WO2007102563A1 - 炎症性マーカー測定によるトロンビン受容体アンタゴニストの効果の判定方法 - Google Patents

炎症性マーカー測定によるトロンビン受容体アンタゴニストの効果の判定方法 Download PDF

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WO2007102563A1
WO2007102563A1 PCT/JP2007/054490 JP2007054490W WO2007102563A1 WO 2007102563 A1 WO2007102563 A1 WO 2007102563A1 JP 2007054490 W JP2007054490 W JP 2007054490W WO 2007102563 A1 WO2007102563 A1 WO 2007102563A1
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hydrogen atom
receptor antagonist
inflammatory marker
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PCT/JP2007/054490
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Inventor
Motoji Kogushi
Hiromitsu Yokohama
Shinichi Kitamura
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/44—Iso-indoles; Hydrogenated iso-indoles
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    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the effect of a tombbin receptor antagonist, preferably a 2-iminopyrrolidine derivative, by reducing inflammatory markers. More specifically, the present invention relates to a method for measuring an inflammatory marker in a biological sample and determining the inhibitory effect of a thrombin receptor antagonist, preferably a 2-iminopyrrolidine derivative, on the occurrence of cardiovascular events from the obtained measurement results. . Background art
  • Cardiovascular events in patients with acute coronary syndrome are difficult to predict the onset, and so far, factors that can assess their risk have been studied.
  • Inflammatory markers are promising as one of the factors. Patients with high levels of inflammatory markers are known to have a high risk of developing cardiovascular events in ACS patients. J 3 .Iibby, PM Eidker and A. Maseri, Inflammation and Atherosclerosis. Circulation 2002; 1135-1143). The local inflammation that occurs in the cardiovascular system is thought to be involved in the occurrence of cardiovascular events.
  • CD40 ligand an inflammatory marker
  • soluble CD40 ligand an inflammatory marker
  • CD40 ligand is normally present in platelets and is found to migrate to the cell surface upon platelet activation and be released as soluble CD40 ligand by platelet aggregation (SX Anaiid, JF Viles -Gonzalez, J. ⁇ J. Badimon, E. Cav sogl and JD 7 054490
  • Soluble p-selectin has been reported to increase myocardial injury in patients with non-elevated ACS at high plasma concentrations (Circ. J 2005; 69: 530-535, Relationship between myocardial injury and soluoie P-selectm in non-ST elevation acute coronary syndrome).
  • thrombin is thought to be an important molecule that constitutes the cascade of inflammatory reactions that occur in blood vessels
  • Thrombin has also been shown to activate the protease activated receptor (PARI) (thrombin receptor).
  • PARI protease activated receptor
  • 2-iminopyrrolidine derivatives are known as PARI (thrombin receptor) antagonists.
  • 2-Iminopyrrolidine derivatives are known to have an inhibitory effect on the occurrence of cardiovascular events in high-risk stable angina patients, myocardial infarction patients who have undergone thrombolytic therapy, or ACS patients.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and a problem to be solved is to find a method for determining the cardiovascular event occurrence inhibitory effect of a mouth-and-mouth receptor antagonist.
  • the present inventor has conducted extensive research to solve the above problems, and as a result, in experiments using platelets and other cells, the ability of 2-iminobilolidine derivative, which is known as a PAE1 antagonist S, found to suppress the value of inflammatory markers.
  • compound A contained in 2-iminopyrrolidine derivatives (see formula (V) below), inhibitory action on soluble CD40 ligand release from platelets, inhibitory action on IL-6 release from vascular smooth muscle cells And found to have an inhibitory effect on P-selectin expression of vascular endothelial cells.
  • These inflammatory markers are known to be elevated in ACS patients and are known to be associated with the incidence of cardiovascular events in patients.
  • 2-iminopyrrolidine derivatives are a group of compounds known to have an inhibitory effect on the occurrence of cardiovascular events.
  • the thrombin receptor Antagoest containing 2-iminopyrrolidine derivatives suppresses local inflammation. This was thought to suppress the occurrence of cardiovascular events.
  • the inhibitory effect of thrombin receptor antagonists on the occurrence of cardiovascular events can be predicted using the decrease in inflammatory markers by thrombin receptor antagonists as an index, and the present invention has been completed. . That is, the present invention measures an inflammatory marker in a biological sample, and determines the inhibitory effect of a thrombin receptor antagonist, preferably a 2-iminopyrrolidine derivative, on the occurrence of a cardiovascular event from the obtained measurement result force Is the method.
  • Examples of the 2-iminopyrrolidine derivative include a compound represented by the general formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • a ring is a pyrrolidine ring
  • B ring is a benzene ring or a pyridine ring
  • R 101 , Ri 02 and R 1Q3 are each independently the same or different, a hydrogen atom, a halogen atom A Ci to C 6 alkyl group or a Ci to C 6 alkoxy group;
  • R 10 , R n , R 12 , R 13 and R 14 are each independently the same or different and represent a hydrogen atom, an alkyl group, a hydroxyl group, a Ci Cs alkoxy group, a morpho 2007/054490 shows a linyl group, an optionally substituted piperazil group, an optionally substituted piperidyl group or an optionally substituted pyrrolidinyl group, R 11 and R 12 , or R 12 and R 13 may be bonded to each other to form a 5- to 8-membered heterocyclic ring.
  • Examples of the 2-iminopyrrolidine derivative include a compound represented by the general formula (III), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • Ri and R 2 are independently the same or different and each represents a hydrogen atom, a methoxy group or an ethoxy group;
  • X 1 represents a hydrogen atom or a halogen atom;
  • a r 2 represents 1 Or a phenyl group which may be substituted with two or more substituents,
  • the substituent is selected from a methyl group, an ethyl group, a methoxy group, an ethoxy group, a t-propyl group, a morpholinyl group, and a substituent represented by the following formula (IV),
  • W represents one CH— or nitrogen atom
  • Ai represents one CH 2 — or a single bond
  • R 3 represents a hydrogen atom or one OR 5a
  • X 2 represents one CH 2 —, oxygen An atom, a single bond or a carbonyl group
  • Y is a single bond or a Ci to C 4 alkylene group
  • R 4 is a hydrogen atom, _OR 6a , a cyan group or Represents one COO R7
  • R 5a , R 6a and R 7 are each independently the same or different and each represents a hydrogen atom or a Ci to C 4 alkyl group.
  • R 1 and R 2 are ethoxy groups, and X 1 is a fluorine atom.
  • the 2-iminopyrrolidine derivative is, for example, at least one selected from the group consisting of compounds represented by formulas (V) to (XII), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvent thereof. You can give a Japanese product.
  • examples of the 2-iminopyrrolidine derivative include a compound represented by the formula (V), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • thrombin receptor antagonist examples include 2. iminopyrrolidine derivative, for example, SCH530348 (International Publication No. 2005/118576 A1 Pamphlet, US2004 / 0176418 Al, Circulation 2005, 112, Supplementll, II-32 ), SCH79797 (Bioorg Med Chem Lett 1999, 9, 2073-2078, Biochemical Pharmacology 2000, 60, 1425-1434), BMS200261 (J Med Chem 1996, 39, 4879-4887), RWJ58259 (J Med Chem 2001, 44, 1021-1024, J Pharmacol. Exp. Ther 2001, 298, 34-42), FR171113 (Eur J Pharmacol 1999, 384, 197-202).
  • SCH530348 International Publication No. 2005/118576 A1 Pamphlet, US2004 / 0176418 Al, Circulation 2005, 112, Supplementll, II-32
  • SCH79797 Bioorg Med Chem Lett 1999, 9, 2073-2078, Biochemical Pharmacology 2000, 60, 14
  • the inflammation individual marker examples include at least one selected from the group consisting of a soluble CD40 ligand, IL-6 and P-selectin force. According to the present invention, there is provided a method for determining the cardiovascular event generation inhibitory effect of a thrombin receptor antagonist by decreasing the inflammatory marker.
  • the inhibitory effect of the tombbin receptor antagonist on the occurrence of cardiovascular events is a decrease in at least one inflammatory marker selected from soluble CD40 ligand, IL-6 and P-selecti. As a result, it became possible to predict.
  • an inflammatory marker is used in an ACS patient. It has become possible to use it as a guideline for deciding a treatment policy such as, and more preferably, an inflammatory marker can be used as an index of effectiveness in the development of therapeutic agents for diseases such as ACS.
  • FIG. 1 shows the inhibitory action of Compound A on the release of soluble CD40 ligand from platelets.
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of Compound A on IL-6 release from vascular smooth muscle cells.
  • FIG. 3 shows the inhibitory action of Compound A on P-selectin expression in vascular endothelial cells.
  • the present invention provides a method for determining the effect of a thrombin receptor antagonist by reducing the inflammatory marker. More specifically, the present invention selects the inhibitory effect of a thrombin receptor antagonist, preferably a 2-iminopyrrolidine derivative, on the occurrence of cardiovascular events from soluble CF40 ligand, IL-6 and P-selectin in biological samples. A method of determining by a decrease in one or more inflammatory markers is provided.
  • the thrombin receptor antagonist acts on the thrombin receptor to reduce the intensity of the signal generated from the receptor, to inhibit the generation of the signal from the thrombin receptor, or to receive thrombin receptor It has the action of antagonizing the binding of an agonist to the body.
  • examples of the thrombin receptor antagonist include 2-iminopyrrolidine derivatives, SCH530348, SCH79797, BMS200261, RWJ58259, and FR171113.
  • the thrombin receptor antagonist is preferably a 2-iminobinary lysine derivative.
  • examples of the 2-iminopyrrolidine derivative may include a compound represented by the following general formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • general formula (I) a compound represented by the following general formula (I), a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • Ring A is a pyrrolidine ring
  • Ring B is a benzene ring or a pyridine ring
  • R101, RK> 2 and R10 3 are each independently the same or different and each represents a hydrogen atom, a rogen atom, a Ci to C 6 alkyl group or a Ci to C 6 alkoxy group;
  • a ri represents a group represented by the following formula (II). 54490
  • R 10 , RU, Ri 2 , R and R 14 are each independently the same or different and are each a hydrogen atom, a C i to C 6 alkyl group, a hydroxyl group, a C i to C 6 alkoxy group, a morpholinyl group, a substituent Has a group, may have piperazinyl group, have a substituent! /, Represents a pyrrolidinyl group which may have a piperidinyl group or a substituent,
  • Rii and Ri 2 , or R 12 and Ris may be bonded to each other to form a 5- to 8-membered heterocyclic ring.
  • the substituent that the piperazinyl group, piperidinyl group or pyrrolidinyl group may have, but is not limited to, for example, a hydroxyl group, a cyanomethyl group, a methoxy group, one COCH 2 OH, one CH 2 COOCH One or more selected from the group consisting of 2 CH 3 and 1 CH 2 COOH can be mentioned.
  • examples of the 2-iminopyrrolidine derivative include a compound represented by the following general formula (III), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvent thereof. .
  • R 1 and R 2 are each independently the same or different and each represents a hydrogen atom, a methoxy group or an ethoxy group;
  • X 1 represents a hydrogen atom or a halogen atom
  • a r 2 represents a phenyl group which may be substituted with one or more substituents, wherein the substituent is a methyl group, an ethyl group, a methoxy group, an ethoxy group, or t-butyl.
  • W represents one C H— or nitrogen atom
  • Ai represents one CH 2 — or single bond
  • R 3 is a hydrogen atom or _O R 5a ;
  • X 2 represents one CH 2 —, an oxygen atom, a single bond or a carbonyl group
  • Y is a single bond or a C 1 -C 4 alkylene group
  • R 4 represents a hydrogen atom, one OR 6a , a cyan group or one COOR 7 ;
  • RSa, RSa ⁇ Pi R7 are each independently the same or different, represent a hydrogen atom or a C] L -C 4 Anorekiru group.
  • R 1 and R 2 are ethoxy groups, and X 1 is a fluorine atom.
  • halogen atom examples include atoms such as a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom, preferably a fluorine atom, a chlorine atom and a bromine atom.
  • ⁇ ⁇ Ji 6 alkyl group represents a linear or branched alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms.
  • Suitable groups include, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, iso-propyl group, n-butynole group, iso-ptynole group, sec-butyl group, tert-butyl group, n-pentyl group, 1, 1-dimethylpropyl group, 1,2-dimethylpropyl group, 2,2-dimethylpropyl group, 1-ethylpropyl group, 2-ethylpropyl group, 1-methylbutyl group, 2-methylbutyl group, n-hexyl group, 1 —Methyl-1-2-ethylpropyl, 1-ethyl-2-methylpropyl, 1,1,2_trimethylpropyl, 1_propylpropyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 2, Examples include linear or branched alkyl groups such as 2-dimethylbutyl group, 1,3-dimethylbutyl
  • C i to C 4 alkyl group represents a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • Suitable groups include, for example, straight or branched alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, iso-propyl, n-butyl, iso-butyl, sec-butyl, and tert-butyl. More preferred are methyl, ethyl, n-propyl pill, 'is ⁇ -propyl, ⁇ -butyl, iso-butyl, sec-butyl, tert-butyl. Etc.
  • C i -C 6 alkoxy group means an alkoxy group having 1 to 6 carbon atoms
  • suitable groups include, for example, a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, and an iso-propoxy group.
  • a divalent group from which hydrogen atoms are removed one by one such as a linear or branched alkylene group such as a methylene group, an ethylene group, an n-propylene group, and an iso-propylene group.
  • Ci ⁇ C 6 alkoxy C i ⁇ C 6 alkyl group as used herein, means a C i to C 6 alkyl group substituted with Ci ⁇ C 6 alkoxy group.
  • 5- to 8-membered heterocyclic ring means a 5- to 8-membered aromatic heterocyclic ring or a non-aromatic heterocyclic ring.
  • the 5- to 8-membered aromatic heterocycle includes, for example, furyl group, enyl group, pyrrolyl group, pyrazolyl group, imidazolyl group, triazol group, oxazolyl group, isoxazolyl group, pillar group, pyridyl group, pyridazinyl group, pyrimidininole group, Examples include pyrajur groups.
  • Examples of the 5- to 8-membered non-aromatic heterocycle include a pyrrolidinyl group, an imidazolinyl group, an oxazolinyl group, an imidazolidinyl group, a piperidyl group, a piperazinyl group, and a morpholinyl group.
  • n— means normal type or primary substituent
  • sec— means secondary substituent
  • t— (tert—) Means a tertiary substituent
  • i— (iso—) means an isotype substituent.
  • the compound represented by the general formula (I) and the compound represented by the general formula ( ⁇ ), or a pharmaceutically acceptable salt, or a solvate thereof is prepared by a person skilled in the art by a known method. It can be produced by the method described in WO 02/085855.
  • the 2-iminopyrrolidine derivative represented by the general formula (I) and the general formula ( ⁇ ) is preferably a compound represented by the formula (V) to (XII), or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Or a solvate thereof. More preferred is a compound represented by formula (V), or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof.
  • the compound represented by the formula (V) may be referred to as “compound A” in the present specification.
  • the 2-iminopyrrolidine derivatives represented by the formulas (V) to (XII) can be produced by the method described in WO 02/085855.
  • the tombin receptor antagonist includes, for example, SCH530348 (WO 2005/118576 A1 pamphlet, US2004 / 0176418 A1, Circulation 2005, 112, Supplementll, ⁇ '32), SCH79797 (Bioorg Med Chem Lett 1999, 9, 2073-2078, Biochemical Pharmacology 2000, 60, 1425-1434), BMS200261 (J Med Chem 1996, 39, 4879-4887), RWJ58259 (J Med Chem 2001, 44, 1021-1024, J Pharmacol Exp. Ther 2001, 298, 34-42), or FR171113 (Eur J Pharmacol 1999, 384, 197-202), their pharmaceutically acceptable salts, or their solvates. .
  • SCH530348 WO 2005/118576 A1 pamphlet, US2004 / 0176418 A1, Circulation 2005, 112, Supplementll, ⁇ '32
  • SCH79797 Bioorg Med Chem Lett 1999, 9, 2073-2078, Biochemical Pharmacology 2000, 60, 14
  • the SCH530348, SCH79797, BMS200261, RWJ58259R and FG171113 can be manufactured by a known method.
  • the SCH530348, SCH79797, BMS200261, and RWJ58259 can be manufactured by the methods described in the literature shown in parentheses after the names.
  • the thrombin receptor antagonist may form a pharmaceutically acceptable salt with an acid or base.
  • the antagonist in the present invention includes these pharmaceutically acceptable salts.
  • the pharmaceutically acceptable salt is not particularly limited as long as it forms a pharmaceutically acceptable salt with the thrombin receptor antagonist. Absent.
  • halogen hydrohydrogen salts for example, hydrofluoric acid salts, hydrochlorides, hydrobromide salts, hydrofluoric acid salts, etc.
  • inorganic acid salts for example, sulfates, nitrates, perchlorates
  • Acid salts for example, phosphates, carbonates, bicarbonates, etc.
  • organic carboxylates eg formate, acetate, lactate, succinate, oxalate, maleate, tartrate, fumaric acid
  • organic sulfonate eg methanesulfonate, trifluoromethanesulfonate, ethanesulfonate, benzenesulfonate, toluenesulfone
  • Acid salts camphor monosulfonates, etc.
  • amino acid salts eg aspartate, glutamate etc.
  • ammonium salt for
  • the thrombin receptor antagonist has an asymmetric carbon depending on the type of substituent, and the force that optical isomers such as geometric isomers, optical isomers, diastereomers, etc. may exist.
  • the body is also included in thrombin receptor antagonists.
  • solvates when a solvate such as a hydrate of a thrombin receptor antagonist exists, these solvates are also included in the thrombin receptor antagonist used in the present invention.
  • solvates include hydrates and non-hydrates, and preferably hydrates.
  • the solvent include water, an alcohol (eg, methanol monoethanol, ethanol, n-propanol), and dimethinorenolem amide.
  • the thrombin receptor antagonist includes a thrombin receptor antagonist that undergoes metabolism such as oxidation, reduction, hydrolysis, and conjugation in vivo.
  • the thrombin receptor antagonist also includes a compound that generates a thrombin receptor antagonist upon metabolism in the living body such as acid, reduction, and water.
  • one or more thrombin receptor antagonists can be used from the above compounds.
  • the thrombin receptor antagonist may be used as it is, or as a medical product.
  • the pharmaceutical composition is not particularly limited as long as it is a composition containing a thrombin receptor antagonist.
  • the pharmaceutical composition includes various dosage forms containing the thrombin receptor antagonist, such as tablets, powders, fines, granules, capsules, syrups, etc. For parenterals, suppositories, injections, ointments, poultices and the like are listed.
  • the effective dose of the thrombin receptor antagonist, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a solvate thereof is the degree of symptoms, patient age, sex, body weight, susceptibility difference, administration method, administration Although it varies depending on the timing, dosing interval, dosing period, properties of the preparation, preparation, type, type of active ingredient, etc., those skilled in the art can appropriately set. For example, for adults (body weight 60 kg), 0.1 to 500 mg, preferably 0.5 to 2 ⁇ O mg, more preferably 1 to 100 mg per day, once to several times It can be administered separately. Administration may be performed orally or parenterally. 2.
  • the present invention provides a method for measuring an inflammatory marker in a biological sample and determining the inhibitory effect of a thrombin receptor antagonist, preferably a 2-iminopyrrolidine derivative, on the occurrence of a cardiovascular event from the obtained measurement result. .
  • a thrombin receptor antagonist preferably a 2-iminopyrrolidine derivative
  • the “living body” means, for example, a mammal such as human, mouse, rat, hamster, guinea pig, rabbit, cat, Inu, pig, rush, horse, goat, monkey or one of them. Part.
  • biological sample means a sample derived from the living body, for example, ⁇ , tissue, cell or body fluid (blood, cerebrospinal fluid, etc.) derived from the living body.
  • the biological sample is preferably an organ, tissue, cell or body fluid in which an inflammatory marker is expressed, and more preferably platelet, vascular smooth muscle cell or vascular endothelial cell.
  • inflammatory marker 1 means that it can be used as an index for determining the presence or absence of inflammation, and is preferably related to the occurrence of cardiovascular events.
  • the inflammatory marker used in the present invention is preferably a soluble CD40 ligand, Interleukin-6 (IL-6), P-selectin, C'reactive protein (CRP), MPO (myeloperoxidase), PIGF (Placental Growth Factor), soluble intracellular adhesion molecule -1 (ICAM-I), soluble E selecting Tumor necrosis factor a (TNFa), LpPLA2 (Iipoprotein-associated p ospholipase A2), ⁇ (pregnancy-associated plasma protein A), serum amyloid A, and fibrinogen
  • the inhibitory effect of a cardiovascular event can be determined using the decrease in the expression level of these inflammatory markers in a biological sample as an index.
  • the expression level of the inflammatory marker can be analyzed by measuring the protein level and / or mRNA level of the inflammatory marker.
  • one kind of inflammation individual marker may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • the amount of protein can be measured by a known method, such as Western plot, ELISA, EIA, RIA, flow cytometry, immunochemical methods such as immunohistochemical staining, mass spectrometry, etc. . Those skilled in the art can carry out these methods according to standard methods. '
  • the method for measuring the amount of niRNA can be carried out by a known method, and examples thereof include in situ hybridization, Northern blot analysis, DNA microarray, RT-PCR, and quantitative PCR. Those skilled in the art can carry out these methods according to standard methods.
  • Reduction of soluble CD40 ligand in the biological sample is preferably
  • CD40 ligand release can be quantified and measured. For example, it can be measured by the method of Example 1 described later.
  • Blood may be collected from healthy individuals or from patients with a history of cardiovascular events. Platelets can be obtained by centrifuging collected blood. The In some cases, a drug such as a citrate solution may be added to the blood to prevent blood clotting.
  • a drug such as a citrate solution may be added to the blood to prevent blood clotting.
  • the thrombin receptor antagonist can act on platelets by mixing with blood, preferably the resulting platelets.
  • a fibrin polymerization inhibitor may be added to the mixed solution.
  • the fipurin polymerization inhibitor for example, a known one such as GPRP-NH 2 (SEQ ID NO: 1) can be used.
  • thrombin solution or: PAR-1 activating peptide eg, SFLLRN-NH 2 (SEQ ID NO: 2)
  • the amount of soluble CD40 ligand in the sampnore can be measured using a commercially available ELISA kit (for example, Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria).
  • adenosine diphosphate instead of thrombin solution or PAR-1 activation peptide as a stimulant, it is also possible to determine whether PAR-1-mediated activation is inhibited or not. Is possible.
  • the decrease in soluble CD40 ligand can be assessed by comparing the amount of soluble CD40 ligand in the absence and presence of thrombin receptor antagonists.
  • the thrombin receptor antagonist may act on platelets by administering the antagonist to a living body.
  • the decrease in soluble CD40 ligand can be evaluated by measuring the amount of soluble CD40 cancer in the blood before and after administration of the antagonist.
  • the dose and route of administration of the thrombin receptor antagonist are not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the decrease in IL-6 in the biological sample can be measured preferably by quantifying IL-6 release from vascular smooth muscle cells. For example, it can be measured by the method of Example 2 described later.
  • vascular smooth muscle cells smooth muscle cells obtained by isolation from blood vessels such as human coronary artery-derived smooth muscle cells (HCASMCs) may be used.
  • HCASMCs human coronary artery-derived smooth muscle cells
  • a thrombin receptor antagonist can be allowed to act on blood vessels, preferably cultured smooth muscle cells, followed by addition of a thrombin solution as a stimulant.
  • a thrombin solution as a stimulant.
  • the amount of IL-6 in the culture supernatant one day after addition can be measured using a commercially available ELISA kit (for example, R & D System, Inc., MiiieapoUs, MN, USA).
  • a decrease in the amount of IL-6 can be evaluated by comparing the amount of IL-6 in the absence and presence of thrombin receptor antagonist.
  • the amount of cellular protein can be measured simultaneously, and the amount of IL-6 released can be compared using the value corrected by the amount of cellular protein.
  • the amount of cellular protein can be determined, for example, for protein assay dve reagent (Bio-ilaa Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA ⁇ ).
  • the thrombin receptor antagonist may act on vascular smooth muscle cells by administering the antagonist to a living body.
  • the decrease in released IL-6 can be evaluated by measuring the amount of IL-6 in the blood before and after administration of the antagonist.
  • the dose and route of administration of the thrombin receptor antagonist are not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the decrease in P-selectin in a biological sample can be preferably measured by quantifying the expression level of P-selectin in vascular endothelial cells or the amount of soluble P-selectin in blood. For example, it can be measured by the method of Example 3 described later.
  • vascular endothelial cells human coronary vein-derived endothelial cells (HCAECs) or endothelial cells obtained by isolation from blood vessels such as human umbilical vein-derived endothelial cells may be used.
  • HCAECs coronary vein-derived endothelial cells
  • endothelial cells obtained by isolation from blood vessels such as human umbilical vein-derived endothelial cells
  • a thrombin receptor antagonist can be allowed to act on blood vessels, preferably cultured endothelial cells, and a thrombin solution can be added as a stimulant.
  • endothelial cells can be treated with IL-4 in advance to enhance the production of P-selecitin and accumulate in the cells. Then, for example, the amount of P-selectin in the endothelial cells 5 minutes after the addition can be measured using an immunohistochemical staining method.
  • the decrease in the amount of P-selectin can be evaluated by comparing the amount of P-selectin in the absence and presence of the tombbin receptor antagonist.
  • the thrombin receptor antagonist may act on endothelial cells by administering the antagonist to a living body.
  • the decrease of P-selectin can be evaluated.
  • the dose and route of administration of the thrombin receptor antagonist are not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the decrease of P-selectin can be evaluated by measuring soluble P-selecti in blood using a commercially available ELISA kit (for example, Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria).
  • cardiovascular event means coronary artery disease death, St fatal and non-fatal myocardial infarction, angina pectoris, coronary bypass surgery, coronary intervention, lethal It means the occurrence of cerebral infarction and non-fatal cerebral infarction, or the occurrence of peripheral vascular injury.
  • the “suppressing effect on the occurrence of cardiovascular events” means reducing the occurrence of cardiovascular events, reducing the level of cardiovascular events, and reducing the probability of occurrence of cardiovascular events. Means that.
  • Patients with a high incidence of cardiovascular events can include patients with a history of cardiovascular events such as myocardial infarction, cerebral infarction, and angina.
  • cardiovascular events such as myocardial infarction, cerebral infarction, and angina.
  • patients with high-risk stable angina patients with myocardial infarction who underwent thrombolytic therapy, patients with acute coronary syndrome (ACS), patients with cerebral infarction, and patients with peripheral vascular disorders.
  • ACS acute coronary syndrome
  • cerebral infarction patients with peripheral vascular disorders.
  • the tombbin receptor antagonist when the inflammatory marker in the biological sample is decreased by the thrombin receptor antagonist, it can be determined that the tombbin receptor antagonist has an inhibitory effect on the occurrence of cardiovascular events.
  • the degree of decrease is 95% or less in the presence of thrombin receptor antagonist, 95% or less in the absence of thrombin receptor antagonist, preferably 90% or less, and more preferably 80% or less. ,.
  • the present invention when the present invention is carried out using platelets, vascular smooth muscle cells, or vascular endothelial cells from patients, preferably patients with a history of cardiovascular events, the decrease in inflammatory markers is due to thrombin receptor antagonists. Suppresses the occurrence of cardiovascular events In addition to showing efficacy, the therapeutic effect of thrombin receptor antagonists is high in the patient.
  • Example 1 Inhibitory effect on soluble CD40 ligand release from platelets
  • PRP platelet-rich plasma
  • Compound A was dissolved in dimethylol sulfoxide (DMSO), and a dilution series was prepared using DMSO. Furthermore, these solutions were diluted 100-fold with Ca-free Tyrode buffer to give test substance solutions.
  • Compound A represented by formula (V) was synthesized by the method described in WO 02/085855 pamphlet.
  • Inhibition% (B— A) / (B-C) X 1 0 0
  • A represents the released amount in the presence of the stimulant and compound A
  • B represents the released amount in the presence of the stimulant
  • C represents the released amount in the absence of the stimulant.
  • the IC 50 value was calculated from the sigmoid curve obtained from the concentration of Compound A and the calculated% inhibition.
  • the IC 50 value is determined by nonlinear regression using the NLIN procedure function of the analysis software SAS8.1 to determine the sigmoid curve parameters of the compound and inhibition%, and the compound concentration (IC 5 o value) that inhibits 50% is calculated. Calculated.
  • Figure 1 shows the inhibitory effect of Compound A on the release of soluble CD40 ligand from platelets.
  • Example 2 Inhibitory effect on IL-6 release from vascular smooth muscle cells
  • HCASMCs Human coronary artery-derived smooth muscle cells
  • Cambrex Bio Science WalkersviUe, Inc. WalkerersviUe, MD, USA.
  • Culture HCASMCs were cultured in a 48-well plate coated with type I collagen so that they were almost confluent.
  • the culture medium was changed to Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 0.1% bovine serum albumin (BSA) and incubated for 1-2 days.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • BSA bovine serum albumin
  • the culture medium was replaced with fresh 0.1% BSA-containing DMEM (200 L), compound A solution 25 / L of various concentrations was added, and thrombin solution (final concentration lunit / mL) was added continuously.
  • the cells from which the nutrient solution supernatant has been collected are immediately washed twice with 250 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), added with Ol molTL NaOH solution (150-200 L) and allowed to stand at room temperature for at least 2 hours. Cells were lysed. The amount of cellular protein was determined using a protein assay dye reagent (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). The quantification of IL-6 in the culture supernatant was measured using a commercially available ELISA kit (R & D System, Inc., MineapoHs, MN, USA).
  • FIG. 2 shows the inhibitory effect of Compound A on IL-6 release from vascular smooth muscle cells.
  • Example 3 Inhibition of P-selectin expression by vascular endothelial cells
  • HCAECs Human coronary artery-derived endothelial cells
  • Cambrex Bio Science Walkersville, Inc. (WalkersviHe, MD, USA).
  • Cultured HCAECs were peeled off with Trypsin-EDTA solution, washed and centrifuged, and then prepared at 10 5 cells / mL using the culture solution EGM-2MV (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.).
  • EGM-2MV Cell Growth Factoration
  • the resulting cell suspension was added in an amount of 200 to a 96-well plate coated with type I collagen. After 1 day of incubation, the culture medium was replaced with fresh EGM-2MV (170 // L). After 1 hour, 10 / L of IL-4 (final concentration: Ing / mL) was added and incubated for another day.
  • Figure 3 shows the inhibitory effect of Compound A on the expression of P-selectin in vascular endothelial cells.
  • the vertical axis in Fig. 3 shows the rate of inhibition of the incidence of P-selectin (also called “CD 62 P”).
  • P-selectin also called “CD 62 P”.
  • Compound A was able to suppress the release of soluble CD40 ligand from platelets, suppress the release of IL-6 from vascular smooth muscle cells, and P- It was shown to have a selectin expression inhibitory effect. That is, it was shown that a tombine receptor antagonist containing Compound A has an action of reducing these inflammatory markers.
  • a method for determining the cardiovascular event generation inhibitory effect of a thrombin receptor antagonist by decreasing the inflammatory marker is provided.
  • the cardiovascular event generation inhibitory effect of the thrombin receptor antagonist is determined by using the decrease amount of at least one inflammatory marker selected from soluble CD40 ligand, IL-6 and P-selectin as an index. It became possible to predict.
  • the therapeutic effect of the thrombin receptor antagonist can be captured at an early stage.
  • the inflammatory marker can be preferably used as a guideline for deciding the treatment policy for ACS patients, and more preferably, the inflammatory marker can be used for the development of therapeutic agents for diseases such as ACS. It can also be used as an indicator. Sequence listing free text

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Abstract

本発明は、生体試料中の炎症性マーカーを測定し、得られた測定結果から心血管イベントの発生に対するトロンビン受容体アンタゴニストの抑制効果を判定する方法に関する。

Description

4490 明 細書 炎症性マーカ一測定によるトロンビン受容体アンタゴニストの効果の判定方法 技術分野 ,
本発明は、 ト口ンビン受容体アンタゴニスト、好ましくは 2—ィミノピロリジン 誘導体の効果を、炎症性マーカーの減少により判定する方法に関する。 より具体的 には、生体試料中の炎症性マーカーを測定し、得られた測定結果から心血管ィベン トの発生に対するトロンビン受容体ァンタゴニスト、好ましくは 2—ィミノピロリ ジン誘導体の抑制効果を判定する方法に関する。 背景技術
急性冠症候群 (ACS) 患者の心血管ィ.ベントは、 発症を予知することが難しい ため、 これまで、 その発生リスクを評価することができる因子の研究が行われてき た。
その因子の一つとして炎症性マーカーが有望視されている。炎症性マーカーが高 値である患者では、 ACS患者の心血管ィベントの発生リスクが高いことが知られ てレヽる J3. Iibby, P. M. Eidker and A. Maseri, Inflammation and Atherosclerosis. Circulation 2002； 105： 1135-1143) 。 そして、 心血管で起きてい る局所的な炎症が、 心血管イベントの発生に関与していると考えられている。
例えば、 炎症性マーカーの一つである可溶性 CD40 リガンドが高値であると、 ACS患者の心血管ィベント発生率が高いことが報告されている （C. Heeschen, S. Dimmeler, C. W. Hamm, M. J. van den Bran a, E. Boersma, A. M. Zeiner, and M. L. Simoons, for the CAPTURE Study Investigators, Soluble CD40 ligandin Acute Coronary Synddromes. N. Engl. J. Med. 2003； 348： 1104-1111)。 CD40 リガンドは、通常は血小板内に存在し、血小板の活性化に伴って細胞表面に移行し、 血小板の凝集により可溶性 CD40 リガンドとして放出されることが明らかにされ てレヽる (S. X. Anaiid, J. F. Viles-Gonzalez, J. <J. Badimon, E. Cav sogl and J. D. 7 054490
Marmur, Membrane- associated CD40L and sCD40L in Atherothrombotic Disease. Thromb. Haemost. 2003； 90: 377-384) 0
また、 炎症性マーカーである IL-6及び C反応性タンパク質 （CHP)+が高値であ る場合も、 ACS 患者の心血管イベント発生率が高いことが報告されている （E. Linamark, E. i3iderholm, L. Wailentm and A. Sieebann, Relationship Between Interleukin 6 and Mortality in Patients with Unstable Coronary Artery Disease. Effects of an Early Invasive or Noninvasive Strategy. JAMA. 2001； 286: 2107-2113)。
可溶性 pセレクチン （p-selectin) については、 血漿中濃度が高値であると ST 非上昇 ACS患者の心筋傷害が進展することが報告されている （Circ. J 2005； 69: 530-535, Relationship between myocardial injury and soluoie P-selectm in non-ST elevation acute coronary syndrome) 。
—方、 トロンビンは、血管内で起きる炎症反応のカスケ一ドを構成する重要な分 子であると考えられており、
1).血小板を活性化し凝集を引き起こすこと （M. G. Davey and E. F. Luscher, Actions of Thrombin and Other Coagulant and Proteolytic Enzymes on Blood Platelets. Nature. 1967； 216： 857-858) 、
2) .血管平滑筋細胞による IL-6 の産生を亢進すること （R. Eranzhofer, S. K. Clinton, K Ishii, S. R. Coughliii, J. W. Fenton, and P. Liboy, Thrombin Potently Stimulates Cytokine Production in Human Vascular Smooth Muscle Cells but Not in Mononuclear Phagocytes. Cixc. Res. 1996； 79: 286-294) 、
3) . 好中球の浸潤に関与する細胞表面上の P セレクチンの発現を宂進すること (M. Takano, A. Meneshian, E. Sheikh, Y. Yamakawa, K. B. WilMns, E. A.
Hopkins, and G. B. Bulkley, Rapid Upregulation of Endothelial P-selectin Expression Via Reactive Oxygen Species Generation. Am. J. Physiol. 2002; 283: H2054-H2061) が知られている。
また、 トロンビンは、 プロテアーゼ活性化受容体 （PARI) (トロンビン受容体） を活性ィ匕することが明らかにされている。 ところで、 PARI (トロンビン受容体) アンタゴニストとして、 2—ィミノピロ リジン誘導体が知られている。 2—ィミノピロリジン誘導体は、ハイリスクの安定 狭心症患者、 血栓溶解療法を施行した心筋梗塞患者又は ACS患者の心血管ィベン ト発生抑制効果を有することが知られている。
これまでに、これら炎症性マーカーの上昇とトロンビン一： PAE1経路との関係に ついて、詳しく調べられたこともなく、 明らかにされていなかった。 特に、炎症性 マーカーの上昇と PARI活性化の関係及び PARIアンタゴニストによる炎症性マ 一力一の抑制については、 全く知られていなかった。 発明の開示
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする 課題は、 ト口ンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果を判定す る方法を見出すことにある。 - 本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、血小板などの細 胞を用いた実験において、 PAE1 (ト口ンビン受容体） アンタゴニストとして知ら れている 2—イミノビロリジン誘導体力 S、炎症性マーカーの値を抑制することを見 出した。具体的には、 2—ィミノピロリジン誘導体に含まれる化合物 A (後述の式 (V) 参照） 、 血小板からの可溶性 CD40リガンド放出に対する抑制作用、 血管 平滑筋細胞からの IL-6放出に対する抑制作用及び血管内皮細胞の P-selectin発現 に対する抑制作用を有することを見出した。 これらの炎症性マーカーは、 ACS患 者で高値であることが知られており、また、患者の心血管イベント発生率と関連す ることが知られている。
一方、 2—ィミノピロリジン誘導体は、心血管ィベントの発生抑制作用を有する ことが知られている化合物群である。
心血管ィベント力 心血管で起きている局所的な炎症に起因すると考えられるこ とと上記知見とを合わせると、 2—ィミノピロリジン誘導体を含むトロンビン受容 体アンタゴエストは、局所的な炎症を抑制することにより心血管イベントの発生を 抑制すると考えられた。 これらの知見から、 トロンビン受容体アンタゴニストによる炎症性マーカーの減 少を指標にして、心血管ィベント発生に対するトロンビン受容体アンタゴニストの 抑制効果が予見可能であると考えられ、 本発明を完成するに至った。 ' すなわち、本発明は、生体試料中の炎症性マーカーを測定し、得られた測定結果 力 ら心血管イベントの発生に対するトロンビン受容体アンタゴニスト、好ましくは 2—ィミノピロリジン誘導体の抑制効果を判定する方法である。
前記 2—ィミノピロリジン誘導体は、 例えば、 一般式 （I) で表される化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をあげることができる。
Figure imgf000005_0001
〔式（I) 中、 A環はピロリジン環を； B環はベンゼン環又はピリジン環を； R101、 Ri02及び R1Q3は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原子、 ハロゲン原 子、 Ci〜C6アルキル基又は Ci〜C6アルコキシ基を； Arリま式 （II)
Figure imgf000005_0002
(式 （II) 中、 R10、 Rn、 R12、 R 13及ぴ R 14は、 それぞれ独立し、 同一又は相異 なって、 水素原子、 〜 アルキル基、 水酸基、 Ci Csアルコキシ基、 モルホ 2007/054490 リニル基、置換基を有していてもよいピペラジ-ル基、置換基を有していてもよい ピペリジ-ル基又は置換基を有していてもよいピロリジニル基を示し、 さらに、 R 11と R12、 又は R12と R13は、 互いに結合して 5〜 8員複素環を形成していてもよ レ、。 ) で表される基を示す。 〕
また、 前記 2—ィミノピロリジン誘導体は、 例えば、 一般式 (III) で表される 化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をあげること ができる。
Figure imgf000006_0001
〔式 (III) 中、 Ri及び R2は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、水素原子、 メ トキシ基又はェトキシ基を； X1は水素原子又はハロゲン原子を； A r 2は、 1又 は 2以上の置換基で置換されていてもよいフエ二ル基を示し、
ここで、 当該置換基は、 メチル基、 ェチル基、 メ トキシ基、 エトキシ基、 t一プチ ル基、 モルホリニル基、 及び下記式 (IV) で表される置換基から選ばれ、
\
(IV)
に ヽ 2一丫、
\R4 式 （IV) 中、 Wは一 C H—又は窒素原子を； Aiは一 C H2—又は単結合を； R3は 水素原子又は一O R5aを； X2は一 CH2—、酸素原子、単結合又はカルボ二ル基を； Yは単結合又は Ci〜C4アルキレン基を； R4は水素原子、 _ O R6a、 シァノ基又 は一C O O R7を； R5a、 R6a及び R7は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原子又は Ci〜C4アルキル基を示す。 〕
一般式 （III) において、 例えば、 前記 R1及び R2はエトキシ基であり、 かつ、 前記 X 1はフッ素原子である。
また、 前記 2—ィミノピロリジン誘導体は、 例えば、 式 （V) 〜 （XII) で表さ れる化合物からなる群から選ばれる少なくとも 1つ、もしくはその薬学的に許容さ れる塩、 又はそれらの溶媒和物をあげることができる。
Figure imgf000007_0001
7 054490 また、前記 2—ィミノピロリジン誘導体は、例えば、式（V)で表される化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物をあげることができる。
Figure imgf000008_0001
また、前記トロンビン受容体アンタゴニストとしては、 2.—ィミノピロリジン誘 導体の他、 例えば、 SCH530348 (国際公開第 2005/118576 A1 号パンフレツト， US2004/0176418 Al, Circulation 2005, 112， Supplementll, II- 32) 、 SCH79797 (Bioorg Med Chem Lett 1999， 9， 2073-2078, Biochemical Pharmacology 2000, 60, 1425-1434)、 BMS200261 (J Med Chem 1996， 39, 4879-4887)、 RWJ58259 (J Med Chem 2001， 44, 1021-1024, J Pharmacol. Exp. Ther 2001， 298， 34-42)、 FR171113 (Eur J Pharmacol 1999， 384, 197-202) をあげることができる。
前記炎症个生マーカーは、 例えば、 可溶性 CD40 リガンド、 IL-6及ぴ P-selectin 力 らなる群から選ばれる少なくとも一つをあげることができる。 本発明により、 トロンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果 を、 炎症性マーカーの減少により判定する方法が提供される。
本発明により、 トロンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果 を、炎症性マーカ一の減少により判定することが可能となった。本発明の好ましレヽ 態様において、 ト口ンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果は、 可溶性 CD40リガンド、 IL-6及ぴ P-selecti から選ばれる少なくとも 1つの炎症 性マーカーの減少量を指標とすることにより、 予測することが可能となった。
したがって、本発明により、 トロンビン受容体アンタゴニストの治療効果を早期 に捕らえることが可能になった。 また、 好ましくは、 炎症性マーカーを ACS患者 等の治療方針を決めるにあたっての指針に用いることが可能になり、さらに好まし くは、 炎症性マーカーを ACS等の疾患の治療薬開発における有効性の指標に用い ることも可能になった。 図面の簡単な説明
図 1は、 血小板からの可溶性 CD40 リガンド放出に対するィ匕合物 Aの抑制作 用を示す図である。
図 2は、 血管平滑筋細胞からの IL-6放出に対する化合物 Aの抑制作用を示す 図である。
図 3は、血管内皮細胞の P-selectin発現に対する化合物 Aの抑制作用を示す図 である。 . 発明を実施するための最良の形態 - 以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための 例示であり、本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、そ の要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した刊行物は、全体を通して本明細書に組み込むも のとする。 また、 本明細書は、 2006年 3月 2日に出願された本願優先権主張の基 礎となる日本国特許出願 （特願 2006-056255号） の明細書に記載の内容を包含す る。
本発明は、 トロンビン受容体アンタゴニストの効果を、炎症性マーカーの減少に より判定する方法を提供する。 より詳しくは、本発明は、心血管イベント発生に対 するトロンビン受容体アンタゴニスト、好ましくは 2—ィミノピロリジン誘導体の 抑制効果を、 生体試料中の可溶性 CF40リガンド、 IL-6及び P-selectinから選ば れる 1以上の炎症性マーカーの減少により判定する方法を提供する。
1 . トロンビン受容体アンタゴニスト 本明細書において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、 トロンビン受容体に作 用して、受容体から発生するシグナルの強さを小さくする作用、 トロンビン受容体 からのシグナルの発生を阻害する作用、又はトロンビン受容体へのァゴニストの結 合を拮抗する作用を有するものである。
本発明において、 トロンビン受容体ァンタゴ二ストとしては、例えば、 2—イミ ノピロリジン誘導体、 SCH530348、 SCH79797, BMS200261, RWJ58259又は FR171113をあげることができる。
本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、好ましくは 2—イミノビ 口リジン誘導体である。
( 1 ) 2—ィミノピロリジン誘導体
本発明において、 2—ィミノピロリジン誘導体は、 例えば以下の一般式 （I) で 表される化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物を挙 げることができる。 - 一般式 （I)
Figure imgf000010_0001
一般式 (I) 中、
A環はピロリジン環を；
B環はベンゼン環又はピリジン環を；
R101、 RK>2及び R103は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原子、 ロゲン原子、 Ci〜C6アルキル基又は Ci〜C6アルコキシ基を；
A r iは下記式 （II) で表される基を示す。 54490
Figure imgf000011_0001
ここで、 式 （II) 中、
R10、 RU、 Ri2、 R 及び R 14は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素 原子、 C i〜C6アルキル基、 水酸基、 C i〜C6アルコキシ基、 モルホリニル基、 置 換基を有してレ、てもよいピペラジニル基、置換基を有して！/、てもよぃピペリジニル 基又は置換基を有していてもよいピロリジニル基を示し、
さらに、 Riiと Ri2、 又は R12と Risは、 互いに結合して 5〜 8員複素環を形成 していてもよい。
本発明において、 ピペラジニル基、 ピペリジニル基又はピロリジニル基が有する ことができる置換基は、 限定されるわけではないが、 例えば、 水酸基、 シァノメチ ル基、 メ トキシ基、 一 COCH2OH、 一 CH2COOCH2CH3及び一 CH2COOHからな る群から選択される 1又は 2以上を挙げることができる。
また、 本発明において、 2—ィミノピロリジン誘導体は、 例えば以下の一般式 (III) で表される化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、 又はそれらの溶 媒和物を挙げることができる。
一般式 (III)
Figure imgf000011_0002
一般式 （III) 中、
R1及び R2は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原子、 メトキシ基又 はエトキシ基を；
X1は水素原子又はハロゲン原子を；
A r 2は、 1又は 2以上の置換基で置換されていてもよいフエ二ル基を示し、 こ こで、 当該置換基は、 メチル基、 ェチル基、 メトキシ基、 エトキシ基、 t一ブチル 基、 モルホリニル基、 及び下記の式 （IV) で表される置換基から選ばれる。
Figure imgf000012_0001
式 （IV) 中、
Wは一 C H—又は窒素原子を；
Aiは一C H2—又は単結合を；
R3は水素原子又は _O R5aを；
X2は一 CH2—、 酸素原子、 単結合又はカルボニル基を；
Yは単結合又は C 1〜C4アルキレン基を；
R4は水素原子、 一 O R6a、 シァノ基又は一 C O O R7を；
RSa、 RSa及ぴ R7は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原子又は C ]L 〜C4ァノレキル基を示す。
一般式 （III) において、 好ましくは、 R1及ぴ R2がエトキシ基であり、 かつ、 X1がフッ素原子である。
本明細書において、 「ハロゲン原子」 は、 例えばフッ素原子、 塩素原子、 臭素原 子、 ヨウ素原子などの原子が挙げられ、 好ましくはフッ素原子、 塩素原子、 臭素原 子である。 本明細書において 「^〜じ6アルキル基」 は、 炭素数が 1から 6個の直鎖状又は 分枝鎖状のアルキル基を示す。 好適な基としては、 例えばメチル基、 ェチル基、 n —プロピル基、 i s o—プロピル基、 n—ブチノレ基、 i s o—プチノレ基、 s e c— プチル基、 t e r t—プチル基、 n—ペンチル基、 1 , 1ージメチルプロピル基、 1 , 2—ジメチルプロピル基、 2 , 2—ジメチルプロピル基、 1一ェチルプロピル 基、 2—ェチルプロピル基、 1一メチルブチル基、 2 _メチルプチル基、 n—へキ シル基、 1—メチル一 2—ェチルプロピル基、 1ーェチル一 2—メチルプロピル基、 1 , 1 , 2 _トリメチルプロピル基、 1 _プロピルプロピル基、 1， 1ージメチル ブチル基、 1 , 2—ジメチルブチル基、 2 , 2—ジメチルブチル基、 1， 3—ジメ チルブチル基、 2 , 3ージメチルブチル基、 2—ェチルブチル基、 2—メチルペン チル基、 3—メチルペンチル基等の直鎖又は分枝状アルキル基があげられ、 より好 ましくはメチル基、 ェチル基、 n—プロピル基、 i s o—プロピル基、 n—ブチル 基、 i s o—ブチル基、 s e c一プチル基、 t e r t—ブチル基、 n—ペンチル基 等である。
本明細書において 「C i〜C4アルキル基」 は、 炭素数が 1から 4個の直鎖状又は 分枝鎖状のアルキル基を示す。 好適な基としては、例えばメチル基、 ェチル基、 n 一プロピル基、 i s o—プロピル基、 n—ブチル基、 i s o—ブチル基、 s e c— ブチル基、 t e r t一プチル基 の直鎖又は分枝状アルキル基があげられ、 より好 ましくはメチル基、 ェチル基、 n—プ.口ピル基、 'i s ο—プロピル基、 η—ブチル 基、 i s o—ブチル基、 s e c—ブチル基、 t e r t—ブチル基等である。
本明細書において 「C i〜C6アルコキシ基」 は、 炭素数 1から 6個のアルコキシ 基を示し、好適な基としては、例えばメ トキシ基、ェトキシ基、 n—プロポキシ基、 i s o—プロポキシ基、 s e c一プロポキシ基、 n—ブトキシ基、 i s o—ブトキ シ基、 s e c一ブトキシ基、 t e r tープトキシ基、 n—ペンチルォキシ基、 i s o—ペンチルォキシ基、 s e c—ペンチルォキシ基、 1 , 1ージメチルプロピルォ キシ基、 1 , 2—ジメチルプロポキシ基、 2 , 2—ジメチルプロピルォキシ基、 n 一へキソキシ基、 1—ェチノレプロポキシ基、 2—ェチノレプロポキシ基、 1ーメチノレ ブトキシ基、 2—メチルブトキシ基、 i s o—へキソキシ基、 1ーメチルー 2—ェ チルプロポキシ基、 1ーェチルー 2—メチルプロポキシ基、 1， 1， 2—トリメチ ルプロポキシ基、 1， 1 , 2—トリメチルプロポキシ基、 1一プロピルプロポキシ 基、 1 , 1一ジメチ /レブトキシ基、 1 , 2—ジメチルブトキシ基、 2 , 2—ジメチ ルブトキシ基、 2， 3—ジメチルブチルォキシ基、 1 , 3一ジメチルブチルォキシ 基、 2—ェチルブトキシ基、 1 , 3—ジメチルブトキシ基、 2—メチルペントキシ 基、 3—メチルぺントキシ基、 へキシルォキシ基等があげられる。
本明細書において 「Cl〜C4アルキレン基」 は、 一般式 CnH2n+2で表される鎖式 飽和炭化水素 （炭素数 (=n ) は 1から 4個） の両端の炭素原子から一つずつ水素 原子が抜けた 2価の基を示し、 例えば、 メチレン基、 エチレン基、 n—プロピレン 基、 i s o—プロピレン基等の直鎖又は分枝状アルキレン基があげられる。
本明細書において 「Ci〜C6アルコキシ C i〜C6アルキル基」 は、 Ci〜C6アル コキシ基で置換された C i〜 C 6アルキル基を意味する。
本明細書にぉレ、て 「 5〜 8員複素環」 とは、 5〜 8員の芳香族複素環または非芳 香族複素環を意味する。 -
5〜 8員芳香族複素環は、 例えば、 フリル基、 チェニル基、 ピロリル基、 ピラゾ リル基、 ィミダゾリル基、 トリアゾル基、 ォキサゾリル基、 イソキサゾリル基、 ピ ラエル基、 ピリジル基、 ピリダジニル基、 ピリミジニノレ基、 ピラジュル基等があげ られる。 5〜 8員非芳香族複素環は、例えば、ピロリジニル基、ィミダゾリニル基、 ォキサゾリニル基、 イミダゾリジニル基、 ピペリジル基、 ピペラジニル基、 モルホ リニル基等があげられる。
また、 本明細書において 「置換基を有していてもよい」 とは、 「置換可能な部位 に、 任意に組み合わせて 1又は複数個の置換基を有してもよい」 と同意義である。 本明細書において「n—」 とはノルマルタイプ又は 1級置換基であることを意味 し、 「s e c—」 とは 2級置換基であることを意味し、 「t— ( t e r t—） 」 と は 3級置換基であることを意味し、 「i— ( i s o—） 」 とはイソタイプの置換基 であることを意味する。
一般式 (I) で表される化合物及び一般式 (ΠΙ) で表される化合物、 もしくは薬 学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物は、当業者であれば公知の方法で製造 することができ、 国際公開第 02/085855号パンフレツトに記載の方法で製造する ことができる。 本発明において、 一般式 （I) 及び一般式 (ΠΙ) で表される 2—ィミノピロリジ ン誘導体は、 好ましくは、 式 （V) 〜 （XII) で表される化合物、 もしくはその薬 学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物が挙げられる。 より好ましくは式 (V) で表される化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物で ある。
Figure imgf000015_0001
式 （V) で表される化合物は、 本明細書において 「化合物 A」 と称する場合もあ る。
Figure imgf000016_0001
式 （V) 〜 （XII) で表される 2—ィミノピロリジン誘導体は、 国際公開第 02/085855号パンフレットに記載の方法で製造することができる。
( 2 ) その他のトロンビン受容体アンタゴニスト
本明細書において、 ト口ンビン受容体アンタゴニストには、例えば、 SCH530348 (国際公開第 2005/118576 A1 号パンフレツ ト， US2004/0176418 A1 , Circulation 2005, 112， Supplementll, Π'32) 、 SCH79797 (Bioorg Med Chem Lett 1999， 9, 2073-2078, Biochemical Pharmacology 2000， 60, 1425-1434) 、 BMS200261 (J Med Chem 1996， 39, 4879-4887)、 RWJ58259 (J Med Chem 2001, 44, 1021-1024, J Pharmacol. Exp. Ther 2001， 298, 34-42) 、 もしくは FR171113 (Eur J Pharmacol 1999, 384, 197-202) 、 それらの薬学的に許容される塩、 又は それらの溶媒和物が含まれる。 .
本発明において、 前記 SCH530348、 SCH79797, BMS200261、 RWJ58259 R ぴ FG171113は、公知の方法で製造することができる。例えば、前記 SCH530348, SCH79797, BMS200261及び RWJ58259は、 それぞれ名称の後に付した括弧内 に示す文献に記載された方法で製造することができる。
( 3 ) 塩、 溶媒和物など
本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、酸又は塩基と薬学的に許 容される塩を形成する場合もある。本発明における当該アンタゴニストは、 これら の薬学的に許容される塩をも包含する。薬学的に許容される塩は、 トロンビン受容 体アンタゴニストと薬学的に許容される塩を形成するものであれば特に限定され ない。具体的には、例えば、ハロゲンィ匕水素酸塩（例えばフッ化水素酸塩、塩酸塩、 臭化水素酸塩、 ョゥ化水素酸塩等） 、 無機酸塩 （例えば硫酸塩、 硝酸塩、 過塩素酸 塩、 リン酸塩、炭酸塩、重炭酸塩等）、有機カルボン酸塩（例えば蟻酸塩、酢酸塩、 乳酸塩、 コノヽク酸塩、 シユウ酸塩、 マレイン酸塩、 酒石酸塩、 フマル酸塩、 クェン 酸塩、 ステアリン酸塩、 安息香酸塩、 トリフルォロ酢酸塩等） 、 有機スルホン酸塩 (例えばメタンスルホン酸塩、 トリフルォロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン 酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、カンファ一スルホン酸塩等）、 アミノ酸塩 （例えばァスパラギン酸塩、 グルタミン酸塩等） 、 アンモニゥム塩、 四 級ァミン塩、 アル力リ金属塩 （例えばナトリゥム塩、 力リゥム塩等） 、 アル力リ土 類金属塩 （例えばマグネシウム塩、 カルシウム塩等） 等が挙げられるが、 これに限 定されない。
また、本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、置換基の種類によ つては不斉炭素を有し、幾何異性体、光学異性体、 ジァステレオマーなどの光学異 性体が存在しうる力 これら光学異性体もトロンビン受容体アンタゴニストに含ま れる。
また、本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストの水和物などの溶媒和 物が存在する場合には、これら溶媒和物も本発明に使用するトロンビン受容体アン タゴニストに含まれる。 溶媒和物は、 例えば、 水和物、 非水和物などを挙げること ができ、 好ましくは水和物を挙げることができる。 溶媒は、 例えば、 水、 ァノレコー ル (例えば、 メタノ一ノレ、 エタノール、 n -プロパノール) 、 ジメチノレホノレムアミ ドなどを挙げることができる。
さらに、 本発明におレ、て、 トロンビン受容体アンタゴニストは、 生体内で酸化、 還元、加水分解、抱合などの代謝を受けるトロンビン受容体アンタゴニストをも包 含する。 また、 本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、 生体内で酸 ィ匕、還元、加水分 などの代謝を受けてトロンビン受容体ァンタゴニストを生成す る化合物をも包含する。
本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、上記の化合物の中から 1 個、 又は複数個を適宜組み合わせて使用することができる。 本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストは、 そのまま用いてもよく、 医 袓成物としてもよレ、。医薬組成物は、 トロンビン受容体アンタゴニストを含有 する組成物であれば、 特に限定されない。例えば、本発明において、 医薬組成物と しては、上記トロンビン受容体アンタゴニストを含む種々の剤形、例えば経口剤で あれば錠剤、 散剤、 細立剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 シロップ剤等、 非経口剤であれ ば坐剤、 注射剤、 軟膏剤、 パップ剤等があげられる。
前記トロンビン受容体アンタゴニスト、もしくはその薬学的に許容される塩、又 はそれらの溶媒和物の有効な投与量は、症状の程度、 患者の年齢、性別、 体重、感 受性差、 投与方法、 投与時期、 投与間隔、投与期間、 製剤の性質、調剤、種類、 有 効成分の種類等によって異なるが、当業者であれば適宜設定することができる。例 えば、成人 （体重 6 0 K g ) に 1日あたり 0 . l〜5 0 0 m g、 好ましくは 0 . 5 〜2◦ O m g、より好ましくは 1〜1 0 0 m gを 1回〜数回に分けて投与すること ができる。 投与は、 経口的に、 あるいは非経口的に行われても良い。 2 . トロンビン受容体アンタゴニストの効果を判定する方法
本発明により、生体試料中の炎症性マーカーを測定し、得られた測定結果から心 血管イベント発生に対するトロンビン受容体アンタゴニスト、好ましくは 2—イミ ノピロリジン誘導体の抑制効果,を判定する方法が提供される。 ( 1 ) 生体試料中の炎症性マーカーの測定方法
本発明において、 「生体」 は、 例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ハムスター、 モ ルモット、 ゥサギ、 ネコ、 ィヌ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ャギ、 サルなどの哺乳動物又 はそれらの一部を意味する。
本発明において、 「生体試料」 は、 上記生体由来の試料、 例えば、 上記生体由来 の β、組織、細胞又は体液（血液、脳脊髄液など）を意味する。本発明において、 生体試料は、好ましくは、炎症性マーカーの発現する臓器、組織、細胞又は体液で あり、 より好ましくは、 血小板、 血管平滑筋細胞又は血管内皮細胞である。
本発明において、 「炎症性マーカ一」 は、炎症の有無の判断の指標となり得るも のを意味し、さらに、心血管ィベントの発生に関与するものであることが好ましレ、。 7 054490 本発明において用いる炎症性マーカーは、 好ましくは可溶性 CD40 リガンド、 Interleukin-6 (IL-6 ) 、 P-selectin 、 C'reactive protein(CRP) 、 MPO (myeloperoxidase)、 PIGF (Placental Growth Factor)、 soluble Intracellular adhesion molecule -1 (ICAM-I) 、 soluble E selecting Tumor necrosis factor a ( TNFa) 、 LpPLA2 (Iipoprotein-associated p ospholipase A2)、 ΡΑΡΡΆ (pregnancy- associated plasma protein A)、 serum amyloid A、 及ぴ fibrinogen
(Circulation 2002； 105, 1135.1143、 J Am Coll Cardiol 2003； 41， 37S'42S、 JAMA 2004； 291, 435-44) からなる群から選ばれる少なくとも 1つであり、 より 好ましくは可溶性 CD40 リガンド、 IL-6及び P-selectinからなる群から選ばれる 少なくとも 1つである。
心血管イベントの抑制効果は、これらの炎症性マーカーの.生体試料中の発現量の 減少を指標として判定することができる。炎症性マーカーの発現量は、炎症性マー カーのタンパク質量及び/又は mRNA量を測定することにより解析することがで きる。本発明において、炎症个生マーカーは 1種類を用いてもよく、又は 2種類以上 を組み合わせて用いることもできる。
タンパク質量の測定方法は、 公知の方法で行うことができ、 例えば、 ウェスタン プロット、 ELISA、 EIA、 RIA、 フローサイトメ トリー、 免疫組織染色などの免疫 化学的方法、質量分析による方法などがあげられる。 これらの方法は、 当業者であ れば、 定法に従い行うことができる。'
また、 niRNA量の測定方法は、 公知の方法で行うことができ、 例えば、 in situ ハイブリダイゼーシヨン、ノザンブロット解析、 DNAマイクロアレイ、 RT-PCR、 定量的 PCRなどの方法があげられる。 これらの方法は、 当業者であれば、 定法に 従い行うことができる。
(i) 可溶性 CD40リガンド
生体試料中の可溶性 CD40 リガンドの減少は、 好ましくは血小板からの可溶性
CD40リガンド放出を定量して測定することができる。 例えば、後述の実施例 1の 方法で測定することができる。
血液は、健常人から採取してもよいし、心血管イベントの病歴を有する患者から 採取してもよい。血小板は、採取した血液を遠心操作することで、得ることができ る。場合によっては、血液凝固を防ぐために、 クェン酸溶液などの薬剤を血液に添 加してもよい。
トロンビン受容体ァンタゴニストは、血液、好ましくは得られた血小板と混合す ることで血小板に作用させることができる。混合液には、 さらに、 フイブリン重合 阻害剤を添カ卩してもよい。 フィプリン重合阻害剤は、 例えば、 GPRP-NH2 (配列 番号 1 ) などの公知のものを使用することができる。
次に、 トロンビン溶液又は： PAR-1活性化ペプチド、例えば、 SFLLRN-NH2 (配 列番号 2 ) ？薪夜を刺激剤として混合液に添加し、 サンプノレ中の可溶性 CD40 リガ ンドの量を市販の ELISAキット （例えば、 Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria) を用いて測定することができる。 また、 刺激剤として、 トロンビン溶液 又は PAR-1活性化べプチドに代えてアデノシン 2リン酸を使用することにより、 PAR-1を介した活性化が阻害されている力否かを判別することも可能である。 可溶性 CD40 リガンドの減少は、 トロンビン受容体ァンタゴニスト非存在下及 び存在下での可溶性 CD40 リガンドの量を比較することで、 評価することができ る。
また、 トロンビン受容体ァンタゴニストは、当該ァンタゴニストを生体に投与す ることで血小板に作用させてもよレヽ。 この場合は、当該アンタゴニストの投与前後 における血中の可溶性 CD40 ガンド量を測定することで、 可溶性 CD40リガン ドの減少を評価することができる。 トロンビン受容体ァンタゴニストの投与量及び 投与経路は、 特に限定.されず、 当業者であれば適宜選択することができる。
(ii) IL-6
生体試料中の IL-6の減少は、好ましくは血管平滑筋細胞からの IL-6放出を定量 して測定することができる。例えば、後述の実施例 2の方法で測定することができ る。
血管平滑筋細胞は、 ヒト冠状動脈由来平滑筋細胞 （HCASMCs) などの血管か ら単離して得た平滑筋細胞を用いてもよい。
血管、好ましくは培養した平滑筋細胞に、 トロンビン受容体アンタゴニストを作 用させ、続いて刺激剤としてトロンビン溶液を添加することができる。例えば、添 加 1日後の培養液上清における IL-6量を、 市販の ELISAキット （例えば、 R&D System, Inc., MiiieapoUs, MN, USA) を用いて測定することができる。
IL-6量の減少は、 トロンビン受容体ァンタゴニストの非存在下及び存在下での IL-6量を比較することで、 評価することができる。
このとき、細胞タンパク質量を同時に測定し、細胞タンパク質量で補正した値を 用いて、 IL-6放出量を比較することができる。細胞タンパク質量は、例えば protein assay dve reagent (Bio-ilaa Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA^ 用 、飞定堇 することができる。
また、 トロンビン受容体アンタゴニストは、当該アンタゴニストを生体に投与す ることで血管平滑筋細胞に作用させてもよい。 この場合は、当該アンタゴニストの 投与前後における血中の IL-6量を測定することで、放出された IL-6の減少を評価 することができる。 トロンビン受容体ァンタゴニストの投与量及び投与経路は、特 に限定されず、 当業者であれば適宜選択することができる。
(i ; i'-selectm
生体試料中の P-selectinの減少は、好ましくは血管内皮細胞の P-selectinの発現 量又は血液中の可溶性 P-selectin量を定量して測定することができる。例えば、後 述の実施例 3の方法で測定することができる。
血管内皮細胞は、 ヒト冠状 脈由来内皮細胞 (HCAECs) ゃヒト臍帯静脈由来 内皮細胞などの血管から単離して得た内皮細胞を用いてもよい。
血管、好ましくは培養した内皮細胞に、 トロンビン受容体アンタゴニストを作用 させ、 続レ、て刺激剤としてトロンビン溶液を添加することができる。 この場合は、 内皮細胞を予め IL-4で処理しておき、 P-selecitinの産生を亢進し、 細胞内に蓄積 させておくこともできる。 そして、 例えば、 添加 5分後の内皮細胞における P-selectin量を、 免疫組織染色の方法を用いて測定することができる。
P-selectin量の減少は、 ト口ンビン受容体アンタゴニストの非存在下及び存在下 での P-selectin量を比較することで、 評価することができる。
また、 トロンビン受容体アンタゴニストは、当該アンタゴニストを生体に投与す ることで内皮細胞に作用させてもよい。 この場合は、当該アンタゴニストの投与前 後における内皮細胞の P-selectin発現量又は可溶性 P-selectin量を測定することで、 P-selectinの減少を評価することができる。 トロンビン受容体ァンタゴ二ストの投 与量及び投与経路は、特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。 また、 血中の可溶性 P-selecti を市販の ELISA キット （例えば、 Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria) で測定することで、 P-selectinの減少を評 価することができる。
( 2 )心血管ィベント発生に対するトロンビン受容体アンタゴニストの抑制効果の 判定方法
本発明において、 「心血管イベント」 とは、冠動脈疾患死、 St死的及び非致死的 心筋梗塞の発生、狭心症の発生、冠動脈パイパス手術の施行、冠インターベンショ ン術の施行、致死的及び非致死的脳梗塞の発生、又は末梢血管障害の発生を意味す る。
本発明において、 「心血管イベント発生に対する抑制効果」 とは、 心血管ィベン トの発生を低減すること、発生する心血管ィベントのレべノレを軽減すること、心血 管イベント発生の確率を低減することを意味する。
心血管イベント発生率の高い患者は、心筋梗塞、脳梗塞、狭心症など心血管ィべ ントの病歴を持つ患者を挙げることができる。例えば、ハイリスクの安定狭心症患 者、 血栓溶解療法を施行した心筋梗塞患者、 急性冠症候群 (ACS) 患者、 脳梗塞 患者、 末梢血管障害を有する患者が挙げられる。
本発明において、 トロンビン受容体アンタゴニストによって、生体試料中の炎症 性マーカーが減少する場合は、ト口ンビン受容体アンタゴニストは心血管ィベント の発生に対して抑制効果を有すると判定することができる。
本発明において、減少の程度は、 トロンビン受容体アンタゴニスト存在下の発現 量がトロンビン受容体アンタゴニスト非存在下の 9 5 %以下であり、 9 0 %以下が 好ましく、 8 0 %以下がより好ましレ、。
また、患者、好ましくは心血管イベントの病歴を有する患者由来の血小板、血管 平滑筋細胞、又は血管内皮細胞を用いて本発明を実施する場合は、炎症性マーカー の減少は、トロンビン受容体アンタゴニストが心血管イベントの発生に対して抑制 効果を有することを示すとともに、トロンビン受容体アンタゴニストによる治療効 果が、 当該患者において高いことを示す。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する力 本実施例により本発明は限定 されるものではない。 実施例 1 血小板からの可溶性 CD40リガンド放出に対する抑制作用
( 1 ) 方法
1週間以上薬物を服用していない健康成人男子から血液を採取した。血液凝固を 防ぐために 1/10容量の 3.8%クェン酸溶液を添加して転倒混和した。卓上遠心機に て室温下で 700 rpmで 10分間遠心し、上清を多血小板血漿（PEP) として分離し た。 PRPを分離した残りの血液をさらに室温下で 3000 rpmで 10分間遠心し、上 清を乏血小板血漿 (PPP) として分離した。 PRP の血小板濃度を自動血球計測装 置 K-4500 (シスメックス （株） ) で計測し、 PPPで希釈することによつて血小板 濃度を 30 J /μ Lに調製した。
化合物 Aはジメチノレスルホキシド (DMSO) に溶解し、 さらに DMSOを用いて 希釈系列を作製した。 さらにこれらの溶液を Ca非含有タイロード緩衝液にて 100 倍希釈し、 被験物質溶液とした。 式 （V) で表される化合物 Aは、 国際公開第 02/085855号パンフレットに記難の方法によつて合成した。
上記のように調製した PRPの 27.5 i Lと被験物質溶液 192.5 / Lとを混合し、 37°Cで 1時間プレインキュベーションを行った。 プレインキュベーションを行つ た混合液 (200 L)にフイブリン重合阻害剤 GPRP-NH2 (配列番号 1 )溶液 (25 μ L) を添加し、 血小板凝集装置 (Hematracer313, ェムシーメディカル） にセットし て攪拌下にて 37°Cで 2分間ィンキュベーションを行った。
続いて、 刺激剤として 25 // L のトロンビン溶液 （最終濃度 lunit/mL、 図 1 r hrombinJ ) 、 PAR- 1活性化ペプチド溶液 (SFLLRN-NH2 (配列番号 2 ) 、 最終濃度 5 μ mol/L、図 1「THAP」）又はアデノシン 2リン酸 (最終濃度 50 μ mol7L、 図 1 「ADP」 ） を添加し、 さらに 20分間インキュベーションを行った。 インキュ ベーシヨン後、 これらの反応液を直ちにマイクロチューブへ移し 4°Cにて 12000i mで 10分間遠心を行った。 上清を別のチューブへ移し、 可溶性 CD40リ ガンド量を測定するまで凍結保存した。 可溶性 CD40 リガンドの定量は市販の ELISAキット （Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria) を用いて測定し た。
血小板 108個当たりの可溶性 CD40リガンド放出量を算出し、化合物 A非添加時 の刺激剤による可溶性 CD40 リガンド放出量から刺激剤を添加しなかつた時の可 溶性 CD40リガンド放出量を差し引いた量を 100%として、下記式により化合物 A 添加による阻害0 /0を算出した。
阻害％= ( B— A) / (B - C) X 1 0 0
式中、 Aは刺激剤及び化合物 A存在下の放出量を、 Bは刺激剤存在下の放出量を、 Cは刺激剤非存在下の放出量を示す。
ィ匕合物 A濃度と算出した阻害％から得られるシグモイド曲線から IC50値を算出 した。 IC50値は、 解析ソフト SAS8.1の NLINプロシージャ機能を使用して化合 物と阻害％のシグモイド曲線のパラメータを非線形回帰で求め、 50%を阻害する化 合物濃度 （IC5o値） を算出した。
( 2 ) 結果
血小板からの可溶性 CD40 リガンドの放出に対する化合物 Aの抑制作用を図 1 に示す。 化合物 Aは、 ト口ンビンに対して ¾)=0·048 μ mol/Lであり、 TRAPに 対して IC5o=0.048 μ mol/Lであつた。 実施例 2 血管平滑筋細胞からの IL-6放出に対する抑制作用
( 1 ) 方法
ヒ ト冠状動脈由来平滑筋細胞 （HCASMCs ) は、 Cambrex Bio Science WalkersviUe, Inc. (WalkersviUe, MD, USA)から購入した。培養 HCASMCsは、 I型コラーゲンをコート処理した 48穴プレートでほぼコンフルェント状態になる ように培養した。 次に、 培養液を 0.1%牛血清アルブミン （BSA) 含有 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) に交換して 1—2日間インキュベーションを 行った。 培養液を新鮮な 0.1%BSA含有 DMEM (200 L) に交換し、 各種濃度の 化合物 A溶液 25 / Lを添加し、 引き続レ、てトロンビン溶液 （最終濃度 lunit/mL) を添加した。 1日後、 培養液上清を回収し IL-6を測定するまで凍結保存した。 培 養液上清を回収した細胞は、 直ちに 250 の Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) で 2回洗浄し、 O.l molTLの NaOH溶液 （150— 200 L) を添加 して室温で 2時間以上静置して細胞を溶解した。 細胞タンパク質量は、 protein assay dye reagent (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) を用レ、て定 量した。培養液上清中の IL-6の.定量は、市販の ELISAキット（R&D System, Inc., MineapoHs, MN, USA) を用レヽて測定した。
培養した各穴ごとの IL-6量を細胞タンパク質量当たりの放出量として標準ィ匕し た。化合物 A非存在下でのト口ンビン刺激による IL-6放出量から非刺激の IL-6放 出量を差し引いた量を 100%として、 各濃度の化合物 Aによる阻害。/。を、 前述の実 施例 1と同様に算出した。化合物 A濃度と阻害％から得られるシグモイド曲線から IC50値を算出した。
( 2 ) 結果
血管平滑筋細胞からの IL-6放出に対する化合物 Aの抑制作用を図 2に示す。 化 合物 Aの ICsoは、 IC50=0.00019 μ mol/Lであった。 実施例 3 血管内皮細胞の P-selectin発現抑制作用
( 1 ) 方法
ヒト冠状動脈由来内皮細胞（HCAECs)は、 Cambrex Bio Science Walkersville， Inc. (WalkersviHe, MD, USA)から購入した。培養 HCAECsは、 Trypsin-EDTA 溶液で剥がし、 洗浄、 遠心した後、 培養液 EGM-2MV (Cambrex Bio Science Walkersville, Inc.) を用いて 105個/ mLとなるように調製した。 得られた細胞懸 濁液は I型コラーゲンをコート処理した 96穴プレートに 200 添加した。 1日 間インキュベーションを行った後、 培養液を新鮮な EGM-2MV (170 // L) に交換 した。 1時間後、 10 / Lの IL-4 (最終濃度： Ing/mL) を添加し、 さらに 1日間ィ ンキュベーシヨンを行った。 次に、 各種濃度の化合物 A溶液 10 Lを添加し、 10 分間後に 10 x Lのトロンビン溶液 （最終濃度： 0.3unit/mL) を添加した。 5分後 に培養液を除去し、 100 / Lの DPBSで 1回洗浄した後、 0.025%ダルタールアル デヒド溶液を 100 i L添カ卩し、 6分間細胞の固定化を行った。 グルタールアルデヒ ド?額夜を除去し、 300 /z Lの 0.1%BSA含有 DPBSを添カロして 20分間静置した。 この溶液を除去した後、 100 μ Lの抗 P-selectin抗体溶液 （BD Biosciences, San Jose, CA, USA) を添加し、 1 時間インキュベーションを行った。 の 0.1%BSA 含有 DPBS で 3 回洗浄した後、 100 yu L の horse radish peroxidase-conjugated iiLマウス IgG 体溶液 (.Jackson ImmunoResearch Lab. Inc., West Grove, PA, USA) を添加し、 1 時間インキュベーションを行った。
300 i L (D 0.1%BSA含有 DPBSで 3回洗浄した後、 100 Lの TMB microweU peroxidase substrate solution (Kir egaard & Perry Lab. Inc., Gaithersburg, MD, USA) を添カ卩して 10分間ィンキュベーションを行つた。 反応を 50 μ Lの lmol/L リン酸？薪夜を添加することによって停止させた後、 450nmの吸光度 (OD450) を 測定した。
ィ匕合物 A非存在下でのトロンビン刺激による OD450から非刺激の OD450を差 し引いた値を 100%として、 各濃度のィ匕合物 Aによる阻害％を、 前述の実施例 1と 同様に算出した。 ィ匕合物 A濃度と阻害％から得られるシグモイド曲線から IC50値 を算出した。
( 2 ) 結果
血管内皮細胞の P-selectinの発現に対する化合物 Aの抑制作用を図 3に示す。化 合物 Aの ICsoは、 IC5o=0.016 i mol/L であった。 図 3の縦軸は、 P-selectin ( 「CD62P」 ともいう） の発率阻害の割合を示す。 これらの実施例 1〜 3により、 ィ匕合物 Aは、 血小板からの可溶性 CD40 リガン ド放出に対する抑制作用、 血管平滑筋細胞からの IL-6放出に対する抑制作用、 及 び血管内皮細胞の P-selectin発現抑制作用を有することが示された。すなわち、化 合物 Aを含むト口ンビン受容体アンタゴニストは、これら炎症性マーカーを減少さ せる作用を有することが示された。
また、 これらの炎症性マーカーは、 ACS患者の心血管イベント発生率に関与し ていることが明らかになつている （C. Heeschen et al., N. Engl. J. Med. 2003； 348: 1104-1111, S. X. Anand et al., Thromb. Haemost. 2003； 90: 377-384, E. Lindmark et al., JAMA. 2001； 286： 2107-2113) 。
したがって、これらの炎症性マーカーの減少を指標にして、心血管イベント発生 に対するトロンビン受容体アンタゴニストの抑制効果を判断することが可能とな つた。 産業上の利用可能性
本発明により、 トロンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果 を、 炎症性マーカーの減少により判定する方法が提供される。
本発明により、 トロンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果 を、炎症性マーカーの減少により判定することが可能となった。本発明の好ましい 態様において、トロンビン受容体アンタゴニストの心血管ィベント発生抑制効果は、 可溶性 CD40リガンド、 IL-6及び P-selectinから選ばれる少なくとも 1つの炎症 性マーカーの減少量を指標とすることにより、 予測することが可能となった。
したがって、本発明により、 トロンビン受容体アンタゴニストの治療効果を早期 に捕らえることが可能になつた。 また、 好ましくは、 炎症性マーカーを ACS患者 等の治療方針を決めるにあたっての指針に用いることが可能になり、さらに好まし くは、 炎症性マーカーを ACS等の疾患の治療薬開発における有効性の指標に用い ることも可能になった。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ：合成ペプチド
配列番号 2 ：合成ペプチド

Claims

請求 の範囲
1 . 生体試料中の炎症性マーカーを測定し、 得られた測定結果から心血管ィベン トの発生に対するト口ンビン受容体アンタゴニストの抑制効果を判定する方法。
2 . 生体試料中の炎症性マーカーを測定し、 得られた測定結果から心血管ィベン 卜の発生に対する 2—ィミノピロリジン誘導体の抑制効果を判定する方法であ つて、
前記 2—ィミノピロリジン誘導体が、 一般式 (I)
Figure imgf000028_0001
〔式 (I) 中、 A環はピロリジン環を； B環はベンゼン環又はピリジン環を； R 101、 Rio2及び RiQ3は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原子、 ハロ ゲン原子、 C i〜C6アルキル基又は Ci〜C6アルコキシ基を； Ar1は式 (II)
Figure imgf000028_0002
(式 （II) 中、 R10、 R11 R12、 R13及び R14は、 それぞれ独立し、 同一又は相 異なって、 水素原子、 Ci〜C6アルキル基、 水酸基、 C i〜C6アルコキシ基、 モ ルホリ-ル基、置換基を有していてもよいピペラジニル基、置換基を有していて もよぃピペリジニル基又は置換基を有していてもよいピロリジ-ル基を示し、さ らに、 R Uと R i2、 又は R 12と R 13は、 互いに結合して 5〜 8員複素環を形成し ていてもよい。 ） で表される基を示す。 〕 で表されるィ匕合物、 もしぐはその薬学 的に許容される塩、 又はそれらの溶媒和物である、
言 己方法。
. 生体試料中の炎症性マーカーを測定し、 得られた測定結果から心血管ィベン トの発生に対する 2—ィミノピロリジン誘導体の抑制効果を判定する方法であ つて、
前記 2—ィミノピロリジン誘導体が、 一般式 (III)
Figure imgf000029_0001
〔式 （III) 中、 R i及び R2は、 それぞれ独立し、 同一又は相異なって、 水素原 子、 メ トキシ基又はエトキシ基を；+ Χ 1は水素原子又はハロゲン原子を； A r 2 は、 1又は 2以上の置換基で置換されていてもよいフエ二ル基を示し、 ここで、 当該置換基は、 メチル基、 ェチル基、 メ トキシ基、 エトキシ基、 tープ チル基、 モルホリニル基、 及ぴ下記式 (IV) で表される置換基から選ばれ、
Figure imgf000029_0002
式 （IV) 中、 Wは一 CH—又は窒素原子を； Aiは一 CH2—又は単結合を； R3 は水素原子又は一 OR5aを； X2は一 CH2—、 酸素原子、 単結合又はカルボ-ル 基を； Yは単結合又は Ci C アルキレン基を； R4は水素原子、 一 OR6a、 シ ァノ基又は一 COOR7を； R5a、 R6a及ぴ R7は、 それぞれ独立し、 同一又は相 異なって、 水素原子又は Ci〜C4アルキル基を示す。 〕
で表される化合物、 もしくはその薬学的に許容される塩、又はそれらの溶媒和物 である、 前記方法。
4. 前記 R1及ぴ R2がエトキシ基であり、 かつ、前記 X1がフッ素原子である請求 項 3記載の方法。
5. 生体試料中の炎症性マーカーを測定し、 得られた測定結果から心血管ィベン トの発生に対する 2—ィミノピロリジン誘導体の抑制効果を判定する方法であ つて、
前記 2—ィミノピロリジン誘導体が、 式 （V) 〜 （XII) で表される化合物か らなる群から選ばれる少なくとも 1つ、 もしくはその薬学的に許容される塩、又 はそれらの溶媒和物である、 前記方法。
Figure imgf000031_0001
. 生体試料中の炎症性マーカーを測定し、 得られた測定結果から心血管ィベン トの発生に対する 2—ィミノピロリジン誘導体の抑制効果を判定する方法であ つて、
前記 2—ィミノピロリジン誘導体が、 式 （V) で表される化合物、 もしくはそ の薬学的に許容される塩、 又はそれらの溶媒和物である、 前記方法。
Figure imgf000032_0001
7. 炎症性マーカ一が、 可溶性 CD40リガンド、 IL-6及び P-selectinからなる群 力 ら選ばれる少なくとも一つである、請求項 1〜 6のいずれか一項に記載の方法。
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