletal muscle, heart and monocytes / macrophages (2).
  • Dysferlin is a 237 kDa protein composed of 2080 amino acids, including a C-terminal transmembrane domain and a very long N-terminal cytosolic domain. It contains six C2 domains (also called calcium-sensors), which extend along the protein and are involved in the fixation of calcium and phospholipids, such as phosphoinositides (14). The dysferlin also contains two specific central domains (the dysferlin domains), the function of which is still unclear.
  • dysferlin is a membrane protein in the fibers of adult skeletal muscle and is expressed from the 5-6 th week of embryonic development (2).
  • Dysferlin belongs to the multiprotein family of ferlines, of which several members have been identified, such as myoferline. They all have structural similarities and contain, in particular, C2 domains. In addition, dysferlin is highly conserved among mammals (5).
  • dysferlin interacts with different proteins such as: Caveolin-3 (12), whose mutations are responsible for LGMD1C (OMIM 607801); Calpain-3 (8), the mutated gene in LGMD2A (OMIM 253600); Annexins I and II (10); affixin (beta-parvin), a novel integrin-binding kinase-binding protein (13); and the dihydropyridine receptor (1); - Ahnak (20).
  • Caveolin-3 (12) whose mutations are responsible for LGMD1C (OMIM 607801); Calpain-3 (8), the mutated gene in LGMD2A (OMIM 253600); Annexins I and II (10); affixin (beta-parvin), a novel integrin-binding kinase-binding protein (13); and the dihydropyridine receptor (1); - Ahnak (20).
  • dysferlin plays a key role in the repair of the sarcolemma, as observed in human
  • the best vectors at present for transfection of muscle are derived from adenovirus-associated viruses (AAV).
  • AAV adenovirus-associated viruses
  • the size of the dysferlin cDNA precludes its direct incorporation into an AAV vector.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising recombinant adeno-associated viral vectors (AAV), advantageously two in number, carrying complementary constructs allowing the expression of a functional dysferlin.
  • AAV adeno-associated viral vectors
  • a first AAV vector comprises: i) a 5 'ITT (Inverted Terminal Repeat) sequence of AAV; ii) a portion of gene placed under the control of a promoter; iii) a sequence comprising a splice donor site; iv) a 3'ITR sequence of AAV.
  • the second AAV vector comprises: v) an AAV 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) sequence; vi) a sequence comprising a splice acceptor site; vii) a portion of the gene; viii) a 3'ITR sequence of AAV.
  • AAV vectors which may be in the same composition or be packaged in two separate compositions, carry complementary sequences which will be made to constitute a functional unit at the time of the concatamerization.
  • This intermediate is in the form of an intermediate, called concatemer, already isolated and characterized in the prior art.
  • ITR Inverted Terminal Repeat
  • AAV RTIs are a T-shaped hairpin structure. These sequences are essential for AAV genome replication, replication and packaging of virus particles. According to the invention, and in a known manner, vectors with non-homologous ITRs are chosen, in order to promote concatemerisation so that the intermolecular recombination is oriented towards the adjacent association of complementary heterodimers.
  • the joining of the gene portions carried by the first and second AAV vectors comprises an open reading frame which encodes a functional dysferlin.
  • functional dysferlin is a therapeutic protein for the treatment of dysferlinopathies.
  • such a protein must satisfy the membrane repair test described by Bansal et al. (21), and even more advantageously to that of muscle function including an evaluation of the activity time, the distance traveled and the average speed described in the present application.
  • It may, of course, be the complete native protein (comprising 55 exons), in particular human, but also a mini-dysferlin (devoid of certain repetitive patterns) or a mutated dysferlin maintaining a therapeutic activity.
  • the gene portions correspond to exons.
  • the gene portions are preferably cDNA fragments.
  • exons 1 to 55 of human dysferlin are amplified from a vector listed in GenBank under number NM 003494.
  • the reading frame constituted by the union of the two AAVs encodes the sequence SEQ ID 16 (AN 075923) corresponding to the human dysferlin, in particular described in publications (5) and (11), or a derivative or an active fragment of that -this.
  • the term "derivative” or “fragment” is intended to mean a protein sequence exhibiting at least 60%, preferably 70%, even more preferably 80% or even 90% identity with the sequence SEQ ID 16.
  • Dysferlines of other origin are thus targeted ( non-human mammals, ...) and mini-dysferlines.
  • the first vector advantageously carries the 5 'part of the gene, while the second vector carries the 3' part of this same gene.
  • dysferlin consists of 55 exons, it has been determined by the inventors that, in order to have portions of this gene that are compatible with the size of AAV packaging, cleavage must be performed between the exons. and 41 of the dysferlin.
  • the first AAV vector advantageously contains the portion of the human dysferlin gene ranging from exon 1 to exon x, while the second AAV vector contains the portion ranging from exon (x + 1) to exon 55, with x ranging from 18 to 41. Even more preferably, the first AAV vector contains exons 1 to 28 and the second AAV vector contains exons 29 to 55 of the human dysferlin gene.
  • the portion of the 5 'gene, ie that carried by the first AAV vector, is placed under the control of a functional promoter.
  • a functional promoter may for example be the synthetic promoter C5-12, well known to those skilled in the art and more particularly adapted to the muscle expression of genes.
  • it may be the Pdesmine promoter, derived from the promoter of the gene encoding desmin.
  • the combination of the sequence comprising the splice donor site and the sequence comprising the splice acceptor site contains all the elements necessary for splicing.
  • these are advantageously derived from a native intron of the dysferlin gene.
  • one of the vectors according to the invention provides a splice donor site and the other a splice acceptor site.
  • a native intron is "simply cut" into two fragments, the portion comprising the splice donor site being naturally located downstream of the 5 'portion of the gene fragment in the first AAV vector and the portion comprising the splice acceptor site being naturally located upstream of the 3 'portion of the gene fragment in the second AAV vector.
  • the combination of the sequence comprising the splice donor site and the sequence comprising the splice acceptor site thus corresponds to a native intron of the human dysferlin gene, advantageously one of the introns chosen from among the introns. 18 to 40, and still more preferably intron 28 (SEQ ID 12). This is for example the case when the cleavage is carried out between nucleotides 140 and 141 of this intron 28.
  • the sequences containing the donor and splice acceptor sites may not be strictly identical to the native intron, in particular because of deletions or substitutions linked to their cloning in the AAV vectors according to the invention. Therefore, the concept according to the invention relates to the fact that the elements necessary for splicing, namely the splice donor and acceptor sites, the branch points, but also the ESE sequences. ("Exonic Splicing Enhancer”), are preserved.
  • the targeted introns advantageously introns 18 to 40 of the human gene and even more advantageously intron 28, contain at least 70% of their sequence potentially involved in splicing.
  • the combination of the sequence comprising the splice donor site and the sequence comprising the splice acceptor site thus has at least 70%, preferably 80%, even more preferably 90% or even 95% identity with the sequence. of the native intron.
  • intron 28 In the particular case of intron 28, the combination of these two sequences has the sequence SEQ ID 13. The latter has 97% identity with the native sequence of intron 28, naturally located between exons 28 and 29 ( SEQ ID 12).
  • the first AAV vector has, as a sequence comprising a splice donor site, the sequence SEQ ID 14, whereas the second vector AAV has, as a sequence comprising a splice acceptor site, the sequence SEQ ID 15.
  • the second AAV vector carries downstream of the portion of the dysferlin gene a polyadenylation signal, for example the polyA of SV40.
  • Both vectors can be used for the in vitro production of dysferlin in cells.
  • these cells are muscle cells, more advantageously derived from mammals, in particular of human origin.
  • AAV-type plasmids which comprise elements i) to iv) or v) to viii) as defined above, and therefore ITR sequences, but lack the sequences. coding for Cape and Rep.
  • the invention therefore also relates to a method for producing dysferlin in vitro in cells, comprising contacting the cell with a composition containing the vectors or recombinant AAV plasmids according to the invention.
  • the two vectors or plasmids are introduced simultaneously or sequentially into the cells, in particular by transfection.
  • the conditions of the cell culture are adjusted by those skilled in the art so that concatamerization, splicing and expression of the dysferlin gene take place: vector or plasmid maintenance, promoter activity, etc.
  • the recombinant AAV vectors as described in the present invention have obvious applications, particularly in the therapeutic field.
  • the invention relates to the use of a composition, comprising a single or both AAV vectors as defined above, as a medicament.
  • compositions comprise the AAV vector (s) associated with a pharmaceutically acceptable and inert carrier.
  • a pharmaceutically acceptable and inert carrier e.g., a pharmaceutically acceptable and inert carrier.
  • excipients, stabilizers, and other suitable compounds known to those skilled in the art can be envisaged in such a composition.
  • composition according to the invention When the composition according to the invention is to be injected into the diseased muscles, it is preferably in liquid form.
  • the determination of the vector concentration, the quantity to be injected and the frequency of the injections is a matter of common practice for those skilled in the art.
  • Another preferred mode of administration according to the invention is systemic administration.
  • Such drugs are especially intended for gene therapy, in particular for the treatment of dysferlinopathies.
  • the two vectors according to the invention may be packaged in the same drug or alternatively may be the subject of two different drugs.
  • the present invention therefore provides a therapeutic solution for the treatment of dysferlinopathies with the advantage of being simple, safe and effective.
  • This example therefore relates to the use of two AAV vectors capable of concatemériser, allowing the production at a therapeutic level of a functional dysferlin.
  • the strategy used is illustrated in Figure 1. It implements two independent AAV vectors, one carrying the 5 'portion of the cDNA with an intron sequence containing a splice donor site, and the other carrying an intron sequence with a splice acceptor site followed by the 3 'part of the cDNA.
  • the expression of the protein is obtained after co-administration of the two vectors, concatemisation of the viral genomes and splicing between the two splice sites.
  • Figure 1 Diagram of the strategy adopted in the context of the invention.
  • Figure 2 Diagram of the cDNA of the dysferlin and the region compatible for cleavage. The boxes represent the different exons.
  • Figure 3 Strategy used to cleave and clone both parts of the dysferlin cDNA.
  • Figure 4 Sequence of intron 28 and position of the cleavage site in the intron (x). Nucleotides in bold are not expected to participate in ESEs.
  • Figure 5 Diagram of the two recombinant AAV vectors used in the invention.
  • Figure 6 A / Gel electrophoresis of the PCR product of the junction.
  • a GFP-Dysferline plasmid was used as a positive control of amplification.
  • B quantitative RT-PCR. The results are presented according to the Ct ratio of dysferlin with
  • Figure 7 RT-PCR analysis of the injected muscles.
  • Figure 8 Analysis of muscles injected by western blot.
  • a / J are deficient models of dysferlin and C57b6 are normal mice.
  • Figure 9 Measurement of the messenger rate of dysferlin produced in injected muscles over time.
  • Figure 10 Western blot detecting dysferlin protein in muscles over time. For each point, three mice were analyzed.
  • Figure 11 Curve showing the increase in fluorescence intensity over time for fibers from uninjected muscle (empty diamond) and fibers from injected muscles (rhombus and full square).
  • FIG. 12 Comparison of the activity time in%, the distance traveled in m and the average speed / activity time between wild-type (+ / +) mice, dysferlin-deficient (- / -) mice, and injected mice (- / - injected).
  • NNSplice (http://www.fraitfly.org/seq_tools/splice.html); SpliceView (http://125.itba.mi.cnr.il/ ⁇ wcbgcnc/wwwsplicevicw.html); Splice Predictor (h ⁇ ); - ESE-fmder (http: //rulai.cshl .edu / tools / ESE /), and
  • a pcDNA3 plasmid, pGFP-Dysferlin, carrying the entire sequence encoding human dysferlin (GenBank number NM 003494) fused to the Green Fluorescent Protein (GFP) was used as a template for the amplification of the 5 'portion of the dysferlin, from exon 1 to 28, using an upstream primer containing the NcoI restriction site (5'-TTCCATGGGCATGCTGAGGGTCTTCATCC-S ') (SEQ ID 1) and a downstream primer carrying the HindIII and Mfel restriction sites ( 5'-TTCAATTGGGAAGCTTGCCCACCTTGCTCATCGACAGCCCGG-3 ') (SEQ ID 2).
  • This PCR product was subcloned into the TOPO XL PCR Cloning Kit plasmid to obtain pTOP0-Dysf5 '. The same procedure was applied to clone the 3 'part of the dysferlin, exons 29-55, using an upstream primer bearing the Spel and MIuI restriction sites.
  • the two vectors were cloned independently into an AAV vector based on pSMD2, derived from a vector carrying type 2 ITRs (Snyder, 1997) to obtain pAAV-dysf5 'and pAAV-dysf3'.
  • the 5 'portion is under the control of a C5-12 promoter (Li, 1999) and the 3' portion is followed by a polyadenylation signal from SV40.
  • AAV2 / 1 adenovirus viral preparations were generated by incorporating recombinant AAV2-ITR viral genomes into AAV1 capsids using a plasmid tri-transfection protocol as described (4). Briefly, 293 HEK cells (60% confluent) were co-transfected with pAAV-DysfE28I28 or pAAV-DysfI28E29, the RepCap plasmid (pLT-RCO2), and the adenoviral helper plasmid (pXX6) at a ratio of 1: 1 2. The crude viral lysate is harvested 60 hours after transfection.
  • the crude lysate is sequentially processed by four freeze-thaw cycles, digested with benzonase (15 'at 37 ° C) and precipitated with ammonium sulfate. Finally, the viral lysate is purified by two cycles of CsCl ultracentrifugation followed by dialysis to remove CsCl. The determination of the viral titre is obtained by real-time PCR (as described in Fougerousse et al (I)).
  • 293 HEK cells were used for in vitro concatemerization assays.
  • the cells are cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) concentrated in glucose supplemented with 10% FCS (fetal calf serum), 1% penicillin-streptomycin.
  • the cells are seeded in 10 cm dishes the day before transfection. Immediately before transfection, the cells are washed with 1% FCS medium.
  • the 293 HEK cells are co-transfected with pAAV-Dysf 5 ', pAAV-Dysf 3' and pLT-RCO2 in a ratio of 1: 1: 1.
  • DMEM (1g / L glucose
  • FBS fetal calf serum
  • RNAs are extracted from cells by the Trizol method (Invitrogen). Residual DNA is removed from the samples with the Free DNA kit (Ambion). 1 ⁇ g of RNA is retrotranscribed using random primers according to the protocol of the RT-PCR system Superscript II first strand synthesis (Invitrogen). The quantitative RT-PCR analyzes are carried out as previously described (4).
  • the primer pairs and Taqman probe used for the specific detection of the spliced dysferlin are as follows.
  • the probe (Exons2829.s) was chosen to overlap the junction between exons 28 and 29.
  • Ubiquitous acidic ribosomal phosphoprotein (PO) was used to normalize the data between the samples (4).
  • mice The SjI, A / J and Swiss mice are from Charles River Laboratories (Les Oncins, France). All experiments are carried out according to the European Charter for the use of animals for experimental purposes. AAVs are delivered in the anterior tibialis muscle.
  • mice received, in the left anterior tibialis muscle (TA), 30 ⁇ l of AAVr2 / l-dysf2728 (9 x 10 e 10 vg) and in the right TA, 30 ⁇ l of a mixture AAVr2 / l-def 2828 'and 2829 vectors in equivalent proportion (9 x 10 e 10 gv each).
  • TA left anterior tibialis muscle
  • AAVr2 / l-dysf2728 9 x 10 e 10 vg
  • a mixture AAVr2 / l-def 2828 'and 2829 vectors in equivalent proportion (9 x 10 e 10 gv each.
  • the muscles were homogenized using an Ultra-Turrax T8 (Ika) in lysis buffer (20 mM pH 7.5 Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 0.1% 100X Triton, 25 ⁇ l per mg of tissue) supplemented with Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche) and 2 ⁇ M E64 (Sigma).
  • the samples are mixed with loading buffer [NuPage LDS (Invitrogen), DTT 3M (Sigma)], denatured for 10 'at 70 0 C and rapidly centrifuged. Samples were loaded onto precolored 3-10% NuPAGE gradient polyacrylamide gels (Invitrogen).
  • the proteins are separated by electrophoresis in MOPS, then electrotransfer (100V for one hour) on a PVDF membrane (Immobilon-P PVDF transfer membrane, Dutscher). Transfer efficiency is verified by staining with Ponceau red (0.2% Ponceau red / 1% acetic acid), followed by decolorization in 1% acetic acid. The membranes were then blocked for one hour at room temperature with 3% bovine serum albumin (BSA) in Tris saline buffer with 0.1% Tween- (TTBS) and hybridized with murine monoclonal primary antibody against dysferlin (NCL-Hamlet, Novocastra, 1: 500 dilution) at room temperature for 2/3 hours.
  • BSA bovine serum albumin
  • TTBS Tris saline buffer with 0.1% Tween-
  • the membranes are incubated for one hour with the secondary anti-murine antibody (1: 1,000 in TTBS) coupled with horseradish peroxidase (HRP) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the revelation was made with the West Pico Chemiluminescent Substrate SuperSignal Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Visualization of the specific bands is obtained by exposing the membranes to X-OMAT-S films (Hyperfilm ECL, Amersham Biosciences).
  • This strategy utilizes two independent AAV vectors, one carrying the 5 'portion of the cDNA with an intron sequence containing a splice donor site, and the other carrying an intron sequence with a splice acceptor site followed by Part 3 cDNA.
  • the expression of the protein is obtained after co-administration of the two vectors, concatemerization of the viral genomes and splicing between the two splice sites (FIG. 1). This approach has been tested in vivo in dysferlin deficient mice.
  • the 6.2 kb messenger of the dysferlin is coded by 55 exons. Considering the encapsidation capacity of the AAV vectors and the minimum size of the necessary regulatory elements, it is theoretically possible to divide the dysferlin cDNA between exons 18 and 41 (FIG. 2).
  • splicing elements to be introduced into the two vectors in order to allow splicing between the two parts of the dysferlin cDNA, it has been chosen, in the context of the invention, to use endogenous sequences. of the dystrophin gene.
  • the sequence encoding dysferlin was cleaved into the 28 th intron (Figure 3).
  • the sequence of this intron (SEQ ID 12) appears in Figure 4.
  • This intron is small (264 bp) and can be used in its entirety, which ensures that all the signals needed for splicing are present.
  • the cleavage site is represented by a cross in the sequence shown in FIG. 4 (between nucleotides 140 and 141).
  • ESE Exon Splicing Enhancer
  • 293 cells were quadri-transfected with pAAV-Dysf5'-E28I28, pAAV-I28E29Dysf3 'and the RepCap and adenovirus helper plasmids. Transfection with pAAV-Dysf5'-E28I28 alone was also performed as a control. After RNA extraction, quantitative RT-PCR was performed to detect expression of human dysferlin with primers flanking the concatenated AAV junction. As expected, no expression of dysferlin was detected in 293 cells transfected with the 5 'vector alone, while a band at the expected size is detected for cells transfected with both vectors ( Figure 6).
  • mice 4-5 months old were injected into Tibialis Anterior (TA).
  • TA Tibialis Anterior
  • the left paw muscle received both AAV2 / 1-Dysf5'-E28I28 and AAV2 / 1-I28E29Dysf3 '(9x1 Oe 10 viral genomes (gv) each) and the right paw muscle AAV 5' vector , AAV2 / 1-Dysf5'-E28I28 (1.5xl ⁇ el l gv) only.
  • the mice were sacrificed 1, 2, 6 or 12 months after the injection.
  • the muscles were removed and level analyzes of the mRNAs and transgenic proteins were performed.
  • the level of mRNA was quantified by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) Taqman showing, for each time point, a significant level of dysferlin in the muscles injected by the two vectors (FIG. 9). In contrast, no messenger was detected in the contralateral muscle.
  • the basal locomotor activity of the mice was quantified using an actimeter (apparatus allowing the recording of the movements of the mice by infrared sensor) over a period of 6 hours. This experiment was conducted on mice injected one month earlier with 7.2 x 10 -2 gv of each vector in the tail vein.
  • the deficient mice have a 31.4% decrease in their activity period, a reduction in the distance traveled of 56.9% and a decrease of 37.24% of the average speed over the activity time compared to wild type.
  • the decreases for the deficient mice injected are only 4.2%, 24.6% and 21.28% for these three parameters (Figure 12).
  • AAV vectors to concatenate to obtain messenger expression and the entire protein of dysferlin.
  • a 5 'vector carrying exons 1 to 28 of the dysferlin cDNA was generated and half of the intron 28 carrying the splice donor site and a complementary 3' vector carrying the other half of intron 28, having the splice acceptor site, followed by the rest of the dysferlin cDNA, as well as a polyadenylation signal.
  • cotransfections in 293 cells or intramuscular injections on animal models were carried out, the 5 'and 3' vectors together making it possible to produce the entire human dysferlin.
  • the efficacy of the vectors used in this strategy to reconstitute dysferlin after intramuscular or intravascular injection into a mouse model of LGMD2B was demonstrated by stable expression of the entire dysferlin protein.
  • transgene expression is associated with restoration of membrane repair capacity and increased locomotor activity.
  • Trans-splicing adeno-associated viral vector-mediated gene therapy is limited by the accumulation of spliced mRNA but not by dual vector coinfection efficiency.
  • H “m Gene Ther. 15: 896-905.
  • AHNAK a novel component of the iron protein complex dys, redistributes to the cytoplasm with dysferlin during skeletal muscle regeneration.

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Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant : un premier vecteur viral adéno-associé (AAV) comprenant : i) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV; ii) une portion de gène placée sous le contrôle d'un promoteur; iii) une séquence comprenant un site donneur d'épissage; iv) une séquence 3'ITR d'AAV; et/ou un second vecteur viral adéno-associé (AAV) comprenant : v) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV; vi) une séquence comprenant un site accepteur d'épissage; vii) une portion de gène; viii)une séquence 3'ITR d'AAV. La réunion des portions de gène portées par les premier et second vecteurs AAV comprend un cadre de lecture ouvert qui code une dysferline fonctionnelle. En outre, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage contient tous les éléments nécessaires à l'épissage, avantageusement issus d'un intron natif du gène de la dysferline.

Description

VECTEURS VIRAUX ADENO-ASSOCIES POUR L'EXPRESSION DE LA DYSFERLINE
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne le traitement des dysferlinopathies.
Elle préconise l'utilisation de deux vecteurs AAV recombinants, permettant d'exprimer une dysferline fonctionnelle. Elle présente l'avantage d'être efficace et d'être basée sur les séquences natives du gène de la dysferline.
ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE
Les dysferlinopathies sont dues à des mutations dans le gène DYSF codant la protéine dysferline et correspondent à trois maladies cliniquement distinctes (9) (17) : la dystrophie des ceintures de type 2B (Limb-Girdle Muscular Dystrophy ; LGMD2B ; OMIM 253601) ; - la myopathie distale de Miyoshi (Miyoshi Myopathy ; MM; OMIM 254130) ; et - la myopathie du compartiment distal antérieur (Distal Anterior Compartment
Myopathy ; DACM; OMIM 606768).
Les deux premiers phénotypes sont caractérisés par des niveaux élevés en créatine kinase et une progression lente de la faiblesse musculaire. Dans les LGMD2B, les muscles proximaux des membres et du tronc sont les plus atteints, alors que dans la MM, ce sont les muscles distaux des membres inférieurs qui sont touchés. La DACM est initialement distale, avec atteinte des muscles de la partie antérieure. La maladie est rapidement progressive, conduisant à une faiblesse sévère des muscles proximaux.
Tous les types possibles de mutations ont été identifiés dans le gène DYSF, incluant des faux-sens, des non-sens, des délétions ou insertions, des mutations d'épissage et de larges délétions (5) (6) (11) (15).
Cependant, un polymorphisme important est également présent dans le gène. Des études récentes indiquent que, dans la plupart des cas, la perte de dysferline « visible » est associée à une mutation non-sens ou à une perte du cadre de lecture (15). Chez l'homme, DYSF est localisé dans la région chromosomique 2pl3 et appartient à la catégorie des grands gènes puisque celui-ci est composé de 55 exons s 'étendant sur 150 kb d'ADN génomique et est transcrit en un messager de 6,5 kb (5) (11).
Le gène DYSF, bien qu'exprimé dans divers tissus tel que le cerveau et les poumons, est principalement exprimé dans le muscle squelettique, le coeur et les monocytes/macrophages (2).
La dysferline est une protéine de 237 kDa composée de 2080 acides aminés, comprenant un domaine transmembranaire en C-terminal et un très long domaine cytosolique en N-terminal. Elle contient six domaines C2 (aussi appelés calcium- senseurs), qui s'étendent le long de la protéine et sont impliqués dans la fixation du calcium et des phospholipides, tels que les phosphoinositides (14). La dysferline contient également deux domaines centraux spécifiques (les domaines dysferline), dont la fonction n'est pas encore élucidée.
Des études indiquent que la dysferline est une protéine membranaire dans les fibres du muscle squelettique adulte et s'exprime dès la 5-6eme semaine du développement embryonnaire (2).
La dysferline appartient à la famille multiprotéique des ferlines, dont plusieurs membres ont été identifiés, tel que la myoferline. Elles présentent toutes des similarités structurales et contiennent, en particulier, des domaines C2. De plus, la dysferline est hautement conservée parmi les mammifères (5).
Des études précédentes ont montré que la dysferline interagit avec différentes protéines telles que : la Cavéoline-3 (12), dont les mutations sont responsables de la LGMDlC (OMIM 607801) ; - la Calpaine-3 (8), le gène muté dans la LGMD2A (OMIM 253600) ; les Annexines I et II (10) ; l'affixine (beta-parvine), une nouvelle protéine se liant aux kinases lié aux intégrines (13) ; et le récepteur dihydropyridine (1) ; - Ahnak (20). Dans les fibres du muscle squelettique adulte, la dysferline joue un rôle clé dans la réparation du sarcolemme, comme observé dans des muscles humains et murins, déficients en dysferline (3).
De plus, une sous-régulation de l'inhibiteur du complément, decay-accelerating factor/CD55, a été observée dans les muscles squelettiques humains et murins, déficients en dysferline, par l'analyse des profils d'expression des messagers. In vitro, l'absence de CD55 mène les myotubes humains à une augmentation de la susceptibilité de l'attaque par le complément (18).
La question du traitement des dysferlinopathies reste cruciale.
En considérant la nature récessive des dysferlinopathies, le transfert de gène constitue une stratégie thérapeutique possible.
Les meilleurs vecteurs, à l'heure actuelle, pour transfecter le muscle sont dérivés des virus associés aux adénovirus (AAV). Cependant, la taille de l'ADNc de la dysferline empêche son incorporation directe dans un vecteur AAV.
II existe donc le besoin de développer de nouveaux outils de thérapie génique permettant de traiter les dysferlinopathies.
OBJET DE L'INVENTION
Selon un premier aspect, la présente invention concerne une composition comprenant des vecteurs viraux adéno-associés (AAV) recombinants, avantageusement au nombre de deux, portant des constructions complémentaires permettant l'expression d'une dysferline fonctionnelle.
Selon l'invention, un premier vecteur AAV comprend : i) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; ii) une portion de gène placée sous le contrôle d'un promoteur; iii) une séquence comprenant un site donneur d'épissage ; iv) une séquence 3'ITR d'AAV. En outre, le second vecteur AAV comprend : v) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; vi) une séquence comprenant un site accepteur d'épissage ; vii) une portion de gène; viii) une séquence 3'ITR d'AAV.
Ces deux vecteurs AAV, qui peuvent se trouver dans une même composition ou être conditionnés dans deux compositions distinctes, portent des séquences complémentaires qui vont être amenées à constituer une unité fonctionnelle au moment de la concatémérisation. Cet intermédiaire se présente sous la forme d'un intermédiaire, appelé concatémère, déjà isolé et caractérisé dans l'art antérieur.
La concatémérisation est assurée grâce à la reconnaissance de séquences terminales inversées répétées, appelées séquences ITR (Inverted Terminal Repeat), présentes et correctement orientées sur chacun des vecteurs AAV. Il se produit alors une recombinaison intermoléculaire des génomes AAV.
Les ITR AAV sont une structure en épingle à cheveux, en forme de T. Ces séquences sont essentielles pour la réplication du génome AAV, la réplication et l'empaquetage des particules virales. Selon l'invention et de manière connue, il est choisi des vecteurs avec des ITR non homologues, afin de favoriser la concatémérisation de telle façon que la recombinaison intermoléculaire soit orientée vers l'association adjacente d'hétérodimères complémentaires.
En outre et selon l'invention, la réunion des portions de gène portées par les premier et second vecteurs AAV comprend un cadre de lecture ouvert qui code une dysferline fonctionnelle. Dans le cadre de l'invention, on appelle « dysferline fonctionnelle », une protéine thérapeutique pour le traitement des dysferlinopathies. Une telle protéine doit en particulier satisfaire au test de réparation membranaire décrit par Bansal et al. (21), et encore plus avantageusement à celui de la fonction musculaire incluant une évaluation du temps d'activité, de la distance parcourue et de la vitesse moyenne, décrit dans la présente demande. Il peut, bien sûr, s'agir de la protéine native complète (comportant 55 exons), en particulier humaine, mais également d'une mini-dysferline (dépourvue de certains motifs répétitifs) ou d'une dysferline mutée conservant une activité thérapeutique. Avantageusement et pour limiter la contrainte de la taille d'encapsidation des AAV, les portions de gène correspondent à des exons. En d'autres termes, les portions de gène sont préférentiellement des fragments d'ADNc.
Ainsi et de manière avantageuse, les exons 1 à 55 de la dysferline humaine sont amplifiés à partir d'un vecteur répertorié dans GenBank sous le numéro NM 003494.
Avantageusement, le cadre de lecture constitué par la réunion des deux AAV code la séquence SEQ ID 16 (AN 075923) correspondant à la dysferline humaine notamment décrite dans les publications (5) et (11), ou un dérivé ou un fragment actif de celle-ci. Plus précisément, on entend par dérivé ou fragment une séquence protéique présentant au moins 60%, préférentiellement 70%, encore plus préférentiellement 80% voire 90% d'identité avec la séquence SEQ ID 16. Sont ainsi visées les dysferlines d'autre origine (mammifères non humains,...) et les mini-dysferlines.
Pour obtenir une protéine fonctionnelle, le premier vecteur porte avantageusement la partie 5' du gène, alors que le second vecteur porte la partie 3' de ce même gène.
En pratique, la dysferline étant constituée de 55 exons, il a été déterminé par les Inventeurs que, dans le but d'avoir des portions de ce gène compatibles avec la taille d'encapsidation des AAV, le clivage doit être réalisé entre les exons 18 et 41 de la dysferline.
Ainsi, le premier vecteur AAV contient avantageusement la portion du gène humain de la dysferline allant de l'exon 1 à l'exon x, alors que le second vecteur AAV contient la portion allant de l'exon (x+1) à l'exon 55, avec x compris entre 18 et 41. Encore plus avantageusement, le premier vecteur AAV contient les exons 1 à 28 et le second vecteur AAV contient les exons 29 à 55 du gène humain de la dysferline.
Pour assurer l'expression du gène de la dysferline après concatémérisation, la portion du gène en 5', c'est à dire celle portée par le premier vecteur AAV, est placée sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel. Il peut par exemple s'agir du promoteur synthétique C5-12, bien connu de l'homme du métier et plus particulièrement adapté à l'expression musculaire des gènes. Alternativement, il peut s'agir du promoteur Pdesmine, dérivé du promoteur du gène codant la desmine. Selon une seconde caractéristique de l'invention, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage contient tous les éléments nécessaires à l'épissage. En outre, ceux-ci sont avantageusement issus d'un intron natif du gène de la dysferline.
Pour assurer cet épissage et de manière classique, un des vecteurs selon l'invention apporte un site donneur d'épissage et l'autre un site accepteur d'épissage.
Dans le cadre de l'invention, il a été mis évidence par les Inventeurs, que de manière surprenante et dans le cas de la dysferline, l'utilisation d'introns natifs était non seulement faisable mais performante.
L'avantage d'utiliser des séquences endogènes et natives apparaît clairement : les constructions sont beaucoup plus simples à obtenir et ne nécessite pas les mutagénèses lourdes, envisagées dans l'art antérieur. En outre, pour les applications cliniques et la sécurité sanitaire en thérapie génique, il est préféré l'utilisation de séquences endogènes plutôt que l'introduction de séquences exogènes pouvant entraîner des réactions chez l'hôte.
Ainsi et selon le principe de l'invention, un intron natif est « simplement découpé » en deux fragments, la partie comprenant le site donneur d'épissage étant naturellement situé en aval de la partie 5 ' du fragment de gène dans le premier vecteur AAV et la partie comprenant le site accepteur d'épissage étant naturellement situé en amont de la partie 3' du fragment de gène dans le second vecteur AAV.
De manière optimisée, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage correspond donc à un intron natif du gène humain de la dysferline, avantageusement l'un des introns choisis parmi les introns 18 à 40, et encore plus avantageusement l'intron 28 (SEQ ID 12). C'est par exemple le cas lorsque le clivage est réalisé entre les nucléotides 140 et 141 de cet intron 28.
Evidemment, les séquences contenant les sites donneur et accepteur d'épissage peuvent ne pas être strictement identiques à l'intron natif, du fait notamment de délétions ou substitutions liées à leur clonage dans les vecteurs AAV selon l'invention. C'est pourquoi, le concept selon l'invention porte sur le fait que les éléments nécessaires à l'épissage, à savoir les sites donneur et accepteur d'épissage, les points de branchement (« Branch Point ») mais également les séquences ESE (« Exonic Splicing Enhancer »), sont conservés.
De manière générale et pour la dysferline, les introns visés, avantageusement les introns 18 à 40 du gène humain et encore plus avantageusement l'intron 28, contiennent au moins 70% de leur séquence potentiellement impliquées dans l'épissage.
Avantageusement, la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage présente donc au moins 70%, préférentiellement 80%, encore plus préférentiellement 90% voire 95% d'identité avec la séquence de l'intron natif.
Dans le cas particulier de l'intron 28, la réunion de ces deux séquences présente la séquence SEQ ID 13. Cette dernière présente 97% d'identité avec la séquence native de l'intron 28, naturellement localisée entre les exons 28 et 29 (SEQ ID 12).
Dans ce cas précis et lorsque le clivage est réalisé en aval du nucléotide 140 de l'intron 28, le premier vecteur AAV présente, en tant que séquence comprenant un site donneur d'épissage, la séquence SEQ ID 14, alors que le second vecteur AAV présente, en tant que séquence comprenant un site accepteur d'épissage, la séquence SEQ ID 15.
De manière avantageuse et pour assurer une bonne stabilité du transcrit, le second vecteur AAV porte en aval de la portion du gène de la dysferline un signal de polyadénylation, par exemple le polyA du SV40.
Les deux vecteurs peuvent être utilisés pour la production in vitro de dysferline dans des cellules. Avantageusement, ces cellules sont des cellules musculaires, encore plus avantageusement issus de mammifères, en particulier d'origine humaine.
Une alternative à l'utilisation directe des vecteurs AAV est l'utilisation de plasmides de type AAV qui comprennent les éléments i) à iv) ou v) à viii) tels que définis précédemment, et donc des séquences ITR, mais sont dépourvus des séquences codant pour Cap et Rep. Selon un autre aspect, l'invention concerne donc également une méthode de production de la dysferline in vitro dans des cellules, consistant à mettre en contact la cellule avec une composition contenant les vecteurs ou les plasmides AAV recombinants selon l'invention.
En pratique, les deux vecteurs ou plasmides sont introduits de manière simultanée ou séquentielle dans les cellules, notamment par transfection.
Pour la production de dysferline à partir de plasmides de type AAV tels que décrits, il est également nécessaire d'apporter les protéines RepCap et une fonction « adenovirus helper », soit sous la forme de deux plasmides supplémentaires lors de la transfection, soit en utilisant des lignées cellulaires comportant de façon stable ces séquences.
Les conditions de la culture cellulaire sont ajustées par l'homme du métier afin que la concatémérisation, l'épissage et l'expression du gène de la dysferline aient lieu : maintien des vecteurs ou plasmides, activité du promoteur, ...
Les vecteurs AAV recombinants tels que décrits dans la présente invention ont des applications évidentes, notamment dans le domaine thérapeutique.
Ainsi et selon un autre aspect de l'invention, l'invention concerne l'utilisation d'une composition, comprenant un seul ou les deux vecteurs AAV tels que définis précédemment, comme médicament.
La composition ou les compositions pharmaceutiques correspondantes comprennent le ou les vecteurs AAV, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable et inerte. Divers excipients, stabilisateurs, et autres composés adaptés connus de l'homme du métier peuvent être envisagés dans une telle composition.
Lorsque la composition selon l'invention est à injecter au niveau des muscles malades, elle se présente préférentiellement sous forme liquide. La détermination de la concentration en vecteur, de la quantité à injecter et de la fréquence des injections relève de la pratique courante de l'homme du métier.
Un autre mode d'administration privilégié selon l'invention est l'administration par voie systémique. De tels médicaments sont notamment destinés à la thérapie génique, en particulier pour le traitement des dysferlinopathies.
Comme déjà dit, les deux vecteurs selon l'invention peuvent être conditionnés dans le même médicament ou alternativement peuvent faire l'objet de deux médicaments distincts.
La présente invention offre donc une solution thérapeutique pour le traitement des dysferlinopathies présentant l'avantage d'être simple, sûre et efficace.
EXEMPLES DE REALISATION
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci n'ont toutefois aucune portée limitative.
Cet exemple porte donc sur l'utilisation de deux vecteurs AAV aptes à concatémériser, permettant la production à un niveau thérapeutique d'une dysferline fonctionnelle.
La stratégie utilisée est illustrée à la Figure 1. Elle met en œuvre deux vecteurs AAV indépendants, un portant la partie 5' de l'ADNc avec une séquence intronique contenant un site donneur d'épissage, et l'autre portant une séquence intronique avec un site accepteur d'épissage suivi de la partie 3' de l'ADNc. Dans cette stratégie, l'expression de la protéine est obtenue après co-administration des deux vecteurs, concatémérisation des génomes viraux et épissage entre les deux sites d'épissage.
Cette approche appliquée à la dysferline a été testée in vivo sur des souris déficientes en dysferline.
Figure 1 : Schéma de la stratégie adoptée dans le cadre de l'invention. Figure 2 : Schéma de l'ADNc de la dysferline et de la zone compatible pour le clivage. Les boîtes représentent les différents exons. Figure 3 : Stratégie utilisée pour cliver et cloner les deux parties de l'ADNc de la dysferline. Figure 4 : Séquence de l'intron 28 et position du site de clivage dans l'intron (x). Les nucléotides en gras sont sensés ne pas participer aux ESE.
Figure 5 : Schéma des deux vecteurs AAV recombinants utilisés dans l'invention.
Figure 6 : A/ Gel d'électrophorèse du produit de PCR de la jonction. Un plasmide GFP-Dysferline a été utilisé comme contrôle positif de l'amplification. B/ RT-PCR quantitative. Les résultats sont présentés suivant le ratio du Ct de la dysferline avec
PO, pour normaliser l'ensemble des échantillons.
Figure 7 : Analyse par RT-PCR des muscles injectés.
Figure 8 : Analyse des muscles injectés par western blot. Les A/J sont des modèles déficients en dysferline et les C57b6, des souris normales.
Figure 9 : Mesure du taux de messagers de la dysferline produite dans les muscles injectés au cours du temps.
Figure 10 : Western blot détectant la protéine dysferline dans les muscles au cours du temps. Pour chaque point, trois souris ont été analysées. Figure 11 :Courbe montrant l'augmentation de l'intensité de fluorescence au cours du temps pour des fibres provenant de muscle non injecté (losange vide) et des fibres venant de muscles injectés (losange et carré pleins).
Figure 12 : Comparaison du temps d'activité en %, de la distance parcourue en m et de la vitesse moyenne/temps d'activité entre des souris sauvages (+/+), des souris déficientes en dysferline (-/-) et des souris injectées (-/- injecté).
I) MATERIEL ET METHODES
1) Analyses bioinformatiques
Les logiciels et les sites web suivant ont été utilisés :
NNSplice: (http://www.fraitfly.org/seq_tools/splice.html); SpliceView (http://125.itba.mi.cnr.il/~wcbgcnc/wwwsplicevicw.html); Splice Predictor (hU^l/άççgçl^ύΛ^^Q^ώ^çgizbinlsQxgi); - ESE-fmder (http ://rulai.cshl .edu/tools/ESE/), et
- Rescue-ESE (http ://genes.mit.edu/burgelab/rescue-ese/).
2) Constructions plasmidiques
Un plasmide pcDNA3, pGFP-Dysferline, portant la séquence entière codant la dysferline humaine (GenBank number NM 003494) fusionnée à la Green Fluorescent Protein (GFP) a été utilisé comme matrice pour l'amplification de la partie 5' de la dysferline, de l'exon 1 à 28, en utilisant une amorce en amont contenant le site de restriction Ncol (5 '-TTCCATGGGCATGCTGAGGGTCTTCATCC-S ') (SEQ ID 1) et une amorce en aval portant les sites de restriction HindIII et Mfel (5'- TTCAATTGGGAAGCTTGCCCACCTTGCTCATCGACAGCCCGG-3') (SEQ ID 2).
Ce produit de PCR a été sous-cloné dans le plasmide TOPO XL PCR Cloning Kit pour obtenir le pT0P0-Dysf5 ' . La même procédure a été appliquée pour cloner la partie 3' de la dysferline, des exons 29 à 55, en utilisant une amorce en amont portant les sites de restriction Spel et MIuI
(5 '-TTACTAGTGGACGCGTCCAGGCTGGGAGTATAGCATCACC-S ') (SEQ ID 3) et une amorce en aval portant le site de restriction Notl (5'- TTGCGGCCGCCTACAGGGCAGGAGAGTCCTCAGCTGAAGGGCTTC-3') (SEQ ID 4) pour obtenir le pTOPO-dysβ'.
Après digestion avec les enzymes de restriction correspondantes (Ncol / Mfel pour la partie 5' et Spel / Notl pour la partie 3' de la dysferline), les deux vecteurs ont été clones indépendamment dans un vecteur AAV basé sur le pSMD2, dérivé d'un vecteur portant des ITR de type 2 (Snyder, 1997) pour obtenir le pAAV-dysf5' et le pAAV-dysf3'. La partie 5' est placée sous le contrôle d'un promoteur C5-12 (Li, 1999) et la partie 3' est suivie par un signal de polyadénylation issu du SV40.
Puis, nous avons utilisé une approche utilisant la PCR pour insérer la séquence du site donneur d'épissage (SD) ou la séquence du site accepteur d'épissage (SA) du 28eme intron du gène de la dysferline dans ces deux plasmides. Les amorces HindIII-SD5' : 5 '-TTAAGCTTAGCATGTGGAACCTGG-S ' (SEQ ID 5) et MfeI-SD3' : 5'- TTC AATTG AGCTTGGAGTGGGGGGTGC-3' (SEQ ID 6) ont été utilisées pour amplifier la partie 5' de l'intron 28 à partir d'ADN génomique humain et SpeI-SA5' : 5 '-TTACTAGTGCAAATTAGGACCGAGAGTCAG-S ' (SEQ ID 7) et MIuI-SA : 5 '-TTACGCGTGGGAGGGGGAACCGGTCACT-3 ' (SEQ ID 8) pour la partie 3 ' de l'intron 28. Après digestion adéquate des plasmides et des produits de PCR, ces produits ont été introduits dans le pAAV-dysf5' et pAAV-dysf3' pour générer les plasmides pAAV2-Dysf.E28I28 et pAAV2-Dysf.I28E29. 3) Production d'AAV recombinant (AAVr)
Les préparations virales d'adénovirus AAV2/1 ont été générées en incorporant les génomes viraux recombinant de type AAV2-ITR dans des capsides AAVl en utilisant un protocole de tri-transfections plasmidiques comme décrit (4). Brièvement, des cellules 293 HEK (confluentes à 60%) ont été co-transfectées avec pAAV- DysfE28I28 ou pAAV-DysfI28E29, le plasmide RepCap (pLT-RCO2), et le plasmide helper adenoviral (pXX6) à un ratio de 1 :1 :2. Le lysat viral brut est récolté 60 heures après la transfection. Pour faciliter le relargage des particules virales, le lysat brut est séquentiellement traité par quatre cycles de congélation-décongélation, digéré par la benzonase (15' à 37°C) et précipité au sulfate d'ammonium. Finalement, le lysat viral est purifié par deux cycles d'ultracentrifugation en CsCl, puis suivi par des dialyses afin d'éliminer le CsCl. La détermination du titre viral est obtenue par PCR en temps réel (comme décrit dans Fougerousse et al (I)).
4) Cultures cellulaires et transfection s
Les cellules 293 HEK ont été utilisées pour des analyses in vitro de concatémérisation. Les cellules sont cultivées dans du DMEM (Dulbecco's modified Eagle médium) concentré en glucose complémenté avec 10% de SVF (sérum de veau fœtal), 1% de pénicilline-streptomycine. Les cellules sont ensemencées dans des boîtes de 10 cm la veille de la transfection. Immédiatement avant la transfection, les cellules sont lavées avec du milieu à 1% de SVF. Les cellules 293 HEK sont co-transfectées avec pAAV- Dysf 5', pAAV-Dysf 3' et pLT-RCO2 dans un ratio de 1 :1 :1. A 6-7h après la transfection, DMEM (lg/L glucose) avec 10% FBS est ajouté. Les cultures cellulaires sont collectées pour l'analyse de l'expression du transgène 48 heures après la transfection.
5) RT-PCR
Les ARNs totaux sont extraits des cellules par la méthode au Trizol (Invitrogen). L'ADN résiduel est éliminé des échantillons avec le kit Free DNA (Ambion). 1 μg d'ARN est rétrotranscrit en utilisant des amorces aléatoires selon le protocole du système de RT-PCR Superscript II first strand synthesis (Invitrogen). Les analyses de RT-PCR quantitative sont réalisées comme décrite précédemment (4). Les paires d'amorces et la sonde Taqman utilisées pour la détection spécifique de la dysferline épissée sont les suivants. Exon28.f 5 CTCAACCGGGCTGTCGAT 3> (SEQ ID 9), Exon29.r 5- GTCGGTGTGTGT AGTAC ATCTTCTCA 3- (SEQ ID 10), et Exons2829.s 5- CAAGGCTGGGAG 3- (SEQ ID 11) La sonde (Exons2829.s) a été choisie pour chevaucher la jonction entre les exons 28 et 29. La phosphoprotéine ribosomale acidique ubiquitaire (PO) a été utilisée pour normaliser les données entre les échantillons (4).
6) Expériences in vivo
Les souris SjI, A/J et Swiss proviennent des laboratoires Charles River (Les Oncins, France). Toutes les expériences sont réalisées selon la Charte Européenne pour l'utilisation des animaux à des fins expérimentales. Les AAV sont délivrés dans le muscle jambier antérieur.
Pour l'injection intramusculaire, les souris ont reçu, dans le muscle jambier antérieur gauche (TA), 30 μl d'AAVr2/l-dysf2728 (9 x 10e10 vg) et dans le TA droit, 30 μl d'un mélange des vecteurs AAVr2/l-dysf 2828' et 2829 en proportion équivalente (9 x 10e 10 gv de chaque). Un mois après l'injection, les souris sont sacrifiées et les deux TA sont prélevés puis rapidement congelés dans de l'azote liquide refroidi en isopentane.
7) Western blot
Les muscles ont été homogénéisés en utilisant un Ultra- Turrax T8 (Ika) dans du tampon de lyse (20 mM pH 7.5 Tris, 150 mM NaCl, 2 mM EGTA, 0.1% 100X Triton ; 25 μl par mg de tissus) complémenté avec Complète Mini Protease Inhibitor Cocktail (Roche) et 2 μM E64 (Sigma). Les échantillons sont mélangés avec du tampon de charge [NuPage LDS (Invitrogen), DTT 3M (Sigma)], dénaturés pendant 10' à 700C et rapidement centrifugés. Les échantillons ont été chargés sur des gels NuPAGE en gradient de polyacrylamide 3-10% précoulés (Invitrogen). Les protéines sont séparées par électrophorèse en MOPS, puis un électrotransfert (100V pendant une heure) sur membrane PVDF (Immobilon-P PVDF transfer membran, Dutscher). L'efficacité du transfert est vérifié par coloration au rouge Ponceau (0.2% de rouge Ponceau / 1% d'acide acétique), suivi d'une décoloration en 1% d'acide acétique. Les membranes ont ensuite été bloquées pendant une heure à température ambiante avec 3% de sérum albumine bovine (BSA) dans du tampon salin Tris avec 0.1% de Tween- 20 (TTBS) et hybridées avec l'anticorps primaire monoclonal murin contre la dysferline (NCL-Hamlet, Novocastra, dilution 1 :500) à température ambiante pendant 2/3 heures. Finalement, les membranes sont incubées pendant une heure avec l'anticorps secondaire anti-murin (1 : 1,000 en TTBS) couplé à l'horseradish peroxidase (HRP) (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). La révélation a été réalisée avec le kit SuperSignal West Pico chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA). La visualisation des bandes spécifiques est obtenue par exposition des membranes sur des films X-OMAT-S (Hyperfïlm ECL, Amersham Bioscences).
II) RESULTATS
Cette stratégie utilise deux vecteurs AAV indépendants, un portant la partie 5' de l'ADNc avec une séquence intronique contenant un site donneur d'épissage, et l'autre portant une séquence intronique avec un site accepteur d'épissage suivi de la partie 3' de l'ADNc. Dans cette stratégie, l'expression de la protéine est obtenue après co- administration des deux vecteurs, concatémérisation des génomes viraux et épissage entre les deux sites d'épissage (Figure 1). Cette approche a été testée in vivo sur des souris déficientes en dysferline.
1) Construction des vecteurs AAV
Les 6,2 kb du messager de la dysferline sont codés par 55 exons. En considérant la capacité d'encapsidation des vecteurs AAV et la taille minimale des éléments régulateurs nécessaires, il est théoriquement possible de diviser l'ADNc de la dysferline entre les exons 18 et 41 (Figure 2).
Concernant les éléments d'épissage devant être introduits dans les deux vecteurs afin de permettre l' épissage entre les deux parties de l'ADNc de la dysferline, il a été choisi, dans le cadre de l'invention, d'utiliser des séquences endogènes du gène de la dystrophine.
Pour le présent exemple de réalisation, la séquence codant la dysferline a été clivée dans le 28eme intron (Figure 3). La séquence de cet intron (SEQ ID 12) apparaît à la figure 4. Cet intron est de petite taille (264 bp) et peut être utilisé dans sa totalité, ce qui garantit que tous les signaux nécessaires pour l'épissage sont présents. Ainsi, il a été vérifié que les sites donneur et accepteur d'épissage ont un score correct en utilisant différents logiciels (NNSplice ; SpliceView ; Splice Preditor ; Table 1). Le site de clivage est matérialisé par une croix dans la séquence représentée à la Figure 4 (entre les nucléotides 140 et 141).
Figure imgf000016_0001
Table 1 Score des sites d'épissage de l'intron 28
Ensuite, la présence d'éléments favorisant l'épissage, Exon Splicing Enhancer (ESE), a été recherchée dans cet intron, en utilisant ESE-finder et Rescue-ESE, afin d'éviter d'insérer les séquences ITR dans des régions régulant l'épissage. Les nucléotides ne participant pas aux ESE selon les logiciels utilisés sont indiqués en gras sur la Figure 4.
Afin de construire les vecteurs désirés, les demis ADNc et demi introns ont été amplifiés en utilisant des amorces portant des sites de restriction, puis successivement insérés dans les vecteurs AAV pour obtenir le pAAV-Dysf5'-E28I28 et pAAV- I28E29Dysf3' (Figure 5).
2) Expression de la dysferline humaine entière in cellulo
Des cellules 293 ont été quadri-transfectées avec pAAV-Dysf5'-E28I28, pAAV- I28E29Dysf3' et les plasmides RepCap et adenovirus helper. Une transfection avec pAAV-Dysf5'-E28I28 seul a également été réalisée pour servir de contrôle. Après l'extraction d'ARN, une RT-PCR quantitative a été réalisée pour détecter l'expression de dysferline humaine avec des amorces encadrant la jonction du concatémère d'AAV. Comme attendu, aucune expression de dysferline n'a été détectée chez les cellules 293 transfectées avec le vecteur 5' seul, alors qu'une bande à la taille attendue est détectée pour les cellules transfectées avec les deux vecteurs (Figure 6).
3) Expression de la dysferline humaine entière après injection en intramusculaire chez la souris.
Ayant validé la possibilité d'obtenir un messager entier de la dysferline humaine à partir des deux vecteurs, nous avons regardé si un événement similaire peut se produire in vivo dans les muscles de souris. Nous avons injecté 9 x 1010 génomes viraux (gv) de chaque vecteur dans le muscle jambier antérieur (TA) de trois souches de souris normales, déficientes en dsyferline SjI et AJJ, âgées de 4 mois. Les muscles ont été prélevés 35 jours après l'injection, puis ont subi une analyse de l'expression du niveau de messagers par Taqman quantitative. Comme montré à la Figure 7, un niveau substantiel de transcrit est obtenu (Figure 7).
L'évaluation de l'efficacité du transfert de gène a également été faite par western blot. L'analyse des TA injectés a montré l'expression de la protéine entière à 250 kDa (Figure 8).
4) Devenir des injections intramusculaires dans le temps
Afin d'analyser l'expression du transgène au cours du temps, des souris AJJ (déficientes en dysferline) de 4-5 mois ont été injectées dans le Tibialis Antérieur (TA). Le muscle de la patte gauche a reçu les deux vecteurs AAV2/l-Dysf5'-E28I28 et AAV2/l-I28E29Dysf3' (9x1 Oe 10 génomes viraux (gv) de chaque) et le muscle de la patte droite le vecteur AAV 5', AAV2/l-Dysf5'-E28I28 (l,5xlθel l gv) uniquement. Les souris ont été sacrifiées 1, 2, 6 ou 12 mois après l'injection.
Les muscles ont été prélevés et les analyses du niveau des ARNm et des protéines transgéniques ont été effectuées. Le niveau d'ARNm a été quantifié par RT-PCR quantitative (qRT-PCR) Taqman montrant, pour chaque point de temps, un niveau significatif de dysferline dans les muscles injectés par les deux vecteurs (Figure 9). En revanche, aucun messager n'a été détecté dans le muscle controlatéral.
L'analyse par western-blot des muscles injectés révèle que la dysferline est détectée à une taille correspondante à la protéine entière (237 kDa), alors qu'aucune bande n'est détectée dans les muscles controlatéraux non injectés (Figure 10).
Ces résultats indiquent que les deux vecteurs injectés permettent une expression à long terme du messager complet et de la protéine dysferline.
5) Evaluation de la réparation membranaire
Lors d'un test basé sur la réalisation de lésions de la membrane plasmique de la fibre musculaire par faisceau laser, il a été montré que la dysferline joue un rôle dans la réparation membranaire (21). Nous avons donc évalué la capacité de réparation des fibres musculaires après injection des vecteurs. Cette expérience a été réalisée sur le muscle Flexor Digitorum Brevis (FDB) après injection intramusculaire de 7,5xl0el0 gv de chaque vecteur chez des souris déficientes en dysferline de 3-4 mois. Un mois après injection, les muscles ont été prélevés et les fibres ont été individualisées après digestion à la collagénase. Celles ci ont été placées dans une solution contenant du colorant FM 1-43 en présence ou non de calcium. Les lésions ont été induites par irradiation maximale pendant un seconde avec un laser deux photons d'un microscope confocal. Les images de pénétration du colorant ont ensuite été acquises pendant 3 min toutes les 7 secondes. L'intensité de fluorescence a été quantifiée à l'aide du logiciel Image J.
Comme attendu, les fibres de souris déficientes n'ont pas été en mesure de réparer les lésions induites, alors que la même lésion a été réparée de manière efficace pour les fibres des souris injectées (Figure 11).
6) Evaluation de la fonction du muscle après injection intramusculaire
L'activité locomotrice basale des souris a été quantifiée à l'aide d'un actimètre (appareil permettant l'enregistrement des déplacements des souris par capteur infrarouge) sur une période de 6 heures. Cette expérience a été menée sur des souris ayant été injectées un mois plus tôt par 7,2xl0el2 gv de chaque vecteur dans la veine caudale.
Les souris déficientes ont une diminution de 31,4% de leur période d'activité, une réduction de la distance parcourue de 56,9% et une diminution de 37,24% de la vitesse moyenne sur le temps d'activité par rapport au type sauvage. Les diminutions pour les souris déficientes injectées ne sont plus que de 4,2%, 24,6% et 21,28% pour ces trois paramètres (Figure 12).
CONCLUSIONS
Nous avons exploité la capacité des vecteurs AAV à se concatémériser pour obtenir l'expression du messager et de la protéine entière de la dysferline. A cet effet, il a été généré un vecteur 5' portant les exons 1 à 28 de l'ADNc de la dysferline et la moitié de l'intron 28 portant le site donneur d'épissage et un vecteur 3' complémentaire portant l'autre moitié de l'intron 28, ayant le site accepteur d'épissage, suivi du reste de l'ADNc de la dysferline, ainsi qu'un signal de polyadénylation. Par la suite, des cotransfections en cellules 293 ou des injections intramusculaires sur des modèles animaux ont été réalisés, les vecteurs 5' et 3' ensemble permettant de produire la dysferline humaine entière.
Plus précisément, l'efficacité des vecteurs utilisés dans cette stratégie à reconstituer la dysferline après injection intramusculaire ou intravasculaire dans un modèle murin de LGMD2B a été démontrée par une expression stable de la protéine dysferline entière. En outre, l'expression du transgène est associée à la restauration de la capacité de réparation membranaire et une augmentation de l'activité locomotrice.
Ainsi, ces résultats montrent l'utilisation potentielle de la concatémérisation d'AAVs pour l'expression de la dysferline comme une stratégie prometteuse pour les déficiences en dysferline chez l'homme. De manière importante, ceci a été réalisé en utilisant des séquences endogènes du gène de la dysferline. Ceci constitue un atout en thérapie génique où l'introduction de séquences exogènes (source éventuelle de réactions ou de recombinaisons indésirables) est évitée au maximum et simplifie l'obtention des constructions. Il a donc été obtenu, de manière simple et efficace, la compensation d'un défaut de dysferline par thérapie génique.
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Claims

REVENDICATIONS
1/ Composition comprenant au moins : un premier vecteur viral adéno-associé (AAV) comprenant : i) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; ii) une portion de gène placée sous le contrôle d'un promoteur; iii) une séquence comprenant un site donneur d'épissage ; iv) une séquence 3'ITR d'AAV ; et - un second vecteur viral adéno-associé (AAV) comprenant : v) une séquence 5'ITR (Inverted Terminal Repeat) d'AAV ; vi) une séquence comprenant un site accepteur d'épissage ; vii) une portion de gène; viii)une séquence 3'ITR d'AAV ; caractérisée en ce que : la réunion des portions de gène portées par les premier et second vecteurs
AAV comprend un cadre de lecture ouvert qui code une dysferline fonctionnelle, avantageusement d'origine humaine ; la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage contient tous les éléments nécessaires à l'épissage.
2/ Composition selon la revendication 1 caractérisée en ce que tous les éléments nécessaires à l'épissage sont issus d'un intron natif du gène de la dysferline, avantageusement d'origine humaine.
3/ Composition selon la revendication 2 caractérisée en ce que la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage comprend tous les éléments nécessaires à l'épissage contenus dans l'un des introns 18 à 40 du gène humain de la dysferline, avantageusement ceux de l' intron 28.
4/ Composition selon la revendication 3 caractérisée en ce que la réunion de la séquence comprenant le site donneur d'épissage et de la séquence comprenant le site accepteur d'épissage présente au moins 70% d'identité avec la séquence de l'intron 28 (SEQ ID 12), et a avantageusement la séquence SEQ ID 13. 5/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que :
- la séquence iii) du premier AAV a la séquence SEQ ID 14 ;
- la séquence vi) du second AAV a la séquence SEQ ID 15.
6/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que :
- la séquence ii) du premier AAV correspond aux exons 1 à x du gène de la dysferline ;
- la séquence vii) du second AAV correspond aux exons (x+1) à 55 du gène de la dysferline, avec x compris entre 18 et 41, avantageusement égale à 28.
7/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le premier vecteur AAV comprend le promoteur synthétique C5-12 ou le promoteur de la desmine, lié fonctionnellement à la portion du gène de la dysferline.
8/ Composition selon l'une des revendications précédentes caractérisée en ce que le second vecteur AAV comprend un signal de polyadénylation, avantageusement la séquence polyA de SV40, en aval de la portion du gène de la dysferline.
9/ Composition selon l'une des revendications précédentes comme composition de combinaison pour son utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps en thérapie génique, notamment pour le traitement des dysferlinopathies.
10/ Méthode pour exprimer la dysferline in vitro chez une cellule hôte comprenant la mise en contact entre la cellule et la composition selon l'une des revendications 1 à 9 ou entre la cellule et les plasmides permettant l'obtention de la composition selon l'une des revendications 1 à 9.
11/ Méthode pour exprimer la dysferline selon la revendication 10 caractérisée en ce que la cellule hôte est une cellule de mammifère, préférentiellement une cellule humaine.
12/ Méthode pour exprimer la dysferline selon la revendication 10 ou 11 caractérisée en ce que la cellule hôte est une cellule musculaire.
13/ Utilisation de la composition selon l'une des revendications 1 à 9 pour la préparation d'un médicament. 14/ Utilisation de la composition selon l'une des revendications 1 à 9 pour la fabrication d'un ou plusieurs médicaments destinés à la thérapie génique, notamment au traitement des dysferlinopathies.
15/ Utilisation selon la revendication 13 ou 14 caractérisée en ce que les deux vecteurs AAV sont conditionnés dans un même médicament.
16/ Utilisation selon la revendication 13 ou 14 caractérisée en ce que chaque vecteur
AAV est conditionné dans un médicament distinct.
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