WO2008150187A1 - Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method - Google Patents

Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method Download PDF

Info

Publication number
WO2008150187A1
WO2008150187A1 PCT/RU2007/000310 RU2007000310W WO2008150187A1 WO 2008150187 A1 WO2008150187 A1 WO 2008150187A1 RU 2007000310 W RU2007000310 W RU 2007000310W WO 2008150187 A1 WO2008150187 A1 WO 2008150187A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
rna
complexes
cells
dna
txaa
Prior art date
Application number
PCT/RU2007/000310
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Inventor
Jury Fedorovich Drygin
Iosif Grigorievich Atabekov
Olga Alexandrovna Kondakova
Sergei Nikolaevich Chirkov
Elena Sergeevna Gavryushina
Original Assignee
Jury Fedorovich Drygin
Iosif Grigorievich Atabekov
Olga Alexandrovna Kondakova
Sergei Nikolaevich Chirkov
Elena Sergeevna Gavryushina
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jury Fedorovich Drygin, Iosif Grigorievich Atabekov, Olga Alexandrovna Kondakova, Sergei Nikolaevich Chirkov, Elena Sergeevna Gavryushina filed Critical Jury Fedorovich Drygin
Priority to PCT/RU2007/000310 priority Critical patent/WO2008150187A1/en
Publication of WO2008150187A1 publication Critical patent/WO2008150187A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides

Definitions

  • the invention relates to molecular biology, biotechnology, genetic engineering and medicine, and can be used as a universal method for isolating RNA, including for diagnostic purposes in mass analysis using DNA (PHK) probes, RT-PCR, etc.
  • the invention also relates to the use of ammonium trichloroacetate as an agent that effectively destroys natural complexes of nucleic acids - RNA and DNA.
  • guanidine thiocyanate is used in a mixture with phenol (in the English language literature TRIZOL Reagent (USPattern No.5346994)), hot water-saturated phenol, phenol with 0.5-4% sodium dodecyl sulfate, chloroform with sodium chloride in a concentration of IM and higher (used by the diagnostic company Agdia, USA).
  • phenol in the English language literature TRIZOL Reagent (USPattern No.5346994)
  • hot water-saturated phenol phenol with 0.5-4% sodium dodecyl sulfate
  • chloroform with sodium chloride in a concentration of IM and higher
  • Trichloroacetate ion is a powerful chaotropic agent and ranks first in the series of chaotropes (Hofeister series) used to destroy complex complexes: CCl 3 COO " > SCN " > gyanidine + > C1O 4 " > Br " > NO 3 " [R.M . C. Dawsop, D.S. Elliott, W.N. Elliott, K. M. Jopes, Datog Biochemil Research, Zd ed., CP., Oxford, 1986].
  • Trichloroacetic acid (TCA) is known to be traditionally A 5–20% concentration is used for the quantitative precipitation of proteins and nucleic acids in the cold from solutions at pH ⁇ l (G.
  • RNA purification from proteins is used either by their extraction with phenol (for phenol-detergent deproteinization) or selective sorption-desorption of RNA on amorphous silica gel ( R. Voom, C.J.A. SoI, M.M.M. Salimaps, CL. Japsep, R.M.E. Werthim-vap Dillep, J. vap der Nordaa J. CHn. Misgob.
  • the main objective of the present invention was to develop a method for isolating RNA, and then DNA, in which the toxic chaotropic deproteinizing agents used were replaced by a non-toxic agent to reduce the danger associated with the nucleic acid isolation procedure and drastically reduce environmental pressure on the environment.
  • Another objective of the invention was to develop a method for isolating RNA, in which RNA is purified using cheap and widely available materials based on fibrous cellulose, such as, for example, filter paper and cotton wool.
  • RNA complexes are not limited to ribonucleoprotein complexes (viruses, ribosomes, informosomes, etc.). In nature, RNA can also be in complexes with DNA (see, for example, RF Itzhaki, et al. “Fractiophthalis diffuse hep dilute salt.”, Nuclide Acids Res. (1978) 5 (3): 739-750; cell membranes (L. Dorssers, et al.
  • RNA purifier ammonium trichloroacetate
  • the authors preferred the ammonium cation, since the formed ammonium salts of RNA are readily soluble at low concentrations of ammonium salt in solution (important for dissolving RNA from the precipitate) and selectively precipitate at a high concentration of ammonium salt (2-10 M short RNAs precipitate at a higher concentration of ammonium ions), see, for example, the protocol of the company EPICENTRE ® Biotechnology "A Simplicity Method for RNA Purification Technology in Vitro Technology Reactions ”, in which RNA in a pure transcription system is selectively precipitated with high concentrations of ammonium acetate, while the DNA and nucleotides remain in solution.
  • the invention allows to drastically reduce the danger associated with the RNA isolation procedure, drastically reduce environmental pressure on the environment and simplify the method of obtaining the total RNA fraction from healthy, virus or viroid-infected plant, animal or bacterial cells.
  • the present invention provides a method for the isolation and purification of total RNA from healthy or infected with viruses or viroid cells of plants, animals, or bacteria, as well as DNA.
  • high molecular weight chromosomal DNAs can be obtained, since trichloroacetate mixes well with the aqueous phase of the cell or nuclear lysate.
  • This makes it possible to exclude shaking of the DNA solution with a deproteinizing agent, which is necessary in the case of Trizol, phenol, chloroform, etc., which are poorly miscible with water.
  • TXAA is able to effectively exert a dissociating effect on any naturally occurring complexes formed by nucleic acids, in particular nucleoprotein ones.
  • the method can be used both for the isolation of viroid or viral RNA, and for the isolation of RNA and DNA from cells of plants, animals or bacteria.
  • the present invention relates to a method for isolating total RNA from viruses, bacteria, plant cells (including viroid RNA) or animals, comprising the following stages: a) dissociation of nucleoprotein and other natural nucleic acid complexes with ammonium trichloroacetate; and b) purification of RNA by sorption-desorption of RNA on filter paper or cotton wool.
  • the cells of plants, animals, or bacteria are healthy cells.
  • the cells of plants, animals or bacteria are cells infected with viruses, infected or transformed by a viroid.
  • the dissociation of nucleoprotein and other the complexes are carried out using an aqueous solution of ammonium trichloroacetate in a final concentration of 2-4 M in an environment having a pH close to neutral at room temperature.
  • the present invention relates to the use of ammonium trichloroacetate as an agent for the dissociation of natural nucleic acid complexes.
  • RNA complexes are nucleoprotein complexes, more preferably viruses, informosomes, ribosomes.
  • RNA complexes are complexes with DNA or with cell membranes.
  • the natural nucleic acid complexes are DNA complexes.
  • the DNA complexes are nucleoprotein complexes.
  • FIG. IA Electrophoresis of XBK RNA preparations obtained by treating a viral preparation with a 3 M or 6 M TXAA solution at different times.
  • RNA preparations were carried out on a 1% agarose gel, RNA was stained with bromide this day.
  • FIG. 1B Electrophoresis of BTM RNA preparations obtained by treating a viral preparation with a 4 M TXAA solution at different times.
  • RNA preparations were carried out on a 1% agarose gel, RNA was stained with ethidium bromide.
  • FIG. 2 Comparison of the electrophoretic mobility of BTM RNA and XBK RNA preparations isolated from purified viruses using TXAA (lanes 1 and 3) and the phenol-chloroform deproteinization method (lanes 2 and 4).
  • RNA preparations have the same electrophoretic RNA mobility.
  • FIG. 3 TXAA inhibits cell nucleases.
  • Lane 1 A clarified potato leaf lysate (100 mg) of potato was added to an XBK RNA solution in the presence of 3 M TXAA. The mixture was incubated for 30 min at room temperature, passed through a cellulose suspension column and analyzed by RNA gel electrophoresis. Lane 2 - Control. RNA was incubated as described above; water was added to the reaction mixture instead of the cell lysate.
  • FIG. 4 Electrophoresis of total cellular RNA preparations obtained at different final concentrations of TXAA from potato leaf tissue.
  • Lanes 1–4 Total potato RNA isolated using 2.5 M, 3 M, 3.5 M, and 4 M TXAA, respectively. A weighed portion of plant tissue (100 mg) was suspended at room temperature in a different concentration of TXAA solution and kept for 30 min. RNA was purified on a microcolumn with filter paper (see examples). The RNA pellet was dissolved in 50 ⁇ l, 15 ⁇ l of RNA solution was applied to the gel. Lane 5 - XBK RNA (2 ⁇ g) isolated by the phenol-detergent method.
  • FIG. 5 Electrophoresis of RNA preparations obtained using TXAA from ascites carcinoma cells Krebs P.
  • Lanes 1, 6 Total RNA of uninfected Krebs II cells isolated by the phenolic method (4 ⁇ g); lane 2 - total RNA of uninfected Krebs II cells isolated by TXAA (10 ⁇ g); lane 3 — total RNA of Krebs II-infected Mengo virus cells isolated by TXAA (10 ⁇ g); lane 4 — Mengo virus RNA (2 ⁇ g) isolated by the phenolic method; lane 5 - BTM RNA (2 ⁇ g) isolated by the phenolic method.
  • FIG. 6 Optical absorption spectra of total RNA isolated from Krebs II ascites carcinoma cells.
  • FIG. 7 Electrophoretic analysis of the preparation of cellular RNA from the bacterium Escherichia coli obtained using ammonium trichloroacetate.
  • Lane 1 - witness - lbs RNA of E. coli isolated by the phenol-detergent method of deproteinization The preparation contains 5s rRNA and trace amounts of tRNA.
  • Lanes 2-4 An RNA preparation obtained by treating 2.8 M TXAA bacteria. To the holes 12 ⁇ l (2), 5 ⁇ l (3) and 1 ⁇ l (4) were applied from 50 ⁇ l of a cell RNA preparation solution obtained from 20 mg of frozen cells. Less mobile RNA (the zone immediately above the Ibs rRNA in the resulting preparation) corresponds to the mobility of 23 ⁇ rRNA of bacteria.
  • FIG. 8 Detection of the recombinant plasmid pGEM-ZZ (PSTVd) with the cDNA insert of the potato tuber spindle viroid (BBKK) and the viroid itself (BBKK, PSTVd) by MGA ELISA on a nitrocellulose membrane in RNA preparations obtained with TXAA filters and purified paper , from collection varieties of potatoes using a DNA probe (dienPt) pGEM-ZZ (PSTVd).
  • the top row of numbers indicates the amount of recombinant plasmid in picograms (pg) deposited on the membrane.
  • 400 pg of total RNA preparations isolated by TXAA from infected (lane 1) and healthy (lane 2-4) plants were applied to the membrane.
  • Nucleic acid preparations were fixed on a nitrocellulose membrane by irradiation with UV light at 254 nm and were detected by hybridization with a specific DNA probe.
  • a DNA probe is a recombinant plasmid containing an insert of a viroid cDNA that determines the specificity of the probe.
  • the DNA probe contains a label - diene-platinum, which is a hapten and can be detected using specific antibodies (V.I. Kiseleva, M.F. Turchinsky, TB.Kolesnik, A.M. Attorney, Bioorg. Chemistry, T. 20, pp. 14-20 (1994)).
  • the bound primary antibodies were detected using conjugates of secondary antibodies with the enzyme and its chemiluminescent substrate.
  • the luminescence of the enzymatic reaction products illuminates the x-ray film, allowing visualization of BBKK in the analyzed samples.
  • FIG. 9 Diagnostic analysis of the infection of potatoes with the virus X using the MGA-ELISA technology.
  • Lane 1 is a recombinant plasmid containing an XBK cDNA insert.
  • Lanes 2-5 are total RNA preparations obtained from healthy (2, 4) and XBK (3, 5) infected potato plants (Nevsky variety) by the phenolic method (4, 5) and using TXAA (2, 3).
  • FIG. 10 A comparative analysis of the sensitivity of the diagnosis of viroid (BBKK) infection by PCR technology (see Fig. 10A), MGA-ELISA (Fig. 10B) and RT- PCR-MGA-ELISA (Fig. 10B) preparations of total RNA obtained using
  • TXAA from collection potato leaf tissue.
  • Lane d4 positive control — recombinant plasmid pGEM-ZZ (PSTVd); further - RNA preparations from test plants of varieties Udacha (1), Golubizna (2), Ilyinsky (3), Price (4), Lugovsky (5), Bryansk (6), Skoroplodny (7), Zhukovsky early (8), Bryansk novelty (9), Autumn (10), Christmas (11), Orlando (12), Elizabeth (13) and RNA from BBKK-infected tomatoes (14-17).
  • Lane M is a length marker (in bp), the numbers on the right indicate the lengths of DNA fragments of the lambda phage, the products of exhaustive hydrolysis of DNA by PsU restriction endonuclease.
  • RNA preparation from Udacha potato and sample 16 in FIG. 10B is an RNA preparation from a highly infected tomato.
  • FIG. 11 Determination of the specificity (diene-Pt) of a DNA probe (labeled recombinant plasmid with an Mengo virus cDNA insert) using MGA ELISA.
  • RNA preparations were obtained by phenol-detergent deproteinization. The analyzed preparations were applied to the nitrocellulose filter in the indicated amounts.
  • Lane 1 Mengo virus RNA (50 pg); 2 - Mengo virus RNA (5 pg); 3 - encephalomyocarditis virus RNA (VEMK, 50 pg); 4 - VEMK RNA (5 pg); 5 - RNA (BTM, 50 pg); E.
  • coli 6-16S rRNA (50 pg); 7-12 - recombinant plasmid with the insertion of cDNA of Mengo virus (7 - 1 ng, 8 - 250 pg, 9 - 50 pg, 10 - 12.5 pg, 11 - 2.5 pg, 12 - 0.5 pg).
  • FIG. 12 Determination of viral RNA in Krebs II cells infected Mengo virus, MGA-ELISA
  • the upper row is the total RNA of Krebs II cells infected with the Mengo virus.
  • the bottom row is the total RNA of uninfected Krebs II cells.
  • FIG. 13 Determination of BBKK by a diene-platinum DNA probe in preparations of viroid RNA (rows 2-4) obtained by different methods from leaf tissue of potatoes.
  • Rows 1 and 5 are from healthy plants.
  • the present invention provides a new environmentally friendly method for producing pure RNA preparations from viruses, bacterial, plant and animal cells, and viroid RNA.
  • the proposed method differs from the known methods using a non-toxic chaotropic / dissociating nucleic acid complexes of an agent, ammonium trichloroacetate.
  • Ammonium trichloroacetate is not included in the list of toxic substances (PAN (Restiside ⁇ stiop Netw Albanyrk N Cincinnatirth ⁇ m convincedrisa) Restiside Database, ⁇ mmopium trichloroacetate) in Canada and the USA.
  • PAN Estimatside ⁇ stiop Netw Albanyrk N Cincinnati ⁇ m convincedrisa
  • Restiside Database ⁇ mmopium trichloroacetate
  • Another advantage of the claimed method is its versatility and the possibility of application for the isolation of RNA of various origin.
  • TCA trichloroacetic acid
  • a trichloroacetate ion has a chaotropic (in this case, dissociating complex natural complexes, which include nucleic acids).
  • chaotropic in this case, dissociating complex natural complexes, which include nucleic acids.
  • This chaotropic agent is an alternative to highly toxic substances that are currently widely used in the isolation of RNA, namely, guanidine thiocyanate, phenol and chloroform.
  • RNA preparations obtained by the developed method are suitable for molecular diagnostics of viral infections of plants and animals by the technologies MGA-IFA, PCR (polymerase chain reaction), RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) and DNA chips.
  • the developed method is suitable for isolating a variety of RNA from various sources.
  • the method of the present invention can be used to isolate various RNAs from viruses, as well as from cells of bacteria, plants, and animals, viroid RNA.
  • the method is suitable for isolation of total cellular and viral RNA in the case of plant cells, animals and bacteria infected with viruses or plant cells infected with viruses.
  • RNA preparations obtained from plant tissue and ascites carcinoma cells using the method of the present invention contain typical eukaryotic ribosomal RNAs (18s and 28s rRNAs) with the expected electrophoretic mobility relative to viral RNAs and cell RNAs isolated using the standard phenolic method.
  • the method of the present invention involves the use of filter paper or cotton wool. Without intending to be limited by any scientific theory, the authors suggest that high concentration of TXAA causes the dissociation of both viruses and cellular nucleoprotein complexes, while proteins denature and completely precipitate in the presence of 70% propanol-2, insoluble in water.
  • RNA it is most preferable to purify the isolated RNA on filter paper or cotton wool in a column chromatography format.
  • filter paper is first crushed if necessary, then crushed paper or cotton is loaded into a column, washed and equilibrated with a buffer containing TXAA.
  • the purification procedure includes applying a virus or cell extract preparation treated with TXAA, washing the column with the preparation with buffer containing TXAA, and eluting the RNA with water.
  • RNA sorption-desorption procedure can be carried out by gravity (under the action of gravity), as well as with a small vacuum, which can be created using, for example, a water-jet pump.
  • Columns can be any column that is commercially available from a wide range of manufacturers of chromatographic equipment, as well as conventional medical plastic syringes.
  • the cleaning procedure on columns with fibrous cellulose can be carried out both individually and using a homemade specially made cassette device.
  • TXAA TXAA for the isolation of nucleic acids of various origins, in particular viral RNA from plant and animal viruses. It was found that treatment of potato and tobacco viruses with 3 M TXAA solution (Table 1) for 5 min leads to the dissociation of viral nucleoproteins and the release of RNA molecules, possessing electrophoretic mobility identical to RNA preparations that were obtained from the same viruses by the classical method of phenol-detergent deproteinization, and the dependence of the RNA yield from different plants quantitatively coincided with the theoretical RNA yields (Table 2) and did not yield to RNA yields upon extraction using the phenol chloroform deproteinization.
  • Example 1 The selection of RNA from plant viruses using ammonium trichloroacetate on the example of the tobacco mosaic virus RNA (BTM, TMV)
  • the composition of solutions A, E, TE, and C is shown in Table 1.
  • Filter paper (REAHIM) or sterile cotton wool was used. 0.5 g of filter paper was cut with scissors into small squares (2x2 mm). Transferred to a 50 ml centrifuge tube. Pour 10 ml of solution A. Hold for 5 minutes and vigorously shake on a Vortex shaker to grind the bulk of the pulp into a suspension of paper fibers. A suspension of 70-80 ml of water was diluted and filtered under vacuum. The resulting cellulose paste was suspended in TE buffer solution, packaged in suspension (10 mg / ml) and stored at room temperature.
  • Microcolumns for RNA purification were prepared from 1 ml insulin syringes (ejecting the piston) with a removable needle. To do this, put a paper filter on the bottom of the syringes, fill the columns with 1 ml of cellulose paste under the shallow vacuum of the water-jet pump, using the cartridge we designed. The sorbent was washed with 0.5 ml of solution C, and then 2 times with 0.5 ml of 70% ethyl alcohol and dried for 5-10 minutes under vacuum.
  • RNA bound to the sorbent was eluted with deionized water (MiIIiQ). 1 ml of water was layered on the column three times (waiting until the next portion of water was completely absorbed into the cotton wool) and 3 fractions of the eluate were obtained. The volume of the first fraction varied from 250 to 350 ⁇ l; the volume of the second and third fractions was 1 ml.
  • RNA after treatment of viral particles of TXAA were close to theoretical, and the optical characteristics corresponded to highly purified RNA.
  • Example 2 The selection of RNA from plant viruses using ammonium trichloroacetate on the example of potato virus X RNA (XBK, PVX)
  • RNA yield is close to theoretical (Table 2), and the spectral characteristics (A 260 / A 280 'table 2) and electrophoretic mobility (Fig. . 1, 2) correspond to highly purified viral RNA.
  • Example 3 Isolation of cellular RNA by the example of RNA isolation from leaf tissue of potato using TXAA
  • TXAA TXAA to dissociate not only viral, but also cellular nucleoproteins has been studied on plant and animal cells.
  • RNAs Isolation of high molecular weight viral and cellular RNAs from plant and animal cells at room temperature is possible only in the case of inhibition of cellular ribonucleases by the used chaotropic / dissociating agent. Indeed, incubation of viral RNA with a cell lysate in the presence of TXAA does not cause a noticeable hydrolysis of the viral RNA (Fig. 3), and cellular RNAs have an electrophoretic mobility that matches that of whole rRNA and tRNA molecules. At the same time, in the absence of TXAA, all RNAs were completely degraded (not shown).
  • a sample (50-100 mg) of potato plant tissue (test plant) at room temperature was ground in a mortar with 500-1000 ⁇ l of buffer solution E (Table 1) for deproteinization and RNA extraction.
  • the mixture was transferred to a test tube, 50-100 ⁇ l of a suspension of filter paper in a 4 M TXAA solution was added, and to the resulting mixture was added propanol-2 to a final concentration of 70%.
  • the mixture was applied to a microcolumn filled with a suspension (200 ⁇ l) of cellulose or cotton wool (the columns were filled in advance, they can be stored for a long time). As a rule, several (up to a hundred) samples were prepared simultaneously.
  • RNA sorbed on fibrous cellulose was eluted with distilled water (2x500 ⁇ l) and concentrated by precipitation with alcohol. The precipitate was dissolved in 50 ⁇ l of water.
  • Fig. 4 An agarose gel electrophoretic analysis (Fig. 4) of the resulting preparation of total potato cellular RNA showed that the preparation contains a typical set of eukaryotic ribosomal and transport RNAs.
  • the ratio A 260 / A 28 o for preparations of total potato RNA was in the range of 1.85-2.0, which is typical for deproteinized RNA.
  • Example 4 Isolation of cellular RNA from leaf tissue of tobacco Ni restroomtiapa glitiposa using ammonium trichloroacetate A weighed portion of 1 g of fresh tobacco leaf was quickly homogenized in a mortar with 6 ml of buffer solution E with different contents of TXAA. Sample homogenization time during incubation was not included. Aliquots of 1.5 ml were collected in microcentrifuge tubes and incubated for 5, 10, 20, and 30 min at room temperature without stirring. Then, the samples were centrifuged (10,000 x g, 5 min) in a Errepdor 5414 benchtop centrifuge. Centrifugation time was turned on during incubation. 1 ml of the supernatant was taken, mixed with 2.5 ml of isopropanol, and the mixture was layered on a column. The results of the isolation of total cellular tobacco RNA are presented in tables 3.4.
  • the optimal conditions for obtaining a cellular RNA preparation from tobacco should be considered: 3 M TXAA tissue processing, and the incubation time of the cell extract with TXAA is 20 minutes.
  • Example 5 The selection of cellular RNA from cells of ascites carcinoma (mice) Krebs II
  • hypotonic buffer (10 mM Tris-Hcl, 15 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , pH 8.0) was added to 430 mg of Krebs II cells and kept for 20 minutes in ice. Then the cells were homogenized in a downs manual homogenizer (20 tractions) and centrifuged for 10 minutes at 2500 rpm in the cold (nuclear fraction was precipitated). The supernatant was distributed in 12 tubes (0.9 ml each), 100 ⁇ l of 10% SDS, pH 7.8 were added and 3 deproteinizations were performed (equal volumes of phenol / chloroform mixture (9: 1) were added, vigorously shaken for 2-3 min. centrifuged for 2 min at 12,000 rpm).
  • RNAs are poorly soluble already in 2M TXAA and precipitate together with the dissociated denatured protein.
  • hypotonic buffer solution (10 mM Tris-Hcl, pH 8.0, 15 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 ) was added, kept for 20 min in ice, homogenized in a Downs hand-held homogenizer (20 tractions) and centrifuged 10 min at 5000 rpm
  • An equal volume of buffer solution E was added to the supernatant (Table 1), stirred and left overnight at + 4 ° C.
  • an equal volume of 100% propanol-2 was added to the mixture to complete RNA deposition, left for 1 h at -2O 0 C and centrifuged for 5 minutes at 12,000 rpm.
  • RNA of uninfected Krebs II cells RNA of the Mengo virus and tobacco mosaic virus isolated by the phenolic method were used.
  • RNA preparations obtained using TXAA are of great importance; nucleic acid preparations obtained by phenol-detergent deproteinization are standard.
  • a comparison of the optical absorption spectra of the total RNA preparations obtained from the cells of ascites carcinoma Kreb II using TXAA and the phenol-detergent method showed their complete identity (Fig. 6).
  • Example 6 Obtaining a preparation of cellular RNA from the bacterium Escherichia coli using ammonium trichloroacetate
  • E. coli cells (20 mg) were suspended in 200 ⁇ l of water for 3 min at room temperature and 800 ⁇ l of E. solution was immediately added. The cell lysate was kept for 5 min at room temperature and centrifuged for 20 min at 12000 rpm on a Errepdor 5414 benchtop centrifuge. 2 volumes of alcohol were added to the supernatant and the volume precipitate was separated by centrifugation. The precipitate was washed twice with 1 ml of 70% alcohol, dried in a vacuum desiccator and suspended for 10 min in 50 ⁇ l of water.
  • the insoluble precipitate was separated by centrifugation and 1, 5 and 12 ⁇ l samples were taken for analysis by agarose gel electrophoresis in the presence of ethidium bromide (Fig. 7). Electrophoretic analysis showed that bacterial cell nucleoproteins dissociate in the presence of TXAA, while ribosomal and transport RNAs are isolated in free form.
  • Example 7 Detection of RNA viroid of the spindle-shaped potato tubers (BBKK) in the total RNA preparation obtained using TXAA from an infected plant
  • the next objective of the invention was to prove the suitability of the obtained RNA preparations for the molecular diagnosis of viroid and viral infections of plants and animals, based on the principle of molecular hybridization of nucleic acids, i.e. for technologies MGA-IFA, RT-PCR, etc.
  • the technology for detecting the target nucleic acid MGA-ELISA is a combination of the Molecular Hybridization Analysis and Immuno-Enzyme Analysis methods.
  • Nucleic acid preparations of the analyzed plant and animal samples are fixed by irradiation with UV light on a nitrocellulose membrane and hybridized with a specific DNA probe.
  • a DNA probe is a recombinant plasmid containing a cDNA insert of a virus or viroid, which determines the specificity of the probe.
  • the DNA probe contains a label - diene-platinum, which is a hapten and can be detected using specific antibodies (V.I. Kiseleva, M.F. Turchinsky, TB.Kolesnik, A.M. Attorney, Bioorg. Chemistry, 20, pp. 14-20 (1994).
  • the bound primary antibodies are detected using commercially available conjugates of secondary antibodies with the enzyme and its chemiluminescent substrate. The luminescence of the enzymatic reaction products illuminates the X-ray film, allowing the pathogen to be visualized in the analyzed samples.
  • RNA preparation obtained from infected cells can be determined using a specific DNA probe.
  • RNA preparation from 100 mg of potato leaf tissue was dissolved in 60 ⁇ l of sterile water. Prior to analysis, the experimental and control samples were denatured in a boiling water bath (3 min), quickly cooled in ice water, and 2 ⁇ l of the analyzed RNA solution was applied to nitrocellulose filters Protap BA-85 or BA-83 (Schleicher & Shuell).
  • the filters were baked at 80 ° C in vacuum (on a standard dryer for polyacrylamide gels) for two hours or irradiated with UV light (Drygin Yu.F., Buzmakov AB, Teterina H.L., Morozov SJ. Molec. Biol . - 1992. - T. 26. - ML. - p. 59-69).
  • RNA fraction from infected potato enriched with viroid RNA by differential precipitation of BBKK with LiCl solutions was separated by electrophoresis in a 7% polyacrylamide gel.
  • Four zones close in mobility to a polynucleotide with a length of 459 nucleotides were excised from the gel.
  • coli cells and isolation of pGEM-ZZ was performed according to the protocols (Mapiatis, T ., Fritsh, E.F. apd Sambrook, J. 1989. Molesuloplopg, A Laboru Mapual (2 nd ed.), CoId Sprig Nagor Laborogo, CoId Sprig Nagog, NY). Additionally, the plasmid was purified by equilibrium centrifugation (see A Laboru Mapul, mentioned above) in the density gradient of cesium chloride with ethidium bromide and was hydrolyzed with WatHl restrictase. Phenol deproteinized in the presence of sodium dodecyl sulfate plasmid was used to synthesize a DNA probe.
  • RNA preparations for molecular diagnostic analysis were determined visually.
  • a plasmid with experimental samples was subjected to serial dilutions of denatured pGEM-ZZ (PSTV in a series of 200 - 0.1 pg of plasmid, which served as an internal indicator of the sensitivity of pathogen determination in this experiment.
  • Samples applied onto a nitrocellulose membrane were hybridized with labeled pGEM-ZZ recombinant DNA diene-platinum (PSTV).
  • PSTV labeled pGEM-ZZ recombinant DNA diene-platinum
  • the bound probe was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay on membranes. Hybridization conditions of the BBKK-specific DNA probe and visual determination of Tests of the analyzed samples (see Fig.
  • a DNA probe i.e. about Zl O "20 g mole [Drygin Yu.F., Musin SM., Kondakova OA, Savenkov E.I., Solomatin CB, Mozheva KA, academician PACXH Atabekov I.G. ((Molecular diagnosis of infection of healthy potato varieties Of the Russian Federation with viroid spindle-shaped spiders ”, PACXH Reports, 6, 24-25 (1996); Kondakova OA, Drygin Yu.F. Diagnosis of potato viroid disease with probes (diene) Pt-DNK, Biotechnology, JY, pp. 83- 90 (1999)).
  • Example 8 The suitability of RNA preparations obtained from plants infected with viruses for diagnostic MGA-ELISA technology
  • RNA The detection of viral (BTM and XBK) RNA in infected plants was carried out similarly as described in Example 7, except for the use of specific for each virus DNA probes.
  • cDNAs of each virus were obtained by cloning ip vitro using RT-PCR and appropriate primers.
  • the length of the cloned DNA fragments was in the range of 450-1600 nucleotide pairs.
  • an XBK potato infection is reliably visible in a series of concentrations of total RNA of 200-2000 ng / ⁇ l, moreover, viral RNA is determined in the same way both in preparations obtained by classical phenol-detergent deproteinization and in a preparation obtained using TXAA ( Fig. 9).
  • Example 9 The suitability of RNA preparations obtained from plants infected with viruses for the diagnosis of RT-PCR and RT-PCR-MGA-ELISA technologies
  • TXAA-derived RNA preparations were amplified by RT-PCR and the products were analyzed by gel fluorescence (Fig. 10A). Similar samples were applied to a nitrocellulose filter (Fig. 10B) and analyzed by MGA-ELISA (see Example 7) or by RT-PCR- MGA-ELISA (Fig. 10B).
  • MGA-IFA ⁇ OT-PCR MGA-IFA-OT-PCR
  • RNA preparations obtained from plant materials are suitable for diagnostic analysis using RT-PCR and RT-PCR-MGA-ELISA.
  • Example 10 Determination of viral RNA by MGA-ELISA technology in a total RNA preparation obtained from Krebs II carcinoma cells infected with Mengo virus
  • RNA preparations from uninfected and infected cells were obtained as described in Example 5.
  • the DNA probe was a recombinant plasmid containing a Mengo virus cDNA insert labeled with dien-platinum.
  • the labeling of specific recombinant DNA with dien-platinum and the detection of the target viral RNA were performed as described in Example 7.
  • the specificity of the DNA probe was determined on control (positive and negative) RNA preparations. Determination of the specificity of the (diene-Pt) -DNA probe (labeled recombinant plasmid with the addition of Mengo virus cDNA) by MGA-ELISA is shown in FIG. 11.
  • the used DNA probe labeled with diene-platinum has a high specificity.
  • DNA probe is not recognizes not related RNAs, namely, BTM RNA and E. coli 16S rRNA.
  • the DNA probe to the Mengo virus is significantly better (compare samples 2 and 4) than VEMK RNA recognizes the Mengo virus RNA.
  • FIG. Figure 12 shows the result of a diagnostic analysis of ascites carcinoma cells in total RNA preparations obtained with TXAA after a 5-hour infection with their Mengo virus. Diagnostic analysis was carried out similarly to that described in Example 7. As can be seen, 10 ng of total cellular RNA isolated from infected cells 5 hours after infection is sufficient to determine viral infection in the early stages of infection, while “diene-platinum” The DNA probe does not bind to 1 ⁇ g of cellular RNA.
  • RNA preparations obtained from test plants or leaf potato tissue or from animal cells using TXAA are suitable for specific and sensitive diagnosis of viroid and viral infections of potato, plum and animal cells. It is important that animals can be diagnosed with picornavirus infection as early as 5 hours after infection, i.e. in its early stages, moreover, 10 ng of total cellular RNA isolated from infected cells is sufficient to detect viral RNA. It is important that the “wild” diene-platinum DNA probe is highly specific and does not bind to a huge excess (1 ⁇ g) of cellular RNA (Fig. 12).
  • Example 11 Comparative analysis of the detection efficiency of viroid RNA preparations obtained by different methods from leaf tissue of potato

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

The invention relates to molecular biology, biotechnology, gene engineering and medicine and provides a multi-purpose method for extracting and purifying RNA, including diagnosis for routine analysis by DNA(RNA)-probe, RT-PCR an other methods. The RNA and DNA are extracted by using ammonium trichloroacetate in a neutral aqueous medium and a filter paper or cotton wool suspension for sorbing RNA and for removing proteins, low-molecular compounds and similar therefrom. The inventive method makes it possible to extract RNA from plant and animal viruses and from plant, animal and bacterial cells, wherein the yield and the purity of RNA preparations are identical to preparations produced by conventional methods using highly toxic and dangerous reagents. In addition, said invention provides for the use of ammonium trichloroacetate in the form of a multipurpose agent for dissociating natural complexes formed by nucleic acids. Ammonium trichloroacetate is accessible, water-soluble, non-toxic and ecologically friendly compound

Description

ПРИМЕНЕНИЕ ТРИХЛОР АЦЕТАТА АММОНИЯ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА APPLICATION TRICHLORO ACETATE AMMONIUM AS A MEANS
ДЛЯ ДИССОЦИАЦИИ ПРИРОДНЫХ КОМПЛЕКСОВ НУКЛЕИНОВЫХFOR DISSOCIATION OF NATURAL NUCLEINE COMPLEXES
КИСЛОТ И СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РНКAcid and RNA Isolation Method
Область техники, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано в качестве универсального способа выделения РНК, в том числе для диагностических целей при массовых анализах методами ДHK(PHK)-зoндoв, ОТ-ПЦР и т.п. Изобретение также относится к применению трихлорацетата аммония в качестве средства, эффективно разрушающего природные комплексы нуклеиновых кислот - РНК и ДНК.The invention relates to molecular biology, biotechnology, genetic engineering and medicine, and can be used as a universal method for isolating RNA, including for diagnostic purposes in mass analysis using DNA (PHK) probes, RT-PCR, etc. The invention also relates to the use of ammonium trichloroacetate as an agent that effectively destroys natural complexes of nucleic acids - RNA and DNA.
Уровень техникиState of the art
Традиционно и наиболее широко для депротеинизации и выделения РНК из вирусов и клеток организмов используют гуанидинтиоцианат в смеси с фенолом (в англоязычной литературе TRIZOL Rеаgепt (U.S.Раtепt No.5346994)), горячий водонасыщенный фенол, фенол с 0,5-4% додецилсульфатом натрия, хлороформ с хлористым натрием в концентрации IM и выше (используется диагностической фирмой «Aгдия», США). Вышеперечисленные депротеинизирующие агенты являются высоко токсичными и опасными с точки зрения возможности загрязнения окружающей среды.Traditionally and most widely, for the deproteinization and isolation of RNA from viruses and cells of organisms, guanidine thiocyanate is used in a mixture with phenol (in the English language literature TRIZOL Reagent (USPattern No.5346994)), hot water-saturated phenol, phenol with 0.5-4% sodium dodecyl sulfate, chloroform with sodium chloride in a concentration of IM and higher (used by the diagnostic company Agdia, USA). The above deproteinizing agents are highly toxic and dangerous in terms of the possibility of environmental pollution.
Особую значимость в настоящее время приобретает разработка способа выделения вирусных и клеточных РНК с помощью нетоксичного хаотропного/диссоциирующего комплексы РНК агента для массового диагностического анализа и промышленного производства препаратов РНК. Из-за отсутствия эффективных методов лечения оздоровление сельскохозяйственных культур основано на регулярной диагностике, выбраковке зараженных и отборе здоровых растений для производства здорового семенного и посадочного материала. Принимая во внимание, что одна лишь культура картофеля требует диагностирования, минимум, шести вирусов и вироида, становится очевидным, что необходимое количество анализов в растениеводстве и селекции только в РФ ежегодно оценивается миллионами. Рост экономических потерь, связанных с укрупнением животноводческих комплексов, при эпизоотиях, вызванных вирусными инфекциями (вирусом ящура, птичьего гриппа или чумы и др.), также вынуждает проводить систематический контроль зараженности животных вирусами. Таким образом, развитие безвирусного растениеводства и животноводства прямо зависит от создания эффективных и безопасных методов массовой диагностики вирусов и вироидов.Of particular importance is the development of a method for isolating viral and cellular RNAs using a non-toxic chaotropic / dissociating RNA complexes agent for mass diagnostic analysis and industrial production of RNA preparations. Due to the lack of effective treatment methods, crop recovery is based on regular diagnostics, rejection of infected and selection of healthy plants for the production of healthy seed and planting material. Taking into account that a potato culture alone requires the diagnosis of at least six viruses and a viroid, it becomes obvious that the required number of analyzes in crop production and selection in the Russian Federation alone is estimated in millions. The growth of economic losses associated with the enlargement of livestock complexes, with epizootics caused by viral infections (foot-and-mouth disease virus, bird flu or plague, etc.), also forces a systematic monitoring of infection of animals with viruses. Thus, the development of virus-free crop production and animal husbandry directly depends on the creation of effective and safe methods for mass diagnosis of viruses and viroids.
Очевидно, что применение до настоящего времени ядовитых веществ: гунидинтиоцианата, фенола, хлороформа и др. для выделения РНК в промышленном производстве и диагностических целях при массовом анализе создает серьезную проблему для окружающей среды.It is obvious that the use of toxic substances: gunidinium thiocyanate, phenol, chloroform, etc., to isolate RNA in industrial production and diagnostic purposes during mass analysis creates a serious environmental problem.
Трихлорацетат-ион является мощным хаотропным агентом и занимает первое место в ряду хаотропов (Ноfiпеistеr sеriеs), используемых для разрушения сложных комплексов: CCl3COO" >SCN" >гyaнидин+ >C1O4 " >Br" >NO3 " [R.М.С. Dаwsоп, D.С. Еlliоtt, W.Н. Еlliоtt, К.М. Jопеs, Dаtа fог Вiосhеmiсаl Rеsеаrсh, Зd еd., СР., Охfоrd, 1986]. Известно, что традиционно трихлоруксусную кислоту (ТХУ) в 5-20%-нoй концентрации используют для количественного осаждения белков и нуклеиновых кислот на холоду из растворов при pH~l (G. Sсhmidt and S. J. Thannhauser "A mеthоd fог thе dеtеrmiпаtiоп оf dеохуribопuсlеiс асid, ribопuсlеiс асid, апd рhоsрhоргоtеiпs iп апimаl tissuеs" J. Вiоl. Сhеm. 161, 83-89 (1945)). Традиционно для очистки РНК от белков используется либо их экстракция фенолом (при фенольно-детергентной депротеинизации), либо избирательная сорбция-десорбция РНК на аморфном силикагеле (R. Вооm, С.J.А. SoI, М.М.М. Sаlimапs, CL. Jапsеп, Р.М.Е. Wеrthеim-vап Dillеп, J. vап dеr Nоrdаа J. CHn. Мiсгоb. 28 (1990) 495-503) после предварительной обработки нуклеопротеидов (либо клеточного экстракта) раствором гуанидинтиоцианата с фенолом (P. Сhоmсzупski, N. Sассhi, Апаl Вiосhеm. 162 (1987) 156-159). Последний метод широко используется в настоящее время. Известно применение гранулированной целлюлозы CF-I l (Whаtmап) для хроматограф ического разделения однонитевых и двунитевых РНК (R.М. Frапkliп "Рurifiсаtiоп апd рrореrtiеs оf thе rерliсаtivе iпtеrmеdiаtе оf thе bасtеriорhаgе Rl 7" Рrос. Nаtl. Асаd. Sсi. USA, 55, 1504-1511 (1966); H. D. Rоbеrtsоп, N. D. Ziпdеr "Рurifiсаtiоп апd Рrореrtiеs оf Nаsсепt f2 Рhаgе Ribопuсlеiс Асid" J. Вiоl. Сhеm. 244, 5790-5800 (1969)), а также применение волокнистых хроматографических бумаг 3MM (Whаtmап, США) или N° 903 (Sсhlеihеr & Sсhuеll, Германия) для очистки РНК [X. Su, А.М. Соmеаu, Апаlуt. Вiосhеm. 267, 415-418 (1999)]. Сущность изобретенияTrichloroacetate ion is a powerful chaotropic agent and ranks first in the series of chaotropes (Hofeister series) used to destroy complex complexes: CCl 3 COO " > SCN " > gyanidine + > C1O 4 " > Br " > NO 3 " [R.M . C. Dawsop, D.S. Elliott, W.N. Elliott, K. M. Jopes, Datog Biochemil Research, Zd ed., CP., Oxford, 1986]. Trichloroacetic acid (TCA) is known to be traditionally A 5–20% concentration is used for the quantitative precipitation of proteins and nucleic acids in the cold from solutions at pH ~ l (G. Schmidt and SJ Thannhauser "Method method of thermothermal acid, ribopulic acid, industrial s іp apimal tiss tiss """J. J. Biol. Chem. 161, 83-89 (1945)). Traditionally, RNA purification from proteins is used either by their extraction with phenol (for phenol-detergent deproteinization) or selective sorption-desorption of RNA on amorphous silica gel ( R. Voom, C.J.A. SoI, M.M.M. Salimaps, CL. Japsep, R.M.E. Werthim-vap Dillep, J. vap der Nordaa J. CHn. Misgob. 28 (1990) 495-503) after preliminary processing of nucleoproteins (or a cell extract) with a solution of guanidine thiocyanate with phenol (P. Schotszupski, N. Sasshi, Apal Biochem. 162 (1987) 156-159). The latter method is widely used at present. It is known to use granular cellulose CF-I l (Whtmap) for chromatographic separation of single-stranded and double-stranded RNAs (R. M. Fraplip "Puritapiop aprprepertys оf tеrеlіpіtе iptеrmеdiаtе оf tеbеtеrаlсаtасlаtасlаtасlаtасlаtасlаtасаlаtаpаlаtаpаlаtасlаtаpаlаtаpаlаtаpаlаtаpal. , 1504-1511 (1966); HD Robertsop, ND Zipder "Rurifiсtiop app and Рrоrеtеs оf Nаssept f2 Раge Ribopusleis Аsid" J. Віl. Scheme. 244, 5790-5800 (1969), as well as chromatographic paper, 3 USA) or N ° 903 (Sсhlеihеr & Sсhuell, Germany) for the purification of RNA [X. Su, A.M. Сomeаu, Apalut. Bioshem. 267, 415-418 (1999)]. SUMMARY OF THE INVENTION
Главная цель настоящего изобретения состояла в разработке способа выделения РНК, а затем и ДНК, в котором используемые токсичные хаотропные депротеинизирущие агенты заменены нетоксичным агентом для уменьшения опасности, связанной с процедурой выделения нуклеиновых кислот, и резкого снижения экологического давления на среду обитания. Другая цель изобретения состояла в разработке способа выделения РНК, в котором для очистки РНК применяются дешевые и общедоступные материалы на основе волокнистой целлюлозы, такие как, например, фильтровальная бумага и хлопковая вата.The main objective of the present invention was to develop a method for isolating RNA, and then DNA, in which the toxic chaotropic deproteinizing agents used were replaced by a non-toxic agent to reduce the danger associated with the nucleic acid isolation procedure and drastically reduce environmental pressure on the environment. Another objective of the invention was to develop a method for isolating RNA, in which RNA is purified using cheap and widely available materials based on fibrous cellulose, such as, for example, filter paper and cotton wool.
Известно, что встречающиеся в природе комплексы РНК не ограничиваются рибонуклеопротеидными комплексами (вирусы, рибосомы, информосомы и др.). В природе РНК может также находиться в комплексах с ДНК (см. например, R F Itzhаki, еt аl. "Frасtiопаtiоп оf сhгоmаtiп bу diffегепtiаl sоlubilitу iп dilutе salt.», Nuсlеiс Асids Rеs. (1978) 5(3): 739-750; клеточными мембранами (L. Dоrssеrs, еt аl. "Рurifiсаtiоп оf Соwреа Моsаiс Viшs RNA Rерliсаtiоп Соmрlех: Idепtifϊсаtiоп оf а Virus-Епсоdеd 110,000-Dalton Роlурерtidе Responsible for RNA Сhаiп Еlопgаtiоп", Pr ос. Nаt. Асаd. ScL USA (1984), 7, 1951-1955; Giегеr, L. "Nаsсепt ribоsоmаl and messenger RNA in DNA- mеmbrапе-соmрlехеs оf Еsсhеriсhiа соli" (1973) MoI. Gеп. Gеп. 125, 2, 173-187; N. Таkеdа, еt аl. "Iпitiаtiоп оf роliоvirus рlus-stгапd RNA sупthеsis iп а mеmbrапе соmрlех оf iпfесtеd HeLa сеlls." J. Virоl. (1986); 60(1): 43-53).It is known that naturally occurring RNA complexes are not limited to ribonucleoprotein complexes (viruses, ribosomes, informosomes, etc.). In nature, RNA can also be in complexes with DNA (see, for example, RF Itzhaki, et al. “Fractiophthalis diffuse hep dilute salt.”, Nuclide Acids Res. (1978) 5 (3): 739-750; cell membranes (L. Dorssers, et al. "Puritaciof оf Свреа Mosaciс Viсhs RNA Relicatiop Сomplex: Ideptifocatiopf а and Virus-Еpocode 110,000-Dalton Рoluretid Responsible for Rnсhp. 7, 1951-1955; Gieger, L. "Nascept ribosomal and messenger RNA in DNA-membre-complexes of Escherichia coli" (1973) MoI. Gep. Gep. 125, 2, 173-187; N. Takeda, et al. "Ipitiatiop o rovio virus plus-stapap RNA supptsis ip and membrap comfax ipfest HeLa sells." J. Virol. (1986); 60 (1): 43-53).
В результате исследовательской деятельности авторы настоящего изобретения разработали новый способ выделения РНК из вирусов, бактерий, клеток растений, животных и, в том числе вироидной РНК, а так же ДНК. В этом способе используются трихлорацетат аммония (TXAA) в качестве агента, диссоциирующего сложные природные комплексы, в состав которых входят нуклеиновые кислоты, и фильтровальная бумага или хлопковая вата в качестве средства для очистки РНК.As a result of research, the authors of the present invention have developed a new method for isolating RNA from viruses, bacteria, plant cells, animals, including viroid RNA, as well as DNA. This method uses ammonium trichloroacetate (TXAA) as an agent that dissociates complex natural complexes that include nucleic acids, and filter paper or cotton wool as an RNA purifier.
При выборе противоиона для трихлорацетат-аниона авторы отдали предпочтение катиону аммония, поскольку образующиеся аммонийные соли РНК хорошо растворимы при невысоких концентрациях соли аммония в растворе (важно для растворения РНК из осадка) и селективно выпадают в осадок при высокой концентрации соли аммония (2-10 M, короткие РНК выпадают в осадок при более высокой концентрации ионов аммония), см. например, протокол фирмы ЕРIСЕNТRЕ® Вiоtесhпоlоgiеs «A Simрlе Меthоd for RNA Рurifiсаtiоп frоm In Vitrо Тrапsсriрtiоп Reactions», в котором РНК в чистой системе транскрипции селективно осаждается высокими концентрациями ацетата аммония, при этом ДНК и нуклеотиды остаются в растворе.When choosing a counterion for the trichloroacetate anion, the authors preferred the ammonium cation, since the formed ammonium salts of RNA are readily soluble at low concentrations of ammonium salt in solution (important for dissolving RNA from the precipitate) and selectively precipitate at a high concentration of ammonium salt (2-10 M short RNAs precipitate at a higher concentration of ammonium ions), see, for example, the protocol of the company EPICENTRE ® Biotechnology "A Simplicity Method for RNA Purification Technology in Vitro Technology Reactions ”, in which RNA in a pure transcription system is selectively precipitated with high concentrations of ammonium acetate, while the DNA and nucleotides remain in solution.
Изобретение позволяет резко уменьшить опасность, связанную с процедурой выделения РНК, резко снизить экологическое давление на среду обитания и упростить способ получения суммарной фракции РНК из здоровых или зараженных вирусами или вироидами клеток растений, животных или бактерий.The invention allows to drastically reduce the danger associated with the RNA isolation procedure, drastically reduce environmental pressure on the environment and simplify the method of obtaining the total RNA fraction from healthy, virus or viroid-infected plant, animal or bacterial cells.
Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает способ выделения и очистки суммарной РНК из здоровых или зараженных вирусами или вироидами клеток растений, животных, или бактерий, а также ДНК. Этим способом могут быть получены высокомолекулярные хромосомные ДНК, поскольку трихлорацетат хорошо смешивается с водной фазой клеточного или ядерного лизата. Это позволяет исключить встряхивание раствора ДНК с депротеинизующим агентом, необходимое в случае плохо смешивающихся с водой Тризола, фенола, хлороформа и т.п. Этот способ ориентирован на максимальное использование доступных недорогих реагентов и материалов и является универсальным, поскольку, как было установлено авторами настоящего изобретения, TXAA способен эффективно оказывать диссоциирующее действие на любые встречающиеся в природе комплексы, образуемые нуклеиновыми кислотами, в частности нуклеопротеидные. Таким образом, способ может быть использован как для выделения вироидных или вирусных РНК, так и для выделения РНК и ДНК из клеток растений, животных или бактерий.Thus, the present invention provides a method for the isolation and purification of total RNA from healthy or infected with viruses or viroid cells of plants, animals, or bacteria, as well as DNA. In this way, high molecular weight chromosomal DNAs can be obtained, since trichloroacetate mixes well with the aqueous phase of the cell or nuclear lysate. This makes it possible to exclude shaking of the DNA solution with a deproteinizing agent, which is necessary in the case of Trizol, phenol, chloroform, etc., which are poorly miscible with water. This method is focused on the maximum use of affordable inexpensive reagents and materials and is universal, since, as was established by the authors of the present invention, TXAA is able to effectively exert a dissociating effect on any naturally occurring complexes formed by nucleic acids, in particular nucleoprotein ones. Thus, the method can be used both for the isolation of viroid or viral RNA, and for the isolation of RNA and DNA from cells of plants, animals or bacteria.
В своем первом аспекте настоящее изобретение относится к способу выделения суммарной РНК из вирусов, бактерий, клеток растений (в том числе вироидных РНК) или животных, включающий следующие стадии: а) диссоциация нуклеопротеидных и других природных комплексов нуклеиновых кислот с помощью трихлорацетата аммония; и б) очистка РНК путем сорбции-десорбции РНК на фильтровальной бумаге или хлопковой вате.In its first aspect, the present invention relates to a method for isolating total RNA from viruses, bacteria, plant cells (including viroid RNA) or animals, comprising the following stages: a) dissociation of nucleoprotein and other natural nucleic acid complexes with ammonium trichloroacetate; and b) purification of RNA by sorption-desorption of RNA on filter paper or cotton wool.
В одном из воплощений клетки растений, животных или бактерий являются здоровыми клетками. В альтернативном воплощении клетки растений, животных или бактерий являются клетками, инфицированными вирусами, инфицированы или трансформированы вироидом.In one embodiment, the cells of plants, animals, or bacteria are healthy cells. In an alternative embodiment, the cells of plants, animals or bacteria are cells infected with viruses, infected or transformed by a viroid.
В еще одном из воплощений диссоциацию нуклеопротеидных и других комплексов осуществляют при помощи водного раствора трихлорацетата аммония в конечной концентрации 2-4 M в среде, имеющей близкое к нейтральному значение рН, при комнатной температуре.In yet another embodiment, the dissociation of nucleoprotein and other the complexes are carried out using an aqueous solution of ammonium trichloroacetate in a final concentration of 2-4 M in an environment having a pH close to neutral at room temperature.
В своем следующем аспекте настоящее изобретение относится к применению трихлорацетата аммония в качестве средства для диссоциации природных комплексов нуклеиновых кислот.In a further aspect, the present invention relates to the use of ammonium trichloroacetate as an agent for the dissociation of natural nucleic acid complexes.
В одном из воплощений природные комплексы нуклеиновых кислот представляют собой комплексы РНК. В одном из предпочтительных воплощений комплексы РНК представляют собой нуклеопротеидные комплексы, предпочтительнее вирусы, информосомы, рибосомы. В еще одном из предпочтительных воплощений комплексы РНК представляют собой комплексы с ДНК или с клеточными мембранами.In one embodiment, the natural nucleic acid complexes are RNA complexes. In one preferred embodiment, RNA complexes are nucleoprotein complexes, more preferably viruses, informosomes, ribosomes. In yet another preferred embodiment, RNA complexes are complexes with DNA or with cell membranes.
В еще одном из воплощений природные комплексы нуклеиновых кислот представляют собой комплексы ДНК. В одном из предпочтительных воплощений комплексы ДНК представляют собой нуклеопротеидные комплексы.In yet another embodiment, the natural nucleic acid complexes are DNA complexes. In one preferred embodiment, the DNA complexes are nucleoprotein complexes.
Краткое описание фигурBrief Description of the Figures
Фиг. IA. Электрофорез препаратов РНК XBK, полученных обработкой вирусного препарата с помощью 3 M или 6 M раствора TXAA в течение разного времени.FIG. IA. Electrophoresis of XBK RNA preparations obtained by treating a viral preparation with a 3 M or 6 M TXAA solution at different times.
Электрофорез препаратов РНК проводили в 1% агарозном геле, РНК окрашивали бромистым эти днем.Electrophoresis of RNA preparations was carried out on a 1% agarose gel, RNA was stained with bromide this day.
Фиг. 1Б. Электрофорез препаратов РНК BTM, полученных обработкой вирусного препарата с помощью 4 M раствора TXAA в течение разного времени.FIG. 1B. Electrophoresis of BTM RNA preparations obtained by treating a viral preparation with a 4 M TXAA solution at different times.
Электрофорез препаратов РНК проводили в 1% агарозном геле, РНК окрашивали бромистым этидием.Electrophoresis of RNA preparations was carried out on a 1% agarose gel, RNA was stained with ethidium bromide.
Фиг. 2. Сравнение электрофоретической подвижности препаратов РНК BTM и РНК XBK, выделенных из очищенных вирусов с помощью TXAA (дорожки 1 и 3) и методом фенольно-хлороформенной депротеинизации (дорожки 2 и 4).FIG. 2. Comparison of the electrophoretic mobility of BTM RNA and XBK RNA preparations isolated from purified viruses using TXAA (lanes 1 and 3) and the phenol-chloroform deproteinization method (lanes 2 and 4).
Сравнение препаратов РНК BTM и РНК XBK, выделенных с помощью TXAA и методом фенольно-хлороформенной депротеинизации, показало, что препараты РНК имеют одинаковую электрофоретическую подвижность РНК.Comparison of BTM RNA preparations and XBK RNA isolated using TXAA and phenol-chloroform deproteinization showed that RNA preparations have the same electrophoretic RNA mobility.
Фиг. 3. TXAA ингибирует клеточные нуклеазы. Дорожка 1 - Осветленный лизат листовой ткани (100 мг) картофеля был добавлен к раствору РНК XBK в присутствии 3 M TXAA. Смесь инкубировали 30 мин при комнатной температуре, пропускали через колонку с суспензией целлюлозы и анализировали РНК электрофорезом в геле. Дорожка 2 - Контроль. РНК инкубировали как указано выше, в реакционную смесь вместо клеточного лизата вносили воду.FIG. 3. TXAA inhibits cell nucleases. Lane 1 — A clarified potato leaf lysate (100 mg) of potato was added to an XBK RNA solution in the presence of 3 M TXAA. The mixture was incubated for 30 min at room temperature, passed through a cellulose suspension column and analyzed by RNA gel electrophoresis. Lane 2 - Control. RNA was incubated as described above; water was added to the reaction mixture instead of the cell lysate.
Фиг. 4. Электрофорез препаратов суммарной клеточной РНК, полученных при разных конечных концентрациях TXAA из листовой ткани картофеля.FIG. 4. Electrophoresis of total cellular RNA preparations obtained at different final concentrations of TXAA from potato leaf tissue.
Дорожки 1 - 4 - Суммарная РНК картофеля, выделенная с помощью 2,5 M, 3 M, 3,5 M и 4 M TXAA, соответственно. Навеску растительной ткани (100 мг) суспендировали при комнатной температуре в растворе TXAA разной концентрации и выдерживали в течение 30 мин. РНК очищали на микроколонке с фильтровальной бумагой (см. примеры). Осадок РНК растворяли в 50 мкл, на гель наносили по 15 мкл раствора РНК. Дорожка 5 - РНК XBK (2 мкг), выделенная фенольно-детергентным методом.Lanes 1–4 — Total potato RNA isolated using 2.5 M, 3 M, 3.5 M, and 4 M TXAA, respectively. A weighed portion of plant tissue (100 mg) was suspended at room temperature in a different concentration of TXAA solution and kept for 30 min. RNA was purified on a microcolumn with filter paper (see examples). The RNA pellet was dissolved in 50 μl, 15 μl of RNA solution was applied to the gel. Lane 5 - XBK RNA (2 μg) isolated by the phenol-detergent method.
Фиг. 5. Электрофорез препаратов РНК, полученных с помощью TXAA из клеток асцитной карциномы Кребс П.FIG. 5. Electrophoresis of RNA preparations obtained using TXAA from ascites carcinoma cells Krebs P.
Дорожки 1, 6 — Суммарная РНК неинфицированных клеток Кребс II, выделенная фенольным методом (4 мкг); дорожка 2 — суммарная РНК неинфицированных клеток Кребс II, выделенная с помощью TXAA (10 мкг); дорожка 3 - суммарная РНК инфицированных вирусом Менго клеток Кребс II, выделенная с помощью TXAA (10 мкг); дорожка 4 - РНК вируса Менго (2 мкг), выделенная фенольным методом; дорожка 5 - РНК BTM (2 мкг), выделенная фенольным методом.Lanes 1, 6 — Total RNA of uninfected Krebs II cells isolated by the phenolic method (4 μg); lane 2 - total RNA of uninfected Krebs II cells isolated by TXAA (10 μg); lane 3 — total RNA of Krebs II-infected Mengo virus cells isolated by TXAA (10 μg); lane 4 — Mengo virus RNA (2 μg) isolated by the phenolic method; lane 5 - BTM RNA (2 μg) isolated by the phenolic method.
Фиг. 6. Спектры оптического поглощения суммарной РНК, выделенной из клеток асцитной карциномы Кребс II.FIG. 6. Optical absorption spectra of total RNA isolated from Krebs II ascites carcinoma cells.
- * - РНК, выделенная фенольным методом,- * - RNA isolated by the phenolic method,
- • - РНК, выделенная способом настоящего изобретения с использованием трихлорацетата аммония.- • - RNA isolated by the method of the present invention using ammonium trichloroacetate.
Фиг. 7. Электрофоретический анализ препарата клеточных РНК из бактерии Еsсhеriсhiа соli, полученного с помощью трихлорацетата аммония.FIG. 7. Electrophoretic analysis of the preparation of cellular RNA from the bacterium Escherichia coli obtained using ammonium trichloroacetate.
Дорожка 1 - свидетель - lбs РНК E. соli, выделенная фенольно-детергентным методом депротеинизации. Препарат содержит 5s рРНК и следовые количества тРНК. Дорожки 2-4 - препарат РНК, полученный обработкой бактерий 2,8 M TXAA. В лунки наносили 12 мкл (2), 5 мкл (3) и 1 мкл (4) из 50 мкл раствора препарата клеточной РНК, полученного из 20 мг замороженных клеток. Менее подвижная РНК (зона непосредственно выше Iбs рРНК в полученном препарате) соответствует подвижности 23^ рРНК бактерий.Lane 1 - witness - lbs RNA of E. coli isolated by the phenol-detergent method of deproteinization. The preparation contains 5s rRNA and trace amounts of tRNA. Lanes 2-4 — An RNA preparation obtained by treating 2.8 M TXAA bacteria. To the holes 12 μl (2), 5 μl (3) and 1 μl (4) were applied from 50 μl of a cell RNA preparation solution obtained from 20 mg of frozen cells. Less mobile RNA (the zone immediately above the Ibs rRNA in the resulting preparation) corresponds to the mobility of 23 ^ rRNA of bacteria.
Фиг. 8. Детекция рекомбинантной плазмиды pGEM-ЗZ(PSTVd) со вставкой кДНК вироида веретеновидности клубней картофеля (BBKK) и самого вироида (BBKK, PSTVd) методом МГА-ИФА на нитроцеллюлозной мембране в препаратах РНК, полученных с помощью TXAA и очищенных на суспензии фильтровальной бумаги, из коллекционных сортообразцов картофеля с помощью ДНК-зонда (dienPt)pGEM-ЗZ(PSTVd).FIG. 8. Detection of the recombinant plasmid pGEM-ZZ (PSTVd) with the cDNA insert of the potato tuber spindle viroid (BBKK) and the viroid itself (BBKK, PSTVd) by MGA ELISA on a nitrocellulose membrane in RNA preparations obtained with TXAA filters and purified paper , from collection varieties of potatoes using a DNA probe (dienPt) pGEM-ZZ (PSTVd).
Верхний ряд цифр обозначает количество рекомбинантной плазмиды в пикограммах (пг), нанесенное на мембрану. В нижнем ряду на мембрану наносили 400 пг препаратов суммарной РНК, выделенной с помощью TXAA из инфицированного (дорожка 1) и здоровых (дорожки 2-4) растений.The top row of numbers indicates the amount of recombinant plasmid in picograms (pg) deposited on the membrane. In the bottom row, 400 pg of total RNA preparations isolated by TXAA from infected (lane 1) and healthy (lane 2-4) plants were applied to the membrane.
Препараты нуклеиновых кислот фиксировали на нитроцеллюлозной мембране облучением УФ-светом при 254 нм и детектировали путем гибридизации со специфическим ДНК-зондом. ДНК-зонд представляет собой рекомбинантную плазмиду, содержащую вставку кДНК вироида, которая определяет специфичность зонда. ДНК-зонд содержит метку - диен-платину, которая является гаптеном и может быть обнаружена с помощью специфичных антител (В. И. Киселева, М.Ф. Турчинский, Т.Б. Колесник, А.М. Поверенный, Биоорг. химия, т. 20, с. 14-20 (1994)).Nucleic acid preparations were fixed on a nitrocellulose membrane by irradiation with UV light at 254 nm and were detected by hybridization with a specific DNA probe. A DNA probe is a recombinant plasmid containing an insert of a viroid cDNA that determines the specificity of the probe. The DNA probe contains a label - diene-platinum, which is a hapten and can be detected using specific antibodies (V.I. Kiseleva, M.F. Turchinsky, TB.Kolesnik, A.M. Attorney, Bioorg. Chemistry, T. 20, pp. 14-20 (1994)).
В свою очередь, связавшиеся первичные антитела детектировали с помощью конъюгатов вторичных антител с ферментом и его хемилюминесцентным субстратом. Люминесценция продуктов ферментативной реакции засвечивает рентгеновскую пленку, позволяя визуализировать BBKK в анализируемых пробах.In turn, the bound primary antibodies were detected using conjugates of secondary antibodies with the enzyme and its chemiluminescent substrate. The luminescence of the enzymatic reaction products illuminates the x-ray film, allowing visualization of BBKK in the analyzed samples.
Фиг. 9. Диагностический анализ зараженности картофеля вирусом X с использованием технологии МГА-ИФА.FIG. 9. Diagnostic analysis of the infection of potatoes with the virus X using the MGA-ELISA technology.
Дорожка 1 - рекомбинантная плазмида, содержащая вставку кДНК XBK. Дорожки 2-5 - препараты суммарной РНК, полученные из здоровых (2, 4) и зараженных XBK (3, 5) растений картофеля (сорт Невский) фенольным методом (4, 5) и с помощью TXAA (2, 3).Lane 1 is a recombinant plasmid containing an XBK cDNA insert. Lanes 2-5 are total RNA preparations obtained from healthy (2, 4) and XBK (3, 5) infected potato plants (Nevsky variety) by the phenolic method (4, 5) and using TXAA (2, 3).
Фиг. 10. Сравнительный анализ чувствительности диагностики вироидной (BBKK) инфекции технологиями ПЦР (см. Фиг. 10A), МГА-ИФА (Фиг. 10Б) и ОТ- ПЦР-МГА-ИФА (Фиг. 10В) препаратов суммарной РНК, полученных с помощьюFIG. 10. A comparative analysis of the sensitivity of the diagnosis of viroid (BBKK) infection by PCR technology (see Fig. 10A), MGA-ELISA (Fig. 10B) and RT- PCR-MGA-ELISA (Fig. 10B) preparations of total RNA obtained using
TXAA, из листовой ткани коллекционного картофеля.TXAA, from collection potato leaf tissue.
А - Анализ проб, соответствующих 1/3 мкл взятых из 60 мкл препаратов суммарной РНК, полученных по протоколу (см. Примеры 3 и 7). Амплифицированные ДНК определяли по флуоресценции с бромистым этидием после электрофореза в 1% агарозном геле. Дорожка d4 - положительный контроль - рекомбинантная плазмида pGEM-ЗZ(PSTVd); далее - препараты РНК из пробирочных растений сортов Удача (1), Голубизна (2), Ильинский (3), Прайса (4), Луговской (5), Брянский (6), Скороплодный (7), Жуковский ранний (8), Брянская новизна (9), Осень (10), Рождественский (11), Петербургский (12), Елизавета (13) и РНК из инфицированных BBKK томатов (14-17). Дорожка M - маркер длин (в п.н.), справа цифрами указаны длины фрагментов ДНК фага лямбда - продуктов исчерпывающего гидролиза ДНК эндонуклеазой рестрикции PsU.A - Analysis of samples corresponding to 1/3 μl taken from 60 μl of total RNA preparations obtained according to the protocol (see Examples 3 and 7). Amplified DNA was determined by fluorescence with ethidium bromide after electrophoresis in 1% agarose gel. Lane d4 — positive control — recombinant plasmid pGEM-ZZ (PSTVd); further - RNA preparations from test plants of varieties Udacha (1), Golubizna (2), Ilyinsky (3), Price (4), Lugovsky (5), Bryansk (6), Skoroplodny (7), Zhukovsky early (8), Bryansk novelty (9), Autumn (10), Christmas (11), Petersburg (12), Elizabeth (13) and RNA from BBKK-infected tomatoes (14-17). Lane M is a length marker (in bp), the numbers on the right indicate the lengths of DNA fragments of the lambda phage, the products of exhaustive hydrolysis of DNA by PsU restriction endonuclease.
Б и В - Для анализа технологией МГА-ИФА на нитроцеллюлозный фильтр наносили 1 мкл каждой пробы суммарной РНК (из 60 мкл), а для технологии OT- ПЦР-МГА-ИФА - соответствующую 1/500 мкл тех же проб.B and C - For analysis by the MGA-ELISA technology, 1 μl of each sample of total RNA (from 60 μl) was applied to the nitrocellulose filter, and for the OT-PCR-MGA-ELISA technology, the corresponding 1/500 μl of the same samples was applied.
В верхнем ряду на Фиг. 10Б и 10В (положительный внутренний контроль) нанесены серийные разведения плазмиды pGEM-ЗZ(PSTVd) в ряду: 200; 66,7; 22,2; 7,4; 2,5; 0,8; 0,3; 0,1 пгIn the upper row of FIG. 10B and 10B (positive internal control), serial dilutions of the plasmid pGEM-3Z (PSTVd) were plotted in the order: 200; 66.7; 22.2; 7.4; 2.5; 0.8; 0.3; 0.1 pg
В среднем (пробы 1-7) и нижнем (пробы 9-15) рядах нанесены образцы с номерами проб РНК, приведенными на Фиг. 10A. Проба 16 на Фиг. 10Б (негативный контроль) - препарат РНК из картофеля сорта «Удaчa» и проба 16 на Фиг. 10В (позитивный контроль) - препарат РНК из сильно зараженного томата.On average (samples 1–7) and the lower (samples 9–15) rows, samples with the RNA sample numbers shown in FIG. 10A. Sample 16 in FIG. 10B (negative control) —RNA preparation from Udacha potato and sample 16 in FIG. 10B (positive control) is an RNA preparation from a highly infected tomato.
Фиг. 11. Определение специфичности (диeн-Pt)ДHK-зoндa (меченой рекомбинантной плазмиды со вставкой кДНК вируса Менго) технологией МГА-ИФА.FIG. 11. Determination of the specificity (diene-Pt) of a DNA probe (labeled recombinant plasmid with an Mengo virus cDNA insert) using MGA ELISA.
Все препараты РНК были получены фенольно-детергентной депротеинизацией. Анализируемые препараты наносили на нитроцеллюлозный фильтр в указанных количествах. Дорожка 1 - РНК вируса Менго (50 пг); 2 - РНК вируса Менго (5 пг); 3 - РНК вируса энцефаломиокардита (ВЭМК, 50 пг); 4 - РНК ВЭМК (5 пг); 5 - РНК (BTM, 50 пг); 6 - 16S рРНК Е.соli (50 пг); 7-12 - рекомбинантная плазмида со вставкой кДНК вируса Менго (7 - 1 нг, 8 - 250 пг, 9 - 50 пг, 10 - 12,5 пг, 11 - 2,5 пг, 12 - 0,5 пг).All RNA preparations were obtained by phenol-detergent deproteinization. The analyzed preparations were applied to the nitrocellulose filter in the indicated amounts. Lane 1 — Mengo virus RNA (50 pg); 2 - Mengo virus RNA (5 pg); 3 - encephalomyocarditis virus RNA (VEMK, 50 pg); 4 - VEMK RNA (5 pg); 5 - RNA (BTM, 50 pg); E. coli 6-16S rRNA (50 pg); 7-12 - recombinant plasmid with the insertion of cDNA of Mengo virus (7 - 1 ng, 8 - 250 pg, 9 - 50 pg, 10 - 12.5 pg, 11 - 2.5 pg, 12 - 0.5 pg).
Фиг. 12. Определение вирусной РНК в клетках Кребс II, инфицированных вирусом Менго, методом МГА-ИФАFIG. 12. Determination of viral RNA in Krebs II cells infected Mengo virus, MGA-ELISA
Верхний ряд - суммарная РНК клеток Кребс II, инфицированных вирусом Менго. Нижний ряд - суммарная РНК неинфицированных клеток Кребс II. Столбец 1 - 1 мкг, 2 - 100 нг, 3 - 10 нг, 4 - 1 нг.The upper row is the total RNA of Krebs II cells infected with the Mengo virus. The bottom row is the total RNA of uninfected Krebs II cells. Column 1 - 1 mcg, 2 - 100 ng, 3 - 10 ng, 4 - 1 ng.
Фиг. 13. Определение BBKK диен-платиновым ДНК-зондом в препаратах вироидной РНК (ряды 2-4), полученных разными методами из листовой ткани картофеля.FIG. 13. Determination of BBKK by a diene-platinum DNA probe in preparations of viroid RNA (rows 2-4) obtained by different methods from leaf tissue of potatoes.
Ряды 1 и 5 - из здоровых растений.Rows 1 and 5 are from healthy plants.
Столбцы: А - с использованием фенольно-детергентного метода; В - с использованием гунидинтиоцианатного метода с последующей сорбцией РНК на силикагеле (T. Маliпоwski, iп: Н.-W Dеhпе, G.Аdаm. еt аl. (Еds.) Dеvеlорmепts iп Рlапt Раthоlоgу, vоl.l l, Кluwег Асаd. Рublishеrs, 1996, pp.445-448); С - способом настоящего изобретения с использованием TXAA.Columns: A - using the phenol-detergent method; B - using the gunidinothiocyanate method followed by sorption of RNA on silica gel (T. Malipowski, ip: H.-W Dehpe, G. Adam. Et al. (Eds.) Devolptes ip Paltapologu, vol.ll, Clueps. 1996, pp. 445-448); C is a method of the present invention using TXAA.
Подробное описание изобретенияDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Настоящее изобретение предлагает новый экологически безопасный способ получения препаратов чистой РНК из вирусов, клеток бактерий, растений и животных, вироидной РНК. Предложенный способ отличается от известных использованием нетоксичного хаотропного/диссоциирующего комплексы нуклеиновых кислот агента, трихлорацетата аммония. Трихлорацетат аммония отсутствует в списке токсичных веществ (PAN (Реstiсidе Асtiоп Nеtwоrk Nоrth Аmеriса) Реstiсidеs Dаtаbаsе, Аmmопium triсhlоrоасеtаtе) Канады и США. Еще одним преимуществом заявленного способа является его универсальность и возможность применения для выделения РНК различного происхождения.The present invention provides a new environmentally friendly method for producing pure RNA preparations from viruses, bacterial, plant and animal cells, and viroid RNA. The proposed method differs from the known methods using a non-toxic chaotropic / dissociating nucleic acid complexes of an agent, ammonium trichloroacetate. Ammonium trichloroacetate is not included in the list of toxic substances (PAN (Restiside Аstiop Netwоrk Nоrth Аmеrisa) Restiside Database, Аmmopium trichloroacetate) in Canada and the USA. Another advantage of the claimed method is its versatility and the possibility of application for the isolation of RNA of various origin.
Хаотропным (в данном случае диссоциирующим сложные природные комплексы, в состав которых входят нуклеиновые кислоты) свойством обладает анион трихлоруксусной кислоты (ТХУ) - трихлорацетат-ион. Норвежскими исследователями было установлено, что ТХУ при внесении в почву вплоть до концентраций 2,24 г/м2 не оказывает заметного воздействия на деревья и почву, и единственными продуктами метаболизма/биодеградации ТХУ в системе «дepeвo-пoчвa» были физиологичные хлориды, углекислый газ и вода и их производные [P. Sсhrоdеr, M. Маtuсhа, S. T. Fоrсzеk, H. Uhliiоvа, К. Fuksоvа and J. Аlbrесhtоvа, Uрtаkе, trапslосаtiоп апd fаtе оf triсhlогоасеtiс асid iп а Nоrwау sрruсе/sоil sуstеm, Сhеmоsрhеге 52 (2003) 437-442]. Данный хаотропный агент является альтернативой высоко токсичным веществам, в настоящее время широко используемым при выделении РНК, а именно, гуанидинтиоцианату, фенолу и хлороформу.The anion of trichloroacetic acid (TCA), a trichloroacetate ion, has a chaotropic (in this case, dissociating complex natural complexes, which include nucleic acids). Norwegian researchers found that TCA, when applied to soil up to concentrations of 2.24 g / m 2, does not have a noticeable effect on trees and soil, and the only products of TCA metabolism / biodegradation in the wood-soil system were physiological chlorides, carbon dioxide and water and their derivatives [P. Sshroder, M. Matusha, ST Forszek, H. Uhliiova, K. and J. Fuksova Albreshtova, Urtake, trapslosatiop apd fate ° F trishlogoasetis asid Ip and Norwau srruse / soil sustem, Shemosrhege 52 (2003) 437-442]. This chaotropic agent is an alternative to highly toxic substances that are currently widely used in the isolation of RNA, namely, guanidine thiocyanate, phenol and chloroform.
Авторы данного изобретения разработали новый способ выделения РНК и ДНК с использованием трихлорацетата аммония в качестве хаотропного агента, который может быть использован как в лабораторных исследованиях, так и для массового получения препаратов нуклеиновых кислот, например, в серийных диагностических анализах инфекций или в их промышленном производстве. Установлено, что препараты РНК, полученные разработанным методом, пригодны для молекулярной диагностики вирусных инфекций растений и животных технологиями МГА-ИФА, ПЦР (полимеразная цепная реакция), ОТ-ПЦР (обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция) и ДНК-чипов.The authors of this invention have developed a new method for the isolation of RNA and DNA using ammonium trichloroacetate as a chaotropic agent, which can be used both in laboratory studies and for mass production of nucleic acid preparations, for example, in serial diagnostic analyzes of infections or in their industrial production. It was found that RNA preparations obtained by the developed method are suitable for molecular diagnostics of viral infections of plants and animals by the technologies MGA-IFA, PCR (polymerase chain reaction), RT-PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) and DNA chips.
Разработанный способ пригоден для выделения разнообразных РНК из различных источников. В частности, способ настоящего изобретения может быть использован для выделения различных РНК из вирусов, а также из клеток бактерий, растений, и животных, вироидной РНК. Кроме того, способ пригоден для выделения суммарной клеточной и вирусной РНК в случае клеток растений, животных и бактерий, инфицированных вирусами или клеток растений, инфицированных и вирой дами.The developed method is suitable for isolating a variety of RNA from various sources. In particular, the method of the present invention can be used to isolate various RNAs from viruses, as well as from cells of bacteria, plants, and animals, viroid RNA. In addition, the method is suitable for isolation of total cellular and viral RNA in the case of plant cells, animals and bacteria infected with viruses or plant cells infected with viruses.
Необходимо отметить, что применение TXAA в качестве хаотропного агента при выделении РНК обеспечивает эффективное ингибирование клеточных нуклеаз. Следствием этого является возможность выделения вирусной/вироидной РНК и клеточной РНК, в частности рибосомной (рРНК) и транспортной (тРНК), которые сохраняют свою интактность в ходе выделения и имеют электофоретическую подвижность «нaтивныx» молекул РНК. Так например, препараты РНК, полученные из растительной ткани и клеток асцитной карциномы с помощью способа настоящего изобретения, содержат типичные рибосомные РНК эукариот (18s и 28s рРНК) с ожидаемой электрофоретической подвижностью относительно вирусных РНК и клеточных РНК, выделенных с помощью стандартного фенольного метода.It should be noted that the use of TXAA as a chaotropic agent in the isolation of RNA provides effective inhibition of cell nucleases. The consequence of this is the possibility of isolating viral / viroid RNA and cellular RNA, in particular ribosomal (rRNA) and transport (tRNA), which retain their intactness during isolation and have the electrophoretic mobility of “native” RNA molecules. For example, RNA preparations obtained from plant tissue and ascites carcinoma cells using the method of the present invention contain typical eukaryotic ribosomal RNAs (18s and 28s rRNAs) with the expected electrophoretic mobility relative to viral RNAs and cell RNAs isolated using the standard phenolic method.
Для очистки РНК, высвобожденной из нуклеопротеидных и других природных комплексов за счет диссоциирующего воздействия TXAA, способ настоящего изобретения предусматривает использование фильтровальной бумаги или хлопковой ваты. Без намерения быть ограниченными какой-либо научной теорией, авторы предполагают, что TXAA в высокой концентрации вызывает диссоциацию как вирусов, так и клеточных нуклеопротеидных комплексов, при этом белки денатурируют и в присутствии 70% пpoпaнoлa-2 полностью выпадают в осадок, нерастворимый в воде.To purify RNA released from nucleoprotein and other natural complexes due to the dissociative effect of TXAA, the method of the present invention involves the use of filter paper or cotton wool. Without intending to be limited by any scientific theory, the authors suggest that high concentration of TXAA causes the dissociation of both viruses and cellular nucleoprotein complexes, while proteins denature and completely precipitate in the presence of 70% propanol-2, insoluble in water.
Наиболее предпочтительно проводить очистку выделенной РНК на фильтровальной бумаге или хлопковой вате в формате колоночной хроматографии. Для этого фильтровальную бумагу предварительно при необходимости измельчают, затем измельченную бумагу или вату загружают в колонку, промывают и уравновешивают буфером, содержащим TXAA. Процедура очистки включает нанесение препарата вируса или клеточного экстракта, обработанных TXAA, промывку колонки с препаратом буфером, содержащим TXAA, и элюцию РНК водой.It is most preferable to purify the isolated RNA on filter paper or cotton wool in a column chromatography format. To do this, filter paper is first crushed if necessary, then crushed paper or cotton is loaded into a column, washed and equilibrated with a buffer containing TXAA. The purification procedure includes applying a virus or cell extract preparation treated with TXAA, washing the column with the preparation with buffer containing TXAA, and eluting the RNA with water.
Процедуру сорбции-десорбции РНК можно проводить самотеком (под действием силы тяжести), а также при небольшом разрежении, которое может создаваться при помощи, например, водоструйного насоса. В качестве колонок могут использоваться любые колонки, коммерчески доступные от широкого спектра производителей хроматографического оборудования, а также обычные медицинские пластиковые шприцы. Процедура очистки на колонках с волокнистой целлюлозой можно проводить как в индивидуальном режиме, так и с использованием самодельного специально изготовленного кассетного устройства.The RNA sorption-desorption procedure can be carried out by gravity (under the action of gravity), as well as with a small vacuum, which can be created using, for example, a water-jet pump. Columns can be any column that is commercially available from a wide range of manufacturers of chromatographic equipment, as well as conventional medical plastic syringes. The cleaning procedure on columns with fibrous cellulose can be carried out both individually and using a homemade specially made cassette device.
ПримерыExamples
Следующие далее примеры раскрывают наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения и приведены исключительно с целью лучшего пояснения его сущности. Специалисту в данной области будет понятно, что можно осуществить множество модификаций как в отношении используемых средств и материалов, так и в отношении используемых способов без отступления за рамки изобретения.The following examples reveal the most preferred embodiments of the present invention and are provided solely for the purpose of better clarifying its essence. One skilled in the art will recognize that many modifications can be made both to the means and materials used, and to the methods used, without departing from the scope of the invention.
Авторы настоящего изобретения задались целью показать пригодность TXAA для выделения нуклеиновых кислот различного происхождения, в частности вирусной РНК из вирусов растений и животных. Было установлено, что обработка вирусов картофеля и табака 3 M раствором TXAA (Табл. 1) в течение 5 мин приводит к диссоциации вирусных нуклеопротеидов и высвобождению молекул РНК, обладающих электрофоретической подвижностью, идентичной препаратам РНК, которые были получены из тех же вирусов классическим методом фенольно- детергентной депротеинизации, причем зависимость выхода РНК из разных растений количественно совпадала с теоретическими выходами РНК (Табл. 2) и не уступала выходам РНК при экстракции методом фенольно-хлороформенной депротеинизации.The authors of the present invention set out to demonstrate the suitability of TXAA for the isolation of nucleic acids of various origins, in particular viral RNA from plant and animal viruses. It was found that treatment of potato and tobacco viruses with 3 M TXAA solution (Table 1) for 5 min leads to the dissociation of viral nucleoproteins and the release of RNA molecules, possessing electrophoretic mobility identical to RNA preparations that were obtained from the same viruses by the classical method of phenol-detergent deproteinization, and the dependence of the RNA yield from different plants quantitatively coincided with the theoretical RNA yields (Table 2) and did not yield to RNA yields upon extraction using the phenol chloroform deproteinization.
Пример 1. Выделение РНК из вирусов растений с помощью трихлорацетата аммония на примере РНК вируса табачной мозаики (BTM, TMV)Example 1. The selection of RNA from plant viruses using ammonium trichloroacetate on the example of the tobacco mosaic virus RNA (BTM, TMV)
Получение трихлорацетата аммонияPreparation of Ammonium Trichloroacetate
К 250 г ТХУ (Реахим, Россия) добавляли небольшими порциями раствор 25% аммиака (Реахим, Россия) до достижения рН = 7-7,5. Далее водой доводили концентрацию трихлорацетата аммония до 4 M (плотность раствора при 2O0C 1,26 г/мл).To 250 g of TCA (Reakhim, Russia) was added in small portions a solution of 25% ammonia (Reakhim, Russia) until a pH of 7-7.5 was reached. Then, with water, the concentration of ammonium trichloroacetate was adjusted to 4 M (the density of the solution at 2O 0 C was 1.26 g / ml).
Приготовление микроколонок с целлюлозой для очистки РНКPreparation of microcolumns with cellulose for RNA purification
Состав растворов A, E, ТЕ и С приведен в Таблице 1. Использовали фильтровальную бумагу (РЕАХИМ) или стерильную хлопковую вату. 0,5 г фильтровальной бумаги нарезали ножницами на мелкие квадратики (2x2 мм). Переносили в центрифужную пробирку на 50 мл. Заливали 10 мл раствора А. Выдерживали 5 мин и энергично встряхивали на встряхивателе Вортекс, чтобы измельчить основную часть целлюлозы в суспензию бумажных волокон. Разбавляли суспензию 70-80 мл воды и фильтровали под вакуумом. Полученную пасту целлюлозы суспендировали в буферном растворе ТЕ, расфасовывали в виде суспензии (10 мг/мл) и хранили при комнатной температуре.The composition of solutions A, E, TE, and C is shown in Table 1. Filter paper (REAHIM) or sterile cotton wool was used. 0.5 g of filter paper was cut with scissors into small squares (2x2 mm). Transferred to a 50 ml centrifuge tube. Pour 10 ml of solution A. Hold for 5 minutes and vigorously shake on a Vortex shaker to grind the bulk of the pulp into a suspension of paper fibers. A suspension of 70-80 ml of water was diluted and filtered under vacuum. The resulting cellulose paste was suspended in TE buffer solution, packaged in suspension (10 mg / ml) and stored at room temperature.
Таблица 1. Растворы для выделения РНКTable 1. Solutions for RNA isolation
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0001
Микроколонки для очистки РНК готовили из инсулиновых шприцев на 1 мл (выбрасывая поршень) со съемной иглой. Для этого помещали на дно шприцев бумажный фильтр, заполняли колонки 1 мл целлюлозной пасты под неглубоким вакуумом водоструйного насоса, используя сконструированную нами кассету. Сорбент промывали 0,5 мл раствора С, а затем 2 раза по 0,5 мл 70% этиловым спиртом и подсушивали 5-10 мин под вакуумом.Microcolumns for RNA purification were prepared from 1 ml insulin syringes (ejecting the piston) with a removable needle. To do this, put a paper filter on the bottom of the syringes, fill the columns with 1 ml of cellulose paste under the shallow vacuum of the water-jet pump, using the cartridge we designed. The sorbent was washed with 0.5 ml of solution C, and then 2 times with 0.5 ml of 70% ethyl alcohol and dried for 5-10 minutes under vacuum.
При использовании ваты для очистки РНК в стерильный одноразовый шприц объемом 2 мл помещали 100 мг хлопковой стерильной хирургической ваты и упаковывали. Такое количество ваты в набухшем состоянии занимает объем около 1 мл. Сорбент промывали 2 мл буферного раствора (TXAA соответствующей молярности, 0,1 M трис-НСl, рН 7,5) и 4 мл 70% этанола. Избыток жидкости удаляли под небольшим вакуумом.When using cotton wool for RNA purification, 100 mg of sterile cotton surgical cotton was placed in a sterile disposable syringe with a volume of 2 ml and packaged. Such a quantity of cotton in a swollen state occupies a volume of about 1 ml. The sorbent was washed with 2 ml of buffer solution (TXAA of the corresponding molarity, 0.1 M Tris-Hcl, pH 7.5) and 4 ml of 70% ethanol. Excess liquid was removed under a slight vacuum.
Депротеинизация BTMDeproteinization BTM
К 100 мкл суспензии BTM (18 мг/мл) добавляли 900 мкл раствора E* (TXAA соответствующей молярности (табл. 2), 0,1 M трис-НСl рН 7,5, 25 мМ ЭДТА, 1,5% Тритон X-100), перемешивали на встряхивателе Вортекс несколько секунд и инкубировали 5, 10, 20 или 30 мин при комнатной температуре.To 100 μl of a BTM suspension (18 mg / ml), 900 μl of an E * solution (TXAA of the corresponding molarity (Table 2), 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 25 mM EDTA, 1.5% Triton X- was added. 100), mixed on a Vortex shaker for several seconds and incubated for 5, 10, 20 or 30 minutes at room temperature.
Очистка и выделение РНК BTMPurification and isolation of RNA BTM
Один мл смеси вируса и раствора E* смешивали с 2,5 мл пpoпaнoлa-2 (конечная концентрация спирта 70%) и наслаивали на колонку. Образец проходил через колонку самотеком со скоростью примерно 30 капель в минуту. После полного впитывания образца в сорбент колонку промывали 4 мл 70% пpoпaнoлa-2 и подсушивали под вакуумом, создаваемым водоструйным насосом, в течение 10 мин.One ml of a mixture of virus and E * solution was mixed with 2.5 ml of propanol-2 (final alcohol concentration of 70%) and layered on a column. The sample passed through the column by gravity at a speed of about 30 drops per minute. After the sample was completely absorbed into the sorbent, the column was washed with 4 ml of 70% propanol-2 and dried under the vacuum created by the water-jet pump for 10 min.
Связанную с сорбентом РНК элюировали деионизованной водой (MiIIiQ). На колонку наслаивали трижды по 1 мл воды (дожидаясь, пока очередная порция воды полностью впитается в вату) и получали 3 фракции элюата. Объем первой фракции варьировал от 250 до 350 мкл, объем второй и третьей фракций составлял 1 мл.RNA bound to the sorbent was eluted with deionized water (MiIIiQ). 1 ml of water was layered on the column three times (waiting until the next portion of water was completely absorbed into the cotton wool) and 3 fractions of the eluate were obtained. The volume of the first fraction varied from 250 to 350 μl; the volume of the second and third fractions was 1 ml.
Оптимальные условия выделения, выходы РНК BTM и оптические характеристики полученного препарата РНК приведены в табл. 2. Электрофоретические данные для полученных препаратов РНК BTM приведены на Фиг. 1 и 2. Таблица 2. Выходы и оптические характеристики препаратов РНК BTM и XBK, выделенных с помощью TXAAThe optimal conditions for the isolation, the outputs of the BTM RNA and the optical characteristics of the obtained RNA preparation are given in table. 2. Electrophoretic data for the obtained BTM RNA preparations are shown in FIG. 1 and 2. Table 2. Yields and optical characteristics of BTM and XBK RNA preparations isolated by TXAA
Figure imgf000015_0001
Figure imgf000015_0001
Выходы РНК после обработки вирусных частиц TXAA были близки к теоретическим, а оптические характеристики соответствовали высокоочищенным РНК.The yields of RNA after treatment of viral particles of TXAA were close to theoretical, and the optical characteristics corresponded to highly purified RNA.
Спектральный анализ полученных фракцийSpectral analysis of the obtained fractions
Оптический спектр полученных фракций определяли непосредственно в элюате на спектрофотометре Ultrоsрес 1100 рrо (Аmеrshаm Вiоsсiепсеs). Для электрофоретического анализа использовали содержимое первой фракции. Электрофорез проводили в 1% геле агарозы (Gibсо) в стандартном трис-ацетатном буфере с ЭДТА (TAE) при напряжении 100 В в присутствии бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в геле и в электродном буфере.The optical spectrum of the obtained fractions was determined directly in the eluate on an Ultropres 1100 ppo spectrophotometer (Аmersham Воссіепсес). For electrophoretic analysis, the contents of the first fraction were used. Electrophoresis was performed on 1% agarose gel (Gibco) in standard Tris-Acetate buffer with EDTA (TAE) at a voltage of 100 V in the presence of ethidium bromide (0.5 μg / ml) in the gel and in the electrode buffer.
Пример 2. Выделение РНК из вирусов растений с помощью трихлорацетата аммония на примере РНК вируса X картофеля (XBK, PVX)Example 2. The selection of RNA from plant viruses using ammonium trichloroacetate on the example of potato virus X RNA (XBK, PVX)
Выделение РНК XBK проводили из вирусной суспензии XBK с концентрацией 6 мг/мл по методике, изложенной для BTM. Оптимальные условия выделения, выходы РНК XBK и оптические характеристики полученного препарата РНК приведены в табл. 2. Электрофоретические данные для полученных препаратов РНК XBK приведены на Фиг. 1 и 2.Isolation of XBK RNA was performed from an XBK virus suspension with a concentration of 6 mg / ml according to the procedure described for BTM. The optimal conditions for the isolation, XBK RNA yields, and optical characteristics of the resulting RNA preparation are given in Table. 2. Electrophoretic data for the obtained XBK RNA preparations are shown in FIG. 1 and 2.
Проведенный анализ выхода и качества РНК, выделенных из вирусов BTM и XBK с помощью TXAA, показал, что выход РНК близок к теоретическому (Табл. 2), а спектральные характеристики (A260/ A280' табл. 2) и электрофоретическая подвижность (Фиг. 1 ,2) соответствуют высокоочищенным вирусным РНК. Пример 3. Выделение клеточных РНК на примере выделения РНК из листовой ткани картофеля с помощью TXAAThe analysis of the yield and quality of RNA isolated from BTM and XBK viruses using TXAA showed that the RNA yield is close to theoretical (Table 2), and the spectral characteristics (A 260 / A 280 'table 2) and electrophoretic mobility (Fig. . 1, 2) correspond to highly purified viral RNA. Example 3. Isolation of cellular RNA by the example of RNA isolation from leaf tissue of potato using TXAA
Универсальная способность TXAA диссоциировать не только вирусные, но и клеточные нуклеопротеиды была исследована на растительных и животных клетках.The universal ability of TXAA to dissociate not only viral, but also cellular nucleoproteins has been studied on plant and animal cells.
Выделение высокомолекулярных вирусных и клеточных РНК из растительных и животных клеток при комнатной температуре возможно только в случае ингибирования клеточных рибонуклеаз используемым хаотропным/ диссоциирующим агентом. Действительно, инкубация вирусной РНК с клеточным лизатом в присутствии TXAA не вызывает заметного гидролиза вирусной РНК (Фиг. 3), а клеточные РНК имеют электрофоретическую подвижность, совпадающую с подвижностью целых молекул рРНК и тРНК. В то же время в отсутствие TXAA все РНК полностью деградировали (не показано).Isolation of high molecular weight viral and cellular RNAs from plant and animal cells at room temperature is possible only in the case of inhibition of cellular ribonucleases by the used chaotropic / dissociating agent. Indeed, incubation of viral RNA with a cell lysate in the presence of TXAA does not cause a noticeable hydrolysis of the viral RNA (Fig. 3), and cellular RNAs have an electrophoretic mobility that matches that of whole rRNA and tRNA molecules. At the same time, in the absence of TXAA, all RNAs were completely degraded (not shown).
Образец (50-100 мг) растительной ткани картофеля (пробирочное растение) при комнатной температуре растирали в ступке с 500-1000 мкл буферного раствора E (табл. 1) для депротеинизации и экстракции РНК. Смесь переносили в пробирку, добавляли 50-100 мкл суспензии фильтровальной бумаги в растворе 4 M TXAA и к полученной смеси добавляли пpoпaнoл-2 до конечной концентрации 70%. После тщательного перемешивания на встряхивателе в течение 5-10 мин смесь наносили на микроколонку, заполненную суспензией (200 мкл) целлюлозы или хлопковой ватой (колонки заполняли заранее, они могут храниться длительное время). Как правило, одновременно готовили несколько (до ста) образцов. Колонки с образцами плотно вставляли в отверстия крышки вакуумной кассеты, сконструированной нами (промывки и элюция РНК на колонках вели под неглубоким вакуумом водоструйного насоса). Сорбированную на волокнистой целлюлозе суммарную РНК элюировали дистиллированной водой (2x500 мкл) и концентрировали осаждением спиртом. Осадок растворяли в 50 мкл воды.A sample (50-100 mg) of potato plant tissue (test plant) at room temperature was ground in a mortar with 500-1000 μl of buffer solution E (Table 1) for deproteinization and RNA extraction. The mixture was transferred to a test tube, 50-100 μl of a suspension of filter paper in a 4 M TXAA solution was added, and to the resulting mixture was added propanol-2 to a final concentration of 70%. After thorough mixing on the shaker for 5-10 minutes, the mixture was applied to a microcolumn filled with a suspension (200 μl) of cellulose or cotton wool (the columns were filled in advance, they can be stored for a long time). As a rule, several (up to a hundred) samples were prepared simultaneously. Columns with samples were tightly inserted into the openings of the lid of the vacuum cassette designed by us (washing and elution of RNA on the columns were carried out under a shallow vacuum of a water-jet pump). Total RNA sorbed on fibrous cellulose was eluted with distilled water (2x500 μl) and concentrated by precipitation with alcohol. The precipitate was dissolved in 50 μl of water.
Электрофоретический анализ в агарозном геле (Фиг. 4) полученного препарата суммарной клеточной РНК картофеля показал, что препарат содержит типичный набор эукариотических рибосомных и транспортных РНК. Соотношение A260/ A28o для препаратов суммарной РНК картофеля было в диапазоне 1,85-2,0, что характерно для депротеинизированной РНК.An agarose gel electrophoretic analysis (Fig. 4) of the resulting preparation of total potato cellular RNA showed that the preparation contains a typical set of eukaryotic ribosomal and transport RNAs. The ratio A 260 / A 28 o for preparations of total potato RNA was in the range of 1.85-2.0, which is typical for deproteinized RNA.
Пример 4. Выделение клеточных РНК из листовой ткани табака Niсоtiапа glиtiпоsа с помощью трихлорацетата аммония Навеску 1 г свежего листа табака быстро гомогенизировали в ступке с 6 мл буферного раствора E с разным содержанием TXAA. Время гомогенизации пробы во время инкубации не включали. Отбирали аликвоты по 1,5 мл в микроцентрифужные пробирки и инкубировали 5, 10, 20 и 30 мин при комнатной температуре, не перемешивая. Затем пробы центрифугировали (10000 х g, 5 мин) на настольной центрифуге Еррепdоrf 5414. Время центрифугирования включали во время инкубации. Отбирали 1 мл супернатанта, смешивали его с 2,5 мл изопропанола, и смесь наслаивали на колонку. Результаты выделения суммарной клеточной РНК табака представлены в таблицах 3,4.Example 4. Isolation of cellular RNA from leaf tissue of tobacco Niсtiapa glitiposa using ammonium trichloroacetate A weighed portion of 1 g of fresh tobacco leaf was quickly homogenized in a mortar with 6 ml of buffer solution E with different contents of TXAA. Sample homogenization time during incubation was not included. Aliquots of 1.5 ml were collected in microcentrifuge tubes and incubated for 5, 10, 20, and 30 min at room temperature without stirring. Then, the samples were centrifuged (10,000 x g, 5 min) in a Errepdor 5414 benchtop centrifuge. Centrifugation time was turned on during incubation. 1 ml of the supernatant was taken, mixed with 2.5 ml of isopropanol, and the mixture was layered on a column. The results of the isolation of total cellular tobacco RNA are presented in tables 3.4.
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
Таблица 4. Выделение клеточных РНК из табака 3 M TXAA.Table 4. Isolation of cellular RNA from tobacco 3 M TXAA.
Figure imgf000017_0002
РНК, мкг/мл
Figure imgf000017_0002
RNA, μg / ml
Объем 500 1000 1000 250 1000 1000 500 1000 1000 фракции, мклVolume 500 1000 1000 250 1000 1000 500 500 1000 1000 fractions, μl
Кол-во РНК 26,2 11,7 3,5 19,7 25,1 4,2 22,6 9Д 3,9 во фракции, мкгNumber of RNA 26.2 11.7 3.5 19.7 25.1 4.2 22.6 9D 3.9 in fraction, μg
Общее кол-во 41,4 49,0 35,6 РНК, мкгTotal number 41.4 49.0 35.6 RNA, mcg
Соотношение 2,0 1,93 2Д 1,91 - 2,0 1,93The ratio of 2.0 1.93 2D 1.91 - 2.0 1.93
A26O/A2goA 26O / A 2 go
Таким образом, оптимальными условиями получения препарата клеточных РНК из табака следует считать: обработку ткани 3 M TXAA, а время инкубации клеточного экстракта с TXAA - 20 мин.Thus, the optimal conditions for obtaining a cellular RNA preparation from tobacco should be considered: 3 M TXAA tissue processing, and the incubation time of the cell extract with TXAA is 20 minutes.
Пример 5. Выделение клеточных РНК из клеток асцитной карциномы (мышей) Кребс IIExample 5. The selection of cellular RNA from cells of ascites carcinoma (mice) Krebs II
Получение препарата суммарной РНК фенольно-детергентным методомPreparation of total RNA preparation by phenol-detergent method
К 430 мг клеток Кребс II прибавляли 10 мл гипотонического буфера (10 мМ трис-НСl, 15 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2, рН 8,0) и выдерживали 20 мин во льду. Затем клетки гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Даунса (20 тракций) и центрифугировали 10 мин , при 2500 об/мин на холоду (в осадке ядерная фракция). Супернатант распределяли по 12 пробиркам (по 0,9 мл), прибавляли по 100 мкл 10% SDS, рН 7,8 и проводили 3 депротеинизации (добавляли равные объемы смеси фенол/хлороформ (9:1), интенсивно встряхивали 2-3 мин, центрифугировали 2 мин при 12000 об/мин). К водной фазе после 3-eй депротеинизации добавляли ОД объема ЗМ ацетата натрия, рН 5,3 и равный объем 100% пpoпaнoлa-2 и оставляли на ночь при -2O0C. Осадок промывали 2 раза 70% этанолом, высушивали в вакуум-эксикаторе и растворяли в тридистиллированной воде. Раствор выделенной РНК спектрофотометрировали в УФ-области спектра (Фиг. 6) и определяли количество РНК, считая, что 1 о.е. оптического поглощения раствора при 260 нм соответствует концентрации РНК 37 мкг/мл. РНК анализировали также методом электрофореза в ТВЕ-буферной системе в 1% агарозном геле с 0,5 мкг/мл бромистого этидия (Фиг. 5).10 ml of hypotonic buffer (10 mM Tris-Hcl, 15 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 , pH 8.0) was added to 430 mg of Krebs II cells and kept for 20 minutes in ice. Then the cells were homogenized in a downs manual homogenizer (20 tractions) and centrifuged for 10 minutes at 2500 rpm in the cold (nuclear fraction was precipitated). The supernatant was distributed in 12 tubes (0.9 ml each), 100 μl of 10% SDS, pH 7.8 were added and 3 deproteinizations were performed (equal volumes of phenol / chloroform mixture (9: 1) were added, vigorously shaken for 2-3 min. centrifuged for 2 min at 12,000 rpm). After the 3rd deproteinization, an OD volume of 3M sodium acetate, pH 5.3 and an equal volume of 100% propanol-2 were added to the aqueous phase and left overnight at -2O 0 C. The precipitate was washed 2 times with 70% ethanol, dried in a vacuum desiccator and dissolved in distilled water. The solution of the isolated RNA was spectrophotometrically in the UV region of the spectrum (Fig. 6) and the amount of RNA was determined, assuming that 1 p.u. optical absorption of the solution at 260 nm corresponds to an RNA concentration of 37 μg / ml. RNA was also analyzed by electrophoresis in TBE buffer system in a 1% agarose gel with 0.5 μg / ml ethidium bromide (Fig. 5).
Подбор концентрации трихлорацетата аммония для осаждения клеточной РНК В 3 пробирки отбирали по 0,8 мкл (20 мкr) раствора суммарной РНК клетокSelection of the concentration of ammonium trichloroacetate for the deposition of cellular RNA In 3 tubes, 0.8 μl (20 μr) of the total RNA of cells was taken.
Кребс II, выделенной фенольно-детергентным методом, разбавляли в 10 раз тридистиллированной водой. В первую пробирку добавляли буферный раствор E до конечной концентрации трихлорацетата аммония IM, во вторую - до 2M, в третью - до ЗМ и оставляли на ночь при O0C. Осадки промывали 2 раза 70% этанолом, высушивали и визуально сравнивали их объемы. Наибольший объём осадка был при концентрации трихлорацетата аммония 2M.Krebs II, isolated by the phenol-detergent method, was diluted 10 times with distilled water. Buffer solution E was added to the first test tube to a final concentration of ammonium trichloroacetate IM, to a second to 2M, to a third to 3M and left overnight at O 0 C. Precipitation was washed 2 times with 70% ethanol, dried and their volumes were visually compared. The largest sediment volume was at a concentration of ammonium trichloroacetate 2M.
Таким образом, высокомолекулярные РНК плохо растворимы уже в 2M TXAA и выпадают в осадок вместе с диссоциировавшим денатурированным белком.Thus, high molecular weight RNAs are poorly soluble already in 2M TXAA and precipitate together with the dissociated denatured protein.
Получение препаратов суммарной РНК с помощью TXAAObtaining preparations of total RNA using TXAA
К 100 мг клеток добавляли 1 мл гипотонического буферного раствора (10 мМ трис-НСl, рН 8,0, 15 мМ NaCl, 1 мМ MgCl2), выдерживали 20 мин во льду, гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Даунса (20 тракций) и центрифугировали 10 мин при 5000 об/мин. К супернатанту добавляли равный объем буферного раствора E (табл. 1), перемешивали и оставляли на ночь при +40C. Затем к смеси для полноты осаждения РНК добавляли равный объем 100% пpoпaнoлa-2, оставляли на 1 ч при - 2O0C и центрифугировали 5 мин при 12000 об/мин. Осадки промывали 2 раза 70% этанолом, высушивали в вакуум-эксикаторе и растворяли в тридистиллированной воде. Раствор выделенной РНК спектрофотометрировали и анализировали методом электрофореза в агарозном геле, как это описано для фенольно-детергентного препарата (см. также Фиг. 5 и 6). В качестве маркеров использовали суммарную РНК незараженных клеток Кребс II, РНК вируса Менго и вируса табачной мозаики, выделенных фенольным методом.To 100 mg of cells, 1 ml of hypotonic buffer solution (10 mM Tris-Hcl, pH 8.0, 15 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 ) was added, kept for 20 min in ice, homogenized in a Downs hand-held homogenizer (20 tractions) and centrifuged 10 min at 5000 rpm An equal volume of buffer solution E was added to the supernatant (Table 1), stirred and left overnight at + 4 ° C. Then, an equal volume of 100% propanol-2 was added to the mixture to complete RNA deposition, left for 1 h at -2O 0 C and centrifuged for 5 minutes at 12,000 rpm. The precipitates were washed 2 times with 70% ethanol, dried in a vacuum desiccator and dissolved in tristilled water. The solution of the isolated RNA was spectrophotometrically and analyzed by agarose gel electrophoresis, as described for the phenolic detergent preparation (see also Figs. 5 and 6). As markers, the total RNA of uninfected Krebs II cells, RNA of the Mengo virus and tobacco mosaic virus isolated by the phenolic method were used.
Важное значение имеет спектрофотометрическая чистота получаемых с помощью TXAA препаратов РНК, эталонными являются препараты нуклеиновых кислот, получаемых фенольно-детергентной депротеинизацией. Сравнение спектров оптического поглощения препаратов суммарной РНК, полученных из клеток асцитной карциномы Креб II с помощью TXAA и фенольно-детергентным методом показало их полную идентичность (Фиг. 6).Spectrophotometric purity of RNA preparations obtained using TXAA is of great importance; nucleic acid preparations obtained by phenol-detergent deproteinization are standard. A comparison of the optical absorption spectra of the total RNA preparations obtained from the cells of ascites carcinoma Kreb II using TXAA and the phenol-detergent method showed their complete identity (Fig. 6).
Пример 6. Получение препарата клеточных РНК из бактерии Еsсhеriсhiа соli с помощью трихлорацетата аммонияExample 6. Obtaining a preparation of cellular RNA from the bacterium Escherichia coli using ammonium trichloroacetate
Замороженные клетки E. соli (20 мг) суспендировали в 200 мкл воды в течение 3 мин при комнатной температуре и немедленно добавляли 800 мкл раствора E. Клеточный лизат выдерживали 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали 20 мин при 12000 об/мин на настольной центрифуге Еррепdоrf 5414. К супернатанту добавляли 2 объема спирта и отделяли объемный осадок центрифугированием. Осадок дважды промывали 1 мл 70% спирта, подсушивали в вакуум-эксикаторе и суспендировали 10 мин в 50 мкл воды. Нерастворившийся осадок отделяли центрифугированием и отбирали пробы 1, 5 и 12 мкл для анализа электрофорезом в агарозном геле в присутствии бромистого этидия (Фиг. 7). Электрофоретический анализ показал, что бактериальные клеточные нуклеопротеиды диссоциируют в присутствии TXAA, при этом рибосомные и транспортные РНК выделяются в свободном виде.Frozen E. coli cells (20 mg) were suspended in 200 μl of water for 3 min at room temperature and 800 μl of E. solution was immediately added. The cell lysate was kept for 5 min at room temperature and centrifuged for 20 min at 12000 rpm on a Errepdor 5414 benchtop centrifuge. 2 volumes of alcohol were added to the supernatant and the volume precipitate was separated by centrifugation. The precipitate was washed twice with 1 ml of 70% alcohol, dried in a vacuum desiccator and suspended for 10 min in 50 μl of water. The insoluble precipitate was separated by centrifugation and 1, 5 and 12 μl samples were taken for analysis by agarose gel electrophoresis in the presence of ethidium bromide (Fig. 7). Electrophoretic analysis showed that bacterial cell nucleoproteins dissociate in the presence of TXAA, while ribosomal and transport RNAs are isolated in free form.
Пример 7. Детекция РНК вироида веретеновидности клубней картофеля (BBKK) в препарате суммарной РНК, полученном с помощью TXAA из зараженного растенияExample 7. Detection of RNA viroid of the spindle-shaped potato tubers (BBKK) in the total RNA preparation obtained using TXAA from an infected plant
Следующей целью изобретения было доказательство пригодности получаемых препаратов РНК для молекулярной диагностики вироидных и вирусных инфекций растений и животных, основанной на принципе молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, т.е. для технологий МГА-ИФА, ОТ-ПЦР и т.п.The next objective of the invention was to prove the suitability of the obtained RNA preparations for the molecular diagnosis of viroid and viral infections of plants and animals, based on the principle of molecular hybridization of nucleic acids, i.e. for technologies MGA-IFA, RT-PCR, etc.
Технология детекции целевой нуклеиновой кислоты МГА-ИФА представляет собой сочетание методов Молекулярного Гибридизационного Анализа и Иммуно- Ферметного Анализа.The technology for detecting the target nucleic acid MGA-ELISA is a combination of the Molecular Hybridization Analysis and Immuno-Enzyme Analysis methods.
Препараты нуклеиновых кислот анализируемых образцов растений и животных фиксируют облучением УФ-светом на нитроцеллюлозной мембране и гибридизуют со специфическим ДНК-зондом. ДНК-зонд представляет собой рекомбинантную плазмиду, содержащую вставку кДНК вируса или вироида, которая определяет специфичность зонда. ДНК-зонд содержит метку - диен-платину, которая является гаптеном и может быть обнаружена с помощью специфичных антител (В. И. Киселева, М.Ф. Турчинский, Т.Б. Колесник, А.М. Поверенный, Биоорг. химия, т. 20, с. 14-20 (1994). В свою очередь, связавшиеся первичные антитела детектируют с помощью коммерчески доступных конъюгатов вторичных антител с ферментом и его хемилюминесцентным субстратом. Люминесценция продуктов ферментативной реакции засвечивает рентгеновскую пленку, позволяя визуализировать патоген в анализируемых пробах.Nucleic acid preparations of the analyzed plant and animal samples are fixed by irradiation with UV light on a nitrocellulose membrane and hybridized with a specific DNA probe. A DNA probe is a recombinant plasmid containing a cDNA insert of a virus or viroid, which determines the specificity of the probe. The DNA probe contains a label - diene-platinum, which is a hapten and can be detected using specific antibodies (V.I. Kiseleva, M.F. Turchinsky, TB.Kolesnik, A.M. Attorney, Bioorg. Chemistry, 20, pp. 14-20 (1994). In turn, the bound primary antibodies are detected using commercially available conjugates of secondary antibodies with the enzyme and its chemiluminescent substrate. The luminescence of the enzymatic reaction products illuminates the X-ray film, allowing the pathogen to be visualized in the analyzed samples.
Поскольку выделение вироидной РНК является сложным, ее присутствие в препарате суммарной РНК, полученном из зараженных клеток, может быть определено с помощью специфичного ДНК-зонда.Since the isolation of viroid RNA is complex, its presence in the total RNA preparation obtained from infected cells can be determined using a specific DNA probe.
Получение суммарной РНК из листовой ткани зараженного BBKK картофеля с помощью TXAAObtaining total RNA from leaf tissue of infected BBKK potato using TXAA
Препарат суммарной РНК из листовой ткани картофеля получали, как это изложено в примере 3.The preparation of total RNA from leaf tissue of potato was obtained, as described in example 3.
Подготовка образцов к диагностическому анализуSample preparation for diagnostic analysis
Препарат суммарной РНК из 100 мг ткани листа картофеля растворяли в 60 мкл стерильной воды. Перед анализом опытные и контрольные образцы денатурировали на кипящей водяной бане (3 мин), быстро охлаждали в ледяной воде, и по 2 мкл анализируемого раствора РНК наносили на нитроцеллюлозные фильтры Рrоtrап BA-85 или BA-83 (Sсhlеiсhеr & Shuеll).The total RNA preparation from 100 mg of potato leaf tissue was dissolved in 60 μl of sterile water. Prior to analysis, the experimental and control samples were denatured in a boiling water bath (3 min), quickly cooled in ice water, and 2 μl of the analyzed RNA solution was applied to nitrocellulose filters Protap BA-85 or BA-83 (Schleicher & Shuell).
Для фиксации образцов фильтры запекали при 800C в вакууме (на стандартной сушилке для полиакриламидных гелей) в течение двух часов или облучали УФ-светом (Дрыгин Ю.Ф., Бузмаков A.B., Тетерина H.Л., Морозов СЮ. Молек. биол. - 1992. - т. 26. - МЛ. - с. 59-69).To fix the samples, the filters were baked at 80 ° C in vacuum (on a standard dryer for polyacrylamide gels) for two hours or irradiated with UV light (Drygin Yu.F., Buzmakov AB, Teterina H.L., Morozov SJ. Molec. Biol . - 1992. - T. 26. - ML. - p. 59-69).
Клонирование ДНК вироида веретеновидности клубней картофеляPotato tuber fusiformity viroid DNA cloning
Для клонирования суммарную фракцию РНК из зараженного картофеля, обогащенную вироидной РНК путем дифференциального осаждения BBKK растворами LiCl (от 2M до 6M), разделяли электрофорезом в 7% полиакриламидном геле. Четыре зоны, близкие по подвижности полинуклеотиду длинной 459 нуклеотидов вырезали из геля. Стандартные процедуры: элюцию полинуклеотида, его очистку переосаждением спиртом, реакцию ОТ-ПЦР, конструирование рекомбинантной плазмиды рGЕМ-ЗZ (PSTV) и секвенирование ДНК BBKK, трансформацию клеток E. соli и выделение рGЕМ-ЗZ (PSTV) проводили согласно протоколам (Мапiаtis, Т., Fritsсh, Е.F. апd Sаmbrооk, J. 1989. Моlесulаr сlопiпg, А Lаbоrаtоrу Мапuаl (2nd еd.), CoId Sрriпg Нагbоr Lаbоrаtогу, CoId Sрriпg Нагbог, N.Y.). Дополнительно плазмиду очищали равновесным центрифугированием (см. А Lаbоrаtоrу Мапuаl, упомянутый выше) в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым этидием и гидролизовали рестриктазой ВатНl. Депротеинизированную фенолом в присутствии додецилсульфата натрия плазмиду использовали для синтеза ДНК-зонда.For cloning, the total RNA fraction from infected potato enriched with viroid RNA by differential precipitation of BBKK with LiCl solutions (from 2M to 6M) was separated by electrophoresis in a 7% polyacrylamide gel. Four zones close in mobility to a polynucleotide with a length of 459 nucleotides were excised from the gel. Standard procedures: elution of the polynucleotide, purification by reprecipitation with alcohol, RT-PCR reaction, construction of the recombinant plasmid pGEM-ZZ (PSTV) and DNA sequencing BBKK, transformation of E. coli cells and isolation of pGEM-ZZ (PSTV) was performed according to the protocols (Mapiatis, T ., Fritsh, E.F. apd Sambrook, J. 1989. Molesuloplopg, A Laboru Mapual (2 nd ed.), CoId Sprig Nagor Laborogo, CoId Sprig Nagog, NY). Additionally, the plasmid was purified by equilibrium centrifugation (see A Laboru Mapul, mentioned above) in the density gradient of cesium chloride with ethidium bromide and was hydrolyzed with WatHl restrictase. Phenol deproteinized in the presence of sodium dodecyl sulfate plasmid was used to synthesize a DNA probe.
Синтез ДНК-зонда для молекулярной диагностики вироидной инфекции Синтез (диeн)Pt (хлордиэтилентриаминплатины хлорида, [Pt(dien)Cl]Cl), диен- платинового ДНК-зонда, проводили, как это описано ранее ((Кондакова О.А. , Дрыгин Ю.Ф. Диагностика вирой дного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt-ДHK, Биотехнология, Jfe4, с. 83-90 (1999)).DNA probe synthesis for molecular diagnosis of viroid infection Synthesis of (diene) Pt (chlorodiethylenetriamineplatinum chloride, [Pt (dien) Cl] Cl), a diene-platinum DNA probe, was carried out as described previously ((Kondakova O.A., Drygin Yu.F. Diagnosis of a single potato disease probes (diene) Pt-DHK, Biotechnology, Jfe4, pp. 83-90 (1999)).
Детекция BBKK в препаратах суммарной РНКBBKK detection in total RNA preparations
Пригодность полученных препаратов РНК для молекулярно-диагностического анализа определяли визуально. Для надежности постановки диагноза в каждом анализе на плазмиду с опытными образцами наносили серийные разведения денатурированной pGEM-ЗZ(PSTV в ряду 200 - 0,1 пг плазмиды, которые служили внутренним индикатором чувствительности определения патогена в данном эксперименте. Нанесенные на нитроцеллюлозную мембрану образцы гибридизовали с меченной диен-платиной рекомбинантной ДНК pGEM-ЗZ(PSTV). Связавшийся зонд определяли непрямым иммуноферментным анализом на мембранах. Условия гибридизации ДНК-зонда, специфичного к BBKK, и визуального определения зараженности анализируемых образцов (см. Фиг. 8) проводили, как описано ранее ((Кондакова О.А. , Дрыгин Ю.Ф. Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt-ДHK, Биотехнология, JЧ°4, с. 83-90 (1999)).The suitability of the obtained RNA preparations for molecular diagnostic analysis was determined visually. For reliability of diagnosis in each analysis, a plasmid with experimental samples was subjected to serial dilutions of denatured pGEM-ZZ (PSTV in a series of 200 - 0.1 pg of plasmid, which served as an internal indicator of the sensitivity of pathogen determination in this experiment. Samples applied onto a nitrocellulose membrane were hybridized with labeled pGEM-ZZ recombinant DNA diene-platinum (PSTV). The bound probe was determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay on membranes. Hybridization conditions of the BBKK-specific DNA probe and visual determination of Tests of the analyzed samples (see Fig. 8) were performed as previously described ((Kondakova O.A., Drygin Yu.F. Diagnosis of potato viroid disease with probes (diene) Pt-DNK, Biotechnology, JCH ° 4, p. 83- 90 (1999)).
Как видно на Фиг. 8, с помощью ДНК-зонда можно обнаруживать до 0,1 пг плазмиды со вставкой кДНК (например, BBKK), т.е. около Зхl О"20 г-моля [Дрыгин Ю.Ф., Мусин СМ., Кондакова O.A., Савенков E.И., Соломатин C.B.,Moжaeвa K.A., акад. PACXH Атабеков И.Г. ((Молекулярная диагностика зараженности оздоровленных сортообразцов картофеля Российской Федерации вироидом веретеновидности клyбнeй», Доклады PACXH, 6, 24-25 (1996); Кондакова О. А., Дрыгин Ю.Ф. Диагностика вироидного заболевания картофеля зондами (диeн)Pt-ДHK, Биотехнология, JЫ, с. 83-90 (1999)).As seen in FIG. 8, up to 0.1 pg of a plasmid with a cDNA insert (e.g., BBKK) can be detected using a DNA probe, i.e. about Zl O "20 g mole [Drygin Yu.F., Musin SM., Kondakova OA, Savenkov E.I., Solomatin CB, Mozheva KA, academician PACXH Atabekov I.G. ((Molecular diagnosis of infection of healthy potato varieties Of the Russian Federation with viroid spindle-shaped spiders ”, PACXH Reports, 6, 24-25 (1996); Kondakova OA, Drygin Yu.F. Diagnosis of potato viroid disease with probes (diene) Pt-DNK, Biotechnology, JY, pp. 83- 90 (1999)).
В случае диагностики вироидного заражения картофеля для детекции вироида было достаточно 400 пг (40OxIO"12 г) препарата суммарной РНК, полученного с помощью TXAA. Высокая чувствительность метода позволяет обнаружить BBKK в зараженных растениях, если на анализ берется всего лишь 400 пг суммарного препарата клеточных нуклеиновых кислот или около 0,4 мкг листовой ткани картофеля. Такая чувствительность определения BBKK, вызывающего карантинное заболевание картофеля, удовлетворяет требованиям, предъявляемым к чувствительности диагностики BBKK Европейской организацией защиты растений [(PM 7/33(1) Potato Spindle Тubеr Роsрvirоid. ОЕРР/ЕРРО Вullеtiп, 34, 257-269 (2004)].In the case of the diagnosis of viral infection of potatoes, 400 pg (40OxIO "12 g) of the total RNA preparation obtained using TXAA was sufficient to detect the viroid. High sensitivity of the method allows BBKK to be detected in infected plants if only 400 pg of the total cellular nucleic acid preparation is taken for analysis acids or about 0.4 micrograms of potato leaf tissue.This sensitivity for the determination of potato quarantine BBKK meets the requirements for sensitivity for BBKK diagnostics European plant protection organization [(PM 7/33 (1) Potato Spindle Tuber Rosviroid. OEPP / EPRO Vuletip, 34, 257-269 (2004)].
Пример 8. Пригодность препаратов РНК, полученных из инфицированных вирусами растений, для диагностической МГА-ИФА технологииExample 8. The suitability of RNA preparations obtained from plants infected with viruses for diagnostic MGA-ELISA technology
Детекцию вирусных (BTM и XBK) РНК в зараженных растениях проводили подобно тому, как это изложено в Примере 7, за исключением используемых специфичных для каждого вируса ДНК-зондов. Как правило, кДНК каждого вируса были получены клонированием iп vitrо с помощью ОТ-ПЦР и подходящих праймеров. Длина клонированных фрагментов ДНК была в ряду 450-1600 пар нуклеотидов. С помощью специфичного ДНК-зонда инфекция картофеля XBK достоверно видна в ряду концентраций суммарной РНК 200-2000 нг/мкл, причем вирусная РНК определяется одинаковым образом как в препаратах, полученных классической фенольно-детергентной депротеинизацией, так и в препарате, полученном с помощью TXAA (Фиг. 9).The detection of viral (BTM and XBK) RNA in infected plants was carried out similarly as described in Example 7, except for the use of specific for each virus DNA probes. Typically, cDNAs of each virus were obtained by cloning ip vitro using RT-PCR and appropriate primers. The length of the cloned DNA fragments was in the range of 450-1600 nucleotide pairs. Using a specific DNA probe, an XBK potato infection is reliably visible in a series of concentrations of total RNA of 200-2000 ng / μl, moreover, viral RNA is determined in the same way both in preparations obtained by classical phenol-detergent deproteinization and in a preparation obtained using TXAA ( Fig. 9).
Пример 9. Пригодность препаратов РНК, полученных из инфицированных вирусами растений, для диагностики ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-МГА-ИФА технологиямиExample 9. The suitability of RNA preparations obtained from plants infected with viruses for the diagnosis of RT-PCR and RT-PCR-MGA-ELISA technologies
ОТ-ПЦР анализ препаратов суммарной РНК, полученных с помощью TXAA, из листовой ткани коллекционного картофеляRT-PCR analysis of total RNA preparations obtained using TXAA from collection potato leaf tissue
Анализ проводили визуально и фотографированием полос флуоресцирующих ДНК (Фиг. 10A), амплифицированных путем последовательной обратной транскрипции РНК вироида с праймером (GААААААGААGGСGGСТСGGАGGА ВВКК-геv), а затем полимеразной цепной реакцией с праймерами (GААААААGААGGСGGСТСGGАGGА (ВВКК-rеv) и GССGАСАGGАGТААТТС (ВВКК-fоrwаrd).Analysis was performed visually and by photographing bands fluorescing DNA (FIG. 10A), amplified by sequential RNA viroid reverse transcription primer (GAAAAAAGAAGGSGGSTSGGAGGA SWCC-gev), and then the polymerase chain reaction with primers (GAAAAAAGAAGGSGGSTSGGAGGA (SWCC-rev) and GSSGASAGGAGTAATTS (SWCC-forward )
Сравнительный анализ чувствительности диагностики вироидной (BBKK) инфекции технологиями ПЦР (см. Фиг. 10A), МГА-ИФА (10Б) и ОТ-ПЦР-МГА-ИФА (10В) препаратов суммарной РНК, полученных с помощью TXAA, из листовой ткани коллекционного картофеляComparative analysis of the sensitivity of diagnosis of viroid (BBKK) infection by PCR technology (see Fig. 10A), MGA-ELISA (10B) and RT-PCR-MGA-ELISA (10B) of total RNA preparations obtained using TXAA from leaf tissue of collection potatoes
Для сравнения чувствительности используемых технологий молекулярной диагностики полученные с помощью TXAA препараты РНК амплифицировали технологией ОТ-ПЦР и продукты анализировали по флуоресценции в геле ( Фиг. 10A). Аналогичные пробы наносили на нитроцеллюлозный фильтр (Фиг. 10Б) и анализировали технологией МГА-ИФА (см. Пример 7) или технологией ОТ-ПЦР- МГА-ИФА (Фиг. 10В). Таким образом, по чувствительности детекции патогена технологии были в ряду MГA-ИФA< OT-ПЦP«MГA-ИФA-OT-ПЦP (сравните пробы 3, 10, 14, 15 на Фиг. 10A, ЮБ и 10В).To compare the sensitivity of the used molecular diagnostic technologies, TXAA-derived RNA preparations were amplified by RT-PCR and the products were analyzed by gel fluorescence (Fig. 10A). Similar samples were applied to a nitrocellulose filter (Fig. 10B) and analyzed by MGA-ELISA (see Example 7) or by RT-PCR- MGA-ELISA (Fig. 10B). Thus, according to the sensitivity of pathogen detection, the technologies were in the series MGA-IFA <OT-PCR "MGA-IFA-OT-PCR (compare samples 3, 10, 14, 15 in Fig. 10A, 10B, 10B).
Таким образом, препараты РНК, полученные из растительного материалы, пригодны для диагностического анализа технологиями ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-МГА- ИФА.Thus, RNA preparations obtained from plant materials are suitable for diagnostic analysis using RT-PCR and RT-PCR-MGA-ELISA.
Пример 10. Определение вирусной РНК технологией МГА-ИФА в препарате суммарной РНК, полученном из клеток карциномы Кребс II, инфицированных вирусом МенгоExample 10. Determination of viral RNA by MGA-ELISA technology in a total RNA preparation obtained from Krebs II carcinoma cells infected with Mengo virus
Заражение клеток асцитной карциномы Кребс II вирусом Менго (одноцикловый опыт)Infection of Krebs II ascites carcinoma cells with Mengo virus (single-cycle experiment)
Заражение клеток проводили по стандартной методике (Практикум по общей вирусологии, ред. И.Г.Атабеков, изд.2-e, МГУ, Москва, 2002). Клетки асцитной карциномы Кребс II культивировали в мышах (беспородные самки, масса 13-17 г). Клетки 7-дневного асцита промывали раствором Эрла на холоду в стерильных условиях и добавляли суспензию вируса Менго (титр 1-2*109 БОЕ/мл, множественность заражения 10 БОЕ/кл). Клетки с вирусом инкубировали 30 мин при комнатной температуре (для адсорбции вирусных частиц), промывали раствором Эрла, затем доводили концентрацию клеток средой Игла до 2*107 кл./мл, выдерживали в течение ночи при +20C (синхронизация вирусной инфекции) и инкубировали 5 ч при 36,50C. Клетки, зараженные вирусом Менго, и незараженные клетки промывали «caxapoзным» буфером (ЮмМ трис-НСl, рН 8,0, с 8% сахарозы и 1 мМ MgCl2), замораживали в жидком азоте и хранили при -7O0C.Cell infection was carried out according to a standard technique (Workshop on General Virology, ed. I.G. Atabekov, ed.2-e, Moscow State University, Moscow, 2002). Krebs II ascites carcinoma cells were cultured in mice (outbred females, weight 13-17 g). 7-day ascites cells were washed with Earle's solution in the cold under sterile conditions and a suspension of Mengo virus was added (titer 1-2 * 10 9 PFU / ml, multiplicity of infection 10 PFU / cell). Cells with the virus were incubated for 30 min at room temperature (for adsorption of viral particles), washed with Earle's solution, then the cell concentration was adjusted with Eagle's medium to 2 * 10 7 cells / ml, kept overnight at +2 0 C (synchronization of viral infection) and incubated for 5 h at 36.5 ° C. Cells infected with the Mengo virus and uninfected cells were washed with caxapose buffer (HMM Tris-Hcl, pH 8.0, with 8% sucrose and 1 mM MgCl 2 ), frozen in liquid nitrogen and stored at -7O 0 C.
Препараты суммарной РНК из незараженных и инфицированных клеток получали, как это описано в Примере 5. ДНК-зонд представлял собой рекомбинантную плазмиду, содержащую вставку кДНК вируса Менго, меченную диен-платиной. Мечение специфичной рекомбинантной ДНК диен-платиной и детекцию целевой вирусной РНК проводили, как это описано в Примере 7.Total RNA preparations from uninfected and infected cells were obtained as described in Example 5. The DNA probe was a recombinant plasmid containing a Mengo virus cDNA insert labeled with dien-platinum. The labeling of specific recombinant DNA with dien-platinum and the detection of the target viral RNA were performed as described in Example 7.
Перед анализом проводили определение специфичности ДНК-зонда на контрольных (положительных и отрицательных) препаратах РНК. Определение специфичности (диeн-Pt)-ДHK-зoндa (меченой рекомбинантной плазмиды со вставкой кДНК вируса Менго) технологией МГА-ИФА приведено на Фиг. 11. Используемый ДНК-зонд, меченный диен-платиной, имеет высокую специфичность. ДНК-зонд не узнает не родственные РНК, а именно, РНК BTM и 16S рРНК E. соli. Несмотря на близкое родство пикорнавирусов Менго и энцефаломиокардита, ДНК-зонд к вирусу Менго значительно лучше (сравни образцы 2 и 4), чем РНК ВЭМК узнает РНК вируса Менго.Before analysis, the specificity of the DNA probe was determined on control (positive and negative) RNA preparations. Determination of the specificity of the (diene-Pt) -DNA probe (labeled recombinant plasmid with the addition of Mengo virus cDNA) by MGA-ELISA is shown in FIG. 11. The used DNA probe labeled with diene-platinum has a high specificity. DNA probe is not recognizes not related RNAs, namely, BTM RNA and E. coli 16S rRNA. Despite the close relationship between the Mengo picornaviruses and encephalomyocarditis, the DNA probe to the Mengo virus is significantly better (compare samples 2 and 4) than VEMK RNA recognizes the Mengo virus RNA.
На Фиг. 12 приведен результат диагностического анализа клеток асцитной карциномы в препаратах суммарной РНК, полученных с помощью TXAA после 5- часовой инфекции их вирусом Менго. Диагностический анализ проводили подобно тому, как это изложено в Примере 7. Как видно, для определения вирусного заражения на ранних стадиях инфекции достаточно 10 нг суммарной клеточной РНК, выделенной из зараженных клеток через 5 часов после инфекции, в то время как «диeн-плaтинoвый» ДНК-зонд не связывается с 1 мкг клеточной РНК.In FIG. Figure 12 shows the result of a diagnostic analysis of ascites carcinoma cells in total RNA preparations obtained with TXAA after a 5-hour infection with their Mengo virus. Diagnostic analysis was carried out similarly to that described in Example 7. As can be seen, 10 ng of total cellular RNA isolated from infected cells 5 hours after infection is sufficient to determine viral infection in the early stages of infection, while “diene-platinum” The DNA probe does not bind to 1 μg of cellular RNA.
Результаты многочисленных экспериментов доказали, что препараты РНК, полученные из пробирочных растений или листовой ткани картофеля или из животных клеток с помощью TXAA, пригодны для специфической и чувствительной диагностики вироидной и вирусных инфекций картофеля, сливы и клеток животных. Важно, что диагностировать пикорнавирусную инфекцию животных можно уже через 5 часов после инфекции, т.е. на ранних ее стадиях, причем для детекции вирусной РНК достаточно 10 нг суммарной клеточной РНК, выделенной из зараженных клеток. Важно, что «виpycный» диен-платиновый ДНК-зонд высоко специфичен и не связывается с огромным избытком (1 мкг) клеточной РНК (Фиг. 12).The results of numerous experiments have proved that RNA preparations obtained from test plants or leaf potato tissue or from animal cells using TXAA are suitable for specific and sensitive diagnosis of viroid and viral infections of potato, plum and animal cells. It is important that animals can be diagnosed with picornavirus infection as early as 5 hours after infection, i.e. in its early stages, moreover, 10 ng of total cellular RNA isolated from infected cells is sufficient to detect viral RNA. It is important that the “wild” diene-platinum DNA probe is highly specific and does not bind to a huge excess (1 μg) of cellular RNA (Fig. 12).
Пример 11. Сравнительный анализ эффективности детекции препаратов вироидной РНК, полученных разными методами из листовой ткани картофеляExample 11. Comparative analysis of the detection efficiency of viroid RNA preparations obtained by different methods from leaf tissue of potato
Выделение РНК из растений фенольно-детергентной депротеинизациейIsolation of RNA from plants by phenol-detergent deproteinization
Анализируемый образец растительной ткани (50 мr) гомогенизировали растиранием в пробирке в 0,25 мл экстрагирующего буфера (100 мМ Трис-НСl (рН 7,2), 1% SDS, 1 мМ EDTA) и выдерживали на водяной бане в течение 5 мин при 1000C, чтобы денатурировать белки и нуклеиновые кислоты. Образцы охлаждали 5 мин в бане с ледяной водой и отделяли осадок центрифугированием (5 мин, 10000 об/мин). К супернатантам добавляли равный объем смеси фенол/хлороформ ((9:1 об/об), насыщенной 0,1 M Трис-НСl (рН 7,5) и трижды депротеинизировали РНК. Препарат суммарной РНК осаждали этанолом, промывали 70% спиртом, растворяли в деионизованной и дважды дистиллированной воде и хранили при -2O0C.The analyzed sample of plant tissue (50 mr) was homogenized by grinding in a test tube in 0.25 ml of extraction buffer (100 mm Tris-Hcl (pH 7.2), 1% SDS, 1 mm EDTA) and kept in a water bath for 5 min at 100 0 C to denature proteins and nucleic acids. Samples were cooled for 5 min in an ice water bath and the precipitate was separated by centrifugation (5 min, 10,000 rpm). An equal volume of phenol / chloroform (9: 1 v / v) saturated with 0.1 M Tris-Hcl (pH 7.5) was added to supernatants and RNA was deproteinized three times. Total RNA was precipitated with ethanol, washed with 70% alcohol, dissolved in deionized and double distilled water and stored at -2O 0 C.
Выделение РНК из растений с помощью гунидинтиоцианата и силикагеля Получение суспензии аморфного силикагеля (Sigmа) и экстракцию РНК проводили аналогично тому, как это описано для выделения ДНК из бактерий и животных клеток ((Вооm R. еt аl. Rарid апd simрlе mеthоd fог рurifiсаtiоп оf пuсlеiс асids. J CUn. МiсrоЪ. 28, 495-503 (1990)).Isolation of RNA from plants using gunidinothiocyanate and silica gel The preparation of a suspension of amorphous silica gel (Sigma) and the extraction of RNA was carried out in the same way as described for the isolation of DNA from bacteria and animal cells ((Boom R. et al. Rarid apd simpé metod fogpurifiсtiop оf pusleis asids. J CUn. Місроб. 28, 495-503 (1990)).
Выделение РНК из растений с помощью TXAAIsolation of RNA from plants using TXAA
Выделение суммарной РНК из зараженного BBKK картофеля проводили таким же образом, как изложено в Примере 3.The selection of total RNA from infected potato BBKK was carried out in the same manner as described in Example 3.
Сравнительный анализ препаратов РНК патогена (на примере BBKK), полученных разными способами: фенольной депротеинизацией, с помощью гуанидинтиоцианата (Сhоmсzупski, N. Sассhi, Siпglе-stер mеthоd оf RNA isоlаtiоп bу асid guапidiпium thiосуопаtе-рhепоl-сhlогоfоrm ехtrасtiоп, Апаl Вiосhеm. 162 (1987) 156-159) и с использованием способа настоящего изобретения, технологией МГА- ИФА показал, что эффективность экстракции и определения вироидной РНК, выделенной из одинакового количества листовой ткани картофеля, одинакова (Фиг. 13).Comparative analysis of pathogen RNA preparations (using BBKK as an example) obtained by different methods: phenol deproteinization using guanidine thiocyanate (Chemzupski, N. Sasshi, Sinter-method met RNA isolitopholepheptophepheptophepheptophephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephephealth 1987) 156-159) and using the method of the present invention, the MGA-ELISA technology showed that the efficiency of extraction and determination of viroid RNA isolated from the same amount of leaf potato tissue is the same (Fig. 13).
Все патенты, публикации, научные статьи, и другие документы и материалы, цитируемые или упоминаемые здесь, включены в настоящее описание путем отсылки в такой степени, как если бы каждый из этих документов был включен путем отсылки индивидуально или приведен здесь в его полном виде.All patents, publications, scientific articles, and other documents and materials cited or referenced herein are hereby incorporated by reference to the extent that each of these documents was individually incorporated by reference or is presented in its entirety.
Конкретные гены, векторы, вирусы и вироиды, клетки, виды растений и животных, применения, используемые материалы и методы, описанные здесь, относятся к предпочтительным вариантам осуществления, приведены в качестве примеров и не предназначены для ограничения объема данного изобретения. При изучении этого описания другие объекты, аспекты и воплощения будут приходить в голову специалистам в данной области, и они охватываются рамками данного изобретения. Специалистам в данной области будет понятно, что различные замены и модификации могут быть произведены в отношении описанного здесь изобретения без отклонения от его объема и рамок, которые определяются прилагаемой формулой изобретения. Specific genes, vectors, viruses and viroids, cells, species of plants and animals, uses, materials and methods described herein are preferred embodiments, are exemplary, and are not intended to limit the scope of the invention. When studying this description, other objects, aspects, and embodiments will come to mind to those skilled in the art, and they are encompassed by the scope of this invention. Specialists in this field will be clear that various replacements and modifications can be made in relation to the invention described here without deviating from its scope and scope, which are determined by the attached claims.

Claims

Формула изобретения Claim
1. Способ выделения суммарной РНК из вирусов, бактерий, клеток растений (в том числе вироидных РНК) или животных, включающий следующие стадии: а) диссоциация нуклеопротеидных и других природных комплексов нуклеиновых кислот с помощью трихлорацетата аммония; и б) очистка РНК путем сорбции-десорбции РНК на фильтровальной бумаге или хлопковой вате.1. A method for isolating total RNA from viruses, bacteria, plant cells (including viroid RNA) or animals, comprising the following stages: a) dissociation of nucleoprotein and other natural nucleic acid complexes using ammonium trichloroacetate; and b) purification of RNA by sorption-desorption of RNA on filter paper or cotton wool.
2. Способ по п. 1, в котором клетки растений, животных или бактерий являются здоровыми клетками.2. The method of claim 1, wherein the cells of plants, animals, or bacteria are healthy cells.
3. Способ по п. 1, в котором клетки растений, животных или бактерий являются клетками, инфицированными вирусами, инфицированы или трансформированы вироидом.3. The method according to p. 1, in which the cells of plants, animals or bacteria are cells infected with viruses, infected or transformed by a viroid.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором диссоциацию нуклеопротеидных и других комплексов осуществляют при помощи водного раствора трихлорацетата аммония в конечной концентрации 2-4 M в среде, имеющей близкое к нейтральному значение рН, при комнатной температуре.4. The method according to any one of the preceding paragraphs, in which the dissociation of nucleoprotein and other complexes is carried out using an aqueous solution of ammonium trichloroacetate in a final concentration of 2-4 M in an environment having a pH close to neutral at room temperature.
5. Применение трихлорацетата аммония в качестве средства для диссоциации природных комплексов нуклеиновых кислот.5. The use of ammonium trichloroacetate as a means for the dissociation of natural nucleic acid complexes.
6. Применение по п. 5, где природные комплексы нуклеиновых кислот представляют собой комплексы РНК.6. The use of claim 5, wherein the natural nucleic acid complexes are RNA complexes.
7. Применение по п. 6, где комплексы РНК представляют собой нуклеопротеидные комплексы.7. The use of claim 6, wherein the RNA complexes are nucleoprotein complexes.
8. Применение по п. 7, где нуклеопротеидные комплексы РНК представляют собой вирусы, информосомы, рибосомы.8. The use of claim 7, wherein the RNA nucleoprotein complexes are viruses, informosomes, ribosomes.
9. Применение по п. 6, где комплексы РНК представляют собой комплексы с ДНК или с клеточными мембранами.9. The use of claim 6, wherein the RNA complexes are complexes with DNA or with cell membranes.
10. Применение по п. 5, где природные комплексы нуклеиновых кислот представляют собой комплексы ДНК.10. The use of claim 5, wherein the natural nucleic acid complexes are DNA complexes.
11. Применение по п. 10, где комплексы ДНК представляют собой нуклеопротеидные комплексы. 11. The use of claim 10, wherein the DNA complexes are nucleoprotein complexes.
PCT/RU2007/000310 2007-06-08 2007-06-08 Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method WO2008150187A1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2007/000310 WO2008150187A1 (en) 2007-06-08 2007-06-08 Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2007/000310 WO2008150187A1 (en) 2007-06-08 2007-06-08 Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2008150187A1 true WO2008150187A1 (en) 2008-12-11

Family

ID=40093894

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2007/000310 WO2008150187A1 (en) 2007-06-08 2007-06-08 Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2008150187A1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2345719A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-20 Qiagen GmbH Method for isolating small RNA
CN102725407A (en) * 2010-01-07 2012-10-10 比格科技私人有限公司 A method for isolation of nucleic acids and a kit thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
WO2003040687A2 (en) * 2001-11-06 2003-05-15 Cortex Biochem, Inc. Isolation and purification of nucleic acids
RU2232810C1 (en) * 2002-12-19 2004-07-20 Лактионов Павел Петрович Method for isolating ribonucleic acids
US20060099605A1 (en) * 2004-11-11 2006-05-11 Hall Gerald E Jr Devices and methods for isolating RNA

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
WO2003040687A2 (en) * 2001-11-06 2003-05-15 Cortex Biochem, Inc. Isolation and purification of nucleic acids
RU2232810C1 (en) * 2002-12-19 2004-07-20 Лактионов Павел Петрович Method for isolating ribonucleic acids
US20060099605A1 (en) * 2004-11-11 2006-05-11 Hall Gerald E Jr Devices and methods for isolating RNA

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Khimicheskaya entsiklopediya, M., iz-vo "Bolshaya Rossisskyay entsiklopediya"", vol. 5, 1999, pages: 296 - 297 *
DAWSON R.M.C. ET AL.: "Data for Biochemical Research", vol. 3RD ED., 1986, CP, OXFORD *
MARISI AIDAR ET AL.: "A simple and cost-effective protocol for DNA isolation from buccal epithelial cells", BRAZ. DENT. J., vol. 18, no. 2, 2007, pages 1 - 8 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102725407A (en) * 2010-01-07 2012-10-10 比格科技私人有限公司 A method for isolation of nucleic acids and a kit thereof
EP2521780A1 (en) * 2010-01-07 2012-11-14 Bigtec Private Limited A method for isolation of nucleic acids and a kit thereof
JP2013516186A (en) * 2010-01-07 2013-05-13 ビッグテック プライベート リミテッド Nucleic acid isolation method and kit
EP2521780A4 (en) * 2010-01-07 2013-07-31 Bigtec Private Ltd A method for isolation of nucleic acids and a kit thereof
EP2345719A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-20 Qiagen GmbH Method for isolating small RNA
WO2011086195A1 (en) * 2010-01-18 2011-07-21 Qiagen Gmbh Method for isolating small rna

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2567599C (en) Kits and processes for removing contaminants from nucleic acids in environmental and biological samples
JP3696238B2 (en) Nucleic acid purification composition and method
JP5554919B2 (en) Nucleic acid isolation and purification
ES2616569T3 (en) Procedure for the isolation of nucleic acids in which nucleic acids are immobilized at high temperature on a matrix
JP4435787B2 (en) Formulations and methods for denaturing proteins
JP2002531126A (en) Formulations and methods for isolation of nucleic acids from any complex starting material and subsequent complex gene analysis
JP2007532140A (en) Reagent and method for isolation of purified RNA
JP7496316B2 (en) Isolating nucleic acids and removing inhibitors from complex samples
CN103898092A (en) Kit and method for extracting plant tissue genome DNA by adopting quick paramagnetic particle method
WO2012155577A1 (en) Method for separating and purifying rna from biomaterial
US20120171728A1 (en) Process for amplifying dna using tetratethylene glycol, kit of parts therefor and use thereof
CN112501162A (en) Kit for extracting new coronavirus RNA by using nano magnetic beads and extraction method
CN104404030B (en) A kind of kit and method of rapid extraction plant genome DNA
US10323241B2 (en) Method for recovering short-chain nucleic acids
WO2008150187A1 (en) Use of ammonium trichloroacetate in the form of an agent for dissociating natural nucleic acid complexes and a rna extracting method
CN114703173A (en) Lambda phage DNA extraction kit and extraction method
KR101380909B1 (en) Absorbents for purification of nucleic acid and a purification method using the absorbents
JP2006067890A (en) Method for extracting nucleic acid and nucleic acid-extracting kit
Khatami et al. Magnetic nanoparticles: a promising component in RNA extraction process
Chattopadhyay et al. Purification of quality DNA from citrus plant using iron oxide nanoparticle as solid based support
RU2807254C1 (en) Universal method of dna isolation and lysis mixture for its implementation
AU2018262177B2 (en) Rapid purification of high quality nucleic acids from biological samples
CN114934041A (en) Reagent and method for extracting nucleic acid
JP2004105009A (en) Reagent for separating nucleic acid comprising tetraphenylboron compound and method for separating nucleic acid using the same

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 07852019

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 07852019

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1