WO2008068827A1

WO2008068827A1 - 腎臓特異性を有する新規な有機イオントランスポーター

Info

Publication number: WO2008068827A1
Application number: PCT/JP2006/324117
Authority: WO
Inventors: Hitoshi Endou; Yoshikatsu Kanai
Original assignee: J-Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2006-12-01
Filing date: 2006-12-01
Publication date: 2008-06-12
Also published as: JPWO2008068827A1

Abstract

　ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジンＦ２α若しくはケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示す、ケトアシドーシス治療のための薬剤を開発するためのリサーチツールとして有用なヒトＳＬＣ２２ファミリー又はマウスｓｌｃ２２ファミリーの新規な有機アニオントランスポーター。

Description

明細書

腎臓特異性を有する新規な有機イオントランスポーター

技術分野

[0001] 本発明は、腎臓におけるケトン体及びその類似物質の輸送に関する新規な有機ィオントランスポーター (膜輸送体)タンパク質、該タンパク質をコードする DNA、該タンノク質の活性を促進又は阻害する化合物のスクリーニング方法及びキット、該スタリ一ユング方法で得られるケトアシドーシス治療 ·改善剤などを提供する。

背景技術

[0002] ケトアシドーシスは、糖尿病患者にぉヽて、ブドウ糖の利用を促進するホルモンであるインシュリンの絶対的欠乏がもたらす病態である。 1型 DM患者の発症時や IDD M患者力インスリン注射を中断したときに生じ易い。インスリンが絶対的な不足状態に陥ると、肝臓や筋肉といった組織が血液中のブドウ糖を取り込めなくなるため、細胞内の脂肪等を強制的に代謝させるが、この際の代謝過程で、 βーヒドロキシ酪酸を主とするケトン体が生成する。この酸性物質であるケトン体力アシドーシス (血液が酸性に傾いた状態）をもたらす。ここで、ヒトの体液は ρΗ7. 4であり、 ρΗ7. 0以下になると生命に危険が及ぶが、当該ケトン体が増加してケトアシドーシスが進行すると、体液が ρΗ7. 0以下になって死亡するケースもある。尚、このケトアシドーシスは、糖尿病のみならず薬剤の副作用に基づヽても生じ得る。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0003] ここで、ケトアシドーシスの治療は輸液がメインである。また、動脈血 ρΗが 7. 0を下回る高度のアシドーシスでは、重炭酸塩を投与する。し力しながら、輸液を用いる治療は患者にとっては面倒であるし、重炭酸塩を用いた場合には、深刻なケースでは塩水過剰になって、二酸ィ匕炭素レベルの急激な上昇により、電解質アンバランス、意識の鈍化、昏睡又は死に至ることがある。これを踏まえ、新たな治療手段として、特許文献 1では、 β ラタトン系アルキレンカルボン酸を有効成分とする糖尿病性ケトァシドーシス治療剤が提案されてヽる。 [0004] 本発明は、 j8—ラタトン系アルキレンカルボン酸よりも優れた、ケトアシドーシス治療のための薬剤を開発するためのリサーチツールを提供することを主目的とし、当該リサーチツールを用いての具体的薬剤を提供することを副次的目的とする。

特許文献 1 :特開平 2— 104523号公報

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者は、前記課題を解決するに際し、 SLC22有機イオントランスポーターファミリ一（以下、「SLC22ファミリー」という）にまず着目した。ここで、 SLC22ファミリ一は、多くの腎尿細管薬物トランスポーターを包含し、有機ァ-オントランスポーター (OA T)、有機カチオントランスポーター（OCT)及び有機カチオン,カル-チントランスポ一ター（OCTN)の三つのサブファミリーが存在することが知られて!/、る。

[0006] このような状況下、本発明者は、 OATにつ、て研究を進めて、たところ、従来知られていた各種有機ァ-オントランスポーターとは異なる性質を有する新たな有機ァ- オントランスポーター（OATの新たなサブファミリー）が存在することを見出し、本発明を完成させたものである。

[0007] 具体的には、本発明に係るヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22ファミリーの有機ァニオントランスポーターは、配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジン F α若しく

2 はケトン体又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示すタンパク質である。また、本発明に係るヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22ファミリーの有機ァニオントランスポーターをコードする DNAは、配列番号 3又は配列番号 4で表される塩基配列である。

[0008] ここで、当該新規 O ATは、他のグループとは相同性の低、ことをゲノムデータべ一スの検索結果からまず確認した。

[0009] 次に、当該新規 O ATについて、 RI標識化合物の取り込み測定での機能解析とともに、生体内での機能を明らかにする目的で遺伝子ノックアウトマウスを作製し、さらにァロキサン投与により糖尿病マウスを作成しその尿中ケトン体濃度の検討による生理機能の検討を行ったところ、 SLC22に属する既知の、有機カチオントランスポーター (OCT)、有機ァ-オントランスポーター（OAT)、両'性イオントランスポーター (OCT N)の輸送基質とは異なる選択性を示すことを確認した。

[0010] 更に、 in vitro発現系での機能解析のために、新規 OATのマウス cDNAをマウス近位尿細管由来株 S細胞に導入して安定発現細胞を榭立した。これを用いて、様

2

々な有機ァ-オン、有機カチオンの放射能標識ィ匕合物の取り込み実験を行ったところ、ニコチン酸、プロスタグランジン F α、サリチル酸などの有機ァ-オンに対して顕

2

著な輸送活性を示した。一方、 ΟΑΤファミリーの代表的な輸送基質である有機ァ- オン (パラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、 _CAMP、ジカルボン酸）、 OCTファミリーの代表的な輸送基質である有機カチオン (テトラェチルアンモ-ゥム、コリン）、 OCTN ファミリーの代表的な輸送基質である両極性有機イオン (カル-チン)の有意な輸送は示さなかった。以上のように既知の SLC22ファミリーのトランスポーターとは異なる基質選択性を示し、構造上も新たなサブファミリーに属することから、この遺伝子産物 novel type organic anion transporter 1 (OATN1)と名付けに。

[0011] 更に、ノーザンブロットにおいて OATN1は腎特異的な発現を示し、 in situハイブリダイゼーシヨンでは近位尿細管への発現が明ら力となった。さらにマウス腎臓を用いた免疫組織ィ匕学的検討により、 OATN1が近位尿細管管腔側膜に限局して存在することが示された。

[0012] OATN1は、腎近位尿細管の管腔側膜に存在し、腎近位尿細管での β -ヒドロキシ酪酸をはじめとするケトン体の再吸収を担当するトランスポーターである。 OATN1の抑制薬は、腎近位尿細管力ものケトン体の再吸収を抑制し、ケトン体排泄薬としての機能を発揮すると想定される。そこで、 S細胞にマウス OATN1を発現させた安定発

2

現細胞において、 OATN1の基質であるニコチン酸の取り込みに対する各種ィ匕合物の抑制効果を検討し、 OATN1の阻害剤を探索した。その結果、 2, 4 ジクロロフエ -ルォキシ酢酸、 3—フエ-ルプロピオン酸、 4 フエ-ルブタン酸又はこれらに類似する物質を含有する化合物が、大きな抑制効果を示した。

[0013] これらのトランスポーター活性阻害剤は、 OATN1のインヒビターとして生体内で作用し、ケトンの排泄を促進することができる。すなわち、ケトン体が過剰になり体内の ρ Ηの低下が原因となるケトアシドーシスの治療又は改善のための医薬として用いることができる。糖尿病、飢餓状態又は薬剤の副作用によって起因するケトアシドーシス向けの医薬としても応用できる。

発明を実施するための最良の形態

[0014] 本発明（1)は、配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したァミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジン F α若しくはケトン体

2

又はその類似物を輸送する能力を有する、ヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22ファミリ一の有機ァ-オントランスポーターである。ここで、「タンパク質のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加」は、選択物質の輸送活性が失われない程度であればよぐ通常 1 〜約 110個、好ましくは 1〜約 55個である。このようなタンパク質は、配列番号 1又は 2で示されたアミノ酸配列と通常、 1〜80%、好ましくは 1〜90%のアミノ酸配列の相同性を有する。また、「ケトン体」とは、 β—ヒドロキシ酪酸、ァセト酢酸及びアセトンを意味する総称である（主に j8—ヒドロキシ酪酸)。更に、「類似物」とは、本明細書の実施例 7に従い試験を行った結果、有意に輸送が確認された物質を指す。また、「有機ァ-オントランスポーター」及び「OAT」とは、従来の狭義の OATを意味するのではなぐ有機ァ-オンのトランスポーターであることを意味する広義の OATである。

[0015] 本発明（2)は、配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したァミノ酸配列を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22 ファミリーの有機ァニオントランスポーターである。

[0016] 本発明（3)は、配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したァミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジン F α若しくはケトン体

2

又はその類似物を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒト SLC22フアミリー又はマウス slc22ファミリーの有機ァ-オントランスポーターである。

[0017] 本発明 (4)は、前記トランスポーターが、腎臓皮質及び腎臓髄質外層に発現を示す、前記発明（1)〜（3)の、ずれか一つのトランスポーターである。

[0018] 本発明（5)は、前記トランスポーターが、近位尿細管細胞の管腔側膜に特異的に発現を示す、前記発明（1)〜 (4)のいずれか一つのトランスポーターである。

[0019] 本発明（6)は、パラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、 _CAMP、ジカルボン酸、テトラエチルアンモ-ゥム、コリン又はカル-チンの輸送を示さない、前記発明（1)〜（5)のいずれか一つのトランスポーターである。ここで、「輸送を示さない」とは、本明細書の実施例 7に従、輸送活性を測定した場合、 Mockとの差が 2倍未満であることを指す。

[0020] 本発明（7)は、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターをコードするヒト又はマウス DNA、或!、は当該 DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズしかつ当該トランスポーターと同じ能力及び Z又は発現部位を示すトランスポーターをコードするヒト又はマウス DNAである。ここで、「ストリンジェントな条件でハイブリダィズ」とは、通常、ハイブリダィゼーシヨンを、 5xSSC又はこれと同等の塩濃度のハイブリダィゼーシヨン溶液中、 37〜42°Cの温度条件下、約 12時間行い、 5xSSC又はこれと同等の塩濃度の溶液などで必要に応じて予備洗浄を行った後、 lxSSC又はこれと同等の塩濃度の溶液中で洗浄を行うことにより実施できる。

[0021] 本発明（8)は、配列番号 3又は配列番号 4で表される塩基配列力もなる、前記発明

(7)の DNAである。

[0022] 本発明（9)は、前記発明（7)又は（8)の DNAが組み込まれた安定発現細胞、或、は前記発明（7)又は（8)の DNA若しくは当該 DNAと相補的な cRNAが導入された一過性発現細胞である。

[0023] 本発明（10)は、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。ここで、当該抗体は、医薬 (抗体医薬)やアツセィ (検出用抗体)等として使用され得る。

[0024] 本発明（11)は、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターを用いるェ程を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法である。ここで、「トランスポーターを用いる」は、当該トランスポーターを細胞に発現させて活性促進 Z阻害物質をスクリーニングする等の直接的使用のみならず、当該トランスポーターの立体構造解析に基づき活性促進 Z阻害物質をスクリーニングする（インシリコ解析)等の間接的使用をも包含する。

[0025] 本発明（12)は、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーター又は前記発明（9)の細胞を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリー-ング用キットである。尚、キットの他の構成パーツは、特に限定されないが、例えば、培地、取り込み標準物質 (RI標識物質)、取り込み実験用各種塩類緩衝液、可溶化剤、シンチレ一ター、 24穴プレート、バイアル瓶を挙げることができる。

[0026] 本発明（13)は、 4 フエ-ルブチル酸、 2, 4 ジクロ口フエ-ルォキシ酢酸、 3 フニルプロピオン酸又はこれらに類似する物質を含有する、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターの活性阻害剤である。ここで、「類似する物質」とは、少なくとも、スルフィンピラゾン、フエ-ルブタゾン、ベンズブロマゾン、バルプロ酸、ブタン酸、吉草酸、へキサン酸、ヘプタン酸、力プリル酸、ノナン酸、デカン酸などの同様の作用を奏する化合物を含むものとする。

[0027] 本発明（14)は、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターの抗体医薬品又はァプタマ一である、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターの活性阻害剤である。

[0028] 本発明（15)は、ケトン体排泄促進のための、前記発明（13)又は（14)の活性阻害剤である。

[0029] 本発明（16)は、ケトアシドーシス治療又は改善のための、前記発明（13)〜（15) の!、ずれか一つの活性阻害剤である。

[0030] 本発明（17)は、糖尿病又は薬剤の副作用に起因したケトアシドーシスである、前記発明（16)の活性阻害剤である。

[0031] 本発明（18)は、尿中の、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーター又は前記発明（7)若しくは (8)の DNAを分析する工程を含む、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターに関連した疾患の有無及び Z又は重篤度を判断する診断方法である。

[0032] 本発明（19)は、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーターに関連した疾患の有無及び Z又は重篤度を判断する診断キットである。

[0033] 本発明（20)は、体液中の、前記発明（1)〜（6)のいずれか一つのトランスポーター又は前記発明（7)若しくは (8)の DNAを分析する工程を含む、前記発明（1)〜（6) のいずれか一つのトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断方法である。

[0034] 本発明（21)は、全ェクソンの情報を知り得るプライマーを含む、前記発明（1)〜（6 )のいずれか一つのトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断キットである。実施例

[0035] 以下、実施例をもって本説明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。なお、下記実施例において、各操作は特に断りがない限り、「MolecularCloning : Sambrook, J. , Fritsh, E. F.及び Maniatis, T. 著、 Cold Spring HarborLaboratory Pressより 1989年に発刊」に記載の方法により行うか、又は、市販のキットを用いる場合には市販品の取扱説明書に従って使用した。

[0036] 実施例 1 (OATN1の分子クローユングと解析）

ヒト OAT1の翻訳領域の塩基配列を用いた NCBIのゲノムデータベース解析により、有機イオントランスポーターファミリー（SLC22)に属する新しいァイソフォーム（OA TNI)を見出した（マウス OATN1 accession No. ： NM— 133980. 1、ヒト OAT Nl accession No. ： NM— 004256. l[GenBankTM/EBl/DDBJ])。このデータベースの配列を参考に、 PCRのためのプライマーをデザインし、マウス及びヒトの腎臓力抽出した mRNAに対して RT— PCRを行った。ここで、プライマーの配列は以下の通りである。

マウス

Fw: CGG GAT CCC TCA GGA GTG AGA AGC AGA C

RV: GCT CTA GAG GGT ACT GTC CCT GAT ACT C

ヒ卜

FW: CGG GAT CCG GAG GTA GTG ACT GGC ATA C

RV: GCT CTA GAA GCC ATG GGC CAG ATT GTG G

RT— PCR→cDNAの増幅により、目的とする cDNAを mRNAを templateとして取得し（OATN1の分子クロー-ング）、それをプラスミドベクターに取り込み、後の解祈が可能な形とした。プラスミドベクター（pcDNA3. 1)に組み込んだ OATNlcDN Aは、安定発現細胞の作製、 DNAシーケンシングによる配列決定、 in situノヽイブリダイゼーシヨンやノーザンブロット用のプローブ作製に使用される。

尚、上記において、 pcDNA3. 1のマルチクロー-ングサイトである BamHI及び Xb alサイトに PCR産物を導入した。また、 template塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネータ一サイクルシークェンス法（Applied Biosystems社）により、 cDNAの全長の塩基配列を決定した（図 1及び図 2)。また、 cDNAの塩基配列を常法により解析して、 cDNAの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のァミノ酸配列を決定した（図 3及び図 4)。

[0037] 実施例 2{マウスの種々の組織における OATN1遺伝子の発現（ノーザンブロッテイングによる解析）}

マウス OATN1の遺伝子の第 1691— 1951番目の塩基に相当する cDNA断片を³ ²P— dCTPでラベルし、これをプローブとして用いて、マウスの種々の組織力抽出した Total RNAを電気泳動 'ブロッテイングしたナイロンメンブレンに対して、ノーザンハイブリダィゼーシヨンを以下のようにして行った。メンブレンを 58度で³² P— dCTP でラベルした OATNlcDNA断片を含んだハイブリダィゼーシヨン液（Perfect Hyb ri, Takara)でー晚ハイブリダィゼーシヨンを行った。メンブレンを、 65度にて、 0. 1 %SDSを含む 0. lxSSCで洗浄した。これをイメージングプレートにラジオオートダラフィ一し、 BAS2000 (Fuji Film)にて検出した（図 5)。その結果、当該 OATN1遺伝子が腎臓特異的な発現を示すことが確認された。

[0038] 実施例 3 {腎臓組織における OATN1遺伝子発現 (In situハイブリダィゼーシヨンによる解析） }

マウスの腎臓を 4%パラホルムアルデヒドで灌流することにより固定した後、これを細切し、 4% パラホルムアルデヒドでさらに固定した。得られたマウス腎臓を 5 μ mの厚さに薄切し、得られた切片を、 in situハイブリダィゼーシヨンに用いた。全長の OAT Nl cDNAから、 T7若しくは T3RNAポリメラーゼを用いてセンス cRNAとアンチセンス cRNAを合成し、プローブとして用いた。切片をハイブリダィゼーシヨン液でー晚プローブでハイブリダィゼーシヨンを行い、 0. 1 X SSCで 30分、 37°Cにて洗浄した。発色は酵素法にて行った。その結果、マウス腎臓では、 OATN1 mRNAは、腎臓の皮質と髄質外層外帯に発現が認められた (図 6)。

[0039] 実施例 4 (マウス OATN1及びヒト OATN1の N末抗体の作製）

マウス OATN1の細胞内 N末端領域のマウス：第 5— 16番目（AQVMAEVGDF GR)、ヒト：第 2— 16番目（AQFVQVLAEIGDFGR)のアミノ酸をペプチド合成し、 KLH (Keyhole limpet hemocyanin)にコンジュゲートさせ、アジュバンドと混和後、ゥサギに免疫した。最初に免疫して力一月後に 2度目、さらに二週間後に 3度目の免疫を行い、血清を採取し、これを OATN1抗血清とした。抗血清を、抗原を用 Vヽたァフィ-ティーカラムにて精製を行、、ァフィユティー抗体を得た。

[0040] 実施例 5 (抗 OATN1抗体を用いた腎臓における免疫組織染色）

C57BLブラックマウスに phosphate buffered saline (PBS : 20mMリン酸、 14 OmM 塩化ナトリウム、 pH 7. 4)を還流し、続いて 4%パラホルムアルデヒド溶液を還流し、その後、腎臓を摘出した。 4%パラホルムアルデヒド溶液に摘出した腎臓を浸し、 2時間固定した。 OCT compoundを用いて包埋し、凍結切片を作製した（5 μ m)。マウス OATN1の N末を抗原として得られた抗体 (実施例 4で製造したマウス OATN1)を 500倍に希釈し、腎臓切片と反応させ、続いてパーォキシダーゼが結合した二次抗体 (Envison/HRP, DAKO)を反応させ、 DAB (diaminobenzidine )発色を行った。結果、マウス腎臓では、 OATN1は、腎臓の近位尿細管の管腔側膜に局在して、ることが確認された（図 7)。

[0041] 実施例 6 (S — OATN1安定発現細胞の作製）

2

近位尿細管由来の細胞株である S細胞に、 pcDNA3. 1— OATN1をリポフエタト

2

ァミン 2000 (Invitrogen)を用いてトランスフエクシヨンし、 400 mg/mlの genetici nにて約一ヶ月間セレクションをかけて、 OATN1の安定発現細胞を作製した。培養条件は以下の通りである。

培養槽： 33度、 5%CO

2

^ ^Wi ' RITし 80—7 medium containing 5% fetal bovine serum, 10mg/mi transferring ， 0.08 U/ml insulin, lOng/ml recombinant epidermal growth factor, and 400mg/ ml ge neticin.

[0042] 実施例 7 (マウス OATN1の輸送活性の測定） S細胞を 24穴の培養細胞用のプレートに 1 X 5¹⁰細胞 Zwellになるようにまき、 2

2

日間培養後、 Dulbecco ' s modified phosphate-buffered saline (D— PBS： 137mM NaCl, 3mM KC1, 8mM NaHP04， ImM KH PO， ImM CaCl

2 4 2 and 0. 5MgCl； pH7. 4)で細胞を洗浄し、 10分間 D— PBSでプレインキュベー

2

シヨンした。各々の RI標識ィ匕合物を含んだ取り込み溶液中にてインキュベートし、アツプテイク後速やかに 4度に冷やした D— PBSにて洗浄、取り込みを止めた。 0. 1Mの水酸ィ匕ナトリウムにて細胞を懸濁し、液体シンチレーシヨンカウンター（LSC— 3100 ;

Aloka)にて測定を行った。この結果、図 8及び図 9に示すように、 OATN1を発現させた S —OATN1安定発現細胞は、ケトン体の主成分である j8—ヒドロキシ酪酸 ^

2

⁴C標識)、ニコチン酸 (³H標識)、プロスタグランジン F a (³H標識)、サリチル酸 (¹⁴C

2

標識)の当該細胞への取り込みを示すことが判明した。一方、有機ァ-オントランスポ一ターの取り込み基質であるパラアミノ馬尿酸 (¹⁴c標識)、エストロン硫酸 (¹⁴c標識）

、 aーケトグルタル酸 ("C標識)、尿酸 ("C標識)、タウロコール酸 (¹⁴C標識)、オクラトキシン A (³H標識）、有機カチオントランスポーターの取り込み基質であるテトラエチルアンモ -ゥム（¹⁴C標識）、有機両性イオントランスポーターの取り込み基質である力ルチュン（³H標識）の取り込みを示さなかった（図 10)。尚、図 11に、マウス OATN1 の安定発現細胞（S )による 13 -ヒドロキシ酪酸の濃度依存的な取り込みを調べた結

2

果を示す。

[0043] 実施例 8 (OATN1の阻害物質のスクリーニング）

実施例 7と同様の方法に従い、 ³H—ニコチン酸 1 μ Μに非 RI化合物 100 /ζ Μと取り込み溶液中に混ぜることで、輸送阻害実験を実施した。その結果、 2, 4ージクロ口フエ-ルォキシ酢酸、 3—フエ-ルプロピオン酸、 4—フエ-ルブタン酸、ジクロロフエナク、 3から 9の炭素数力もなるアルキル置換基を有するカルボン酸等のァ-オン性物質の添加で、ニコチン酸の取り込み効果の阻害が確認された（図 12〜図 17)。

[0044] 実施例 9 (OATN1ノックアウトマウスの作製）

マウス OATN1遺伝子の第一ェキソン及びそのプロモーター領域と予想される第一ェキソン以前のイントロン部分に、ターゲテイングベクターを用いた相同組換えによりネオマイシン遺伝子を挿入することで、 OATN1遺伝子の発現調節部位及びファーストメチォニンを含む N末端翻訳領域を破壊した。

[0045] 実施例 10 (糖尿病モデルマウスにおける尿中の βーヒドロキシ酪酸濃度の比較）糖尿病を惹起することが知られているァロキサン（100mg/kg)を尾静脈力も投与することで糖尿病マウスを作成した。尿糖の確認は試験紙を用いて行った。糖尿病になつた野生型マウス及び OATN1ノックアウトマウスから、ァロキサン投与後 4日目の尿を採取し、尿中の β—ヒドロキシ酪酸濃度を、試験紙を用いた定性的検討及び生化学的手法を用いた定量的検討にて測定した。その結果を図 18に示す。ここで、図 18 (1)は、尿中ケトン体定性反応試験の結果であり、上が野生型マウス、下が OATN1 ノックアウトマウス、左がァロキサン投与糖尿病群、右が生食投与群を示している。当該図から分かるように、 OATN1ノックアウトマウスのァロキサン投与糖尿病群のみが、発色 (紫色)する結果となった。尚、図中、生食投与群が黒く見えるのは、紫色に発色しているのではなく黄色が濃く写っているためである。次に、図 18 (2)は、尿中 /3 ーヒドロキシ酪酸の定量結果である。当該図から分力るように、野生型マウスでは |8 —ヒドロキシ酪酸は検出されな力つたのに対し、 OATN1ノックアウトマウスでは大量の βーヒドロキシ酪酸が検出された。また、図 19は、ァロキサン投与後における、尿中の全ケトン排泄量の経時変化を示した図である。当該図から分力るように、野生型マウスと比較すると、 OATN1ノックアウトマウスの全ケトン体排泄量は非常に大きい値を示した。尚、本明細書における「全ケトン体」は、ケトン基に反応する化学反応を用いた周知の試験法で測定した。

[0046] 実施例 11 (尿中ケトン体排泄促進確認試験）

OATN1のインヒビターのうち、 4 フエ-ルブチル酸、 2,4 ジクロ口フエ-ルォキシ酢酸、 3—フエ-ルプロピオン酸を腹腔内投与し、尿中ケトン体排泄への影響を検討した。ォス 8週の野生型マウスにァロキサンを 100 mgZkg bw(2%ァロキサン、 0. 05 ml/lOg bw)尾静脈力も投与し、静脈内投与 4日後、 OATN1インヒビター (上記)を腹腔内投与し、投与後 30分、 60分、 90分、 180分に尿を採取し、尿中ケトン体濃度を測定した。各インヒビター投与前 (inhibitor (—））と投与後（inhibitor ( + ；) )の尿中ケトン体濃度を比較した。 4 フエ-ルブチル酸、 2, 4 ジクロ口フエ-ルォキシ酢酸、 3—フエニルプロピオン酸ともに、有意に尿中ケトン体排泄を上昇させた（図 20)。さらに、 4 フエニルブチル酸による尿中ケトン体濃度上昇の時間依存性を測定したところ、 4 フエ-ルブチル酸の投与により速やかに尿中のケトン体排泄量の上昇が観測された（図 21)。

図面の簡単な説明

[図 1]図 1は、マウス OATN1の塩基配列を示した図である。

[図 2]図 2は、ヒト OATN1の塩基配列を示した図である。

[図 3]図 3は、マウス OATN1のアミノ酸配列を示した図である。

[図 4]図 4は、ヒト OATN1のアミノ酸配列を示した図である。

[図 5]図 5は、マウスの各臓器組織における OATN1遺伝子 mRNAの発現をノーザンブロッテイングにより解析した結果を示した図である。調べた臓器の中で、腎臓にのみ強く発現して、ることが示された。

[図 6]図 6は、マウス腎臓切片を用いた OATN1の in situハイブリダィゼーシヨンの結果を示した図である。皮質部分と髄質外層外帯に強、シグナルが確認された。

[図 7]図 7は、マウス腎臓切片における抗 OATN1抗体を用いた免疫組織染色の結果を示した図である。近位尿細管の管腔側膜に局在してヽることが確認された。

[図 8]図 8は、マウス OATN1の安定発現細胞（S — OATN1)による βーヒドロキシ

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酪酸の取り込み実験の結果を示した図である。マウス OATN1による βーヒドロキシ酪酸の有意な輸送活性が確認された。

[図 9]図 9は、マウス OATN1の安定発現細胞（S — OATN1)による βーヒドロキシ

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酪酸以外の取り込みの見られた化合物の取り込み実験の結果を示した図である。二コチン酸、サリチル酸、プロスタグランジン F aの有意な輸送活性が確認された。

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[図 10]図 10は、マウス OATN1の安定発現細胞（S — OATN1)による取りこみの見

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られな力つた SLC22ファミリーの代表基質の取りこみ実験の結果を示した図である。有機イオントランスポーターの代表基質であるパラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、 a ーケトグルタル酸、尿酸、オクラトキシン A、タウロコール酸、有機カチオントランスポ一ターの代表基質であるテトラエチルアンモ-ゥム、有機カチオン Z両極性イオントランスポーターの代表基質であるカル-チンの OATN1による輸送活性は確認されなかった。 [図 11]図 11は、マウス OATNlの安定発現細胞（S—OATN1)による j8 -ヒドロキシ

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酪酸の濃度依存的な取り込みを調べた結果を示した図である。横には Eadie-Hofstee プロットの結果を示す。

[図 12]図 12は、マウス OATN1の安定発現細胞（S— OATN1)によるニコチン酸取

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りこみ実験にぉ、て、系への各種有機ァ-オン添加の影響を調べた結果を示した図である。

[図 13]図 13は、マウス OATN1の安定発現細胞（S— OATN1)によるニコチン酸取

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りこみ実験にぉ、て、系への各種利尿薬添加の影響を調べた結果を示した図である

[図 14]図 14は、マウス OATN1の安定発現細胞（S— OATN1)によるニコチン酸取

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りこみ実験にぉ、て、系への様々な有機ァ-オン添加の影響を調べた結果を示した図である。

[図 15]図 15は、マウス OATN1の安定発現細胞（S— OATN1)によるニコチン酸取

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りこみ実験にぉ、て、系への短鎖脂肪酸添加の影響を調べた結果を示した図である

[図 16]図 16は、マウス OATN1の安定発現細胞（S— OATN1)によるニコチン酸取

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りこみ実験にぉ、て、系への神経伝達物質の代謝産物添加の影響を調べた結果を示した図である。

[図 17]図 17は、マウス OATN1の安定発現細胞（S— OATN1)によるニコチン酸取

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りこみ実験の総括的な結果を示した図である（図 12〜図 16に不掲載の一部化合物のデータも掲載)。

[図 18]図 18は、糖尿病になった野生型マウス及び OATN1ノックアウトマウスにおける、尿中の j8—ヒドロキシ酪酸濃度を示した図である。

[図 19]図 19は、ァロキサン投与後における、尿中の全ケトン排泄量の経時変化を示した図である。

[図 20]図 20は、 OATN1インヒビター処理をした後の、糖尿病 WTマウスにおける尿中の全ケトン体濃度を示した図である。

[図 21]図 21は、 4 フエニルブチル酸 (PBA)処理をした後の、尿中の全ケトン体濃度の時間依存を示した図である。

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジン F α若しくはケトン体又はその類似物

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を輸送する能力を有する、ヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22ファミリーの有機ァ二オントランスポーター。

[2] 配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22ファミリーの有機ァニオントランスポーター。

[3] 配列番号 1又は配列番号 2で表されるアミノ酸配列と同一又は当該アミノ酸配列のうち一若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加したアミノ酸配列を有する、ニコチン酸、サリチル酸、プロスタグランジン F α若しくはケトン体又はその類似物

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を輸送する能力を有する、腎臓特異的な発現を示す、ヒト SLC22ファミリー又はマウス slc22ファミリーの有機ァニオントランスポーター。

[4] 前記トランスポーターが、腎臓皮質及び腎臓髄質外層に発現を示す、請求項 1〜3 のいずれか一項記載のトランスポーター。

[5] 前記トランスポーターが、近位尿細管細胞の管腔側膜に特異的に発現を示す、請求項 1〜4のいずれか一項記載のトランスポーター。

[6] パラアミノ馬尿酸、エストロン硫酸、 cAMP、ジカルボン酸、テトラエチルアンモ-ゥム、コリン又はカル-チンの輸送を示さない、請求項 1〜5のいずれか一項記載のトランスポーター。

[7] 請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターをコードするヒト又はマウス D NA、或!、は当該 DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィズしかつ当該トランスポ一ターと同じ能力及び Z又は発現部位を示すトランスポーターをコードするヒト又はマウス DNA。

[8] 配列番号 3又は配列番号 4で表される塩基配列力もなる、請求項 7記載の DNA。

[9] 請求項 7又は 8記載の DNAが組み込まれた安定発現細胞、或いは請求項 7又は 8 記載の DNA若しくは当該 DNAと相補的な cRNAが導入された一過性発現細胞。

[10] 請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体。

[11] 請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターを用いる工程を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング方法。

[12] 請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーター又は請求項 9記載の細胞を含む、当該トランスポーターの活性を促進又は阻害する物質のスクリーニング用キット。

[13] 4 フエ-ルブチル酸、 2, 4 ジクロ口フエ-ルォキシ酢酸、 3 フエ-ルプロピオン酸又はこれらに類似する物質を含有する、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターの活性阻害剤。

[14] 請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターの抗体医薬品又はァプタマ一である、請求項 1〜6の、ずれか一項記載のトランスポーターの活性阻害剤。

[15] ケトン体排泄促進のための、請求項 13又は 14記載の活性阻害剤。

[16] ケトアシドーシス治療又は改善のための、請求項 13〜 15のいずれか一項記載の活性阻害剤。

[17] 糖尿病又は薬剤の副作用に起因したケトアシドーシスである、請求項 16記載の活性阻害剤。

[18] 尿中の、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーター又は請求項 7若しくは 8記載の DNAを分析する工程を含む、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターに関連した疾患の有無及び Z又は重篤度を判断する診断方法。

[19] 請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体を含む、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポータ一に関連した疾患の有無及び Z又は重篤度を判断する診断キット。

[20] 体液中の、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーター又は請求項 7若しくは 8記載の DNAを分析する工程を含む、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断方法。

[21] 全ェクソンの情報を知り得るプライマーを含む、請求項 1〜6のいずれか一項記載のトランスポーターの遺伝子異常を判断する診断キット。