WO2007110462A1 - Vacuna contra la tuberculosis - Google Patents

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WO2007110462A1
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gene
bcg
inactivation
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Carlos MARTÍN MONTAÑÉS
Brigitte Gicquel
Esther Perez Herran
Jesus Gonzalo Asensio
Ainhoa ARBUÉS ARRIBAS
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Universidad De Zaragoza
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated

Definitions

  • the present invention relates to an isolated microorganism belonging to the Mycobacterium genus characterized in that it comprises the inactivation of the RvO757 gene that confers a PhoP- phenotype and the inactivation of a second gene that prevents the production of DIM (DIM- phenotype).
  • the present invention comprises the use of said microorganism for the elaboration of a vaccine for the immunization or prevention of tuberculosis.
  • BCG derived from M. bovis
  • M. bovis is today the only vaccine in use against tuberculosis and is the most widely used vaccine worldwide.
  • the initial promises were not fulfilled and, due to the results of a large number of efficacy trials, it is evident that the BCG vaccine, in its current form, is of limited use for the control of the disease, particularly in the Respiratory forms in adults from third world areas where the disease is endemic [4]. With a better knowledge of the virulence of M.
  • tuberculosis tuberculosis and the models of immune responses that lead to the generation of protective immunity, it is possible to develop better vaccines than BCG.
  • tuberculosis with the gene RvO757 (phoP) inactivated and a second independent mutation of phoP that prevents the synthesis of DIM, as a prototype of a single-dose live vaccine, and we demonstrate that, in addition to being more attenuated than BCG in SCID immunocompromised mice, it provided levels of protection comparable to conferred by BCG in mice and superior protection to BCG in guinea pigs.
  • phoP gene RvO757
  • the phoP gene together with the phoR is part of a two component system that shows a high degree of similarity with other two component systems that control the transcription of key virulence genes in intracellular pathogens. It also serves to control the expression of many other genes that are not directly involved in virulence [19].
  • the elimination of virulence genes does not seem to be, per se, the only way to attenuate M. tuberculosis. It was demonstrated that an auxotrophic mutant of pantothenate of M. tuberculosis, incapable of de novo synthesis of pantothenic acid, persisted in SCID mice, without being able to cause the disease [17].
  • tuberculosis of the present invention with the sum of 2 independent mutations 1.- in the synthesis of the PhoP proteins and 2.- the synthesis of DIM is more attenuated than BCG in The SCID mouse model, even when applied at a dose 10 times higher than that, as well as the greater degree of protection than BCG in the guinea pig model is particularly surprising and relevant.
  • a first aspect of the invention refers to an isolated microorganism belonging to the genus Mycobacterium characterized in that it comprises the inactivation of the Rv 0757 gene (jphoP) and the inactivation of a second gene that eliminates the production of DIM (pthiocerol dimycocerosates).
  • this isolated microorganism will be called the microorganism of the present invention.
  • a second aspect of the present invention relates to an isolated microorganism belonging to the Mycobacterium genus characterized in that it comprises the inactivation of the Rv 0757 (phoP) gene and a second independent mutation of phoP that eliminates the production of DIM.
  • said second mutation being in the Rv2930 gene (fadD26) which consists in the deletion of the fadD26 gene that is essential for the synthesis of DIM.
  • a third aspect of the present invention refers to the use of the isolated microorganism of the present invention for the elaboration of a vaccine for the prevention of animal tuberculosis and even more preferably for the prevention of human tuberculosis as well as other uses that currently have the vaccines against tuberculosis in the treatment of diseases in humans such as bladder cancer.
  • M.Sub.2 strain of M. tuberculosis the microorganism isolated from the strain of M. tuberculosis to which the RvO757 gene constructed from the clinical strain of M has been inactivated.
  • tuberculosis MT103 by the insertion of a marker of resistance to kanamycin in the BcII site of the RvO757 gene of M. tuberculosis by homologous recombination according to the method described by Pelicic et al (1997) (Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis.
  • said strain of the invention has two independent mutations in live attenuated vaccines derived from M. tuberculosis, the second independent mutation of phoP not affecting the vaccine properties derived from the inactivation of said gene.
  • the second independent mutation of phoP not affecting the vaccine properties derived from the inactivation of said gene.
  • BCG the current vaccine in use against tuberculosis since 1921. It is a live attenuated vaccine derived from a strain of M. bovis that after subculturing in the laboratory lost its virulence and today we know that it has more than one hundred deleted genes (5). From here on in the context of the present invention we will refer to as H37Rv a strain of pathogenic M. tuberculosis that has been sequenced and in which genes such as Rv CoIe refer to, ei al. (Ref CoIe ei 1998 Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544).
  • MT103 as a clinical isolation of M. tuberculosis (Reference 15 Camacho et al.)
  • strain 1A29 is used, which consists of strain MT 103 which has inactivated the Rv2930 gene (fadD26) by transposon 1096 described in ref 15 (Camacho e ⁇ al. 1999 Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature -tagged transposon mutagenesis Mol Microbio / 34: 257-267)
  • SO2 + pS05 the strain of M. tuberculosis SO2 in which the mutation in RvO757 is complemented with the RvO757 gene by the transformation of a replicative plasmid with the mycobacterial phoP gene , but it is not able to complement the synthesis of DIM, its phenotype being phoP + DIM-.
  • M. tuberculosis phoP- the strain of M. tuberculosis to which the RvO757 gene has been inactivated by deletion between the EcoRV-Bsp sites, its phoP phenotype being - DIM +.
  • Rv2930 (fadD26) to the gene that is at the beginning of the operon responsible for the synthesis of the pthiocerol dimycocerosatos (Reference 15 Camacho et al. 1999) and the elimination of this gene in M. tuberculosis it confers a stable DIM - phenotype.
  • Fig. 1 Western blot analysis. Western blot image of extracellular protein extracts of MT103, of the SO2 strain of the present invention and BCG Pasteur, using polyclonal antibodies obtained against PhoP and ESAT-6.
  • the MT103 strain has an ESAT6 + and phoP + phenotype
  • the SO2 strain has a PhoP- and ESAT6 + phenotype
  • the BCG vaccine strain is PhoP + and ESAT6 -.
  • FIG. 2 Attenuation of the SO2 strain of the present invention in SCID mice.
  • the means of survival days were greater than 245 days (SO2), 62.1 + 5.88 (SO2 + pSO5) and 36.7 ⁇ 0.67 (MT 103).
  • Fig. 3 Cellular immune responses in mice vaccinated with the SO2 strain of the present invention and BCG.
  • Balb / c mice were vaccinated subcutaneously with 8x10 3 cfu of BCG (Phipps) or 2.5 x 10 3 cfu of the SO2 strain of the present invention.
  • the results are presented as a percentage of the total populations of CD4 + / CD8 + in spleen a time intervals after vaccination and as a percentage of cells expressing IFN- ⁇ of the total population of CD4 + / CD8 + after stimulation with complete M. tuberculosis antigen. * denotes statistically significant differences between the groups at the indicated time points (p ⁇ 0.005).
  • the results of cellular immunity show that the number of CD4 + lymphocytes in animals vaccinated with the SO2 strain is greater at days 14, 30, 45 and 60 and the production of specific IFN ⁇ against M. tuberculosis antigens is significant on days 45 and 60 with respect to mice vaccinated with BCG.
  • the number of CD8 + lymphocytes in animals vaccinated with the SO2 strain is greater on days 45 and 60 and the production of specific IFN ⁇ against M. tuberculosis antigens is significant on day 14 with respect to mice vaccinated with BCG.
  • Fig. 4 Protective efficacy of SO2 of the present invention compared to BCG in vaccinated Balb / c mice.
  • the reduction of cfus in lung and spleen mice vaccinated with SO2 is similar to that obtained with those vaccinated with BCG and demonstrates significant protection with respect to unvaccinated mice.
  • Fig. 5 Protective efficacy in guinea pigs vaccinated with the SO2 strain of the present invention and BCG against low doses of M. tuberculosis
  • Fig. 6 Protective efficacy in guinea pigs vaccinated with the SO2 strain of the present invention and BCG against infection with high doses of M. tuberculosis H37Rv. a, Since the mouse and guinea pig protection experiments infected at low doses showed clear protection in mice vaccinated with SO2 and BCG but no differences between BCG and SO2, a guinea pig model with high dose infection was used.
  • Guinea pig survival curve after aerosol infection with H37Rv of M. tuberculosis, b The extent of lung disease and disseminated infection, measured by total pulmonary consolidation. The values of each individual animal sacrificed at the human endpoint are indicated by an "x".
  • the dashed line indicates the average value in percentage of the group (# in SO2 corresponds to two animals), c, low resolution (x30) of images of representative sections of pulmonary lobes taken from guinea pigs of each of the treatment groups.
  • the bar represents 1 mm. d, Average cfu counts in the spleen and lungs of vaccinated and unvaccinated guinea pigs.
  • FIG. 7 The attenuation of infection with SO2 of the present invention in a BaIbC mouse intravenously is not restored by complementing with phoP.
  • Colony reduction (CFU) is observed in both spleen (7a spleen) and lung (7b lung), measured at 3 and 6 weeks.
  • the cfus levels of the wild strain are not restored in the complemented strain.
  • the SO2 strain of the present invention does not produce DIM and the synthesis of DIM is independent of the phoP mutation. Lipid analysis of different strains of M. tuberculosis by thin layer chromatography. 8 a DIM production can be observed in strain MT103 while strain SO2 and complementation with the phoP gene (SO2 pS05) do not produce DIM. This demonstrates that in SO2 the absence of DIM is independent of phoP. 8 b
  • the strain MT103 and strain MT103 are shown inactivating only the phoP gene (MT103 AphoP / .hyg) and the 2 are capable of synthesizing DIM I confirming that the production of DIM is independent of the phoP mutation.
  • Fig 11. Study of mouse attenuation: Survival curve of Balb / C mice inoculated by "intratracheal route" to study the attenuation of the different strains of M. tuberculosis. H37Rv and MT103 correspond to strains of M. tuberculosis without mutations and all mice die before 10 a week with the strain of M. tuberculosis DIM- (1A29) at 20 weeks 50% of the mice survive. All animals inoculated with SO2 (mutant phoP- and DIM-) survive the 20 weeks of the experiment. Fig. 12. Survival curve and guinea pig weight to study the toxicity of SO2, with 50 times the vaccine dose.
  • Fig 13 Survival of vaccinated guinea pigs after infection with M. tuberculosis. Protection study in guinea pigs, survival at 300 days: Survival curve of unvaccinated guinea pigs (saline), vaccinated with the current BCG vaccine, with a strain of M. tuberculosis phoP- or with SO2 (mutant phoP- and DIM-) . After vaccination subcutaneously, the animals are infected with a strain of virulent M. tuberculosis (H37Rv) at a high dose to study survival. At 60 days the 6 unvaccinated guinea pigs die while the groups vaccinated with SO2, phoP- and BCG survive.
  • H37Rv virulent M. tuberculosis
  • One aspect of the present invention relates to an isolated microorganism belonging to the genus Mycobacter ⁇ um characterized in that it comprises the inactivation of the RvO757 gene that confers a PhoP- phenotype and the inactivation of a second gene that prevents the production of DIM (DIM- phenotype). Additionally, the present invention comprises the use of said microorganism for the elaboration of a vaccine for the prevention of tuberculosis as well as the vaccine per se.
  • isolated strains of the genus Mycobacterium phoP-DIM- have characteristics that make them especially suitable for use as vaccines, both for the level of attenuation they acquire and for the level of protection they confer .
  • mice were inoculated by aerosol with the SO2 strain (phoP-DIM-). Said mice survive (fig 2a) significantly more than mice infected by the wild strain. Additionally, this attenuation is complemented with phoP in the SO2 + pS05 strain (phoP + DIM-) (Fig. 8a).
  • the levels of protection conferred by the M. tuberculosis strain of M. tuberculosis of the present invention and the BCG were similar in both the lungs and the spleen up to four weeks after the infection. If we compare the relative proportions of CD4 + and CD8 + cells of the spleens of vaccinated mice, in the mice vaccinated with the SO2 strain of the present invention a higher percentage of both CD4 + and CD8 + cells was found, compared with the mice vaccinated with BCG.
  • tuberculosis depends in general on the generation of a cellular immune response of the THi type characterized by the secretion of IFN- ⁇ from the antigen-specific T cells, we can conclude that the relatively high levels of cell activation T induced by the SO2 strain of the present invention contributes to its ability to confer a potent protective response.
  • guinea pigs were inoculated with a low dose of M. tuberculosis H37Rv, the levels of protection conferred by vaccination with the SO2 strain of the present invention and similar BCG in both the lungs and the spleen up to 4 weeks after the infection.
  • Both vaccines provided extremely efficient protection, reducing the cfs in the lungs and spleens by approximately 2 log, compared to the control groups that received saline.
  • there was no statistically significant difference between the two vaccine groups With such a short period after infection, we can assume that it would be difficult to demonstrate the greater efficacy of a new vaccine with respect to BCG.
  • the results described in the present invention demonstrate that the SO2 strain and therefore a microorganism belonging to the Mycobacterium genus (particularly of the M. Tuberculosis complex) with phoP-DIM- phenotype, is a more effective vaccine than BCG according to a series of criteria. It is more attenuated than BCG in SCID mice, imparts to mice a protective immunity at least as good as BCG and generates more potent cellular immunity responses. Additionally, in protection experiments carried out in guinea pigs against a high-dose infection of H37Rv, the strain with DIM-phoP phenotype imparts 100% survival to guinea pigs in circumstances in which BCG only allows 33% survival.
  • a first aspect of the present invention refers to an isolated microorganism belonging to the genus Mycobacter ⁇ um characterized in that it comprises inactivation or deletion: a. from the phoP gene or from one to more phoP gene regulatory genes or regulated by Phop and b. of a second gene that eliminates the production of DIM.
  • the microorganism isolated from the invention is characterized in that the inactivation of the phoP gene is carried out by means of the inactivation or deletion of the RvO757 gene.
  • the isolated microorganism of the invention is characterized in that the inactivation of the production of DIM is carried out by means of the deletion or inactivation of the Rv2930 gene (fadD26).
  • the isolated microorganism of the invention is characterized by comprising the deletion or inactivation of the genes Rv2930 and RvO757.
  • the microorganism isolated from the invention is characterized in that the species of the genus Mycobacterium belongs to the Mycobactarium tuberculosis complex.
  • a second aspect of the invention refers to the process of manufacturing the isolated microorganism of the invention comprising:
  • the inactivation or deletion of the phoP gene or one or more regulatory genes of the phoP gene preferably the inactivation or deletion of the RvO757 gene and b.
  • the inactivation or deletion of a second gene that eliminates the production of DIM preferably the deletion or inactivation of the gene Rv2930 ⁇ fadD26
  • a third aspect of the invention relates to a vaccine (hereinafter vaccine of the invention) to immunize an individual against the symptoms caused by tuberculosis, wherein said vaccine comprises at least one microorganism isolated from the invention.
  • the vaccine also comprises pharmacologically acceptable excipients.
  • a fourth aspect of the invention relates to the process of preparing a medicament, preferably a vaccine, which comprises the incorporation of an isolated microorganism of the invention in a therapeutically effective dose to a medium suitable for human or animal administration and, optionally, adding pharmacologically suitable excipients for the manufacture of vaccines.
  • Said medication is suitable for the treatment of bladder cancer, for the treatment or prevention of tuberculosis, or as a vector or adjuvant.
  • Said medication is suitable for the treatment of bladder cancer, for the treatment or prevention of tuberculosis, or as a vector or adjuvant.
  • a fifth aspect of the invention refers to the use of the isolated microorganism of the invention, for the elaboration of the vaccine of the invention, for the prevention and / or treatment of human or animal tuberculosis.
  • Western blot analysis was performed following normal procedures. As secondary antibodies, goat anti-rabbit antibodies labeled with horseradish peroxidase (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) were used.
  • tuberculosis in order to provide an approximate absorption of 20 viable bacilli within the lungs.
  • Ten mice were used for each experimental group.
  • groups of 7 mice were infected with 200 Dl of PBS containing doses equivalent to 2 x10 5 , 2 x10 4 and 2 x10 3 of viable BCG and 5.4 x 10 6 , 5.4 x 10 5 and 5.4 x 10 4 of The viable M. tuberculosis phoP strain through a lateral vein of the tail.
  • the significance in the differences in survival times among treated mice was determined with the use of the Mantel-Haenszel test.
  • Feasibility counts were made in serial dilutions of the homogenate, placing on Middlebrook 7H11 + OADC agar and examining its growth after 3 weeks.
  • the tissues were fixed in formalin buffered saline and fixed in paraffin. Five Dm thick sections were cut, colored with Ziehl-Neelsen dye.
  • Invitrogen Corporation containing 0.5 mg / ml type 2 collagenase (Worthington, NJ, USA) , and 2U / ml of DNAase (GIBCO), incubating for 1 hour at 37 ° C, with 5% CO2. They were then passed through a 70 ⁇ m cell sieve (Falcon, Becton Dickinson 70 ⁇ m Nylon 35-2350), crushed with the piston of a syringe and rinsed with medium. The cells were centrifuged, the supernatant was removed and the red blood cells were removed with lysis buffer [26].
  • the cells were resuspended in FACS buffer (1X PBS, pH 7.2, 1% BSA), and counted.
  • FACS buffer (1X PBS, pH 7.2, 1% BSA
  • the marking of the cell surface was carried out through incubation of 10 6 cells with 100 ⁇ l of monoclonal antibodies against CD4-FITC or CD8-FITC, diluted at a ratio of 1: 20 in PBS containing 1% of BSA and 0, 1% sodium azide for 20 min at 4 o C, analyzed with a FACScan cytometer.
  • the strain M. tuberculosis H37Rv was grown in Middlebrook 7H9 medium
  • the cells and the culture medium were centrifuged, the supernatant was discarded and, after counting and checking the viability, 2.5x10 5 cells per tube were labeled on the surface of the CD4 + or CD8 + cells as described above. After washing, the cells were resuspended and incubated for 20 min at 4 o C in 0.1% saponin dissolved in PBS. Intracellular IFN- ⁇ was detected by incubation of the cell for 20 min at 4 o C in the dark, with 100 ⁇ l of a 1/20 dilution of monoclonal anti-IFN- ⁇ labeled with phycoerythrin (PE). The cells were fixed with 100 ⁇ l of 4% paraformaldehyde diluted in PBS. Samples were analyzed at 20 minutes with a FACScan cytometer. The isotype controls were Ab-FITC (1: 20 dilution) + Ab-PE (1: 20 dilution).
  • mice 1.4.- Protective efficacy of SO2 of the present invention in Balb / c mice. All animals were kept under controlled conditions in the P3 High Security Laboratory of the Animal Installation of the Pasteur Institute in Paris, in accordance with the directives of the European Union for the protection of experimental animals. Groups of Balb / c mice (7 per group) were vaccinated subcutaneously at the base of the tail with 10 7 cfus of the SO2 strain of the present invention or BCG (Pasteur). At 8 weeks after vaccination, 2.5 x 10 5 cfu of M. tuberculosis H37Rv were applied to all mice intravenously. Four weeks after the injection, the mice were sacrificed.
  • Viability counts were made in serial dilutions of the homogenate, grown in Middlebrook 7H11 broth + OADC agar, examining at 3 weeks the growth of M. tuberculosis H37Rv, of the SO2 strain of the present invention based on the kanamycin resistance phenotype of this second strain.
  • Spleen and lung tissue were aseptically removed left and middle, right middle lobe and right caudal lobes), being placed in sterile containers.
  • the material was stored at - 20 ° C, then processed in order to count the number of bacteria.
  • the tissues were homogenized in 10 ml (lung) or 5 ml (spleen) of sterile deionized water, with the use of a rotary blade macerator system (Ystral). Viable cell counts were performed in serial dilutions of the homogenate, grown in Middlebrook 7H11 + OADC agar, the growth of M. tuberculosis was examined at 3 weeks. The data were transformed into log- ⁇ 0 for analysis and the viable M. tuberculosis numbers of each vaccine group were compared with the control group with saline solution by Student's "t" test.
  • Post-mortem collection and treatment of the samples were performed as described above, except that the pulmonary consolidation was measured with the use of image analysis of sections of lung tissue fixed in formalin, colored with Hematoxyline and Eosin (H + E).
  • the survival of the animals was compared with the use of Kaplan Meier survival calculations, using the Log Rank distribution analysis to identify statistically significant differences.
  • Data on cfu and consolidation of lesions were analyzed by ANOVA, with the use of Fishers pair comparisons, in order to compare the average values of the groups.
  • Example 3 Survival of mice infected with the strains of the present invention and BCG.
  • the attenuation of the SO2 strain was also compared with the BCG in SCID mice after intravenous administration.
  • Groups of SCID mice were inoculated with a series of doses (2 x10 5 , 2 x10 4 and 2 x10 3 cfu) of BCG Pasteur or of the SO2 strain (5.4 x 10 6 , 5.4 x 10 5 and 5 ., x 10 4 cfu) through a lateral vein of the tail.
  • the histological staining of infected alveolar macrophages of a subgroup of mice sacrificed three weeks after the infection revealed a lower number of alcohol resistant acid bacilli in the lungs of mice infected with the SO2 strain of M.
  • spleen cell suspensions were collected from groups of at least four Balb / c mice vaccinated subcutaneously with the SO2 strain of the present invention and BCG Phipps, the relative proportions of CD4 + and CD8 + cells being determined by cytofluorometry (Fig. 3).
  • Vaccination with SO2 induced a significantly higher number of CD4 + cells 14 days after vaccination, compared with BCG vaccination, and a significantly higher number superior of CD8 + cells after 45 days.
  • These splenocytes were stimulated with total antigens derived from culture filtrate of M. tuberculosis.
  • lymphocyte populations were analyzed by flow cytometry, combining specific antibodies for the detection of CD4 + / CD8 + cells and intracellular synthesis of IFN-D.
  • Vaccination with SO2 induced a significantly higher proportion of CD4 + / IFN-D + producing cells 45 days after vaccination, compared with BCG (Fig. 3). From a certain point in time, the proportion of cells that produced CD8 + / IFN-D + was always higher in the SO2 group (significantly different on day 14).
  • Example 5 Protective immunity generated by SO2 of the present invention in Balb / c mice.
  • mice vaccination experiments indicated that the attenuation of the SO2 strain of the present invention gave vaccine characteristics similar to BCG Pasteur.
  • guinea pigs constitute a more relevant model of human tuberculosis, with many similarities regarding the progress and pathology of the disease.
  • this animal model is a more appropriate system to evaluate the efficacy of a vaccine.
  • the animals that received the lower dose were sacrificed at 4 weeks, counting the bacterial loads in the lungs and spleens.
  • Protective efficacy was determined by comparing the numbers of viable M. tuberculosis H37Rv recovered from guinea pig organs in each treatment group. In this experiment, the reduction of cfus in lungs and spleens was significantly different between the unvaccinated control animals and those vaccinated with BCG or SO2 of M. tuberculosis
  • the guinea pigs who received the high dose were sacrificed 180 days after application or when 20% loss of body weight was observed. Protection levels were determined by comparing the Survival times of the guinea pigs of each treatment group. The progress of lesion development was also studied in vaccinated / infected guinea pigs, compared with that observed in unvaccinated / infected animals. During the phase of the post-inhalation experiment, all unvaccinated guinea pigs and four of the guinea pigs vaccinated with BCG were sacrificed at the human endpoint, before the endpoint of time (180 days) due to severe and progressive disease (Fig. 6a).
  • the guinea pigs vaccinated with the SO2 strain of the present invention survived during the study.
  • the guinea pigs vaccinated with the SO2 strain gained weight and did not show any visible or clinical signs of disease.
  • Example 7 Attenuation of SO2 of the present invention is due to the double PhoP-DIM- mutation.
  • Example 8 Protection of SO2 of the present invention is due to the double PhoP-DIM- mutation.
  • the protection in vaccinated guinea pigs and infected by aerosol with M. tuberculosis H37Rv was studied. Survival in guinea pigs at 300 days. After vaccination by subcutaneous route, the animals are infected with a strain of virulent M. tuberculosis (H37Rv) with a high dose to study survival. At 60 days the 6 unvaccinated guinea pigs die while the groups vaccinated with S02, phoP- and BCG survive.
  • Example 9 Construction of the vaccine candidate against tuberculosis based on the mutation by deletion of the fadD26 gene
  • the M. tuberculosis strains used for the construction of the mutant by deletion of the fadD26 gene are SO2, which contains the inactivated phoP gene by insertion of a kanamycin resistance cassette, and the clinical strain MT103.
  • fadD26 Cloning of the fadD26 gene, involved in the synthesis of DIM.
  • the fadD26 gene was amplified by PCR, from genomic DNA of M. tuberculosis H37Rv using primers fadD26Fw (SEQ ID NO: 1) and fadD26Rv (SEQ ID NO: 2).
  • the PCR product was inserted into the pGEM-T Easy vector (Promega), to construct plasmid pAZ1.
  • Plasmid pAZ3 was digested with Xho ⁇ releasing the insert fadD26 :: ⁇ hyg that was incorporated into the vector pJQ200X, linearized with the same enzyme. The final plasmid was named pAZ5.
  • Plasmid pAZ5 was introduced into strains of M. tuberculosis SO2 and MT103.
  • plasmid pWM19 which contains the ⁇ resolvase, is introduced and selected for resistance to gentamicin. Subsequently, the plasmid is removed by incubating 39
  • the phoP gene was amplified by PCR, from genomic DNA of M. tuberculosis H37Rv using the phoPF primers (SEQ ID NO: 3) and phoPR (SEQ ID NO: 4). The PCR product was inserted into the pGEM-T Easy vector (Promega), to construct plasmid pAZ11.
  • Plasmid pAZ13 was digested with Xho ⁇ releasing the phoPv. ⁇ km insert that was incorporated into the linear vector pJQ200X raised with the same enzyme. The final plasmid was named pAZ15.
  • Plasmid pAZ15 will be introduced into the strain of M. tuberculosis MT103 AfadD26.
  • Selection of simple recombinants Kanamycin culture (20 ⁇ g / ml) of the bacteria that have incorporated the plasmid and verification for its resistance to gentamicin (10 ⁇ g / ml).
  • plasmid pWM19 which contains the ⁇ resolvase, will be introduced and selected for hygromycin resistance (20 ⁇ g / ml). Subsequently, the plasmid will be removed by incubating at 39 0 C in 2% sucrose (Malaga e ⁇ al. 2003).

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Abstract

La presente invención se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacterium caracterizado porque comprende la inactivación del gen Rv0757 que confiera un fenotipo PhoP- y la inactivación de un segundo gen que impide la producción de DIM (fenotipo DIM-). Adicionalmente, la presente invención comprende el uso de dicho microorganismo para la elaboración de una vacuna para la inmunización ó prevención de la tuberculosis.

Description

Vacuna contra Ia tuberculosis
La presente invención se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacterium caracterizado porque comprende Ia inactivación del gen RvO757 que confiera un fenotipo PhoP- y Ia inactivación de un segundo gen que impide Ia producción de DIM (fenotipo DIM-).
Adicionalmente, Ia presente invención comprende el uso de dicho microorganismo para Ia elaboración de una vacuna para Ia inmunización ó prevención de Ia tuberculosis.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El uso de vacunas para prevenir Ia tuberculosis en humanos ha demostrado ser un formidable desafío durante cerca de un siglo. BCG, derivada de M. bovis, es hoy en día Ia única vacuna en uso contra Ia tuberculosis y es Ia vacuna más utilizada en todo el mundo. El desarrollo y administración generalizada de Ia vacuna BCG desde comienzos de los años 1920 representó un importante avance, con Ia expectativa de poder erradicar del mundo Ia plaga de Ia tuberculosis. No obstante, las promesas iniciales no se cumplieron y, por los resultados de un gran número de ensayos de eficacia, es evidente que Ia vacuna BCG, en su forma actual, es de un uso limitado para el control de Ia enfermedad, particularmente en las formas respiratorias en adultos de áreas del tercer mundo donde Ia enfermedad es endémica [4]. Con un mejor conocimiento de Ia virulencia del M. tuberculosis y los modelos de respuestas inmunes que llevan a Ia generación de inmunidad protectora, hace posible desarrollar vacunas mejores que Ia BCG. La observación de que los mayores niveles de protección se obtienen cuando el huésped se vacuna con BCG indica que Ia viabilidad y Ia persistencia son propiedades fundamentales exigidas para tener éxito con una vacuna contra Ia tuberculosis. En Ia presente invención, utilizamos una cepa de M. tuberculosis con el gen RvO757 (phoP) inactivado y una segunda mutación independiente de phoP que impide Ia síntesis de DIM, como prototipo de vacuna viva de una sola dosis, y demostramos que, además de ser más atenuada que Ia BCG en los ratones inmunocomprometidos SCID, impartía niveles de protección comparables a los conferidos por BCG en ratones y una protección superior a BCG en cobayos.
El gen phoP junto con el phoR forma parte de un sistema de dos componentes que muestra un elevado grado de semejanza con otros sistemas de dos componentes que controlan Ia transcripción de genes clave de Ia virulencia en patógenos intracelulares. Sirve igualmente para controlar Ia expresión de otros muchos genes que no intervienen directamente en Ia virulencia [19]. La eliminación de los genes de Ia virulencia no parece ser, per se, Ia única vía para Ia atenuación del M. tuberculosis. Se demostró que un mutante auxotrófico de pantotenato del M. tuberculosis, incapaz de una síntesis de novo del ácido pantoténico, persistía en ratones SCID, sin poder provocar Ia enfermedad [17]. Los auxótrofos de leucina individuales resultan también fuertemente atenuados e incapaces de replicar in vivo en ratones SCID [28]. Así pues, se admite ya generalmente el principio de que las cepas de vacunas en basadas en el M. tuberculosis pueden ser atenuadas con éxito, mientras que se retienen los genes que se suprimen en Ia BCG de M. bovis.
En el pasado, Ia investigación de vacunas con eficacia superior a BCG se basaba en Ia noción de que Ia pérdida de virulencia de Ia BCG era en sí misma un factor que contribuía a su falta de eficacia protectora completa
[32]. Se razonó, pues, que nuevos mutantes atenuados de M. tuberculosis, con menor virulencia, podrían resultar más efectivos como vacunas. No obstante, un reciente trabajo ha demostrado que Ia infección natural con M. tuberculosis y Ia vacunación con BCG no difieren en su capacidad para producir inmunidad protectora contra Ia tuberculosis [34]. Esto plantea las cuestiones de si es o no posible mejorar Ia BCG por atenuación racional de M. tuberculosis. En este contexto, Ia observación de que Ia cepa mutante de M. tuberculosis de Ia presente invención con Ia suma de 2 mutaciones independientes 1.- en Ia síntesis de las proteína PhoP y 2.- Ia síntesis de DIM resulta más atenuada que BCG en el modelo de ratón SCID, incluso cuando se aplicaba a una dosis 10 veces superior a aquella, así como el mayor grado de protección que BCG en el modelo de cobayo es particularmente sorprendente y relevante.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de Ia invención, se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacterium caracterizado por que comprende Ia inactivación del gen Rv 0757 (jphoP) y Ia inactivación de un segundo gen que elimine Ia producción de DIM (pthiocerol dimycocerosatos). De aquí en adelante este microorganismo aislado se denominará microorganismo de Ia presente invención.
Un segundo aspecto de Ia presente invención se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacterium caracterizado por que comprende Ia inactivación del gen Rv 0757 (phoP) y una segunda mutación independiente de phoP que elimine Ia producción de DIM. En un aspecto preferido de Ia presente invención, siendo dicha segunda mutación en el gen Rv2930 (fadD26) Ia cual consiste en Ia delección del gen fadD26 que es esencial para Ia síntesis de DIM.
Un tercer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del microorganismo aislado de Ia presente invención para Ia elaboración de una vacuna para Ia prevención de Ia tuberculosis animal y aún más preferentemente para Ia prevención de Ia tuberculosis humana así como otros usos que actualmente tienen las vacunas contra Ia tuberculosis en el tratamiento de enfermedades en humanos como puede ser el cáncer de vejiga.
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como "cepa SO2 de M. tuberculosis" al microorganismo aislado de Ia cepa de M. tuberculosis a Ia que se ha inactivado el gen RvO757 construida a partir de Ia cepa clínica de M. tuberculosis MT103 por Ia inserción de un marcador de resistencia a kanamicina en el sitio BcII del gen RvO757 de M. tuberculosis por recombinación homologa según el método descrito por Pelicic et al (1997) (Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc Nati Acad Sci U S A 94: 10955-10960) y que adicionalmente comprende Ia inactivación de un segundo gen que elimine Ia producción DIM (pthiocerol dimycocerosatos). Por Io tanto, dicha cepa de Ia invención presenta dos mutaciones independientes en vacunas vivas atenuadas derivadas de M. tuberculosis no afectando Ia segunda mutación independiente de phoP las propiedades vacunales derivadas de Ia inactivación de dicho gen. En el ejemplo 9 se describe como construir un microorganismo aislado del género Mycobacterium con Ia doble mutación independiente que proporciona un fenotipo igual que Ia descrita para Ia cepa SO2 de M. tuberculosis.
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como vacuna a aquellos fármacos que al ser administrados producen defensas frente a Ia enfermedad que se quiere prevenir.
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como BCG a Ia actual vacuna en uso contra Ia tuberculosis desde 1921. Se trata de una vacuna viva atenuada derivada de una cepa de M. bovis que tras subcultivarse en el laboratorio perdió su virulencia y hoy sabemos que tiene más de cien de genes deleccionados (5) . De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como H37Rv a una cepa de M. tuberculosis patógena que ha sido secuenciada y en a Ia que se refieren los genes como Rv CoIe, eí al. (Ref CoIe eí al 1998 Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544).
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como MT103 a un aislamiento clínico de M. tuberculosis (Referencia 15 Camacho et al.)
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como cepa DIM- aquella cepa del complejo M. tuberculosis que no es capaz de sintetizar phthiocerol dimycocerosatos, importantes lípidos relacionados con Ia patogenicidad de M. tuberculosis. En Ia figura 11 se utiliza Ia cepa 1A29 que consiste en Ia cepa MT 103 que tiene inactivado el gen Rv2930 (fadD26) por el transposon 1096 descrito en ref 15 (Camacho eí al. 1999 Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbio/ 34: 257-267)
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como SO2+ pS05 a Ia cepa de M. tuberculosis SO2 en Ia que Ia mutación en RvO757 se complementa con el gen RvO757 por Ia transformación de un plásmido replicativo con el gen phoP de micobacterias, pero no es capaz de complementar Ia síntesis de DIM, siendo su fenotipo phoP+ DIM-.
De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como M. tuberculosis phoP- a Ia cepa de M. tuberculosis a Ia que se Ie ha se ha inactivado el gen RvO757 por delección entre los sitios EcoRV-BspEl siendo su fenotipo phoP- DIM+. De aquí en adelante en el contexto de Ia presente invención nos referiremos como Rv2930 (fadD26) al gen que se encuentra en el inicio del operón encargado de Ia síntesis los pthiocerol dimycocerosatos (Referencia 15 Camacho et al. 1999) y Ia eliminación de este gen en M. tuberculosis confiere un fenotipo estable DIM -.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1 Análisis Western blot. Imagen "Western blot" de extractos proteicos extracelulares de MT103, de Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG Pasteur, usando anticuerpos policlonales obtenidos contra PhoP y ESAT-6. La cepa MT103 tiene un fenotipo ESAT6 + y phoP+, Ia cepa SO2 tiene un fenotipo PhoP- y ESAT6 + y Ia cepa vacunal BCG es PhoP+ y ESAT6 -.
Fig. 2 Atenuación de Ia cepa SO2 de Ia presente invención en ratones SCID. a, Curva de supervivencia de ratones SCID infectados (n=10) a través de aerosol, con 20 cfu de SO2, SO2 complementado con pSO5 (SO2 + pSO5) y MT103. Las medias de días de supervivencia fueron superiores a 245 días (SO2), 62.1+5,88 (SO2 +pSO5) y 36.7±0,67 (MT 103). Los ratones infectados por aerosol con Ia cepa SO2 sobreviven los 245 días del experimento mientras los infectados por MT103 y Ia cepa SO2 complementada con phoP mueren antes del día 62 b, Curvas de supervivencia de ratones SCID (n=7) infectados por inyección intravenosa con 5,4 x 106 cfus de con SO2 y 2 x 105 cfus de BCG Pasteur. Lo que demuestra que el nivel atenuación de Ia cepa SO2 es mayor que Ia vacuna que actualmente se usa en humanos contra Ia tuberculosis BCG.
Fig. 3 Respuestas inmunes celulares en ratones vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG. Ratones Balb/c fueron vacunados por vía subcutánea con 8x103 cfu de BCG (Phipps) o 2,5 x 103 cfu de Ia cepa SO2 de Ia presente invención. Los resultados se presentan como porcentaje de las poblaciones totales de CD4+/ CD8+ en bazo a intervalos de tiempo después de Ia vacunación y como porcentaje de células que expresan IFN-γ de Ia población total de CD4+/ CD8+ después de estimulación con antígeno completo de M. tuberculosis. * denota diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en los puntos de tiempo indicados (p < 0,005). Los resultados de inmunidad celular muestran que el número de linfocitos CD4+ en los animales vacunados con Ia cepa SO2 es mayor a los días 14, 30, 45 y 60 y Ia producción de IFNγ específica contra los antígenos de M. tuberculosis es significativa los días 45 y 60 respecto a los ratones vacunados con BCG. El numero de linfocitos CD8+ en los animales vacunados con Ia cepa SO2 es mayor a los días 45 y 60 y Ia producción de IFNγ específica contra los antígenos de M. tuberculosis es significativa el día 14 respecto a los ratones vacunados con BCG.
Fig. 4 Eficacia protectora de SO2 de Ia presente invención comparada con BCG en ratones Balb/c vacunados. Número de cfu recuperadas de pulmones (a) y bazos (b) de ratones Balb/c vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG, infectados por vía intravenosa con H37Rv de M. tuberculosis. La reducción de cfus en pulmón y bazo el ratones vacunados con SO2 es similar a Ia obtenida con los vacunados con BCG y demuestra una protección significativa respecto a los ratones no vacunados.
Fig. 5 Eficacia protectora en cobayos vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG frente dosis bajas de M. tuberculosis
H37Rv. Números medios de log10 cfu / mi en los pulmones (a) y los bazos
(b) de cobayos vacunados y de control con solución salina infectados con dosis bajas de M. tuberculosis H37Rv. Los datos representan los cfu medios de todos los animales (n=6) sacrificados al cabo de 4 semanas. Las barras de error indican Ia desviación típica. La reducción de cfus en pulmón y bazo de cobayos infectados con M. tuberculosis a dosis bajas y vacunados con SO2 es similar a Ia obtenida en los vacunados con BCG y significativa respecto a los ratones no vacunados.
Fig. 6 Eficacia protectora en cobayos vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG frente a Ia infección con dosis elevadas de M. tuberculosis H37Rv. a, Dado que los experimentos de protección en ratón y en cobayo infectados a bajas dosis mostraban una clara protección en los ratones vacunados con SO2 y BCG pero no diferencias entre BCG y SO2 se utilizó un modelo de cobayo con infección a altas dosis. Curva de supervivencia de cobayos después de infección por aerosol con H37Rv de M. tuberculosis, b, La extensión de Ia enfermedad pulmonar y Ia infección diseminada, medida por Ia consolidación pulmonar total. Los valores de cada animal individual sacrificado en el punto final humano se indican con una "x". La línea discontinua indica el valor medio en porcentaje del grupo (# en SO2 corresponde a dos animales), c, baja resolución (x30) de imágenes de secciones representativas de lóbulos pulmonares tomadas de cobayos de cada uno de los grupos de tratamiento. La barra representa 1 mm. d, Recuentos medios de cfu en el bazo y pulmones de cobayos vacunados y no vacunados. Este experimento demuestra que en modelo cobaya a dosis altas de infección con M. tuberculosis, los cobayos vacunados con SO2 sobreviven significativamente más que BCG y además producen menos lesiones en el pulmón y reducen el número de cfus en bazo y pulmón frente a Ia actual vacuna BCG.
Figura 7 La atenuación de infección con SO2 de Ia presente invención en ratón BaIbC por vía intravenosa no se restaura complementando con phoP. Estudio de Ia infección en ratón Balb/C por vía intravenosa de 105 cfusde Ia cepa SO2 (phoP-DIM-) comparada con Ia cepa silvestre MT103 y Ia cepa complementada con phoP (SO2 + pS05). Se observa una reducción de colonias (CFU) tanto en bazo (7a spleen) como en pulmón (7b lung), medidas a las 3 y 6 semanas. Los niveles de cfus de Ia cepa salvaje no se restauran en Ia cepa complementada. Estos experimentos en ratón immunocompetente indican que Ia sorprendente de atenuación podría deberse a una segunda mutación adicional no restaurada por Ia complementación phoP.
Fig 8. La cepa SO2 de Ia presente invención no produce DIM y Ia síntesis de DIM es independiente de Ia mutación phoP. Análisis de lípidos de diferentes cepas de M. tuberculosis por cromatografía en capa fina. 8 a Puede observarse Ia producción de DIM en Ia cepa MT103 mientras que Ia cepa SO2 y Ia complementación con el gen phoP (SO2 pS05) no producen DIM. Con esto se demuestra que en SO2 Ia ausencia de DIM es independiente de phoP. 8 b Se muestra Ia cepa MT103 y Ia cepa MT103 inactivando sólo el gen phoP (MT103 AphoP/.hyg) y las 2 son capaces de sintetizar DIM Io que confirma que Ia producción de DIM es independiente de Ia mutación phoP.
Fig 9. Construcción de los plásmidos para Ia inactivación del gen fadD26.
Fig 10. Construcción de los plásmidos para Ia inactivación del gen phoP
Fig 11. Estudio de Ia atenuación en ratón: Curva de supervivencia de ratones Balb/C inoculados por "via intratraqueal" para estudiar Ia atenuación de las diferentes cepas de M. tuberculosis. H37Rv y MT103 corresponden a cepas de M. tuberculosis sin mutaciones y todos los ratones mueren antes de Ia 10a semana con Ia cepa de M. tuberculosis DIM- (1A29) a las 20 semanas sobreviven el 50% de los ratones. Todos los animales inoculados con SO2 (mutante phoP- y DIM-) sobreviven las 20 semanas del experimento. Fig. 12. Curva de supervivencia y peso en cobayo para estudio de Ia toxicidad de SO2, con 50 veces Ia dosis vacuna . Para demostrar que SO2 no es tóxico fueron inoculados seis cobayos con 50 veces Ia dosis vacunal. La supervivencia fue del 100% a los 6 meses de duración del experimento. En todos los animales se observó un aumento de peso durante los 6 meses, indicando Ia no toxicidad de Ia cepa SO2 (Y= peso en gramos y semana de infección. X= tiempo en semanas).
Fig 13. Supervivencia cobayos vacunados tras infección con M. tuberculosis. Estudio de protección en cobayos, supervivencia a los 300 días: Curva de supervivencia de cobayos sin vacunar (salino), vacunados con Ia vacuna actual BCG, con una cepa de M. tuberculosis phoP- o con SO2 (mutante phoP- y DIM-). Tras Ia vacunación por vía subcutánea los animales son infectados con una cepa de M. tuberculosis virulenta (H37Rv) a dosis alta para estudiar Ia supervivencia. A los 60 días los 6 cobayos no vacunados mueren mientras los grupos vacunados con SO2, phoP- y BCG sobreviven. A los 300 días de Ia infección 3 cobayos vacunados con BCG y phoP- mueren mientras que sólo uno del grupo vacunado con SO2 Io que indica que Ia protección del mutante phoP es similar a Ia actual vacuna BCG mientras Ia vacunación con SO2, el doble mutante phoP- y DIM-, protege mejor en el modelo cobayo.
Fig 14. Estudio de protección en cobayos supervivencia a los 400 días: Continuación del experimento de Ia figura 13. Los 6 cobayos no vacunados murieron a los 60 días. A los 400 días de Ia infección sobreviven 3 cobayos del grupo vacunado con SO2 (fig 14a) mientras solo 1 cobayo vacunado con BCG (fig 14a y Fig 14 b) y phoP- (fig 14b) sobreviven indicando nuevamente que Ia protección del mutante phoP es similar a BCG mientras Ia vacunación con SO2 el doble mutante phoP- y DIM protege mejor a los 400 días del experimento DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de Ia presente invención se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacteríum caracterizado por que comprende Ia inactivación del gen RvO757 que confiera un fenotipo PhoP- y Ia inactivación de un segundo gen que impide Ia producción de DIM (fenotipo DIM-). Adicionalmente Ia presente invención comprende el uso de dicho microorganismo para Ia elaboración de una vacuna para Ia prevención de Ia tuberculosis así como Ia vacuna per se.
A Io largo de Ia presente invención, se demuestra como cepas aisladas del género Mycobacterium phoP- DIM- presentan unas características que les hacen especialmente aptos para su utilización como vacunas, tanto por el nivel de atenuación que adquieren como por el nivel de protección que confieren.
Con Ia finalidad de demostrar Ia atenuación se inocularon ratones inmunodeprimidos SCID por aerosol con Ia cepa SO2 (phoP- DIM-). Dichos ratones sobreviven (fig 2a) significativamente más que los ratones infectados por Ia cepa salvaje. Adicionalmente, esta atenuación es complementada con phoP en Ia cepa SO2 + pS05 (phoP+ DIM-) (Fig. 8a).
Por otro lado, cuando los estudios de atenuación se realizan en ratones inmunocompetente Balb/C por vía intravenosa (fig 7) se muestra una clara atenuación de SO2 respecto a Ia cepa salvaje MT103, pero sorprendentemente esta atenuación no se complementa con phoP al resultar Ia cepa SO2 + PSO5 (phoP+ DIM-) tan virulenta para el ratón inmunocompetente como Ia cepa salvaje. Estudios de supervivencia en ratón Balb/C comparando Ia cepa SO2 (DIM-, phoP-) con una cepa solo DIM- demuestran una supervivencia sorprendentemente mayor para SO2 (fig 11 ). Estudios comparativos de supervivencia de SO2 y BCG, en ratones SCID infectados por vía intravenosa, demuestra que el nivel atenuación de Ia cepa SO2 es mayor que Ia vacuna que actualmente se usa en humanos contra Ia tuberculosis BCG (fig 2b). Estudios de toxicidad en cobayos con 50 veces Ia dosis vacunal que se realizan como control de calidad de los lotes de vacuna BCG demuestran que en los 6 meses de estudio los cobayos aumentan su peso y no presentan lesiones histológicas no visibles macroscópicamente ni al microscopio compatibles con tuberculosis con Io que confirman Ia atenuación y no toxicidad de SO2 (fig 12). Esta sorprendente atenuación y falta de toxicidad es debida al fenotipo PhoP- DIM- y además estas mutaciones mantienen Ia sensibilidad a los fármacos antituberculosos Io que permitiría un tratamiento convencional.
En Ia presente invención se muestra como en los experimentos de vacunación realizados en los ratones Balb/c, los niveles de protección conferidos por Ia cepa SO2 de M. tuberculosis de Ia presente invención y Ia BCG fueron similares tanto en los pulmones como en el bazo hasta cuatro semanas después de Ia infección. Si comparamos las proporciones relativas de células CD4+ y CD8+ de los bazos de ratones vacunados, en los ratones vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención se encontró un porcentaje mayor de células tanto CD4+ como CD8+, comparados con los ratones vacunados con BCG. Además, cuando se estimulaban estas células con antígenos derivados de filtrado de cultivos, se midió un porcentaje significativamente superior de CD4+/IFN-γ+ en los ratones vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención a los 45 y 60 días después de Ia vacunación. Aunque no es significativa en cada punto del tiempo, se midió una tendencia similar para las CD8+/IFN-γ+ en los ratones vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención. Los datos sugieren que Ia vacunación con Ia cepa SO2 de Ia presente invención da como resultado una mejor activación de las células T, comparada con Ia vacunación con BCG, medido por Ia síntesis de IFN-γ. Dado que Ia inmunidad protectora contra M. tuberculosis depende en general de Ia generación de una respuesta inmune celular del tipo THi caracterizada por Ia secreción de IFN-γ a partir de las células T específicas del antígeno, podemos concluir que los niveles relativamente elevados de activación de las células T inducidos por Ia cepa SO2 de Ia presente invención contribuye a su capacidad para conferir una potente respuesta protectora. Adicionalmente con el uso de diversos sistemas y de modelos de ensayo y varias condiciones, hemos podido demostrar Ia capacidad relativa del modelo ratón para estudiar las diferencias de protección de BCG respecto a SO2. Se demostró que las dos vacunas SO2 (phoP- DIM-) y BCG protegen en el modelo de ratón.
Se emprendió una estrategia para comparar las vacunas en un ensayo más relevante y progresivamente más exigente con cobayos. Este enfoque sistemático a Ia comparación de vacunas podría representar un punto de partida útil para identificar las mejores vacunas candidatas que deberían llevar a nuevos ensayos. Se acepta, en general, que el cobayo es más susceptible a Ia infección por tuberculosis y, en consecuencia, podría ser un modelo más relevante para esta enfermedad [30]. En comparación con los ratones, el cobayo tiene Ia ventaja de que Ia patología de Ia enfermedad es similar a Ia que se observa en Ia tuberculosis humana y sirve, por consiguiente, como modelo apropiado para probar Ia eficacia de una vacuna. En un reciente estudio de vacuna aplicada en aerosol, con un doble mutante auxotrófico de pantotenato y leucina del M. tuberculosis, se obtuvieron niveles de protección equivalentes a Ia BCG de M. bovis en los pulmones y en el bazo de cobayos vacunados, con una difusión reducida de Ia infección al bazo inducida por ambas vacunas, cinco semanas después de Ia aplicación en aerosol de M. tuberculosis [34]. En otro estudio que utilizó BCG recombinante que expresaba ESAT-6, sólo se observaron en el bazo [6] niveles de protección superiores a Ia BCG de M. bovis, sugiriendo que Ia mejora de Ia protección se limita a su capacidad para impedir Ia difusión de Ia infección desde el pulmón.
Para llevar a cabo Ia presente infección se inocularon cobayos con una baja dosis de M. tuberculosis H37Rv, siendo los niveles de protección conferidos por Ia vacunación con Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG similares tanto en los pulmones como en el bazo hasta 4 semanas después de Ia infección. Ambas vacunas proporcionaron una protección sumamente eficiente, reduciendo los cfus en los pulmones y bazos en aproximadamente 2 log., comparado con los grupos de control que recibieron solución salina. No obstante, no existió diferencia estadísticamente significativa entre los dos grupos de vacunas. Con un período tan breve después de Ia infección, podemos suponer que sería difícil demostrar Ia mayor eficacia de una nueva vacuna respecto a Ia BCG. Esto se debe a que, en este momento, los cfu (unidad formadora de colonia) de los órganos de animales vacunados con BCG son tan bajos que el ensayo no tiene el poder diferenciador que demuestre una reducción adicional significativa de los cfu. En otros estudios de supervivencia con cobayos, se ha demostrado que, si bien Ia vacunación con BCG proporciona una protección estadísticamente significativa, comparada con controles no vacunados (o vacunas no efectivas), esta protección sólo es parcial incluso contra el ataque a baja dosis con M. tuberculosis. En los estudios de aplicación de dosis bajas realizados durante 60 a 80 semanas después de Ia infección, algunos controles con BCG no protegieron a ninguno de los cobayos [35], mientras que otros protegieron a un porcentaje reducido (de un 20 a un 30%) de los animales [36] [37]. Por el contrario, una dosis elevada de aplicación puede dar como resultado una enfermedad más grave de Ia utilizada habitualmente para evaluar Ia eficacia protectora de las vacunas para Ia TB. Para llevar a cabo Ia presente invención utilizamos infección por aerosol con una dosis relativamente elevada de M. tuberculosis H37Rv y el período de estudio fue ampliado hasta 180 días. Hicimos esto para generar un nivel más exigente de desafío que pudiera demostrar Ia potencial eficacia protectora de Ia cepa SO2 de Ia presente invención, y facilitar al mismo tiempo un nivel de discriminación en comparación con Ia BCG. En términos de supervivencia, los animales del grupo vacunado con BCG quedaron significativamente protegidos en comparación con los controles no vacunados, y demostraron un nivel global de protección similar al observado en otros estudios, a pesar de Ia dosis relativamente elevada de infección utilizada en nuestro estudio. Además, encontramos también un aumento estadísticamente significativo de Ia eficacia protectora de Ia cepa SO2 (phoP- DIM-) de Ia presente invención en comparación con Ia BCG, medida por varios indicadores, que incluían una prolongación de Ia supervivencia y el grado de consolidación de las lesiones pulmonares. Esta forma menos grave de enfermedad podría haber llevado directamente a Ia mayor supervivencia de los animales vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención.
Los resultados descritos en Ia presente invención demuestran que Ia cepa SO2 y por tanto un microorganismo perteneciente al género Mycobacterium (de forma particular del complejo M. Tuberculosis) con fenotipo phoP- DIM-, es una vacuna más eficaz que BCG de acuerdo con una serie de criterios. Es más atenuada que Ia BCG en los ratones SCID, imparte a ratones una inmunidad protectora al menos tan buena como Ia BCG y genera respuestas de inmunidad celular más potentes. Adicionalmente, en experimentos de protección realizados en cobayos contra una infección a dosis elevadas de H37Rv, Ia cepa con fenotipo DIM- phoP- imparte un 100% de supervivencia a los cobayos en circunstancias en las que Ia BCG sólo permite un 33% de supervivencia. Esta protección va asociada a una disminución de Ia gravedad de Ia enfermedad y de Ia carga bacteriana. Con objeto de comprobar si el nivel de protección de SO2 (phoP- DIM-) era debido a Ia mutación phoP o podría deberse a Ia mutación adicional en DIM se realizó un nuevo experimento de vacunación en cobayos a alta dosis de infección. Grupos de 6 animales fueron vacunados con BCG, con SO2 (PhoP- DIM-) y con M. tuberculosis phoP- DIM+ y 6 animales utilizados como control no fueron vacunados. El experimento se prolongo 400 días.
En este nuevo experimento los cobayos no vacunados murieron antes del día 70. A los 300 días de Ia infección 3 cobayos vacunados con BCG y phoP- DIM+ mueren mientras que solo Io hace uno del grupo vacunado con
SO2 Io que indica que Ia protección del mutante phoP- DIM+ es similar a Ia actual vacuna BCG mientras Ia vacunación con SO2, el doble mutante phoP- y DIM-, protege mejor en el modelo cobayo (Fig 13). A los 400 días sobreviven 3 cobayos del grupo vacunado con SO2 (fig 14a) mientras solo
1 cobayo vacunado con BCG (fig 14a y Fig 14 b) y phoP- DIM+ (fig 14b) sobreviven indicando que Ia protección del mutante phoP- DIM+ es similar a BCG mientras Ia vacunación con SO2 el doble mutante phoP- y DIM- , protege mejor a los 400 días del experimento siendo atribuido el efecto sorprendente de protección mayor que BCG no sólo a Ia mutación phoP- sino a Ia doble mutación de SO2 phoP- DIM-.
Por Io tanto un primer aspecto de Ia presente invención se refiere a un microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacteríum caracterizado porque comprende Ia inactivación o delección: a. del gen phoP ó de uno a más genes reguladores del gen phoP ó regulados por Phop y b. de un segundo gen que elimine Ia producción de DIM.
En una realización preferida de Ia invención el microorganismo aislado de Ia invención, se caracteriza porque Ia inactivación del gen phoP se realiza mediante Ia inactivación o delección del gen RvO757. En una realización más preferida de Ia invención, el microorganismo aislado de Ia invención se caracteriza porque Ia inactivación de Ia producción de DIM se realiza mediante Ia delección o inactivación del gen Rv2930 (fadD26).
En una realización aún más preferida de Ia invención, el microorganismo aislado de Ia invención, se caracteriza por comprender Ia delección o inactivación de los genes Rv2930 y RvO757.
En otra realización de Ia invención, el microorganismo aislado de Ia invención se caracteriza porque Ia especie del género Mycobacterium pertenece al complejo Mycobactarium tuberculosis.
Un segundo aspecto de Ia invención, se refiere al proceso de elaboración de el microorganismo aislado de Ia invención que comprende:
a. La inactivación o delección del gen phoP o de uno a más genes reguladores del gen phoP, preferentemente Ia inactivación o delección del gen RvO757 y b. La inactivación o delección de un segundo gen que elimine Ia producción de DIM, preferentemente Ia delección o inactivación del gen Rv2930 {fadD26)
Un tercer aspecto de Ia invención se refiere a una vacuna (de aquí en adelante vacuna de Ia invención) para inmunizar un individuo frente a los síntomas causados por Ia tuberculosis, donde dicha vacuna comprende al menos un microorganismo aislado de Ia invención.
En una realización preferida de Ia invención, Ia vacuna además comprende excipientes farmacológicamente aceptables. Un cuarto aspecto de Ia invención se refiere al proceso de elaboración de un medicamento, preferiblemente una vacuna, que comprende Ia incorporación de un microorganismo aislado de Ia invención en una dosis terapéuticamente efectiva a un medio adecuado para Ia administración humana o animal y opcionalmente, adicionar excipientes farmacológicamente adecuados para Ia fabricación de vacunas.
Dicho medicamento es adecuado para el tratamiento del cáncer de vejiga, para el tratamiento o prevención de Ia tuberculosis, o como vector o adyuvante. Preferiblemente para inmunizar un individuo frente a los síntomas causados por Ia tuberculosis,
Un quinto aspecto de Ia invención se refiere al uso del microorganismo aislado de Ia invención, para Ia elaboración de Ia vacuna de Ia invención, para Ia prevención y/o tratamiento de Ia tuberculosis humana o animal.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Materiales y métodos
1.1.- Extracción de Ia proteína e inmunoblotting. Se obtuvieron anticuerpos policlonales contra Ia proteína PhoP que recibieron cuatro dosis de PhoP
(0,5 mg), en las semanas 0, 4, 8, 12 y 16, respectivamente. Los anticuerpos anti-PhoP fueron detectados por el ensayo ELISA (ZEU- Immunotec Zaragoza, España). Los anticuerpos monoclonales contra ESAT-6 fueron facilitados amablemente por S. CoIe [24]. Se prepararon extractos proteínicos de micobacterias libres de células a partir de cultivos precoces en fase-log que crecieron en caldo Middlebrook 7H9-ADC, siguiendo los procedimientos habituales [25]. Los extractos proteínicos de M. tuberculosis se filtraron a través de un filtro Millex-GP con un tamaño de poros de 0,22 μm (Millipore, Bedford, MA). Se recogió el filtrado del cultivo del M. tuberculosis H37Rv cultivado durante 5-6 semanas y las proteínas de filtrado se precipitaron con un 45% (p/v) de sulfato amónico. Se efectuó el análisis Western Blot siguiendo los procedimientos normales. Como anticuerpos secundario se utilizaron anticuerpos anti-conejo de cabra marcados con peroxidasa de rábano (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).
1.2.- Infección de ratones SCID con M. tuberculosis. Los trabajos con ratones SCID se desarrollaron bajo el control del Comité de Atención a los Animales del Hospital Universitario "Germans Trias i Pujol", de acuerdo con las Leyes de Ia Unión Europea sobre protección de animales experimentales. Se obtuvieron ratones libres de patógenos específicos (spf) de Ia cepa SCID CB-17/lcr Ico de Charles River (Bagneux Cedex, Francia). Para infección por aerosol, los ratones se colocaron en Ia cámara de exposición de un aparato de infección transmitida por el aire (Glas-col Inc., Terre Haute, IN, EE.UU.). El compartimiento nebulizados se lleno con 7 mi de una suspensión de M. tuberculosis a fin de proporcionar una absorción aproximada de 20 bacilos viables dentro de los pulmones. Se utilizaron diez ratones por cada grupo experimental. Para infección intravenosa, grupos de 7 ratones se infectaron con 200 Dl de PBS que contenían dosis equivalentes a 2 x105, 2 x104 y 2 x103 de BCG viable y 5.4 x 106, 5.4 x 105 y 5.4 x 104 de Ia cepa M. tuberculosis phoP viable a través de una vena lateral de Ia cola . La significancia en las diferencias de los tiempos de supervivencia entre ratones tratados se determinó con el uso del test de Mantel-Haenszel. Se efectuaron recuentos de viabilidad en diluciones en serie del homogeneado, colocándose sobre agar Middlebrook 7H11 + OADC y examinándose su crecimiento al cabo de 3 semanas. Para análisis histológico, los tejidos se fijaron en solución salina tamponada con formol y se fijaron en parafina. Se cortaron secciones de cinco Dm de espesor, coloreándose con el colorante de Ziehl-Neelsen.
1.3.- Determinación de Ia activación de Ia inmunidad celular en ratones Balb/c después de vacunación subcutánea con SO2 de Ia presente invención y BCG. Se sacrificaron grupos de cuatro ratones Balb/C en los días 7, 14, 21 , 28, 45 y 60 post-vacunación subcutánea con 8x103 cfu de BCG (Phipps) o 2,5 x 103 cfu de Ia cepa SO2 de Ia presente invención. Se recogieron los bazos y se colocaron en 2 mi de medio RPMI y suero fetal de ternera al 10% (GIBCO. Invitrogen Corporation), que contenía 0,5 mg/ml de colagenasa tipo 2 (Worthington, NJ, EE.UU.), y 2U/ml de DNAase (GIBCO), incubándose durante 1 hora a 37° C, con un 5% de CO2. A continuación se pasaron a través de un tamiz celular de 70 μm (Falcon, Becton Dickinson 70 μm Nailon 35-2350), se trituraron con el pistón de una jeringa y se enjuagaron con medio. Se centrifugaron las células, se retiró el sobrenadante y se eliminaron los glóbulos rojos con tampón para lisis [26]. Después de centrifugación y lavado con medio RPMI, las células se resuspendieron en tampón FACS (PBS 1X, pH 7,2, 1% BSA), y se contaron. El mareaje de Ia superficie celular se realizó a través de incubación de 106 células con 100 μl de anticuerpos monoclonales contra CD4-FITC o CD8-FITC, diluidos a razón 1 :20 en PBS que contenía un 1% de BSA y un 0,1% de azida sódica durante 20 min a 4o C, analizándose con un citómetro FACScan.
La cepa M. tuberculosis H37Rv se cultivó en medio 7H9 de Middlebrook
(Difco Laboratories) complementado con OADC (Difco Laboratories). Al cabo de 1 mes de cultivo, se separó Ia masa bacteriana y se recogió el filtrado del cultivo. Los antígenos de dicho filtrado se precipitaron con un 45% (p/v) de sulfato amónico, se lavaron y se volvieron a disolver en PBS. Para estimular las células, 1x106 células del bazo se volvieron a suspender en 100 μl de medio RPMI por pocilio de cultivo, incubándose con 10 μg de antígenos de filtrado de cultivo de M. tuberculosis, suspendidos en 100 μl de PBS durante 72 horas a 37° C con un 5% de CO2. Las células y el medio de cultivo se centrifugaron, se desechó el sobrenadante y, después de contar y comprobar Ia viabilidad, 2,5x105 células por tubo se marcaron en Ia superficie de las células CD4+ o CD8+ tal como se ha descrito anteriormente. Después del lavado, las células se volvieron a suspender y se incubaron durante 20 min a 4o C en 0,1% de saponina disuelta en PBS. La IFN-γ intracelular se detectó por incubación de Ia célula durante 20 min a 4o C en Ia oscuridad, con 100 μl de una dilución al 1/20 de anti-IFN-γ monoclonal marcada con ficoeritrina (PE). Las células se fijaron con 100 μl de paraformaldehido al 4% diluido en PBS. Las muestras se analizaron a los 20 minutos con un citómetro FACScan. Los controles de los isotipos fueron Ab-FITC (dilución 1 :20) +Ab-PE (dilución 1 :20).
1.4.- Eficacia protectora de SO2 de Ia presente invención en los ratones Balb/c. Todos los animales se mantuvieron en condiciones controladas en el Laboratorio de Alta Seguridad P3 de Ia Instalación de Animales del Instituto Pasteur de París, de acuerdo con las directivas de Ia Unión Europea para Ia protección de animales experimentales. Grupos de ratones Balb/c (7 por grupo) fueron vacunados por vía subcutánea en Ia base del cola con 107 cfus de Ia cepa SO2 de Ia presente invención o BCG (Pasteur). A las 8 semanas después de Ia vacunación, se aplicaron a todos los ratones, por vía intravenosa, 2,5 x 105 cfu de M. tuberculosis H37Rv. Cuatro semanas después de Ia inyección, fueron sacrificados los ratones. Se efectuaron recuentos de viabilidad en diluciones en serie del homogeneado, cultivado en caldo Middlebrook 7H11 + agar OADC, examinándose a las 3 semanas el crecimiento de M. tuberculosis H37Rv , de Ia cepa SO2 de Ia presente invención sobre Ia base del fenotipo de resistencia a Ia kanamicina de esta segunda cepa.
1.5.- Eficacia protectora de SO2 de Ia presente invención en cobayos. El trabajo experimental con cobayos se desarrolló de acuerdo con las Leyes del RU para experimentación con animales, siendo aprobado por un comité local de ética de Ia Administración de Protección Sanitaria, Portón Down, RU. Se obtuvieron cobayos Dunkin-Hartley hembras de proveedores comerciales acreditados (Ministerio del Interior del RU) (David Hall, Burton- on-Trent, RU o Harían Ltd UK, Bicester, RU), y se criaron con un aislamiento completo. Los resultados presentados en Ia figura 6 muestran que Ia cepa SO2 confiere una mayor protección que BCG. Los resultados presentados en Ia figura 13 y 14 muestran que esta protección sorprendente del mutante SO2 es debida a su doble fenotipo D\M-/PhoP-.
1.6.- Aplicación de dosis baja. Grupos de 6 cobayos fueron vacunados por vía subcutánea en Ia nuca con 250μl de: 5x104 cfu de BCG Pasteur; 5x104 cfus de SO2 de Ia presente invención; o bien solución salina. Los animales se mantuvieron en reposo durante un período de 12 semanas antes del ataque con aerosol, usándose un aparato de Henderson contenido tal como se ha descrito anteriormente [27]. Se generaron aerosoles de partículas finas de M. tuberculosis H37Rv, con un diámetro medio de 2 μm, (rango de diámetro: de 0,5-7 μm), con el uso de un nebulizador de Collison, aplicándose directamente al hocico del animal. El aerosol se generó a partir de una suspensión en agua que contenía 2x106 cfu/ml a fin de obtener una dosis inhalada retenida calculada de aproximadamente 10- 50 cfu/pulmón.
Cuatro semanas después de Ia aplicación se evaluó Ia protección. Los animales se sacrificaron por sobredosis peritoneal de pentabarbital sódico.
Se retiró asépticamente tejido del bazo y pulmonar (los lóbulos craneal izquierdo y medio, lóbulo medio derecho y lóbulos caudales derechos), colocándose en recipientes estériles. El material se almacenó a - 20° C, elaborándose a continuación a fin de contar el número de bacterias. Los tejidos se homogeneizaron en 10 mi (pulmón) o 5 mi (bazo) de agua estéril desionizada, con el uso de un sistema macerador de cuchillas giratorias (Ystral). Se realizaron recuentos de células viables en diluciones en serie del homogeneado, cultivadas en Middlebrook 7H11 + agar OADC, examinándose a las 3 semanas el crecimiento del M. tuberculosis. Los datos fueron transformados en log-ι0 para su análisis y los números de M. tuberculosis viables de cada grupo de vacuna se compararon con el grupo de control con solución salina por el test de Ia "t" de Student.
1.7.- Ensayo de protección en cobayo tras infección de dosis elevada de M. tuberculosis. Grupos de 6 cobayos se vacunaron por vía subcutánea con 5 x 104 cfu de SO2 de Ia presente invención o BCG (Danish 1331 ) 10 semanas antes de Ia aplicación de aerosol con M. tuberculosis. La aplicación del aerosol se realizó como se ha descrito en el párrafo anterior, utilizándose una suspensión de 5 x 107 cfu/ml a fin de proporcionar a los pulmones alrededor de 500 cfu. Después de Ia aplicación, los animales fueron alojados al nivel de contención 3 del ACDP, se controlaron regularmente los cambios de peso y se sacrificaron humanamente 180 días después de Ia aplicación o en el punto final humano (20% de pérdida de peso corporal máximo). La recogida post mortem y el tratamiento de las muestras se realizaron como se ha descrito arriba, a excepción de que Ia consolidación pulmonar se midió con el uso de análisis por imágenes de secciones de tejido pulmonar fijado en formalina, coloreado con Hematoxylina y Eosina (H+E). La supervivencia de los animales se comparó con el uso de los cálculos de supervivencia de Kaplan Meier, utilizándose el análisis de distribución Log Rank para identificar las diferencias estadísticamente significativas. Los datos sobre cfu y consolidación de las lesiones se analizaron por el ANOVA, con el uso de comparaciones en pares de Fishers, a fin de comparar los valores medios de los grupos.
Ejemplo 2. Caracterización del M. tuberculosis phoP.
La prueba de Ia intervención del gen phoP en Ia regulación global de los circuitos genéticos de las micobacterias se obtuvo por Ia observación de los cambios en el tamaño del bacilo y las propiedades de formación de cordones de las células en crecimiento que alojaban el gen phoP inactivado. Dadas las propiedades clave de los antígenos secretados como determinantes Ia protección contra Ia tuberculosis, deseábamos determinar si los efectos pleiotrópicos de Ia mutación del gen phoP se extendían hasta influir en Ia síntesis del principal antígeno inmunodominante: el ESAT-6. En Ia cepa SO2, Ia BCG y Ia MT103 se efectuó el análisis Western blot, con el uso de anticuerpos obtenidos contra Ia proteína PhoP y ESAT-6. Los resultados demostraron claramente que Ia proteína PhoP se expresaba constitutivamente en las cepas MT103 del M. tuberculosis y de BCG, mientras que aparecía totalmente ausente en Ia cepa SO2 de Ia presente invención. Por el contrario, los niveles de expresión del ESAT-6 en el sobrenadante de cultivos de Ia cepa SO2 fueron similares a los detectados en Ia cepa parental MT103 y, como era de esperar, no se detectó Ia proteína ESAT-6 en BCG.
Ejemplo 3. Supervivencia de ratones infectados con las cepas de Ia presente invención y BCG.
La supervivencia de los ratones SCID inmuno-comprometidos se evaluó después de infección por medio aerosol (alrededor de. 20 cfu) con Ia cepa MT103, Ia SO2 y Ia SO2 complementada con el gen phoP (SO2 + pSO5) [23]. Todos los ratones infectados con Ia SO2 sobrevivieron durante más de 245 días. Por el contrario, todos los ratones SCID infectados con Ia MT103 o Ia SO2-pSO5 del M. tuberculosis complementada habían muerto a los 62 días después de Ia infección, indicando una recuperación de Ia virulencia de Ia cepa complementada (Fig. 2a).
La atenuación de Ia cepa SO2 se comparó igualmente con el BCG en ratones SCID después de administración por vía intravenosa. A grupos de ratones SCID se les inoculó una serie de dosis (2 x105, 2 x104 y 2 x103 cfu) de BCG Pasteur o de Ia cepa SO2 (5,4 x 106, 5,4 x 105 y 5., x 104 cfu) a través de una vena lateral de Ia cola. La coloración histológica de los macrófagos alveolares infectados de un subgrupo de ratones sacrificados tres semanas después de Ia infección reveló un menor número de bacilos ácido alcohol resistentes en los pulmones de ratones infectados con Ia cepa SO2 del M. tuberculosis, comparados con el BCG. Todos los ratones inoculados con las dosis mayores de BCG (2 x 105 cfu) habían muerto 92 días después de Ia infección (tiempo medio de supervivencia: 89 ± 3,5 días) (Fig. 2b). Por el contrario, todos los ratones infectados con Ia dosis más alta de SO2 (5,4 x 106 cfu) sobrevivían al cabo de 120 días (Fig. 2b). En el momento de Ia muerte, las cargas bacterianas de los pulmones de ratones infectados con BCG, 2 x 105 cfu, eran al menos 100 veces superiores, si se comparaban con los ratones infectados con SO2 con 5,4 x 106 cfu.
Ejemplo 4 Respuestas cuantitativas de CD4+ y CD8+ de ratones Balb/c vacunados
Con el fin de comparar Ia activación de Ia inmunidad celular inducida por vacunación con SO2 de Ia presente invención y BCG, los días 7, 14, 30, 45 y 60 después de Ia vacunación se recogieron suspensiones de células del bazo de grupos de al menos cuatro ratones Balb/c vacunados por vía subcutánea con Ia cepa SO2 de Ia presente invención y BCG Phipps, determinándose por citofluorometría las proporciones relativas de células CD4+ y CD8+ (Fig. 3). La vacunación con SO2 indujo un número significativamente superior de células CD4+ a los 14 días de Ia vacunación, comparado con Ia vacunación con BCG, y un número significativamente superior de células CD8+ al cabo de 45 días. Estos esplenocitos se estimularon con antígenos totales derivados de filtrado de cultivo de M. tuberculosis. A los 3 días, las poblaciones de linfocitos se analizaron por citometría de flujo, combinándose anticuerpos específicos para Ia detección de las células CD4+/CD8+ y Ia síntesis intracelular de IFN-D. La vacunación con SO2 indujo una proporción significativamente superior de células productoras de CD4+/IFN-D+ a los 45 días de Ia vacunación, comparado con el BCG (Fig. 3). A partir de un determinado punto en el tiempo, Ia proporción de células que produjeron CD8+/ IFN-D+ fue siempre superior en el grupo de SO2 (significativamente diferente el día 14).
Ejemplo 5 Inmunidad protectora generada por SO2 de Ia presente invención en ratones Balb/c.
Una vez comprobado que Ia cepa SO2 de Ia presente invención quedaba atenuada en los ratones SCID, nos interesaba determinar si Ia disminución de virulencia observada confería algún tipo de propiedad protectora a Ia cepa mutante. Vacunamos subcutáneamente a ratones Balb/c con Ia cepa SO2 de Ia presente invención o con BCG (Pasteur). Ocho semanas después de Ia vacunación, a todos los ratones se les inyectó por vía intravenosa 2,5 x 105 cfu de M. tuberculosis H37Rv. Los ratones se sacrificaron a las 4 semanas después de Ia inyección. Se determinaron los niveles de protección evaluándose los números de M. tuberculosis H37Rv viables recuperados de los pulmones y el bazo de ambos grupos de ratones (Fig. 4). Ambas vacunas confirieron niveles similares pero significativos de protección, si se comparaban con los controles tratados con solución salina (p<0,05). La inhibición del crecimiento del M. tuberculosis H37Rv se registró tanto en los pulmones como en el bazo, con reducciones de aproximadamente 1 ,5 logio y 1 ,3 logio cfu, respectivamente. Ejemplo 6 Inmunidad protectora de SO2 de Ia presente invención en cobayos.
Los resultados obtenidos en los experimentos de vacunación de ratones indicaron que Ia atenuación de Ia cepa SO2 de Ia presente invención Ie otorgaba características de vacuna similares a BCG Pasteur. No obstante, se admite por Io general que los cobayos constituyen un modelo más relevante de tuberculosis humana, con muchas semejanzas en cuanto al avance y patología de Ia enfermedad. Así pues, este modelo animal es un sistema más apropiado para evaluar Ia eficacia de una vacuna. Con el fin de investigar Ia eficacia protectora de Ia cepa SO2 de Ia presente invención, realizamos experimentos que incluían Ia aplicación a animales vacunados de aerosol a dosis bajas (10-50 cfu) y a dosis elevadas (500 cfu). Grupos de seis cobayos fueron vacunados por vía subcutánea con SO2 de Ia presente invención o con BCG. Diez semanas después de Ia vacunación, a todos los cobayos se les administraron dosis inhaladas de M. tuberculosis H37Rv.
Los animales que recibieron Ia dosis menor fueron sacrificados a las 4 semanas, contándose las cargas bacterianas en pulmones y bazos. La eficacia protectora se determinó comparándose los números de M. tuberculosis H37Rv viables recuperados de los órganos de cobayos en cada grupo de tratamiento. En este experimento, Ia reducción de las cfus en pulmones y bazos fue significativamente diferente entre los animales control no vacunados y los vacunados con BCG o SO2 de M. tuberculosis
(p=0, 005). No obstante, entre los grupos vacunados no se halló diferente significativa alguna (Fig. 5).
Los cobayos que recibieron Ia dosis elevada fueron sacrificados 180 días después de Ia aplicación o cuando se apreció 20% de pérdida de peso corporal. Se determinaron los niveles de protección comparándose los tiempos de supervivencia de los cobayos de cada grupo de tratamiento. El avance del desarrollo de las lesiones se estudió igualmente en los cobayos vacunados /infectados , comparándose con el observado en los animales no vacunados / infectados . Durante Ia fase del experimento posterior a Ia inhalación, se sacrificaron todos los cobayos no vacunados y cuatro de los cobayos vacunados con BCG en el punto final humano, antes del punto final del tiempo (180 días) debido a enfermedad grave y progresiva (Fig. 6a). Por el contrario, todos los cobayos vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención sobrevivieron mientras duró el estudio. Los cobayos vacunados con Ia cepa SO2 de Ia presente invención sobrevivieron significativamente más que los vacunados con BCG (p = 0,018), los cuales, a su vez, sobrevivieron significativamente más tiempo que los cobayos de control, tratados con solución salina (p = 0,0049). Además, los cobayos vacunados con Ia cepa SO2 aumentaron de peso y no presentaron ningún signo visible ni clínico de enfermedad.
La extensión de Ia enfermedad pulmonar, medida por Ia consolidación pulmonar total, fue también diferente entre los grupos de tratamiento. El nivel más alto de avance de Ia enfermedad se observó, como era de prever, en los cobayos no vacunados, midiéndose en este grupo de animales un porcentaje medio de consolidación del 76% (Fig. 6b, 6c). La coalescencia de granulomas fue también pronunciada en los cobayos vacunados con BCG, con una consolidación media del 70% medida en los pulmones. Por el contrario, se observó una menor consolidación (aproximadamente el 50%) en los cobayos vacunados con SO2 de Ia presente invención, siendo esta consolidación significativamente reducida (p<0.05) tanto con los animales no vacunados como con los vacunados con BCG (Fig. 6c). Esta disminución de Ia gravedad de Ia enfermedad se reflejó igualmente en los recuentos bacterianos de homogeneados de pulmón y bazo. En los grupos vacunados se observó una diferencia en los niveles de inhibición del crecimiento de M. tuberculosis H37Rv en ambos órganos. Los números de cfu recuperados de los cobayos vacunados con SO2 se redujeron en más de 1 x logio comparados con los de cobayos vacunados con BCG, y esta reducción fue estadísticamente significativa (p <0,05) en el bazo (Fig 6d). Estos datos demostraron que en Ia cepa SO2 de Ia presente invención fue superior al BCG para conferir una mayor supervivencia a los cobayos infectados, una disminución de Ia gravedad de Ia enfermedad en el pulmón y el paso de Ia infección al bazo.
Ejemplo 7 Atenuación de SO2 de Ia presente invención es debida a Ia doble mutación PhoP- DIM-.
Los estudios de infección en ratón Balb/C por vía intravenosa de Ia cepa SO2 (phoP-DIM-) comparada con Ia cepa silvestre MT103 y Ia cepa complementada con phoP (SO2 + pS05) mostraron que Ia atenuación de infección con SO2 en ratón BaIbC por vía intravenosa no se restaura al complementar con phoP. La reducción de colonias (CFU) tanto en bazo (7a spleen) como en pulmón (7b lung), medidas a las 3 y 6 semanas, no se restauran en Ia cepa complementada siendo no virulenta en ratón immunocompetente sugiriendo estos experimentos que Ia sorprendente de atenuación podría deberse a una segunda mutación adicional (figura 7).
Los estudios de los lípidos de diferentes cepas de M. tuberculosis por cromatografía en capa fina mostraron que Ia cepa SO2 no produce DIM y este hecho es independiente de Ia mutación phoP (figura 8)
Para demostrar que SO2 no es tóxico fueron inoculados seis cobayos con 50 veces Ia dosis vacunal. La supervivencia fue del 100% a los 6 meses de duración del experimento. En todos los animales se observó un aumento de peso durante los 6 meses, indicando Ia no toxicidad de Ia cepa SO2 (Y= peso en gramos y semana de infección. X= tiempo en semanas) Fig 12. También se estudió Ia sensibilidad a fármacos antituberculosos. Se determinó Ia concentración inhibitoria mínima (CIM) de los antituberculosos Etambutol, Isoniacida, Rifampicina y Estreptomicina frente a las cepas de M. tuberculosis H37Rv, MT103 (wild type) como control y Ia cepa SO2. Los valores (microgramos/ml) indican que tras Ia inactivación de gen phoP Ia cepa candidata a vacuna SO2 conserva Ia sensibilidad a los fármacos mas frecuentes usados en clínica contra Ia tuberculosis.
Etambutol Isoniacida Rifampicina Estreptomicina H37Rv 2 0,5 < 0,004 <0,5
MT103 2 0,5 < 0,004 <0,5
SO2 2 0,25 < 0,004 <0,5
Los estudios de Ia atenuación en ratones BaIbC inoculados por "vía intratraqueal" mostraron que cepa de M. tuberculosis DIM- (1A29) a las 20 semanas sobreviven el 50% de los ratones. Todos los animales inoculados con SO2 (mutante phoP- y DIM-) sobreviven sorprendentemente las 20 semanas del experimento (figura 11)
Ejemplo 8 Protección de SO2 de Ia presente invención es debida a Ia doble mutación PhoP- DIM-.
Se estudió Ia protección en cobayos vacunados e infectados por aerosol con M. tuberculosis H37Rv. La supervivencia en cobayos a los 300 días. Tras Ia vacunación por vía subcutánea los animales son infectados con una cepa de M. tuberculosis virulenta (H37Rv) con dosis alta para estudiar Ia supervivencia. A los 60 días los 6 cobayos no vacunados mueren mientras los grupos vacunados con S02, phoP- y BCG sobreviven. A los 300 días de Ia infección 3 cobayos vacunados con BCG y phoP- mueren mientras que solo uno del grupo vacunado con SO2 Io que indica que Ia protección del mutante phoP es similar a Ia actual vacuna BCG mientras Ia vacunación con SO2 el doble mutante phoP- y DIM protege mejor en el modelo cobayo Figura 13).
Prolongando estos estudios de protección en cobayos 400 días los 6 cobayos no vacunados murieron a los 60 días. A los 400 días de Ia infección sobreviven 3 cobayos del grupo vacunado con SO2 (fig 14a) mientras solo 1 cobayo vacunado con BCG (fig 14a y Fig 14 b) y phoP- (fig
14b) sobrevive indicando nuevamente que Ia protección del mutante phoP es similar a BCG mientras Ia vacunación con SO2 el doble mutante phoP- y DIM protege sorprendentemente mejor a los 400 días del experimento.
Ejemplo 9. Construcción del candidato a vacuna contra Ia tuberculosis basado en Ia mutación por deleción del gen fadD26
Las cepas de M. tuberculosis utilizadas para Ia construcción del mutante por deleción del gen fadD26 (AfadD26) son SO2, que contiene el gen phoP inactivado por inserción de un cassette de resistencia a kanamicina, y Ia cepa clínica MT103.
1. Construcción de los plásmidos
1.1. Clonaje del gen fadD26, implicado en Ia síntesis de DIM. El gen fadD26 fue amplificado por PCR, a partir de DNA genómico de M. tuberculosis H37Rv usando los cebadores fadD26Fw (SEQ ID NO:1 ) y fadD26Rv (SEQ ID NO:2). El producto de PCR fue insertado en el vector pGEM-T Easy (Promega), para construir el plásmido pAZ1.
1.2. Deleción del gen fadD26 e inserción del cassette de resistencia a higromicina. Un fragmento BamHI-EcoRV de pWM27 (Malaga et al.
2003), que contiene el cassette res-ΩΛygr-res (los sitios res, reconocidos por Ia resolvasa γδ, permitirán en un segundo paso eliminar el marcador de resistencia), fue insertado entre los sitios BamHI-EcoRV de fadD26 en pAZ1 para construir pAZ3.
1.3. Construcción del vector suicida para Ia inactivación del gen por recombinación homologa. El plásmido pAZ3 fue digerido con Xho\ liberando el inserto fadD26::Ωhyg que se incorporó al vector pJQ200X, linealizado con Ia misma enzima. El plásmido final fue nombrado pAZ5.
2. Construcción de las cepas de M. tuberculosis DIM-
2.1. El plásmido pAZ5 fue introducido en las cepas de M. tuberculosis SO2 y MT103.
2.2. Selección de los recombinantes simples. Cultivo en higromicina (20 μg/ml) de las bacterias que han incorporado el plásmido y comprobación por su resistencia a gentamicina (10 μg/ml).
2.3. Selección de los dobles recombinantes. Cultivo en sacarosa 2%
(Pelicic et al. 1997) e higromicina de los recombinantes simples y comprobación por su sensibilidad a gentamicina.
3. Eliminación del marcador de resistencia a antibiótico de Ia mutación AfadD26
3.1. Para eliminar el cassette res-ΩΛygr-res y producir Ia mutación sin marcador de resistencia a antibiótico, el plásmido pWM19, que contiene Ia resolvasa γδ, se introduce y selecciona por resistencia a gentamicina. Posteriormente, el plásmido se elimina incubando a 39
0C en sacarosa 2% (Malaga eí al. 2003). Ejemplo 2.2.- La cepa de M. tuberculosis utilizada para Ia construcción del doble mutante por delección AphoP AfadD26 es MT103 AfadD26.
4. Construcción de los plásmidos
4.1. Clonaje del gen phoP. El gen phoP fue amplificado por PCR, a partir de DNA genómico de M. tuberculosis H37Rv usando los primers phoPF (SEQ ID NO:3) y phoPR (SEQ ID NO:4). El producto de PCR fue insertado en el vector pGEM-T Easy (Promega), para construir el plásmido pAZ11.
4.2. Deleción del gen phoP e inserción del cassette de resistencia a kanamicina. Un fragmento BamHI-EcoRV de pCG122 (Malaga et al. 2003), que contiene el cassette res-Ω/oτ7-res, fue insertado entre los sitios Bc/l-£coRV de phoP en pAZ11 para construir pAZ13.
4.3. Construcción del vector suicida para Ia inactivación del gen por recombinación homologa. El plásmido pAZ13 fue digerido con Xho\ liberando el inserto phoPv.Ωkm que se incorporó al vector pJQ200X, lineal izado con Ia misma enzima. El plásmido final fue nombrado pAZ15.
5. Construcción de Ia cepa de M. tuberculosis doble mutante AphoP AfadD26
5.1. El plásmido pAZ15 será introducido en Ia cepa de M. tuberculosis MT103 AfadD26. 5.2. Selección de los recombinantes simples. Cultivo en kanamicina (20 μg/ml) de las bacterias que han incorporado el plásmido y comprobación por su resistencia a gentamicina (10 μg/ml).
5.3. Selección de los dobles recombinantes. Cultivo en sacarosa 2%
(Pelicic et al. 1997) y kanamicina de los recombinantes simples y comprobación por su sensibilidad a gentamicina.
6. Eliminación del marcador de resistencia a antibiótico de Ia mutación AphoP
6.1. Para eliminar el cassette res-Ω/oτ7-res y producir Ia mutación sin marcador de resistencia a antibiótico, el plásmido pWM19, que contiene Ia resolvasa γδ, será introducido y seleccionado por resistencia a higromicina (20μg/ml). Posteriormente, el plásmido será eliminado incubando a 39 0C en sacarosa 2% (Malaga eí al. 2003).
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Claims

Reivindicaciones
1. Microorganismo aislado perteneciente al género Mycobacteríum caracterizado porque comprende Ia inactivación o delección:
a) del gen phoP ó de uno a más genes reguladores del gen phoP ó regulados por Phop y b) de un segundo gen que elimine Ia producción de DIM.
2. Microorganismo aislado según Ia primera reivindicación, dónde Ia inactivación del gen phoP se realiza mediante Ia inactivación o delección del gen RvO757.
3. Microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, dónde Ia inactivación de Ia producción de DIM se realiza mediante Ia delección o inactivación del gen Rv2930 (fadD26).
4. Microorganismo aislado según Ia reivindicación 3, dónde dicho microorganismo está caracterizado por comprender Ia delección o inactivación de los genes Rv2930 y RvO757.
5. Microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores dónde Ia especie del género Mycobacteríum pertenece al complejo Mycobactaríum tuberculosis.
6. Proceso de construcción de el microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 que comprende: a) La inactivación o delección del gen phoP o de uno a más genes reguladores del gen phoP ó regulados por PhoP y b) La inactivación o delección de un segundo gen que elimine Ia producción de DIM.
7. Proceso según Ia reivindicación anterior donde Ia inactivación del gen phoP se realiza mediante Ia inactivación del gen RvO757.
8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, dónde Ia inactivación de Ia producción de DIM se realiza mediante Ia delección o inactivación del gen Rv2930 (fadD26).
9. Vacuna para inmunizar o prevenir frente a los síntomas causados por Ia tuberculosis, que comprende un microorganismo aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
10. Vacuna según Ia reivindicación anterior, que además comprende excipientes farmacológicamente aceptables.
11. Proceso de elaboración de Ia vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9-10 para inmunizar o prevenir frente a los síntomas causados por Ia tuberculosis, que comprende al menos:
a) Incorporar un microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 en una dosis terapéuticamente efectiva a un medio adecuado para Ia administración humana o animal y b) Opcionalmente adicionar excipientes farmacológicamente adecuados para Ia fabricación de vacunas.
12. Microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso como medicamento.
13. Microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso como vacuna.
14. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 para el tratamiento del cáncer de vejiga.
15. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 para el tratamiento o prevención de Ia tuberculosis.
16. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13 como vector o adyuvante.
17. Uso del microorganismo aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, para Ia elaboración de una vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, para Ia prevención o inmunización frente a Ia tuberculosis humana o animal.
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