WO2008031910A2 - Experimental models for non-microcytic lung cancer metastasis to bone - Google Patents

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WO2008031910A2
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Abstract

The invention relates to several cell lines of non-microcytic lung cancer which can metastasize to bone with great efficiency. Said cell lines are: a large-cell carcinoma cell line NCI-H640 which overexpresses genes TCF4 and PKD3 together with MCAM or SUSD5 and may also overexpress KIAA0960; a carcinoid cell line H727 which overexpresses genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR; and a bronchoalveolar carcinoma cell line A549 which overexpresses genes IL11, PITX1, HDAC4, RHOB, ROBO1 and SLC26A2. The invention also relates to the method for obtaining said cell Ines, the corresponding models and the use of same.

Description

MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA METÁSTASIS A HUESO DF CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO EXPERIMENTAL MODELS FOR BONE METALASIS DF CANCER OF NON-MICROCHITICAL LUNG
CAMPO DE LA TÉCNICA La presente invención se engloba dentro del estudio del cáncer, en concreto del desarrollo de modelos experimentales de cáncer de pulmón.FIELD OF THE TECHNIQUE The present invention is encompassed within the study of cancer, in particular the development of experimental models of lung cancer.
ESTADO DE LA TÉCNICA El cáncer de pulmón representa la principal causa de mortalidad en los países occidentales con más de 500.000 muertes anuales en Estados Unidos y más de un millón en el mundo entero, con una tasa de supervivencia a los 5 años situada en torno al 10-15%. Más del 90% de los cánceres de pulmón se han asociado con el consumo de tabaco. A pesar del uso de terapias combinadas y de los esfuerzos realizados por los políticos y organizaciones de la salud dirigidos a prevenir este hábito, la incidencia y mortalidad no han mejorado sustancialmente en el mundo. La mayoría de los esfuerzos actuales están destinados a mejorar tanto el diagnóstico temprano, como la terapia, pero hasta el momento hay pocos estudios dedicados a la metástasis, la complicación más devastadora del cáncer de pulmón, responsable de casi todas las muertes. El adenocarcinoma, una forma de cáncer de pulmón no microcitico, representa aproximadamente el 80% de los casos de cáncer de pulmón no microcitico. A pesar de que el estadio I de la enfermedad está asociado con un pronóstico favorable, el 30-40% de los pacientes diagnosticados con el estadio I de cáncer de pulmón no microcitico, recayeron con metástasis después de una extirpación tumoral completa. Tal y como se ha demostrado para otros tumores, las células de cáncer de pulmón a menudo se escapan del foco primario y tienden a diseminarse bien localmente en la cavidadSTATE OF THE TECHNIQUE Lung cancer represents the leading cause of death in Western countries with more than 500,000 deaths annually in the United States and more than one million worldwide, with a 5-year survival rate around 10-15% More than 90% of lung cancers have been associated with tobacco use. Despite the use of combined therapies and the efforts made by politicians and health organizations aimed at preventing this habit, the incidence and mortality have not improved substantially in the world. Most current efforts are aimed at improving both early diagnosis and therapy, but so far there are few studies devoted to metastasis, the most devastating complication of lung cancer, responsible for almost all deaths. Adenocarcinoma, a form of non-small cell lung cancer, accounts for approximately 80% of cases of non-small cell lung cancer. Despite the fact that stage I disease is associated with a favorable prognosis, 30-40% of patients diagnosed with stage I non-small cell lung cancer relapsed with metastasis after complete tumor removal. As has been shown for other tumors, lung cancer cells often escape the primary focus and tend to spread well locally in the cavity.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) torácica o bien hasta órganos distantes como el cerebro, hueso, glándula adrenal, pericardio e hígado.SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) thoracic or even distant organs such as the brain, bone, adrenal gland, pericardium and liver.
El hueso representa una diana frecuente para las metástasis pulmonares, que aparecen en hasta un 40% de los pacientes con cáncer de pulmón. La mediana de supervivencia de estos pacientes es ≤6 meses, la menor de todos los tipos de cáncer que metastatizan a hueso, por tanto es con mucho el de peor pronóstico. La metástasis de cáncer pulmonar a hueso está asociada clínicamente con dolor, frecuentemente refractario a terapias convencionales, y con compresión y fractura de la médula ósea, con desenlace fatal en todos los casos.Bone represents a frequent target for lung metastases, which appear in up to 40% of patients with lung cancer. The median survival of these patients is ≤6 months, the lowest of all types of cancer that metastasize to bone, therefore it is by far the worst prognosis. The metastasis of lung cancer to bone is clinically associated with pain, often refractory to conventional therapies, and with compression and fracture of the bone marrow, with fatal outcome in all cases.
Este proceso de varias etapas implica la acción coordinada de múltiples genes que permite la invasión e intravasación, supervivencia en los capilares, detención y crecimiento o finalmente extravasación y multiplicación en el órgano diana. La capacidad metastásica de las células tumorales está muy influenciada por su interacción con el microambiente óseo. Las interacciones heterotipicas tumor- estroma, las interacciones célula-matriz, y la estimulación paracrina por parte de factores solubles, pueden modular el comportamiento tumoral.This multi-stage process involves the coordinated action of multiple genes that allows invasion and intravasation, survival in the capillaries, arrest and growth or finally extravasation and multiplication in the target organ. The metastatic capacity of tumor cells is greatly influenced by their interaction with the bone microenvironment. Heterotopic tumor-stromal interactions, cell-matrix interactions, and paracrine stimulation by soluble factors, can modulate tumor behavior.
A pesar de que los mecanismos de inducción, progresión y dispersión de metástasis no se conocen bien, se acepta que el microambiente óseo ejerce un fuerte efecto modulando la atracción celular, el crecimiento y la invasión.Although the mechanisms of induction, progression and dispersion of metastases are not well known, it is accepted that the bone microenvironment exerts a strong effect by modulating cell attraction, growth and invasion.
En un trabajo reciente [Kang et al. A multigenic program mediating breast cáncer metástasis to bone . Cáncer CeIl, 3: 537-549; 2003] se demostró que la actividad prometastásica estaba gobernada por un grupo pequeño de genes, los cuales cuando son sobrexpresados en una fracción de células procedentes de tumores primarios les conferian una fuerte proclividad metastásica. La identificación de perfiles de expresión de subpoblaciones de células metastásicas con tropismo hacia pulmón, frente a las que presentan tropismo hacia hueso, reveló que un grupo concreto de genes confiere especificidad para cada órgano diana y coopera para adquirir diversas funciones complementarias necesarias para desarrollar una metástasis agresiva. Adicionalmente, el grupo de genes que mediaba exclusivamente la metástasis pulmonar fue validado clínicamente y permitía predecir pacientes de mal pronóstico con riesgo de desarrollar metástasis pulmonar.In a recent paper [Kang et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. CeIl Cancer, 3: 537-549; 2003] it was shown that promtastatic activity was governed by a small group of genes, which when overexpressed in a fraction of cells from primary tumors confer a strong metastatic proclivity. The identification of expression profiles of subpopulations of metastatic cells with tropism towards the lung, compared to those they present tropism towards bone, revealed that a specific group of genes confers specificity for each target organ and cooperates to acquire various complementary functions necessary to develop an aggressive metastasis. Additionally, the group of genes that exclusively mediated pulmonary metastasis was clinically validated and allowed to predict patients with poor prognosis with risk of developing pulmonary metastases.
Los esfuerzos dirigidos a bloquear estos procesos metastásicos se han visto dificultados por la falta de modelos consistentes en los que se pudiera identificar dianas moleculares clave. Estos modelos facilitan el análisis de nuevos protocolos terapéuticos antimetastásicos . En el documento ["Animal models of bone metástasis" Cáncer 2003; 97:748-757], se describe una técnica que consiste en realizar xenotransplantes o inoculación/inyección de células o tejidos derivados de tumores humanos en ratones inmunodeficientes para seleccionar subpoblaciones de células tumorales con una capacidad elevada de generar metástasis. La capacidad de formar metástasis a uno u otro órgano depende de las características fenotípicas de cada tipo celular, es decir, de la expresión de un perfil de genes prometastásicos que confieren capacidad de formar metástasis en unos u otros órganos. Hasta el momento no se conoce cuales son los genes cuya expresión define el tropismo y metastaticidad hacia uno u otro órgano.Efforts aimed at blocking these metastatic processes have been hampered by the lack of consistent models in which key molecular targets could be identified. These models facilitate the analysis of new antimetastatic therapeutic protocols. In the document ["Animal models of bone metastasis" Cancer 2003; 97: 748-757], a technique is described that consists of performing xenotransplants or inoculation / injection of cells or tissues derived from human tumors in immunodeficient mice to select subpopulations of tumor cells with a high capacity to generate metastases. The ability to metastasize to one or the other organ depends on the phenotypic characteristics of each cell type, that is, on the expression of a profile of promtastatic genes that confer the ability to form metastases in one or the other organs. So far it is not known which are the genes whose expression defines tropism and metastaticity towards one or the other organ.
El documento más cercano del estado de la técnica lo constituye la solicitud de patente US 2002/0199212. En este documento se describe un modelo animal de metástasis ósea de células tumorales. Dichas células tumorales proceden de cáncer de pulmón o de mama y se caracterizan por expresar niveles elevados de PTHrP (péptido relacionado con la paratohormona) . Se describe un modelo de metástasis ósea obtenido mediante la inyección periférica de células de carcinoma pulmonar microcitico humano en ratones inmunodeficientes SCID, en el que además se forman metástasis multiorgánicas en uno o más de los siguientes órganos: pulmón, hígado, riñon y ganglios linfáticos.The closest document of the prior art is the patent application US 2002/0199212. This document describes an animal model of bone metastasis of tumor cells. These tumor cells come from lung or breast cancer and are characterized by expressing elevated levels of PTHrP (peptide related to paratohormone). A model of bone metastasis is described obtained by peripheral injection of human microcytic lung carcinoma cells in SCID immunodeficient mice, in which multiorgan metastases are also formed in one or more of the following organs: lung, liver, kidney and lymph nodes.
El objeto de la presente invención se refiere a un modelo animal no humano de metástasis a hueso de cáncer de pulmón no microcitico. El cáncer de pulmón no microcitico es el más frecuente y representa alrededor de un 70-80% del total de todos los casos de cáncer de pulmón. En este modelo se obtienen metástasis a hueso con una eficiencia de al menos 90%, y de forma reproducible y extraordinariamente rápida con un tiempo de latencia de 9-12 dias, diferenciándose de la solicitud estadounidense anteriormente citada en que adicionalmente, no se producen metástasis multiorgánicas, sino casi exclusivamente con tropismo a hueso.The object of the present invention relates to a non-human animal model of bone metastasis of non-small cell lung cancer. Non-small cell lung cancer is the most frequent and accounts for about 70-80% of the total of all cases of lung cancer. In this model bone metastases are obtained with an efficiency of at least 90%, and in a reproducible and extraordinarily fast manner with a latency time of 9-12 days, differing from the aforementioned US application in that additionally, metastases do not occur multiorganic, but almost exclusively with bone tropism.
DESCRIPCIÓN DE IA INVENCIÓN Para facilitar la comprensión de la presente invención se definen a continuación una serie de conceptos tal y como se entienden en el presente contexto.DESCRIPTION OF THE INVENTION To facilitate the understanding of the present invention, a series of concepts are defined below as understood in the present context.
El término "metástasis" según se utiliza en la presente descripción se refiere a un cáncer o tumor (tumor secundario) que se desarrolla en un órgano o parte del cuerpo por diseminación a partir de células tumorales procedentes de un tumor iniciado en otro órgano o parte del cuerpo (tumor primario) . Asi, células tumorales que se han propagado al hueso desde otro órgano (por ejemplo desde un cáncer de mama) no son un cáncer de hueso, sino metástasis óseas de un cáncer de mama. Estas células tumorales seguirán siendo células tumoraies de mama, independientemente de su localización en el hueso.The term "metastasis" as used herein refers to a cancer or tumor (secondary tumor) that develops in an organ or part of the body by dissemination from tumor cells from a tumor initiated in another organ or part. of the body (primary tumor). Thus, tumor cells that have spread to the bone from another organ (for example from a breast cancer) are not a bone cancer, but bone metastases from a breast cancer. These tumor cells will remain breast tumor cells, regardless of their location in the bone.
El "cáncer de pulmón no microcitico" agrupa diversos subtipos histológicos de pulmón que se caracterizan porque tienen un crecimiento y diseminación lentos y porque pueden ser tratados de la misma manera (resección quirúrgica como primera opción, radioterapia y quimioterapia) . A diferencia del cáncer de pulmón microcítico, que se caracteriza por ser muy agresivo y de rápida diseminación, y porque una vez ha metastatizado no es candidato para la resección quirúrgica y no responde a la quimioterapia convencional. Desde el punto de vista epidemiológico, los subtipos de cáncer de pulmón no microcitico más relevantes son: adenocarcinoma mixto (mixed cell adenocarcinoma o adenocarcinoma with mixed subtypes), carcinoma escamoso y carcinoma broncoalveolar (bronchioloalveolar carcinoma) , este último incluido entre los adenocarcinomas. [Brambilla E et al . The World Health Organization classification of lung tumours . Eur. Respir. J. 2001; 18:105.9-1068]. Entre los subtipos de cáncer de pulmón no microcítico se incluye también el carcinoma de células grandes y otros subtipos histológicos más raros."Non-small cell lung cancer" groups several histological lung subtypes that are characterized by they have a slow growth and dissemination and because they can be treated in the same way (surgical resection as a first option, radiotherapy and chemotherapy). Unlike microcytic lung cancer, which is characterized by being very aggressive and rapidly spreading, and because once it has metastasized, it is not a candidate for surgical resection and does not respond to conventional chemotherapy. From the epidemiological point of view, the most relevant non-small cell lung cancer subtypes are: mixed adenocarcinoma (mixed cell adenocarcinoma or mixed subtypes), squamous carcinoma and bronchoalveolar carcinoma (bronchioloalveolar carcinoma), the latter included among the adenocarcinomas. [Brambilla E et al. The World Health Organization classification of lung tumors. Eur. Respir. J. 2001; 18: 105.9-1068]. Non-small cell lung cancer subtypes also include large cell carcinoma and other more rare histological subtypes.
La "inyección por via intracardiaca" se refiere a la inyección en el ventrículo izquierdo del corazón del animal en cuestión."Intracardiac injection" refers to the injection into the left ventricle of the heart of the animal in question.
El hecho de que una línea celular posea capacidad de metastatizar a hueso con una "eficiencia de al menos el 90%", se refiere a que en al menos 9 de cada 10 ratones que han recibido una inyección intracardiaca de dichas células se han formado masas tumorales en tejido óseo.The fact that a cell line has the ability to metastasize to bone with an "efficiency of at least 90%" refers to the fact that in at least 9 out of 10 mice that have received an intracardiac injection of said cells, masses have formed Bone tissue tumors.
El término "sobrexpresión" de un gen, se refiere a que su nivel de expresión es de al menos 1,5 veces mayor al nivel de expresión de las células empleadas como control. La "actividad antimetastásica" de un compuesto se refiere a su capacidad de reducir la migración de células desde el foco primario, o su alojamiento en un foco secundario o su crecimiento y desarrollo en ese foco secundario. Dentro del contexto de la presente invención el foco secundario es un hueso.The term "overexpression" of a gene refers to its expression level being at least 1.5 times higher than the expression level of the cells used as a control. The "antimetastatic activity" of a compound refers to its ability to reduce cell migration from the primary focus, or its accommodation in a secondary focus or its growth and development in that focus secondary. Within the context of the present invention the secondary focus is a bone.
Asi, la presente invención se refiere en primer lugar a una linea celular de cáncer de pulmón caracterizada porque es un cáncer de pulmón no microcitico y posee capacidad de metastatizar a hueso con una eficiencia de al menos 90% con un tiempo de latencia de entre 9 a 12 dias. Preferentemente dicha linea celular de cáncer de pulmón no microcitico está caracterizada porque dicho cáncer se ha seleccionado entre una linea derivada de un carcinoma de células grandes (LCC), carcinoide y carcinoma broncoalveolar .Thus, the present invention relates firstly to a lung cancer cell line characterized in that it is a non-small cell lung cancer and has the ability to metastasize to bone with an efficiency of at least 90% with a latency time of between 9 12 days Preferably said non-small cell lung cancer cell line is characterized in that said cancer has been selected from a line derived from a large cell carcinoma (LCC), carcinoid and bronchoalveolar carcinoma.
En una realización concreta, la presente invención se refiere a una linea celular de cáncer de pulmón no microcitico según las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque dicha linea celular está seleccionada entre: NCI- H460 subpoblación M5 (ECACC 06091547) : LCC, H727 subpoblación M5/M2 (ECACC 06091545) : carcinoide y A549 subpoblación Ml/Ml (ECACC 06091546): adenocarcinoma broncoalveolar . En una realización particular, la linea celular de cáncer de pulmón no microcitico objeto de la presente invención es una linea celular de carcinoma de células grandes que sobrexpresa al menos 3, 4 ó 5 genes seleccionados entre: TCF4, PKD3 (conocido también como PRKD3), MCAM, SUSD5 y KIAA0960. En una realización más preferente dicha linea celular de carcinoma de células grandes de pulmón sobrexpresa los genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 y KIAA0960. En una realización más particular, la linea celular se obtiene mediante la transducción de células parentales con al menos 3, 4 ó 5 de los genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 y KIAA0960, es decir transfectadas con vectores que expresan las proteínas que dichos genes codifican. En una realización concreta, dicha linea celular de carcinoma de pulmón se deriva de la linea NCI-H460, por ejemplo de la subpoblación M5 (ECACC 06091547) .In a specific embodiment, the present invention relates to a non-small cell lung cancer cell line according to claims 1 or 2, characterized in that said cell line is selected from: NCI-H460 subpopulation M5 (ECACC 06091547): LCC, H727 subpopulation M5 / M2 (ECACC 06091545): carcinoid and A549 subpopulation Ml / Ml (ECACC 06091546): bronchoalveolar adenocarcinoma. In a particular embodiment, the non-small cell lung cancer cell line object of the present invention is a large cell carcinoma cell line that overexpresses at least 3, 4 or 5 genes selected from: TCF4, PKD3 (also known as PRKD3) , MCAM, SUSD5 and KIAA0960. In a more preferred embodiment said large cell lung carcinoma cell line overexpresses the genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and KIAA0960. In a more particular embodiment, the cell line is obtained by transducing parental cells with at least 3, 4 or 5 of the genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and KIAA0960, that is to say transfected with vectors that express the proteins that said genes encode In a specific embodiment, said lung carcinoma cell line is derived from the NCI-H460 line, for example from subpopulation M5 (ECACC 06091547).
En otra realización particular, la linea celular de cáncer de pulmón no microcitico objeto de la presente invención es una linea celular de carcinoide que sobrexpresa al menos 3, 4 ó 5 genes seleccionados entre:In another particular embodiment, the non-small cell lung cancer cell line object of the present invention is a carcinoid cell line that overexpresses at least 3, 4 or 5 genes selected from:
GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR. En una realización más particular, la linea celular se obtiene mediante la transducción de células párenteles con al menos 3, 4 ó 5 de los genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR.GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR. In a more particular embodiment, the cell line is obtained by transducing parental cells with at least 3, 4 or 5 of the GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR genes.
En una realización concreta, dicha linea celular de carcinoide se deriva de la linea H727, por ejemplo de la subpoblación M5/M2 (ECACC 06091545) . En otra realización particular adicional, la línea celular de cáncer de pulmón no microcitico objeto de la presente invención es una línea celular de adenocarcinoma broncoalveolar que sobrexpresa al menos 3, 4, 5 ó 6 genes seleccionados entre: ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, R0301 y SLC26A2. En una realización más particular, la línea celular se obtiene mediante la transducción de células parentales con al menos 3, 4, 5 ó 6 de los genes ILIl,In a specific embodiment, said carcinoid cell line is derived from the H727 line, for example from subpopulation M5 / M2 (ECACC 06091545). In another additional particular embodiment, the non-small cell lung cancer cell line object of the present invention is a bronchoalveolar adenocarcinoma cell line that overexpresses at least 3, 4, 5 or 6 genes selected from: ILIl, PITX1, HDAC4, RHOB, R0301 and SLC26A2. In a more particular embodiment, the cell line is obtained by transducing parental cells with at least 3, 4, 5 or 6 of the ILI genes,
PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2.PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2.
En una realización concreta, dicha línea celular de adenocarcinoma broncoalveolar se deriva de la línea A549, por ejemplo de la subpoblación Ml/Ml (ECACC 06091546).In a specific embodiment, said bronchoalveolar adenocarcinoma cell line is derived from the A549 line, for example of the Ml / Ml subpopulation (ECACC 06091546).
Por otro lado, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener una línea celular anteriormente descrita, caracterizado porque comprende: a) inyectar por vía intracardiaca en un animal no humano células derivadas de una línea parental procedente de dicho cáncer de pulmón, previamente transfectada con un gen de selección; y b) aislar, expandir en cultivo y seleccionar las células tumorales de las metástasis óseas generadas en dicho animal .On the other hand, the present invention relates to a method for obtaining a cell line described above, characterized in that it comprises: a) intracardiac injection into a non-human animal of cells derived from a parental line from said lung cancer, previously transfected with a selection gene; Y b) isolate, expand in culture and select tumor cells from bone metastases generated in said animal.
Adicionalmente, dicho procedimiento preferentemente comprende : a) inyectar por via intracardiaca las células obtenidas en el paso b en un animal no humano; y b) aislar, expandir en cultivo y seleccionar las células tumorales de las metástasis óseas generadas en dicho animal.Additionally, said method preferably comprises: a) intracardially injecting the cells obtained in step b into a non-human animal; and b) isolate, expand in culture and select tumor cells from bone metastases generated in said animal.
En una realización preferente de este procedimiento dicho gen de selección es un gen de resistencia a antibiótico y un gen que codifica luciferasa.In a preferred embodiment of this method said selection gene is an antibiotic resistance gene and a gene encoding luciferase.
En una realización concreta del procedimiento descrito, la linea celular a inyectar en el animal no humano se deriva de un carcinoma de células grandes, y dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobrexpresan al menos 3, 4 ó 5 genes seleccionados entre: TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 y KIAA0960. En una realización preferente, dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobrexpresan los 5 genes . En otra realización la linea celular a inyectar se deriva de un carcinoide, y dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobre expresan al menos 3, 4 ó 5 genes seleccionados entre: GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR. En una realización preferente, dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobrexpresan los 5 genes. En otra realización adicional la línea celular a inyectar se deriva de un adenocarcinoma broncoalveolar, y dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobre expresan al menos 3, 4, 5 ó 6 genes seleccionados entre: ILIl, PITXl, HDΔC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2. En una realización preferente, dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobrexpresan los 6 genes. En una realización preferente del procedimiento objeto de la presente invención se caracteriza porque dichas células derivadas de una linea parental de cáncer de pulmón no microcitico está seleccionada entre: NCI-H460, A549 y H727.In a specific embodiment of the described procedure, the cell line to be injected into the non-human animal is derived from a large cell carcinoma, and said method comprises selecting the cells that overexpress at least 3, 4 or 5 genes selected from: TCF4, PKD3 , MCAM, SUSD5 and KIAA0960. In a preferred embodiment, said method comprises selecting the cells that overexpress the 5 genes. In another embodiment the cell line to be injected is derived from a carcinoid, and said method comprises selecting the cells that express at least 3, 4 or 5 genes selected from: GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR. In a preferred embodiment, said method comprises selecting the cells that overexpress the 5 genes. In a further embodiment, the cell line to be injected is derived from a bronchoalveolar adenocarcinoma, and said method comprises selecting the cells that express at least 3, 4, 5 or 6 genes selected from: ILIl, PITXl, HDΔC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2 . In a preferred embodiment, said method comprises selecting the cells that overexpress the 6 genes. In a preferred embodiment of the method object of the present invention it is characterized in that said cells derived from a parental line of non-small cell lung cancer are selected from: NCI-H460, A549 and H727.
Adicionalmente, la presente invención se refiere a un modelo animal no humano de cáncer de pulmón no microcitico con metástasis a hueso caracterizado porque comprende inyectar por via intracardiaca en el animal células tumorales procedentes de una linea celular anteriormente descrita. Preferentemente, el animal no humano objeto del presente modelo es un animal inmunodeprimido, más preferentemente es un roedor. En una realización concreta del modelo animal objeto de la presente invención dicho animal es un ratón atimico desnudo (athymic nude) .Additionally, the present invention relates to a non-human animal model of non-small cell lung cancer with bone metastases characterized in that it comprises injecting tumor cells intracardially into the animal from a cell line described above. Preferably, the non-human animal object of the present model is an immunosuppressed animal, more preferably it is a rodent. In a specific embodiment of the animal model object of the present invention said animal is a nude athletic mouse.
Por otro lado, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de dicho modelo animal no humano de cáncer de pulmón no microcitico con metástasis a hueso caracterizado porque comprende inyectar por via intracardiaca en el animal células tumorales procedentes de una linea celular definida en los párrafos precedentes.On the other hand, the present invention relates to a method for obtaining said non-human animal model of non-small cell lung cancer with bone metastases characterized in that it comprises injecting intracellularly into the animal tumor cells from a cell line defined in the preceding paragraphs.
Por otro lado, la presente invención se refiere al uso de la linea celular o del modelo animal anteriormente descritos y objeto de la presente invención, para ensayar la actividad antimetastásica de un compuesto.On the other hand, the present invention relates to the use of the cell line or animal model described above and object of the present invention, to test the antimetastatic activity of a compound.
En una realización preferente dicho se caracteriza porque dicho ensayo de actividad metastásica comprende: a) cultivar células de dicha linea celular con el compuesto a ensayar; y b) comparar el efecto antimetastásico producido sobre dichas células con respecto a células control tratadas con otro compuesto de referencia o que no han sido tratadas. En otra realización preferente, dicho ensayo de actividad antimetastásica comprende: a) administrar el compuesto a ensayar a dicho animal modelo, y; b) comparar el efecto de dicho compuesto sobre los tumores de dicho animal, con los tumores de animales control tratados con otro compuesto de referencia o que no han sido tratados .In a preferred embodiment said is characterized in that said metastatic activity assay comprises: a) culturing cells of said cell line with the compound to be tested; and b) compare the antimetastatic effect produced on said cells with respect to control cells treated with another reference compound or that have not been treated. In another preferred embodiment, said antimetastatic activity assay comprises: a) administering the compound to be tested to said model animal, and; b) compare the effect of said compound on the tumors of said animal, with the tumors of control animals treated with another reference compound or that have not been treated.
En una realización concreta dicha actividad antimetastásica a ensayar está seleccionada entre: prevención de la metástasis, amortiguación de los efectos deletéreos de la metástasis, y una acción bloqueante del tropismo tejido-especifico.In a specific embodiment said antimetastatic activity to be tested is selected from: prevention of metastasis, damping of the deleterious effects of metastasis, and a blocking action of tissue-specific tropism.
Adicionalmente, la presente invención se refiere al uso de una linea celular anteriormente descrita, en un método para identificar marcadores asociados a cáncer de pulmón no microcitico caracterizado porque comprende comparar la presencia, ausencia, o el nivel de expresión génica en muestras de tejido tumoral de dicha linea celular, con la expresión génica en células control.Additionally, the present invention relates to the use of a cell line described above, in a method for identifying markers associated with non-small cell lung cancer characterized in that it comprises comparing the presence, absence, or level of gene expression in tumor tissue samples of said cell line, with gene expression in control cells.
Por otro lado, la presente invención también se refiere al uso de un modelo animal anteriormente descrito, en un método para identificar marcadores asociados a cáncer de pulmón no microcitico caracterizado porque comprende comparar la presencia, ausencia, o el nivel de expresión génica en muestras de tejido tumoral dicho animal modelo, con la expresión génica en el tejido de un segundo animal que no ha recibido inyección de células.On the other hand, the present invention also relates to the use of an animal model described above, in a method for identifying markers associated with non-small cell lung cancer characterized in that it comprises comparing the presence, absence, or level of gene expression in samples of Tumor tissue said model animal, with the gene expression in the tissue of a second animal that has not received cell injection.
BlREVE DESCRIPCIÓN DE IAS FIGURASBLREVE DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1: Análisis mediante RT-PCR de un panel de lineas de cáncer de pulmón microcitico (SCLC) y no microciticoFigure 1: RT-PCR analysis of a panel of microcytic (SCLC) and non-microcytic lung cancer lines
(NSCLC) . Los genes implicados en , metástasis en otros modelos incluyen MIP-lα, osteopontina, PTHrP, MMP-2, Galectina-3, CTGF se compararon con un gen control, β-actina. Las células utilizadas incluyeron SCLC: 1. H69; 2. H82; 3. H187; 4. H345; 5. H446; 6. H510 y NSCLC: 7. H460; 8. A549; 9. H441; 10. HTB58; 11. H676; 12. H727; 13. H720; 14. H1299. Figura 2: Ensayo de quimiotaxis . Células inducidas o no inducidas con 10% de suero (FCS) en el compartimento inferior de una cámara de Boyden durante 6 horas . Las células que migraron al compartimento inferior se tiñeron con tinción fluorescente. La fluorescencia total se midió utilizando un filtro 480/520 nm.(NSCLC). The genes involved in, metastases in other models include MIP-lα, osteopontin, PTHrP, MMP-2, Galectin-3, CTGF were compared with a control gene, β-actin. The cells used included SCLC: 1. H69; 2. H82; 3. H187; 4. H345; 5. H446; 6. H510 and NSCLC: 7. H460; 8. A549; 9. H441; 10. HTB58; 11. H676; 12. H727; 13. H720; 14. H1299. Figure 2: Chemotaxis test. Induced or non-induced cells with 10% serum (FCS) in the lower compartment of a Boyden chamber for 6 hours. The cells that migrated to the lower compartment were stained with fluorescent staining. Total fluorescence was measured using a 480/520 nm filter.
Figura 3: Curva Kaplan-Meier de varios grupos de ratones atimicos inoculados con diferentes lineas celulares tumorales humanas: H460, H157, H1299 y A549. Figura 4: Imagen de bioluminiscencia in vivo. Células establemente transfectadas con CMV-Luc, fueron seleccionadas e inoculadas en el ventrículo izquierdo del corazón de ratones atimicos. Dos semanas después se visualizaron. A. Células H1299. B. Células A549. Los ratones control están en la parte inferior. C. Células H460. El ratón control está en el centro de la parte inferior.Figure 3: Kaplan-Meier curve of several groups of atomic mice inoculated with different human tumor cell lines: H460, H157, H1299 and A549. Figure 4: Bioluminescence image in vivo. Cells stably transfected with CMV-Luc were selected and inoculated into the left ventricle of the heart of atomic mice. Two weeks later they were visualized. A. H1299 cells. B. A549 cells. Control mice are at the bottom. C. H460 cells. The control mouse is in the center of the bottom.
Figura 5: Análisis mediante rayos-X de las vértebras dorsales de un ratón control y de un ratón inoculado con la linea tumoral A. A549. Como se muestra, las lesiones osteoliticas aparecen de forma concomitante con una osteogénesis perióstica reactiva (panel de la derecha, flechas) .B. H460. Las lesiones osteoliticas se observaron en las epífisis distales y proximales de fémur y tibia. Figura 6: Imágenes de bioluminiscencia in vivo. Las células fueron transfectadas con ON-Luc (promotor de osteonectina con luciferasa) . Tras la selección, las células fueron inoculadas en el ventrículo izquierdo de ratones atimicos desnudos. Dos meses después de la inyección las células fueron visualizadas. A. Células H727. B. Células HTB58. Los ratones control son los primeros de la izquierda en ambos paneles .Figure 5: X-ray analysis of the dorsal vertebrae of a control mouse and a mouse inoculated with tumor line A. A549. As shown, osteolytic lesions appear concomitantly with reactive periodic osteogenesis (right panel, arrows) .B. H460 Osteolytic lesions were observed in the distal and proximal epiphyses of the femur and tibia. Figure 6: Bioluminescence images in vivo. The cells were transfected with ON-Luc (osteonectin promoter with luciferase). After selection, the cells were inoculated into the left ventricle of nude atomic mice. Two months after the injection the cells were visualized. A. H727 cells. B. HTB58 cells. The Control mice are the first on the left in both panels.
Figura 7: Estrategia in vivo para averiguar los tejidos diana de metástasis. Figura 8: Curva de Kaplan-Meier de H460 parental (CMV) y subpoblaciones metastásicas (Ml, M4 y M5) .Figure 7: In vivo strategy to find out the target tissues of metastasis. Figure 8: Kaplan-Meier curve of parental H460 (CMV) and metastatic subpopulations (Ml, M4 and M5).
Figura 9: Número de SCC (colonias derivadas de una única célula) derivadas de la inoculación de 10 ratones con H460 parental (CMV) y subpoblaciones metastásicas (Ml, M4 y M5) . Figura 10: Área metastásica en los huesos largos de los ratones inoculados con H460 parental (CMV) y subpoblaciones metastásicas (Ml, M4 y M5) .Figure 9: Number of SCC (colonies derived from a single cell) derived from the inoculation of 10 mice with parental H460 (CMV) and metastatic subpopulations (Ml, M4 and M5). Figure 10: Metastatic area in the long bones of mice inoculated with parental H460 (CMV) and metastatic subpopulations (Ml, M4 and M5).
Figura 11: Curva de Kaplan-Meier de A549 parental (CMV) y subpoblaciones metastásicas (Ml, Ml/Ml, M1/M3 y M1/M4) . Figura 12: Área metastásica en los huesos largos de los ratones inoculados con A549 parental (CMV) y subpoblaciones metastásicas (Ml, Ml/Ml y M1/M3) .Figure 11: Kaplan-Meier curve of parental A549 (CMV) and metastatic subpopulations (Ml, Ml / Ml, M1 / M3 and M1 / M4). Figure 12: Metastatic area in the long bones of mice inoculated with parental A549 (CMV) and metastatic subpopulations (Ml, Ml / Ml and M1 / M3).
Figura 13: Número total de subpoblaciones metastásicas aisladas de fémures y tibias de 7 de los 8 ratones inoculados con lineas celulares altamente metastásicasFigure 13: Total number of metastatic subpopulations isolated from femurs and tibiae of 7 of the 8 mice inoculated with highly metastatic cell lines
(M1/M4 y Ml/Ml) y células parentales (A549 CMV-Luc) .(M1 / M4 and Ml / Ml) and parental cells (A549 CMV-Luc).
Veinticinco dias post-inoculación, los ratones fueron sacrificados y las células de la médula ósea fueron cultivadas en medio de selección conteniendo G-418, durante 5 dias. Tras ese tiempo se contaron las SCC (colonias derivadas de una única célula) .Twenty-five days post-inoculation, the mice were sacrificed and the bone marrow cells were cultured in selection medium containing G-418, for 5 days. After that time the SCC (colonies derived from a single cell) were counted.
Figura 14: A. Número de subpoblaciones aisladas de huesos largos de 8 ratones inoculados con células YiI21 , 59 dias después de la inoculación (panel superior) y en 7 ratones inoculados con células A549, 29 dias tras la inoculación (panel inferior) . B. Radiografía de la extremidad inferior de un ratón inoculado con células H727 y A549, mostrando lesiones metastásicas. El número total de subpoblaciones aisladas después de "flushing" de la médula ósea fue de 192 para H727 y de 3190 para A549. Obsérvese las lesiones prominentes inducidas por H727 y el número tan pequeño de subpoblaciones aisladas con comparación en A549. Figura 15: A. Hematoxilina-Eosina de cortes de fémures de ratones tratados con vehículo e inoculados con células H460 por via intracardiaca. B. Recuento del número de osteoclastos inducido por la linea H460.Figure 14: A. Number of isolated subpopulations of long bones from 8 mice inoculated with YiI21 cells, 59 days after inoculation (upper panel) and in 7 mice inoculated with A549 cells, 29 days after inoculation (lower panel). B. Radiography of the lower limb of a mouse inoculated with H727 and A549 cells, showing metastatic lesions. The total number of subpopulations isolated after "flushing" of the bone marrow was 192 for H727 and 3190 for A549. Observe the injuries prominent induced by H727 and the small number of isolated subpopulations compared to A549. Figure 15: A. Hematoxylin-Eosin of femoral sections of mice treated with vehicle and inoculated with H460 cells intracardiacly. B. Count of the number of osteoclasts induced by the H460 line.
Figuxa 16: Recuento del porcentaje del área metastásica de osteolisis total con respecto al área ósea total en las radiografías, obtenido mediante análisis de imagen de los huesos largos (fémures y tibias) de ratones inoculados con células H460 control, o H460 transducidas con A. TCF4, PRKD3, MCAM y SUSD5. B. H460 transducidas con tres genes, PRKD3, SUSD5, TCF4 o bien, PRKD3, MCAM y TCF4. Figura 17: A. Curva de Kaplan-Meier de células H727 transfectada parental (ON-LUC) y subpoblaciones metastásicas (M4/M2, M4/M3, M5/M2 y M5/M4) derivados de la línea parental. B. Área metastásica de osteolisis total en las radiografías mediante análisis de imagen de los huesos largos (fémures y tibias) de ratones inoculados con células H727 parental y transfectadas (con el plásmido ON-LUC) , y subpoblaciones altamente metastásicas derivadas de ésta, M4/M2, M4/M5, M5/M2 y M5/M4. **p<0,001 y ***p<0,0001 con respecto a ON-LUC y parental.Figure 16: Count of the percentage of the metastatic area of total osteolysis with respect to the total bone area on radiographs, obtained by image analysis of the long bones (femurs and tibiae) of mice inoculated with control H460 cells, or H460 transduced with A. TCF4, PRKD3, MCAM and SUSD5. B. H460 transduced with three genes, PRKD3, SUSD5, TCF4 or, PRKD3, MCAM and TCF4. Figure 17: A. Kaplan-Meier curve of parental transfected H727 cells (ON-LUC) and metastatic subpopulations (M4 / M2, M4 / M3, M5 / M2 and M5 / M4) derived from the parental line. B. Metastatic area of total osteolysis on radiographs by image analysis of the long bones (femurs and tibiae) of mice inoculated with parental and transfected H727 cells (with the ON-LUC plasmid), and highly metastatic subpopulations derived from it, M4 / M2, M4 / M5, M5 / M2 and M5 / M4. ** p <0.001 and *** p <0.0001 with respect to ON-LUC and parental.
MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓNEMBODIMENTS OF THE INVENTION
A continuación se describen una serie de ejemplos para ilustrar la realización de la presente invención, sin poseer en modo alguno carácter limitativo del alcance de la misma.A series of examples are described below to illustrate the embodiment of the present invention, without in any way limiting the scope thereof.
EJEMPLO 1: Desarrollo de líneas celulares altamente metastásicas con tropismo a hueso. Material y métodos Las líneas celulares empleadas fueron: H460 (ATCC N° HTB-177) : procedente de un cáncer pulmonar no microcítico mixto obtenido a partir de una biopsia pulmonar de un hombre de raza negra de 54 años, con tumor de estadio 3A en el momento de diagnóstico.EXAMPLE 1: Development of highly metastatic cell lines with bone tropism. Material and methods The cell lines used were: H460 (ATCC No. HTB-177): from a mixed non-small cell lung cancer obtained from a lung biopsy of a 54-year-old black man with stage 3A tumor at the time of diagnosis.
H727 (ATCC N° CRL-5815) : procedente de un tumor carcinoide obtenido de una biopsia pulmonar de una mujer caucasoide de 65 años, con tumor de estadio 3A en el momento de diagnóstico . H157 (ATCC N° CRL-5802) : procedente de un carcinoma de células escamosas obtenido de la efusión pleural de un hombre caucasoide de 59 años, con un tumor de estadio 3A en el momento de diagnóstico. H1299 (ATCC N° CRL-5803) : procedente de un carcinoma pulmonar obtenido de la biopsia de un ganglio linfático procedente de un hombre caucasoide de 43 años, con un tumor de estadio 3A en el momento de diagnóstico.H727 (ATCC No. CRL-5815): from a carcinoid tumor obtained from a lung biopsy of a 65-year-old Caucasian woman with stage 3A tumor at the time of diagnosis. H157 (ATCC No. CRL-5802): from a squamous cell carcinoma obtained from the pleural effusion of a 59-year-old caucasoid man, with a stage 3A tumor at the time of diagnosis. H1299 (ATCC No. CRL-5803): from a lung carcinoma obtained from the biopsy of a lymph node from a caucasoid man of 43 years, with a stage 3A tumor at the time of diagnosis.
A549 (ATCC N° CCL-185) : procedente de un carcinoma pulmonar obtenido de la biopsia de un tumor de un hombre caucasoide de 58 años.A549 (ATCC No. CCL-185): from a lung carcinoma obtained from the biopsy of a tumor of a 58-year-old caucasoid man.
HTB58 (ATCC) : procedente de un carcinoma de células escamosas obtenido de la efusión pleural de un hombre caucasoide de 65 años.HTB58 (ATCC): from a squamous cell carcinoma obtained from the pleural effusion of a 65-year-old Caucasian man.
La inyección intracardiaca se realizó de acuerdo con los protocolos conocidos por un experto en la materia. Un total de 200.000 células en las que previamente se ha insertado un gen de selección, con una viabilidad superior al 95% en 100 μl de PBS fueron inyectadas. La invasión celular fue determinada empleando un ensayo de migración en dos cámaras modificado (diámetro de poro de 8 μm, Chemicon International, Inc) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron sembradas en la cámara superior en un medio que contenía un 0,4% de suero y migraron hacia un 10% de suero bovino de ternero (FCS) en la cámara inferior durante 8 horas. Las células del inferior de la membrana fueron despegadas, Usadas y teñidas con CyQuant GR Dye . La fluorescencia fue analizada en un lector de placas empleando los filtros de 480/520 nm.Intracardiac injection was performed according to the protocols known to a person skilled in the art. A total of 200,000 cells in which a selection gene has previously been inserted, with a viability greater than 95% in 100 µl of PBS were injected. Cellular invasion was determined using a modified two chamber migration assay (8 μm pore diameter, Chemicon International, Inc) according to the manufacturer's instructions. The cells were seeded in the upper chamber in a medium containing 0.4% serum and migrated to 10% bovine serum from Calf (FCS) in the lower chamber for 8 hours. The cells of the lower membrane were peeled, used and stained with CyQuant GR Dye. Fluorescence was analyzed in a plate reader using 480/520 nm filters.
El aislamiento de células metastásicas de la médula ósea de las extremidades inferiores se realizó mediante protocolos de sobra conocidos por un experto en la materia. En resumen, los ratones fueron sacrificados de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Experimentación Animal de la institución donde se realizaron los ensayos. Los huesos largos fueron extirpados y limpiados de todos los tejidos blandos. Las células de la médula fueron liberadas mediante arrastre, introduciendo 5 mi de α-MEM con una aguja de diámetro 27G en la epífisis distal a través de la médula ósea. Las células fueron plaqueadas en placas p-100 y p-150 y expandidas durante 5 días en medio suplerαentado con G-418. Este procedimiento se realizó por separado para cada fémur y tibia. Las subpoblaciones fueron cuantificadas bajo el microscopio tras su tinción con cristal violeta.Isolation of metastatic cells from the bone marrow of the lower extremities was performed by means of surplus protocols known to a person skilled in the art. In summary, the mice were sacrificed according to the protocols approved by the Animal Experimentation Committee of the institution where the trials were conducted. The long bones were removed and cleaned of all soft tissues. The marrow cells were released by dragging, introducing 5 ml of α-MEM with a 27G diameter needle into the distal epiphysis through the bone marrow. The cells were plated on p-100 and p-150 plates and expanded for 5 days in medium supplemented with G-418. This procedure was performed separately for each femur and tibia. Subpopulations were quantified under the microscope after staining with violet crystal.
El análisis mediante rayos X se realizó empleando un Faxitron MX-20 con una película de elevada sensibilidad MNR-2000 (Kodak) , empleando una exposición de 2OkW y 20 segundos y 2 x aumentos.The X-ray analysis was performed using a Faxitron MX-20 with a high sensitivity film MNR-2000 (Kodak), using an exposure of 2OkW and 20 seconds and 2 x magnifications.
Estas películas fueron escaneadas y el análisis de la imagen se realizó empleando ScanAnalys®, determinando el % de área metastásica de hueso/área total de hueso.These films were scanned and image analysis was performed using ScanAnalys®, determining the% metastatic bone area / total bone area.
ResultadosResults
Se desarrolló una estrategia sistemática para desarrollar un modelo nuevo de células de cáncer de pulmón no microcítico con un tropismo específico a hueso. En primer lugar se analizó la expresión de diversos genes previamente relacionados con fenómenos de metástasis en otros modelos, incluyendo galectina-3, PTHrP, MIP-Ia, MMP- 2, CTGF y osteopontina (FIGURA 1) . Por otro lado se comprobó la capacidad de migración hacia un 10% o 0,4% de suero (FCS) en una cámara de Boyden (FIGURA 2) . En función de estos dos criterios se seleccionaron cuatro lineas celulares de cáncer de pulmón no microcitico: A549, H157, HTB58 y H460, para analizar su capacidad de metastatizar en un modelo in vivo.A systematic strategy was developed to develop a new model of non-small cell lung cancer cells with bone-specific tropism. First, the expression of several genes previously related to phenomena of metastasis in other models, including galectin-3, PTHrP, MIP-Ia, MMP-2, CTGF and osteopontin (FIGURE 1). On the other hand, the migration capacity towards 10% or 0.4% of serum (FCS) in a Boyden chamber (FIGURE 2) was checked. Based on these two criteria, four non-small cell lung cancer cell lines were selected: A549, H157, HTB58 and H460, to analyze their ability to metastasize in an in vivo model.
En primer lugar se realizó una transfección estable con el gen reportero de la luciferasa (CMV-luc) para poder monitorizar el tropismo mediante la obtención de imágenes por bioluminiscencia in vivo. Estas células fueron inoculadas en el ventrículo izquierdo del corazón de ratones atimicos desnudos. Cada dos semanas la bioluminiscencia fue monitorizada in vivo mediante la inyección de D-luciferina (3 mg/lOOμl, Xenogen Inc.). El desarrollo de las metástasis fue diferente para cada linea celular, en términos de especificidad de tejidos, incidencia y periodo de latencia (FIGURA 3) . Las curvas Kaplan-Meier de monitorización de supervivencia libre de metástasis mostraron un patrón diferente de progresión de las metástasis entre las diferentes lineas celulares.First, a stable transfection was performed with the luciferase reporter gene (CMV-luc) in order to monitor tropism by obtaining bioluminescence imaging in vivo. These cells were inoculated in the left ventricle of the heart of nude atomic mice. Every two weeks the bioluminescence was monitored in vivo by injection of D-luciferin (3 mg / lOOμl, Xenogen Inc.). The development of metastases was different for each cell line, in terms of tissue specificity, incidence and latency period (FIGURE 3). Kaplan-Meier curves for metastasis-free survival monitoring showed a different pattern of metastasis progression between different cell lines.
A pesar de poseer patrones de expresión de genes relacionados con metástasis semejantes, las metástasis alcanzaron diferentes órganos específicos. La linea parental A549 produjo lesiones metastásicas significativas en los huesos largos en 4 de 8 de los animales estudiados, y en las vértebras (Figura A) . También fue detectada una bioluminiscencia difusa que sugiere una potencial colonización de otros huesos. 4 de los 8 animales mostraron una reducción dramática de la movilidad de las extremidades, sugiriendo un defecto en la médula espinal. Mediante un examen de rayos X, se observó una osteolisis intensa en combinación con una osteogénesis de novo en la columna vertebral (Figura 5A) . Por el contrario, la inyección de células H460 en ratones desnudos desencadenó la aparición de luz intensa en las extremidades inferiores de 2 de 8 animales (Figura 4) . El análisis mediante rayos X mostró la presencia de lesiones osteoliticas dramáticas frecuentemente localizadas en las metáfisis tibiales proximales y femorales distales (Figura 5B) .Despite having patterns of gene expression related to similar metastases, metastases reached different specific organs. The A549 parental line produced significant metastatic lesions in the long bones in 4 of 8 of the animals studied, and in the vertebrae (Figure A). A diffuse bioluminescence that suggests a potential colonization of other bones was also detected. 4 of the 8 animals showed a dramatic reduction in limb mobility, suggesting a defect in the spinal cord. Through an X-ray examination, an intense osteolysis was observed in combination with a de novo osteogenesis in the spine (Figure 5A). On the contrary, the H460 cell injection in nude mice triggered the appearance of intense light in the lower extremities of 2 of 8 animals (Figure 4). X-ray analysis showed the presence of dramatic osteolytic lesions frequently located in the proximal tibial and distal femoral metaphyses (Figure 5B).
La linea parental B727 mostró bioluminiscencia en sitios compatibles con una localización ósea en 7 de 8 animales (Figura 6) . La inoculación intracardiaca de células HTB58 induce la formación de tumores en la región dorsal de la escápula en 5 de los 7 animales estudiados (Figura 6) .The B727 parental line showed bioluminescence at sites compatible with a bone location in 7 of 8 animals (Figure 6). Intracardiac inoculation of HTB58 cells induces the formation of tumors in the dorsal region of the scapula in 5 of the 7 animals studied (Figure 6).
Para monitorizar señales de caquexia, el peso fue examinado durante todo el periodo. Curiosamente, en la linea parental H460, la detección de bioluminiscencia en huesos largos y una manifiesta metástasis detectada mediante rayos X, se correlacionan con caquexia. Sin embargo, HTB58 y H1299 incluso con una masa tumoral prominente no presentaban alteraciones en su masa corporal. Adicionalmente, animales inoculados con células H727, una linea parental que mostró un elevado tropismo a hueso, no presentaban señales de caquexia en el momento en que se detectaban profundas lesiones osteoliticas mediante rayos X. Para establecer lineas celulares con capacidad metastásica, las células parentales fueron transfectadas de forma estable con un gen de resistencia a la geneticina. Estas células fueron inoculadas por via intracardiaca en ratones desnudos atimicos (Figura 7). Tras lavar la médula de los huesos largos de dichos animales, las células de médula se expandieron en cultivo, y se obtuvieron diversas colonias de células de cáncer de pulmón no microcitico resistentes a la geneticina en cultivo. Células procedentes de las colonias resistentes obtenidas en el paso anterior fueron reinoculadas en ratones atimicos desnudos. Este procedimiento permitió el aislamiento de subpoblaciones altamente metastásicas en comparación con la linea celular parental . Asi se seleccionaron subpoblaciones con un periodo de latencia menor, una elevada incidencia y una mayor capacidad de formar lesiones óseas con mayor carga tumoral (Figura 7).To monitor signs of cachexia, the weight was examined throughout the period. Interestingly, in the parental line H460, the detection of bioluminescence in long bones and a manifest metastasis detected by X-rays, correlate with cachexia. However, HTB58 and H1299 even with a prominent tumor mass did not show alterations in their body mass. Additionally, animals inoculated with H727 cells, a parental line that showed a high tropism to bone, did not show signs of cachexia at the time when deep osteolytic lesions were detected by X-rays. To establish cell lines with metastatic capacity, the parental cells were stably transfected with a geneticin resistance gene. These cells were inoculated intracardiacly in nude nude mice (Figure 7). After washing the marrow of the long bones of said animals, the marrow cells were expanded in culture, and various colonies of non-small cell lung cancer cells resistant to the geneticin in culture were obtained. Cells from the resistant colonies obtained in the previous step were realmized in nude atomic mice. This procedure allowed the isolation of highly metastatic subpopulations compared to the parental cell line. Thus, subpopulations were selected with a lower latency period, a high incidence and a greater capacity to form bone lesions with a higher tumor load (Figure 7).
Esta estrategia se siguió con las líneas parentales H727, H460 y A549. En la Figura 8 se muestran las curvas Kaplan-Meier para diferentes subpoblaciones de H460. Tal y como se esperaba, el aislamiento de diversas subpoblaciones tras la reinoculación intracardiaca, dio lugar a la selección de subpoblaciones altamente metastásicas con un periodo de latencia menor, y una incidencia y especificidad a hueso mayores en comparación con la línea parental. Como puede verse en la figura 9 la subpoblación M5 procedente de la línea H460 muestra una elevada carga tumoral tras el aislamiento y recuento in vitro de las células de la médula ósea formadoras de colonias (SCC, single cell colonies) metastaticidad y capacidad de crecimiento al estudiar el número de subpoblaciones aisladas in vitro en comparación con la línea parental o transfectada con CMV-Luc . El área de lesión osteolítica metastásica en las subpoblaciones Ml, M4 y M5 fue también mayor que la población parental (Figura 10) .This strategy was followed with parental lines H727, H460 and A549. The Kaplan-Meier curves for different subpopulations of H460 are shown in Figure 8. As expected, the isolation of various subpopulations after intracardiac renewing, resulted in the selection of highly metastatic subpopulations with a lower latency period, and a greater incidence and specificity to bone compared to the parental line. As can be seen in Figure 9, subpopulation M5 from the H460 line shows a high tumor burden after isolation and in vitro count of colony-forming bone marrow cells (SCC, single cell colonies) metastaticity and growth capacity at study the number of subpopulations isolated in vitro compared to the parental line or transfected with CMV-Luc. The area of metastatic osteolytic lesion in subpopulations Ml, M4 and M5 was also larger than the parental population (Figure 10).
Con la subpoblación Ml procedente de la línea parental A549 se obtuvieron resultados comparables (Figura 11). De forma semejante se muestran los resultados obtenidos para la línea A549 (Figura 11, 12 y 13) . Para todas las líneas parentales, se obtuvo al menos una subpoblación que mostraba tropismo a hueso de elevada especificidad, un periodo de latencia corto que variaba entre 9 y 20 días, y una elevada reproducibilidad. Curiosamente, el área metastásica determinada mediante rayos X no siempre correlaciona con el número de subpoblaciones aisladas después del lavado de médula. Por ejemplo, las células A549 desarrollan lesiones óseas en 29 días, mientras que la línea H727 muestra metástasis prominentes determinadas por rayos X en 59 días, como puede verse en la Figura 14. El número de subpoblaciones aisladas a partir de un grupo de 7 animales inoculados con H727 era extremadamente bajo, comparado con los animales inoculados con células A549.Comparable results were obtained with subpopulation Ml from the parental line A549 (Figure 11). Similarly, the results obtained for line A549 are shown (Figure 11, 12 and 13). For all parental lines, at least one subpopulation was obtained that showed tropism to bone of high specificity, a short latency period that varied between 9 and 20 days, and a high reproducibility. Interestingly, the metastatic area determined by X-rays does not always correlate with the number of isolated subpopulations after bone marrow. For example, A549 cells develop bone lesions in 29 days, while the H727 line shows prominent metastases determined by X-rays in 59 days, as can be seen in Figure 14. The number of subpopulations isolated from a group of 7 animals inoculated with H727 was extremely low, compared to animals inoculated with A549 cells.
También se realizó el experimento descritoThe experiment described was also performed
) anteriormente con la línea H727 correspondiente a un tumor carcinoide, y se obtuvieron subpoblaciones más metastásicas que la población parental . Como se observa en la figura 17 A, las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier realizadas 42 días tras la inoculación de las células mostraron una disminución significativa en la supervivencia de los ratones inoculados con las subpoblaciones altamente metastásicas M4/M2, M4/M5, M5/M2 y M5/M4 con respecto a la población parental y la población transfectada con el plásmido de luciferasa (ON-Luc) . Asimismo, el área de lesión osteolítica fue superior muy significativamente en las lesiones inducidas en los huesos largos de las extremidades de los ratones inoculados con las subpoblaciones altamente metastásicas (Figura 17 B) . Estos resultados sustentan de forma fidedigna la mayor capacidad metastásica a hueso de las subpoblaciones M4/M2, M4/M5, M5/M2 y M5/M4 derivadas de H727.) previously with the H727 line corresponding to a carcinoid tumor, and more metastatic subpopulations were obtained than the parental population. As seen in Figure 17 A, Kaplan-Meier survival curves performed 42 days after cell inoculation showed a significant decrease in the survival of mice inoculated with highly metastatic subpopulations M4 / M2, M4 / M5, M5 / M2 and M5 / M4 with respect to the parental population and the population transfected with the luciferase plasmid (ON-Luc). Likewise, the area of osteolytic lesion was significantly higher in the lesions induced in the long bones of the limbs of the mice inoculated with the highly metastatic subpopulations (Figure 17 B). These results reliably support the greater bone metastatic capacity of subpopulations M4 / M2, M4 / M5, M5 / M2 and M5 / M4 derived from H727.
Mediante un examen histológico se detectaron diferencias sutiles entre las tres líneas parentales H460, H727 y A549. Aunque la localización era similar, el examen histológico reveló patrones específicos de invasión y colonización. Las lesiones de las tres líneas parentales se encontraban en las extremidades inferiores. Las lesiones causadas por H460 siempre aparecían en las metáfisis tibiales proximales y femorales distales. La superficie subperióstica es una diana frecuente de metástasis, especialmente alrededor de la región epifisial. El crecimiento de los tumores periostios progresa entre el periostio y el hueso cortical, frecuentemente induciendo una osteogénesis reactiva en el hueso cortical. Tanto la linea A549 como H460 inducen una nueva formación osteoide desde el periostio de la región epifisio-metafisiaria. En la médula ósea, la progresión de las lesiones está dirigida por el crecimiento tumoral colonizando la médula y destruyendo la esponjosa primaria. En contraste con H460, la linea A549 posee la capacidad de dirigirse a las vértebras además de a las extremidades inferiores. En las regiones tibiales proximales y femorales distales, las lesiones osteoliticas macroscópicas podian detectarse en el hueso cortical, surgiendo del periosteo y progresando hacia la médula. Mediante tinción TRAP se detectó una fuerte actividad osteoclástica en el endostio (Figura 15) .Subtle differences between the three parental lines H460, H727 and A549 were detected by histological examination. Although the location was similar, the histological examination revealed specific patterns of invasion and colonization. Lesions of the three parental lines were in the lower extremities. Lesions caused by H460 always appeared in the metaphyses proximal tibial and distal femoral. The subperiosteal surface is a frequent target of metastasis, especially around the epiphyseal region. The growth of periosteal tumors progresses between the periosteum and the cortical bone, often inducing a reactive osteogenesis in the cortical bone. Both line A549 and H460 induce a new osteoid formation from the periosteum of the epiphyseal-metaphyseal region. In the bone marrow, the progression of the lesions is driven by tumor growth by colonizing the bone marrow and destroying the primary spongy. In contrast to H460, the A549 line has the ability to target the vertebrae in addition to the lower extremities. In the proximal tibial and distal femoral regions, macroscopic osteolytic lesions could be detected in the cortical bone, arising from the periosteum and progressing to the medulla. A strong osteoclastic activity was detected in the endostium by TRAP staining (Figure 15).
Por último, se realizó el mismo procedimiento con las lineas celulares H157 y H1299, dos lineas celulares de cáncer de pulmón no microcitico que expresaban el perfil metastásico descrito al principio de este ejemplo y que poseen capacidad de migración a suero en cámaras de Boyden. Sin embargo, estas dos lineas celulares no dieron lugar a metástasis óseas tras su inoculación intracardiaca en animales modelo. Poniendo asi de manifiesto que la especificidad del tropismo a hueso es lo que representa la actividad inventiva necesaria para desarrollar el modelo objeto de la presente invención.Finally, the same procedure was performed with the H157 and H1299 cell lines, two non-small cell lung cancer cells that expressed the metastatic profile described at the beginning of this example and that have serum migration capacity in Boyden chambers. However, these two cell lines did not give rise to bone metastases after intracardiac inoculation in model animals. Thus showing that the specificity of bone tropism is what represents the inventive activity necessary to develop the model object of the present invention.
EJEMPLO 2: Desarrollo de un modelo animal de metástasis a hueso de cáncer de pulmón no microcitico. Material y métodosEXAMPLE 2: Development of an animal model of bone metastasis of non-small cell lung cancer. Material and methods
Como lineas celulares se han empleado las lineas H460 subpoblación M5, A549 subpoblación Ml/Ml y H727 subpoblación M5/M2, las cuales fueron crecidas en RPMI al 10% FBS, suplementario con 0,4 mg/ml de G418.The H460 subpopulation M5, A549 subpopulation Ml / Ml and H727 lines have been used as cell lines subpopulation M5 / M2, which were grown in RPMI at 10% FBS, supplemented with 0.4 mg / ml G418.
Se emplearon hembras de ratones nu/nu de 4 semanas de edad, que fueron anestesiados con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) previamente a la inyección intracardiaca .Female 4-week-old nu / nu mice were used, which were anesthetized with ketamine (100 mg / kg) and xylazine (10 mg / kg) prior to intracardiac injection.
ResultadosResults
Para desarrollar un nuevo modelo animal de metástasis a hueso con tropismo especifico a hueso, se emplearon aquellas lineas celulares obtenidas en el ejemplo 1.To develop a new animal model of bone metastasis with bone-specific tropism, those cell lines obtained in example 1 were used.
El procedimiento consistió en inyectar 200,000 células de una de las lineas celulares H460 subpoblación M5 (ECACCThe procedure consisted of injecting 200,000 cells from one of the H460 subpopulation M5 cell lines (ECACC
06091547), A549 subpoblación Ml/Ml (ECACC 06091546) y H727 subpoblación M5/M2 (ECACC 06091545), en 100 μl de PBS, con una viabilidad superior al 95%, en el ventrículo izquierdo de un ratón atimico nu/nu.06091547), A549 subpopulation Ml / Ml (ECACC 06091546) and H727 subpopulation M5 / M2 (ECACC 06091545), in 100 μl of PBS, with a viability greater than 95%, in the left ventricle of an atomic mouse nu / nu.
Tras un periodo de latencia de 7 dias, este animal puede considerarse un modelo de metástasis ósea de cáncer de pulmón que puede emplearse para estudiar el desarrollo de dichas metástasis, para ensayar el efecto de potenciales agentes antimetastásicos, etc.After a latency period of 7 days, this animal can be considered a model of bone metastasis of lung cancer that can be used to study the development of such metastases, to test the effect of potential antimetastatic agents, etc.
EJEMPLO 3: Perfil de expresión genética asociada con la metástasis ósea.EXAMPLE 3: Profile of genetic expression associated with bone metastasis.
Se realizaron análisis de la expresión genética en células de subpoblaciones derivadas de las líneas celularesAnalysis of the genetic expression in cells of subpopulations derived from cell lines
H460, H727 y A459 seleccionadas por su capacidad de generar metástasis óseas. En todos los casos se realizó un análisis de expresión diferencial frente a la linea parental de la que se derivaron.H460, H727 and A459 selected for their ability to generate bone metastases. In all cases a differential expression analysis was performed against the parental line from which they were derived.
Para cada subpoblación celular se realizaron 3 extracciones de mRNA independientes y se formó un "pool" para posteriormente realizar una hibridación en un Chip comercial (Genechip U133A 2.0, affymetrix, CA, USA).For each cell subpopulation 3 independent mRNA extractions were performed and a "pool" was formed to subsequently hybridize in a Chip commercial (Genechip U133A 2.0, affymetrix, CA, USA).
Posteriormente, se aplicó el algoritmo RMA (Robust microarray análisis) (Irizarry et al. Nucleic Acids Res.,Subsequently, the RMA algorithm (Robust microarray analysis) (Irizarry et al. Nucleic Acids Res.,
2003, 31: el5) para la corrección del fondo, normalización y cálculo de la expresión para cada juego de sondas, utilizando la herramienta informática R y bioconductor2003, 31: el5) for the correction of the background, normalization and calculation of the expression for each set of probes, using the computer tool R and bioconductor
(www.bioconductor.org). Tras el cálculo de la expresión para cada juego de sondas se empleó otro algoritmo para emplear aquellas sondas que mostraban una expresión diferencial significativa entre muestras metastásicas y control. Se empleó SAM (Significance Analysis of Microarrays) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) que emplea permutaciones para chequear la estabilidad de las variables que cumplen la hipótesis alternativa, es decir, la hipótesis que indica la existencia de una diferencia significativa en la expresión de un gen dado entre las muestras a analizar y las muestras control. Al mismo tiempo, este método calcula el error tipo I o número de falsos positivos esperados empleando el cálculo del parámetro FDR (False Discovery Rate) . Se estableció un valor de corte de FDR <0.2 calculado para el grupo de significantes junto con un valor p<0,0006 para cada gen individual. De este modo, la matriz de valores de expresión correspondiente a las sondas que mostraban una expresión diferencial, fue analizada mediante el algoritmo hclust insertado en el programa R (wwww.bioconductor.org) Este algoritmo realiza un análisis de grupo aglomerativo jerárquico para encontrar la similaridad entre juegos de sondas basado en sus valores de expresión. Este algoritmo se emplea para clasificar los juegos de sondas en grupos con perfiles de expresión similares.(www.bioconductor.org). After calculating the expression for each set of probes another algorithm was used to employ those probes that showed a significant differential expression between metastatic and control samples. SAM (Significance Analysis of Microarrays) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) was used, which uses permutations to check the stability of the variables that meet the alternative hypothesis, that is, the hypothesis that indicates the existence of a significant difference in the expression of a given gene between the samples to be analyzed and the control samples. At the same time, this method calculates the type I error or number of false positives expected using the calculation of the FDR (False Discovery Rate) parameter. A cut-off value of FDR <0.2 calculated for the group of signifiers was established along with a p value <0.0006 for each individual gene. Thus, the matrix of expression values corresponding to the probes that showed a differential expression was analyzed using the hclust algorithm inserted in the R program (wwww.bioconductor.org) This algorithm performs a hierarchical agglomerative group analysis to find the similarity between sets of probes based on their expression values. This algorithm is used to classify probe sets into groups with similar expression profiles.
ResultadosResults
Con el objeto de identificar genes implicados en el comportamiento metastásico de las lineas celulares altamente metastásicas en comparación con células parentales, se emplearon "microarrays" humanos.In order to identify genes involved in the metastatic behavior of cell lines highly metastatic compared to parental cells, human "microarrays" were used.
Para la línea H460 se analizó la expresión génica de las subpoblaciones Ml, M4 y M5. Los genes expresados diferencialmente fueron seleccionados realizando un contraste en condiciones altamente restrictivas mediante el algoritmo descrito previamente (Irizarry, 2003) y FDR<0.02. Las subpoblaciones altamente metastásicas mostraron un patrón transcripcional único de 43 genes. La mayoría de estos genes se encontraban sobrexpresados más de 1,5 veces. Estas proteínas incluyen MCAM, una molécula de adhesión transmembrana previamente asociada con metástasis de melanoma. Dos componentes intracelulares también fueron identificados: TCF4, un factor de transcripción, y PKD3, una serín/treonín quinasa poco caracterizada. Adicionalmente se determinaron dos proteínas putativas transmembrana relacionadas con las interacciones célula/matriz, incluyendo SUSD5, una proteína perteneciente a la superfamilia de "dominios de unión" que contiene dominios de unión a ácido hialuróníco, y KIAA0960 una proteína desconocida que contiene un dominio GON-I y diversas repeticiones de trombospondina. Algunos genes poseían una expresión significativamente inferior, entre ellos CSF2RA, GDF15, STC2, NID, EXT, TGF-β, y NFκB2. Para estudiar la contribución de estos genes a la capacidad metastásica de las subpoblaciones celulares altamente metastásicas, se seleccionaron los 5 genes que mostraban mayor sobrexpresión y mayor significación estadística. A continuación, se generaron grupos de células transducidas con uno de esos genes y diferentes combinaciones cié transducidos dobles y triples. Aquellas células que sólo sobrexpresaban MCAM no mostraron un incremento significativo de su capacidad de formar metástasis a hueso en comparación con la línea celular parental, aunque el análisis por rayos X dio un valor al limite de la significancia. Por el contrario, los animales inoculados con células que sobrexpresaban PKC, TCF4 y SUSD5 mostraron un incremento significativo moderado en su capacidad prometastásica en comparación con la linea celular parental. Sin embargo, las combinaciones génicas triples sobreexpresadas en la linea celular parental H460 mostraron un incremento dramático en la incidencia y agresividad de las lesiones metastásicas (Figura 16). Las actividades combinadas de estos genes incrementaron la metástasis ósea.For the H460 line the gene expression of the subpopulations Ml, M4 and M5 was analyzed. Differentially expressed genes were selected by contrasting under highly restrictive conditions using the algorithm described previously (Irizarry, 2003) and FDR <0.02. Highly metastatic subpopulations showed a unique transcriptional pattern of 43 genes. Most of these genes were overexpressed more than 1.5 times. These proteins include MCAM, a transmembrane adhesion molecule previously associated with melanoma metastases. Two intracellular components were also identified: TCF4, a transcription factor, and PKD3, a poorly characterized serine / threonine kinase. Additionally, two putative transmembrane proteins related to cell / matrix interactions were determined, including SUSD5, a protein belonging to the "binding domains" superfamily containing hyaluronic acid binding domains, and KIAA0960 an unknown protein containing a GON- domain. I and various thrombospondin repeats. Some genes had a significantly lower expression, including CSF2RA, GDF15, STC2, NID, EXT, TGF-β, and NFκB2. To study the contribution of these genes to the metastatic capacity of highly metastatic cell subpopulations, the 5 genes that showed greater overexpression and greater statistical significance were selected. Next, groups of transduced cells with one of those genes and different combinations of double and triple transduced cells were generated. Those cells that only overexpressed MCAM did not show a significant increase in their ability to form bone metastases compared to the cell line parental, although the X-ray analysis gave a value to the limit of significance. In contrast, animals inoculated with cells that overexpressed PKC, TCF4 and SUSD5 showed a significant moderate increase in their promtastatic capacity compared to the parental cell line. However, triple gene combinations overexpressed in the H460 parental cell line showed a dramatic increase in the incidence and aggressiveness of metastatic lesions (Figure 16). The combined activities of these genes increased bone metastasis.
Se comprobó que estas células transíectantes crecían a un ritmo similar a la linea celular parental en cultivo e in vivo tras su inyección subcutánea. Lo que quiere decir que su mayor actividad destructora de hueso no se debe simplemente a la reproliferación más rápida de células, sino a su efecto especifico en el hueso.It was found that these transient cells grew at a rate similar to the parental cell line in culture and in vivo after subcutaneous injection. Which means that its greater activity of bone destruction is not simply due to the faster reproliferation of cells, but to its specific effect on the bone.
En el caso de la linea A549, se analizó la expresión génica de las subpoblaciones Ml, Ml /Ml y Ml /M3, de manera similar a como se realizó para las subpoblaciones de la linea H460. Las subpoblaciones altamente metastásicas mostraron 6 genes que se encontraban sobrexpresados más de 1,5 veces. Estos genes incluyen ILIl que codifica una citoquina de la familia gpl30, PITXl codificante de un factor que actúa como regulador transcripcional, HDAC4 que codifica la histona deacetilasa 4 implicada en el ciclo celular, el encogen RHOB , ROBOl un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas y SLC26A2 codificante de una proteina de membrana. Del mismo modo, en el caso de la línea H727 se analizó la expresión génica de las subpoblaciones M4/M2, M4/M3, M2/M5 y M5/M4. Las subpoblaciones altamente metastásicas mostraron 5 genes diferencialmente sobrexpresados : GAL que codifica la proteina Galanina (neuropéptido) , SPOCK2 una proteina de la familia de proteoglicanos que se une al Ca (2+) , CRIP2 codificante de la proteina rica en cisteina 2, ELF5 un factor de transcripción y EPCR codificante del receptor endotelial de proteina C.In the case of the A549 line, the gene expression of the subpopulations Ml, Ml / Ml and Ml / M3 was analyzed, in a similar way as it was done for the subpopulations of the H460 line. Highly metastatic subpopulations showed 6 genes that were overexpressed more than 1.5 times. These genes include ILIl encoding a cytokine of the gpl30 family, PITXl encoding a factor that acts as a transcriptional regulator, HDAC4 encoding the histone deacetylase 4 involved in the cell cycle, the RHOB shrink, ROBOl a member of the immunoglobulin superfamily and SLC26A2 encoding a membrane protein. Similarly, in the case of the H727 line, the gene expression of the subpopulations M4 / M2, M4 / M3, was analyzed. M2 / M5 and M5 / M4. Highly metastatic subpopulations showed 5 differentially overexpressed genes: GAL encoding the Galanin protein (neuropeptide), SPOCK2 a protein from the family of proteoglycans that binds to Ca (2+), CRIP2 encoding the cysteine-rich protein 2, ELF5 a transcription factor and EPCR encoding the endothelial protein C receptor.
EJEMPLO 4: Ensayo de potenciales agentes antimetastásicos en las lineas celulares y/o modelo animal descrito en los ejemplos anteriores.EXAMPLE 4: Test of potential antimetastatic agents in cell lines and / or animal model described in the previous examples.
Se inyectaron 200.000 células de una de las lineas H460 subpoblación M5 (ECACC 06091547), A549 subpoblación Ml/Ml (ECACC 06091546) o H727 subpoblación M5/M2 (ECACC 06091545), en 100 μl de PBS, con una viabilidad superior al 95%, en el ventrículo izquierdo de un ratón nu/nu.200,000 cells of one of the lines H460 subpopulation M5 (ECACC 06091547), A549 subpopulation Ml / Ml (ECACC 06091546) or H727 subpopulation M5 / M2 (ECACC 06091545), in 100 µl of PBS, were injected with a viability greater than 95% , in the left ventricle of a mouse nu / nu.
Tras un periodo de latencia de 7 dias, este animal puede considerarse un modelo de metástasis ósea de cáncer de pulmón. Una vez transcurridos estos 7 dias se administra el agente antimetastásico a estudiar, siguiendo un régimen de administración previamente diseñado. A los 21 dias después de la inoculación se sacrifica el animal. Mediante el estudio comparado de los fémures de animales que han recibido el antimetastásico y animales control (que han desarrollado la metástasis sin ningún tratamiento adicional o habiendo recibido dosis de vehículo) puede determinarse la actividad antimetastásica del agente en cuestión. After a latency period of 7 days, this animal can be considered a model of bone metastasis of lung cancer. After these 7 days the antimetastatic agent to be studied is administered, following a previously designed administration regimen. At 21 days after inoculation the animal is sacrificed. By comparing the femurs of animals that have received the antimetastatic and control animals (who have developed the metastasis without any additional treatment or having received vehicle doses) the antimetastatic activity of the agent in question can be determined.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico caracterizada porgue posee la capacidad de metastatizar a hueso con una eficiencia de al menos el 90% y porque ha sido obtenida mediante administración por vía intracardiaca de células tumorales en un animal no humano .1. A non-small cell lung cancer cell line characterized by having the ability to metastasize to bone with an efficiency of at least 90% and because it has been obtained by intracardiac administration of tumor cells in a non-human animal.
2. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 1, caracterizada porque posee un periodo de latencia entre 9 a 12 días y porque ha sido obtenida mediante administración por vía intracardiaca de células tumorales en un animal no humano . 2. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 1, characterized in that it has a latency period between 9 to 12 days and because it has been obtained by intracardiac administration of tumor cells in a non-human animal.
3. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque dicho cáncer se ha seleccionado entre una línea de carcinoma de células grandes, carcinoide y carcinoma broncoalveolar . 3. A non-small cell lung cancer cell line according to one of claims 1 or 2, characterized in that said cancer has been selected from a line of large cell carcinoma, carcinoid and bronchoalveolar carcinoma.
4. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según una de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizada porque es una línea de carcinoma de células grandes que sobreexpresa al menos 3 genes seleccionados entre TCF4 , PKD3, MCAM, SUSD5 y KIAA0960. 4. A non-small cell lung cancer cell line according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is a large cell carcinoma line that overexpresses at least 3 genes selected from TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and KIAA0960.
5. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 4, caracterizada porque sobreexpresa los genes TCF4 , PKD3 , MCAM, SUSD5 y5. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 4, characterized in that it overexpresses the genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and
KIAA0960.KIAA0960.
6. Una línea celular de carcinoma de células grandes de pulmón, caracterizada porque dicha línea celular se ha obtenido mediante la transducción de células parentales con al menos 3 de los genes TCF4 , PKD3 , MCAM, SUSD5 y KIAA0960.6. A large cell lung carcinoma cell line, characterized in that said cell line has been obtained by transducing parental cells with at least 3 of the genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and KIAA0960.
7. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 4, caracterizada porque es la línea NCI-H460 subpoblación M5 (ECACC 06091547) .7. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 4, characterized in that it is the N5-H460 subpopulation M5 line (ECACC 06091547).
8. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según una de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizada porgue es una línea de carcinoide que sobreexpresa al menos 3 genes seleccionados entre GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR.8. A non-small cell lung cancer cell line according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is a carcinoid line that overexpresses at least 3 genes selected from GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR.
9. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 8 , caracterizada porque sobreexpresa los genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR.9. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 8, characterized in that it overexpresses the GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR genes.
10. Una línea celular de carcinoide, caracterizada porque dicha línea celular se ha obtenido mediante la transducción de células parentales con al menos 3 de los genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR.10. A carcinoid cell line, characterized in that said cell line has been obtained by transducing parental cells with at least 3 of the GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR genes.
11. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 8, caracterizada porque es la línea H727 subpoblación M5/M2 (ECACC 06091545) .11. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 8, characterized in that it is the H727 subpopulation M5 / M2 line (ECACC 06091545).
12. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque es una línea de adenocarcinoma broncoalveolar que sobreexpresa al menos 3 genes seleccionados entre ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2.12. A non-small cell lung cancer cell line according to one of claims 1 to 3, characterized in that it is a bronchoalveolar adenocarcinoma line that overexpresses at least 3 genes selected from ILI1, PITX1, HDAC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2.
13. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 12, caracterizada porque sobreexpresa los genes ILlI, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2. 13. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 12, characterized in that it overexpresses the ILlI, PITX1, HDAC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2 genes.
14. Una línea celular de adenocarcinoma broncoalveolar, caracterizada porque dicha línea celular se ha obtenido mediante la transducción de células parentales con al menos 3 de los genes ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2.14. A bronchoalveolar adenocarcinoma cell line, characterized in that said cell line has been obtained by transducing parental cells with at least 3 of the ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2 genes.
15. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según la reivindicación 12, caracterizada porgue es la línea A549 subpoblación Ml/Ml (ECACC 06091546).15. A non-small cell lung cancer cell line according to claim 12, characterized in that it is line A549 subpopulation Ml / Ml (ECACC 06091546).
16. Una línea celular de cáncer de pulmón no microcítico según una de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizada porque dicha línea celular está seleccionada entre: NCI-H460 subpoblación M5 (ECACC 06091547) , H727 subpoblación M5/M2 (ECACC 06091545) y A549 subpoblación Ml/Ml (ECACC 06091546) .16. A non-small cell lung cancer cell line according to one of claims 1 to 3, characterized in that said cell line is selected from: NCI-H460 subpopulation M5 (ECACC 06091547), H727 subpopulation M5 / M2 (ECACC 06091545) and A549 subpopulation Ml / Ml (ECACC 06091546).
17. Procedimiento para obtener una línea celular descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende: a) inyectar por vía intracardiaca en un animal no humano células derivadas de una línea parental procedente de dicho cáncer de pulmón previamente transfectada con un gen de selección; y b) aislar, expandir en cultivo y seleccionar las células tumorales de las metástasis óseas generadas en dicho animal .17. Method for obtaining a cell line described in any one of claims 1 to 16, characterized in that it comprises: a) intracardiac injection into a non-human animal cells derived from a parental line from said lung cancer previously transfected with a selection gene; and b) isolate, expand in culture and select tumor cells from bone metastases generated in said animal.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque además comprende : a) inyectar por vía intracardiaca las células obtenidas en el paso b en un animal no humano, y b) aislar, expandir en cultivo y seleccionar las células tumorales de las metástasis óseas generadas en dicho animal. 18. Method according to claim 17, characterized in that it further comprises: a) intracardiac injection of the cells obtained in step b in a non-human animal, and b) isolate, expand in culture and select tumor cells from bone metastases generated in said animal.
19. Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho gen de selección es un gen de resistencia a antibiótico, y un gen que codifica luciferasa. 19. Method according to claim 17, characterized in that said selection gene is an antibiotic resistance gene, and a gene encoding luciferase.
20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la línea celular a inyectar en el animal no humano se deriva de un carcinoma de células grandes, y porque dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobreexpresan al menos 3 genes seleccionados entre: TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 y KIAAO960.20. Method according to any one of claims 17 to 19, characterized in that the cell line to be injected into the non-human animal is derived from a large cell carcinoma, and that said method comprises selecting cells that overexpress at least 3 genes selected from : TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and KIAAO960.
21. Procedimiento según la reivindicación 20, caracterizado porque comprende seleccionar las células que sobreexpresan los genes TCF4 , PKD3 , MCAM, SUSD5 y KIAA0960.21. Method according to claim 20, characterized in that it comprises selecting the cells that overexpress the genes TCF4, PKD3, MCAM, SUSD5 and KIAA0960.
22. Procedimiento según una de las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque la línea celular a inyectar en el animal no humano se ha obtenido mediante la transducción de células parentales de carcinoma de células grandes con al menos 3 de los genes TCF4 , PKD3, MCAM, SUSD5 y KIAAO960.22. Method according to one of claims 20 or 21, characterized in that the cell line to be injected into the non-human animal has been obtained by transducing parental cells of large cell carcinoma with at least 3 of the genes TCF4, PKD3, MCAM , SUSD5 and KIAAO960.
23. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la línea celular a inyectar en el animal no humano se deriva de un carcinoide, y porque dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobreexpresan al menos 3 genes seleccionados entre: GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR. 23. Method according to any one of claims 17 to 19, characterized in that the cell line to be injected into the non-human animal is derived from a carcinoid, and that said method comprises selecting cells that overexpress at least 3 genes selected from: GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque comprende seleccionar las células que sobreexpresan los genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y24. Method according to claim 23, characterized in that it comprises selecting the cells that overexpress the genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and
EPCR.EPCR
25. Procedimiento según una de las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizado porque la línea celular a inyectar en el animal no humano se ha obtenido mediante la transducción de células parentales de un carcinoide con al menos 3 de los genes GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 y EPCR.25. Method according to one of claims 23 or 24, characterized in that the cell line to be injected into the non-human animal has been obtained by transducing parental cells of a carcinoid with at least 3 of the GAL, SPOCK2, CRIP2, ELF5 and EPCR genes.
26. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizado porque la línea celular a inyectar en el animal no humano se deriva de un adenocarcinoma broncoalveolar, y porque dicho procedimiento comprende seleccionar las células que sobreexpresan al menos 3 genes seleccionados entre-. ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2. 26. A method according to any one of claims 17 to 19, characterized in that the cell line to be injected into the non-human animal is derived from a bronchoalveolar adenocarcinoma, and that said method comprises selecting cells that overexpress at least 3 genes selected from among. ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2.
27. Procedimiento según la reivindicación 26, caracterizado porque comprende seleccionar las células que sobreexpresan los genes ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2.27. Method according to claim 26, characterized in that it comprises selecting the cells that overexpress the genes ILIl, PITX1, HDAC4, RHOB, ROBOl and SLC26A2.
28. Procedimiento según "una de las reivindicaciones 26 ó 27, caracterizado porque la línea celular a inyectar en el animal no humano se ha obtenido mediante la transducción de células parentales de adenocarcinoma broncoalveolar con al menos 3 de los genes ILIl, PITXl, HDAC4, RHOB, ROBOl y SLC26A2. 28. Method according to "one of claims 26 or 27, characterized in that the cell line to be injected into the non-human animal has been obtained by transducing parental cells of bronchoalveolar adenocarcinoma with at least 3 of the ILIl, PITX1, HDAC4 genes, RHOB, ROBOl and SLC26A2.
29. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque dichas células se derivan de una línea parental de cáncer de pulmón no microcítico seleccionado entre: NCI-H460, H727 y A549. 29. Method according to one of claims 1 to 16, characterized in that said cells are derived from a parental line of non-small cell lung cancer selected from: NCI-H460, H727 and A549.
30. Un modelo animal no humano de cáncer de pulmón no microcítico con metástasis a hueso caracterizado porque ha sido obtenido mediante administración por vía intracardiaca de células tumorales procedentes de una línea celular definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16. 30. A non-human animal model of non-small cell lung cancer with bone metastases characterized in that it has been obtained by intracardiac administration of tumor cells from a defined cell line in any one of claims 1 to 16.
31. Modelo animal no humano según la reivindicación 30, caracterizado porque dicho animal es un animal inmunodeprimido .31. Non-human animal model according to claim 30, characterized in that said animal is an immunosuppressed animal.
32. Modelo animal no humano según una de las reivindicaciones 30 ó 31, caracterizado porque dicho animal no humano es un roedor.32. Non-human animal model according to one of claims 30 or 31, characterized in that said non-human animal is a rodent.
33. Modelo animal no humano según la reivindicación 32, caracterizado porque dicho roedor es un ratón atímico desnudo (athymic mide) . 33. Non-human animal model according to claim 32, characterized in that said rodent is a nude athymic mouse (athymic measures).
34. Un procedimiento para la obtención de un modelo animal no humano de cáncer de pulmón no microcítico con metástasis a hueso caracterizado porque ha sido obtenido mediante administración por vía intracardiaca de células tutnorales procedentes de una linea celular según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.34. A method for obtaining a non-human animal model of non-small cell lung cancer with bone metastases characterized in that it has been obtained by intracardiac administration of tutnoral cells from a cell line according to any one of claims 1 to 16 .
35. Uso de una línea celular descrita en una de las reivindicaciones 1 a 16, o de un modelo animal descrito en una de las reivindicaciones 30 a 33, para ensayar la actividad antimetastásica de un compuesto. 35. Use of a cell line described in one of claims 1 to 16, or of an animal model described in one of claims 30 to 33, to test the antimetastatic activity of a compound.
36. Uso según la reivindicación 35, caracterizado porque dicho ensayo de actividad metastásica comprende: a) cultivar células de dicha línea celular con el compuesto a ensayar, y b) comparar el efecto antimetastásico producido sobre dichas células con respecto a células control tratadas con otro compuesto de referencia o que no han sido tratadas. 36. Use according to claim 35, characterized in that said metastatic activity assay comprises: a) culturing cells of said cell line with the compound to be tested, and b) comparing the antimetastatic effect produced on said cells with respect to control cells treated with another compound of reference or that have not been treated.
37. Uso según la reivindicación 35, caracterizado porque dicho ensayo de actividad antimetastásica comprende: a) administrar el compuesto a ensayar a dicho animal modelo, y b) comparar el efecto de dicho compuesto sobre los tumores de dicho animal, con los tumores de animales control tratados con otro compuesto de referencia o que no han sido tratados. 37. Use according to claim 35, characterized in that said antimetastatic activity test comprises: a) administering the test compound to said model animal, and b) compare the effect of said compound on the tumors of said animal, with the tumors of control animals treated with another reference compound or that have not been treated.
38. Uso según una de las reivindicaciones 35 a 37, caracterizado porque dicha actividad antimetastásica a ensayar está seleccionada entre: prevención de la metástasis, amortiguación de los efectos deletéreos de la metástasis, y una acción bloqueante del tropismo tejido-específico.38. Use according to one of claims 35 to 37, characterized in that said antimetastatic activity to be tested is selected from: prevention of metastasis, damping of the deleterious effects of metastasis, and a blocking action of tissue-specific tropism.
39. Uso de una línea celular descrita en una de las reivindicaciones 1 a 16, en un método para identificar marcadores asociados a cáncer de pulmón no microcítico caracterizado porque comprende comparar la presencia, ausencia, o el nivel de expresión génica en muestras de tejido tumoral de dicha linea celular, con la expresión génica en células control .39. Use of a cell line described in one of claims 1 to 16, in a method for identifying markers associated with non-small cell lung cancer characterized in that it comprises comparing the presence, absence, or level of gene expression in tumor tissue samples. of said cell line, with gene expression in control cells.
40. Uso de un modelo animal descrito en una de las reivindicaciones 30 a 33, en un método para identificar marcadores asociados a cáncer de pulmón no microcítico caracterizado porque comprende comparar la presencia, ausencia, o el nivel de expresión génica en muestras de tejido tumoral de dicho animal modelo, con la expresión génica en el tejido de un segundo animal que no ha recibido inyección de células. 40. Use of an animal model described in one of claims 30 to 33, in a method for identifying markers associated with non-small cell lung cancer characterized in that it comprises comparing the presence, absence, or level of gene expression in tumor tissue samples. of said model animal, with the gene expression in the tissue of a second animal that has not received cell injection.
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