WO2008020742A2 - Method for extracting fibrinogenic/fibrinolytic protein from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom - Google Patents

Method for extracting fibrinogenic/fibrinolytic protein from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom Download PDF

Info

Publication number
WO2008020742A2
WO2008020742A2 PCT/MN2006/000004 MN2006000004W WO2008020742A2 WO 2008020742 A2 WO2008020742 A2 WO 2008020742A2 MN 2006000004 W MN2006000004 W MN 2006000004W WO 2008020742 A2 WO2008020742 A2 WO 2008020742A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
buffer
protein
column
tris hcl
fibrinogen
Prior art date
Application number
PCT/MN2006/000004
Other languages
French (fr)
Russian (ru)
Other versions
WO2008020742A3 (en
Inventor
Georgiy Volkov
Alexiy Savchuk
Vitaly Karbovskyy
Original Assignee
Wisdom Asset Company
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wisdom Asset Company filed Critical Wisdom Asset Company
Publication of WO2008020742A2 publication Critical patent/WO2008020742A2/en
Publication of WO2008020742A3 publication Critical patent/WO2008020742A3/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/58—Reptiles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Definitions

  • the invention relates to the industry of bioactive substances and can be used in biotechnological industries, medicine and the pharmaceutical industry, namely the production of medicines and diagnostic preparations from snake venom.
  • Fibrinogen / fibrinoliptic protein-enzyme that breaks down in the bloodstream and on model systems fibrinogen and fibrin.
  • the source of fibrinogen / fibrinoliptic proteins are snake venoms, which contain only protein components and have a stable composition.
  • the composition of the poison in different snakes varies, this is due to the species specificity of the poisons, as well as to the habitat and living conditions.
  • Some methods for producing active enzymes from snake venom are known.
  • Biochemisal and thromb-lik likem apd and fibriolutis seripe roteas from spaké (Agkistrodop sakhatillis) vepom., Tohisop. -2001. -V. 39, N4. -P.555-560); from Agkistrodop asiitis poison, in which the poison dissolved in the buffer is subjected to chromatography on DEAE-Sepharose, Sephacryl S-200, and CM-Sepharose (Huapg Q., Teng M., Niu L.
  • Purificapofepofitofibf Race Spake (Agkistrodop asites) venom., Toxicon.-1999.-V.37, N7.-P.999-1013); from Agistrodop asiatica poison, in which the poison dissolved in the buffer is subjected to separation of a DEAE Sephadex A-50 anion exchanger, then chromatographed twice on Sephadex G-200 (Quaupg C, Hong J. et al. Aspirates Vpom apd its comraritiop with bvipe thrombi., Thromb.Diath.haemorrth. -1971.
  • a method is known that characterizes that the poison dissolved in the buffer solution is subjected to stepwise chromatography on Sephadex G-100, on a SM-Touorerl 650M cation exchanger with a linear gradient of sodium chloride concentration and a full gradient volume, which provide the most complete identification and separate elution of thrombin-like enzymes, then separate rechromatography of these enzymes is carried out, setting linear gradients of the concentration of sodium chloride from the elution conditions of the corresponding thrombus-like enzyme to at the previous stage, while the total volumes of these gradients were increased to a level that provides additional separation of neighboring thrombin-like enzymes, the target product is obtained in a homogeneous state after separate purification of thrombin-like enzymes on an ABA-TSK sorbent.
  • the disadvantage of the prototype is both a low level of profitability of the production process, a low level of purity and a large investment of time.
  • the basis of the invention is the task to develop a method for the isolation of fibrinogen / fibrinoliptic protein from Agkistrodop Yothoffii poison syriepsis venom, which allows affinity chromatography and the use of carriers with higher chromatographic properties and physico-chemical stability to increase the profitability of the production process and reduce the time for fibrinogen / fibrinogen / fibrinogen / protein isolation and increase its purity.
  • the problem is solved in a method for the isolation of fibrinogen / fibrinoliptic protein from Agkistrodop Yothoffii poison syriepsis poison in that affinity chromatography is performed on a column with a carrier of Serharose FF, using 1OmM Tris HCl filled with pH 8.2 as a buffer solution and applied
  • DEAE Series FF pre-equilibrated with 50 mM Tris HCl buffer with pH 8.2.
  • a 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 is passed through the column. which contains 0.12 M NaCl.
  • the fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent together with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2.
  • the protein peak containing these proteins is collected, diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with a CM Sercho FF cation exchanger, equilibrated with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, at a rate of 1 ml / min
  • These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), in the appropriate buffer.
  • a protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected and dried by lyophilization.
  • the implementation of the invention The problem is solved by the proposed method, when the parameters of the process for the isolation of fibrinogen / fibrinoliptic protein are in the range specified in the claims. When the parameters are changed in the direction of increasing or decreasing, the characteristics of the resulting preparation worsen.
  • the invention is illustrated by examples 1-3 of a specific implementation. Example 1
  • the solution of the poison is applied to a column ( ⁇ / 10, volume 7 ml) with an affinity sorbent ⁇ li Canal Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min) .
  • 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all unbound material (60 ml) is collected.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the fraction of unrelated to Vlie Serharose FF material was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 and applied to a column filled with DEAE Serharose FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), previously equilibrated with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger.
  • 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 8.2 which contains 0.12M NaCl (150 ml) is passed through the column at a speed of 2 ml / min.
  • fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent together with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the protein peak containing these enzymes is collected (20 ml), diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with a CM Sercho FF cation exchanger (Hi Tpar CM HP, lml volume), balanced with 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2b at a rate of lml / min.
  • CM Sercho FF cation exchanger Hi Tpar CM HP, lml volume
  • 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2b at a rate of lml / min.
  • These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), a volume of 20 ml, in the appropriate buffer at a speed of l ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the solution of the poison is applied to a column (C 10/10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min ) After application, 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all material unbound with the sorbent (75 ml) is collected.
  • a 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 which contains 0.12M NaCl (165 ml) is passed through the column at a speed of 2 ml / min.
  • the fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent along with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the protein peak containing these proteins is collected (20 ml), diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with a CM Sarcho FF cation exchanger (Hi Tpar CM HP, lml volume), balanced with 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2, with a speed of lml / min.
  • These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), a volume of 30 ml in the appropriate buffer at a speed of l ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected (12 ml) and dried by lyophilization.
  • Example 3 To 96 mg of Far Eastern mollusk venom, add 4.5 ml of 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 and mix until the poison is completely dissolved at 4 0 C. The dissolved poison is centrifuged at 5000 rpm at 4 0 C for 15 minutes. The precipitate is discarded and the supernatant is used for affinity chromatography.
  • the solution of the poison is applied to a column (C 10/10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min )
  • 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 is passed at a rate of 2 ml / min and all material unbound with the sorbent (53 ml) is collected.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the fraction of material unrelated to Vlhe Serofaros FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl with a pH 8.2 buffer and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), pre-equilibrated with 5OmM Tris HCl 2 buffered with a pH of 2 buffered with 2 buffered with a pH of 2 buffered with 8.2 buffer min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger.
  • 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 8.2 which contains 0.12M NaCl (150 ml) is passed through the column at a speed of 2 ml / min.
  • the fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent along with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min.
  • the optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech).
  • the protein peak containing the indicated proteins is collected (18 ml), diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with pH 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with CM Sercharose FF (Hi ⁇ par CM HP, volume lml), balanced with 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2, with a speed of lml / min. These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), with a volume of 25 ml in the appropriate buffer at a speed of l ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected (8 ml) and dried by lyophilization. Characteristic Yield, mg 9.0 mg (20%)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

The invention relates to producing bioactive substances and can be used for biotechnological production processes, in medicine and in the pharmacological industry, in particular to producing medicinal and diagnosis preparations from snake venom. The inventive method consists in carrying affinity chromatography on a column with a Blue Sepharose FF carrier using a buffer solution and in applying it to a column filled with a DEAE Sepharose FF anion exchanger, in washing out unconjugated material from a sorbent by an application buffer, in eluting a fibrinogenic/fibrinolytic protein from the sorbent, in collecting and diluting the protein peak containing said proteins, in applying said peak to a column with a CM Sepharose cation exchanger, in dividing it with a NaCl (0-0.2M) linear gradient in a corresponding buffer, in collecting the protein peak containing the fibrinogenic/fibrinolytic protein and in drying it by lyophilising.

Description

Название изобретения: Title of invention:
Способ выделения фибриногено/фибринолиптического белка из яда Аgкistrоdоп blотhоffii иssиriепsis I Меthоd fоr рrоduсtiоп оf fibriпоgеп/fibriпоlуtiс рrоtеiп frоm vепоm Аgкistrоdоп blотhоffii иssиriепsisMethod for isolating fibrinogen / fibrinoliptic protein from Agististopod blotchoffii poison syndripsis I Method forpropodophyloprotein / fibrotolipotropic blotchoff
МПК: А 61 К 35/588 IPC: A 61 K 35/58 8
Область техники к которой относится изобретенияFIELD OF THE INVENTION
Изобретение относится к промышленности биоактивных веществ и может быть использовано в биотехнологических производствах, медицине и фармацевтической промышленности, а именно к производству лекарственных и диагностических препаратов из яда змей.The invention relates to the industry of bioactive substances and can be used in biotechnological industries, medicine and the pharmaceutical industry, namely the production of medicines and diagnostic preparations from snake venom.
Уровень техникиState of the art
Фибриногено/фибринолиптический белок-фермент, расщепляющий в кровотоке и на модельных системах фибриноген и фибрин.Fibrinogen / fibrinoliptic protein-enzyme that breaks down in the bloodstream and on model systems fibrinogen and fibrin.
Источником фибриногено/фибринолиптических белков являются змеиные яды, которые содержат только белковые компоненты и имеют стабильный состав. Состав яда в различных змей варьирует, это связано с видовой специфичностью ядов, а также с местом обитания и условиям существования.The source of fibrinogen / fibrinoliptic proteins are snake venoms, which contain only protein components and have a stable composition. The composition of the poison in different snakes varies, this is due to the species specificity of the poisons, as well as to the habitat and living conditions.
Известены некоторые способы получения активных ферментов из яда змеи. Например, известен способ получения активных ферментов из яда змеи Тriтеrеsиrиs окiпаvепsis путем фракционирования растворенного буфером яда на Сефадексе G- 100, хроматографии на СМ-Тоуореаrl 650M в два этапа и заключительной очистки на Mono Q геле. (Nоsе S., Shimоhigаshi Y. еt аl. Рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf а соаgulапt епzуmе, оkiпахоbiп II, frоm Тriтеrеsиrиs окiпаvепsis (Нiтеhаbи sпаке) vепоm whiсh rеlеаsеs fibrinopeptides A апd В., Toxicoп.,-1994.-V.32,-P.1509-1520); из сырого яда змей рода Аgкistrоdоп sахаtilis, в котором сырый яд, растворенный в буфере, подвергается поэтапному фракцированию на Q-сефарозе, Сефадексе G-75 и Mono Q геле (Коh.Y., Chung K., Кim.D. Вiосhеmiсаl сhаrасtеrizаtiоп оf а thrоmbiп-likе епzуmе апd а fibriпоlуtiс sеriпе рrоtеаsе frоm sпаkе {Аgкistrоdоп sахаtillis) vепоm., Тохiсоп. -2001. -V.39, N4. -P.555-560); из яда Аgkistrоdоп асиtиs, в котором, растворенный в буфере яд подвергают хроматографии на DЕАЕ-Сефарозе, Сефакриле S-200 и СМ-Сефарозе (Нuапg Q., Teng M., Niu L.Рurifiсаtiоп апd сhаrасtеrizаtiоп оf twо fibriпоgеп-сlоttiпg епzуmеs frоm fivе-расе sпаkе {Аgkistrоdоп асиtиs) venom.,Toxicon.-1999.-V.37, N7.-P.999-1013); из яда Аgkistrоdоп асиtиs, в котором, растворенный в буфере яд подвергают разделению анионообменнике DEAE Сефадексе A-50, затем дважды хроматографируют на Сефадексе G-200 (Quуапg С, Hong J. еt аl. Рurifiсаtiоп апd рrореrtiеs оf thе trоmbiп-likе рriпсiрlе оf Аgkistrоdоп асиtиs vепоm апd its соmраritiоп with bоviпе thrоmbiп., Тhrоmb.Diаth.hаеmоrrth. -1971. -V.26 -P.224-234); из сырого яда змей рода Аgkistrоdоп асиtиs, в котором растворенный в буфере (рН 7.2), яд подвергают последовательной хроматографии на Сефадексе G-75, анионообменнике DЕАЕ-Сефадексе A-50 с градиентомд хлорида натрия 0.01-0.6M, сорбенте Гепарин-Сефарозе CL-6B (градиент хлорида натрия NaCl 0.1-0.3; 0.5M) и в отдельном случае дополнительно на Сефадексе G-100. (Коmоri Y, Nikаi Т.еt аl. А соmраrаtivе studу оf сlоttiпg fасtоrs frоm thе vепоm оf Аgkistrоdоп асиtиs соllесtеd iп сhiпа апd Таiwап., Соmр.Вiосhеm.Рhуsiоl. -1987. -V.88B, N2. -P643-649); из сырого яда змей Воthrорs аtrох, заключающийся в выделении тромбиноподобной фракции, способной вызывать коагуляцию фибриногена. (Ноllеmап W.H., Wеiss LJ. , thе thrоmbiп-likе епzуmе frоm Воthrорs аtrох аmiпоbепzаmidiпе-substitutеd аgаrоsе. J Вiоl.Сhеm. 1976, Маг. -25. -251(6). -P.1663-1669); кроме того известен способ, храктеризующий тем, что растворенный в буферном растворе яд подвергают поэтапной хроматографии на Сефадексе G-100, на катионообменнике СМ-Тоуореаrl 650M с линейным градиентом концентрации хлорида натрия и полным объёмом градиента, обеспечивающими наиболее полное выявление и раздельное элюирование тромбиноподобных ферментов, затем проводят раздельную рехроматографию этих ферментов, задавая линейные градиенты концентрации хлорида натрия из условий элюирования соответствующего тромбоподобного фермента на предыдущем этапе при одновременном увеличении полных объемов этих градиентов до уровня, обеспечивающего дополнительное разделение соседных тромбиноподобных ферментов и получают целевой продукт в гомогенном состоянии после раздельной очистки тромбиноподобных ферментов на сорбенте ABA-TSK. (RU 2271219 Cl (2004123274/15, 28.07.2004) 10.03.2006 Бюл.7., Способ получения тромбиноподобных ферментов из яда змеи). Кроме того предложен способ получения активных ферментов из яда змей путем, идентификации и смещивания фракций, содержащих активных фермент и белок, с последующим выделением целевого продукта хроматографией на Sерhаrоsе, уравновешенной TPИC-HC1 буферным раствором, при этом яд змеи Аgkistrоdоп hаlуs в 0.05M растворе натрия хлорида хроматографирует на колонке заполненной Sерhасrуl S-300 HR, после идентификации и смешивания фракций с тромбиноподобным ферментом их концентрируют ультрафилтрацией с отбором по молекулярной массе ЮКд, полученный раствор хроматографируют на колонке с DEAE Sерhаrоsе FF, уравновешенной ацетатным буферным раствором, отбирают и смешивают фракции с тромбиноподобным ферментом, повторно концентрируют ультрафильтрацией, затем концентрат хроматографируют на колонке с гелом SP Sерhаrоsе FF, фракций, содержащие целевой продукт, объединяют, разводят дистилированной водой до активности 12-15 с в тесте тромбинового времени, вносят сахарозу, азид натрия до 0.01%, разливают во флаконы и лиофильно высушивают. (RU 2 262 947C2 (2002120163/15, 24.07.2002) Способ получения тромбиноподобного коагулирующего фермента).Some methods for producing active enzymes from snake venom are known. For example, there is a known method for producing active enzymes from the snake venom of Triteresiris okapavepsis by fractionation of the poisoned buffer with Sephadex G-100, chromatography on SM-Touorerl 650M in two stages and final purification on Mono Q gel. (Nose S., Shimohigashi Y. et al. Rurifiсtiop apd сhаrаsterizatiop оf а coаgulapt еpzume, okіpakhоbіp II, frоtеrеsіrіs іkіpіpеpісепіпепепепепепіпепепіпепепіпепепіпепепепе P.1509-1520); from raw poison of snakes of the genus Agistrodop sakhatilis, in which the raw poison dissolved in the buffer is subjected to gradual fractionation on Q-Sepharose, Sephadex G-75 and Mono Q gel (Koh.Y., Chung K., Kim.D. Biochemisal and thromb-lik likem apd and fibriolutis seripe roteas from spaké (Agkistrodop sakhatillis) vepom., Tohisop. -2001. -V. 39, N4. -P.555-560); from Agkistrodop asiitis poison, in which the poison dissolved in the buffer is subjected to chromatography on DEAE-Sepharose, Sephacryl S-200, and CM-Sepharose (Huapg Q., Teng M., Niu L. Purificapofepofitofibf Race Spake (Agkistrodop asites) venom., Toxicon.-1999.-V.37, N7.-P.999-1013); from Agistrodop asiatica poison, in which the poison dissolved in the buffer is subjected to separation of a DEAE Sephadex A-50 anion exchanger, then chromatographed twice on Sephadex G-200 (Quaupg C, Hong J. et al. Aspirates Vpom apd its comraritiop with bvipe thrombi., Thromb.Diath.haemorrth. -1971. -V.26 -P.224-234); from crude venom of Agkistrodop asites, in which the poison, dissolved in a buffer (pH 7.2), is subjected to sequential chromatography on Sephadex G-75, an anion exchanger DEAE-Sephadex A-50 with a gradient of sodium chloride 0.01-0.6M, sorbent Heparin-Sepharose CL 6B (gradient of sodium chloride NaCl 0.1-0.3; 0.5M) and, in a separate case, additionally on Sephadex G-100. (Komori Y, Nikita T. et al. And the program is studded with the tactics of the acceleration system and the updated version of Taiwap., Comp. Bios. -64. ; from the raw poison of snakes Віthrоs аtroh, which consists in the isolation of a thrombin-like fraction that can cause coagulation of fibrinogen. (Butlemap WH, Weiss LJ., Thе thrombіp likе іzpеm frоm Thіthors аtroh аmіpobepzamidіpe-substitutеd аgarosе. J Віl.Сhem. 1976, Mag. -25. -251 (6-166) (666) .666). in addition, a method is known that characterizes that the poison dissolved in the buffer solution is subjected to stepwise chromatography on Sephadex G-100, on a SM-Touorerl 650M cation exchanger with a linear gradient of sodium chloride concentration and a full gradient volume, which provide the most complete identification and separate elution of thrombin-like enzymes, then separate rechromatography of these enzymes is carried out, setting linear gradients of the concentration of sodium chloride from the elution conditions of the corresponding thrombus-like enzyme to at the previous stage, while the total volumes of these gradients were increased to a level that provides additional separation of neighboring thrombin-like enzymes, the target product is obtained in a homogeneous state after separate purification of thrombin-like enzymes on an ABA-TSK sorbent. (RU 2271219 Cl (2004123274/15, 07.28.2004) 10.03.2006 Bull.7., Method for producing thrombin-like enzymes from snake venom). In addition, a method is proposed for producing active enzymes from snake venom by identifying and shifting fractions containing the active enzyme and protein, followed by isolation of the target product by chromatography on Serharos equilibrated with TPIC-HC1 buffer solution, while the venom of the snake Agkistrodop halus in a 0.05M sodium solution Chromatography is chromatographed on a column filled with Serhasul S-300 HR, after identification and mixing of the fractions with a thrombin-like enzyme, they are concentrated by ultrafiltration with selection by molecular weight of SC, the resulting solution is chromium chromatographs on a DEAE Serfos FF column equilibrated with acetate buffer, fractions with a thrombin-like enzyme are taken and mixed, re-concentrated by ultrafiltration, then the concentrate is chromatographed on a SP Serfos FF gel column, the fractions containing the desired product are combined, diluted with water, diluted, diluted with activity -15 s in the thrombin time test, sucrose, sodium azide up to 0.01% are added, poured into vials and freeze-dried. (RU 2 262 947C2 (2002120163/15, 07.24.2002) A method for producing a thrombin-like coagulating enzyme).
Недостатком прототипа является как низкий уровень рентабельности производственного процесса, низкий уровень чистоты и большой затрат времени.The disadvantage of the prototype is both a low level of profitability of the production process, a low level of purity and a large investment of time.
Сущность изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION
В основу изобретения поставлена задача разработать способ выделения фибриногено/фибринолиптического белка из яда Аgkistrоdоп Ыотhоffii иssиriепsis, позволяющий путем проведения афинной хроматографии и применения носителей, обладающих более высокими хроматографическими свойствами и физико-химической стабилностью, повысить рентабельность производственного процесса, сократить время выделения фибриногено/фибринолиптического белка и повысить его чистоту. Поставленная задача решается в способе выделения фибриногено/фибринолиптического белка из яда Аgkistrоdоп Ыотhоffii иssиriепsis в том, что аффинную хроматографию проводят на колонке с носителем Вlие Sерhаrоsе FF, используя в качестве буферного раствора 1OmM Тris HCl с рН 8.2, и наносят на колонку заполненную анионообменникомThe basis of the invention is the task to develop a method for the isolation of fibrinogen / fibrinoliptic protein from Agkistrodop Yothoffii poison syriepsis venom, which allows affinity chromatography and the use of carriers with higher chromatographic properties and physico-chemical stability to increase the profitability of the production process and reduce the time for fibrinogen / fibrinogen / fibrinogen / protein isolation and increase its purity. The problem is solved in a method for the isolation of fibrinogen / fibrinoliptic protein from Agkistrodop Yothoffii poison syriepsis poison in that affinity chromatography is performed on a column with a carrier of Serharose FF, using 1OmM Tris HCl filled with pH 8.2 as a buffer solution and applied
DEAE Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50 mМ Тris HCl буфером с рН 8.2. После отмывания сорбента от несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения, через колонку пропускают 5OmM Тris HCl буфер с рН 8.2. который содержит 0.12 M NaCl. Фибриногено/фибринолиптического белка элюируют с сорбента вместе с фибринолитическим ферментом, используя ступенчатый градиент ионной силы 0.2 M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2. Белковый пик содержащий указанные белки собирают, разбавляют 8 раз 2OmM Nа-фосфатным буфером с pH6.2, доводят рН до значения 6.2 и наносят на колонку с катионообменником CM Sерhаrоsе FF, уравновешенную 2OmM Nа-фосфатным буфером с рН 6.2, со скоростью 1 мл/мин. Указанные белки разделяют линейным градиентом NaCl(0-0.2M), в соответствующем буфере. Белковый пик, содержащий фибриногено/фибринолиптического белка собирают и высушивают лиофилизацией. Осуществление изобретения Поставленная задача решается предлагаемым способом, когда параметры процесса выделения фибриногено/фибринолиптического белка находятся в переделах, указанных в формуле изобретения. При изменении параметров в сторону увеличения или уменьшения характеристики получаемого препарата ухудшаются. Изобретение иллюстрируется примерами 1-3 конкретного осуществления. Пример.1DEAE Series FF, pre-equilibrated with 50 mM Tris HCl buffer with pH 8.2. After washing the sorbent from a material unrelated to Vlie Serharos FF, dilute in 8 times with 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 8.2 and applied to a column filled with DEAE Serharose FF anion exchanger, previously equilibrated with 5OmM Tris HCl with a pH of 8.2 buffer. After washing the sorbent from the unbound material with the application buffer, a 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 is passed through the column. which contains 0.12 M NaCl. The fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent together with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2. The protein peak containing these proteins is collected, diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with a CM Sercho FF cation exchanger, equilibrated with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, at a rate of 1 ml / min These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), in the appropriate buffer. A protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected and dried by lyophilization. The implementation of the invention The problem is solved by the proposed method, when the parameters of the process for the isolation of fibrinogen / fibrinoliptic protein are in the range specified in the claims. When the parameters are changed in the direction of increasing or decreasing, the characteristics of the resulting preparation worsen. The invention is illustrated by examples 1-3 of a specific implementation. Example 1
К 100мг яда щитомордника дальневосточного добавляют 5мл 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и перемешивают до полного растворения яда при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40C в течении 15 мин. Осадок отбрасывают а надосадочную жидкость используют для афинной хроматографии. Раствор яда наносят на колонку (СЮ/10, объём 7мл) с афинным сорбентом Вlие Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50мл 1OmM Тris HCl буфером с рН 7,4 (скорость уравновешивания колонки 2 мл/мин, скорость нанесения яда 0,5мл/мин). После нанесения, через колонку со скоростью 2мл/мин пропускают 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и собирают весь несвязанный с сорбентом материал (60мл). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с pH 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF (размер колонки Ix8cм, объем 7мл), предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 со скоростью 2 мл/мин (Скорость нанесения образца lмл/мин). Основная часть белков (85%) собируется на анионообменнике. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения (110мл), через колонку со скоростью 2 мл/мин пропускают 5OmM Тris HCl буфер с рН 8.2 который содержит 0.12M NaCl (150мл). фибриногено/фибринолиптический белок элюируют с сорбента вместе с фибринолитическим ферментом, используя ступенчатый градиент ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 со скоростью 2мл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий указанные ферменты собирают (20мл), разбавляют в 8 раз 2OmM Nа-фосфатным буферем с рН 6.2, доводят рН до значения 6.2 и наносят на колонку с катионообменником CM Sерhаrоsе FF (Hi Тrар CM HP, объем lмл), уравновешенную 2OmM Nа-фосфатным буфером с рН 6.2ь со скоростью lмл/мин. Указанные белки разделяют линейным градиентом NaCl (0-0.2M), объемом 20мл , в соответствующем буфере со скоростью lмл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий фибриногено/фибринолиптический белок собирают (10мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика5 ml of 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 is added to 100 mg of Far Eastern thyroid muzzle venom and mixed until the venom is completely dissolved at 4 ° C. The dissolved venom is centrifuged at 5000 rpm at 4 ° C for 15 minutes. The precipitate is discarded and the supernatant is used for affinity chromatography. The solution of the poison is applied to a column (СУ / 10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Вliе Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min) . After application, 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all unbound material (60 ml) is collected. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The fraction of unrelated to Vlie Serharose FF material was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 and applied to a column filled with DEAE Serharose FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), previously equilibrated with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger. After washing the sorbent from the unbound material with the application buffer (110 ml), 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 8.2 which contains 0.12M NaCl (150 ml) is passed through the column at a speed of 2 ml / min. fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent together with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing these enzymes is collected (20 ml), diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with a CM Sercho FF cation exchanger (Hi Tpar CM HP, lml volume), balanced with 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2b at a rate of lml / min. These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), a volume of 20 ml, in the appropriate buffer at a speed of l ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected (10 ml) and dried by lyophilization. Characteristic
Выход, мг 10.0 мг (20%)Yield, mg 10.0 mg (20%)
Пример 2.Example 2
К 110мг яда щитомордника дальневосточного добавляют 5мл 1OmM Тris HCl буфера с рН5 ml of 1OmM Tris HCl buffer with pH is added to 110 mg of Far Eastern muzzle poison
7,4 и перемешивают до полного растворения яда при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40C в течении 15 мин. Осадок отбрасывают а надосадочную жидкость используют для афинной хроматографии. Раствор яда наносят на колонку (С 10/10, объём 7мл) с афинным сорбентом Вlие Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50мл 1OmM Тris HCl буфером с рН 7,4 (скорость уравновешивания колонки 2 мл/мин, скорость нанесения яда 0,5мл/мин). После нанесения, через колонку со скоростью 2мл/мин пропускают 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и собирают весь несвязанный с сорбентом материал (75мл). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF (размер колонки lхδсм, объем 7мл), предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 со скоростью 2 мл/мин (Скорость нанесения образца lмл/мин). Основная часть белков (85%) собируется на анионообменнике. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения (135мл), через колонку со скоростью 2 мл/мин пропускают 5OmM Тris HCl буфер с рН 8.2 который содержит 0.12M NaCl (165мл). Фибриногено/фибринолиптического белка элюируют с сорбента вместе с фибринолитическим ферментом, используя ступенчатый градиент ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 со скоростью 2мл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий указанные белки собирают (20мл), разбавляют в 8 раз 2OmM Nа-фосфатным буферем с рН 6.2, доводят рН до значения 6.2 и наносят на колонку с катионообменником CM Sерhаrоsе FF (Hi Тrар CM HP, объем lмл), уравновешенную 2OmM Nа-фосфатным буфером с рН 6.2, со скоростью lмл/мин. Указанные белки разделяют линейным градиентом NaCl (0-0.2M), объемом 30мл в соответствующем буфере со скоростью lмл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий фибриногено/фибринолиптический белок собирают (12мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика7.4 and stirred until the poison is completely dissolved at 4 0 C. The dissolved poison is centrifuged at 5000 rpm at 4 0 C for 15 minutes. The precipitate is discarded and the supernatant is used for affinity chromatography. The solution of the poison is applied to a column (C 10/10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min ) After application, 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 is passed through the column at a speed of 2 ml / min and all material unbound with the sorbent (75 ml) is collected. Optical density recorded continuously using the flow monitor REC 102 (Parmacia Biothesh). The fraction of material unrelated to Vlhe Serofaros FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 8.2 and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger (column size lхδcm, volume 7ml), pre-equilibrated with 5OmM Tris HCl pH 2 with a buffer speed of 2 ml with a buffer of 2 buffers min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger. After washing the sorbent from the unbound material with the application buffer (135 ml), a 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 which contains 0.12M NaCl (165 ml) is passed through the column at a speed of 2 ml / min. The fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent along with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing these proteins is collected (20 ml), diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with a CM Sarcho FF cation exchanger (Hi Tpar CM HP, lml volume), balanced with 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2, with a speed of lml / min. These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), a volume of 30 ml in the appropriate buffer at a speed of l ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected (12 ml) and dried by lyophilization. Characteristic
Выход, мг 12.0 мг (20%)Yield, mg 12.0 mg (20%)
Пример 3. К 96мг яда щитомордника дальневосточного добавляют 4.5мл 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и перемешивают до полного растворения яда при 40C. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин при 40C в течении 15 мин. Осадок отбрасывают а надосадочную жидкость используют для афинной хроматографии. Раствор яда наносят на колонку (С 10/10, объём 7мл) с афинным сорбентом Вlие Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 50мл 1OmM Тris HCl буфером с рН 7,4 (скорость уравновешивания колонки 2 мл/мин, скорость нанесения яда 0,5мл/мин). После нанесения, через колонку б со скоростью 2мл/мин пропускают 1OmM Тris HCl буфера с рН 7,4 и собирают весь несвязанный с сорбентом материал (53мл). Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF (размер колонки Ix8cм, объем 7мл), предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2 со скоростью 2 мл/мин (Скорость нанесения образца lмл/мин). Основная часть белков (85%) собируется на анионообменнике. После отмывания сорбента от несвязанного материала буфером нанесения (110мл), через колонку со скоростью 2 мл/мин пропускают 5OmM Тris HCl буфер с рН 8.2 который содержит 0.12M NaCl (150мл). фибриногено/фибринолиптического белка элюируют с сорбента вместе с фибринолитическим ферментом, используя ступенчатый градиент ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2 со скоростью 2мл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий указанные белки собирают (18мл), разбавляют в 8 раз 2OmM Nа-фосфатньм буферем с рН 6.2, доводят рН до значения 6.2 и наносят на колонку с катионообменником CM Sерhаrоsе FF (Hi Тrар CM HP, объем lмл), уравновешенную 2OmM Nа-фосфатным буфером с рН 6.2, со скоростью lмл/мин. Указанные белки разделяют линейным градиентом NaCl (0-0.2M), объемом 25мл в соответствующем буфере со скоростью lмл/мин. Оптическую плотность регистрируют непрерывно с помощью проточного монитора REC 102 ("Раrmасiа biоtесh"). Белковый пик содержащий фибриногено/фибринолиптический белок собирают (8мл) и высушивают лиофилизацией. Характеристика Выход, мг 9.0 мг (20%) Example 3. To 96 mg of Far Eastern mollusk venom, add 4.5 ml of 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 and mix until the poison is completely dissolved at 4 0 C. The dissolved poison is centrifuged at 5000 rpm at 4 0 C for 15 minutes. The precipitate is discarded and the supernatant is used for affinity chromatography. The solution of the poison is applied to a column (C 10/10, volume 7 ml) with an affinity sorbent Vlie Serharose FF, previously equilibrated with 50 ml of 1OmM Tris HCl buffer with a pH of 7.4 (column equilibration rate of 2 ml / min, poison application rate 0.5 ml / min ) After application, through column b 1OmM Tris HCl buffer with pH 7.4 is passed at a rate of 2 ml / min and all material unbound with the sorbent (53 ml) is collected. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The fraction of material unrelated to Vlhe Serofaros FF was diluted 8 times with 5OmM Tris HCl with a pH 8.2 buffer and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger (column size Ix8cm, volume 7ml), pre-equilibrated with 5OmM Tris HCl 2 buffered with a pH of 2 buffered with 2 buffered with a pH of 2 buffered with 8.2 buffer min (Sample application speed lml / min). The bulk of the proteins (85%) are collected on the anion exchanger. After washing the sorbent from the unbound material with the application buffer (110 ml), 5OmM Tris HCl buffer with a pH of 8.2 which contains 0.12M NaCl (150 ml) is passed through the column at a speed of 2 ml / min. the fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent along with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 at a rate of 2 ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing the indicated proteins is collected (18 ml), diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with pH 6.2, adjusted to pH 6.2 and applied to a column with CM Sercharose FF (Hi Тpar CM HP, volume lml), balanced with 2OmM Na -phosphate buffer with a pH of 6.2, with a speed of lml / min. These proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), with a volume of 25 ml in the appropriate buffer at a speed of l ml / min. The optical density was recorded continuously using a flow monitor REC 102 (Parmacia biotech). The protein peak containing fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected (8 ml) and dried by lyophilization. Characteristic Yield, mg 9.0 mg (20%)

Claims

Формула изобретения Claim
Способ выделения фибриногено/фибринолиптического белка из яда Аgкistrоdоп blотhоffii иssиriепsis, включающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, аффинной хроматографии, и следующей за ней ионнообменной хроматографией в две стадии, сбор фракций, содержащих биологическую активность фибриногено/фибринолиптического белка и лиофилизацию отличающийся тем, что аффинную хроматографию проводят на колонке с носителем Вlие Sерhаrоsе FF, используя в качестве буферного раствора 1OmM Тris HCl с рН 7,4 и затем фракцию несвязанного с Вlие Sерhаrоsе FF материала разбавляют в 8 раз 5OmM Тris HCl bуфером с рН 8.2 и наносят на колонку заполненную анионообменником DEAE Sерhаrоsе FF, предварительно уравновешенную 5OmM Тris HCl буфером с рН 8.2; затем отмывают сорбента от несвязанного материала буфером нанесения, через колонку пропускают 5OmM Тris HCl буфер с рН 8.2 который содержит 0.12M NaCl; и фибриногено/фибринолиптического белка элюируют с сорбента вместе с фибринолитическим ферментом, используя ступенчатый градиент ионной силы 0.2M NaCl в 5OmM Тris HCl буфере с рН 8.2; и белковый пик содержащий указанные белки собирают, разбавляют в 8 раз 2OmM Nа-фосфатным буферем с рН 6.2, доводят рН до значения 6.2 и наносят на колонку с катионообменником CM Sерhаrоsе FF, уравновешенную 2OmM Nа-фосфатным буфером с рН 6.2, со скоростью lмл/мин; и указанные белки разделяют линейным градиентом NaCl (0-0.2M), в соответствующем буфере и собирают белковый пик содержащий фибриногено/фибринолиптический белок затем высушивают лиофилизацией. A method for isolating a fibrinogen / fibrinoliptic protein from Agistrodop blothoffii poison syriepsis venom, comprising dissolving the venom in a buffer solution followed by centrifugation, affinity chromatography, and subsequent ion-exchange chromatography in two stages, collecting fractions containing the biological activity of fibrinogen-different fibrinolipin or fibrin protein that affinity chromatography is carried out on a column with the carrier Blie Serharose FF, using 1OmM Tris HCl with pH 7.4 as a buffer solution and then a fraction of unbound The Serfaros FF material is diluted 8 times with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 and applied to a column filled with DEAE Serocos FF anion exchanger, previously equilibrated with 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2; then the sorbent is washed from the unbound material with the application buffer, a 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2 which contains 0.12M NaCl is passed through the column; and the fibrinogen / fibrinoliptic protein is eluted from the sorbent together with the fibrinolytic enzyme using a stepwise gradient of ionic strength of 0.2 M NaCl in 5OmM Tris HCl buffer with pH 8.2; and the protein peak containing these proteins is collected, diluted 8 times with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2, the pH is adjusted to a value of 6.2 and applied to a column with a CM SerchoFose cation exchanger balanced with 2OmM Na-phosphate buffer with a pH of 6.2 at a rate of lml / min; and these proteins are separated by a linear gradient of NaCl (0-0.2M), in the appropriate buffer, and the protein peak containing the fibrinogen / fibrinoliptic protein is collected and then dried by lyophilization.
PCT/MN2006/000004 2006-08-16 2006-08-30 Method for extracting fibrinogenic/fibrinolytic protein from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom WO2008020742A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
MN381006 2006-08-16
MN3810 2006-08-16

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2008020742A2 true WO2008020742A2 (en) 2008-02-21
WO2008020742A3 WO2008020742A3 (en) 2008-07-10

Family

ID=39082465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/MN2006/000004 WO2008020742A2 (en) 2006-08-16 2006-08-30 Method for extracting fibrinogenic/fibrinolytic protein from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2008020742A2 (en)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1504569A (en) * 2002-12-05 2004-06-16 合肥兆峰科大药业有限公司 Chromatography purification process of viper venom blood clotting enzyme
RU2262947C2 (en) * 2002-07-24 2005-10-27 Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" Method for obtaining thrombin-like coagulating enzyme
CN1737133A (en) * 2004-08-16 2006-02-22 北京赛生药业有限公司 High purity venom fibrinolysin prepartion method and its pharmaceutical formulation
RU2271219C1 (en) * 2004-07-28 2006-03-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации" Method for production of thrombin-like enzyme from snake venom

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2262947C2 (en) * 2002-07-24 2005-10-27 Общество с ограниченной ответственностью фирма "Технология-Стандарт" Method for obtaining thrombin-like coagulating enzyme
CN1504569A (en) * 2002-12-05 2004-06-16 合肥兆峰科大药业有限公司 Chromatography purification process of viper venom blood clotting enzyme
RU2271219C1 (en) * 2004-07-28 2006-03-10 Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова Министерства здравоохранения Российской Федерации" Method for production of thrombin-like enzyme from snake venom
CN1737133A (en) * 2004-08-16 2006-02-22 北京赛生药业有限公司 High purity venom fibrinolysin prepartion method and its pharmaceutical formulation

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008020742A3 (en) 2008-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101560510B (en) Agkistrodon acutus hemocoagulase atrox
JPH06511018A (en) Plasma fractionation purification method
US4314994A (en) Process for obtaining a plasminogen activator
CN101407801B (en) Preparation of earthworm fibrinolytic enzyme from Pheretima guillelmi Michaelsen and lyophilized powder preparation for injection prepared thereby
US4177262A (en) Plasminogen compositions containing preactivated plasminogens with or without native plasminogens, process for making same, pharmaceutical compositions and control of blood clots
CN100386433C (en) White-browed snake venom blood coagulation enzyme and its extraction method and application
CN102925422B (en) Agkistrodon acutus hemocoagulase-B
De-Simone et al. Simple affinity chromatographic procedure to purify β-galactoside binding lectins
CN113755476B (en) Preparation method and application of maggot kinase
WO2008020742A2 (en) Method for extracting fibrinogenic/fibrinolytic protein from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom
CN107460182B (en) Method for preparing activated pig plasma coagulation factor X
US4027012A (en) Process for the extraction of components having anticoagulant activity "in vivo" from snake venoms and products obtained
CN113789319B (en) Method for separating maggot kinase from fly maggots and application thereof
WO2008020740A2 (en) Method for extracting protein c activator from agkistrodon blomhoffii ussuriensis venom
CN102021160B (en) Snake venom serine protease and coding gene and application thereof
Lee et al. Cloning and characterization of a blood coagulation factor IX-binding protein from the venom of Trimeresurus stejnegeri
CN104498464A (en) Method for extracting agkistrodon snake venom hemocoagulase from gloydius blomhoffi brevicaudus venom
CN109943554A (en) A method of extracting factor X activator from snake venom
WO2008020741A2 (en) Method for extracting phospholipase a2 from agkistrodon blomhoffii venom
EP0650364B1 (en) Purification of factor ix
CN104593344B (en) Agkistrodon acutus hemocoagulase atrox C
Sadeesh Kumar et al. Screening and characterization of fibrinolytic protease producing Bacillus circulans from mangrove sediments Pitchavaram, South East Coast of India
WO2008020739A2 (en) METHOD FOR EXTRACTING α-SPECIFIC TROMBIN-LIKE ENZYME (ANCISTRON-B) FROM AGKISTRODON BLOMHOFFII USSURIENSIS VENOM
CN105586330B (en) A kind of Halase and preparation method thereof
Gomez et al. An alternative method to isolate protease and phospholipase A2 toxins from snake venoms based on partitioning of aqueous two-phase systems

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 06799434

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: DE

NENP Non-entry into the national phase in:

Ref country code: RU

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 06799434

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2