WO2007138148A1 - Enzima penicilina g acilasa mutada inmovilizada y estabilizada, procedimiento de obtención y sus aplicaciones - Google Patents
Enzima penicilina g acilasa mutada inmovilizada y estabilizada, procedimiento de obtención y sus aplicaciones Download PDFInfo
- Publication number
- WO2007138148A1 WO2007138148A1 PCT/ES2007/070104 ES2007070104W WO2007138148A1 WO 2007138148 A1 WO2007138148 A1 WO 2007138148A1 ES 2007070104 W ES2007070104 W ES 2007070104W WO 2007138148 A1 WO2007138148 A1 WO 2007138148A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- enzyme
- penicillin
- immobilization
- immobilized
- acylase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
- C12N9/84—Penicillin amidase (3.5.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
Definitions
- Enzymes are capable of catalyzing the most complex chemical processes in the most benign experimental and environmental conditions. In most cases, for economic and technological reasons, enzymes must be used in immobilized form to be able to be reused or used in continuous reactors. Thus, the use of immobilized enzymes during numerous reaction cycles in industrial reactors implies the development of very simple methods of immobilization of enzymes that also allow to greatly increase the stability of these excellent, but generally labile, biological catalysts.
- Multi-point covalent immobilization seems to be the most appropriate method to associate immobilization and stabilization of industrial enzymes.
- the participation of numerous residues of the protein in the covalent junction, through short spacer arms, to the surface of rigid supports must promote an important stabilization of the immobilized enzyme molecules.
- the relative distances between the different residues involved in the immobilization must remain practically unchanged during any conformational change induced by any inactivating agent (heat, co-solvents, etc.). In this way, the intensity of these conformational changes, and consequently the rate of inactivation of enzymes, should be greatly reduced.
- This method was based on the following starting hypotheses: a.- immobilize all enzyme molecules by a single region of its surface, b.- immobilize them in principle for each of the regions rich in lysine residues, c-insert, by directed mutagenesis, a Cys residue in each of the regions for which the enzyme is to be immobilized, d.- prepare supports containing a small amount of highly reactive disulfides and a large number of epoxide groups, e.- perform the immobilization uni- point oriented of each of the enzymes mutated by thiol-disulfide exchange through the Cys inserted in each region of the enzyme and the disulfide residues of the support, and f.- promote a subsequent multi-point immobilization between the lysine residues located in the vicinity of the Cys inserted and the epoxy groups of the support.
- the surface of the protein is the most decisive in the inactivation of the enzyme and, therefore, the area that is most important to stiffen, if it is intended to increase the stability of the enzyme.
- this region could be enriched (also by Molecular Biology techniques) with new lysine residues and obtain even more stabilized derivatives.
- this enzyme Penicillin G acylase is currently used in the pharmaceutical industry for the hydrolysis of Penicillin G and cephalosporin G to produce 6 APA and 7ADCA respectively.
- the enzyme can be used in the synthesis reaction of semi-synthetic beta-lactam antibiotics, both in media with high co-solvent content using the non-activated substrates, and in aqueous media using the activated acyl donor. Given its relative low specificity for nucleophiles, the enzyme also has an interest in solving racemic mixtures of amines and alcohols, or for the synthesis of amides.
- the stability of the enzyme reduces the range of conditions that can be used (mainly the concentration of organic solvents, so that the preparation of immobilized enzymes with greater stability would be very important.
- This region was enriched (by directed mu ⁇ agenesis) in additional superficial Lys and the muieids obtained were immobilized, on the other side of this region, on different supports.
- the best results were obtained on supports containing glyoxyl groups, aliphatic aldehyde groups of short chain.
- glyoxyl groups aliphatic aldehyde groups of short chain.
- the first step is to detect the most relevant areas for the stability of the enzyme, for this it is necessary to direct the immobilization by the different areas rich in reactive residues, so that the areas in which the stabilization achieved is greater can be detected.
- epoxy supports react very slowly with the nucleophilic groups of the enzymes, in fact if the proteins are not adsorbed to the support for some reason, in principle the immobilization on epoxy supports is not significant.
- epoxy supports require some type of group or property that allows prior adsorption of enzymes on the surface, e.g.
- the majority of commercial supports are hydrophobic and their use at high ionic strength is recommended.
- commercial epoxy supports were modified (Eupergit C de
- Rhm-Hass with different concentrations of two different reagents (dithiothreitol (DTT) and sodium sulfide).
- DTT dithiothreitol
- sodium sulfide sodium sulfide
- partially modified supports were obtained with different concentrations of thiol groups located at a different distance from the surface of the support: with a spacer arm (modification with DTT) and without a spacer arm (modification with sodium sulphide).
- the supports were activated with 2,2' - dipyridyl disulfide (2PDS) and thus highly reactive disulfide groups were obtained on the support, surrounded by many epoxide groups. They found that these supports could not immobilize enzymes that lacked thiol groups (natural or inserted) and that the rate of immobilization on them was several orders of magnitude greater than that observed with groups that only had thiol groups.
- 2PDS 2,2' - dipyridyl disulfide
- the mutated enzymes had a specific activity very similar to the enzyme without mutating (in the order of 25-30 Ul / mg protein) and also had the same thermal stability and identical activity-pH profiles. It seems that, as predicted by the mathematical simulation, the mutations made hardly affected the structure-function of the PGA.
- the directed immobilization of the mutated enzymes was carried out on epoxy disulfide supports at neutral pH to favor thiol disulphide exchange immobilization. Subsequently, the subsequent multipuntual covalent interaction was promoted by incubating them derivatives at alkaline pH to increase the reactivity of the lysine residues located in the environment of the Cys inserted and involved in the directed immobilization. Finally, the remaining epoxy groups are blocked with glycine to avoid undesirable effects promoted by a certain hydrophobicity of the supports used. As reference targets, disulfide-epoxy supports blocked with glycine were used where only directed immobilization of the mutated enzymes was possible through a single enzyme-support bond.
- This mutant also exhibited very inésan ⁇ catalytic properties (based better than those of the naive enzyme) in bioerformations of in ⁇ erés: enan ⁇ ioselec ⁇ iva hydrolysis of racemic mixtures of chiral esieres and the ciné ⁇ icamen ⁇ e con ⁇ rolada syn ⁇ esis of amido bonds.
- the immobilization on disulfide-epoxide supports allows to detect the key regions for the stabilization of enzymes and, however, once these regions (enriched in lysine residues) are optimized, the immobilization on glyoxyl supports allows to obtain much greater stabilizing effects.
- FIGURES Figure 1 Representation in Grasp of the surface of the PGA. In green: serines to mutate by cysteines. In blue plants; yellow ⁇ chain of the PGA and gray ⁇ chain of the PGA.
- Figure 2 Representation in Grasp of the waste selected to be replaced by cysteine. In red residues to mutate by cysteines, in blue plants, yellow ⁇ chain of the PGA and in gray ⁇ chain of the PGA.
- Figure 3 Representation in Grasp of the waste selected to be replaced by PGA front face plants near Ia CysB380.
- Green CysB380 black AspA61, pink ThrA121, orange AsnB110, brown AspB381, light blue ArgB437, blue asnB457, red Glub468, violet ThrB470, yellow chain ⁇ of PGA and light gray chain ⁇ of Ia PGA.
- FIG. 4 Kinetics of thermal inactivation of bifunctional derivatives of the different cysteine mutants. The inactivation was performed at pH 7 (50 mM sodium phosphate) and 55 0 C.
- Bifunctional derivatives (») CysA86-PGA, ( • ) CysB9-PGA, O CysB112-PGA, (») CysB201-PGA ,, ( *) CysB361-PGA, () CysB380-PGA; Control derivative: () CysB380-PGA.
- FIG. 5 Dioxane inactivation of bifunctional derivatives of the different cysteine mutants. The inactivation was performed with 60% dioxane at pH 7 (10 mM sodium phosphate) and 4 0 C.
- Bifunctional derivatives (•) CysA86-PGA, () CysB9-PGA, O CysB112-PGA, (a) CysB201-PGA ,, (#) CysB361-PGA, () CysB380-PGA; Control derivative: () CysB380-PGA.
- FIG. 6 Course of kinetically controlled synthesis (SCC) of L-mandelylglycineamide. Catalyzed by: () monofunctional derivative and () bifunctional of CysB380-PGA and bifunctional derivative of CysB112-PGA. Control derivatives and bifunctional of the other mutants presented reaction courses similar to those of the control derivatives of CysB380-PGA and the bifunctional derivative of CysB112-PGA. The reactions were performed at 25 0 C, pH 7.5 and substrate concentrations were 5OmM glycinamide and 1OmM (R) of methyl mandelate.
- Figure 7 Kinetics of immobilization on glyoxyl-agarose support.
- Soluble enzymes have exactly the same thermostability, activity and activity / pH.
- Figures 4 and 5 show the thermal inactivations and in the presence of solvents of the different enzymes mutated on epoxy-thiol reagent supports, where some co-accelerated multi-point bonding has been achieved (demonstrated by SDS electrophoresis where no PUN subunits are released, there are It should be noted that the disulfide bridge should break under these conditions, so there are at least 3 junctions between the enzymes and the support). It is observed that the mutant with Ia Cys in position 380 B was the most stable both in organic medium and in thermal inactivations.
- Figure 6 shows that the mutant with aá. B 380 replaced by Cys urn and immobilized on thiol-epoxide supports has better behaviors in SCC than the enzyme mutated in position B112 (which is similar to the form native) or the derivative in which the Cys B380 mutant binds to supports that only have thiol-reactive groups.
- the mutant Cys B 380 immobilized on epoxy-ileum-reactive supports was the only one that saw a significant improvement in the enzyme E of the enzyme.
- Figure 7 shows how the enzymes with additional Lys are immobilized much faster than the naive enzyme, confiormando that on esios soiperies Muiyan esios are immobilized preferentially by zone B 380.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
En la presente invención se describen diferentes mutantes de la enzima PGA preparados mediante la inserción de una (1) Cys (en cada mutante) en una región diferente de la superficie de la enzima que fuese relativamente rica en residuos lisina, así como formas inmovilizadas sobre soportes disulfuro-epóxido, y con mutaciones adicionales que incrementan su estabilidad frente al efecto del calor y los disolventes orgánicos (300.000 veces más estables que la correspondiente enzima soluble). La excelente estabilidad de estos derivados enzimáticos los hace muy útiles para catalizar diferentes procesos industriales de interés en química orgánica y farmacéutica: hidrólisis de penicilina, reacciones de síntesis en presencia o ausencia de disolventes y reacciones de hidrólisis y síntesis enantioselectivas.
Description
TITULO
ENZIMA PENICILINA G ACILASA MUTADA INMOVILIZADA y ESTABILIZADA, PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE APLICACIÓN
La excelente estabilidad de estos derivados enzimáticos los hace muy útiles para catalizar diferentes procesos industriales de interés en química orgánica y farmacéutica: hidrólisis de penicilina, reacciones de síntesis en presencia o ausencia de disolventes y reacciones de hidrólisis y síntesis enantioselectivas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las enzimas son capaces de catalizar los procesos químicos más complejos en las condiciones experimentales y medioambientales más benignas. En Ia mayoría de los casos, por razones económicas y tecnológicas, las enzimas deben de emplearse en forma inmovilizada para poder así re-usarse o utilizarse en reactores continuos. Así pues el empleo de enzimas inmovilizadas durante numerosos ciclos de reacción en reactores industriales implica el desarrollo de métodos muy sencillos de inmovilización de enzimas que permitan además aumentar grandemente Ia estabilidad de estos excelentes, pero generalmente lábiles, catalizadores biológicos.
La inmovilización covalente multipuntual parece ser el método más adecuado para asociar inmovilización y estabilización de enzimas industriales. La participación de numerosos residuos de Ia proteína en Ia unión covalente, a través de brazos espaciadores cortos, a Ia superficie de soportes rígidos debe promover una importante estabilización de las moléculas de enzimas inmovilizadas. Ahora, las distancias relativas entre los diferentes residuos involucrados en Ia inmovilización deben mantenerse prácticamente inalteradas durante cualquier cambio conformacional inducido por cualquier agente inactivante (calor, codisolventes, etc.). De este modo Ia intensidad de estos cambios conformacionales, y consecuentemente Ia velocidad de inactivación de las enzimas, deberían quedar muy reducidas. La bondad de esta hipótesis ha sido corroborada por diferentes autores y especialmente por el presente grupo de
investigación que desarrolló un método general de estabilización de enzimas por unión covalente multipuntual, a través de sus regiones ricas en residuos lisina, sobre soportes pre-existentes conteniendo una elevada densidad de grupos glioxil (grupos aldehido alifáticos muy próximos a Ia superficie del soporte). La presente patente muestra Ia puesta a punto de un nuevo más eficaz de inmovilización-estabilización de enzimas por unión covalente multipuntual. Este método se basó en las siguientes hipótesis de partida: a.- inmovilizar todas las moléculas de enzima por una única región de su superficie, b.- inmovilizarlas en principio por cada una de las regiones ricas en residuos lisina, c- insertar, mediante mutagénesis dirigida, un residuo Cys en cada una de las regiones por las que se quiere inmovilizar Ia enzima, d.- preparar soportes conteniendo una pequeña cantidad de disulfuros altamente reactivos y una gran cantidad de grupos epoxido, e.- realizar Ia inmovilización uni-puntual orientada de cada una de las enzimas mutadas por intercambio tiol-disulfuro a través de Ia Cys insertada en cada región de Ia enzima y los residuos disulfuro del soporte, y f.- fomentar una posterior inmovilización multipuntual entre los residuos lisina situados en las proximidades de Ia Cys insertada y los grupos epóxido del soporte.
De este modo, evaluando Ia estabilidad de los diferentes derivados obtenidos frente a diferentes agentes inactivantes se podrá detectar que región de
Ia superficie de Ia proteína es Ia más decisiva en Ia inactivación de Ia enzima y, por Io tanto, Ia zona que más interesa rigidificar, si se pretende aumentar Ia estabilidad de Ia enzima.
Posteriormente, se podría enriquecer (también por técnicas de Biología Molecular) esa región con nuevos residuos lisina y obtener derivados todavía más estabilizados. Finalmente, utilizando estos mutantes altamente enriquecidos en residuos lisina alrededor de una Cys altamente reactiva (no sólo por intercambio tiol- disulfuro) se evaluarán otras alternativas (soportes epóxido monofuncionales, soportes glioxil, etc.) para lograr los máximos efectos estabilizantes.
Esta enzima Penicilina G acilasa es utilizada actualmente en Ia industria farmacéutica para al hidrólisis de Penicilina G y cefalosporina G para producir 6 APA y 7ADCA respectivamente. Además, Ia enzima puede utilizarse en Ia reacción de síntesis de antibióticos betalactámicos semi-sintéticos, tanto en medios con alto contenido en codisolverntes utilizando los sustratos sin activar, como en medio acuosos utilizando el donador de acilo activado. Dada su relativa baja especificidad por los nucleofilos, Ia enzima también tiene interés para resolver mezclas racémicas de aminas y alcoholes, o para Ia síntesis de amidas.
En algunas de estas reacciones Ia estabilidad de Ia enzima reduce el margen de condiciones que pueden utilizarse (fundamentalmente Ia concentración de disolventes orgánicos, pro Io que Ia preparación de enzimas inmovilizadas con mayor estabilidad seria muy importante.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción Breve
En Ia presente invención se describen diferentes mutantes de Ia enzima PGA preparados mediante Ia inserción de una (1) Cys (en cada muíante) en una región diferente de Ia superficie de Ia enzima que fuese relativamente rica en residuos lisina. Cada muíante se inmovilizó sobre soportes disulfuro-epóxido y de ese modo Ia inmovilización se dirigió selecíivameníe sobre Ia Cys insertada y posíeriormeníe Ia unión covaleníe mulíipuníual enzima-soporte se promovió por reacción eníe los aminos cercanos a cada Cys insertada y los grupos epóxido del soporte. De esíe modo se descubrió que Ia región próxima al amino ácido 380b era una región clave para Ia esíabilización de Ia enzima freníe al efecío del calor y los disolveníes orgánicos. Esía región se enriqueció (por muíagénesis dirigida) en Lys superficiales adicionales y los muíaníes obíenidos se inmovilizaron, a íravés de esía región, sobre difereníes soportes. Los mejores resulíados se obíuvieron sobre soportes coníeniendo grupos glioxil, grupos aldehido alifáíicos de cadena corta. Uíilizando geles de agarosa al 10% acíivados con grupos glioxil se consiguieron derivados que eran 300.000 veces más esíables que Ia correspondieníe enzima soluble. La exceleníe esíabilidad de esíos derivados enzimáíicos los hace muy úíiles para caíalizar difereníes procesos indusíriales de iníerés en química orgánica y farmacéuíica: hidrólisis de penicilina, reacciones de
síntesis en presencia o ausencia de disolventes y reacciones de hidrólisis y síntesis enantioselectivas.
A partir de este planteamiento completamente original y combinando técnicas de Biología Molecular y técnicas de Diseño de Soportes Activados "a medida", se ha logrado finalmente un método muy sencillo de inmovilización y estabilización muy drástica de enzimas industriales. El método ha sido puesto a punto utilizando Ia enzima penicilina G acilasa (de gran interés industrial por las múltiples biotransformaciones que es capaz de catalizar), aunque este nuevo método de inmovilización-estabilización de enzimas sería igualmente valido para Ia inmensa mayoría de enzimas industriales.
Descripción Detallada
Diseño de soportes disulfuro-epóxido a medida
El primer paso es detectar las zonas mas relevantes para Ia estabilidad de Ia enzima, para ello es preciso dirigir Ia inmovilización por las diferentes zonas ricas en residuos reactivos, de forma que se puedan detectar las zonas en las que Ia estabilización conseguida sea mayor.
Los soportes epoxido reaccionan muy lentamente con los grupos nucleófilos de las enzimas, de hecho si las proteínas no se adsorben al soporte por algún motivo, en principio Ia inmovilización sobre soportes epóxido no es significativa. De esta forma, los soportes epóxidos requieren de algún tipo de grupo o propiedad que permita al adsorción previa de las enzimas sobre Ia superficie, p.e. Ia mayoría de los soportes comerciales son hidrofóbicos y se recomienda su uso a elevada fuerza iónica. Para ello se modificaron los soportes epóxido comerciales (Eupergit C de
Róhm-Hass) con diferentes concentraciones de dos reactivos diferentes (ditiotreitol (DTT) y sulfuro sódico). De este modo se obtuvieron soportes parcialmente modificados con diferentes concentraciones de grupos tiol situados a diferente distancia de Ia superficie del soporte: con un brazo espaciador (modificación con DTT) y sin brazo espaciador (modificación con sulfuro sódico). Posteriormente, los soportes se activaron con 2,2'dipiridil disulfuro (2PDS) y así se obtuvieron grupos disulfuro altamente reactivos sobre el soporte, rodeados de muchos grupos epóxido. Se comprobaron que estos soportes no podían
inmovilizar enzimas que carecieran de grupos tiol (naturales o insertados) y que Ia velocidad de inmovilización sobre los mismos era varios ordenes de magnitud mayor a Ia observada con grupos que solo tenían grupos tiol.
De esta forma disponíamos de un soporte capaz de inmovilizar de proteínas específicamente por grupos tiol insertados en Ia superficie de Ia proteína
2.- Diseño de mutaciones dirigidas de Ia superficie de Ia PGA para insertar grupos Cys en distintas zonas: Se estudió Ia superficie de Ia enzima penicilina G acilasa (PGA) y se detectaron todas las regiones ricas en residuos Lys, más o menos cercanas al centro activo de Ia enzima. En tres regiones se encontraron residuos Ser (B9, B201y A84) que se reemplazaron por Cys (unas mutaciones muy conservadoras) (Figura 1 ). En otros tres o casos no se encontró ningún residuo Ser superficial y se tuvo que optar por reemplazamientos menos conservadores (GlnB380, GlnB112 y AlaB361 ) (Figura 2).
Las enzimas mutadas tenían una actividad específica muy similar a Ia enzima sin mutar (del orden de 25-30 Ul/mg de proteína) y además poseían Ia misma estabilidad térmica e idénticos perfiles actividad-pH. Parece que, tal como predecía Ia simulación matemática, las mutaciones realizadas apenas afectaban a Ia estructura-función de Ia PGA.
3.- Inmovilización- Estabilización de las enzimas mutadas por unión covalente multipuntual sobre soportes disulfuro-epóxido Se comprobó que Ia PGA nativa no se inmovilizaba de forma significativa sobre los nuevos soportes tiol epóxido. Sin embargo, las distintas enzimas con una Cys superficial si se inmovilizaban sobre el soporte.
Se realizó Ia inmovilización dirigida de las enzimas mutadas sobre soportes disulfuro epóxido a pH neutro para favorecer Ia inmovilización por intercambio tiol- disulfuro. Posteriormente, se promovió Ia posterior interacción covalente multipuntual incubándolos derivados a pH alcalino para aumentar Ia reactividad de los residuos lisina situados en el entorno de las Cys insertadas e involucradas en Ia inmovilización dirigida. Finalmente, los grupos epóxidos remanentes se
bloquearon con glicina para evitar efectos indeseables promovidos por una cierta hidrofobicidad de los soportes empleados. Como blancos de referencia se utilizaron soportes disulfuro-epóxido bloqueados con glicina donde solo era posible Ia inmovilización dirigida de las enzimas mutadas a través de una única unión enzima-soporte.
En todos los casos se comprobó Ia formación de una unión covalente multipuntual entre las enzimas mutadas y los soportes disulfuro epóxido (al menos un enlace amino-epóxido por cada una de las dos subunidades de Ia enzima más el enlace disulfuro). A pesar de ello Ia estabilización de los diferentes derivados era muy diferente: en algunos casos Ia inmovilización multipuntual apenas tenia efectos estabilizantes y en el mejor de los casos (muíante B380 cercano al centro activo de Ia enzima) se obtuvieron unos factores de estabilización de 12-20 veces frente al efecto desestabilizante del calor y los codisolventes. También este muíante exhibió unas propiedades catalííicas muy iníeresaníes (basíaníe mejores que las de Ia enzima naíiva) en bioíransformaciones de iníerés: hidrólisis enaníioselecíiva de mezclas racémicas de esíeres quirales y Ia síníesis cinéíicameníe conírolada de enlaces amido.
4.- Enriquecimienlo en grupos amino de Ia superficie de Ia PGA en lomo al residuo B380
Gracias al planíeamienío realizado pudimos descubrir una región de Ia enzima (alrededor del amino ácido B380) que era clave para Ia esíabilización y Ia mejora de sus propiedades caíalííicas. Posíeriormeníe procedimos a enriquecerla en 8 nuevos residuos lisina para mejorar su rigidificación por unión covaleníe mulíipuníual sobre soportes disulfuro-epóxido.
Las muíaciones realizadas fue cambiar por Lys los siguieníes residuos: ArgB437, AspA61 , ThrA121 , AsnB110, AspB381 , AsnB457, GluB468 y ThrB470 (Figura 3).
Esías muíaciones reducían Ia acíividad específica de Ia enzima en un 50% y su íermo-esíabilidad a pH 7 por un facíor de 40. Al enriquecer una en Lys una zona ya rica en Lys, se puede asumir que posiblemeníe esa nueva zona sea Ia más rica en residuos aminos de íoda Ia superficie de Ia enzima. De esía forma,
ahora había dos características de esta zona que permitían orientar Ia molécula en el entorno al residuo B380: Ia Cys y Ia mayor densidad de grupos Lisina.
5.- Inmovilización sobre diferentes soportes (Epóxido, tiol-epoxido o Glioxil) La presencia, incluso de bajas concentraciones, de grupos disulfuro en Ia superficie del soporte puede impedir un perfecta congruencia geométrica entre las nuevas enzimas mutadas (enriquecidas en aminos en Ia zona más sensible para Ia estabilidad de Ia enzima) y los soportes epóxido altamente activado. Además, los soportes Eupergit puede que no presenten superficies internas demasiado grandes (sean más bien mallas de fibras relativamente finas) y por ello no sean los soportes ideales para una unión covalente multipuntual muy intensa entre enzimas y soportes. Por ello, se evaluó otros métodos de inmovilización de estas enzimas altamente aminadas para ver si mejorábamos su estabilidad térmica: a.- inmovilización covalente de sobre soportes epóxido mono-funcionales a pH neutro. Las enzimas conteniendo un grupo tiol (Ia Cys insertada) reaccionan lentamente con los soportes epóxido monofuncionales pero Io hacen mucho más rápidamente que las enzimas nativas sin Cys insertada. Los derivados obtenidos por este procedimiento tenían un factor de estabilización de 1 ,500 con respecto a los derivados unipuntuales en experimentos de inactivación térmica. Parece que efectivamente Ia presencia de grupos disulfuro puede reducir Ia intensidad de Ia rigidificación de Ia enzima. b.- inmovilización sobre soporte glioxil-agarosa. Esta inmovilización ocurre a través de las regiones de Ia enzima ricas en residuos lisina con soportes formados por fibras muy gruesas que pueden promover una intensa multi- interacción con enzimas. De hecho, Ia enzima mutada enriquecida se inmoviliza mucho más rápidamente que Ia enzima nativa (unas 15 veces más rápido) y ello parece indicar que efectivamente se está inmovilizando mayoritariamente Ia enzima a través de Ia nueva región enriquecida en residuos Lys (alrededor del amino ácido B380). Ahora los derivados mostraban un factor de estabilización de un factor de varios cientos de miles veces más estable con respecto a los derivados unipuntuales. De hecho, esta enzima mutada comparada en forma libre con al enzima nativa era 40 veces menos estable que Ia enzima nativa, mientras
que comparando las enzimas inmovilizadas, este derivado era dos ordenes de magnitud mas estable que Ia enzima nativa inmovilizada sobre un soporte similar.
La inmovilización sobre soportes disulfuro-epóxido permite detectar las regiones claves para Ia estabilización de enzimas y sin embargo, una vez optimizadas estas regiones (enriquecidas en residuos lisina) Ia inmovilización sobre soportes glioxil permite obtener unos efectos estabilizantes mucho mayores.
DESCRIPCIÓN DE LA FIGURAS Figura 1 : Representación en Grasp de Ia superficie de Ia PGA. En verde: serinas a mutar por las cisteínas. En azul usinas; amarillo cadena α de Ia PGA y en gris cadena β de Ia PGA.
Figura 2: Representación en Grasp de los residuos seleccionados para ser reemplazados por cisteína. En rojo residuos a mutar por cisteínas, en azul usinas, amarillo cadena α de Ia PGA y en gris cadena β de Ia PGA.
Figura 3: Representación en Grasp de los residuos seleccionados para ser reemplazados por usinas cara frontal PGA cerca de Ia CysB380. En verde CysB380, negro AspA61 , rosa ThrA121 , naranja AsnB110, marrón AspB381 , celeste ArgB437, azul asnB457, rojo Glub468, violeta ThrB470, amarillo cadena α de Ia PGA y en gris claro cadena β de Ia PGA.
Figura 4: Cinética de inactivación térmica de derivados bifuncionales de los distintos mutantes de cisteína. La inactivación se realizó a pH 7 (fosfato de sodio 50 mM) y 550C. Derivados bifuncionales: (») CysA86-PGA, (•) CysB9-PGA, O CysB112-PGA, (») CysB201-PGA,, (*) CysB361-PGA, ( ) CysB380-PGA; Derivado control: ( ) CysB380-PGA.
Figura 5: Inactivación frente a dioxano de derivados bifuncionales de los distintos mutantes de cisteína. La inactivación se realizó con 60% dioxano a pH 7 (fosfato de sodio 10 mM) y 40C. Derivados bifuncionales: (•) CysA86-PGA, ( ) CysB9-PGA, O CysB112-PGA, (a) CysB201-PGA,, (#) CysB361-PGA, ( ) CysB380-PGA; Derivado control: ( ) CysB380-PGA.
Figura 6: Curso de síntesis cinéticamente controlada (SCC) de L-mandelil- glicinamida. Catalizada por: ( ) derivado monofuncional y ( ) bifuncional de CysB380-PGA y O derivado bifuncional de CysB112-PGA. Los derivados control
y bifuncionales de los demás mutantes presentaron cursos de reacción similares a los de los derivados control de CysB380-PGA y el derivado bifuncional de CysB112-PGA. Las reacciones se realizaron a 250C, pH 7.5 y las concentraciones de sustratos fueron 5OmM de glicinamida y 1OmM (R) de mandelato de metilo. Figura 7: Cinética de inmovilización sobre soporte glioxil-agarosa. ( ) CysB380-PGA, (s) CysB380(4Lys)-PGA, (•) CysB380(4Lys)-PGA, y (*) CysB380(8l_ys)-PGA. La inmovilización se realizó con una relación volumen de enzima:g de soporte 50:1 en tampón bicarbonato de sodio pH 10 0.1 M a 40C. Figura 8: Cinética de Ia cinética de inactivación frente a dioxano del derivado CysB380 (8 Lys)-PGA-glioxil y de derivados reportados como muy estables en Ia literatura. La inactivación se realizó con 60% dioxano a pH 7 (fosfato de sodio 10 mM) y 40C. Derivados glioxil-agarosa de: (Φ) PGA nativa, (Φ)CysB380(6Lys)-PGA, (*) Derivado de Ia PGA nativa preparado sobre Eupergit C preparado a alta fuerza iónica. (#) Derivado comercial de PGA (Fluka).
EJ EMPLOS DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1.- Prueba de Ia inmovilización dirigida.
Inmovilización de enzimas con Cys insertadas y enzima nativa en soportes tiol reactivo-epoxido La enzima nativa no se inmoviliza a pH 7 y 10 mM de fosfato en los soportes tiol reactivos, mientras que las enzimas con Cys si que se inmovilizaban en los soportes tiol reactivo, tanto solo con grupos tiol reactivos como tiol-epoxido, a una velocidad idéntica. Esto demuestra que se está inmovilizando fundamentalmente las enzimas por Ia nueva Cys.
Inmovilización de distintos imitantes en soportes bifuncionales de eupergit (7 μmol grupos tiol-reactivos/g soporte). La inmovilización se realizó a pH 7 (fosfato de sodio 50 mM) y temperatura ambiente, o soporte monofuncional bloqueado con glicina
2.- Inactivación térmica y en presencia de disolventes de los diferentes derivados.
Las enzimas solubles presentan exactamente Ia misma termoestabilidad, actividad y actividad/pH. Las Figuras 4 y 5 muestran las inactivaciones térmicas y en presencia de disolventes de las distintas enzimas mutadas sobre soportes epoxido-tiol reactivo, donde se ha conseguido cierta unión covalente multipuntual (demostrada por electroforesis en SDS donde no se liberan subunidades de Ia PGA, hay que destacar que el puente disulfuro debería de romperse en esas condiciones, así que al menos hay 3 uniones entra las enzimas y el soporte). Se observa que el muíante con Ia Cys en Ia posición 380 B era el más estable tanto en medio orgánico como en inactivaciones térmicas.
3.- Síntesis cinéticamente controlada catalizada por diferentes derivados de PGA nativa o mutada.
La Figura 6 muestra que el muíante com el aá. B 380 sustiíuido por urna Cys e inmovilizado sobre soportes tiol-epóxido presenta mejores comportamientos en SCC que Ia enzima mutada en Ia posición B112 (que es similar a Ia forma
nativa) o el derivado en el que el muíante Cys B380 se une a soportes que tan sólo tiene grupos tiol-reactivos.
4.- Enantioselectividad de Ia enzima.
El muíante Cys B 380 inmovilzada sobre soportes epoxido-íiol-reacíivo fue el único que vio mejoradas de forma significaíiva de Ia E de Ia enzima
Enantioselectividad frente a (R) y (S) 2-fenilpropionato de etilo de los derivados bifuncionales de los distintos mutantes de Cys de PGA. Las condiciones de hidrólisis fueron 1 mM ( R) o (S) 2-fenilpropionato de etilo en fosfato de sodio 10 mM pH 7.0 a 25°C.
5.- Inmovilización sobre sopones glyoxyl de las enzimas enriquecidas en grupos KLys en el enlomo del residuo B 380.
La Figura 7 muesíra como las enzimas con Lys adicionales se inmovilzan mucho mas rápido que Ia enzima naíiva, confiormando que sobre esíos soproíes esíos muíaníes se inmovilizan de forma prefereníe por Ia zona B 380.
6.- Estabilidad de los derivados de enzimas enriquecidas en Lys en el entorno de el residuo B 380 inmovilizadas sobre soportes glyoxyl agarosa. Estas enzimas esíán mucho más esíables que las enzimas solubles o que
Ia enzima unida a soportes íiolreacíivos, Eupergií or Eupergoií con grupos íiol reacíivos y epóxido, en íodas las condiciones de pH, T y presencia de ageníes disíorsionaníes esíudiados. A modo de ejemplo, se presenía en Ia Figura 8 Ia
inactivación del nuevo derivado y los derivados glyoxyl-agarosa de Ia enzima nativa, as como otros derivados comerciales. Puede apreciarse que el nuevo biocatalizador es mucho más estable que cualquiera de las otras preparaciones ensayadas.
Claims
REIVINDICACIONES
1.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa basado en Ia promoción de una inmovilización covalente multipuntual muy intensa a través de grupos amino, y de otros nucleófilos, situados en las proximidades del amino ácido 380b de Ia superficie de Ia enzima.
2.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa según reivindicación 1 en el cual el amino ácido GIn 380b de Ia superficie de Ia enzima es reemplazado, por mutagénesis dirigida, por un residuo Cys. 3.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa según reivindicación 2 en el que Ia superficie de Ia enzima, en las proximidades del residuo 380b, es enriquecida en residuos Lys adicionales en Ia superficie de Ia enzima por mutagénesis dirigida.
A - Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa según reivindicación 3 en el que los residuos Lys insertados en Ia superficie de Ia enzima reemplazan a los siguientes amino ácidos de Ia enzima nativa: ArgB437, AspA61 , ThrA121 , AsnB110, AspB381 , AsnB457, GluB468 y ThrB470. 5.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 2 a Ia 4, en los que Ia enzima se inmoviliza sobre soportes disulfuro-epóxido conteniendo una baja concentración (hasta 10 μmoles/gramo) de disulfuros altamente reactivos y una alta concentración de grupos epóxido (desde 25 hasta 200 μmoles / gramo de soporte).
6.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 2 a Ia 4, en los que Ia enzima se inmoviliza sobre soportes epóxido monofuncionales conteniendo una alta concentración de grupos epóxido, entre 20 y 200 μmoles de epóxido/gramo de soporte.
7.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 3 y 4, en los que Ia enzima se inmoviliza sobre cualquier tipo de soporte conteniendo una elevada concentración de grupos glioxil, entre 10 y 200 μmoles de glioxil/gramo de soporte. 8.- Un procedimiento de inmovilización de Ia enzima penicilina G acilasa, según reivindicaciones 5 a Ia 7 en el que Ia unión multipuntual enzima-soporte activado se optimizaba por incubación de Ia enzima inmovilizada a temperaturas
moderadas, entre 4 y 3O0C, y a pHs moderadamente alcalinos, entre pH 8.0 y pH 11.0.
9.- Enzima penicilina G acilasa inmovilizada obtenida según las reivindicaciones 1 a Ia 8. 10. Uso de Ia enzima penicilina G acilasa según Ia reivindicación 9 en procesos industriales de producción de penicilina.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200601424 | 2006-05-30 | ||
| ESP200601424 | 2006-05-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2007138148A1 true WO2007138148A1 (es) | 2007-12-06 |
Family
ID=38778158
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/ES2007/070104 Ceased WO2007138148A1 (es) | 2006-05-30 | 2007-05-30 | Enzima penicilina g acilasa mutada inmovilizada y estabilizada, procedimiento de obtención y sus aplicaciones |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2007138148A1 (es) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010054319A3 (en) * | 2008-11-10 | 2010-08-19 | Codexis, Inc. | Penicillin-g acylases |
| CN103865911A (zh) * | 2014-02-20 | 2014-06-18 | 浙江普洛得邦制药有限公司 | 青霉素g酰化酶突变体及其在合成头孢类抗生素中的应用 |
| CN108660127A (zh) * | 2017-03-27 | 2018-10-16 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种人工设计的青霉素g酰化酶原及其编码序列与应用 |
-
2007
- 2007-05-30 WO PCT/ES2007/070104 patent/WO2007138148A1/es not_active Ceased
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ABIAN O.: "Stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli: site-directed mutagenesis of the protein surface to increase multipoint covalent attachment", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 70, no. 2, February 2004 (2004-02-01), pages 1249 - 1251, XP002431788 * |
| GRAZU BONAVIA M.V.: "Resumen de la Tesis Doctoral: Estabilizacion de penicilina G acilasa por inmovilizacion covalente multipuntual dirigida. Mutagenesis de la superficie de la enzima para mejorar la complementariedad enzima-soporte activado", UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID, vol. 90, no. 5, June 2005 (2005-06-01), pages 597 - 605, XP008097374, Retrieved from the Internet <URL:http://www.kriptia.com/QUIMICA/BIOQUIMICA/GENETICA_BIOQUIMICA/1> * |
| GRAZU V.: "Stabilization of enzymes by multipoint immobilization of thiolated protiens on new epoxy-thiol supports", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 90, no. 5, June 2005 (2005-06-01), pages 597 - 605, XP008090469 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010054319A3 (en) * | 2008-11-10 | 2010-08-19 | Codexis, Inc. | Penicillin-g acylases |
| US8247192B2 (en) | 2008-11-10 | 2012-08-21 | Codexis, Inc. | Penicillin-G acylases |
| US8569013B2 (en) | 2008-11-10 | 2013-10-29 | Codexis, Inc. | Penicillin-G acylases |
| CN103865911A (zh) * | 2014-02-20 | 2014-06-18 | 浙江普洛得邦制药有限公司 | 青霉素g酰化酶突变体及其在合成头孢类抗生素中的应用 |
| CN108660127A (zh) * | 2017-03-27 | 2018-10-16 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种人工设计的青霉素g酰化酶原及其编码序列与应用 |
| CN108660127B (zh) * | 2017-03-27 | 2021-09-21 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 一种人工设计的青霉素g酰化酶原及其编码序列与应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pagar et al. | Recent advances in biocatalysis with chemical modification and expanded amino acid alphabet | |
| de Albuquerque et al. | Easy stabilization of interfacially activated lipases using heterofunctional divinyl sulfone activated-octyl agarose beads. Modulation of the immobilized enzymes by altering their nanoenvironment | |
| Mateo et al. | Immobilization of enzymes on heterofunctional epoxy supports | |
| Shah et al. | Preparation of cross-linked enzyme aggregates by using bovine serum albumin as a proteic feeder | |
| Zucca et al. | Inorganic materials as supports for covalent enzyme immobilization: methods and mechanisms | |
| Guisan et al. | 4. Immobilization of Enzymes 5. and Cells 6. Methods and Protocols 7. | |
| dos Santos et al. | Evaluation of divinylsulfone activated agarose to immobilize lipases and to tune their catalytic properties | |
| Zhang et al. | Activity and stability of immobilized carbonic anhydrase for promoting CO2 absorption into a carbonate solution for post-combustion CO2 capture | |
| Kanbar et al. | Thermal stability of carbonic anhydrase immobilized within polyurethane foam | |
| López-Gallego et al. | Stabilization of enzymes by multipoint covalent immobilization on supports activated with glyoxyl groups | |
| Hara et al. | A pseudo-Michaelis quaternary complex in the reverse reaction of a ligase: structure of Escherichia coli B glutathione synthetase complexed with ADP, glutathione, and sulfate at 2.0 Å resolution | |
| Moreno-Pérez et al. | Intense PEGylation of enzyme surfaces: relevant stabilizing effects | |
| Galvis et al. | Effect of solid-phase chemical modification on the features of the lipase from Thermomyces lanuginosus | |
| Twala et al. | Immobilisation and characterisation of biocatalytic co-factor recycling enzymes, glucose dehydrogenase and NADH oxidase, on aldehyde functional ReSyn™ polymer microspheres | |
| WO2007138148A1 (es) | Enzima penicilina g acilasa mutada inmovilizada y estabilizada, procedimiento de obtención y sus aplicaciones | |
| Godoy et al. | Changes on enantioselectivity of a genetically modified thermophilic lipase by site-directed oriented immobilization | |
| Lee et al. | Stabilization of Bovine carbonic anhydrase II through rational site-specific immobilization | |
| Giri et al. | Carbonic anhydrase modification for carbon management | |
| Kołodziejczak‐Radzimska et al. | Physicochemical and catalytic properties of acylase I from aspergillus melleus immobilized on amino‐and carbonyl‐grafted stöber silica | |
| Pandey et al. | Solvent-tolerant acyltransferase from Bacillus sp. APB-6: purification and characterization | |
| Abellanas-Perez et al. | The nature of the buffer alters the effects of the chemical modification on the stability of immobilized lipases | |
| Mozhaev et al. | Strategy for stabilizing enzymes part two: increasing enzyme stability by selective chemical modification | |
| Mukherjee et al. | Adding an appropriate amino acid during crosslinking results in more stable crosslinked enzyme aggregates | |
| Mishra et al. | Activation of inert supports for enzyme (s) immobilization harnessing biocatalytic sustainability for perennial utilization | |
| Furukawa et al. | Effect of imprinting sol–gel immobilized lipase with chiral template substrates in esterification of (R)-(+)-and (S)-(−)-glycidol |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 07765889 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 07765889 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |