WO2007085621A1 - Method and apparatus for exerting an effect on cells - Google Patents

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WO2007085621A1
WO2007085621A1 PCT/EP2007/050699 EP2007050699W WO2007085621A1 WO 2007085621 A1 WO2007085621 A1 WO 2007085621A1 EP 2007050699 W EP2007050699 W EP 2007050699W WO 2007085621 A1 WO2007085621 A1 WO 2007085621A1
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WO
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aerosol
cells
aerosols
exposure
aerosol generator
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PCT/EP2007/050699
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German (de)
French (fr)
Inventor
Ulrich Mohr
Josef Vogel
Ulrich Deschl
Original Assignee
Boehringer Ingelheim International Gmbh
Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
    • C12M35/08—Chemical, biochemical or biological means, e.g. plasma jet, co-culture

Definitions

  • the present invention relates to a method for assaying the biological effect of a huable substance or composition on living cells and a device for carrying out such studies.
  • the present invention is based on the idea of using such culture devices in a standardized test system with which the biological effect of inhalable substances or substance mixtures on living cells is systematically examined, whereby the substances to be investigated are brought into direct contact as aerosols with the prokaryotic or eukaryotic biological test cultures and then examine the effects of this contact on the biological systems.
  • a system makes it possible to detect from a large number of substances those whose biological activity permits a statement about the therapeutic benefit and / or its toxicity, while at the same time the number of animal experiments and the required substance quantities are reduced.
  • the present invention thus relates to an in vitro method for investigating the biological effect of a test substance, characterized in that
  • test substance is transferred by the aerosol generator into a finely divided particle stream
  • moistening the air can be kept at a value of at least 60% relative humidity. Preference is given to saturated saturation of the clean air with water vapor, which then forms a carrier matrix for the test substance in the resulting aerosol.
  • Aerosols are understood as meaning gases which contain liquid or solid substances in extremely finely divided form. Typical particle sizes for inhalation purposes are from 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably from 1 ⁇ m to 5 ⁇ m aerodynamic diameter. Various possibilities of aerosol production are described in "Theory and Practice of Inhalation Therapy” by Dieter Köhler and Wolfgang Fleischer, Arcis Verlag, Kunststoff, 2000, ISBN 3-89075-140-7 and summarized in Figure 22, page 33 of the book.
  • aerosols containing liquid particles may be venturi-atomized (compressed air or steam), single-fluid nozzles (eg Respimat®), ultrasound (pressing the fluid through a vibrating perforated membrane, detaching droplets from surface waves) or vaporizing and subsequent condensation are made.
  • venturi-atomized compressed air or steam
  • single-fluid nozzles eg Respimat®
  • ultrasound pressing the fluid through a vibrating perforated membrane, detaching droplets from surface waves
  • vaporizing and subsequent condensation are made.
  • Solid particle aerosols can be generated by dispersing the powder with a suitable gas, especially air.
  • the powder can be metered in accordance with an inhalation with individual strokes (for example HandiHaler®) or in large quantities as a heap.
  • Solid particles aerosols can also be removed by one or more sharp edges of a compact of active ingredient and excipients. Evaporation and subsequent condensation can also produce aerosols with solid particles.
  • aerosol generation i. the selection of the aerosol generator takes place depending on the agent to be characterized (liquid aerosol, solid / powder aerosol) but is of minor importance for the claimed method.
  • Typical examples of aerosol generators which can be used in the present invention are known by the name of Respimat® for the production of droplets and Handihaler® for the production of solid particles.
  • Preferred aerosol generators can produce a defined aerosol concentration of the substance in the range of 1 ⁇ g / L to 20 mg / L.
  • the size of the particles produced should be in the range of 0.1 ⁇ m to 10 ⁇ m, preferably 1 ⁇ m to 5 ⁇ m.
  • test atmosphere generated by mixing the streams from the aerosol generator and possibly the humidifier in the distributor should be kept at a constant temperature. Depending on the applied cell type, the temperature should be maintained between 20 ° C and 45 ° C and preferably between 37 ° C and 42 ° C. - A -
  • the withdrawn volume flow should be able to be varied in the range from 1 ml / min to 200 ml / min, preferably from 5 ml / min to 10 ml / min.
  • Cell cultures which are cultivated in so-called CULTEX® modules are particularly suitable for charging cells with the test atmosphere generated in the distributor by mixing the streams from the aerosol generator and optionally the humidifier.
  • Part of the test atmosphere in the distributor is preferably via a flow guide with an inlet for introducing the
  • Test atmosphere i n the flow guide and an opening above the cell culture output opening in the Kutur / exposure device forcibly guided and comes into direct contact with the cells in order to develop a possibly biological effect can.
  • the flow guidance is characterized in that the outlet orifice of the flow guide opens in the direction of flow corresponding to the bell of a trumpet (hereinafter "trumpet-shaped"), thereby ensuring an intensive loading of the cells with the test atmospheres opening starting orifice opposite a circular cylindrical inlet pipe is that in particular difficult to control
  • the flow guide can be designed in such a way that the flow flow of the test atmosphere is generated over the surface of the cell culture and through an annular gap existing between the flow guide and the culture inner wall, for example by means of a vacuum pump arranged downstream of said annular gap. She leaves the admission area, for example, via holes in a circle around the Inlet nozzles of the flow guide are arranged and the output side are bundled in an output port.
  • the flow guide may be connected on the input side to an intake manifold, which is connected to the generation source of the test atmosphere.
  • the exposure attachment includes one or more, for example, three separate flow guides that allow separate loading of the cells in separate cell culture vessels of the exposure device.
  • various materials can be used, which are based on the properties of the test atmosphere, e.g. Teflon, metallic materials, polished stainless steel and specially non-stick or glass-coated trumpet-shaped flow guides, which allow application of cultured cells, such as cells of the respiratory tract, with ultrafine particles.
  • Prokaryotic test systems are usually cultured on media solidified with agar or chelatine, while eukaryotic cells are preferentially cultured on membranes for direct loading. These are basally supplied with culture medium via the membrane, so that the cells grow without medium (apical).
  • eukaryotic cells are cells of the animal or human respiratory tract; macrophages; endothelial cells; or fibroblasts.
  • cells of the respiratory tract for example, nasal, bronchial or alveolar epithelial cells come into question for the investigations.
  • the cells grow apically and come into direct contact with the test atmosphere at the air / liquid boundary layer. They can be cultured on microporous membranes (see DE 198 01 763 A1).
  • suitable microporous membranes are coated membranes, for example the companies Becton Dickinson (FALCON) and Corning (Costar), which ensure appropriate cell growth on account of their membrane properties.
  • a special culture guide not only allows the study of the drugs with the above cell types, but also allows their combination with other cells, such as macrophages, endothelial cells and fibroblasts, which may play a role in the development of the effect of the respective substance. This takes place in so-called co-cultures, wherein the cells are grown on both sides of a membrane.
  • Such a culture device in combination with the method after direct exposure of the apical cell type to the test atmosphere, allows an analysis of the interactions between the various cell types present on the membrane in order to obtain further information on the effect of the test substance.
  • Vessels which receive cells grown on microporous membranes and cultured to be exposed to the test atmosphere are preferably in a separate subset, with each vial being individually supplied with nutrients.
  • the supply of nutrients takes place via a feed line which is connected via a suitable connection, e.g. a hose connection is connected to the nutrient reservoir, and via an inlet nozzle allows a supply of nutrients in the relevant vessel of the pedestal.
  • the vessel can be filled to a certain level with medium to supply the cells over the time of exposure.
  • Another nozzle opens up the possibility of a constant medium flow in which the inflowing volume flows off or is removed in an analogous manner via the outlet nozzle.
  • the medium flow may e.g. controlled by a peristaltic pump.
  • test method described makes it possible, for example, to apply different target cells of the respiratory tract or suitable bacterial test systems to potentially therapeutically active substances which are taken up by inhalation and act directly.
  • This is not limited to gaseous and liquid aerosols, but also includes agents that are administered as solid aerosol particles.
  • the procedure ensures an immediate Loading the cultured cells or bacteria with a test atmosphere and allows a precise analysis of the resulting cellular reaction pattern to describe the expected therapeutic and possibly unwanted toxic effect.
  • the bioavailability and efficacy of substances applied in solid particulate form can be studied depending on particle size and support material, an aspect that can not be realized under conventional conditions.
  • Another advantage of the method is the ability to test not only individual substances, but also combinations thereof in different mixing ratios of cells to select therapeutically relevant agents or combinations thereof.
  • the treatment of cultured cells with therapeutic aerosols by direct application contains no limitation with regard to the determinable biological endpoints or effects. Typically certain parameters are e.g. Viable cell count, metabolic activity, membrane integrity, energy status, or oxidative stress.
  • a comprehensive characterization of the treated cells for example with respect to the cytotoxic and genotoxic activity of the test atmosphere, their inflammatory potential or molecular biology aspects (Genomics, Metabono mics) is fully possible, as well as receptor studies, the determination of mediators or other biomarkers, the analysis of signal transduction pathways and bioavailability conditions of the test atmosphere.
  • the investigations preferably carried out in the context of the method relate to the biological effect of aerosols / test atmosphere on cells cultured in vitro. They are typically aimed at
  • Examples of molecular biology studies include receptor studies, determination of mediators or other biomarkers, or analysis of signal transduction pathways.
  • Another object of the invention relates to a device based on the method just described.
  • Such a device is used to study the biological effect of an inhaled substance comprises
  • the device described additionally comprises on-line analyzers for measuring aerosol parameters, which are connected to the distributor via sampling points and, like the cell culture units, are supplied with samples from the distributor.
  • cold traps or activated carbon filters for gaseous components particle filters for aerosol particles or impactors for defined particle sizes can be connected as sampling devices.
  • devices for determining the particle concentration devices for determining the particle size distribution or devices for determining the concentration of certain gaseous constituents can be connected as online analysis devices.
  • Typical examples of aerosol generators which can be used in the context of the present invention are known under the names Respimat® and Handihaler®.
  • a suitable culture and exposure unit are those available as CULTEX® modules.
  • a conditioning to a fixed temperature value between 20 ° C and 45 ° C and preferably between 37 ° C and 42 ° C.
  • FIGS. 1 and 6 show the aerosol exposure structure.
  • the complete construction consists of at least two such constructions, which are used for the simultaneous exposure of A549 cultures on microporous membranes to a control substance (aerosolized PBS) and a test substance (eg aerosolized tertiary butyl hydroperoxide).
  • a control substance e.g aerosolized PBS
  • a test substance eg aerosolized tertiary butyl hydroperoxide
  • Example 1 Apparatus for the Generation and Exposure of Droplet Aerosols on a Cell Culture Scale
  • a modular construction in parallel arrangement allows the simultaneous operation of several nebulizers.
  • the simultaneous, parallel exposure of cells to microporous membranes is e.g. to a test aerosol and a control aerosol (e.g., PBS as the vehicle or solvent of the test substance) in an experiment.
  • a control aerosol e.g., PBS as the vehicle or solvent of the test substance
  • nebulizers of the "Miniheart Low Flow Nebulizer” brand (Westmed Inc., Arlington, USA) are used, which are continuously pumped into the nebulizer storage vessel by means of a perfusor pump for constant levels in the nebulizer 37 ° C, 2 l / min)
  • the aerosols are sampled for cell exposures immediately above the outlet
  • the sampling position for an online aerosol analysis before the test aerosol is passed through a cold trap and a combined activated carbon / particulate filter.
  • the parallel operated position de s Kontrollaerosols be extended by such a cleaning unit and online aerosol analysis.
  • the entire flow path of the aerosols above the Nebulizer is heated by an electric winding heater to approx. 37 ° C constantly thermostated.
  • A549 culture DSMZ, Braunschweig cells are harvested during the routine culture split and seeded on membranes (BD Falcon). After a 72 h attachment and growth phase under standard culture conditions, the cells on the membranes are microscopically controlled and provided with fresh medium. Eighteen hours before the actual exposure, the adherently-growing cells become submerged in culture spent in an air / lifted cultural tour. The cells conditioned in this way are used for exposure to the test aerosol or the control aerosol or as incubator control. Following the exposure period, the cells are worked up or post-cultured under submerged conditions in the incubator for further analysis.
  • WST-1 dye reagent (Boehringer, Mannheim) is added to the culture medium supernatant. The cells are reincubated under cell-type-specific conditions in the incubator for 30 min. The measurement of the absorption in the microtiter plate reader at the wavelengths 450 nm / 630 nm is then carried out from the medium.
  • a trypsin / EDTA solution is added and the cells are reincubated at 37 ° C for 5 min in the incubator. Subsequently, the trypsin effect is stopped by addition of trypsin inhibitor and the cells are carefully suspended.
  • an electronic cell analyzer (CASY, Fa. Sharp) an aliquot of cell trypsinate is suspended in a weak electrolyte and sucked at a constant flow rate through a capillary of defined geometry. Each cell suspension is subjected to a triple measurement.
  • Incubator controls are incubated in the incubator for the period of exposure under air-liquid culture conditions.
  • Exposure controls are cultures that are exposed simultaneously and simultaneously to the aerosol exposure under the same conditions as the cells in aerosol exposure. The only difference with aerosol exposure is that this exposure occurs exclusively against aerosolized PBS. In aerosol exposure, the cultures are exposed for 30 minutes to various concentrations of a freshly generated droplet aerosol of a model substance.
  • Various concentrations of a model substance are used.
  • the cells are exposed to the generated aerosols at an exposure flux of 5 ml / min / cm 2 for 30 min each.
  • the deposition of the aerosol is quantified using Na fluorescein (10 ⁇ g / ml in the Nebulizer filling) on the microporous membranes. Under conditions of cell exposure, they are overflowed with exposure fluxes of 5 ml / min for periods of 10 to 30 minutes.
  • the membranes are removed, cut out of the holders, extracted with ultrapure water and quantified the fluorescence of the extract at the wavelengths 435 nm (ex.) 510 nm (em.) against reference solutions of Na-fluorescein in ultrapure water. By cutting out the membranes, only the growth areas are included in the measurement, on which the adherent cell cultures will be located.
  • the volumes of PBS deposited during the exposure time can be determined by staining the Nebulizer filling with sodium fluorescein and detecting in cell-free experiments.
  • the maximum deposited volume is within 30 minutes at 1 ul / cm 2 .
  • the medium level (“medium level”) below the membrane can also be an influence on the exposure situation of apically adherently cultivated cells when using microporous membranes. Therefore, cell-grown membranes are exposed to the aerosolized model substances or the corresponding PBS control for the duration of exposure as a function of the medium level in up to three different variations: (1) under the conditions of a "high” medium level, and a resulting maximum hydrostatic level Pressure on the microporous membrane (2) minimal “contact” between the membrane and the basal medium, and (3) no membrane and medium contact, a so-called “low” medium level ( Figure 2-2).
  • Exposure controls are used concurrently with each aerosol exposure in parallel construction and are the reference for the aerosol exposure results as they are subject to all exposure factors, except for the effect of the test substance.
  • the cell-grown originating from the respective control situations are used concurrently with each aerosol exposure in parallel construction and are the reference for the aerosol exposure results as they are subject to all exposure factors, except for the effect of the test substance.
  • Membranes are processed in parallel with the membranes derived from the aerosol exposures.
  • the results for the incubator controls and the exposure controls depending on the respective exposure day are shown separately after endpoints.
  • the results of the tetrazolium salt conversion (WST-1) after exposure of the A549 cells to a PBS droplet aerosol as a control situation for the aerosol exposures carried out with model substances are shown in FIG. 2 for two exposure days (Di and Mi) as a function of the exposure situation (mean values with standard deviation for medium high, medium contact and medium deep).
  • the data are related to the respective incubator controls currently carried out during each exposure.
  • the values are in the fluctuation range of the incubator controls and document that the exposure situation has no influence on the tetrazolium salt conversion of the cells.
  • the results of the living cell count determination, which was recorded as a further vitality parameter following the exposure, are compiled in FIG.
  • the values on both days of exposure coincide on average Exposure controls in all exposure situations with incubator control values.
  • the medium level "contact” is used.
  • FIG. 4 shows the results of this series of experiments.
  • the results from the study of the tetrazolium salt conversion at the median level "contact" against the dose determined by the deposition study are shown: Measurement points taken into account for the regression are marked with "x", not taken into account with "o.”
  • the plotted curves correspond to the regression line with The corresponding confidence limits (95%)
  • a dose-response relationship is calculated which describes the complete vitality range of 100% to 0% within the investigated doses compared to the PBS-exposed control.
  • characteristic values for example ED 50 values (value at which the measured signal of an end point, eg metabolic activity in the WST-1 assay, is reduced by 50% compared to the control culture) can be calculated allow a direct comparison of effects of different substances.
  • ED 50 values value at which the measured signal of an end point, eg metabolic activity in the WST-1 assay, is reduced by 50% compared to the control culture
  • tBuOOH this value, based on the measurement of the metabolic activity (WST-1 assay) under the conditions mentioned, is 0.05 ⁇ mol / cm 2 or 0.08 ⁇ mol / cm 2 for the cell number.

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Abstract

A method and an apparatus for investigating the biological effect of a test substance is described and is characterized in that (a) an aerosol generator and, where appropriate, a humidifier are supplied with pure air, (b) the substance to be tested is converted by the aerosol generator into a finely dispersed particle stream, (c) the streams from the aerosol generator and, where appropriate, the humidifier are mixed in a suitable manner to give an aerosol and passed to a distributor, and (d) defined volumetric streams of the aerosol are drawn off from the distributor and brought into direct contact with prokaryotic or eukaryotic in vitro cultures in a culturing/exposure apparatus.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Beaufschlagung von Zellen Method and device for charging cells
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer hhalierbaren Substanz oder Zusammensetzung auf lebende Zellen und eine Vorrichtung zur Durchführung solcher Untersuchungen.The present invention relates to a method for assaying the biological effect of a huable substance or composition on living cells and a device for carrying out such studies.
In der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung verwendete in vitro Prüfsysteme untersuchen potentielle Wirksubstanzen unter konventionellen Kulturbedingungen. Dies gilt auch für Substanzen, die am besten inhalativ appliziert werden. In diesen Prüfsystemen werden Zellen submers, d.h. mit Mediumüberschichtung kultiviert und eine potentielle Wirksubstanz dem Medium zugegeben beziehungsweise gelöst. Eine Untersuchung der biologischen Wirkung von Substanzen und Substanzkombinationen, die inhaliert werden müssten, können auf diesem Wege in vitro nicht in der Form untersucht werden, wie sie für den Patienten entwickelt werden (z.B. als Aerosol), sondern nur in Inhalationsversuchen am lebenden Tier.In vitro testing systems used in pharmaceutical research and development investigate potential drugs under conventional culture conditions. This also applies to substances that are best applied by inhalation. In these test systems, cells are submerged, i. cultured with medium coating and added or dissolved a potential active substance in the medium. A study of the biological effects of substances and combinations of substances that would need to be inhaled can not be tested in vitro in the form they are developed for the patient (for example, as an aerosol), but only in inhalation experiments on living animals.
DE 10014057 A1 und DE 1021 1324 beschreiben Kulturvorrichtungen, die es gestatten, die darin kultivierten Zellen den schädigenden oder therapeutischen Bedingungen gasförmiger Medien, Aerosole oder Partikelströme auszusetzen. Se können kommerziell unter der Bezeichnung CULTEX® erworben werden.DE 10014057 A1 and DE 1021 1324 describe culture devices which make it possible to expose the cells cultured therein to the damaging or therapeutic conditions of gaseous media, aerosols or particle streams. Se can be purchased commercially under the name CULTEX®.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee derartige Kulturvorrichtungen in einem standardisiertes Prüfsystem zu nutzen, mit dem die biologische Wirkung inhalierbarer Substanzen oder Substanzmischungen auf lebende Zellen systematisch untersucht wird, wobei die zu untersuchenden Substanzen als Aerosole mit den prokaryotischen oder eukaryotischen biologischen Testkulturen in unmittelbaren Kontakt gebracht und anschließend die Auswirkungen dieses Kontaktes auf die biologischen Systeme untersucht werden. Durch ein solches System lassen sich aus einer Vielzahl von Substanzen jene aufspüren, deren biologische Wirkung eine Aussage über den therapeutischen Nutzen und/oder seine Toxizität zulässt, während gleichzeitig die Zahl der Tierversuche als auch die benötigten Substanzmengen verringert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein in vitro Verfahren zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer Prüfsubstanz, dadurch gekennzeichnet dassThe present invention is based on the idea of using such culture devices in a standardized test system with which the biological effect of inhalable substances or substance mixtures on living cells is systematically examined, whereby the substances to be investigated are brought into direct contact as aerosols with the prokaryotic or eukaryotic biological test cultures and then examine the effects of this contact on the biological systems. Such a system makes it possible to detect from a large number of substances those whose biological activity permits a statement about the therapeutic benefit and / or its toxicity, while at the same time the number of animal experiments and the required substance quantities are reduced. The present invention thus relates to an in vitro method for investigating the biological effect of a test substance, characterized in that
(a) ein Aerosol Generator und gegebenenfalls ein Befeuchter mit Reinluft versorgt werden,(a) an aerosol generator and possibly a humidifier are supplied with clean air,
(b) die Prüfsubstanz durch den Aerosol Generator in einen fein verteilten Partikelstrom überführt wird,(b) the test substance is transferred by the aerosol generator into a finely divided particle stream,
(c) die Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter in geeigneter Weise zu einem Aerosol durchmischt und einem Verteiler zugeleitet werden, und(c) the streams from the aerosol generator and optionally the humidifier are suitably mixed into an aerosol and fed to a distributor, and
(d) aus dem Verteiler definierte Volumenströme des Aerosols abgezogen und in unmittelbaren Kontakt mit prokaryotischen oder eukaryoti sehen In-vitro- Testkulturen in einer Kultur/Expositionsvorrichtung gebracht werden.(D) withdrawn from the manifold volume flows of the aerosol and brought into direct contact with prokaryotic or eukaryotic in vitro test cultures in a culture / exposure device.
Als besonders vorteilhaft für die Durchführung des Verfahrens hat sich erwiesen, durch eine Wärmekonditionierung über den gesamten Prozess hinweg das Auftreten von Kondensationseffekten zu reduzieren bzw. zu minimieren. Besonders geeignet ist eine Konditionierung auf einen festen Temperaturwert zwischen 20 °C und 45 °C und bevorzugt zwischen 37°C und 42 °C.It has proven to be particularly advantageous for carrying out the method to reduce or minimize the occurrence of condensation effects by means of thermal conditioning throughout the entire process. Particularly suitable is a conditioning to a fixed temperature value between 20 ° C and 45 ° C and preferably between 37 ° C and 42 ° C.
Durch eine Befeuchtung kann die Luft auf einem Wert von wenigstens 60% relativer Feuchte gehalten werden. Bevorzugt ist eine Sättigung der Reinluft mit Wasserdampf, die dann im resultierenden Aerosol eine Trägermatrix für die Prüfsubstanz darstellt.By moistening the air can be kept at a value of at least 60% relative humidity. Preference is given to saturated saturation of the clean air with water vapor, which then forms a carrier matrix for the test substance in the resulting aerosol.
Als Aerosole zu verstehen sind Gase, welche flüssige oder feste Stoffe i n feinst verteilter Form enthalten. Typische Partikelgrößen für Inhalationszwecke sind von 0,1 μm bis 10μm, bevorzugt von 1 μm bis 5μm aerodynamischer Durchmesser. Verschiedene Möglichkeiten der Aerosolerzeugung werden in „Theorie und Praxis der Inhalationstherapie" von Dieter Köhler und Wolfgang Fleischer, Arcis Verlag, München, 2000, ISBN 3-89075-140-7 beschrieben und in Abbildung 22, Seite 33 des Buches zusammengefasst. So können Aerosole mit flüssigen Partikeln (Tröpfchen) durch Venturi- Düsenvernebler (Pressluft- oder Wasserdampf-getheben), durch Einstoffdüsen (z.B. Respimat®), durch Ultraschall (Pressen der Flüssigkeit durch vibrierende, perforierte Membran; Ablösen von Tröpfchen durch Oberflächenwellen) oder Verdampfen und anschließende Kondensation hergestellt werden.Aerosols are understood as meaning gases which contain liquid or solid substances in extremely finely divided form. Typical particle sizes for inhalation purposes are from 0.1 μm to 10 μm, preferably from 1 μm to 5 μm aerodynamic diameter. Various possibilities of aerosol production are described in "Theory and Practice of Inhalation Therapy" by Dieter Köhler and Wolfgang Fleischer, Arcis Verlag, Munich, 2000, ISBN 3-89075-140-7 and summarized in Figure 22, page 33 of the book. For example, aerosols containing liquid particles (droplets) may be venturi-atomized (compressed air or steam), single-fluid nozzles (eg Respimat®), ultrasound (pressing the fluid through a vibrating perforated membrane, detaching droplets from surface waves) or vaporizing and subsequent condensation are made.
Durch Versprühen mit Treibgasen (FCKW, HFKW) können feste oder flüssige Partikel entstehen, je nachdem, ob es sich um eine Suspension von festen Partikeln im Treibgas oder um eine Lösung des Wirkstoffes und eventueller Hilfsstoffe im Treibgas handelt. Aerosole mit festen Partikeln können durch dispergieren des Pulvers mit einem geeigneten Gas, insbesondere Luft, erzeugt werden. Dabei kann das Pulver dosiert entsprechend einer Inhalation mit Einzelhüben (z.B. HandiHaler®) oder als Haufwerk in größerer Menge vorliegen. Aerosole mit festen Partikeln können ferner durch eine oder mehrere scharfe Kanten von einem Presskörper aus Wirkstoff und Hilfsstoffen abgetragen werden. Durch Verdampfen und anschließende Kondensation können auch Aerosole mit festen Partikeln entstehen.By spraying with propellants (CFCs, HFCs), solid or liquid particles may form, depending on whether it is a suspension of solid particles in the propellant or a solution of the active ingredient and any excipients in the propellant gas. Solid particle aerosols can be generated by dispersing the powder with a suitable gas, especially air. In this case, the powder can be metered in accordance with an inhalation with individual strokes (for example HandiHaler®) or in large quantities as a heap. Solid particles aerosols can also be removed by one or more sharp edges of a compact of active ingredient and excipients. Evaporation and subsequent condensation can also produce aerosols with solid particles.
Die Technologie der Aerosol Generierung, d.h. die Auswahl des Aerosol Generators erfolgt in Abhängigkeit vom zu charakterisierenden Agens (Flüssigaerosol, Feststoff/Pulveraerosol) ist aber für das beanspruchte Verfahren von untergeordneter Bedeutung. Typische Bespiele von Aerosol Generatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden könne n, sind unter der Bezeichnung Respimat® für die Erzeugung von Tröpfchen und Handihaler® für die Erzeugung von festen Partikeln bekannt. Bevorzugte Aerosol Generatoren können eine definiert Aerosolkonzentration der Substanz im Bereich von 1 μg/l bis 20mg/l erzeugen. Die Grosse der erzeugten Partikel sollte sich im Bereich von 0,1 μm bis 10μm, vorzugsweise 1 μm bis 5μm bewegen.The technology of aerosol generation, i. the selection of the aerosol generator takes place depending on the agent to be characterized (liquid aerosol, solid / powder aerosol) but is of minor importance for the claimed method. Typical examples of aerosol generators which can be used in the present invention are known by the name of Respimat® for the production of droplets and Handihaler® for the production of solid particles. Preferred aerosol generators can produce a defined aerosol concentration of the substance in the range of 1 μg / L to 20 mg / L. The size of the particles produced should be in the range of 0.1 μm to 10 μm, preferably 1 μm to 5 μm.
Die durch Durchmischung der Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter im Verteiler erzeugte Prüfatmosphäre sollte konstant temperiert sein. Je nach beaufschlagtem Zelltyp sollte die Temperatur zwischen 20 °C und 45 °C und bevorzugt zwischen 37°C und 42 °C gehalten werden. - A -The test atmosphere generated by mixing the streams from the aerosol generator and possibly the humidifier in the distributor should be kept at a constant temperature. Depending on the applied cell type, the temperature should be maintained between 20 ° C and 45 ° C and preferably between 37 ° C and 42 ° C. - A -
Um aus dem Verteiler unterschiedliche Proben reproduzierbar abziehen zu können sollte der abgezogene Volumenstrom im Bereich von 1 ml/Min bis 200ml/Min, vorzugsweise von 5ml/Min bis 10Oml/Min variiert werden können.In order to be able to remove different samples reproducibly from the distributor, the withdrawn volume flow should be able to be varied in the range from 1 ml / min to 200 ml / min, preferably from 5 ml / min to 10 ml / min.
Besonders geeignet zur Beaufschlagung von Zellen mit der im Verteiler durch Durchmischung der Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter erzeugten Prüfatmosphäre sind Zellkulturen, die in sogenannten CULTEXΘ-Modulen kultiviert werden. Ein Teil der Prüfatmosphäre im Verteiler wird bevorzugt über eine Strömungsführung mit einem Eingang zum Einleiten derCell cultures which are cultivated in so-called CULTEX® modules are particularly suitable for charging cells with the test atmosphere generated in the distributor by mixing the streams from the aerosol generator and optionally the humidifier. Part of the test atmosphere in the distributor is preferably via a flow guide with an inlet for introducing the
Prüfatmosphäre i n die Strömungsführung und eine oberhalb der Zellkultur mündende Ausgangsöffnung in der Kutur/Expositionsvorrichtung zwangsgeführt und kommt in unmittelbaren Kontakt mit den Zellen, um eine allenfalls biologische Wirkung entfalten zu können. In einer besonderen Ausführungsform zeichnet sich die Strömungsführung dadurch aus, dass die Ausgangsmündung der Strömungsführung sich in Strömungsrichtung entsprechend dem Schalltrichter einer Trompete (im folgenden „trompetenförmig") öffnet. Dadurch wird eine intensive Beaufschlagung der Zellen mit den Prüfatmosphären gewährleistet. Der Vorteil dieser trompetenförmig sich öffnenden Ausgangsmündung gegenüber einem kreiszylindrischem Einleitungsrohr liegt darin, dass insbesondere schwer zu kontrollierendeTest atmosphere i n the flow guide and an opening above the cell culture output opening in the Kutur / exposure device forcibly guided and comes into direct contact with the cells in order to develop a possibly biological effect can. In a particular embodiment, the flow guidance is characterized in that the outlet orifice of the flow guide opens in the direction of flow corresponding to the bell of a trumpet (hereinafter "trumpet-shaped"), thereby ensuring an intensive loading of the cells with the test atmospheres opening starting orifice opposite a circular cylindrical inlet pipe is that in particular difficult to control
Ablösezonen an deren Mündungskante vermieden werden, die beispielsweise zu in sich geschlossenen Wirbeln und damit Totzonen ohne oder mit Undefinierter Beaufschlagung oberhalb der Kulturoberfläche führen. Mit dieser speziell geformten Ausgangsmündung wird sichergestellt, dass die Strömung der Prüfatmosphäre glatt und ablösefrei über die Zellen geführt wird und die in der Strömung enthaltenenAblösezonen be avoided at the mouth edge, for example, lead to self-contained vortices and thus dead zones with no or undefined exposure above the culture surface. This specially shaped exit port ensures that the flow of the test atmosphere is smoothly passed through the cells, free of charge, and contained in the flow
Stoffe, insbesondere Partikeln etc., möglichst gleichmäßig über die Kulturoberfläche verteilt werden. Die Strömungsführung kann derart gestaltet sein, dass der Strömungsfluss der Prüfatmosphäre über die Oberfläche der Zellkultur und durch einen zwischen der Strömungsführung und der Kultur-innenwand bestehenden Ringspalt hindurch erzeugt wird, beispielsweise durch eine Vakuumpumpe, die in Strömungsrichtung hinter dem genannten Ringspalt angeordnet ist. Sie verlässt den Beaufschlagungsraum z.B. über Bohrungen, die in einem Kreis um den Einlassstutzen der Strömungsführung angeordnet sind und die ausgangsseitig in einem Ausgangstutzen gebündelt werden. Die Strömungsführung kann eingangsseitig mit einem Ansaugstutzen verbunden sein, der mit der Generationsquelle der Prüfatmosphäre verbunden ist. Der Expositionsaufsatz beinhaltet ein oder mehrere, beispielsweise drei separate Strömungsführungen, die eine separate Beaufschlagung der Zellen in separaten Zellkulturgefäße der Expositionsvorrichtung ermöglichen.Substances, in particular particles etc., are distributed as evenly as possible over the culture surface. The flow guide can be designed in such a way that the flow flow of the test atmosphere is generated over the surface of the cell culture and through an annular gap existing between the flow guide and the culture inner wall, for example by means of a vacuum pump arranged downstream of said annular gap. She leaves the admission area, for example, via holes in a circle around the Inlet nozzles of the flow guide are arranged and the output side are bundled in an output port. The flow guide may be connected on the input side to an intake manifold, which is connected to the generation source of the test atmosphere. The exposure attachment includes one or more, for example, three separate flow guides that allow separate loading of the cells in separate cell culture vessels of the exposure device.
Für die Strömungsführung können verschiedene Materialien zum Einsatz kommen, die sich nach den Eigenschaften der Prüfatmosphäre richten, z.B. Teflon, metallische Werkstoffe, polierter Edelstahl und speziell antihaft- oder Glasbeschichtete trompetenförmige Strömungsführungen, die eine Beaufschlagung von kultivierten Zellen, beispielsweise Zellen des Respirationstraktes, mit ultrafeinen Partikeln gestatten.For the flow guidance various materials can be used, which are based on the properties of the test atmosphere, e.g. Teflon, metallic materials, polished stainless steel and specially non-stick or glass-coated trumpet-shaped flow guides, which allow application of cultured cells, such as cells of the respiratory tract, with ultrafine particles.
Prokaryotische Testsysteme werden in der Regel auf Medien kultiviert, die mit Agar oder Chelatine verfestigt sind, während eukaryotische Zellen zur Direktbeaufschlagung bevorzugt auf Membranen kultiviert werden. Diese werden basal mit Kulturmedium über die Membran versorgt, sodass die Zellen ohne Mediumüberschichtung (apikal) wachsen.Prokaryotic test systems are usually cultured on media solidified with agar or chelatine, while eukaryotic cells are preferentially cultured on membranes for direct loading. These are basally supplied with culture medium via the membrane, so that the cells grow without medium (apical).
Beispiele für eukaryotische Zellen sind Zellen des tierischen oder menschlichen Respirationstraktes; Makrophagen; Endothelzellen; oder Fibroblasten. Als Zellen des Respirationstraktes kommen zum Beispiel Nasen-, Bronchial- oder Alveolarepithelzellen für die Untersuchungen in Frage. Die Zellen wachsen apikal und treten an der Luft/Flüssigkeitsgrenzschicht direkt mit der Prüftatmosphäre in Kontakt. Sie können auf mikroporösen Membranen kultiviert werden (vgl DE 198 01 763 A1). Beispiele für geeignete mikroporöse Membranen sind beschichtete Membranen z.B. der Firmen Becton Dickinson (FALCON) und Corning (Costar), die aufgrund ihrer Membraneigenschaften ein entsprechendes Zellwachstum gewährleisten. Eine spezielle Kulturführung gestattet nicht nur die Untersuchung der Wirkstoffe mit den oben genannten Zelltypen, sondern erlaubt auch deren Kombination mit weiteren Zellen, wie zum Beispiel Makrophagen, Endothelzellen und Fibroblasten, die bei der Entfaltung der Wirkung des jeweiligen Stoffes eine Rolle spielen können. Dies erfolgt in sogenannten Kokulturen, wobei die Zellen beidseitig auf einer Membran angezüchtet werden. Eine solche Kulturvorrichtung in Kombination mit dem Verfahren erlaubt nach Direktbeaufschlagung des apikal befindlichen Zelltyps mit der Testatmosphäre eine Analyse der Interaktionen zwischen den auf der Membran befindlichen verschiedenen Zelltypen, um weitergehende Aufschlüsse über die Wirkung der Prüfsubstanz zu ermitteln.Examples of eukaryotic cells are cells of the animal or human respiratory tract; macrophages; endothelial cells; or fibroblasts. As cells of the respiratory tract, for example, nasal, bronchial or alveolar epithelial cells come into question for the investigations. The cells grow apically and come into direct contact with the test atmosphere at the air / liquid boundary layer. They can be cultured on microporous membranes (see DE 198 01 763 A1). Examples of suitable microporous membranes are coated membranes, for example the companies Becton Dickinson (FALCON) and Corning (Costar), which ensure appropriate cell growth on account of their membrane properties. A special culture guide not only allows the study of the drugs with the above cell types, but also allows their combination with other cells, such as macrophages, endothelial cells and fibroblasts, which may play a role in the development of the effect of the respective substance. This takes place in so-called co-cultures, wherein the cells are grown on both sides of a membrane. Such a culture device in combination with the method, after direct exposure of the apical cell type to the test atmosphere, allows an analysis of the interactions between the various cell types present on the membrane in order to obtain further information on the effect of the test substance.
Gefäße, welche auf mikroporösen Membranen angezüchtete und kultivierte Zellen zur Beaufschlagung mit der Prüfatmosphäre aufnehmen (z.B. in sogenannten Transwell-Inserts), befinden sich bevorzugt in einem separaten Untersatz, wobei jedes Gefäß individuell mit Nährstoffen versorgt wird. Die Nährstoffversorgung erfolgt über eine Zuleitung, die über eine entsprechende Verbindung wie z.B. eine Schlauchverbindung mit dem Nährstoffreservoir verbunden ist, und die über einen Eingangsstutzen eine Nährstoffzufuhr in das betreffende Gefäß des Untersatzes ermöglicht. Das Gefäß kann bis zu einer bestimmten Höhe mit Medium zur Versorgung der Zellen über die Zeit der Beaufschlagung gefüllt werden. Ein weiterer Stutzen eröffnet die Möglichkeit eines ständigen Mediumflusses, in dem das einströmende Volumen in analoger Weise über den Ausgangsstutzen abfließt bzw. entfernt wird. Der Mediumstrom kann z.B. durch eine Schlauchpumpe kontrolliert reguliert werden. Durch diese Maßnahmen wird eine kontinuierliche Mediumversorgung über lange Beaufschlagungszeiten erreicht.Vessels which receive cells grown on microporous membranes and cultured to be exposed to the test atmosphere (e.g., in so-called transwell inserts) are preferably in a separate subset, with each vial being individually supplied with nutrients. The supply of nutrients takes place via a feed line which is connected via a suitable connection, e.g. a hose connection is connected to the nutrient reservoir, and via an inlet nozzle allows a supply of nutrients in the relevant vessel of the pedestal. The vessel can be filled to a certain level with medium to supply the cells over the time of exposure. Another nozzle opens up the possibility of a constant medium flow in which the inflowing volume flows off or is removed in an analogous manner via the outlet nozzle. The medium flow may e.g. controlled by a peristaltic pump. Through these measures, a continuous supply of medium over long admission times is achieved.
Mit dem beschriebenen Prüfverfahren ist es möglich z.B. unterschiedliche Zielzellen des Respirationstraktes oder geeignete bakterielle Prüfsysteme mit potentiell therapeutisch wirksamen Substanzen zu beaufschlagen, die speziell inhalativ aufgenommen werden und direkt wirken. Dies beschränkt sich nicht nur auf gasförmige und Flüssigaerosole, sondern umfasst auch Wirkstoffe, die als feste Aerosolpartikel verabreicht werden. Das Verfahren gewährleistet eine unmittelbare Beaufschlagung der kultivierten Zellen oder Bakterien mit einer Prüfatmosphäre und erlaubt eine genaue Analyse des resultierenden zellulären Reaktionsmusters zur Beschreibung der zu erwartenden therapeutischen und allenfalls unerwünschten toxischen Wirkung. Die Bioverfügbarkeit und Wirksamkeit von Substanzen, die in fester partikulärer Form appliziert werden, kann in Abhängigkeit von der Partikelgröße und dem Trägermaterial untersucht werden, ein Aspekt, der unter konventionellen Bedingungen nicht realisiert werden kann.The test method described makes it possible, for example, to apply different target cells of the respiratory tract or suitable bacterial test systems to potentially therapeutically active substances which are taken up by inhalation and act directly. This is not limited to gaseous and liquid aerosols, but also includes agents that are administered as solid aerosol particles. The procedure ensures an immediate Loading the cultured cells or bacteria with a test atmosphere and allows a precise analysis of the resulting cellular reaction pattern to describe the expected therapeutic and possibly unwanted toxic effect. The bioavailability and efficacy of substances applied in solid particulate form can be studied depending on particle size and support material, an aspect that can not be realized under conventional conditions.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht in der Möglichkeit nicht nur Einzelsubstanzen, sondern auch Kombinationen derselben in unterschiedlichen Mischungsverhältnissen an Zellen zu testen, um therapeutisch relevante Wirkstoffe oder deren Kombinationen zu selektieren.Another advantage of the method is the ability to test not only individual substances, but also combinations thereof in different mixing ratios of cells to select therapeutically relevant agents or combinations thereof.
Die Behandlung kultivierter Zellen mit therapeutischen Aerosolen durch Direktbeaufschlagung beinhaltet keine Limitierung hinsichtlich der bestimmbaren biologischen Endpunkte bzw. Wirkungen. Typischerweise bestimmte Parameter sind z.B. Lebendzellzahl, metabolische Aktivität, Membranintegrität, Energiestatus oder oxidativer Stress. Eine umfassende Charakterisierung der behandelten Zellen zum Beispiel in Bezug auf die zyto- und genotoxische Aktivität der Prüfatmosphäre, deren inflammatorisches Potential oder molekularbiologische Aspekte (Genomics, Metabono mics) ist uneingeschränkt möglich, ebenso wie Rezeptoruntersuchungen, die Bestimmung von Mediatoren oder anderen Biomarkern, die Analyse von Signaltransduktionswegen und Bestimmungen zur Bioverfügbarkeit der Prüfatmosphäre.The treatment of cultured cells with therapeutic aerosols by direct application contains no limitation with regard to the determinable biological endpoints or effects. Typically certain parameters are e.g. Viable cell count, metabolic activity, membrane integrity, energy status, or oxidative stress. A comprehensive characterization of the treated cells, for example with respect to the cytotoxic and genotoxic activity of the test atmosphere, their inflammatory potential or molecular biology aspects (Genomics, Metabono mics) is fully possible, as well as receptor studies, the determination of mediators or other biomarkers, the analysis of signal transduction pathways and bioavailability conditions of the test atmosphere.
Die im Rahmen des Verfahrens bevorzugt durchgeführten Untersuchungen betreffen die biologische Wirkung von Aerosole n/Prüfatmosphäre auf in vitro kultivierte Zellen. Sie sind typischerweise gerichtet aufThe investigations preferably carried out in the context of the method relate to the biological effect of aerosols / test atmosphere on cells cultured in vitro. They are typically aimed at
• die Wirksamkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial; • die Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial;The effectiveness of active substances or combinations of active substances of particulate aerosols, depending on their particle size and optionally the carrier material used; The bioavailability of active substances or combinations of active substances of particulate aerosols as a function of their particle size and optionally the carrier material used;
• die zyto- und genotoxische Wirkung der Gase, Aerosole oder Mischungen auf die Zellkulturen;The cytotoxic and genotoxic effects of gases, aerosols or mixtures on cell cultures;
• das inflammatorisches Potential der Gase, Aerosole oder Mischungen für die Zellkulturen;The inflammatory potential of gases, aerosols or mixtures for cell cultures;
• das zelluläre Reaktionsmuster der Zellkulturen auf den unmittelbaren Kontakt mit den Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen; und • molekularbiologsiche Aspekte des unmittelbaren Kontaktes der Zellen mit den Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen.• the cellular response of cell cultures to direct contact with the gases, aerosols or their mixtures; and • molecular biology aspects of the direct contact of the cells with the gases, aerosols or mixtures thereof.
Beispiele für Untersuchungen molekularbiologischer Aspekte sind Rezeptorstudien, die Bestimmung von Mediatoren oder anderer Biomarker oder die Analyse von Signaltransduktionswegen.Examples of molecular biology studies include receptor studies, determination of mediators or other biomarkers, or analysis of signal transduction pathways.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft eine Vorrichtung basierend auf dem soeben beschriebenen Verfahren. Eine solche Vorrichtung dient der Untersuchung der biologischen Wirkung einer inhalierten Substanz, umfasstAnother object of the invention relates to a device based on the method just described. Such a device is used to study the biological effect of an inhaled substance comprises
• einen Luftbefeuchter;• a humidifier;
• einen Aerosol Generator für feste oder flüssige Substanzen, der befeuchtete Reinluft des Luftbefeuchters als Trägergas nutzt;• an aerosol generator for solid or liquid substances, which uses humidified clean air of the humidifier as carrier gas;
• einen Verteiler, der mit dem erzeugten Aerosol beschickt wird; und • ein oder mehrere Zellkultureinheiten, die mit dem Verteiler über ein oder mehrere• a distributor, which is fed with the generated aerosol; and • one or more cell culture units connected to the manifold via one or more
Probenahmepunkte in Verbindung stehen; und ist dadurch gekennzeichnet dass der erzeugte Aerosolstrom von einem Probenahmepunkt zur verbundenen Zellkultureinheit geführt und dort mit den kultivierten Zellen in unmittelbaren Kontakt gebracht wird. In einer besonderen Ausführungsform umfasst die beschriebene Vorrichtung zusätzlich Online Analysegeräte zur Messung von Aerosolparametern, die über Probenahmepunkte mit dem Verteiler verbunden sind und ebenso wie die Zellkultureinheiten mit Proben aus dem Verteiler beschickt werden.Sampling points; and is characterized in that the generated aerosol stream is passed from a sampling point to the connected cell culture unit where it is brought into direct contact with the cultured cells. In a particular embodiment, the device described additionally comprises on-line analyzers for measuring aerosol parameters, which are connected to the distributor via sampling points and, like the cell culture units, are supplied with samples from the distributor.
Als Probenahmevorrichtungen angeschlossen sein können beispielsweise Kühlfallen oder Aktivkohlefilter für gasförmige Bestandteile, Partikelfilter für Aerosolpartikel oder Impaktoren für definierte Partikelgrößen.For example, cold traps or activated carbon filters for gaseous components, particle filters for aerosol particles or impactors for defined particle sizes can be connected as sampling devices.
Als Online Analysegeräte angeschlossen sein können beispielsweise Vorrichtungen zur Bestimmung der Partikelkonzentration, Vorrichtungen zur Bestimmung der Partikel Größenverteilung oder Vorrichtungen zur Bestimmung der Konzentration bestimmter gasförmiger Bestandteile.For example, devices for determining the particle concentration, devices for determining the particle size distribution or devices for determining the concentration of certain gaseous constituents can be connected as online analysis devices.
Typische Bespiele von Aerosol Generatoren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden könne n sind unter der Bezeichnung Respimat® und Handihaler® bekannt. Eine geeignete Kultur- und Expositionseinheit sind die als CULTEXΘ-Module erhältlichen Vorrichtungen.Typical examples of aerosol generators which can be used in the context of the present invention are known under the names Respimat® and Handihaler®. A suitable culture and exposure unit are those available as CULTEX® modules.
Als vorteilhaft erweist sich eine Wäremkonditionierung der gesamten Vorrichtung um das Auftreten von Kondensationseffekten zu reduzieren bzw. zu minimieren. Besonders geeignet ist eine Konditionierung auf einen festen Temperaturwert zwischen 20 °C und 45 °C und bevorzugt zwischen 37°C und 42°C.It proves to be advantageous to heat-condition the entire device in order to reduce or minimize the occurrence of condensation effects. Particularly suitable is a conditioning to a fixed temperature value between 20 ° C and 45 ° C and preferably between 37 ° C and 42 ° C.
Die wesentlichen Verfahrensschritte bzw. Elemente der vorliegenden Erfindung werden in den beispielhaften Fließschemata der Figuren 1 und 6 näher erläutert. Sie zeigt den Aerosol-Expositionsaufbau. Der komplette Aufbau besteht aus mindestens zwei derartigen Aufbauten, die zur gleichzeitigen Exposition von A549-Kulturen auf mikroporösen Membranen gegen eine Kontrollsubstanz (aerosoliertes PBS) und eine Prüfsubstanz (z.B. aerosolisiertes tert.-Butylhydroperoxid) genutzt wird. Beispiele:The essential method steps or elements of the present invention are explained in greater detail in the exemplary flow diagrams of FIGS. 1 and 6. It shows the aerosol exposure structure. The complete construction consists of at least two such constructions, which are used for the simultaneous exposure of A549 cultures on microporous membranes to a control substance (aerosolized PBS) and a test substance (eg aerosolized tertiary butyl hydroperoxide). Examples:
Beispiel 1 : Vorrichtung für die Generierung und Exposition von Tröpfchen- Aerosolen im Zellkulturmaßstab Eine modulare Bauweise in paralleler Anordnung gestattet den gleichzeitigen Betrieb von mehreren Nebulizern. Damit ist die zeitgleiche, parallele Exposition von Zellen auf mikroporösen Membranen z.B. gegenüber einem Prüfaerosol und einem Kontrollaerosol (z.B. PBS als Träger bzw. Lösungsmittel der Prüfsubstanz) in einem Experiment möglich. Zur Herstellung des Tröpfchen-Aerosols aus Flüssigkeiten werden kommerziell erhältliche Nebulizer der Marke „Miniheart Low Flow Nebulizer" (Westmed Inc., Tucson, USA) verwendet. Mittels einer Perfusorpumpe werden die Testflüssigkeiten kontinuierlich in das Vorratsgefäß des Nebulizers transportiert und so konstante Füllstände im Nebulizer über den gesamten Expositionszeitraum gewährleistet. Die durch ein Wasserbad auf 37°C äußerlich permanent erwärmten Nebulizer werden mit einem Reinluft-Strom (Ca. 37°C , 2 l/min) betrieben. Die Probeentnahme der Aerosole für die Zellexpositionen erfolgt unmittelbar oberhalb des Austritts des Aerosols aus dem Nebulizer an zwei einander gegenüberliegenden Entnahmepunkten. Im weiteren Strömungsweg des Prüfaerosols liegt die Probenahme-Position für eine Online-Aerosolanalyse bevor das Prüfaerosol durch eine Kühlfalle und einen kombinierten Aktivkohle -/Partikelfilter geleitet wird. Bei Bedarf kann die parallel betriebene Position des Kontrollaerosols um eine derartige Reinigungseinheit und Online-Aerosolanalyse erweitert werden. Der gesamte Strömungsweg der Aerosole oberhalb der Nebulizer wird durch eine elektrische Wickelheizung auf Ca. 37°C konstant thermostatisiert.Example 1: Apparatus for the Generation and Exposure of Droplet Aerosols on a Cell Culture Scale A modular construction in parallel arrangement allows the simultaneous operation of several nebulizers. Thus, the simultaneous, parallel exposure of cells to microporous membranes is e.g. to a test aerosol and a control aerosol (e.g., PBS as the vehicle or solvent of the test substance) in an experiment. To produce the droplet aerosol from liquids, commercially available nebulizers of the "Miniheart Low Flow Nebulizer" brand (Westmed Inc., Tucson, USA) are used, which are continuously pumped into the nebulizer storage vessel by means of a perfusor pump for constant levels in the nebulizer 37 ° C, 2 l / min) The aerosols are sampled for cell exposures immediately above the outlet In the further flow path of the test aerosol is the sampling position for an online aerosol analysis before the test aerosol is passed through a cold trap and a combined activated carbon / particulate filter.If necessary, the parallel operated position de s Kontrollaerosols be extended by such a cleaning unit and online aerosol analysis. The entire flow path of the aerosols above the Nebulizer is heated by an electric winding heater to approx. 37 ° C constantly thermostated.
Beispiel 2: ZellkulturExample 2: cell culture
Aus einer kontinuierlich passagierten A549-Kultur (DSMZ, Braunschweig) werden im Verlauf des routinemäßigen Kultursplits Zellen geerntet und auf Membranen (BD Falcon) ausgesät. Nach einer 72h Anheftungs- und Wachstumsphase unter Standardkulturbedingungen werden die Zellen auf den Membranen mikroskopisch kontrolliert und mit frischem Medium versehen. 18 Stunden vor der eigentlichen Exposition werden die adhärent wachsenden Zellen aus der submersen Kultivierung in eine air/lifted Kulturführung verbracht. Die derart konditionierten Zellen werden für die Exposition gegen das Testaerosol oder das Kontrollaerosol bzw. als Inkubator- Kontrolle verwendet. Im Anschluss an den Expositionszeitraum werden die Zellen aufgearbeitet oder unter submersen Bedingungen im Inkubator nachkultiviert, um dann weiter analysiert zu werden.From a continuously passaged A549 culture (DSMZ, Braunschweig) cells are harvested during the routine culture split and seeded on membranes (BD Falcon). After a 72 h attachment and growth phase under standard culture conditions, the cells on the membranes are microscopically controlled and provided with fresh medium. Eighteen hours before the actual exposure, the adherently-growing cells become submerged in culture spent in an air / lifted cultural tour. The cells conditioned in this way are used for exposure to the test aerosol or the control aerosol or as incubator control. Following the exposure period, the cells are worked up or post-cultured under submerged conditions in the incubator for further analysis.
Beispiel 3: Analyse zellulärer WirkungenExample 3: Analysis of cellular effects
Direkt nach der Exposition werden die Membranen den Expositionseinrichtungen entnommen, mit frischem Medium versehen und zunächst der Analyse des Tetrazoliu msalz- Umsatzes mittels WST- 1 Assay zugeführt. WST-1 AssayImmediately after exposure, the membranes are removed from the exposure equipment, fitted with fresh medium, and first analyzed for tetrazolium-malt salt by WST-1 assay. WST-1 assay
WST-1 Farbstoff-Reagenz (Boehringer, Mannheim) wird zum Kulturmediumüberstand gegeben. Die Zellen werden unter zelltypspezifischen Bedingungen im Brutschrank für 30min reinkubiert. Aus dem Medium wird anschließend die Messung der Absorption im Mikrotiter-Platten Reader bei den Wellenlängen 450 nm/ 630 nm durchgeführt.WST-1 dye reagent (Boehringer, Mannheim) is added to the culture medium supernatant. The cells are reincubated under cell-type-specific conditions in the incubator for 30 min. The measurement of the absorption in the microtiter plate reader at the wavelengths 450 nm / 630 nm is then carried out from the medium.
Messung der LebendzellzahlMeasurement of the living cell count
Nach Entfernung des Mediums aus den Inserts wird eine Trypsin/EDTA-Lösung zugegeben und die Zellen bei 37°C für 5min im Brutschrank reinkubiert. Anschließend wird die Trypsinwirkung durch Zugabe von Trypsin-Inhibitor gestoppt und die Zellen werden vorsichtig suspendiert. Zur Bestimmung der Lebendzellzahl mittels eines elektronischen Zellanalysegerätes (CASY, Fa. Schärfe) wird ein Aliquot des Zelltrypsinats in einem schwachen Elektrolyt suspendiert und mit konstanter Strömungsgeschwindigkeit durch eine Kapillare definierter Geometrie gesaugt. Von jeder Zellsuspension wird eine Dreifachmessung durchgeführt.After removal of the medium from the inserts, a trypsin / EDTA solution is added and the cells are reincubated at 37 ° C for 5 min in the incubator. Subsequently, the trypsin effect is stopped by addition of trypsin inhibitor and the cells are carefully suspended. To determine the viable cell count by means of an electronic cell analyzer (CASY, Fa. Sharp), an aliquot of cell trypsinate is suspended in a weak electrolyte and sucked at a constant flow rate through a capillary of defined geometry. Each cell suspension is subjected to a triple measurement.
Beispiel 4: Exposition Experimentelle GruppenExample 4: Exposure Experimental groups
Inkubator-Kontrollen werden für den Zeitraum der Exposition unter air-liquid Kulturbedingungen im Brutschrank inkubiert.Incubator controls are incubated in the incubator for the period of exposure under air-liquid culture conditions.
Als Expositionskontrollen werden Kulturen eingesetzt, die parallel und zeitgleich zur Aerosolexposition unter denselben Bedingungen exponiert werden wie die Zellen in der Aerosolexposition. Der einzige Unterschied zur Aerosolexposition besteht darin, dass diese Exposition ausschließlich gegen aerosolisiertes PBS stattfindet. In der Aerosolexposition werden die Kulturen über einen Zeitraum von 30 Minuten gegen verschiedene Konzentrationen eines frisch generierten Tröpfchen-Aerosols einer Modellsubstanz exponiert.Exposure controls are cultures that are exposed simultaneously and simultaneously to the aerosol exposure under the same conditions as the cells in aerosol exposure. The only difference with aerosol exposure is that this exposure occurs exclusively against aerosolized PBS. In aerosol exposure, the cultures are exposed for 30 minutes to various concentrations of a freshly generated droplet aerosol of a model substance.
Expositionsdosenexposure doses
Es werden verschiedene Konzentrationen einer Modellsubstanz verwendet. Die Zellen werden den hieraus generierten Aerosolen bei einem Expositionsfluss von 5ml/min/cm2 für jeweils 30min ausgesetzt. Zur Ermittlung der tatsächlichen Expositionsdosis wird für jede Testsubstanz in zellfreien Experimenten die Deposition des Aerosols mittels Na-Fluorescein (10 μg/ml in der Nebulizer-Füllung) auf den mikroporösen Membranen quantifiziert. Unter den Bedingungen der Zellexposition werden diese mit Expositionsflüssen von 5 ml/min über Zeiträume von 10 bis 30 Minuten überströmt. Danach werden die Membranen entnommen, aus den Halterungen ausgeschnitten, mit Reinstwasser extrahiert und die Fluoreszenz des Extraktes bei den Wellenlängen 435 nm (ex.) 510 nm (em.) gegen Vergleichslösungen von Na-Fluorescein in Reinstwasser quantifiziert. Durch das Ausschneiden der Membranen werden ausschließlich die Wachstumsflächen in der Messung berücksichtigt, auf der sich im weiteren die adhärenten Zellkulturen befinden werden.Various concentrations of a model substance are used. The cells are exposed to the generated aerosols at an exposure flux of 5 ml / min / cm 2 for 30 min each. To determine the actual exposure dose, for each test substance in cell-free experiments, the deposition of the aerosol is quantified using Na fluorescein (10 μg / ml in the Nebulizer filling) on the microporous membranes. Under conditions of cell exposure, they are overflowed with exposure fluxes of 5 ml / min for periods of 10 to 30 minutes. Thereafter, the membranes are removed, cut out of the holders, extracted with ultrapure water and quantified the fluorescence of the extract at the wavelengths 435 nm (ex.) 510 nm (em.) Against reference solutions of Na-fluorescein in ultrapure water. By cutting out the membranes, only the growth areas are included in the measurement, on which the adherent cell cultures will be located.
Die Volumina an PBS z.B., die während der Expositionszeit deponiert werden, können mittels Anfärbung der Nebulizer-Füllung mit Natrium -Fluoreszin und Nachweis in zellfreien Experimenten derart bestimmt werden. Das maximal deponierte Volumen liegt innerhalb von 30 Minuten bei 1 μl/cm2.For example, the volumes of PBS deposited during the exposure time can be determined by staining the Nebulizer filling with sodium fluorescein and detecting in cell-free experiments. The maximum deposited volume is within 30 minutes at 1 ul / cm 2 .
Expositionssituationexposure situation
Zusätzlich zur Modulation üblicher Expositionsparameter wie z.B. Zeit, Konzentration oder Temperatur kann bei der Verwendung mikroporöser Membranen auch der Mediumfüllstand („Mediumlevel") unterhalb der Membrane eine Einflussgröße auf die Expositionssituation der apikal adhärent kultivierten Zellen darstellen. Daher werden zellbewachsene Membranen für die Dauer der Exposition in Abhängigkeit vom Mediumlevel in bis zu drei unterschiedlichen Variationen gegen die aerosolisierten Modellsubstanzen bzw. die korrespondierende PBS-Kontrolle exponiert: (1 ) unter den Bedingungen eines „hohen" Mediumlevels, und eines daraus resultierenden maximalen hydrostatischen Druckes auf die mikroporöse Membran (2) einem minimalen „Kontakt" zwische n Membran und basal herangeführtem Medium und (3) keinem Kontakt von Membrane und Medium, einem sog. "niedrigen" Mediumlevel (Abbildung 2-2).In addition to the modulation of common exposure parameters such as time, concentration or temperature, the medium level ("medium level") below the membrane can also be an influence on the exposure situation of apically adherently cultivated cells when using microporous membranes. Therefore, cell-grown membranes are exposed to the aerosolized model substances or the corresponding PBS control for the duration of exposure as a function of the medium level in up to three different variations: (1) under the conditions of a "high" medium level, and a resulting maximum hydrostatic level Pressure on the microporous membrane (2) minimal "contact" between the membrane and the basal medium, and (3) no membrane and medium contact, a so-called "low" medium level (Figure 2-2).
Expositionskontrollenexposure controls
Die Expositionskontrollen werden gleichzeitig zu jeder Aerosolexposition im Parallelaufbau verwendet und stellen die Bezugsgröße für die Ergebnisse der Aerosolexposition dar, da sie - mit Ausnahme der Wirkung der Testsubstanz - allen Einflüssen der Exposition unterliegen. Die aus den jeweiligen Kontrollsituationen stammenden zellbewachsenenExposure controls are used concurrently with each aerosol exposure in parallel construction and are the reference for the aerosol exposure results as they are subject to all exposure factors, except for the effect of the test substance. The cell-grown originating from the respective control situations
Membranen werden parallel mit den aus den Aerosolexpositionen stammenden Membranen aufgearbeitet. Im Folgenden sind getrennt nach Endpunkten die Ergebnisse für die Inkubatorkontrollen und die Expositionskontrollen in Abhängigkeit vom jeweiligen Expositionstag dargestellt. Die Ergebnisse des Tetrazoliumsalz-Umsatzes (WST-1 ) nach Exposition der A549- Zellen gegen ein PBS Tröpfchen-Aerosol als Kontrollsituation zu den durchgeführten Aerosolexpositionen mit Modellsubstanzen sind in Figur 2 für zwei Expositionstage (Di und Mi) in Abhängigkeit von der Expositionssituation (Mittelwerte mit Standardabweichung für Medium hoch, Medium Kontakt und Medium tief) aufgetragen. Die Daten sind auf die jeweils expositionstäglich aktuell mitgeführten Inkubatorkontrollen bezogen.Membranes are processed in parallel with the membranes derived from the aerosol exposures. In the following, the results for the incubator controls and the exposure controls depending on the respective exposure day are shown separately after endpoints. The results of the tetrazolium salt conversion (WST-1) after exposure of the A549 cells to a PBS droplet aerosol as a control situation for the aerosol exposures carried out with model substances are shown in FIG. 2 for two exposure days (Di and Mi) as a function of the exposure situation (mean values with standard deviation for medium high, medium contact and medium deep). The data are related to the respective incubator controls currently carried out during each exposure.
Die Werte liegen im Schwankungsbereich der Inkubator-Kontrollen und dokumentieren, dass die Expositionssituation auf den Tetrazoliumsalz- Umsatz der Zellen keinen Einfluss hat. Die Ergebnisse der Lebendzellzahlbestimmung, die als weiterer Vitalitätsparameter im Anschluss an die Exposition erfasst wurde, sind in Figur 3 zusammengestellt. Auch hier decken sich die Werte an beiden Expositionstagen im Mittel der Expositionskontrollen in allen Expositionssituationen mit den Inkubatorkontrollenwerten.The values are in the fluctuation range of the incubator controls and document that the exposure situation has no influence on the tetrazolium salt conversion of the cells. The results of the living cell count determination, which was recorded as a further vitality parameter following the exposure, are compiled in FIG. Here, too, the values on both days of exposure coincide on average Exposure controls in all exposure situations with incubator control values.
In Bezug auf die untersuchten Vitalitätsparameter können damit für die A549-Zellen in den beschriebenen Expositionskontrollsituationen auch unter Variation der Mediumlevel keinerlei Effekte beobachtet werden. Die Vitalitätsmessungen an kontrollexponierten Zellen führen sogar zu annähernd deckungsgleichen Ergebnissen wie sie für Zellen unter air/liquid Bedingungen im Inkubator ermittelt wurden.With regard to the vitality parameters examined, no effects whatsoever can be observed for the A549 cells in the described exposure control situations even with variation of the medium level. The vitality measurements on control-exposed cells even lead to approximately congruent results as determined for cells under air / liquid conditions in the incubator.
Expositionenexposures
Zur Erstellung von Dosis-Wirkungsbeziehungen wird als Beispiel tert. Butyl-hydroper- oxid (tBuOOH) in verschiedenen Konzentrationen von 0.02M bis 1 M im Aufbau vernebelt und dessen Wirkung auf die Zellen über die Bestimmung der metabolischen Aktivität (WST-1 Assay) und Lebendzellzahl untersucht. Dabei wird der Mediumlevel „Kontakt" verwendet.To create dose-response relationships is tert as an example. Butyl hydroperoxide (tBuOOH) in various concentrations of 0.02M to 1 M in the construction nebulized and its effect on the cells by determining the metabolic activity (WST-1 assay) and living cell count investigated. The medium level "contact" is used.
Beispiel 5: AuswertungExample 5: Evaluation
In Figur 4 sind die Ergebnisse dieser Versuchsserie dargestellt. Dabei sind die Ergebnisse aus der Untersuchung des Tetrazoliumsalz- Umsatzes bei Mediiumlevel „Kontakt" gegen die per Depositionsuntersuchung ermittelte Dosis dargestellt. Für die Regression berücksichtigte Messpunkte sind mit „x" gekennzeichnet, nicht berücksichtigte mit „o". Die eingezeichneten Kurven entsprechen der Regressionsgeraden mit den dazugehörigen Konfidenzgrenzen (95%). Es wird eine Dosis-Wirkungsbeziehung berechnet, die innerhalb der untersuchten Dosierungen den kompletten Vitalitätsbereich von 100 % bis 0 % im Vergleich zur PBS- exponierten Kontrolle beschreibt.FIG. 4 shows the results of this series of experiments. The results from the study of the tetrazolium salt conversion at the median level "contact" against the dose determined by the deposition study are shown: Measurement points taken into account for the regression are marked with "x", not taken into account with "o." The plotted curves correspond to the regression line with The corresponding confidence limits (95%) A dose-response relationship is calculated which describes the complete vitality range of 100% to 0% within the investigated doses compared to the PBS-exposed control.
Die entsprechende Darstellung der Ergebnisse zur Ermittlung der Zellzahl ist in Figur 5 aufgetragen. Aus diesen Dosis-Wirkungskurven können Kennwerte z.B. ED50 Werte (Wert, bei dem das gemessene Signal eines Endpunktes, z.B. metabolische Aktivität im WST-1 Assay, um 50% gegenüber der Kontrollkultur erniedrigt ist) berechnet werden, die einen unmittelbaren Vergleich von Wirkungen unterschiedlicher Stoffe erlauben. Für tBuOOH beträgt dieser Wert bezogen auf die Messung der metabolischen Aktivität (WST-1 Assay) unter den genannten Bedingungen 0.05 μMole/cm2 beziehungsweise 0.08 μMole/cm2 für die Zellzahl. The corresponding representation of the results for determining the cell number is plotted in FIG. From these dose-response curves, characteristic values, for example ED 50 values (value at which the measured signal of an end point, eg metabolic activity in the WST-1 assay, is reduced by 50% compared to the control culture) can be calculated allow a direct comparison of effects of different substances. For tBuOOH, this value, based on the measurement of the metabolic activity (WST-1 assay) under the conditions mentioned, is 0.05 μmol / cm 2 or 0.08 μmol / cm 2 for the cell number.

Claims

Ansprüche: Claims:
1 . In vitro Verfahren zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer Prüfsubstanz, dadurch gekennzeichnet dass (a) ein Aerosol Generator und gegebenenfalls ein Befeuchter mit Reinluft versorgt werden,1 . In vitro method for investigating the biological effect of a test substance, characterized in that (a) an aerosol generator and optionally a humidifier are supplied with clean air,
(b) die Prüfsubstanz durch den Aerosol Generator in einen fein verteilten Partikelstrom überführt wird,(b) the test substance is transferred by the aerosol generator into a finely divided particle stream,
(c) die Ströme aus dem Aerosol Generator und gegebenenfalls dem Befeuchter in geeigneter Weise zu einem Aerosol durchmischt und einem Verteiler zugeleitet werden, und(c) the streams from the aerosol generator and optionally the humidifier are suitably mixed into an aerosol and fed to a distributor, and
(d) aus dem Verteiler definierte Volumenströme des Aerosols abgezogen und in unmittelbaren Kontakt mit prokaryotischen oder eukaryotischen In vitro- Kulturen in einer Kultur/Expositionsvorrichtung gebracht werden.(d) withdrawn from the manifold volume flows of the aerosol and brought into direct contact with prokaryotic or eukaryotic in vitro cultures in a culture / exposure device.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkulturen in einem CULTEX® Modul kultiviert und mit dem Aerosol in Kontakt gebracht werden.2. The method according to claim 1, characterized in that the cell cultures are cultured in a CULTEX® module and brought into contact with the aerosol.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass durch den Aerosol Generator definierte Aerosolkonzentrationen der Substanz erzeugt werden können.3. The method according to claim 1, characterized in that defined by the aerosol generator aerosol concentrations of the substance can be generated.
4. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet dass die durch den Aerosol Generator fein verteilten Substanzen fest oder flüssig sind.4. The method according to claim 1, characterized in that the finely distributed by the aerosol generator substances are solid or liquid.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet dass als Aerosol Generator ein Respimat® oder Handihaler® verwendet wird.5. The method according to claim 4, characterized in that as aerosol generator, a Respimat® or Handihaler® is used.
6. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass der Volumenstrom für die Probennahme variiert werden kann. 6. The method according to claim 1, characterized in that the volume flow for the sampling can be varied.
7. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet dass die Untersuchungen gerichtet sind auf7. The method according to claim 1, characterized in that the investigations are directed to
• die Wirksamkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial;The effectiveness of active substances or combinations of active substances of particulate aerosols, depending on their particle size and optionally the carrier material used;
• die Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen oder Wirkstoffkombinationen partikulärer Aerosole in Abhängigkeit von ihrer Partikelgröße und gegebenenfalls dem verwendeten Trägermaterial;The bioavailability of active substances or combinations of active substances of particulate aerosols as a function of their particle size and optionally the carrier material used;
• die zyto- und genotoxische Wirkung der Gase, Aerosole oder Mischungen auf die Zellkulturen;The cytotoxic and genotoxic effects of gases, aerosols or mixtures on cell cultures;
• das inflammatorisches Potential der Gase, Aerosole oder Mischungen für die Zellkulturen;The inflammatory potential of gases, aerosols or mixtures for cell cultures;
• das zelluläre Reaktionsmuster der Zellkulturen nach dem unmittelbaren Kontakt mit den Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen; • molekularbiologsiche Aspekte des unmittelbaren Kontaktes der Zellen mit denThe cellular reaction pattern of the cell cultures after direct contact with the gases, aerosols or their mixtures; • molecular biology aspects of the direct contact of the cells with the
Gasen, Aerosolen oder deren Mischungen.Gases, aerosols or mixtures thereof.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet dass die molekularbiologischen Aspekte durch Rezeptorstudien, die Bestimmung von Mediatoren oder anderer Biomarker oder durch Analyse von8. The method according to claim 7, characterized in that the molecular biological aspects by receptor studies, the determination of mediators or other biomarkers or by analysis of
Signaltransduktionswegen untersucht werden.Signal transduction pathways are investigated.
9. Anordnung zur Untersuchung der biologischen Wirkung einer inhalierten Substanz umfassend (a) einen Luftbefeuchter;9. An arrangement for examining the biological effect of an inhaled substance comprising (a) a humidifier;
(b) einen Aerosol Generator für feste oder flüssige Substanzen, der befeuchtete Reinluft des Luftbefeuchters als Trägergas nutzt;(b) an aerosol generator for solid or liquid substances which uses humidified clean air of the humidifier as a carrier gas;
(c) einen Verteiler, der mit dem erzeugten Aerosol beschickt wird; und(c) a manifold which is charged with the generated aerosol; and
(d) ein oder mehrere Zellkultureinheiten, die mit dem Verteiler über einen oder mehrere Probenahmepunkte in Verbindung stehen; dadurch gekennzeichnet dass der erzeugte Aerosolstrom von einem Probenahmepunkt zur verbundenen Zellkultureinheit geführt und dort mit den kultivierten Zellen in unmittelbaren Kontakt gebracht wird.(d) one or more cell culture units associated with the manifold via one or more sampling points; characterized in that the generated aerosol stream is passed from a sampling point to the connected cell culture unit where it is brought into direct contact with the cultured cells.
10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet dass zusätzlich ein oder mehrere Online Analysegeräte zur Messung von Aerosolparametern über Probenahmepunkte mit dem Verteiler verbunden sind und ebenso wie die Zellkultureinheiten mit Proben aus dem Verteiler beschickt werden10. Arrangement according to claim 9, characterized in that in addition one or more online analyzers for measuring aerosol parameters are connected via sampling points to the distributor and as well as the cell culture units are loaded with samples from the distributor
1 1 . Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet dass zur Vermeidung von Kondensationseffekten eine Wärmekonditionierung aller Komponenten verwirklicht ist. 1 1. Arrangement according to claim 9, characterized in that in order to avoid condensation effects, a thermal conditioning of all components is realized.
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