WO2008089690A1 - Procédé de préparation de la protéine humaine recombinante p43 - Google Patents

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WO2008089690A1
WO2008089690A1 PCT/CN2008/070132 CN2008070132W WO2008089690A1 WO 2008089690 A1 WO2008089690 A1 WO 2008089690A1 CN 2008070132 W CN2008070132 W CN 2008070132W WO 2008089690 A1 WO2008089690 A1 WO 2008089690A1
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peak
edta
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Datao Liu
Xiaoding Tan
Linda Hu
Yan Wang
Xi Zhu
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Sine Pharmaceutical Laboratories
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the invention relates to a preparation process of recombinant human protein, in particular to a preparation process of recombinant human p43 protein. Background of the invention
  • Malignant tumors are the enemy of human health.
  • the medical field mainly treats malignant tumors by killing cancer cells, gp: surgery, chemotherapy, radiotherapy, etc. These methods also kill normal cells while killing cancer cells, and easily cause tumor cells to develop drug resistance. Therefore, people have been exploring a cancer treatment method that specifically kills tumor cells without damaging normal cells, and at the same time is not easy to cause tumor resistance.
  • New drugs currently used to treat tumors are emerging. In recent years, with the continuous improvement of the research level of molecular biology and genetic engineering, people have gradually paid attention to the method of using genetic engineering drugs to treat malignant tumors.
  • Most of the traditional tumor chemotherapy methods are cytotoxic drugs, which kill the tumor cells and cause damage to normal cells, which weakens the human body.
  • a common feature of malignant tumors is that local cells proliferate wildly and unchecked, and maintaining this proliferation means a large supply of nutrients. At the same time as the tumor is formed, a large number of blood vessels supplying nutrients are formed inside and around the tumor. Then if you can cut off these feeding "pipes" and block the source of the tumor, the tumor will die and die.
  • Anti-angiogenic therapy mainly inhibits the growth of vascular endothelial cells with rapid abnormal proliferation, specifically inhibits the proliferation and growth of tumor vascular endothelial cells, thereby preventing tumor angiogenesis, atrophy of tumor capillaries, cutting off the nutritional supply of tumors, and making tumors Apoptosis, which degenerates to its initial dormancy, achieves the goal of treating cancer.
  • Endostatin has passed the first phase of the FDA and is currently in Phase II clinical phase.
  • Phase II clinical phase due to the poor solubility of Endostatin, its preparation cost is increased, and at the same time, the water injection dosage form can only be used in use, which limits its application.
  • the p43 protein is a cofactor for mammalian tRNA synthetase, which directly regulates the physiological processes of endothelial cells forming capillaries, and on the other hand inhibits tumor angiogenesis by altering the microenvironment.
  • the anti-angiogenic activity of p43 protein and its inhibition of tumor growth have been confirmed in vitro and in animal experiments.
  • Human Recombinant p43 protein has been shown to be developed as a novel therapeutic drug for cancer, effective against a variety of primary and metastatic solid tumors, and can be combined with chemotherapy and radiotherapy.
  • the p43 protein is a family member of the human aminoacyl tRNA synthetase system and is a precursor of the endothelial mononuclear cell activating peptide discovered in 1997 by SophieQ et al.
  • the p43 protein is a single-chain protein with a total length of 312 amino acids and a secondary structure containing 11 ⁇ sheets.
  • Imagene Corporation of Korea has conducted in-depth research on the structure and biological activity of human ⁇ 43 protein. The results show that human ⁇ 43 protein can inhibit the growth of rapidly and abnormally proliferating vascular endothelial cells and inhibit the angiogenesis of chick embryo chorioallantoic membrane, indicating that ⁇ 43 protein Has a potential anti-tumor effect.
  • ⁇ 43 protein In order to develop ⁇ 43 protein as a drug, it must be genetically engineered and purified in large quantities to obtain a certain amount of high-purity protein.
  • the protein has been cloned into a prokaryotic expression vector by conventional molecular biology techniques and has high expression in E. coli, but its purification process has always been problematic, mainly because the p43 protein and nucleic acid are difficult to separate after binding, resulting in The purified yield of the protein is drastically reduced.
  • ⁇ 43 protein is a protein that binds easily to nucleic acids. In general conditions and homogenate disruption of genetically engineered bacteria, a large amount of ⁇ 43 protein binds to the nucleic acid released after cell disruption, resulting in a strong heterogeneity of the charge of ⁇ 43 protein. The molecular weight is not uniform, which brings great difficulty to the purification of the protein, and the purification yield of the protein is drastically reduced.
  • the object of the present invention is to provide a genetically engineered Escherichia coli containing p43 protein gene which is effective and pure A method of producing p43 protein and having a high yield.
  • the present invention provides a method for producing recombinant human p43 protein from genetically engineered Escherichia coli containing the p43 protein gene, the method comprising the steps of:
  • step (2) the resulting supernatant was treated DEAESephoarose TM FastFlow column; for (3) with ammonium sulfate solution in step (2) salting out the supernatant obtained precipitate, the resulting precipitate was then dissolved buffer solution to give a solution of , collecting through the peak solution;
  • the buffer solution is selected from one or more of the group consisting of trishydroxymethylaminomethane hydrochloride and a phosphate solution.
  • the buffer solution has a pH of from 6.5 to 9.0.
  • the pH of the buffer solution is from 7 to 8.5.
  • the pH of the buffer solution is from 7.0 to 8.0.
  • the p43 protein is a protein that binds easily to nucleic acids. In general conditions and homogenate disruption of genetically engineered bacteria, a large amount of p43 protein binds to the nucleic acid released after cell disruption, resulting in a strong heterogeneity of the charge of p43 protein. The molecular weight is not uniform, which brings great difficulty to the purification of the protein, and the purification yield of the protein is drastically reduced.
  • the invention effectively separates the target protein and the nucleic acid by exploring and optimizing the purification process, and greatly improves the purification efficiency and the yield.
  • Figure 1 depicts the results of electrophoretic detection of expression.
  • Figure 2 depicts the protein elution peak and cross-peak SDS-PAGE electrophoresis after passing through the SP column.
  • Figure 3 depicts the variation in p43 protein yield as a function of nucleic acid removal.
  • the present invention provides a method for producing recombinant human p43 protein from genetically engineered Escherichia coli containing the p43 protein gene, the method comprising the steps of:
  • step (2) The supernatant obtained in the step (2) is subjected to salting-out precipitation with an ammonium sulfate solution, and the obtained precipitate is used again. Red solution was dissolved to obtain a solution; Alternatively, step (2) The resulting supernatant was DEAESephoarose TM FastFlow column treatment, through peak was collected;
  • the method for preparing the genetically engineered Escherichia coli of the p43 protein gene is as follows: The full-length gene is synthesized according to the known DNA sequence of the human p43 protein gene, and the Ncol enzyme is introduced at the 5' end of the gene sequence.
  • the cleavage site was introduced into the 3'-end Xhol site, and the plasmid pET28a-43 containing the human p43 protein gene was constructed by double-digesting with NcoI and Xhol and inserting the pET28a plasmid which was digested with the two enzymes. The accuracy of the gene sequence was confirmed by DNA sequencing analysis.
  • Escherichia coli BL21-DE3 as a host strain, plasmid pET28a-43 was transformed into BL21-DE3 and expressed, and a stably and highly expressed genetically engineered Escherichia coli containing the p43 protein gene was obtained by repeated screening and expression analysis.
  • the buffer solution used in the step (1) is conventional, and those skilled in the art can directly obtain which buffer solution can be used in the present invention in accordance with the description of the present invention in combination with the prior art.
  • the buffer solution is selected from one or more of the group consisting of trishydroxymethylaminomethane hydrochloride and a phosphate solution.
  • the pH of the buffer solution is conventional, and one of ordinary skill in the art can directly obtain its specific pH range in accordance with the description of the present invention in combination with the prior art.
  • the pH of the buffer solution is from 6.5 to 9.0, preferably from 7 to 8.5, more preferably from 7.0 to 8.0.
  • the crushing method and the centrifuging method described in the step (2) are conventional, and those skilled in the art can directly obtain which methods can be used in the present invention in accordance with the description of the present invention in combination with the prior art.
  • the crushing method comprises disrupting the cells by high pressure homogenization under conditions of 1000 atmospheres and one cycle.
  • the centrifugation method is carried out at 5,000 to 20,000 rpm, preferably 12,000 to 15,000 rpm.
  • the ammonium sulfate solution is conventional, and those skilled in the art can directly obtain which ammonium sulfate solution can be used in the present invention after reading the description of the present invention in combination with the prior art.
  • the ammonium sulfate solution is a 60% by weight aqueous solution.
  • the buffer solution used is conventional, and those skilled in the art can directly obtain which buffer solution can be used in the present invention in accordance with the description of the present invention in combination with the prior art.
  • the buffer solution is the same as the buffer solution used in the step (1), or the buffer solution includes other components, such as sodium chloride, in addition to the components of the buffer solution used in the step (1). .
  • Example 8 the sp column of the protein and nucleic acid separated was passed through a peak by the method optimized by the present invention.
  • the invention is described in detail below with reference to the embodiments, which are intended to be illustrative only and not to limit the scope of the invention.
  • ACTCGAGTTATTTGATTCCACTGTTGCTC uses the pUC-18 plasmid containing the fully synthetic p43 protein gene as a template for PCR amplification according to standard methods: denaturation at 94 ° C for 1 minute, annealing at 55 ° C for 40 seconds.
  • reaction system 20 ⁇ Double digestion, reaction system 20 ⁇ 1, as follows:
  • the reaction temperature was 37 ° C and the time was 1.5 hours.
  • Ligase (ligase) 0.5 ⁇ ⁇
  • the reaction temperature was 16 ° C for 24 hours.
  • the reagents used in the above experimental procedures were purchased from Dalian Bao Biotech Co., Ltd.
  • the ligation product was transformed into E. coli TOP10 (purchased from Shanghai Pufei Biotechnology Co., Ltd.), and identified by the above PCR and double enzyme digestion methods, and positive clones were selected. After the culture, the plasmid was extracted to obtain the expression vector pET28a containing the human p43 protein gene. 43.
  • the cells were recovered by centrifugation at 3000 rpm at 4 ° C for 10 min, and resuspended in 2 ml of pre-cooled 0.1 M calcium chloride to prepare competent cells.
  • the LB plates of themycin were cultured overnight at 37 ° C in an incubator. Picking out grown clones Incubate overnight at 37 ° C in 2 ml of LB medium. Inoculated in 3 ml of LB at 1:50, cultured at 37 ° C until
  • the fermentation medium is prepared by using conventional M9 medium, and the inoculum is about 2%-5%.
  • IPTG isopropyl-bD-thiogalactoside
  • the gradient of the B solution was used to wash the p43 protein of the hanging column with about 10 bed volumes, and the protein absorption peak of the p43 protein was collected, and the detection wavelength was 280 nm.
  • the detection wavelength was 280 nm.
  • DEAE DEAE
  • the gradient of the B solution was used to wash the p43 protein of the hanging column with about 10 bed volumes, and the protein absorption peak of the p43 protein was collected, and the detection wavelength was 280 nm.
  • the detection wavelength was 280 nm.

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Description

重组人 P43蛋白的制备工艺 技术领域
本发明涉及重组人蛋白的制备工艺， 具体涉及重组人 p43蛋白的制备工艺。 发明背景
恶性肿瘤是威胁人类健康的大敌， 医学界对恶性肿瘤的治疗主要采取杀死癌 细胞为主的方法， gp : 手术、 化疗、 放疗等。 这些方法在杀死癌细胞的同时也损 伤正常细胞， 并且容易使肿瘤细胞产生耐药性。 因而， 人们一直在探索一种能专 一性地杀死肿瘤细胞且不损伤正常细胞， 同时又不易使肿瘤产生耐药性的治癌方 法。 目前用于治疗肿瘤的新药层出不穷。 近年来， 随着分子生物学基因工程的研 究水平的不断提高， 人们逐渐关注运用基因工程药物治疗恶性肿瘤的方法。 传统 的肿瘤化疗方法大多为细胞毒性药物， 在杀死肿瘤细胞的同时也对正常细胞造成 损害， 削弱人的体质。所以很多癌症晚期患者最后多因为无法承受治疗而致死亡。 恶性肿瘤有一个共同的特性， 那就是局部的细胞疯狂地、 不受遏制地增殖， 而维 持这种增殖就意味着需要大量营养供应。 在肿瘤形成的同时， 瘤体的内部及周围 会形成大量供应养分的血管。 那么如果能切断这些供养 "管道" ， 阻断肿瘤的营 养来源， 肿瘤也就会衰竭而死。
当前兴起的新生血管抑制疗法为彻底治疗肿瘤带来了曙光。 抗血管生成疗法 主要是通过抑制快速异常增殖的血管内皮细胞的生长， 特异性抑制肿瘤血管内皮 细胞增殖生长， 从而达到阻止肿瘤血管生成， 使肿瘤毛细血管发生萎缩， 切断肿 瘤的营养供应， 使肿瘤细胞凋亡， 退化到最初的休眠状态， 从而达到治疗癌症的 目的。
近十年来已发现了多种有希望成为肿瘤治疗药物的新生血管抑制剂， 其中最 具代表性的是人体内皮抑素 （humanendostatin) 。 有关内皮抑素 （Endostatin) 国 际上首先报道是 1997年 1月 Cell杂志上刊登了美国哈佛医学院福尔克曼
( Folkman) 研究小组的鼠内皮抑素基因的论文， 发现两种药物 （ Angiostatin、 Endostatin) 可以消除老鼠体内恶性肿瘤， 而且未再复发。 这两种药物是以阻止为 肿瘤提供营养的血管生长的方式治疗肿瘤的。 当时引起了国际轰动， Endostatin 迅速成为肿瘤治疗领域的研究热点。美国 FDA在没有完成临床前研究的情况下特 批 30例对其它药物已无反应的晚期癌症病人于 99年初用人血管抑素 ( Angiostatin) 和鼠内皮抑素 （Endostatin) 混合基因工程针剂进行临床试验。 美 国临床肿瘤学会专家认为该药的出现是很有希望的迹象。 目前， Endostatin已经通 过了 FDA的一期临床， 目前正处于二期临床阶段。 但由于 Endostatin的溶解性较 差， 使得它的制备成本升高， 同时在使用上也只能采用水针剂型， 这使它的应用 受到了很大的限制。
p43蛋白是哺乳类动物 tRNA合成酶的辅助因子， 一方面直接调节内皮细胞 形成毛细血管的生理过程， 另一方面通过改变微环境来抑制肿瘤血管的生成。 p43 蛋白的抗血管生成活性及抑制肿瘤生长作用已经在体外及动物实验获得证实。 人 基因重组 p43蛋白显示出其被开发成新型治疗癌症药物的潜力， 对抗多种原发性 和转移性实体肿瘤均有效， 并可与化疗和放疗协同治疗。
p43 蛋白作为人体氨酰 tRNA合成酶系的家族成员并且是内皮单核细胞激活 肽的前体于 1997年被 SophieQ等人发现。 p43蛋白为单链蛋白， 全长 312个氨基 酸， 二级结构含有 1 1个 β片层。 韩国 Imagene公司对人 ρ43蛋白的结构、 生物活 性进行了深入的研究， 结果显示人 ρ43蛋白可以抑制快速异常增殖的血管内皮细 胞的生长， 以及抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成， 这说明 ρ43蛋白具有潜在的抗肿 瘤作用。
为了将 ρ43蛋白作为一种药物进行开发， 必须用基因工程的方法将其大量表 达并进行纯化， 从而获得一定量的高纯度蛋白。 目前已经使用常规分子生物学技 术将该蛋白克隆到原核表达载体中， 并在大肠杆菌中实现高表达， 但是其纯化工 艺一直存在问题， 主要是因为 ρ43蛋白和核酸结合后很难分离， 从而导致蛋白的 纯化收率急剧减少。
Ρ43蛋白是一种极易与核酸结合的蛋白,在一般条件及基因工程菌的匀浆破 碎液中，大量 Ρ43蛋白与细胞破碎后放出的核酸结合,造成了 ρ43蛋白所带电荷的强 烈不均一,分子量不均一,,给蛋白的纯化带来了极大的困难,使蛋白的纯化收率急剧 减少。
因此， 目前急需一种从含有 ρ43蛋白基因的基因工程大肠杆菌有效纯化 ρ43 蛋白且具有高收率的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从含有 ρ43蛋白基因的基因工程大肠杆菌有效纯 化 p43蛋白且具有高收率的方法。
本发明提供了一种从含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌制得重组人 p43 蛋白的方法， 所述方法包括以下步骤：
( 1 ) 用缓冲溶液悬浮含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌， 得混悬液； (2 ) 将步骤 （1 ) 所得混悬液进行破碎， 同时离心得上清液；
( 3 ) 用硫酸铵溶液对步骤 （2) 所得上清液进行盐析沉淀， 所得沉淀再用缓 冲溶液溶解，得溶液；或者，对步骤（2)所得上清液经 DEAESephoaroseTMFastFlow 柱处理后， 收集穿过峰溶液；
(4 ) 将步骤 （3 ) 所得溶液经 SPSephoaroseTMFastFlow柱处理；
( 5 ) 用缓冲溶液洗脱 SPSephoaroseTMFastFlow柱后得到 p43蛋白溶液。 在本发明的一个优选实例中， 所述缓冲溶液选自三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和 磷酸盐溶液中的一种或多种。
在本发明的一个优选实例中， 所述缓冲溶液的 pH为 6.5-9.0。
在本发明的一个优选实例中， 所述缓冲溶液的 pH为 7-8.5。
在本发明的一个优选实例中， 所述缓冲溶液的 pH为 7.0-8.0。
p43蛋白是一种极易与核酸结合的蛋白,在一般条件及基因工程菌的匀浆破 碎液中，大量 p43蛋白与细胞破碎后放出的核酸结合,造成了 p43蛋白所带电荷的强 烈不均一， 分子量不均一， 给蛋白的纯化带来了极大的困难,使蛋白的纯化收率急 剧减少。 本发明通过对纯化工艺的摸索和优化， 有效分离了目的蛋白和核酸， 极 大了提高了纯化效率和得率。
附图简述
图 1描述了电泳检测表达结果。
图 2描述了过 SP柱后的蛋白洗脱峰和穿过峰 SDS-PAGE电泳。
图 3描述了 p43蛋白得率随去核酸方法不同的变化。
具体实施方式
本发明提供了一种从含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌制得重组人 p43 蛋白的方法， 所述方法包括以下步骤：
( 1 ) 用缓冲溶液悬浮含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌， 得混悬液；
(2 ) 将步骤 （1 ) 所得混悬液进行破碎， 同时离心得上清液；
( 3 ) 用硫酸铵溶液对步骤 （2) 所得上清液进行盐析沉淀， 所得沉淀再用缓 冲溶液溶解，得溶液；或者，对步骤（2)所得上清液经 DEAESephoaroseTMFastFlow 柱处理后， 收集穿过峰溶液；
(4 ) 将步骤 （3 ) 所得溶液经 SPSephoaroseTMFastFlow柱处理；
( 5 ) 用缓冲溶液洗脱 SPSephoaroseTMFastFlow柱后得到 p43蛋白溶液。 在本领域中， 得到含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌的方法是常规的， 具体可参见《分子克隆》 （第二版） 。 在本发明的一个具体实例中， 所述制备 p43 蛋白基因的基因工程大肠杆菌的方法如下： 根据已知的人 p43蛋白基因 DNA序 列合成了全长基因， 在基因序列的 5'端引入 Ncol酶切位点， 3'端引入 Xhol酶切 位点， 经 NcoI、 Xhol双酶切后插入同样用这两个酶双酶切的 pET28a质粒， 构建 成含有人 p43蛋白基因的质粒 pET28a-43，并通过 DNA测序分析确证了基因序列 的准确无误。 采用大肠杆菌 BL21-DE3作为宿主菌， 将质粒 pET28a-43转化 BL21-DE3并使之表达，通过反复的筛选和表达分析获得了稳定高表达的含有 p43 蛋白基因的基因工程大肠杆菌。
在本发明中， 步骤 （1 ) 所用缓冲溶液是常规的， 本领域的普通技术人员根据 本发明的描述再结合现有技术可以直接得到哪些缓冲溶液可用于本发明中。 在本 发明的一个优选实例中， 所述缓冲溶液选自三羟甲基氨基甲烷盐酸盐和磷酸盐溶 液中的一种或多种。
在本发明中， 所述缓冲溶液的 pH是常规的， 本领域的普通技术人员根据本 发明的描述再结合现有技术可直接得到其具体 pH范围。 在本发明的一个优选实 例中， 所述缓冲溶液的 pH为 6.5-9.0， 较好为 7-8.5， 更好为 7.0-8.0。
在本发明中， 步骤 （2 ) 所述的破碎方法和离心方法是常规的， 本领域的普 通技术人员根据本发明的描述再结合现有技术可以直接得到哪些方法可用于本发 明中。在本发明的一个优选实例中， 所述破碎方法包括在 1000个大气压和一次循 环的条件下通过高压匀浆法破碎菌体。 在本发明的另一个优选实例中， 所述离心 方法包括在 5000— 20000rpm、 较好 12000— 15000rpm的条件下进行。
在上述步骤 （3 ) 中， 所述硫酸铵溶液是常规的， 本领域的普通技术人员在 阅读本发明的描述后再结合现有技术可以直接得到哪些硫酸铵溶液可用于本发明 中。 在本发明的一个优选实例中， 所述硫酸铵溶液是 60重量％的水溶液。
在上述步骤 （5 ) 中， 所用缓冲溶液是常规的， 本领域的普通技术人员根据 本发明的描述再结合现有技术可以直接得到哪些缓冲溶液可用于本发明中。 在本 发明的一个优选实例中， 所述缓冲溶液与步骤 （1 )所用缓冲溶液相同， 或者除了 步骤（1 )所用缓冲溶液的组分外， 所述缓冲溶液还包括其他组分，例如氯化钠等。
在图 1中， 数字 1一 4的含义如下：
1. 标准蛋白分子量 Marker
2. 高表达菌株
3. 高表达菌株
4. 诱导前对照。
在图 2中， 数字 1一 7的含义如下：
1. 标准蛋白分子量 Marker;
2. 实施例 2进行蛋白质和核酸分离后的 sp柱洗脱峰
3. 实施例 4进行蛋白质和核酸分离后的 sp柱洗脱峰
4. 实施例 8中用本发明优化的方法进行蛋白质和核酸分离后的 sp柱洗脱峰
5. 实施例 4中进行蛋白质和核酸分离后的 sp柱穿过峰
6. 实施例 2中进行蛋白质和核酸分离后的 sp柱穿过峰
7.实施例 8中用本发明优化的方法进行蛋白质和核酸分离后的 sp柱穿过峰。 下面结合实施例细说明本发明，这些实施例只是用于举例说明的目的，并没有限制 本发明的范围。
实施例
实施例 1含有人 p43蛋白基因工程菌的构建
1： 含有人 p43蛋白基因的表达质粒的构建
设计引物 A: ACACCATGGCAAATAATGATGCTGTTC引物 B:
ACTCGAGTTATTTGATTCCACTGTTGCTC以含有全合成 p43蛋白基因序列的 pUC-18质粒为模板按标准方法进行 PCR扩增： 94°C 1分钟变性， 55°C 40秒退火，
72°C 1.5分钟延伸， 共反应 30个循环， 得到含有 p43蛋白基因的片段， 其 5'端和 3'端分别带有 NcoI、 Xhol酶切位点。 将抽提纯化的 pET28a质粒用 NcoI、 Xhol
(takara公司） 双酶切， 反应体系 20 μ 1,具体如下：
pET28al5 μ 1
NcoI0.5 μ 1
XhoI0.5 μ 1
10 X bufferK2 u 1 BSA (牛血清白蛋白） 2μ 1 反应温度为 37°C， 时间 1.5小时。 基因片段用同样方法双酶切， 反应体系 20μ1,具体如下
PCR产物 10 μ 1
NcoI0.5 μ 1
XhoI0.5 μ 1
10XbufferK2u 1
BSA2 μ 1
dd¾O5 μ 1
反应温度为 37°C， 时间 1.5小时。
将酶切纯化后的产物进行连接， 反应体系 15 μ ΐ,具体如下：
pET28a/Ncoi+xhoil μ 1
Figure imgf000008_0001
10XbufferH1.5u 1
ligase (连接酶） 0.5 μ ΐ
dd¾O7 μ 1
反应温度为 16°C， 时间 24小时。 上述实验操作所用试剂均购自大连宝生物 公司。
将连接产物转化大肠杆菌 TOP10 (购自上海普飞生物技术有限公司） ， 以上 述 PCR和双酶切方法鉴定， 挑选得到阳性克隆， 培养后抽提质粒得到含有人 p43 蛋白基因的表达载体 pET28a-43。
2： 工程菌的构建
大肠杆菌 BL21 (DE3) (购自上海普飞生物技术有限公司） 本实验室保存， 从新鲜培养的 LB平板上挑取单菌落转到一个 2ml的 LB中， 37°C摇床过夜， 1% 的接种量接种于 50mlLB培养基中， 同样条件下培养至 OD600=0.4， 冰浴 10min， 4°C3000rpm离心 10min， 收集菌体以 10ml预冷的 0.1M的氯化钙重悬冰上放置 30min， 4°C3000rpm离心 lOmin回收细胞， 用 2ml预冷的 0.1M的氯化钙重悬制 备成感受态细胞。 将表达质粒 pET28a-43约 0.5~2 g加入 200μ1感受态细胞中， 冰浴 30min， 42°C热休克 90s， 加入 1.5mlLB培养基 37°C温浴 lhr， 涂布于含 30 g/ml卡那霉素的 LB平板上， 于 37°C孵箱培养过夜。 挑选长出的克隆接种于 2mlLB培养基中 37°C培养过夜。 以 1 : 50接种于 3mlLB中， 37°C培养至
OD600=0.4~0.6,加入 IPTG (异丙基 -b-D-硫代半乳糖苷）至终浓度 0.4~0.8mmol.诱导 表达 6小时， 每 2小时取样跑 SDS-PAGE电泳， 考马斯亮蓝染色并扫描分析重组 蛋白含量。 筛选得到高表达克隆 （见图一）
4:菌泥的获取： 发酵培养基采用常规的 M9培养基， 接种量约为 2%-5%， 在
30°C， pH=7.0的起始条件下培养， 培养过程中， 温度控制在 30°C ,通过提高转速 控制 DO在 25%以上， 用 4M的 NaOH调节发酵液维持 pH在 7.0左右。 在发酵中 后期间歇补加葡萄糖， 并开始一同补加 Y.E， 当 OD=14〜15时， 加入 IPTG(异丙 基 -b-D-硫代半乳糖苷)诱导表达， IPTG终浓度为 lmmol/L,诱导 4hr， 测定 OD600, 当 OD600达到 40左右， 放罐， （培养条件） 菌液用管式离心机 （上海离心机械 研究所） 于 lOOOOrpm的条件下离心， 得到菌泥， 菌泥于 -70°C低温冷冻保存。
实施例 2
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎。 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀。 以此溶液为上样溶液， 过 SPSephoaroseTMFastFlow ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗 两个床体积。 再用 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM溶液拉梯度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果发现 p43 蛋白在 SP的穿过峰以及洗脱峰中都普遍存在， 穿过峰与洗脱峰中的比例为 1 : 1， p43蛋白分布范围极广， 无法得到有效的集中， 给分离纯化带来了极大的困难。
实施例 3
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀。 以此溶液为上样溶液， 过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三羟甲基氨基甲 烷盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床体积。 再用 B. 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM溶液拉 梯度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸 收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果发现 p43蛋白在 SP的穿过峰以及洗 脱峰中都普遍存在， 穿过峰与洗脱峰中的比例为 2: 1， p43蛋白分布范围极广， 无法得到有效的集中， 给分离纯化带来了极大的困难。
实施例 4
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀。 以此溶液为上样溶液， 过 DEAESephoaroseTMFastFlow ( GE.corp. ) 柱， 所用的平 衡溶液与冲洗溶液分别为 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA和 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇，
5mMEDTA,NaCllM, 收集穿过峰溶液， 以 DEAEff柱上收集到的穿过峰溶液为上 样溶液稀释一倍过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸 盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床体积。 再用 B溶液拉 梯度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸 收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果发现在 SP的穿过峰中仍然存在一定 的 p43蛋白， 在洗脱峰中的 p43蛋白比例约为 50%左右。
实施例 5
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎， 将破碎液在 12000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀。 将得到的上清溶液， 用 60%的硫酸铵进行盐析沉淀， 得到的沉淀用 50mM的三羟 甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液溶解， 并脱 盐， 上 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床体积。再用 B.三羟甲基氨基甲烷盐 酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM溶液拉梯度， 用约 10个床 体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果发现在 SP的穿过峰中仍然存在一定的 p43蛋白， 洗脱峰 中的 p43蛋白比例约为 68%左右。
实施例 6
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=7.8， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀后， 将得到的上清溶液在 4°C下调节其 pH大于 7.2， 以此溶液为上样溶液， 过 DEAE ( GE.corp. ) 柱， 所用的平衡溶液与冲洗溶液分别为 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.6， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA和 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.6， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM， 收集穿过峰溶液， 以 DEAEff柱上收集 到的穿过峰溶液为上样溶液稀释一倍过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三 羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.6， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床 体积。 再用 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.6， 2mM的巯基乙醇，
5mMEDTA,NaCllM溶液拉梯度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果可以发现 在 SP的传过峰中没有一点 p43蛋白， p43蛋白全部集中在洗脱峰中。 说明 p43蛋 白的带电性质均一， 受到带负电荷的核酸影响减少， p43蛋白在离子柱上能够有 效地按带电性质进行集中。
实施例 7
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=7.8， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀后， 将得到的上清溶液在 4°C下调节其 pH大于 6.8， 以此溶液为上样溶液， 过 DEAE ( GE.corp. ) 柱， 所用的平衡溶液与冲洗溶液分别为 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA和 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM， 收集穿过峰溶液， 以 DEAEff柱上收集 到的穿过峰溶液为上样溶液稀释一倍过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三 羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床 体积。 再用 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.0， 2mM的巯基乙醇，
5mMEDTA,NaCllM溶液拉梯度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果可以发现 在 SP的传过峰中有少量 p43蛋白， 大部分在洗脱峰中， 比例为 65%
实施例 8
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 50mM的三羟甲基氨基甲烷 盐酸盐 pH=8.0， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀后， 将得到的上清溶液在 4°C下调节其 pH大于 7.2， 以此溶液为上样溶液， 过 DEAE ( GE.corp. ) 柱， 所用的平衡溶液与冲洗溶液分别为 A.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA和 B.三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM， 收集穿过峰溶液， 以 DEAEff柱上收集 到的穿过峰溶液为上样溶液稀释一倍过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.三 羟甲基氨基甲烷盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床 体积。 再用 B溶液拉梯度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果可以发现在 SP 的传过峰中没有一点 p43蛋白， p43蛋白全部集中在洗脱峰中。 说明 p43蛋白的 带电性质均一， 受到带负电荷的核酸影响减少， p43蛋白在离子柱上能够有效地 按带电性质进行集中。
实施例 9
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 20mM的磷酸盐溶液 pH=7.8， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀 浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀后， 将得到 的上清溶液在 4°C下调节其 pH大于 7.2，以此溶液为上样溶液，过 DEAE( GE.corp. ) 柱， 所用的平衡溶液与冲洗溶液分别为 A.20mM的磷酸盐溶液 pH=7.4， 2mM的 巯基乙醇， 5mMEDTA和 B.20mM的磷酸盐溶液 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇，
5mMEDTA,NaCllM, 收集穿过峰溶液， 以 DEAEff柱上收集到的穿过峰溶液为上 样溶液稀释一倍过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A.20mM的磷酸盐溶液 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床体积。 再用 B.三羟甲基 氨基甲烷盐酸盐 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM溶液拉梯度， 用 约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收峰， 检 测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果可以发现在 SP的穿过峰中有少量 p43蛋白， 大部分在洗脱峰中， 比例为 85%左右。
实施例 10
取实施例 1所得 p43蛋白表达大肠杆菌的菌泥与 lOOmM的磷酸盐溶液 pH=7.8， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA的溶液以 1 : 10的比例溶解后， 在高压匀 浆下破碎， 将破碎液在 15000rpm、 4°C条件下离心， 去除离心的沉淀后， 将得到 的上清溶液在 4°C下调节其 pH大于 7.2，以此溶液为上样溶液，过 DEAE( GE.corp. ) 柱， 所用的平衡溶液与冲洗溶液分别为 A. lOOmM的磷酸盐溶液 pH=7.4， 2mM的 巯基乙醇， 5mMEDTA和 B. lOOmM的磷酸盐溶液 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA,NaCllM, 收集穿过峰溶液， 以 DEAEff柱上收集到的穿过峰溶液为上 样溶液稀释一倍过 SP ( GE.corp. ) 柱子， 当挂柱后， 用 A. lOOmM的磷酸盐溶液 pH=7.4， 2mM的巯基乙醇， 5mMEDTA溶液冲洗两个床体积。 再用 B溶液拉梯 度， 用约 10个床体积将挂柱的 p43蛋白冲洗下来， 收集 p43蛋白所在的蛋白吸收 峰， 检测波长为 280nm。 蛋白电泳的结果可以发现在 SP的穿过峰中没有 p43蛋 白， 都在洗脱峰中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。

Claims

权利要求
1. 种从含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌制得重组人 p43蛋白的方法， 所述方法包括以下步骤：
( 1 ) 用缓冲溶液悬浮含有 p43蛋白基因的基因工程大肠杆菌， 得混悬液；
(2 ) 将步骤 （1 ) 所得混悬液进行破碎， 同时离心得上清液；
( 3 ) 用硫酸铵溶液对步骤 （2) 所得上清液进行盐析沉淀， 所得沉淀再用缓 冲溶液溶解，得溶液；或者，对步骤（2)所得上清液经 DEAESephoaroseTMFastFlow 柱处理后， 收集穿过峰溶液；
(4 ) 将步骤 （3 ) 所得溶液经 SPSephoaroseTMFastFlow柱处理；
( 5 ) 用缓冲溶液洗脱 SPSephoaroseTMFastFlow柱后得到 p43蛋白溶液。
2. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于所述缓冲溶液选自三羟甲基氨基 甲烷盐酸盐和磷酸盐溶液中的一种或多种。
3. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于所述缓冲溶液的 pH为 6.5-9.0。
4. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于所述缓冲溶液的 pH为 7-8.5。
5. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于所述缓冲溶液的 pH为 7.0-8.0。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101824083B (zh) * 2009-03-06 2014-01-15 信谊药厂 C端缺失型p43蛋白及其在肿瘤治疗药物中的应用
CN102109527B (zh) * 2009-12-28 2015-04-22 上海信谊药厂有限公司 一种重组人p43蛋白生物学活性的检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001095927A1 (en) * 2000-06-14 2001-12-20 Imagene Co., Ltd. P43 anti-tumor therapeutic agent and three dimensional structure of its cytokine domain
CN1341727A (zh) * 2000-09-07 2002-03-27 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——甲硫氨酰tRNA合成酶35.09和编码这种多肽的多核苷酸
US6734168B2 (en) * 1993-09-29 2004-05-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Endothelial monocyte activating polypeptide II: a mediator which activates host response

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6734168B2 (en) * 1993-09-29 2004-05-11 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Endothelial monocyte activating polypeptide II: a mediator which activates host response
WO2001095927A1 (en) * 2000-06-14 2001-12-20 Imagene Co., Ltd. P43 anti-tumor therapeutic agent and three dimensional structure of its cytokine domain
CN1341727A (zh) * 2000-09-07 2002-03-27 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——甲硫氨酰tRNA合成酶35.09和编码这种多肽的多核苷酸

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CELL, January 1997 (1997-01-01)
QUEVILLON S. ET AL.: "The p43 component of the mammalian multi-synthetase complex is likely to be the precursor of the endothelial monocyte-activating polypeptide II cytokine", J. BIOL. CHEM., vol. 272, no. 51, 19 December 1997 (1997-12-19), pages 32573 - 32579, XP008116659 *
See also references of EP2128172A4
WEI J. ET AL.: "Role of Hydrophobic Interaction Chromatography in Purification of rProEMAP II/P43 Protein Expressed in E. coli", CHINESE JOURNAL BIOLOGICALS, vol. 19, no. 1, January 2006 (2006-01-01), pages 73 - 76, XP008136064 *

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