WO2007083071A2 - Procede pour la preparation d'un precurseur d'un compose aromatique, par biosynthese - Google Patents

Procede pour la preparation d'un precurseur d'un compose aromatique, par biosynthese Download PDF

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WO2007083071A2
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Gilles Feron
Caroline Blin
Geneviève MAUVAIS
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones

Definitions

  • the present invention relates to the field of the synthesis of aromatic compounds enzymatically or biologically.
  • the invention relates more particularly to a process for obtaining a precursor of aromatic compounds, in particular a precursor of raspberry ketone, by enzymatic bioconversion.
  • each natural flavor is made up of several hundred volatile compounds.
  • a volatile compound or a small number of volatile compounds, alone confers the characteristic olfactory note of said flavor.
  • Raspberry ketone is an aromatic molecule that is highly sought after in the agri-food industry. In this area, raspberry ketone is not only used as a raspberry aroma. Raspberry ketone is also used in various aromatic mixtures, including aromatic mixtures of peach, pineapple, strawberry, kiwi or even cherry. Raspberry ketone is also used for its ability to provide a fruity note in certain aromatic mixtures in perfumery, cosmetics and pharmacy. Raspberry fruit is the only source for direct extraction of raspberry ketone. However, the ketone raspberry is present at very low concentrations in the fruit, of the order of 0.1 mg / l of raspberry juice. Consequently, the cost price of raspberry ketone obtained by direct extraction from the fruit is not compatible with the economic constraints related to the manufacture of industrial products, in particular food and cosmetics, which must be cost-effective. moderate when they are intended for wide public dissemination.
  • a process for the chemical synthesis of raspberry ketone has also been described in two steps, respectively (i) a step of synthesis of para-hydroxyphenyl-3-buten-2-one by condensation of parahydroxybenzaldehyde with ketone, followed (ii) by a step of catalytic hydrogenation of parahydroxyphenyl-3-buten-2-one to obtain parahydroxyphenyl-butan-2-one or raspberry ketone.
  • the raspberry ketone obtained by such a process is classified as a "nature-identical" flavor, since it is chemically identical to natural raspberry ketone but has been obtained by chemical synthesis.
  • the aromatic precursor compounds of the phenyl-3-buten-2-one type substituted in the para position can be obtained by means of a step of condensation, by enzymatic aldolization, of acetone with a benzaldehyde substituted in the para position.
  • the aldolisation step of acetone with a benzaldehyde compound substituted in the para position by a hydroxyl or alkoxy group in order to produce aromatic precursors of the phenyl-3-butene type.
  • 2-one substituted in the para position by a hydroxy or alkoxy group could be carried out by a deoxyribose-phosphate aldolase (DERA) catalysed enzymatic bioconversion step.
  • DUA deoxyribose-phosphate aldolase
  • the subject of the present invention is a process for the biosynthetic preparation of the compound of formula (I) below:
  • R 1 is hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, said process comprising the steps of: a) adding:
  • R1 is hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and (ii) acetone in a reaction medium comprising 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase; and b) recovering the compound of formula (I) from the medium obtained at the end of step a).
  • deoxyribose 5-phosphate aldolase also called DERA
  • DERA deoxyribose 5-phosphate aldolase
  • 2-Deoxyribose-5-phosphate aldolase is a class I aldolase that is known to catalyze the condensation of acetaldehyde and D-glyceraldehyde-3-phosphate to produce 2-deoxyribose-5-phosphate.
  • DERA is classified according to international nomenclature in the class of aldolases EC 4.1.2.4.
  • the specific catalytic activity of DERA can easily be verified by those skilled in the art, for example using the technique described by WONG et al. (2003, Bioorganic and Medicinal Chemistry, Vol 11: 43-52, Section “Experimental”, subsection “DERA addition (aldol) assay")
  • the group R 1 represents hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having 1, 2, 3 or 4 carbon atoms.
  • the compound of formula (II) is such that R 1 represents a hydrogen atom.
  • the compound of formula (II) is a para-hydroxybenzaldehyde compound which makes it possible, by means of the process of the invention, to prepare the compound of formula (I) consisting of parahydroxyphenyl-3-buten-2 -one, also referred to as 4-OH-benzylidene acetone, which is a precursor of raspberry ketone.
  • the compound of formula (II) is such that the group R 1 represents a group -CH 3 .
  • the compound of formula (II) is paramethoxybenzaldehyde, which is also called anisaldehyde.
  • the compound of formula (I) obtained according to the method of the invention is paramethoxyphenyl-3-buten-2-one, which is also called anisylidene acetone, which may also be a precursor compound of raspberry ketone.
  • parahydroxybenzaldehyde can be obtained by extraction from a variety of biological sources.
  • parahydroxybenzaldehyde is produced by organisms such as certain Coleoptera such as Agabus melanarius, heteropterans such as Llyocoris cimicoides and Notonecta, and Lepidoptera such as Eldana saccharina.
  • parahydroxybenzaldehyde can be released, for example by simply heating, in the presence of emulsin, an aqueous suspension of hurrin, which is an amygdalin-like glucoside, the latter being present in particular in young shoots of sorghum (Sorghum).
  • Natural parahydroxybenzaldehyde can also be obtained by biodegradation of picteide, a stylbene present in the bark of spruce, as described by Shiotsu et al. (1989, Mukuzai, 35: 826).
  • Parahydroxybenzaldehyde can also be obtained by chemical synthesis, in particular according to the techniques described by Freudenberg and Gehrke (1951, Chem Ber, vol.84: 443-450) or Schoutissen (1935, Recl, Trav Chim, The Netherlands). , Vol. 54: 97-99).
  • parahydroxybenzaldehyde is a compound that can be commonly found commercially.
  • a compound of formula (II) such as paramethoxybenzaldehyde or anisaldehyde can be obtained from natural sources such as oil extracted from star anise.
  • Anisaldehyde is also a chemical compound that can be commonly found in commerce.
  • the acetone which is used in the implementation of the process of the invention can be obtained from natural sources, such as plants and trees. Acetone is also produced by various microorganisms. Acetone can be obtained by fermentation of glucose by cultures of bacterial cells of Clostridium acetobutylicum. Acetone is also a compound that is commonly found in commerce. Thus, thanks to the process of the invention, it is now possible to obtain a natural precursor of raspberry ketone. In addition, when this natural raspberry ketone precursor is subsequently converted to raspberry ketone microbiologically, the end product is then a raspberry ketone which consists of a natural flavor.
  • the above process is characterized in that in step a), a quantity by weight of acetone in excess, based on the weight of compound (II), is added to the reaction medium.
  • a quantity by weight of acetone in excess is added to step a).
  • at least two times the weight (P) of acetone is added to step a).
  • at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 are added to step a).
  • 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 or 32 times the weight (P) of acetone By way of illustration, in the examples a weight (P) of 0.5 g / l of compound of formula (II) is used for 16 g / l of acetone, ie 32 times the weight (P).
  • step b) comprises the following steps: b1) performing at least one cycle of freezing and thawing of the medium obtained at the end of step a); b2) recovering the compound of formula (I) from the thawed medium obtained at the end of step b1).
  • the applicant believes that the cycle (s) of freezing and thawing lead to a change in the mobility of the solvent, which may be water, at the catalytic site of the enzyme. This change in the mobility of the solvent would lead to a change in the solubility and the accumulation of reaction intermediates, such as to promote the completion of the aldolization reaction of the compound of formula (II), and the final dehydration step leading to the production of the compound of formula (I).
  • reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase having at least 30% amino acid identity with the SEQ ID sequence polypeptide.
  • SEQ ID NO : 1 sequence consists of the amino acid sequence of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase expressed by Escherichia coli.
  • an identity of at least 30% in amino acids, on a segment of at least 100 consecutive amino acids, between two polypeptides means a strong structural and functional relationship between these two polypeptides.
  • Bacillus subtilis 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase has the amino acid sequence SEQ ID No. 2 according to the invention.
  • reaction medium comprising a Bacillus cereus 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase having an amino acid identity of 38% with the sequence SEQ ID NO: 1
  • No. 1 was able to catalyze the aldol reaction of the compound of formula (II) to produce the final compound of formula (I).
  • Bacillus cereus 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase has the amino acid sequence SEQ ID NO: 3 according to the invention.
  • amino acid sequence may be used to denote either a polypeptide or a protein.
  • amino acid sequence encompasses the protein material itself and is therefore not restricted to information concerning its sequence.
  • a first polypeptide having at least 30% amino acid identity with a second reference polypeptide will have at least 30%, preferably at least 31%, 32%, 33%, 34%,
  • Nucleotide sequence can be used to denote either a polynucleotide or a nucleic acid.
  • nucleotide sequence includes the genetic material itself and is therefore not restricted to information about its sequence.
  • nucleic acid include RNA, DNA or cDNA sequences, or hybrid RNA / DNA sequences of more than one nucleotide, regardless of in the single-stranded form or in the form of duplex.
  • nucleotide refers to natural nucleotides (A, T, G, C and U).
  • a first polynucleotide is considered to be "complementary" to a second polynucleotide when each base of the first nucleotide is base-paired.
  • complementary to the second polynucleotide whose orientation is reversed.
  • the complementary "bases” are A and T (or A and U), and C and G.
  • a first nucleic acid having at least 30% identity with a second reference nucleic acid will have at least 30%, preferably at least 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52% 53% 54% 55% 56% 57% 58% 59% 60% 61% 62% 63% 64% 65% 66% 67% 68% 69 % 70% 71% 72% 73% 74% 75% 76% 77% 78% 79% 80% 81% 82% 83% 84% 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97.5%, 98%, 98.3% 98, 6%, 99%, or at least 99.5% nucleotide identity with said second reference nucleic acid.
  • the "percent identity" between two amino acid sequences or between two nucleic acid sequences, within the meaning of the present invention, is determined by comparing the two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the amino acid sequence or of the nucleotide sequence in the comparison window can thus comprise additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment between the two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of positions at which an identical amino acid, or identical nucleotide base, is observed for the two sequences compared, and then dividing the number of positions at which there is identity between the two amino acids. , or between the two nucleobases, by the total number of positions in the comparison window, and then multiplying the result by one hundred to obtain the percentage amino acid or nucleotide identity of the two sequences between them.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be performed in a computer manner using known algorithms.
  • the percentage of sequence identity is determined using the BLAST software, version 2.0, which implements the BLAST algorithm (for "Basic Local Alignment Search Tool"), as defined by Karlin and Altshul (Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul (1990), Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence by using general scoring schemes, Proc Natl Acad Sci USA 87: 2264-68, Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul (1993), Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences, Proc Natl Acad Sci USA 90: 5873-7).
  • BLAST algorithm for "Basic Local Alignment Search Tool”
  • the BLASTN software is preferably used, based on the algorithm defined by Altschul et al. (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Zhang Jinghui, Zheng Zhang, Miller Webb, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs ", Nucleic Acids Res 25: 3389-3402), using the default settings.
  • BLASTP software To determine the percentage of amino acid identity between two polypeptides, use is preferably made of the BLASTP software, based on the algorithm defined by Altschul et al. (Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugene W. Myers, and David J. Lipman (1990), Basic Local Alignment Search Tool, J. Mol Biol 215: 403-10), using the parameters by default. To determine the percentage of amino acid identity between two polypeptides, use is preferably made of the BLASTP software, version 2.2.10, the principles of which are described by Tatusova et al.
  • step a) of the above process can be carried out using a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase having at least 30% amino acid identity with the sequence SEQ ID No. 1 of E. coli and encoded by a nucleic acid derived from (i) a prokaryotic organism, (ii) a eukaryotic organism, excluding filamentous fungi.
  • step a) of the above process may be carried out using a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase from a prokaryotic organism of a species selected from Escherichia coli, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces , Corynebacterium and Shewanella.
  • step a) of the above process can be carried out using a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase encoded by a nucleic acid from a prokaryotic organism selected from Escherichia coli K12, Escherichia coli CFT073, Shigella flexneri, Salmonella enterica subsp.
  • a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase encoded by a nucleic acid from a prokaryotic organism selected from Escherichia coli K12, Escherichia coli CFT073, Shigella flexneri, Salmonella enterica subsp.
  • TM 1040 Rhodobacter sphaeroides
  • Bacteroides thetaiotaomicron Francisella tularensis
  • Bacteroides fragilis Silicibacter pomeroyi, Burkholderia fungorum, Jannaschia sp.
  • CCS 1 Porphyromonas gingivalis, Legionella pneumophila, Treponema denticola, Bacillus cereus, Geobacillus kaustophilus, Bacillus halodurans, Solibacter usitatus, Streptococcus suis, Bacillus licheniformis, Listeria monocytogenes, Deinococcus geothermalis, Chloroflexus aurantiacus, Rubrobacter xylanophilus, Desulfitobacterium hafniense, Arthrobacter sp.
  • the reaction medium comprises a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase encoded by Bacilus subtilis, preferably 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase of sequence SEQ ID No. 2 .
  • the reaction medium comprises a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase encoded by Bacilus cereus, preferably the 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase sequence SEQ ID N 0 3.
  • step a) of the above process can also be carried out using a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase encoded by a nucleic acid from a eukaryotic organism, for example a eukaryotic organism selected from Homo sapiens, Gallus gallus, Canis familiaris, Mus musculus, Caenorhabditis elegans, Anopheles gambiae, Danio rerio, Xenopus tropicalis, Plasmodium chabaudi, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Apis mellifera, Drosophila melanogaster, Entamoeba histolytica, Aspergillus fumigatus, Strongylocentrotus purpuratus, and Aspergillus nidulans.
  • a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase encoded by a nucleic acid from a
  • a "reaction medium" comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase includes both (i) a reaction medium consisting of a culture of prokaryotic cells or eukaryotic cells producing a 2-deoxyribose-5 -phosphate aldolase, and (ii) a reaction medium consisting of an acellular composition comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase.
  • the cells are chosen from the prokaryotic or eukaryotic cells described above, which naturally produce a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase having at least 30% d amino acid identity with 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase of E. coli of sequence SEQ ID N 0 1.
  • the cells are chosen from recombinant cells into which has been inserted a nucleic acid coding for a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase having at least 30% identity in amino acids with 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase E. coli sequence SEQ ID N 0 1.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid encoding a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase as defined above with a view to producing a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase for its implementation for the preparation of the reaction medium used in the process above.
  • nucleotide sequences of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolases whose references are specified in Table 1, one skilled in the art is capable of detecting, isolating, cloning and characterizing any nucleic acid encoding a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase, for example by synthesizing specific nucleotide probes or primers.
  • nucleotide probes or primers one skilled in the art can refer to any one of the many conventional techniques known in the state of the art.
  • the nucleic acid encoding a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase consists of the nucleic acid encoding the amino acid sequence polypeptide SEQ ID N 0 1, referenced as No. P0A6L0 in the base of NCBI data or in the SWISSPROT database.
  • the nucleic acid encoding a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase consists of the nucleic acid encoding the amino acid sequence polypeptide SEQ ID N 0 2, referenced under the number NP-391 821 in the NCBI database or in the SWISSPROT database.
  • the nucleic acid encoding a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase consists of the nucleic acid encoding the polypeptide of amino acid sequence SEQ ID N 0 3 under the reference No. NP-978291 in the NCBI database or in the SWISSPROT database.
  • the invention also relates to a process for the production of one of the 2-deoxyribose-5-phosphate aldolases as defined above, said method comprising the steps of: i) inserting a nucleic acid encoding said polypeptide into an appropriate vector; ii) culturing, in a suitable culture medium, a host cell previously transformed or transfected with the recombinant vector of step a); iii) recovering the conditioned culture medium or lysing the host cell, for example by sonication, by osmotic shock, or with the aid of a French press; iv) separating and purifying from said culture medium or from the cell lysates obtained in step c), said polypeptide; v) where appropriate, characterizing the recombinant polypeptide produced.
  • a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase produced by non-recombinant cells or by recombinant cells into which the corresponding nucleic acid has been inserted, can be purified by passage through an appropriate series of chromatography columns. according to the methods known to those skilled in the art, for example an immunoaffinity chromatography column on which the antibodies directed against this 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase or against a fragment thereof have been immobilized beforehand.
  • a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention may also be prepared by conventional techniques of chemical synthesis indifferently in homogeneous solution or solid phase.
  • a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase as defined according to the invention may be prepared by the homogeneous solution synthesis technique described by Houben Weyl (Houben Weyl, 1974, in Meuthode der Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volume 15-1 and 15-
  • a recombinant vector comprising a nucleic acid coding for a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase as defined above is advantageously used.
  • vector will be understood to mean a circular or linear DNA or RNA molecule which is indifferently in the form of a single-stranded or double-stranded form.
  • Expression vectors comprising, in addition to a nucleic acid encoding a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention, are preferred regulatory sequences making it possible to direct its transcription and / or its translation.
  • a recombinant vector according to the invention will comprise in particular the following elements: (1) regulatory elements of the expression of the nucleic acid to be inserted, such as promoters and enhancers;
  • the recombinant vectors according to the invention may include one or more origins of replication in cell hosts in which their expression is sought, one or more selection markers.
  • the bacterial promoters may be the LacI, LacZ promoters, the T3 or T7 bacteriophage RNA polymerase promoters, the PR promoters, or the phage lambda PL promoters.
  • Promoters for eukaryotic cells will include the HSV thymidine kinase promoter or the mouse L-metallothionein promoter.
  • Particularly suitable vectors for an expression of the nucleic acids according to the invention in bacteria are, for example, the pQE70, pQE60 or pQE-9 vectors (marketed by QIAGEN), the pBluescript, Page script, pNH8A vectors; pNH16a, pNH18a, pNH46A (sold by the company Stratagene), the vectors pKK223-3, pKK233-3, pDR540 and pRIT5 (sold by the company Pharmacia).
  • Particularly suitable vectors for expression in eukaryotic cells are, for example, the pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 and pSG vectors (marketed by Stratagene), the pSVK3, pBPV, pMSG and pSVL vectors (marketed by Pharmacia).
  • a first vector preferably implemented in the context of the invention is the pcDNA3 vector marketed by Invitrogen.
  • a second particularly preferred vector is the vector pBluescript SK (-), marketed by the company Stratagene.
  • the preferred bacterial vectors according to the invention are for example the pBR322 vectors (ATCC37017) or also vectors such as pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Sweden), and pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WI, USA).
  • adenoviral vectors such as human adenovirus type 2 or 5.
  • reaction medium of the second type (ii) consists of an acellular composition comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention or a liquid composition comprising an enzymatic extract obtained from a prokaryotic or eukaryotic cell culture produces a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase.
  • a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention can be obtained, at varying degrees of purification, (i) from cells of any of the organisms referenced in Table 1 which produce naturally said enzyme, (ii) from recombinant cells into which a nucleic acid encoding said enzyme has been inserted, and which produces said enzyme.
  • an acellular reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase may be prepared according to a process comprising the following steps:
  • step b) recovering the cell culture supernatant comprising the enzyme excreted by the cultured cells. 3) if necessary, enrich the medium obtained at the end of step b) in 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase, by purification.
  • an acellular reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase may be prepared according to a process comprising the following steps: 1) culturing recombinant or non-recombinant cells producing said enzyme;
  • step a 2) preparing a cell extract from the cells cultured in step a); 3) if necessary, enrich the medium obtained at the end of step b) in 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase, by purification.
  • the cell extract may for example be prepared by grinding the cells cultured in step 1), and then centrifugation of the cell broyast thus obtained, in order to separate unwanted solid cellular particles and the liquid. extract which contains 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase in suspension.
  • the centrifugation may for example be carried out at 800 g for a suitable duration, for example ranging from 1 to 30 minutes, preferably from 15 to 25 minutes.
  • one or more protease-inhibiting compounds can be added to the cell-free reaction mixture enriched in 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase, in order to reduce or block the possible degradation of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase, which is susceptible to to occur during the execution of the process for the preparation by biosynthesis of the compound of formula (I) which is the subject of the invention.
  • the reaction medium consists of a culture of cells, recombinant or non-recombinant, producing a DERA
  • the culture conditions are adapted according to the type of cells.
  • prokaryotes or eukaryotes that are used. In general, prokaryotic or eukaryotic cell cultures having a cell density corresponding to at least a value of 2 OD, and more preferably at least 3 OD, are used, the absorbance value being measured at the wavelength of 600 nanometers.
  • the cell density value of the cell culture used in step a) of the process can be easily adapted by those skilled in the art depending on the type of bacterial cells used, including its growth rate in in vitro cultures and its ability to produce 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase.
  • step a) of the process the acetone and the compound (II) are advantageously added to the cell culture substantially simultaneously over time.
  • the order of addition of acetone and the compound of formula (II) to the cell cultures is irrelevant.
  • Step a) of the process according to the invention has a duration that can vary between 10 hours and 10 days, depending on the reaction medium used and the amounts of starting material added at the beginning of this step.
  • a high level of production of the compound of formula (I) is obtained from the first hours after the addition of the starting materials to the reaction medium containing a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase.
  • a peak of compound of formula (II) is observed after about 6 hours to 30 hours following the addition of the starting materials of the reaction medium, in particular when using a cellular reaction medium.
  • a peak of the compound of formula (II) may be observed after several days, for example after 5 to 10 days following the addition of the starting materials to the reaction medium, in particular when a reaction medium is used. acellular.
  • the process is carried out continuously.
  • Step a) of bioconversion of the starting products of compound of formula (I) is carried out, during the selected time, at a temperature ranging from 35 ° C. to 39 ° C., preferably from 36 ° C. to 38 ° C.
  • Step a) is most preferably carried out at a temperature of about 37 ° C.
  • reaction medium when the reaction medium consists of an acellular medium, said reaction medium is recovered by any known technique, for example by simple aspiration.
  • step c) when the reaction medium consists of a cell culture, the culture supernatant can be recovered by any technique known to those skilled in the art. In particular, it can be recovered conventionally by centrifugation of the suspension of prokaryotic or eukaryotic cells in the culture medium and recovery of the centrifugation supernatant.
  • step b) comprises a step b1) and a step b2) advantageously in step b1) advantageously 1 to 5 cycles of freezing and thawing, and preferably 1 to 3 cycles freezing and thawing the culture supernatant obtained in step c).
  • the method of the invention can be successfully implemented by performing, in step b1), a single cycle of freezing and thawing of the culture supernatant obtained at the end of step a).
  • the culture supernatant is first frozen at a temperature of at least -1 0 ° C., better still at least -2 ° C.
  • a slow defrosting phase is carried out for a period of time. at least 5 hours.
  • the frozen supernatant is slowly defrosted, for example by placing the frozen supernatant at a temperature of at least + 40 ° C., for example at a temperature of + 8 ° C., for a duration of up to 5 hours. at 48 hours, better from 12 hours to 36 hours, for example during a period of 18 hours to 24 hours.
  • Step b1) of carrying out at least one cycle of freezing and then thawing the culture supernatant obtained at the end of step c) is essential to obtain the compound (I).
  • the compound (I) contained in the culture supernatant after thawing can be recovered by any technique known to man of the particularly by any liquid / liquid or liquid / gas extraction process appropriate.
  • the compound of formula (I), in step b), or in step b2) of the process can be recovered, in particular by a liquid / liquid extraction, for example in an organic phase, such as diethyl ether or esters such as ethyl acetate, or in any polar solvent immiscible with appropriate water.
  • a liquid / liquid extraction for example in an organic phase, such as diethyl ether or esters such as ethyl acetate, or in any polar solvent immiscible with appropriate water.
  • an acceptable solvent is advantageously used to obtain a final product under a process. This form is compatible with the regulations governing the placing on the market or the incorporation of natural flavorings into food and cosmetic products.
  • the recovery of the compound of formula (I) can also be carried out from the thawed culture supernatant by any purification technique by chromatography, including reverse phase chromatography. Thanks to the process of the invention, it is now easy to obtain an aromatic precursor of the phenyl-3-buten-2-one type substituted in the para position by a group R 1 as defined above, by simple bioconversion, and from starting materials that can be obtained from natural sources, including vegetable. In particular, thanks to the process of the invention, it is possible to obtain parahydroxyphenyl-3-buten-2-one, which is a precursor of the raspberry ketone compound, from parahydroxybenzaldehyde in the presence of acetone.
  • raspberry ketone can also be obtained by implementing the process of the invention with other starting materials such as paramethoxybenzaldehyde or anisaldehyde.
  • the process comprises an additional step of converting the compound (II) anisaldehyde to parahydroxyphenyl-3-buten-2-one, via a demethoxylation or demethylation step.
  • This demethoxylation or demethylation step can be carried out by any technique known to those skilled in the art.
  • Lopretti et al. (Lopretti M et al (1998) Demethoxylation of lignin-model compounds with enzyme extracts from Gloeophilum trabeum, Proc Biochem 33: 657-661).
  • the technique described by Lopretti et al. includes the use of enzymatic extracts of fungous fungi for the demethoxylation of phenolic compounds.
  • an appropriate quantity of an enzymatic extract obtained from a filamentous fungus, for example Gloeophilum trabeum is incubated at a temperature of 28 ° C. in the presence of the methoxylated compound to be converted, and then the compound is recovered. final demethoxylated.
  • Bossert et al. Bossert et al. (Bossert et al (1989) Anaerobic Oxidation of p-cresol mediated by a partially purified methylhydroxylase from a denitrifying bacterium J. Bact 171: 2956-2962), which comprises a step of incubating a methylhydroxylase, at the temperature of 25 ° C. and under anaerobic conditions, followed by a step of recovering the demethoxylated final compound.
  • the compounds (I) constitute precursors of aromatic compounds.
  • the compound (I) in which R 1 is hydrogen, that is to say parahydroxyphenyl-3-buten-2-one constitutes a direct precursor of the raspberry ketone compound.
  • raspberry ketone is obtained from para-hydroxyphenyl-3-buten-2-one by a dehydrogenation reaction. by chemical or enzymatic reduction of the compound of formula (I) which is obtained at the end of step b), or at the end of step b2) of the process described above.
  • R 1 represents hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having from 1 to 4 carbon atoms, said process comprising the steps of: a) obtaining a compound of formula (I) from a compound of formula (II) by carrying out the process as described above, b) synthesizing the compound of formula (III) by chemical or enzymatic reduction of the compound of formula (I) obtained in step a).
  • the aromatic compound of formula (III), including raspberry ketone, can be obtained, in stage b) of the above process, by conventional chemical reduction, in particular by means of any suitable method using a catalyst.
  • hydrogenation for example a catalyst based on nickel or palladium.
  • the reduction of the compound of formula (I) to obtain the compound of formula (III) can be carried out enzymatically, for example according to the technique described in French patent application N 0 FR 2,729,386 and in the application
  • the compound of formula (I) is incubated in the presence of a yeast cell culture Saccharomyces cerevisiae, or a protein or enzymatic extract of Saccharomyces cerevisiae. Then, the culture supernatant of Saccharomyces cerevisiae cells, or the reaction medium comprising the enzymatic extract of Saccharomyces cerevisiae, is recovered. Then, the final aromatic compound of formula (III) is recovered, for example by liquid / liquid or liquid / gas extraction or purification by chromatography, including reverse phase chromatography or gas chromatography.
  • step b) of synthesis of the compound of formula (III) by enzymatic reduction of the compound of formula (I) of the above process a person skilled in the art will advantageously refer to the technique described in the application N 0 PCT WO 96 / 21,739.
  • this technique 1 kg of baker's yeast is first added to a container in the open air comprising, with stirring, 2.5 liters of water and 100 g of D-glucose. The suspension is vigorously stirred at the temperature of 3O 0 C to 35 0 C. After starting the fermentation of glucose drop was added dropwise over 10 minutes a solution of compound (I) then, after the appropriate incubation time for example 48 hours, the compound of formula (III) is extracted.
  • the extraction of the compound (III) can be classically a liquid / liquid extraction, for example using methyltertiobutylether.
  • the solid residue obtained after evaporation of the solvent can be subjected to a final purification step of the compound of formula (III) by crystallization of the compound of formula (III) in an ethyl acetate solution to which add hexane drop by drop.
  • the compound of formula (III) can be recrystallized, for example in a mixture of water and methanol.
  • a yeast protein extract such as that marketed by SIGMA under the reference Y-2875, as described in PCT application N 0 WO 96 /21.739.
  • the subject of the present invention is also a kit for the preparation by biosynthesis of the compound of formula (I) below:
  • R 1 is hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • said kit comprising: a) a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase; b) a compound of formula (II) below: wherein R 1 represents hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, and c) optionally, acetone; and d) the chemical or enzymatic reagent or reagents necessary for the conversion of a compound of formula (I) into a compound of formula (III).
  • the reaction medium may consist of (i) either recombinant or non-recombinant cells, which produce a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention, ( or ii) an acellular composition comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention.
  • a reaction medium of the type (i) above may consist of a liquid medium comprising recombinant or non-recombinant cells in culture. It may be a cell preculture medium, which requires the implementation of a cell growth step prior to the addition of the compound of formula (II) and acetone. It can also be a reaction medium in which the density of the cells are in sufficient number or density to immediately start the process of the invention, by adding the appropriate amounts of the compound of formula (II) and acetone. .
  • a reaction medium of the type (i) above, as contained in a kit according to the invention may consist of a solid composition comprising the cells, recombinant or non-recombinant, in freeze-dried form.
  • a reaction medium of the type (ii) may consist of a liquid composition comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention, in suspension.
  • reaction medium of the type (ii) may consist of a solid composition, for example a solid composition comprising 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention, in frozen or freeze-dried form.
  • the kit above is characterized in that the compound of formula (II) consists of a compound of formula (II) in which R 1 represents a hydrogen atom.
  • the compound of formula (II) consists of a compound of formula (II) in which R 1 represents the group -CH 3 .
  • the subject of the invention is also a kit for preparing a compound of formula (III) as defined in the present description, from a compound of formula (II) as defined in the present description, said kit comprising: a reaction medium comprising a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase; b) a compound of formula (II) below: wherein R 1 is hydrogen or an unsubstituted linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, c) optionally, acetone, and d) the chemical or enzymatic reagent (s) necessary for the conversion of a compound of formula (I) to a compound of formula (III).
  • the reaction medium, the compound of formula (II), optionally acetone, and the reagent or reagents necessary for the conversion of a compound of formula (II) into a compound of formula (III), are presented in separate containers.
  • the reaction medium consists of any of the reaction mediums that can be used for the kit described above.
  • the reaction medium may consist of (i) either recombinant or non-recombinant cells, which produce a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase according to the invention, or (ii) an acellular composition comprising a 2-deoxyribose -5-phosphate aldolase according to the invention.
  • said kit further comprises an enzymatic reagent chosen from Saccharomyces cerevisiae cells and an enzymatic extract of Saccharomyces cerevisiae.
  • said kit comprises a chemical reagent consisting of a hydrogenation catalyst, for example a nickel-based catalyst or a palladium-based catalyst.
  • a hydrogenation catalyst for example a nickel-based catalyst or a palladium-based catalyst.
  • Figure 1 illustrates the production of 4-OH-Benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone, in the presence of a reaction medium comprising E. coli cells (ATCC Accession No. 86963).
  • culture time expressed in hours.
  • the period between the -5h time and the Oh time consists of a cell preculture time.
  • FIG. 1 In ordinates, on the scale on the right of the figure: density of the bacterial cells (A), expressed in Units of Optical Density (OD) at the wavelength of 600 nanometers.
  • Figure 2 illustrates the production of Anisylidene acetone from Anisaldehyde and acetone, in the presence of a reaction medium comprising E. coli cells (ATCC Accession No. 86963).
  • Figure 3 illustrates the production of 4-OH-Benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone in the presence of a reaction medium comprising E. coli K12 cells.
  • a reaction medium comprising E. coli K12 cells.
  • culture time expressed in hours. The period between the -5h time and the Oh time consists of a cell preculture time.
  • OH-benzaldehyde ()), expressed in mg / l. - In ordinates, on the scale on the right of the figure: density of the bacterial cells (A), expressed in Units of Optical Density (OD) at the wavelength of 600 nanometers, or concentration of 4-OH-Benzylidene acetone (B) expressed in mg / l.
  • Figure 4 illustrates the production of 4-OH-Benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone in the presence of a reaction medium comprising Bacillus subtilis cells (ATCC Reference No. 31324).
  • culture time expressed in hours.
  • the period between the -5h time and the Oh time consists of a cell preculture time.
  • FIG. 5 illustrates the production of 4-OH-benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone, in the presence of a reaction medium comprising Bacillus subtilis cells (CIP reference No. 52.65).
  • Figure 6 illustrates the production of 4-OH-benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone, in the presence of a reaction medium comprising Bacillus subtilis 168 cells (ATCC Accession No. 23857).
  • culture time expressed in hours.
  • the period between the -5h time and the Oh time consists of a cell preculture time.
  • FIG. 7 illustrates the production of 4-OH-Benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone in the presence of a reaction medium comprising Bacillus cereus cells (CIP Part No. 54.9).
  • FIG. 8 illustrates the production of 4-OH-benzylidene acetone from 4-OH-benzaldehyde and acetone, in the presence of a reaction medium comprising an enzymatic extract of deoxyribose 5-phosphate aldolase from Escherichia coli (ATCC Reference No. 86963).
  • concentration of 4-OH-benzaldehyde (B) expressed in mg / l concentration of 4-OH-benzaldehyde (B) expressed in mg / l.
  • the upper curve (u) illustrates the evolution of the concentration of 4-OH-benzaldehyde in the presence of a reaction medium comprising 1 mg, expressed as an amount of protein, of cell extract.
  • the lower curve (u) illustrates the evolution of the concentration of 4-OH-benzaldehyde in the presence of a reaction medium comprising 5 mg, expressed as an amount of protein, of cell extract.
  • Benzylidene acetone (•), expressed in mg / l.
  • the lower curve (•) illustrates the evolution of the 4-OH-benzylidene acetone concentration in the presence of a reaction medium comprising 1 mg, expressed as an amount of protein, of cell extract.
  • the upper (•) curve illustrates the evolution of the concentration of 4-OH-benzylidene acetone in the presence of a reaction medium comprising 5 mg, expressed as an amount of protein, of cell extract.
  • the following bacterial strains were used: (a) Escherichia coli (ATCC Reference No. 86963); (b) Escherichia coli K12 (ATCC accession No. 29425) (c) Bacillus subtilis (ATCC reference No. 31324, DSM reference No. 704) (d) Bacillus subtillis (Pasteur Institute collection -IPC reference No. 52.65) e) Bacillus subtilis 168 (ATCC Reference No. 23857); and f) Bacillus cereus (Institut Pasteur Collection - CIP Reference No. 54.9)
  • composition of the medium of culture (QSR 1 liter) products Bio Balley and Sigma for the salts: Extract of yeast (2g), FeSO 4 - 7H 2 O (0,001g), CaCl 2 (O 1 OIg), CuSO-5H 2 O (0.01 g), MgSO 4 (0.8 g), ZnSO 4 -H 2 O (0.01 g), (NH 4) 2 SO 4 (5 g), K 2 HPO 4 -3H 2 O (1.32 g) MnSO 4 -H 2 O (0.1 g) The pH is adjusted to 7 (NaOH or HCl) and the medium is autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes When the temperature of the medium has dropped to 60 ° C.
  • the cell extract was obtained from cells of the Escherichia coli strain referenced ATCC under No. 86963.
  • the production of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase is induced in the presence of substrate.
  • the first step therefore consists of a step of induction of the production of 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase by the cells in culture, lasting for 24 hours.
  • the cells After 24 hours of preculture of E. coli with an OD of 3.2, the cells are centrifuged, washed 5 times in phosphate buffer pH 7.4 and then crushed with the French press in the same buffer supplemented with benzamidine (1 mM), EDTA (2 mM), PMSF (1 mM) and DTT (1 mM). After grinding, the extracts are centrifuged at 8000xg for 15 minutes and the supernatant is preserved.
  • the samples containing the final products of the enzymatic reaction are extracted as described below.
  • the samples are centrifuged at 3000g for 15 minutes. The supernatant is then recovered and frozen at -2O 0 C. After slow thawing (one night between 40 ° C. and 80 ° C.) and after addition of 40 ⁇ l of a 1 g / l solution of 1,4-dimethoxybenzene (internal standard), the supernatant is extracted twice successively with 5 ml. of ethyl acetate (Carlo Erba). The two extracts are then combined, dried over anhydrous sodium sulphate and then filtered on glass cotton and concentrated under a stream of nitrogen to a volume of 500 ⁇ l. Determination of volatile compounds
  • Example 1 Production of a compound of formula (I) using a reaction medium comprising cells producing a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase.
  • FIG. 1 show that, thanks to the process of the invention, 4-OH-benzylidene acetone is produced from 4-OH-benzaldehyde and acetone, using a reaction medium comprising E. coli cells (ATCC 86963), in significant amount (160 mg / ml).
  • FIG. 2 show that, thanks to the process of the invention, Anisylidene acetone is produced from anisaldehyde and acetone, using a reaction medium comprising E. coli cells (ATCC 86963 ), in significant amount (6 to 10 mg / ml)
  • FIG. 3 show that, thanks to the process of the invention, 4-OH-benzylidene acetone is produced from 4-OH-benzaldehyde and acetone, using a reaction medium comprising E-cells. coli K12, in significant amount (approximately 4 mg / ml).
  • Benzaldehyde and acetone using a reaction medium comprising Bacillus subtilis cells (ATCC 86963), in a significant amount (about 25 mg / ml).
  • Example 2 Production of a compound of formula (I) using a reaction medium comprising an enzymatic extract of E. coli cells producing a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase.
  • the results of FIG. 8 show that, thanks to the process of the invention, 4-OH-benzylidene acetone is produced from 4-OH-benzaldehyde and acetone, using a reaction medium comprising an enzymatic extract obtained from E. coli cells (ATCC 86963), in significant amount. More particularly, the results of FIG. 8 show that with an amount of enzymatic extract comprising 1 mg of total protein, a final concentration of 4-OH-benzylidene acetone of about 2 mg / ml can be obtained after a period of 5 days of the enzymatic reaction.
  • results of FIG. 8 show that with an amount of enzymatic extract comprising 5 mg of total proteins, a final concentration of 4-OH-benzylidene acetone of about 5 mg / ml can be obtained after a period of 5 days of the enzymatic reaction.

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Abstract

La présente invention se rapporte au domaine de la synthèse de composés aromatiques par voie enzymatique ou biologique. L'invention est plus particulièrement relative à un procédé d'obtention d'un précurseur de composés aromatiques, notamment un précurseur de cétone framboise, par bioconversion enzymatique.

Description

PROCEDE POUR LA PREPARATION D'UN PRECURSEUR D'UN COMPOSE AROMATIQUE, PAR BIOSYNTHESE
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la synthèse de composés aromatiques par voie enzymatique ou biologique.
L'invention est plus particulièrement relative à un procédé d'obtention d'un précurseur de composés aromatiques, notamment un précurseur de cétone framboise, par bioconversion enzymatique ART ANTERIEUR
En général, chaque arôme naturel est constitué de plusieurs centaines de composés volatils. Toutefois, parmi les nombreux composés volatils constitutifs d'un arôme naturel, un composé volatil, ou un nombre restreint de composés volatils, confère à lui seul la note olfactive caractéristique dudit arôme.
A ce jour, plus de 230 composés volatils ont été identifiés comme étant constitutifs de l'arôme framboise. Toutefois, la note olfactive de l'arôme framboise naturel lui est conférée essentiellement, sinon exclusivement, par le composé 4-(4'-hydroxyphényl) butane-2-one, qui est aussi appelé para-hydroxyphényl-butane-2-one ou « cétone framboise », ou encore « frambinone ».
La cétone framboise est une molécule aromatique très recherchée en agro-alimentaire. Dans ce domaine, la cétone framboise n'est pas seulement utilisée en tant qu'arôme framboise. La cétone framboise est également employée dans divers mélanges aromatiques, notamment des mélanges aromatiques de pêche, d'ananas, de fraise, de kiwi ou encore de cerise. La cétone framboise est également utilisée pour ses capacités à fournir une note fruitée dans certains mélanges aromatiques en parfumerie, en cosmétique et en pharmacie. Les fruits de framboise représentent à ce jour la seule source permettant l'extraction directe de la cétone framboise. Toutefois, la cétone framboise est présente à de très faibles concentrations dans le fruit, de l'ordre de 0,1 mg/l de jus de framboise. En conséquence, le prix de revient de la cétone framboise obtenue par extraction directe à partir du fruit n'est pas compatible avec les contraintes économiques liées à la fabrication de produits industriels, notamment alimentaires et cosmétiques, qui doivent être d'un prix de revient modéré lorsqu'ils sont destinés à une large diffusion auprès du public.
Pour pallier ces contraintes techniques et économiques, on a décrit, dans l'état de la technique divers procédés de synthèse chimique de la cétone framboise. On a ainsi décrit un procédé de synthèse chimique de la cétone framboise par condensation de phénol avec la méthyl- vinylcétone, en présence d'un catalyseur approprié. Cependant, ce procédé de synthèse chimique présente de nombreux inconvénients. La méthyl-vinylcétone est un composé difficile à synthétiser, et qui de plus est instable. En outre, le phénol est un produit de synthèse toxique qui provoque des brûlures graves sur la peau.
On a aussi décrit un procédé de synthèse chimique de cétone framboise en deux étapes, respectivement (i) une étape de synthèse du para-hydroxyphényl-3-buten-2-one par condensation du parahydroxybenzaldéhyde avec la cétone, suivie (ii) d'une étape d'hydrogénation catalytique du parahydroxyphényl-3-buten-2-one pour obtenir le parahydroxyphényl-butan-2-one ou cétone framboise. La cétone framboise obtenue par un tel procédé est classée comme un arôme « nature-identique », du fait qu'elle est chimiquement identique à la cétone framboîse naturelle mais qu'elle a été obtenue par synthèse chimique.
Toutefois, il existe un besoin dans l'industrie pour des arômes naturels, c'est-à-dire des substances aromatisantes chimiquement définies et qui sont obtenues à partir des sources naturelles, soit par des procédés physiques appropriés, y compris la distillation et l'extraction par solvant, soit par des procédés enzymatiques ou microbiologiques, à partir de la matière d'origine végétale ou animale.
Dans cet objectif de synthèse d'un composé d'arôme cétone framboise naturelle, il a antérieurement été mis au point un procédé comprenant deux étapes de biosynthèse, respectivement (i) une étape de condensation du 4-coumaroyl-CoA avec le malonyl-CoA, puis (ii) une étape de décarboxylation du composé intermédiaire produit lors de l'étape précédente afin d'obtenir le 4-(4'-hydroxy-phényl)-but-3-ene-2-one. Puis le 4,4'-hydroxyphényl)-but-3-ene-2-one est réduit en cétone framboise par catalyse enzymatique en présence de NADPH (Borejsza-wysocki et Hrazdina, 1994, Biosynthesis of p-hydroxyphenylbutane-2-one in Raspberry fruits and tissue cultures, Phytochemistry, vol. 35 : 623). En dépit de son apparente simplicité, ce procédé de biosynthèse de cétone framboise apparaît peu économique, notamment du fait qu'il nécessite l'extraction préalable des enzymes de bioconversion à partir de tissus végétaux et aussi parce qu'il nécessite l'utilisation de co-facteurs tels que CoA SH, de l'APP et du NADPH.
Il a également été décrit un procédé d'obtention de cétone framboise par bioconversion du 3-(4'-hydroxyphényl)-1-méthyl-propyl- béta-D-glucopyranoside, aussi appelé bétuloside ou rhododendrine, par actions successives d'une béta-glucosidase, puis d'une alcool secondaire déhydrogénase (ASDH), comme cela est décrit dans la demande PCT N0WO 99/49 069. Dans ce procédé de biosynthèse, le produit de départ, qui est le composé bétuloside, est extrait à partir du bouleau. Bien que ce procédé de biosynthèse apparaisse satisfaisant sur le plan technique, son utilisation industrielle à des coûts modérés est incertaine, essentiellement du fait de la faible disponibilité du produit de départ, et, bien que dans une moindre mesure, aussi du fait de la nécessité d'utiliser des enzymes purifiées à partir de substances naturelles. II existe donc toujours un besoin dans l'état de la technique pour des procédés d'obtention de composés aromatiques, notamment de cétone framboise, par biosynthèse totale ou partielle, alternatifs aux procédés connus. Notamment, il existe un besoin dans l'état de la technique pour de nouveaux procédés de biosynthèse de composés aromatiques, notamment de la cétone framboise, qui soient d'un prix de revient modéré. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
II est fourni selon l'invention un nouveau procédé de préparation par biosynthèse de précurseurs aromatiques du type phényl-3-butèn-2- one substituée en position para, à partir de produits de départ naturels ou synthétiques aisément accessibles.
De manière surprenante, on a montré selon l'invention que les composés précurseurs aromatiques du type phényl-3-butèn-2-one substitués en position para pouvaient être obtenus grâce à une étape de condensation, par aldolisation enzymatique, de l'acétone avec un benzaldéhyde substitué en position para.
Ainsi, de manière surprenante, on a montré selon l'invention, que la réaction d'aldolisation entre l'acétone et un benzaldéhyde substitué par un hydroxy ou un alcoxy en position para, qui était jusqu'à aujourd'hui réalisée exclusivement par synthèse chimique, pouvait être réalisée par voie microbiologique.
Plus précisément, on a montré selon l'invention que l'étape d'aldolisation de l'acétone avec un composé benzaldéhyde substitué en position para par un groupe hydroxy ou alcoxy, afin de produire des précurseurs aromatiques du type phényl-3-butèn-2-one substitués en position para par un groupe hydroxy ou alcoxy, pouvait être réalisée par une étape de bioconversion enzymatique catalysée par une déoxyribose- phosphate aldolase (DERA). La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation par biosynthèse du composé de formule (I) suivant :
Figure imgf000006_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) ajouter :
(i) un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000006_0002
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, et (ii) de l'acétone, dans un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ; et b) récupérer le composé de formule (I), à partir du milieu obtenu à la fin de l'étape a).
Ainsi, on a montré selon l'invention qu'une aldolase particulière, la déoxyribose 5-phosphate aldolase, encore appelée DERA, était capable de convertir un benzaldéhyde substitué en position para en un phényl-3- butèn-2-one possédant le même substituant en position para, en présence d'acétone.
La 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase est une aldolase de classe I qui est connue pour sa capacité à catalyser la condensation de l'acétaldéhyde et du D-glycéraldéhyde-3-phosphate pour produire du 2- déoxyribose-5-phosphate.
La DERA est classée, selon la nomenclature internationale, dans la classe d'aldolases EC 4.1.2.4. L'activité catalytique spécifique de la DERA peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, par exemple en utilisant la technique décrite par WONG et al. (2003, Bioorganic and Médicinal Chemistry, Vol. 11 : 43-52; Section "Expérimental", sous-section "DERA addition (aldol) assay")
Dans les composés de formule (I) et (II), le groupe Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant 1 ,2,3 ou 4 atomes de carbone.
Selon un premier aspect préféré, le composé de formule (II) est tel que Ri représente un atome d'hydrogène. Dans ce mode de réalisation particulier, le composé de formule (II) est un composé de para- hydroxybenzaldéhyde permettant, grâce au procédé de l'invention, de préparer le composé de formule (I) consistant en le parahydroxyphenyl-3- butèn-2-one, aussi désigné 4-OH-benzylidène acétone, qui est un précurseur de la cétone framboise.
Selon un second aspect préféré, le composé de formule (II) est tel que le groupe Ri représente un groupe -CH3. Selon ce second aspect particulier, le composé de formule (II) consiste en le paraméthoxybenzaldéhyde, qui est aussi appelé anisaléhyde. Selon ce second aspect particulier, le composé de formule (I) obtenu selon le procédé de l'invention est le paraméthoxyphényl-3-butèn-2-one, qui est aussi appelé anisylidène acétone, qui peut être également un composé précurseur de la cétone framboise.
Les produits de départ utilisés dans le procédé de biosynthèse de l'invention sont aisément accessibles et peu onéreux. Par exemple, le parahydroxybenzaldéhyde peut être obtenu par extraction à partir de diverses sources biologiques. Le parahydroxybenzaldéhyde est par exemple produit par des organismes tels que certains coléoptères comme Agabus melanarius, des hétéroptères comme llyocoris cimicoides et Notonecta, ou encore par des lépidoptères comme Eldana saccharina. Egalement, le parahydroxybenzaldéhyde peut être libéré, par exemple par simple chauffage en présence d'émulsine d'une suspension aqueuse d'hurrine, qui est un glucoside analogue à l'amygdaline, cette dernière étant présente notamment dans les jeunes pousses de sorgho (Sorghum vulgare). On peut aussi obtenir le parahydroxybenzaldéhyde naturel, par biodégradation de la picéide, un stylbène présent dans l'écorce de l'épicéa, comme décrit par Shiotsu et al. (1989, Mukuzai, vol. 35 : 826).
Le parahydroxybenzaldéhyde peut être également obtenu par synthèse chimique, notamment selon les techniques décrites par Freudenberg et Gehrke (1951 , Chem. Ber, vol.84 : 443-450) ou encore de Schoutissen (1935, Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, vol.54 : 97-99). De plus, le parahydroxybenzaldéhyde est un composé que l'on peut trouver couramment dans le commerce.
Un composé de formule (II) comme le paraméthoxybenzaldéhyde ou anisaldéhyde peut être obtenu à partir de sources naturelles telle que l'huile extraite de l'anis étoilée. L'anisaldéhyde est également un composé chimique que l'on peut trouver couramment dans le commerce.
L'acétone qui est utilisée dans la mise en œuvre du procédé de l'invention peut être obtenue à partir de sources naturelles, tels que les plantes et les arbres. L'acétone est également produite par divers microorganismes. L'acétone peut être obtenue par fermentation du glucose par des cultures de cellules bactériennes de Clostridium acetobutylicum. L'acétone est par ailleurs un composé que l'on trouve couramment dans le commerce. Ainsi, grâce au procédé de l'invention, on peut désormais obtenir un précurseur naturel de la cétone framboise. De plus, lorsque ce précurseur naturel de cétone framboise est subséquemment converti en cétone framboise par voie microbiologique, le produit final est alors une cétone framboise qui consiste en un arôme naturel. Selon un troisième aspect préféré, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce qu'à l'étape a), on ajoute dans le milieu réactionnel une quantité en poids d'acétone en excès, par rapport au poids de composé (II). Préférentiel lement, pour un poids (P) déterminé du composé de formule (II), on ajoute à l'étape a) au moins deux fois le poids (P) d'acétone. Dans certains modes de réalisation du procédé, on ajoute à l'étape a) au moins 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32 fois le poids (P) en acétone. A titre illustratif, on utilise dans les exemples un poids (P) de 0,5 g/l de composé de formule (II) pour 16 g/l d'acétone, soit 32 fois le poids (P).
Dans certains modes de réalisation du procédé, l'étape b) comprend les étapes suivantes : b1) réaliser au moins un cycle de congélation puis décongélation du milieu obtenu à la fin de l'étape a) ; b2) récupérer le composé de formule (I) à partir du milieu décongelé obtenu à la fin de l'étape b1 ).
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que le ou les cycle(s) de congélation puis décongélation entraînent une modification dans la mobilité du solvant, qui peut être l'eau, au niveau du site catalytique de l'enzyme. Cette modification dans la mobilité du solvant conduirait à une modification de la solubilité et à l'accumulation d'intermédiaires réactionnels, de nature à favoriser l'achèvement de la réaction d'aldolisation du composé de formule (II), et de l'étape de déshydratation finale aboutissant à la production du composé de formule (I).
On a montré que l'on pouvait avantageusement mettre en œuvre le procédé de l'invention avec un milieu réactionnel comprenant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase ayant au moins 30% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de séquence SEQ ID N°1. Le polypeptide de séquence SEQ ID N0 1 consiste en la séquence d'acides aminés de la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase exprimée par Escherichia coli.
De manière générale, on sait dans l'état de la technique qu'une identité d'au moins 30 % en acides aminés, sur un segment d'au moins 100 acides aminés consécutifs, entre deux polypeptides signifie une relation structurelle et fonctionnelle forte entre ces deux polypeptides.
De plus, on a montré dans les exemples qu'un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de Bacillus subtilis ayant une identité en acides aminés de 36% avec la séquence SEQ ID N°1 était capable de catalyser la réaction d'aldolisation du composé de formule (II) pour produire le composé final de formule (I).
La 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de Bacillus subtilis possède la séquence en acides aminés SEQ ID N°2 selon l'invention.
On a aussi montré dans les exemples qu'un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de Bacillus cereus ayant une identité en acides aminés de 38% avec la séquence SEQ ID
N°1 était capable de catalyser la réaction d'aldolisation du composé de formule (II) pour produire le composé final de formule (I).
La 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de Bacillus cereus possède la séquence en acides aminés SEQ ID N°3 selon l'invention. Aux fins de la présente description, l'expression « séquence d'acides aminés » peut être employée pour désigner indifféremment un polypeptide ou une protéine. L'expression " séquence d'acides aminés " englobe le matériel protéique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Selon l'invention, un premier polypeptide ayant au moins 30 % d'identité en acides aminés avec un second polypeptide de référence, possédera au moins 30 %, de préférence au moins 31%, 32%, 33%, 34%,
35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%,
61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%,
74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%,
98%, 98,3% 98,6%, 99%, ou au moins 99,5% d'identité en acides aminés avec ledit second polypeptide de référence.
Egalement, aux fins de la présente description, l'expression
" séquence nucléotidique " peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression
" séquence nucléotidique " englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
Les termes " acide nucléique ", " polynucléotide ", " oligonucléotide " ou encore " séquence nucléotidique " englobent des séquences d'ARN, d'ADN, d'ADNc ou encore des séquences hybrides ARN/ADN de plus d'un nucléotide, indifféremment sous la forme simple brin ou sous la forme de duplex.
Le terme " nucléotide " désigne les nucléotides naturels (A, T, G, C et U).
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant " complémentaire " d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée. Les « bases », complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
Selon l'invention, un premier acide nucléique ayant au moins 30 % d'identité avec un second acide nucléique de référence, possédera au moins 30 %, de préférence au moins 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 97,5%, 98%, 98,3% 98,6%, 99%, ou au moins 99,5% d'identité en nucléotides avec ledit second acide nucléique de référence.
Le « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides aminés ou entre deux séquences d'acides nucléiques, au sens de la présente invention, est déterminé en comparant les deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison.
La partie de la séquence d'acides aminés ou de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal entre les deux séquences.
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles un acide aminé identique, ou une base nucléique identique, est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité entre les deux acides aminés, ou entre les deux bases nucléiques, par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par cent afin d'obtenir le pourcentage d'identité en acides aminés ou en nucléotides des deux séquences entre elles. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus.
De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité de séquence est déterminé à l'aide du logiciel BLAST, version 2.0, qui met en œuvre l'algorithme BLAST (pour « Basic Local Alignment Search Tool »), tel que défini par Karlin et Altshul (Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul (1990) ; Methods for assessing the statistical significance of molecular séquence features by using gênerai scoring schemes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68. Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul (1993); Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular séquences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).
Pour déterminer le pourcentage d'identité en nucléotides entre deux polynucléotides, on utilise préférentiel lement le logiciel BLASTN, basé sur l'algorithme défini par Altschul et al. (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new génération of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402), en utilisant les paramètres par défaut.
Pour déterminer le pourcentage d'identité en acides aminés entre deux polypeptides, on utilise préférentiellement le logiciel BLASTP, basé sur l'algorithme défini par Altschul et al. (Altschul, Stephen F., Warren Gish, Webb Miller, Eugène W. Myers, and David J. Lipman (1990). Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-10), en utilisant les paramètres par défaut. Pour déterminer le pourcentage d'identité en acides aminés entre deux polypeptides, on utilise préférentiellement le logiciel BLASTP, version 2.2.10 , dont les principes sont décrits par Tatusova et al. (Tatusova TA, Madden TL (1999) BLAST 2 S, a new tool for comparing protein and nucleotide séquences. FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250), avec les paramètres fixés comme suit : (1 ) Matrix=BLOSUM62; (2) Gap Open=11 ; (3) Gap Extension=1 ; (4) X_dropoff=15; (5) Expect=10.000000; (6) Wordsize=3; (7) Filter (T/F) default =T
Ainsi, l'étape a) du procédé ci-dessus peut être réalisée en utilisant un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ayant au moins 30% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N°1 de E. coli et codée par un acide nucléique provenant (i) soit d'un organisme procaryote, (ii) soit d'un organisme eucaryote, à l'exclusion des champignons filamenteux.
Notamment, l'étape a) du procédé ci-dessus peut être réalisée en utilisant un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase provenant d'un organisme procaryote d'une espèce choisie parmi Escherichia coli, Bacillus , Pseudomonas, Streptomyces, Corynebacterium et Shewanella.
Plus particulièrement, l'étape a) du procédé ci-dessus peut être réalisée en utilisant un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose- 5-phosphate aldolase codée par un acide nucléique provenant d'un organisme procaryote choisi parmi Escherichia coli K12, Escherichia coli CFT073, Shigella flexneri, Salmonella enterica subsp. enterica, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia pseudotubercolis, Photobacterium profundum, Vibrio fischeri, Erwinia carotovora, Actinobacillus pleuropneumoniae, Colwellia psychererythraea, Shewanella baltica, Shewanella amazonensis, Shewanella frigidimarina, Shewanella denitrificans, Chromohalobacter salexigens, Burkholderia pseudomallei, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, Pseudomonas syringae pv. tomato, Idiomarina loihiensis, Pseudomonas syringae pv. Syringae, Magnetospirillum magnetotacticum, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis, Coxiella burnetii, Nocardioides sp. JS614, Paracoccus denitrificans, Mesorhizobium sp. BNC1 , Silicibacter sp. TM 1040, Rhodobacter sphaeroides, Bacteroides thetaiotaomicron, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Silicibacter pomeroyi, Burkholderia fungorum, Jannaschia sp. CCS 1 , Porphyromonas gingivalis, Legionella pneumophila, Treponema denticola, Bacillus cereus, Geobacillus kaustophilus, Bacillus halodurans, Solibacter usitatus, Streptococcus suis, Bacillus licheniformis, Listeria monocytogenes, Deinococcus geothermalis, Chloroflexus aurantiacus, Rubrobacter xylanophilus, Desulfitobacterium hafniense, Arthrobacter sp. FB24, Bacillus clausii, Rhodospirillum rubrum, Staphylococcus haemolyticus, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, Symbiobacterium thermophilum, Thermococcus kodakarensis et Exiguobacterium sp . 255- 15.
Dans un mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, le milieu réactionnel comprend une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase codée par Bacilus subtilis, de préférence la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de séquence SEQ ID N0 2. Dans un autre mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, le milieu réactionnel comprend une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase codée par Bacilus cereus, de préférence la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de séquence SEQ ID N0 3.
Comme cela a été mentionné précédemment, l'étape a) du procédé ci-dessus peut aussi être réalisée en utilisant un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase codée par un acide nucléique provenant d'un organisme eucaryote, par exemple un organisme eucaryote choisi parmi Homo sapiens, Gallus gallus, Canis familiaris, Mus musculus, Caenorhabditis elegans, Anophèles gambiae, Danio rerio, Xenopus tropicalis, Plasmodium chabaudi, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Apis mellifera, Drosophila melanogaster, Entamoeba histolytica, Aspergillus fumigatus, Strongylocentrotus purpuratus, et Aspergillus nidulans.
Pour les séquences d'acides aminés et les séquences nucléotidiques correspondant aux divers organismes procaryotes ou eucaryotes spécifiés ci-dessus, l'homme du métier se référera avantageusement à la colonne de gauche du Tableau 1 dans lequel, pour chaque organisme procaryote ou eucaryote, est indiquée la référence d'accès aux séquences correspondantes, dans la base de données du NCBI (pour « National Center for Biotechnology Information »).
Aux fins de la présente description, un « milieu réactionnel » comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase englobe à la fois (i) un milieu réactionnel consistant en une culture de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes produisant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase, et (ii) un milieu réactionnel consistant en une composition acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
Dans certains modes de réalisation d'un milieu réactionnel du premier type(i), les cellules sont choisies parmi le cellules procaryotes ou eucaryotes décrites ci-dessus, qui produisent naturellement une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase ayant au moins 30% d'identité en acides aminés avec la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de E. coli de séquence SEQ ID N0 1.
Dans d'autres modes de réalisation d'un milieu réactionnel du premier type(i), les cellules sont choisies parmi des cellules recombinantes dans lesquelles a été inséré un acide nucléique codant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ayant au moins 30% d'identité en acides aminés avec la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase de E. coli de séquence SEQ ID N0 1.
L'invention est également relative à l'utilisation d'un acide nucléique codant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase tel que définie ci-dessus en vue de produire une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase pour sa mise en œuvre pour la préparation du milieu réactionnel utilisé dans le procédé ci-dessus.
A partir des séquences en acides aminés et/ou des séquences nucléotidiques des 2-déoxyribose-5-phosphate aldolases dont les références sont spécifiées dans le Tableau 1 , l'homme du métier est capable de détecter, isoler, cloner et caractériser tout acide nucléique codant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase, par exemple en synthétisant des sondes ou des amorces nucléotidiques spécifiques. Pour construire de telles sondes ou amorces nucléotidiques, l'homme du métier peut se référer à l'une quelconque des nombreuses techniques conventionnelles connues dans l'état de la technique.
Selon un premier aspect, l'acide nucléique codant pour une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase consiste en l'acide nucléique codant le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N0 1 , référencé sous le n° P0A6L0 dans la base de données du NCBI ou dans la base de données SWISSPROT.
Selon un second aspect, l'acide nucléique codant pour une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase consiste en l'acide nucléique codant le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N0 2, référencé sous le n° NP-391 821 dans la base de données du NCBI ou dans la base de données SWISSPROT.
Selon un troisième aspect, l'acide nucléique codant pour une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase consiste en l'acide nucléique codant le polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N0 3, référencé sous le n° NP-978 291 dans la base de données du NCBI ou dans la base de données SWISSPROT.
L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'une des 2-déoxyribose-5-phosphate aldolases telles que définies ci- dessus, ladite méthode comprenant les étapes de : i) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; ii) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; iii) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication, par choc osmotique, ou à l'aide d'une presse de French ; iv) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des lysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; v) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Selon un autre aspect, une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase, produite par des cellules non recombinantes ou par des cellules recombinantes dans lesquelles l'acide nucléique correspondant a été inséré, peut être purifiée par passage sur une série appropriée de colonnes de chromatographie, selon les méthodes connues de l'homme de l'art, par exemple une colonne de chromatographie d'immunoaffinité sur laquelle les anticorps dirigés contre cette 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ou contre un fragment de cette dernière ont été préalablement immobilisés.
Dans certains cas, une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase selon l'invention peut être également préparée par les techniques classiques de synthèse chimique indifféremment en solution homogène ou phase solide.
A titre illustratif, une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase telle que définie selon l'invention pourra être préparée par la technique de synthèse en solution homogène décrite par HOUBEN WEYL (Houben Weyl, 1974, in Meuthode der Organischen Chemie, E. Wunsch Ed., Volume 15-1 et 15-
II,) ou encore la technique de synthèse en phase solide décrite par
MERRIFIELD (Merrifield RB, 1965a, Nature, Vol. 207(996): 522-523. Merrifield RB., 1965b, Science, Vol. 150(693): 178-185).
Pour obtenir des cellules recombinantes exprimant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase, on utilise avantageusement un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique codant une 2-déoxyribose-5- phosphate aldolase telle que définie ci-dessus. Par " vecteur " au sens de la présente invention on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme de simple brin ou double brin.
Sont préférés les vecteurs d'expression comprenant, outre un acide nucléique codant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention, des séquences régulatrices permettant d'en diriger sa transcription et/ou sa traduction.
Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants : (1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique à insérer, tels que des promoteurs et des enhanceurs ;
(2) la séquence codante comprise dans l'acide nucléique conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence codante étant placée en phase avec les signaux de régulation décrits aux (1 ) ; et (3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriées.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur expression est recherchée, un ou plusieurs marqueurs de sélection.
A titre d'exemples, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Les promoteurs pour cellules eucaryotes comprendront le promoteur de la thymidine kinase du virus HSV ou encore le promoteur de la métallothionéine-L de souris.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de
SAMBROOK et al. (Sambrook, J. Fritsch, E. F., and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2ed. CoId Spring Harbor Laboratory, CoId spring Harbor, New York.) ou encore aux techniques décrites par FULLER et al. (Fuller S.A. et al., 1996, Immunology in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. Eds, John Wiley & Sons, Inc., USA). Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression des acides nucléiques selon l'invention dans des bactéries sont par exemple les vecteurs pQE70, pQE60 ou pQE-9 (commercialisés par la société QIAGEN), les vecteurs pBluescript, Page script, pNH8A ; pNH16a, pNH18a, pNH46A (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pKK223-3, pKK233-3, pDR540 et pRIT5 (commercialisés par la société Pharmacia) .
Des vecteurs particulièrement adaptés pour une expression dans cellules eucaryotes sont par exemple les vecteurs pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 et pSG (commercialisés par la société Stratagene), les vecteurs pSVK3, pBPV, pMSG et pSVL (commercialisés par la société Pharmacia)
Un premier vecteur préférentiellement mis en œuvre dans le cadre de l'invention est le vecteur pcDNA3 commercialisé par la société Invitrogen . Un second vecteur particulièrement préféré est le vecteur pBluescript SK (-), commercialisé par la société Stratagene.
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR322(ATCC37017) ou encore des vecteurs tels que pAA223-3 (Pharmacia, Uppsala, Suède), et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, Wl, ETATS-UNIS).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs psiX174, pBluescript SA, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTI, pSG(Stratagene). II peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATCC N0CRL 1711 ) dérivées de Spodoptera frugiperda.
Il peut encore s'agir de vecteurs adénoviraux tels que l'adénovirus humain de type 2 ou 5.
Dans d'autres modes de réalisation d'un milieu réactionnel, du second type (ii), ledit milieu réactionnel consiste en une composition acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention ou encore en une composition liquide comprenant un extrait enzymatique obtenu à partir d'une culture de cellules procaryotes ou eucaryotes produit une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
Par exemple, une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention peut être obtenue, à des degrés de purification variables, (i) soit à partir de cellules de l'un quelconque des organismes référencés dans le Tableau 1 qui produisent naturellement ladite enzyme, (ii) soit à partir de cellules recombinantes dans lesquelles a été inséré un acide nucléique codant ladite enzyme, et qui produisent ladite enzyme.
A titre illustratif, un milieu réactionnel acellulaire comprenant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase peut être préparé selon un procédé comprenant les étapes suivantes :
1) cultiver des cellules, recombinantes ou non recombinantes, produisant ladite enzyme ;
2) récupérer le surnageant de culture cellulaire comprenant l'enzyme excrétée par les cellules cultivées. 3) le cas échéant, enrichir le milieu obtenu à la fin de l'étape b) en 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase, par purification.
Selon une autre alternative, un milieu réactionnel acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase peut être préparé selon un procédé comprenant les étapes suivantes : 1 ) cultiver des cellules, recombinantes ou non recombinantes, produisant ladite enzyme ;
2) préparer un extrait cellulaire à partir des cellules cultivées à l'étape a) ; 3) le cas échéant, enrichir le milieu obtenu à la fin de l'étape b) en 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase, par purification.
A l'étape 2) ci-dessus, l'extrait cellulaire peut par exemple être préparé par broyage des cellules cultivées à l'étape 1 ), puis centrifugation du broyât cellulaire ainsi obtenu, afin de séparer les particules cellulaires solides indésirables et le liquide d'extraction qui contient la 2-déoxyribose- 5-phosphate aldolase en suspension. La centrifugation peut par exemple être réalisée à 800 g pendant une durée appropriée, par exemple allant de 1 à 30 minutes, préférentiellement de 15 à 25 minutes.
Le cas échéant, on peut ajouter au milieu réactionnel acellulaire enrichi en 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase un ou plusieurs composés inhibiteurs de protéases, afin de réduire ou bloquer l'éventuelle dégradation de la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase, susceptible de se produire lors de l'exécution du procédé pour la préparation par biosynthèse du composé de formule (I) qui est l'objet de l'invention. A l'étape a) du procédé de production du composé de formule (I), lorsque le milieu réactionnel consiste en une culture de cellules, recombinantes ou non recombinantes, produisant une DERA, les conditions de culture sont adaptées en fonction du type de cellules procaryotes ou eucaryotes qui sont utilisées. En général, on utilise des cultures de cellules procaryotes ou eucaryotes ayant une densité cellulaire correspondant à au moins une valeur de 2 D.O., et encore mieux d'au moins 3 D.O., la valeur d'absorbance étant mesurée à la longueur d'onde de 600 nanomètres.
La valeur en densité cellulaire de la culture de cellules utilisée à l'étape a) du procédé peut être aisément adaptée par l'homme du métier en fonction du type de cellules bactériennes utilisées, notamment de sa vitesse de croissance dans des cultures in vitro et de sa capacité à produire la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
A l'étape a) du procédé, l'acétone et le composé (II) sont avantageusement ajoutés à la culture cellulaire de manière sensiblement simultanée dans le temps. Toutefois, l'ordre d'addition de l'acétone et du composé de formule (II) aux cultures de cellules est indifférent.
L'étape a) du procédé selon l'invention, a une durée qui peut varier entre 10 heures et 10 jours, selon le milieu réactionnel utilisé et les quantités de produit de départ ajoutés au début de cette étape.
Comme cela est illustré dans les exemples, un haut niveau de production du composé de formule (I) est obtenu dès les premières heures après l'ajout des produits de départ au milieu réactionnel contenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase. Un pic de composé de formule (II) est observé après environ 6 heures à 30 heures suivant l'addition des produits de départ du milieu réactionnel, en particulier lorsqu'on utilise un milieu réactionnel cellulaire. Dans d'autres cas, on peut observer un pic de composé de formule (II) après plusieurs jours, par exemple après 5 à 10 jours suivants l'ajout des produits de départ au milieu réactionnel, en particulier lorsqu'on utilise un milieu réactionnel acellulaire.
Dans d'autres modes de réalisation, le procédé est réalisé en continu.
L'étape a) de bioconversion des produits de départ en composé de formule (I) est réalisée, pendant la durée choisie, à une température variant de 350C à 390C, de préférence de 360C à 380C. L'étape a) est réalisée de manière tout à fait préférée à une température d'environ 370C.
Comme déjà mentionné, on ajoute avantageusement dans le milieu réactionnel une quantité en poids d'acétone en excès, par rapport au poids de composé (II). A l'étape b), lorsque le milieu réactionnel consiste en un milieu acellulaire, ledit milieu réactionnel est récupéré selon toute technique connue, par exemple par simple aspiration.
A l'étape c), lorsque le milieu réactionnel consiste en une culture de cellules, le surnageant de culture peut être récupéré par toute technique connue de l'homme du métier. Il peut notamment être récupéré de manière conventionnelle, par centrifugation de la suspension de cellules procaryotes ou eucaryotes dans le milieu de culture, puis récupération du surnageant de centrifugation. Dans les modes de réalisation du procédé dans lesquels l'étape b) comprend une étape b1 ) et une étape b2) on réalise à l'étape b1 ) avantageusement de 1 à 5 cycles de congélation puis décongélation, et mieux de 1 à 3 cycles de congélation puis décongélation du surnageant de culture obtenu à l'étape c). Le procédé de l'invention peut être mis en œuvre avec succès en réalisant, à l'étape b1 ), un seul cycle de congélation puis décongélation du surnageant de culture obtenu à la fin de l'étape a).
Préférentiellement, le surnageant de culture est tout d'abord congelé à une température d'au moins -1O0C, mieux d'au moins -2O0C. Préférentiellement, on procède à une phase de décongélation lente d'une durée d'au moins 5 heures.
Préférentiellement, on procède à la décongélation lente du surnageant congelé, par exemple en plaçant le surnageant congelé à une température d'au moins + 40C, par exemple à la température de +80C, pendant une durée pouvant aller de 5 heures à 48 heures, mieux de 12 heures à 36 heures, par exemple pendant une durée de 18 heures à 24 heures.
L'étape b1 ) de réalisation d'au moins un cycle de congélation puis décongélation du surnageant de culture obtenu à la fin de l'étape c) est essentielle à l'obtention du composé (I). A la fin de l'étape b) du procédé, ou à l'étape b2) selon les modes de réalisation, le composé (I) contenu dans le surnageant de culture après décongélation peut être récupéré par toute technique connue de l'homme du métier notamment par tout procédé d'extraction liquide/liquide ou liquide/gaz appropriée.
On peut récupérer le composé de formule (I), à l'étape b), ou à l'étape b2) du procédé, notamment par une extraction liquide/liquide, par exemple dans une phase organique, tel que l'éther diéthylique ou des esters tel que l'acétate d'éthyle, ou encore dans tout solvant polaire non miscible à l'eau approprié. Avantageusement, lorsque l'on récupère le composé de formule (I) par un procédé d'extraction liquide/liquide, à l'étape b) du procédé, on utilise avantageusement un solvant acceptable pour l'obtention d'un produit final sous une forme compatible avec la réglementation régissant la mise sur le marché ou l'incorporation dans les produits alimentaires et cosmétiques des arômes naturels.
On peut également effectuer la récupération du composé de formule (I) à partir du surnageant de culture décongelé par toute technique de purification par chromatographie, y compris par chromatographie en phase inverse. Grâce au procédé de l'invention, on peut désormais obtenir facilement un précurseur aromatique de type phényl-3-butèn-2-one substitué en position para par un groupe Ri tel que défini ci-dessus, par simple bioconversion, et à partir de produits de départ qui peuvent être obtenus à partir de sources naturelles, notamment végétale. Notamment, grâce au procédé de l'invention, on peut obtenir le parahydroxyphényl-3-butèn-2-one, qui est un précurseur du composé cétone framboise, à partir du parahydroxybenzaldéhyde en présence d'acétone.
D'autres précurseurs de la cétone framboise peuvent également être obtenus en mettant en œuvre le procédé de l'invention avec d'autres produits de départ tels que le paraméthoxybenzaldéhyde ou anisaldéhyde. Dans ce dernier cas, le procédé comprend une étape additionnelle de conversion du composé (II) anisaldéhyde en parahydroxyphényl-3-butèn- 2-one, via une étape de déméthoxylation ou de déméthylation. Cette étape de déméthoxylation ou de déméthylation peut être réalisée par toute technique connue de l'homme du métier.
Par exemple, on peut utiliser la technique décrite par Lopretti et al. (Lopretti M et al. (1998) Déméthoxylation of lignin-model compounds with enzyme extracts from Gloeophilum trabeum. Proc. Biochem. 33:657-661 ). La technique décrite par Lopretti et al. inclut l'utilisation d'extraits enzymatiques de champignons fiamenteux pour la déméthoxylation des composés phénoliques. Dans la pratique, on incube une quantité appropriée d'un extrait enzymatique obtenu à partir d'un champignon filamenteux, par exemple de Gloeophilum trabeum, à la température de 280C, en présence du composé méthoxylé à transformer, puis on récupère le composé final déméthoxylé.
On peut aussi mettre en œuvre une technique similaire à celle décrite par Bossert et al. (Bossert et al. (1989) Anaerobic Oxidation of p- cresol mediated by a partially purified methylhydroxylase from a denitrifying bacterium. J. Bact. 171 :2956-2962), qui comprend une étape d'incubation d'une methylhydroxylase, à la température de 250C et en conditions anaérobies, puis une étape de récupération du composé final déméthoxylé.
Comme cela a déjà été mentionné précédemment dans la présente description, les composés (I) constituent des précurseurs de composés aromatiques. Tout particulièrement, le composé (I) dans lequel Ri est l'hydrogène, c'est-à-dire le parahydroxyphényl-3-butèn-2-one constitue un précurseur direct du composé cétone framboise.
De manière générale, on obtient la cétone framboise, à partir du parahydroxyphényl-3-butèn-2-one, par une réaction de déhydrogénation, par réduction chimique ou enzymatique du composé de formule (I) qui est obtenue à la fin de l'étape b), ou à la fin de l'étape b2) du procédé décrit ci-dessus.
En conséquence, la présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'un composé de formule (III) suivante :
Figure imgf000027_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un composé de formule (I) à partir d'un composé de formule (II) en réalisant le procédé tel que décrit ci-dessus, b) synthétiser le composé de formule (III) par réduction chimique ou enzymatique du composé de formule (I) obtenu à l'étape a).
Le composé aromatique de formule (III), y compris la cétone framboise, peut être obtenu, à l'étape b) du procédé ci-dessus, par réduction chimique classique, notamment à l'aide de tout procédé approprié mettant en œuvre un catalyseur d'hydrogénation, par exemple un catalyseur à base de nickel ou de palladium.
Selon un second aspect du procédé ci-dessus, la réduction du composé de formule (I) pour obtenir le composé de formule (III) peut être réalisée par voie enzymatique, par exemple selon la technique décrite dans la demande de brevet français N0FR 2.729.386 et dans la demande
PCT N0WO 96/21.739. Selon cette technique, le composé de formule (I) est incubé en présence d'une culture de cellule de levure Saccharomyces cerevisiae, ou encore d'un extrait protéique ou enzymatique de Saccharomyces cerevisiae. Puis, le surnageant de culture des cellules de Saccharomyces cerevisiae, ou le milieu réactionnel comprenant l'extrait enzymatique de Saccharomyces cerevisiae, est récupéré. Puis, le composé aromatique final de formule (III) est récupéré, par exemple par extraction liquide/liquide ou liquide/gaz ou encore par purification par chromatographie, y compris par chromatographie en phase inverse ou par chromatographie en phase gazeuse.
Par exemple, pour réaliser l'étape b) de synthèse du composé de formule (III) par réduction enzymatique du composé de formule (I) du procédé ci-dessus, l'homme du métier se référera avantageusement à la technique décrite dans la demande PCT N0WO 96/21.739. Selon cette technique, on ajoute tout d'abord 1 kg de levure de boulanger à un récipient à l'air libre comprenant, sous agitation, 2,5 litres d'eau et 100 g de D-glucose. La suspension est vigoureusement agitée à la température de 3O0C à 350C. Après le démarrage de la fermentation du glucose, on ajoute goutte à goutte en 10 minutes une solution de composé (I) puis, après le temps d'incubation approprié, par exemple de 48 heures, on procède à une extraction du composé de formule (III).
L'extraction du composé (III) peut être classiquement une extraction liquide/liquide, par exemple à l'aide de méthyltertiobutyléther.
Si on le souhaite, le résidu solide obtenu après évaporation du solvant peut être soumis à une étape de purification finale du composé de formule (III) par cristallisation du composé de formule (III) dans une solution d'acétate d'éthyle à laquelle on rajoute goutte à goutte de l'hexane. Si désiré, on peut procéder à une recristallisation du composé de formule (III), par exemple dans un mélange d'eau et de méthanol. A la place d'une culture de cellule de Saccharomyces cerevisiae, on peut utiliser un extrait protéique de levure tel que celui qui est commercialisé par la Société SIGMA sous la référence Y-2875, comme cela est décrit dans la demande PCT N0WO 96/21.739. Lorsque l'on met en œuvre le procédé ci-dessus en utilisant un composé de formule (I) dans lequel le groupe Ri signifie l'hydrogène, c'est-à-dire le composé parahydroxybenzaldéhyde, alors que le composé de formule (III) est le parahydroxyphényl-butan-2-one ou cétone framboise. Avec le même procédé, on obtient également la cétone framboise en tant que produit final en utilisant la paraméthoxybenzaldéhyde ou anisaldéhyde comme produit de départ.
La présente invention a également pour objet un kit pour la préparation par biosynthèse du composé de formule (I) suivant :
Figure imgf000029_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ledit kit comprenant : a) un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase; b) un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000030_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, et c) facultativement, de l'acétone ; et d) le ou les réactifs chimiques ou enzymatiques nécessaires à la conversion d'un composé de formule (I) en un composé de formule (III).
Préférentiel lement, dans le kit ci-dessus, le milieu réactionnel, le composé de formule (II) ,et éventuellement l'acétone, sont présentés dans des conteneurs séparés. Comme cela a déjà été décrit en détail précédemment dans la présente description, le milieu réactionnel peut consister (i) soit en des cellules, recombinantes ou non recombinantes, qui produisent une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention, (ii) soit en une composition acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention.
Un milieu réactionnel du type (i) ci-dessus peut consister en un milieu liquide comprenant des cellules, recombinantes ou non recombinantes, en culture. Il peut s'agir d'un milieu de pré-culture cellulaire, qui nécessite la mise en œuvre d'une étape de croissance des cellules préalablement à l'ajout du composé de formule (II) et de l'acétone. Il peut aussi s'agir d'un milieu réactionnel dans lequel la densité des cellules sont en nombre ou densité suffisantes pour débuter immédiatement le procédé de l'invention, par ajout des quantités appropriées du composé de formule (II) et de l'acétone. Alternativement, un milieu réactionnel du type (i) ci-dessus, tel que contenu dans un kit selon l'invention, peut consister en une composition solide comprenant les cellules, recombinantes ou non recombinantes, sous forme lyophilisées. La mise en œuvre du procédé de l'invention, à l'aide d'un kit comprenant un tel milieu réactionnel nécessite l'ajout d'un volume approprié milieu de culture à la composition solide, et, le cas échéant, une étape préalable de pré-culture cellulaire, afin de fournir un milieu réactionnel directement utilisable pour la mise en œuvre du procédé selon l'invention. Dans d'autres modes de réalisation d'un kit ci-dessus, un milieu réactionnel du type (ii) peut consister en une composition liquide comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention, en suspension.
Alternativement, le milieu réactionnel du type (ii) peut consister en une composition solide, par exemple une composition solide comprenant la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention, sous forme congelée ou lyophilisée.
Préférentiel lement, le kit ci-dessus se caractérise en ce que le composé de formule (II) consiste en un composé de formule (II) dans lequel Ri représente un atome d'hydrogène.
Selon un second aspect préférentiel dudit kit, le composé de formule (II) consiste en un composé de formule (II) dans lequel Ri représente le groupe -CH3.
L'invention a également pour objet un kit pour préparer un composé de formule (III) tel que défini dans la présente description, à partir d'un composé de formule (II) tel que défini dans la présente description, ledit kit comprenant : a) un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ; b) un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000032_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, c) facultativement, de l'acétone ;.et d) le ou les réactifs chimiques ou enzymatiques nécessaires à la conversion d'un composé de formule (I) en un composé de formule (III).
Préférentiel lement, dans le kit ci-dessus, le milieu réactionnel, le composé de formule (II) , éventuellement l'acétone, et le ou les réactifs nécessaires à la conversion d'un composé de formule (II) en un composé de formule (III), sont présentés dans des conteneurs séparés.
Le milieu réactionnel consiste en l'un quelconque des milieux réactionnels utilisables pour le kit décrit précédemment. Ainsi, le milieu réactionnel peut consister (i) soit en des cellules, recombinantes ou non recombinantes, qui produisent une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention, (ii) soit en une composition acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase conforme à l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier du kit ci-dessus, ledit kit comprend de plus un réactif enzymatique choisi parmi des cellules de Saccharomyces cerevisiae et un extrait enzymatique de Saccharomyces cerevisiae.
Selon un second mode de réalisation préféré du kit ci-dessus, ledit kit comprend un réactif chimique consistant en un catalyseur d'hydrogénation, par exemple un catalyseur à base de nickel ou un catalyseur à base de palladium. La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples qui suivent. FIGURES
La Figure 1 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de E. coli (Référence ATCC n° 86963).
- En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire.
- En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4- OH-Benzaldehyde (^) ou de 4-OH-Benzylidene acétone (B), exprimée en mg/l.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres. La Figure 2 illustre la production d'Anisylidène acétone à partir d'Anisaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de E. coli (Référence ATCC n° 86963).
- En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire. - En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration d'Anisaldéhyde (^) , exprimée en mg/l.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres, ou concentration d'Anisylidène acétone (B), exprimé en mg/l.
La Figure 3 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de E. coli K12. - En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire.
- En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4-
OH-Benzaldehyde (^) , exprimée en mg/l. - En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres, ou concentration de 4-OH- Benzylidène acétone (B)exprimée en mg/l.
La Figure 4 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus subtilis (Référence ATCC n° 31324).
- En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire.
- En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4- OH-Benzaldehyde (^) ou de 4-OH-Benzylidene acétone (B), exprimée en mg/l.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres. La Figure 5 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus subtilis (Référence CIP n° 52.65).
- En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire. - En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4-
OH-Benzaldehyde (^), exprimée en mg/l.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres, ou concentration de 4-OH- Benzilidène acétone (B) exprimée en mg/l.
La Figure 6 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus subtilis 168 (Référence ATCC n° 23857).
- En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire.
- En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4- OH-Benzaldehyde (^) ou de 4-OH-Benzylidene acétone (B), exprimée en mg/l.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres. La Figure 7 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus cereus (Référence CIP n° 54.9).
- En abscisse : temps de culture, exprimé en heures. La période entre le temps -5h et le temps Oh consiste en un temps de pré-culture cellulaire. - En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4-
OH-Benzaldehyde (^) ou de 4-OH-Benzylidene acétone (B), exprimée en mg/l.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : densité des cellules bactériennes (A), exprimé en Unités de Densité optique (DO) à la longueur d'onde de 600 nanomètres.
La Figure 8 illustre la production du 4-OH-Benzylidene acétone à partir de 4-OH-Benzaldéhyde et d'acétone, en présence d'un milieu réactionnel comprenant un extrait enzymatique de déoxyribose 5-phosphate aldolase provenant de Escherichia coli (Référence ATCC n° 86963).
- En abscisse : temps d'incubation, exprimé en jours.
- En ordonnées, sur l'échelle à gauche de la figure : concentration de 4- OH-Benzaldehyde (B)exprimée en mg/l. La courbe (u) supérieure illustre l'évolution de la concentration de 4-OH-Benzaldehyde en présence d'un milieu réactionnel comprenant 1 mg, exprimé en quantité de protéine, d'extrait cellulaire. La courbe (u) inférieure illustre l'évolution de la concentration de 4-OH-Benzaldehyde en présence d'un milieu réactionnel comprenant 5 mg, exprimé en quantité de protéine, d'extrait cellulaire.
- En ordonnées, sur l'échelle à droite de la figure : concentration de 4-OH-
Benzylidene acétone (•), exprimée en mg/l. La courbe (•) inférieure illustre l'évolution de la concentration 4-OH-Benzylidene acétone en présence d'un milieu réactionnel comprenant 1 mg, exprimé en quantité de protéine, d'extrait cellulaire. La courbe (•) supérieure illustre l'évolution de la concentration de 4-OH-Benzylidene acétone en présence d'un milieu réactionnel comprenant 5 mg, exprimé en quantité de protéine, d'extrait cellulaire.
EXEMPLES
A. MATERIEL ET METHODES A.1. Souches bactériennes.
On a utilisé les souches bactériennes suivantes: a) Escherichia coli (Référence ATCC n° 86963) ; b) Escherichia coli K12 (Référence ATCC n° 29425) c) Bacillus subtilis (Référence ATCC n° 31324 ; Référence DSM n° 704) d) Bacillus subtillis (Collection de l'Institut Pasteur -Référence CIP n° 52.65) e) Bacillus subtillis 168 (Référence ATCC n° 23857) ; et f) Bacillus cereus (Collection de l'Institut Pasteur - Référence CIP n° 54.9)
A.2. Milieux et conditions de culture Composition du milieu de préculture (OSP 1 litre) produits BioValley et Sigma pour les sels : peptone de viande (4,3g), NaCI (6,4g), le pH est ajusté à 7 (NaOH ou HCI).
Composition du milieu de culture (QSR 1 litre) produits Bio Balley et Sigma pour les sels : Extrait de levure (2g), FeSO4 - 7H2O (0,001g), CaCI2(O1OIg), CuSO-5H2O (0,01g), MgSO4 (O,8g), ZnSO4-H2O (0,01g), (NH4J2SO4 (5g) , K2HPO4-3H2O (1 ,32g), MnSO4-H2O (0,1g). Le pH est ajusté à 7 (NaOH ou HCI) et le milieu est autoclave à 1210C pendant 20 mn. Quand la température du milieu est redescendue à 6O0C on rajoute de la 2-Desoxyadenosine (Fluka) à une concentration finale de 1OmM. Toutes les cultures et précultures sont effectuées sur les milieux précédents à 3O0C en fiole d'Erlenmeyer de 5 litres contenant 500 ml de milieu et bouchées avec du coton cardé. L'agitation est de 130 agitations par minute. Les précultures sont effectuées pendant 16h jusqu'à une DO de 4 à 4,5 pour les deux souches. On ensemence le milieu de culture avec cette préculture à raison de 5%. Après 6h à 12h de préculture (DO de 2 à 3,5 environ, selon la souche étudiée), on ajoute les précurseurs (acétone (Sigma)) à 2% et le composé phénolique (Sigma) à 0,5g/l sous forme d'une solution éthanolique mère). L'ordre d'ajout n'a pas d'importance. Un prélèvement de 5 ml est effectué toutes les 4 heures. La DO est mesurée à 600 nm.
A.3. Préparation d'un extrait cellulaire comprenant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase.
L'extrait cellulaire a été obtenu à partir de cellules de la souche de Escherichia coli référencée à l'ATCC sous le n° 86963. Pour cette souche de E. coli, la production de 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase est induite en présence de substrat.
La première étape consiste donc à une étape d'induction de la production de 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase par les cellules en culture, d'une durée de 24 heures.
Après 24h de pré-culture de E. coli à une D. O. de 3,2, les cellules sont centrifugées, lavées 5 fois dans du tampon phosphate pH 7,4 puis broyées à la presse de French dans le même tampon additionné de benzamidine (1 mM), EDTA (2 mM), PMSF (1 mM) et DTT (1 mM). Après broyage, les extraits sont centrifugés à 8000xg pendant 15 minutes et le surnageant est conservé.
Les essais de production de composés de formule (I) sont réalisées avec cet extrait cellulaire, selon le protocole suivant :
- dans du tampon Triethanolamine 10OmM pH 8,1 + EDTA 1 mM, le composé de formule (II) et l'acétone sont ajoutés, ainsi que l'extrait enzymatique obtenu comme décrit ci-dessus.
- la réaction a lieu sous azote à 370C. Des ajouts réguliers de PMSF (1 mM) sont effectués pour limiter l'action des protéases.
- les échantillons contenant les produits finals de la réaction enzymatique sont extraits tel que décrit ci-dessous.
A. 3. Extraction et dosage :
Mesure de la biomasse :
5 ml de culture sont filtrés sur filtre 0,45 μm préalablement pesé. Le filtre est mis à sécher à 6O0C pendant 24h avant pesée finale. Lorsque nécessaire, une mesure de viabilité est effectuée par étalement sur le milieu de culture correspondant additionné de gélose
(15g/l).
Extraction des composés volatils
Les échantillons sont centrifugés 3000g pendant 15 minutes. Le surnageant est alors récupéré et congelé à -2O0C. Après décongélation lente (une nuit entre 40C et 80C) et après ajout de 40μl d'une solution de 1 ,4-Diméthoxybenzène à 1 g/l (Etalon Interne), le surnageant est extrait deux fois successivement avec 5 ml d'acétate d'éthyl (Carlo Erba). Les deux extraits sont alors réunis, séchés sur sulfate de sodium anhydre puis filtrés sur coton de verre et concentrés sous flux d'azote jusqu'à un volume de 500μl. Dosage des composés volatils
I μl d'extrait sont injectés sur une colonne DB5 (30m x 0.319mm) , épaisseur 0,25 μm (référence J & W US 1 477866H) . Gaz vecteur hélium ou hydrogène (vélocité 40.5 cm/seconde à 4O0C). Gradient de température de 40 à 240 °C/min.
Les composés sont quantifiés par rapport à l'étalon interne. A.4. Témoins de réaction
II a été vérifié qu'aucune production d'un composé final de formule (I) n'a été détectée, dans les conditions réactionnelles décrites ci-dessus, avec l'une quelconque des compositions témoin suivantes :
- Acétone 2% seule + milieu de culture + E. coli (ATCC 86963) ;
- 4-OH-benzaldehyde seul (0,5 g/1) + milieu de culture + E. coli (ATCC 86963) ; - Acétone (2%) + 4-OH-benzaldehyde (0,5 g/1) seuls + milieu de culture ;
- Culture seule de E. coli (ATCC 86963) ;
- DERA seule (origine Lactobacillus plantarum ;
B. RESULTATS
Exemple 1 : Production d'un composé de formule (I) en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules produisant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase.
Les résultats de la Figure 1 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH- Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de E. coli (ATCC 86963), en quantité significative (160 mg/ml).
Les résultats de la Figure 2 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit de l'Anisylidène acétone, à partir d'anisaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de E. coli (ATCC 86963), en quantité significative (6 à 10 mg/ml)
Les résultats de la Figure 3 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH- Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de E. coli K12, en quantité significative (environ 4 mg/ml).
Les résultats de la Figure 4 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH-
Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus subtilis (ATCC 86963), en quantité significative (environ 25 mg/ml).
Les résultats de la Figure 5 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH-
Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus subtilis (CIP 52.65), en quantité significative (environ 3,5 mg/ml).
Les résultats de la Figure 6 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH-
Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus subtilis 168, en quantité significative (environ 30 mg/ml).
Les résultats de la Figure 7 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH-
Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant des cellules de Bacillus cereus (CIP 54.9), en quantité significative (environ 30 mg/ml). Exemple 2 : Production d'un composé de formule (I) en utilisant un milieu réactionnel comprenant un extrait enzymatique de cellules de E. coli produisant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase. Les résultats de la Figure 8 montrent que, grâce au procédé de l'invention, on produit du 4-OH-Benzylidène acétone, à partir de 4-OH- Benzaldéhyde et d'acétone, en utilisant un milieu réactionnel comprenant un extrait enzymatique obtenu à partir de cellules de E. coli (ATCC 86963), en quantité significative. Plus particulièrement, les résultats de la Figure 8 montrent qu'avec une quantité d'extrait enzymatique comprenant 1 mg de protéines totales, on peut obtenir une concentration finale de 4-OH-Benzylidène acétone d'environ 2 mg/ml, après une durée de 5 jours de la réaction enzymatique.
Egalement, les résultats de la Figure 8 montrent qu'avec une quantité d'extrait enzymatique comprenant 5 mg de protéines totales, on peut obtenir une concentration finale de 4-OH-Benzylidène acétone d'environ 5 mg/ml, après une durée de 5 jours de la réaction enzymatique.
Tableau 1
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000043_0002
BACTERIES
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0003
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000044_0002
BACTERIES
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0003
Figure imgf000045_0001
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000045_0003
BACTERIES
Figure imgf000045_0002
Figure imgf000045_0004
TABLEAU 1 (suite)
Ref Organisme Score % Identité % Positif % Gap Longueur séquence (a.a.) (N" d'accès)
BACTERIES
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000046_0002
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000047_0001
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000048_0002
BACTERIES
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000048_0003
TABLEAU 1 (suite)
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000049_0002

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour la préparation par biosynthèse du composé de formule (I) suivant :
Figure imgf000050_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) ajouter :
(i) un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000050_0002
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, et
(ii) de l'acétone, dans un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5- phosphate aldolase ; et b) récupérer le composé de formule (I), à partir du milieu obtenu à la fin de l'étape a).
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé de formule (II) est tel que Ri représente un atome d'hydrogène.
3. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le composé de formule (II) est tel que Ri représente un groupe -CH3.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape a), on ajoute dans le milieu réactionnel une quantité en poids d'acétone en excès, par rapport au poids de composé (II).
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'étape b) comprend les étapes suivantes : b1 ) réaliser au moins un cycle de congélation puis décongélation du milieu obtenu à la fin de l'étape a) ; b2) récupérer le composé de formule (I) à partir du milieu décongelé obtenu à la fin de l'étape b1).
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que, pour chaque cycle de congélation puis décongélation de l'étape b1 ), la phase de décongélation consiste en une décongélation lente d'une durée d'au moins 5 heures.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'à l'étape b2), le composé de formule (I) est récupéré par extraction à l'aide d'un solvant choisi parmi l'éther diéthylique, l'acétate d'éthyle ou encore tout solvant polaire non miscible à l'eau.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase possède une séquence d'acides aminés ayant au moins 30 % d'identité avec la séquence d'acides aminés SEQ ID N°1
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que la 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase possède une séquence d'acides aminés coisie parmi les séquences SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase est codée par un acide nucléique provenant d'un organisme procaryote d'une espèce choisie parmi Escherichia coli, Bacillus , Pseudomonas, Streptomyces, Corynebacterium et Shewanella.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase est codée par un acide nucléique provenant d'un organisme procaryote choisi parmi Escherichia coli K12, Escherichia coli CFT073, Shigella flexneri, Salmonella enterica subsp. enterica, Vi brio cholerae, Yersinia pestis, Yersinia pseudotubercolis, Photobacterium profundum, Vibrio fischeri, Erwinia carotovora, Actinobacillus pleuropneumoniae, Colwellia psychererythraea, Shewanella baltica, Shewanella amazonensis, Shewanella frigidimarina, Shewanella denitrificans, Chromohalobacter salexigens, Burkholderia pseudomallei, Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, Pseudomonas syringae pv. tomato, Idiomarina loihiensis, Pseudomonas syringae pv. Syringae, Magnetospirillum magnetotacticum, Streptomyces coelicolor, Streptomyces avermitilis, Coxiella burnetii, Nocardioides sp. JS614, Paracoccus denitrificans, Mesorhizobium sp. BNC1 , Silicibacter sp. TM 1040, Rhodobacter sphaeroides, Bacteroides thetaiotaomicron, Francisella tularensis, Bacteroides fragilis, Silicibacter pomeroyi, Burkholderia fungorum, Jannaschia sp. CCS 1 , Porphyromonas gingivalis, Legionella pneumophila, Treponema denticola, Bacillus cereus, Geobacillus kaustophilus, Bacillus halodurans, Solibacter usitatus, Streptococcus suis, Bacillus licheniformis, Listeria monocytogenes, Deinococcus geothermalis, Chloroflexus aurantiacus, Rubrobacter xylanophilus, Desulfitobacterium hafniense, Arthrobacter sp. FB24, Bacillus clausii, Rhodospirillum rubrum, Staphylococcus haemolyticus, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Bacillus subtilis, Symbiobacterium thermophilum, Thermococcus kodakarensis et Exiguobacterium sp. 255-15.
12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que la 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase est codée par un acide nucléique provenant d'un organisme eucaryote appartenant à une espèce choisie parmi Homo sapiens, Gallus gallus, Canis familiaris, Mus musculus, Caenorhabditis elegans, Anophèles gambiae, Danio rerio, Xenopus tropicalis, Plasmodium chabaudi, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Apis mellifera, Drosophila melanogaster, Entamoeba histolytica, Aspergillus fumigatus, Strongylocentrotus purpuratus, et Aspergillus nidulans.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le milieu réactionnel consiste en une culture de cellules procaryotes ou eucaryotes produisant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cellules procaryotes ou eucaryotes consistent en des cellules produisant naturellement une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les cellules procaryotes ou eucaryotes consistent en des cellules recombinantes dans lesquelles a été inséré un acide nucléique codant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase.
16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que le milieu réactionnel consiste en une composition acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que le milieu réactionnel consiste en une composition liquide comprenant un extrait enzymatique obtenu à partir d'une culture de cellules procaryotes ou eucaryotes produisant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
18. Procédé selon l'une des revendications 1 et 3 à 17, caractérisé en ce que lorsque le groupe Ri du composé (II) signifie -CH3, le procédé comprend une étape additionnelle c) de conversion dudit composé (II) en p-hydroxyphényl-3-butèn-2-one.
19. Procédé d'obtention d'un composé de formule (III) suivante :
Figure imgf000054_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un composé de formule (I) à partir d'un composé de formule (II) en réalisant le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18; b) synthétiser le composé de formule (III) par réduction chimique ou enzymatique du composé de formule (I) obtenu à l'étape a).
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le composé de formule (II) possède un groupe Ri qui signifie l'hydrogène ou un groupe -CH3, et en ce que le composé de formule (III) est le p- hydroxyphényl-butan-2-one.
21. Kit pour la préparation par biosynthèse du composé de formule (I) suivant :
Figure imgf000055_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, ledit kit comprenant : a) un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ; b) un composé de formule (II) suivante :
Figure imgf000056_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, et c) facultativement, de l'acétone.
22. Kit selon la revendication 21 , caractérisé en ce qu'il comprend un composé de formule (II) dans lequel Ri représente un atome d'hydrogène.
23. Kit selon la revendication 21 , caractérisé en ce qu'il comprend un composé de formule (II) dans lequel Ri représente -CH3.
24. Kit selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que le milieu réactionnel consiste en une composition comprenant des cellules procaryotes ou eucaryotes produisant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
25. Kit selon l'une des revendications 21 à 23, caractérisé en ce que le milieu réactionnel consiste en une composition acellulaire comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
26. Kit pour préparer un composé de formule (III) tel que défini dans la revendication 19, à partir d'un composé de formule (II) tel que défini dans la revendication 1 , ledit kit comprenant : a) un milieu réactionnel comprenant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase ; b) un composé de formule (II) suivante
Figure imgf000057_0001
dans laquelle Ri représente l'hydrogène ou un groupe alkyle linéaire ou ramifié non substitué ayant de 1 à 4 atomes de carbone, c) facultativement, de l'acétone, et d) le ou les réactifs chimiques ou enzymatiques nécessaires à la conversion d'un composé de formule (I) en un composé de formule (III)
27. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que le milieu réactionnel consiste en une culture de cellules procaryotes ou eucaryotes produisant une 2-déoxyribose-5-phosphate aldolase.
28. Kit selon la revendication 26, caractérisé en ce que le milieu réactionnel consiste en une composition liquide comprenant une 2- déoxyribose-5-phosphate aldolase.
29. Kit selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif enzymatique choisi parmi des cellules de Saccharomyces cerevisiae et un extrait enzymatique de Saccharomyces cerevisiae.
30. Kit selon l'une quelconque des revendications 26 à 28, caractérisé en ce qu'il comprend un réactif chimique consistant en un catalyseur d'hydrogénation.
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Cited By (2)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105198720A (zh) * 2015-10-29 2015-12-30 广西万山香料有限责任公司 一种由天然等同物大茴香醛合成覆盆子酮的生产线
CN114933997A (zh) * 2022-06-13 2022-08-23 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一株珊瑚来源的共生链霉菌sh001及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2724666B1 (fr) * 1994-09-19 1997-01-17 Bfa Lab Production par bioconversion de cetone framboise
FR2776301B1 (fr) * 1998-03-20 2000-11-10 Pernod Ricard Bioconversion de cetone framboise
AU2003263031A1 (en) * 2002-09-20 2004-04-08 Diversa Corporation Chemoenzymatic methods for the synthesis of statins and stain intermediates

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105198720A (zh) * 2015-10-29 2015-12-30 广西万山香料有限责任公司 一种由天然等同物大茴香醛合成覆盆子酮的生产线
CN114933997A (zh) * 2022-06-13 2022-08-23 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一株珊瑚来源的共生链霉菌sh001及其应用
CN114933997B (zh) * 2022-06-13 2023-06-23 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 一株珊瑚来源的共生链霉菌sh001及其应用

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