WO2007076839A1 - Method for determining a movement parameter for fluorochromes in a surrounding medium - Google Patents

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WO2007076839A1
WO2007076839A1 PCT/DE2006/002329 DE2006002329W WO2007076839A1 WO 2007076839 A1 WO2007076839 A1 WO 2007076839A1 DE 2006002329 W DE2006002329 W DE 2006002329W WO 2007076839 A1 WO2007076839 A1 WO 2007076839A1
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series
fluorochromes
diffusion
measurements
surrounding medium
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PCT/DE2006/002329
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Inventor
Michael Schaefer
Astrid Tannert
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Charite - Universitätsmedizin Berlin
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence

Definitions

  • the invention relates to a method for determining a motion parameter for fluorochromes in a surrounding medium.
  • the mobility of fluorescent molecules can, in many respects, provide information on the one hand about the properties of a molecule, macromolecule or protein body linked to the fluorochrome and, on the other hand, about the surrounding environment.
  • fluorochrome fluorescent molecules
  • binding states of a protein body, a complex formation or homo- or heterophilic oligomerization can be detected via the determination of lateral fluorochrome mobilities and used for the analysis of cellular functional states.
  • Lateral motility of fluorochromes may be accomplished by local bleaching and observation of subsequent fluorescence recovery, with recovery due to lateral movement of non-bleached fluorochromes into the previously bleached zone (D. Axelrod et al., Biophys J. , 16, 1055-1069 (1976)).
  • This common technique is also referred to as FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), where data acquisition can be done only in the bleached area, in a line that passes over the bleached spot, or in two- or three-dimensional imaging procedures.
  • this may include either exact knowledge of the diameter of the bleached point, the assumption that the amount of faded fluorochrome is negligibly small in relation to the total amount of fluorochrome, an assumption that the fluorochrome In fact, in the bleached spot, it has in fact completely bleached out, an assumption that the environment of the bleached point has a homogeneous fluorochrome distribution and is significantly larger in relation to the bleached point.
  • the object of the invention is to provide an improved method for determining a motion parameter for fluorochromes in a surrounding medium, in which the above-described disadvantages of the prior art are avoided.
  • Fluorescence values I " j (x t , y j ⁇ t") for different positions (x ⁇ _, yj) in FIG. 1 comprise an examination region of the surrounding medium
  • Extending the first experimentally determined series of measurements P 1 to twice the width corresponds to an extension to a double image width compared to the width of the images in the photobleaching examination, which can also be indicated by means of a number of image pixels or points.
  • the assumption is that the measured values for the intensity found at the image edges continue into subsequent image pixels which are not measured and are located outside the image recording region.
  • the measurement series can also be normalized, in which case the normalization value 1 is assigned to all unmeasured pixels.
  • An extension to a larger width is possible. However, it has been shown that this hardly any optimization effects can be achieved.
  • the mathematical convolution including the summation included, is then performed using all values of the extended series of measurements.
  • the result of the method is then output by the computer-based analysis device, for example to a file or via a screen.
  • the determination can each use time ranges within which large gradients undergo a motion-dependent recovery and thereby promote maximum robustness of determination with low sample loading, secondly For example, normalization techniques that are capable of compensating for local inhomogeneities in fluorochrome signal intensity are less disturbed by slow changes in local inhomogeneity, such as due to cell movement, and thirdly, a rapid succession of independent determinations of motion parameters, either by averaging, can further the accuracy of determination increase or be used for a time-resolved determination of fluorochrome mobility and thus for the analysis of mobility-based bioindicators.
  • An expedient embodiment of the invention provides that a multidimensional diffusion distribution function or a Gaussian distribution is used as the diffusion distribution function G.
  • a Gaussian function is preferably used for a one-dimensional case, in particular when the diffusion in the test sample being examined is sufficiently fast.
  • integral can be used via an error function, which is a solution to the problem Difference equation for an extended source as a distribution function corresponds, in particular in its two-dimensional form.
  • the diffusion distribution function is then determined for multi-dimensional output pixels G (x, y, z, t, D ') which are derived from multiple spatial locations. Positional parameters depends, for example, x, y, z in the case of a movement (diffusion) in three dimensions, the time t and a motion parameters D 'to be optimized.
  • a preferred embodiment of the invention provides that deviation squares are minimized in the minimization method.
  • an embodiment of the invention provides that a plurality of motion parameters are determined, which are optionally diffusion coefficients for the fluorochromes. Also in the calculation of several motion parameters D k (k> 1), depending on the application, the use of a one-dimensional or a multi-dimensional distribution function can be provided.
  • the diffusion distribution function is composed of the sum of k single distribution function for a plurality of motion parameters D k , each of which has an amplitude a ⁇ .
  • the folding takes place by summing up values of the diffusion distribution function G weighted with the intensities of the measurement series P 1 , which in the example chosen are two-dimensional, over all location coordinates or positions and corresponding to the further measured measurement series P 1 with their temporal parameter.
  • the determined motion parameter D or the determined motion parameters D k are output by the computer-based evaluation device by providing a corresponding electronically evaluable information that can be stored, for example, in a file, displayed on a screen or printed by a printer.
  • Figure 2 is a plot of intensity versus distance for a simulated distribution (gray bars) of the fluorochromes for a single intensity (white bar) from the series of measurements in Figure 1;
  • FIG. 3 shows a graph of the intensity as a function of the distance for a family of curves simulated distributions of the fluorochromes for the individual intensities from the series of measurements in FIG. 1;
  • FIG. 4 is a plot of intensity vs. distance for summed values of the simulated distributions in FIG. 3;
  • Fig. 5 is a plot of intensity versus distance for accumulated values of the simulated distributions before and after applying a constraint that the portions of the gaussian functions shown in Fig. 1 outside the region of interest measured at the edges of the examination region is mirrored and summed up to the values or the series of measurements has been extended to the left and right according to the boundary values assuming a homogeneous intensity distribution;
  • Fig. 7 is a graph of YFP fluorescence intensity versus time
  • Fig. 8 is a graph of CFP fluorescence intensity versus time; 9 shows a graphic representation of an experimentally determined fluorescence signal F YF P as a function of the distance;
  • FIG. 11 is a graphical representation of experimental results of the quotient F YFP / F CFP as a function of the distance for the experimentally determined fluorescence signals from FIGS. 9 and 10;
  • Fig. 13 is a graph showing the sum of deviation squares in response to a lateral mobility ⁇
  • FIG. 14 is a graph showing the lateral mobility ⁇ as a function of time
  • Fig. 15 are views for the study of the activation of a G ⁇ -coupled receptor using the fluorescent biosensor GRP1 (PH);
  • FIG. 16 shows representations of a Gq-coupled activation with subsequent translocation of a biosensor PLC ⁇
  • FIG. 17 shows representations of a Gs-coupled signal cascade leading to the translocation of a specially developed biosensor
  • FIG. 18 depicts a translocation of Grb2 mediated by activation of receptor tyrosine kinases
  • FIG 19 shows representations for a stimulation of the endogenous EGF receptor in vascular smooth muscle cells and subsequent translocation of the biosensor GRP1 (PH).
  • a method for determining a motion parameter D for fluorochromes in a surrounding medium in a computer-based evaluation, in particular for determining a diffusion coefficient, using measurement results of a photobleach test on a sample with the fluorochromes in described the surrounding medium is first explained in general terms, to then apply it to experimental measurement results.
  • the method explained below for determining the motion parameter D from the experimentally obtained measured data does not make any assumptions about the diameter, shape and quantity of the faded area in the test sample or the fluorochromes contained therein. Therefore, the bleached area may have any shapes and sizes.
  • bleaching pulses can also be applied repeatedly, wherein in the subsequent evaluation of the experimentally determined measurement data each bleaching pulse can be assigned an independent determination of the diffusion coefficient.
  • the spatially resolved determination of the fluorochrome signal intensity is preferably carried out in a fluorescence microscope using a laser scanning method, by CCD cameras or comparable line or area sensors.
  • the time resolution of the data acquisition should be sufficiently high in order to record several data sets or measurement series as possible in relation to the rate of recovery of the fluorochrome signal intensity after the bleaching pulse.
  • a typical application example is fluorescent fusion proteins, wherein the same protein with different color variants of those from Aequora victoria or Discosoma spp. derived fluorescent proteins is linked.
  • a double fusion with two different colored fluorescent proteins can be used, in which case the stoichiometry of both fluorescence proteins is fixed and the ratiometric normalization (eg acceptor fluorescence / donor fluorescence) by fluorescence resonance energy transfer to a further amplification of the ratiometrically determined gradients after fading of the acceptor leads.
  • the bleaching pulse is generated by means of a laser, which can be modulated in intensity, for example with the aid of an acousto-optical filter (AOTF).
  • AOTF acousto-optical filter
  • the measured data sets are recorded spectrally separated, wherein the fluorochrome separation in the excitation or / and E- mission domain can be done by means of suitable excitation and emission wavelengths.
  • the fluorochrome separation in the excitation or / and E- mission domain can be done by means of suitable excitation and emission wavelengths.
  • either a simple quotient formation can take place between measurement data sets which predominantly represent the bleached or reference fluorochrome or an upstream spectral separation (cf., for example, DE 199 15 137) and subsequent quotient formation.
  • the intensity recorded for a volume element or a surface element (pixel) of the examination medium. signal is proportional to the fluorochrome present there and concentrated in the volume / area element. Accordingly, an intensity profile of a series of measurements is composed of a summation of the signals which are idealized in each case in individual pixels.
  • the diffusion equation for an extended source for determining the diffusion distribution must be taken into account.
  • a concentration of the measured pixel intensities can be assumed in one point, which leads to a simplified solution of the diffusion equation and thus to a minimization of the computational effort.
  • FIG. 1 shows a graphic representation of a distribution of fluorescence intensities /, "(x t , t"), at a measurement time t "in the one-dimensional case over distances x ;
  • Fig. 1 Define locations in the examination area measured during the photobleaching study. Clearly visible in Fig. 1 is a bleached area of distribution in which the intensities are less than outside the bleached area.
  • the measured time scales and the known distances x t between the examination sites can furthermore be used to calculate how the fluorochromes would have to disperse after a time interval which corresponds to the actual recording interval.
  • a Gaussian function G is used. The Gaussian function G is directly dependent on the motion parameter D:
  • the distribution is now determined for distance steps x, which correspond to the pixel / measurement distances used in the photobleach test.
  • the distribution determination is now carried out over all the pixel / intensities of the measurement series from Fig. 1 (see Fig. 3), wherein the determined values are summed for all distances, so that a first simulated profile results, which is shown in Fig. 4 .
  • a reflection is simulated as a boundary condition or, alternatively, the intensity of the outermost measurement data lying within the examined range continues beyond the recording range (FIG. 5) or, in the case of standardized measurement series, the value 1 is assigned to the pixels outside the measuring range , It is thus obtained a highly accurate simulation of the diffusion over the entire range at a given diffusion coefficient, the shape and the homogeneity of the faded region is irrelevant.
  • the sum of the intensities obtained in the simulation is formed, and the simulation data is normalized to the sum of the fluorescence signals found in the measurement. Thus, there are no sum differences that could lead to an offset of the signal height compared to the measured data.
  • the simulation procedure is carried out for all the series of measurements following the first series of measurements, the first series of measurements serving as a starting point for the simulation at different times.
  • the respectively measured data set or the previously simulated data set can serve as a template, whereby the simulation is performed for only one time step, namely the time difference between the elevation of the measurement series. It should be noted, however, that a high measurement noise would have a disturbing influence or accumulate rounding errors.
  • the predetermined motion parameter D is varied so that the sum of the deviation squares becomes minimal.
  • minimization methods are used, as described, for example, by Brent (RP Brent: Algorithms for minimization without derivatives, in Prentice-Hall series in automatic configuration), Chapter 3/4, Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall (1973)).
  • the determination of the lateral diffusion coefficient for all bleaching pulses and / or all areas is carried out, as a result of a time course of molecular mobility or a statistical determination of the mobility in different areas reach, for example in several cells or in different cell compartments.
  • a global analysis of all bleaching pulses with respect to the values of the several movement parameters is offered, while the amplitudes of the respective movement parameters are determined separately for each bleaching pulse.
  • a live fibroblast cell expressing an intramolecularly fused CFP -YFP fusion protein was excited with a 458 nm argon multi-line laser through a 100 x 1.45 objective, and fluorescence emission was observed after passage recorded by a confocal pinhole at eight different emission wavelengths in the range between 482 nm and 566 nm and separated by spectral segregation into the signals of CFP and YFP fluorochromes (see Fig. 6).
  • the image components scanned in rapid succession in the sequence covered an inhomogeneous portion of the cytosol ("measuring range" in FIG. 6), which already leads without bleaching pulse to a non-horizontal intensity profile of the individual fluorochromes (see the drawn horizontally aligned region in FIG. After every 30 image cycles, a region of maximum intensity of the 488 nm and 514 nm lines of the argon laser was irradiated for a short time in the center of the image ("bleached area" in Fig. 6) to locally and selectively fluoresce the YFP content in the Bleach fusion protein.
  • the fluorescence intensities averaged over the image height yield intensity profiles which have a strongly corrugated shape due to cellular compartments and cell boundaries both for the partially bleached YFP in the middle of the image (FIG. 9) and for the non-bleached CFP (FIG. 10) and thus unsuitable for are a purely intensity-based FRAP analysis. Shown are the measuring cycles directly after the second bleaching pulse and some subsequent measuring cycles. After forming a quotient of the two fluorochrome signals, the inhomogeneities equalize ( Figure 11), and the measurement data set can serve as a template for the simulation.
  • the method described can also be carried out in a two-dimensional version.
  • the convolution then takes place with the solution of the two-dimensional diffusion equation.
  • the method can be extended to the determination of several motion parameters, namely the determination of diffusion coefficients of spectrally identical fluorochromes which diffuse at different speeds.
  • the solution of the diffusion equation for different diffusion coefficients is folded with the first measurement series P 1 .
  • the use of the method explained above for an embodiment for determining two diffusion coefficients is explained in more detail below with reference to FIGS. 15 to 19.
  • the measured data were two-dimensional images, which were determined with the aid of a confocal laser scanning microscope.
  • two diffusion coefficients for repeated FRAP measurements are determined by means of the method described above.
  • the investigated fluorescent proteins, which serve as biosensors for different signaling pathways, can in these cases be localized in two different organelles, where a different diffusion coefficient results due to the different local viscosities. If the diffusion coefficients are determined globally for all FRAP measurements in a cell and the proportions of the diffusion coefficients for each of the repetitive measurements, a quantitative image results which describes the translocation of the respective biosensor and thus the activation of a signal path.
  • FIGS. 15 to 19 the signal transduction pathways are shown schematically in the upper part, respectively. Measured fluorescence images at different times before (0 min) or after stimulation with the corresponding agonist (bar corresponds to 5 ⁇ m) are then shown for the investigated signal paths. The individual signaling pathways were then analyzed by the method described above. For each representative measurement, the course of the membrane association resulting from this model for the respective biosensor is shown. This proportion corresponds to the amplitude of the slower diffusion coefficient, which was determined globally by the method described above. The time of addition of the agonist is indicated in these representations with an arrow.
  • Fig. 15 shows illustrations of an embodiment in which HEK293 cells were transfected with plasmids for YFP-GRP1 (PH), plO1 and plOI ⁇ subunits of PI3 kinase ⁇ and the fMLP receptor.
  • the fluorescent biosensor YFP-GRP1 (PH) is mainly located in the cytoplasm in quiescent cells and, after stimulation with 1 ⁇ M fMLP (activation of G ⁇ ), is bound to PI (3,4,5) P3 formed in the plasma membrane, from where it is redistributed to the cytoplasm during the course of the experiment.
  • PI 1,4,5
  • Figure 16 shows plots for stimulating HEK293 cells expressing YFP-PL ⁇ (PH) and the Gq-coupled histamine HI receptor with 5 ⁇ M histamine, resulting in a transient redistribution of the biosensor from the plasma membrane to the cytoplasm. Diffusion coefficients of 20 ⁇ m 2 / s for the fast cytosolic fraction and 0.61 ⁇ rnVs for the slower membrane-associated fraction were obtained as motion parameters.
  • Fig. 17 shows representations of a biosensor indicating the stimulation of cAMP-dependent protein kinase (PKA) by redistribution.
  • PKA cAMP-dependent protein kinase
  • HEK293 cells were transfected in addition to the described plasmids with the Gs-coupled vasopressin V2 receptor. After addition of 1 ⁇ M AVP, the fluorescent biosensor YFP-PKA (catalytic subunit ⁇ ) was redistributed from the plasma membrane (diffusion coefficient of 0.3 ⁇ m 2 / s) into the cytosol (diffusion coefficient of 6.5 ⁇ m 2 / s).
  • FIG. 18 shows representations of Grb2, which serves as an example of a protein redistributed by a receptor tyrosine kinase and which has been fluorescently labeled with YFP.
  • an expression plasmid for the EGF receptor was transfected into HEK293 cells.
  • the biosensor is located in unstimulated cells in the cytoplasm and nucleus and, after stimulation with 100 ng / ml EGF, is bound to the EGF receptor and thus to the plasma membrane.
  • diffusion coefficients of 6.5 ⁇ m 2 / s were determined for the cytoplasmic fraction and 0.43 ⁇ m 2 / s for the membrane-associated fraction.
  • Figure 19 shows plots for stimulation of the endogenous EGF receptor in vascular smooth muscle cells which, in turn, could be detected by transfection with fluorescent GRPL-PH spike.
  • EGF endogenous EGF receptor
  • a temporary membrane association was achieved, which binds Grpl to the resulting PI (3,4,5) P3.
  • the diffusion coefficients here were 16 ⁇ m 2 / s for the cytosolic fraction and 0.51 ⁇ m 2 / s for membrane-bound protein.

Abstract

The invention relates to a method for determining a movement parameter (D) for fluorochromes in a surrounding medium in a computer-based evaluation unit, especially for determining a diffusion coefficient, with the aid of test results of a photobleaching analysis on a test sample comprising said fluorochromes in the surrounding medium. The inventive method comprises the following steps: experimentally determined series of measurements Pn = {(formula I (n = 1, 2,...; i = 1, 2,....; j = 1, 2,....) of the photobleaching analysis are provided in the evaluation unit, said experimentally determined series of measurements Pn = {(formula I encompassing respective fluorescence values (formula I) (xi, yj tn) for different positions (xi, yj) in a test range of the surrounding medium at different measurement times tn; a diffusion distribution function G is provided which depends on the different positions (xi, yj), the timet, and a movement parameter D' that is to be optimized; diffusion distribution function G values are determined for the movement of the fluorochromes that is to be analyzed in the surrounding medium for the movement parameter D' that is to be optimized; a first experimentally determined series of measurements P <SUP>1</SUP>

Description

Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium Method for determining a motion parameter for fluorochromes in a surrounding medium
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium.The invention relates to a method for determining a motion parameter for fluorochromes in a surrounding medium.
Hintergrund der ErfindungBackground of the invention
Die Beweglichkeit fluoreszierender Moleküle (Fluorochrom) kann in vielfacher Hinsicht Informationen einerseits über Eigenschaften eines mit dem Fluorochrom verknüpften Moleküls, Makromoleküls oder Eiweißkörpers und andererseits über das umgebende Milieu erbringen. So können beispielsweise Bindungszustände eines Eiweißkörpers, eine Komplexbildung oder homo- oder heterophile Oligomerisierung über die Bestimmung lateraler Fluorochrombeweglichkeiten erfaßt und zur Analyse zellulärer Funktionszustände genutzt werden.The mobility of fluorescent molecules (fluorochrome) can, in many respects, provide information on the one hand about the properties of a molecule, macromolecule or protein body linked to the fluorochrome and, on the other hand, about the surrounding environment. Thus, for example, binding states of a protein body, a complex formation or homo- or heterophilic oligomerization can be detected via the determination of lateral fluorochrome mobilities and used for the analysis of cellular functional states.
Die laterale Beweglichkeit von Fluorochromen kann mit Hilfe eines lokalen Ausbleichens und der Beobachtung der dann nachfolgenden Fluoreszenz-Erholung erfolgen, wobei die Erholung durch eine laterale Bewegung nicht geblichener Fluorochrome in die zuvor ausgeblichene Zone bedingt ist (D. Axelrod et al., Biophys J., 16, 1055-1069 (1976)). Diese allgemeine Technik wird auch als FRAP {fluorescence Recovery After Photobleaching") bezeichnet. Die Meßdatenaufzeichnung kann hierbei entweder nur im geblichenen Punkt erfolgen, in einer Linie, die den geblichenen Punkt überstreicht oder in zwei- oder dreidimensionalen bildgebenden Verfahren.Lateral motility of fluorochromes may be accomplished by local bleaching and observation of subsequent fluorescence recovery, with recovery due to lateral movement of non-bleached fluorochromes into the previously bleached zone (D. Axelrod et al., Biophys J. , 16, 1055-1069 (1976)). This common technique is also referred to as FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), where data acquisition can be done only in the bleached area, in a line that passes over the bleached spot, or in two- or three-dimensional imaging procedures.
Die bislang etablierten Verfahren zur Bestimmung der lateralen Bewegung eines Fluorochroms (vgl. beispielsweise T. Tsay et al., Biophys J., 60, 360-368 (1991); U. Kubitscheck et al., Biophys J., 61, 948-956 (1994); P. Wedekind et al., Biophys J., 71, 1621-1632 (1996); Y. Sniekers et al.:, Biophys J., 89, 1302-1307 (2005)) gehen von verschiedenen Vorbedingungen aus, ohne die eine nachfolgende Ermittlung der Beweglichkeit nicht zulässig wäre. Hierzu gehören je nach Verfahren entweder die genaue Kenntnis des Durchmessers des geblichenen Punktes, die Annahme, daß die Menge des ausgeblichenen Fluorochroms im Verhältnis zur gesamten Fluorochrom-Menge vernachlässigbar klein ist, eine Annahme, daß das Fluoroch- rom im geblichenen Punkt tatsächlich vollständig ausgeblichen wurde, eine Annahme, daß die Umgebung des geblichenen Punktes eine homogene Fluorochrom- Verteilung besitzt und in Relation zum geblichene Punkt deutlich größer ist.The previously established methods for determining the lateral motion of a fluorochrome (see, for example, T. Tsay et al., Biophys J., 60, 360-368 (1991), U. Kubitscheck et al., Biophys J., 61, 948- 956 (1994); Wedekind, P. et al., Biophys J., 71, 1621-1632 (1996); Y. Sniekers et al., Biophys J., 89, 1302-1307 (2005)) have various preconditions without which a subsequent determination of mobility would not be allowed. Depending on the process, this may include either exact knowledge of the diameter of the bleached point, the assumption that the amount of faded fluorochrome is negligibly small in relation to the total amount of fluorochrome, an assumption that the fluorochrome In fact, in the bleached spot, it has in fact completely bleached out, an assumption that the environment of the bleached point has a homogeneous fluorochrome distribution and is significantly larger in relation to the bleached point.
Neben diesen Randbedingungen liegt ein weiterer Nachteil bekannter Verfahren darin, daß räumlich aufgelöste Meßdatensätze nicht oder nur zum Teil in die Berechnungen einfließen und somit die Genauigkeit der Bestimmung erhöhen können. Mit Hilfe einer ,/ast-Fourier- Analyse" wurde dieser Nachteil nur teilweise kompensiert (vgl. T. Tsay et al., Biophys J., 60, 360-368 (1991)), da die Anwendung dieses Verfahrens eine homogene Fluorochrom- Verteilung vor dem Ausbleichen erfordert.In addition to these boundary conditions, a further disadvantage of known methods is that spatially resolved measured data records do not or only partially contribute to the calculations and thus can increase the accuracy of the determination. This disadvantage was only partially compensated for by means of a "Fourier Fourier analysis" (see T. Tsay et al., Biophys J., 60, 360-368 (1991)), since the use of this method results in a homogeneous fluorochrome Distribution before fading requires.
Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention
Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium zu schaffen, bei dem die oben erläuterten Nachteile des Standes der Technik vermieden sind.The object of the invention is to provide an improved method for determining a motion parameter for fluorochromes in a surrounding medium, in which the above-described disadvantages of the prior art are avoided.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren nach dem unabhängigen Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand von abhängigen Unteransprüchen.The object is achieved by a method according to independent claim 1. Advantageous embodiments of the invention are the subject of dependent subclaims.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters (D) für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung geschaffen, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:According to the invention, a method is provided for determining a motion parameter (D) for fluorochromes in a surrounding medium in a computer-based evaluation device, in particular for determining a diffusion coefficient, using measurement results of a photobleach test on a test sample with the fluorochromes in the surrounding medium, the method following steps include:
- Bereitstellen von experimentell ermittelten Meßreihen P" ={ I"j } (n = 1 , 2, ... ; i = 1 , 2, ... ; 7 = 1, 2, ...) der Photobleich-Untersuchung in der Auswerteeinrichtung, wobei die experimentell ermittelten Meßreihen Pn-{I". } für unterschiedliche Meßzeitpunkte f jeweils- Providing experimentally determined series of measurements P "= {I" j } (n = 1, 2, ..., i = 1, 2, ..., 7 = 1, 2, ...) of the photobleaching investigation in the evaluation device, wherein the experimentally determined series of measurements P n - {I ".} For different measuring times f respectively
Fluoreszenzwerte I "j(xt , yJ } t" ) für verschiedene Positionen (xι_ , yj) in1 einem Untersuchungsbereich des Umgebungsmediums umfassen,Fluorescence values I " j (x t , y j} t") for different positions (xι_, yj) in FIG. 1 comprise an examination region of the surrounding medium,
- Bereitstellen einer Diffusionsverteilungsfunktion G, die von den verschiedenen Positionen (Xi1 , yj) , der Zeit t und einem zu optimierenden Bewegungsparameter D ' abhängt; Ermitteln von Werten für die Diffusionsverteilungsfunktion G für die zu untersuchenden Bewegung der Fuorochrome in dem Umgebungsmedium für den zu optimierenden Bewegungsparameter D ' ,- Providing a diffusion distribution function G, which depends on the different positions (Xi 1 , yj), the time t and a motion parameter D 'to be optimized; Determining values for the diffusion distribution function G for the movement of the Fuorochrome in the surrounding medium for the motion parameter D 'to be optimized,
Erweitern einer ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 auf mindestens eine doppelte Breite, mathematisches Falten der erweiterten, ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 mit der ermittelten Diffusionsverteilungsfünktion gemäßExtending a first experimentally determined measurement series P 1 to at least twice the width, mathematically folding the extended, first experimentally determined measurement series P 1 with the determined diffusion distribution function according to FIG
Fl = r(x,ytr) = '∑l∑(Ki-x,j-ytl,D'yi(kiJfi,F l = r (x, y t r) = ' Σ l Σ ( Ki-x, jy t l, D'yi ( k iJfi)
um simulierte Meßreihen zu ermitteln,to determine simulated series of measurements,
- Bestimmen des Bewegungsparameters D aus einem Vergleich der experimentellen Meßreihen mit den simulierten Meßreihen unter Verwendung eines Minimierungsverfahrens für die Differenz zwischen den experimentellen Meßreihen und den simulierten Meßreihen undDetermining the motion parameter D from a comparison of the experimental measurement series with the simulated measurement series using a minimization method for the difference between the experimental measurement series and the simulated measurement series and
- Ausgeben einer den ermittelten Bewegungsparameter D anzeigenden Information durch die computerbasierte Auswerteeinrichtung.- Issuing a the movement parameter D indicating information by the computer-based evaluation.
Das Erweitern der ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 auf die doppelte Breite entspricht einer Erweiterung auf eine doppelte Bildbreite verglichen zu der Breite der Bilder bei der Photobleich-Untersuchung, was auch als mittels einer Anzahl von Bildpixeln oder -punkten angegeben werden kann. Es gilt die Annahme, daß sich die an den Bildrändern gefundenen Meßwerte für die Intensität in nachfolgende, nicht gemessene und außerhalb des Bildaufnahmebereiches liegende Bildpixel fortsetzen. Alternativ kann die Meßreihe auch normiert werden, in diesem Falle wird allen nichtgemessenen Pixeln der Normierungswert 1 zugewiesen. Eine Erweiterung auf eine größere Breite ist möglich. Allerdings hat sich gezeigt, daß hierdurch kaum noch Optimierungseffekte erreicht werden.Extending the first experimentally determined series of measurements P 1 to twice the width corresponds to an extension to a double image width compared to the width of the images in the photobleaching examination, which can also be indicated by means of a number of image pixels or points. The assumption is that the measured values for the intensity found at the image edges continue into subsequent image pixels which are not measured and are located outside the image recording region. Alternatively, the measurement series can also be normalized, in which case the normalization value 1 is assigned to all unmeasured pixels. An extension to a larger width is possible. However, it has been shown that this hardly any optimization effects can be achieved.
Das mathematische Falten, einschließlich der hiervon umfaßten Summation, wird dann unter Eibeziehung aller Werte der erweiterten Meßreihe durchgeführt.The mathematical convolution, including the summation included, is then performed using all values of the extended series of measurements.
Mit Hilfe der Erfindung ist ein Verfahren zum computergestützten Auswerten von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit Fluorochromen in einem Um- gebungsmedium geschaffen, bei dem keine Annahmen über Durchmesser, Form und / oder Quantität des ausgeblichenen Bereiches als Voraussetzung für die Meßdatenauswertung gemacht werden. Auf diese Weise können Einschränkungen hinsichtlich der Aussagekraft und Genauigkeit der ermittelten Ergebnisse für den Bewegungsparameter, wie sie im Stand der Technik häufig vorhanden sind, vermieden werden. Das Ergebnis des Verfahrens wird von der computerbasierten Analyseeinrichtung dann ausgegeben, beispielsweise in eine Datei oder über einen Bildschirm.With the aid of the invention, a method for computer-aided evaluation of measurement results of a photobleach test on a test sample with fluorochromes in a Um- created in which no assumptions about the diameter, shape and / or quantity of the faded area as a prerequisite for the measurement data evaluation are made. In this way, restrictions on the validity and accuracy of the determined results for the motion parameter, as they are frequently present in the prior art, can be avoided. The result of the method is then output by the computer-based analysis device, for example to a file or via a screen.
Alle Meßinformationen über Intensitäten an verschieden weit vom geblichenen Areal oder von mehreren geblichenen Arealen entfernten Meßpunkten werden in die Analyse eingeschlossen und erhöhen somit die Genauigkeit der Bestimmung des Bewegungsparameters, wobei die Analyse weitgehend robust gegenüber einem Rauschen des Meßsignals ist.All measurement information on intensities at different distances from the bleached area or multiple bleached areas are included in the analysis and thus increase the accuracy of the determination of the motion parameter, the analysis being largely robust against noise of the measurement signal.
Weiterhin besteht der Vorteil, daß das bei bekannten Verfahren vorgegebene Erfordernis entfällt, nach dem ein zweiter Bleichimpuls oder mehrere darauf folgende Bleichimpulse erst dann appliziert werden dürfen, wenn die vorausgehende Erholung weitestgehend abgeschlossen ist. Gerade aufgrund dieser Unabhängigkeit von partieller Erholung können Bleichimpulse in rascher Abfolge appliziert werden, was mehrere weitere Vorteile bedingt: Erstens kann die Bestimmung jeweils Zeitbereiche nutzen, innerhalb derer große Gradienten einer bewegungsabhängigen Erholung unterliegen und hierdurch bei geringer Probenbelastung eine maximale Robustheit der Bestimmung fördern, zweitens werden Normierungsverfahren, die geeignet sind, lokale Inhomogenitäten der Fluorochrom-Signalintensität zu kompensieren, weniger durch langsame Veränderungen dieser lokalen Inhomogenität, die zum Beispiel aufgrund von Zellbewegung auftreten, gestört, und drittens kann eine rasche Abfolge unabhängiger Bestimmungen der Bewegungsparameter entweder durch Mittelwertbildung die Bestimmungsgenauigkeit weiter erhöhen oder für eine zeitaufgelöste Bestimmung der Fluorochrombeweglichkeit und damit für die Analyse Mobilitäts-gestützter Bioindikatoren genutzt werden.Furthermore, there is the advantage that the requirement specified in known methods is eliminated, according to which a second bleaching pulse or several subsequent bleaching pulses may be applied only when the preceding recovery has largely been completed. Precisely because of this independence from partial recovery bleaching pulses can be applied in rapid succession, which causes several further advantages: First, the determination can each use time ranges within which large gradients undergo a motion-dependent recovery and thereby promote maximum robustness of determination with low sample loading, secondly For example, normalization techniques that are capable of compensating for local inhomogeneities in fluorochrome signal intensity are less disturbed by slow changes in local inhomogeneity, such as due to cell movement, and thirdly, a rapid succession of independent determinations of motion parameters, either by averaging, can further the accuracy of determination increase or be used for a time-resolved determination of fluorochrome mobility and thus for the analysis of mobility-based bioindicators.
Eine zweckmäßige Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, daß als die Diffusionsverteilungsfunktion G eine mehrdimensionale Diffusionsverteilungsfunktion oder eine Gaußverteilung verwendet wird. Als Verteilungsfunktion wird für einen eindimensionalen Fall bevorzugt eine Gaußfunktion verwendet, insbesondere dann, wenn die Diffusion in der untersuchten Meßprobe ausreichend schnell ist. Alternativ kann für schnelle Diffusionsprozesse in anderen Anwendungen ein integral über eine Fehlerfunktion genutzt werden, was einer Lösung der Diffüsionsgleichung für eine ausgedehnte Quelle als Verteilungsfunktion entspricht, insbesondere in ihrer zweidimensionalen Ausprägung. Die Diffusionsverteilungsfunktion wird dann für mehrdimensionale Ausgangspixel G(x, y , z, t, D ') bestimmt, die von mehreren Ortsbzw. Positionsparametern abhängt, beispielsweise von x, y, z im Falle einer Bewegung (Diffusion) in drei Dimensionen, der Zeit t und einem zu optimierenden Bewegungsparametern D '.An expedient embodiment of the invention provides that a multidimensional diffusion distribution function or a Gaussian distribution is used as the diffusion distribution function G. As a distribution function, a Gaussian function is preferably used for a one-dimensional case, in particular when the diffusion in the test sample being examined is sufficiently fast. Alternatively, for fast diffusion processes in other applications, integral can be used via an error function, which is a solution to the problem Difference equation for an extended source as a distribution function corresponds, in particular in its two-dimensional form. The diffusion distribution function is then determined for multi-dimensional output pixels G (x, y, z, t, D ') which are derived from multiple spatial locations. Positional parameters depends, for example, x, y, z in the case of a movement (diffusion) in three dimensions, the time t and a motion parameters D 'to be optimized.
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform der Erfindung sieht vor, daß bei dem Minimierungsverfah- ren Abweichungsquadrate minimiert werden.A preferred embodiment of the invention provides that deviation squares are minimized in the minimization method.
Zweckmäßig sieht eine Ausfuhrungsform der Erfindung vor, daß mehrere Bewegungsparameter ermittelt werden, bei denen es sich wahlweise um Diffusionskoeffizienten für die Fluoro- chrome handelt. Auch bei der Berechnung mehrerer Bewegungsparameter Dk (k > 1) kann je nach Anwendungsfall die Verwendung einer ein- oder einer mehrdimensionalen Verteilungsfunktion vorgesehen sein. Die mathematische Faltung der erweiterten, ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 =I(i, j, 1), die wahlweise sowohl im eindimensionalen als auch im mehrdimensionalen Fall normiert werden kann, mit der berechneten Diffusionsverteilungsfunktion ergibt sich dann zu:Expediently, an embodiment of the invention provides that a plurality of motion parameters are determined, which are optionally diffusion coefficients for the fluorochromes. Also in the calculation of several motion parameters D k (k> 1), depending on the application, the use of a one-dimensional or a multi-dimensional distribution function can be provided. The mathematical convolution of the extended, first experimentally determined measurement series P 1 = I (i, j, 1), which can be normalized either in the one-dimensional or in the multidimensional case, with the calculated diffusion distribution function then results in:
P'/ = /'(x,^/) = ∑∑∑σo--x,y-j,/,DÄ)-α, -/o-5y,i),P ' / = /' (x, ^ /) = ΣΣΣσo - x, yj, /, D Ä ) -α, - / o- 5 y, i),
wobei sich die Diffusionsverteilungsfunktion als Summe von k Einzelverteilungsfunktion für mehrere Bewegungsparameter Dk zusammensetzt, die jeweils mit einer Amplitude a^ eingehen. Die Faltung erfolgt mittels Aufsummieren von mit den Intensitäten der Meßreihe P1 gewichteten Werten der Diffusionsverteilungsfunktion G, die im gewählten Beispiel zweidimensional ausgestaltet ist, über alle Ortskoordinaten bzw. Positionen und entsprechend der weiteren gemessenen Meßreihe P1 mit deren zeitlichem Parameter. Alternativ kann bei einem konstanten zeitlichen Abstand der Erfassung der erfaßten Meßreihen P" die Simulation so erfolgen, daß die Meßreihe P1 mittels Faltung mit der jeweils zuvor simulierten Verteilung P'ι"ι=I'(x, y, l-\) mit der Diffusionsverteilungsfunktion G(x, y, 1, Dk) oder Faltung des Meßreihe PM mit der Diffusionsverteilungsfunktion G(x, y, 1, Dk) simuliert wird. Der ermittelte Bewegungsparameter D oder die ermittelten Bewegungsparameter Dk werden von der computerbasierten Auswerteeinrichtung ausgegeben, indem eine entsprechende elektronisch auswertbare Information bereitgestellt wird, die zum Beispiel in einer Datei speicherbar ist, auf einem Bildschirm angezeigt werden kann oder auch mittels eines Druckers gedruckt werden kann.wherein the diffusion distribution function is composed of the sum of k single distribution function for a plurality of motion parameters D k , each of which has an amplitude a ^. The folding takes place by summing up values of the diffusion distribution function G weighted with the intensities of the measurement series P 1 , which in the example chosen are two-dimensional, over all location coordinates or positions and corresponding to the further measured measurement series P 1 with their temporal parameter. Alternatively, at a constant time interval of the detection of the detected series of measurements P ", the simulation can be carried out so that the series P 1 by means of convolution with the previously simulated distribution P 'ι" I = (x, y, l-) with the diffusion distribution function G (x, y, 1, D k ) or convolution of the measurement series P M with the diffusion distribution function G (x, y, 1, Dk) is simulated. The determined motion parameter D or the determined motion parameters D k are output by the computer-based evaluation device by providing a corresponding electronically evaluable information that can be stored, for example, in a file, displayed on a screen or printed by a printer.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele der ErfindungDescription of preferred embodiments of the invention
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme aufThe invention will be described below with reference to embodiments with reference to
Figuren einer Zeichnung näher erläutert. Hierbei zeigen:Figures of a drawing explained in more detail. Hereby show:
Fig. 1 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für eine Meßreihe einer Photobleich-Untersuchung an Fluorochromen in einem Umgebungsmedium;1 shows a graph of the intensity as a function of the distance for a series of measurements of a photobleaching test on fluorochromes in a surrounding medium;
Fig. 2 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für eine simulierte Verteilung (graue Balken) der Fluorochrome für eine Einzelintensität (weißer Balken) aus der Meßreihe in Fig. 1;Figure 2 is a plot of intensity versus distance for a simulated distribution (gray bars) of the fluorochromes for a single intensity (white bar) from the series of measurements in Figure 1;
Fig. 3 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für eine Kurvenschar simulierter Verteilungen der Fluorochrome für die Einzelintensitäten aus Meßreihe in Fig. 1 ;3 shows a graph of the intensity as a function of the distance for a family of curves simulated distributions of the fluorochromes for the individual intensities from the series of measurements in FIG. 1;
Fig. 4 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für aufsummierte Werte der simulierten Verteilungen in Fig. 3;FIG. 4 is a plot of intensity vs. distance for summed values of the simulated distributions in FIG. 3; FIG.
Fig. 5 eine grafische Darstellung der Intensität in Abhängigkeit vom Abstand für aufsummierte Werte der simulierten Verteilungen vor und nach den Anwenden einer Randbedingung, daß die außerhalb des in Fig. 1 gemessenen Untersuchungsbereiches gelegenen Anteile der in Fig. 3 gezeigten Gaußfunktionen an den Rändern des Untersuchungsbereiches spiegelt und auf die Werte aufsummiert werden oder die Meßreihe entsprechend den Randwerten nach links und rechts unter Annahme eine homogenen Intensitätsverteilung erweitert wurde;Fig. 5 is a plot of intensity versus distance for accumulated values of the simulated distributions before and after applying a constraint that the portions of the gaussian functions shown in Fig. 1 outside the region of interest measured at the edges of the examination region is mirrored and summed up to the values or the series of measurements has been extended to the left and right according to the boundary values assuming a homogeneous intensity distribution;
Fig. 6 experimentelle Ergebnisse einer Untersuchung mit einem Laser-Scanning-Mikroskop an lebenden Fibroblasten-Zellen;6 shows experimental results of a study with a laser scanning microscope on living fibroblast cells;
Fig. 7 eine grafische Darstellung einer YFP-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit;Fig. 7 is a graph of YFP fluorescence intensity versus time;
Fig. 8 eine grafische Darstellung einer CFP-Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit von der Zeit; Fig. 9 eine grafische Darstellung eines experimentell ermittelten Fluoreszenzsignals FYFP in Abhängigkeit vom Abstand;Fig. 8 is a graph of CFP fluorescence intensity versus time; 9 shows a graphic representation of an experimentally determined fluorescence signal F YF P as a function of the distance;
Fig. 10 eine grafische Darstellung eines experimentell ermittelten Fluoreszenzsignals FCFP in Abhängigkeit vom Abstand;10 shows a graphic representation of an experimentally determined fluorescence signal F CF P as a function of the distance;
Fig. 11 eine grafische Darstellung experimenteller Ergebnisse des Quotienten FYFP / FCFP in Abhängigkeit vom Abstand für die experimentell ermittelten Fluoreszenzsignale aus den Fig. 9 und 10;11 is a graphical representation of experimental results of the quotient F YFP / F CFP as a function of the distance for the experimentally determined fluorescence signals from FIGS. 9 and 10;
Fig. 12 eine grafische Darstellung des Quotienten Fypp / FCFP in Abhängigkeit vom Abstand für eine erste Meßreihe nach dem Anwenden des Bleichimpulses und mehrere simulierte Meßreihen;12 shows a graphical representation of the quotient Fypp / F CFP as a function of the distance for a first series of measurements after the application of the bleaching pulse and several simulated series of measurements;
Fig. 13 eine grafische Darstellung der Summe von Abweichungsquadraten in Abhängigkeit von einer lateralen Beweglichkeit λ;Fig. 13 is a graph showing the sum of deviation squares in response to a lateral mobility λ;
Fig. 14 eine grafische Darstellung der lateralen Beweglichkeit λ in Abhängigkeit von der Zeit;FIG. 14 is a graph showing the lateral mobility λ as a function of time; FIG.
Fig. 15 Darstellungen zur Untersuchung der Aktivierung eines Gßγ-gekoppelten Rezeptors unter Verwendung des fluoreszierenden Biosenosrs GRPl(PH);Fig. 15 are views for the study of the activation of a Gβγ-coupled receptor using the fluorescent biosensor GRP1 (PH);
Fig. 16 Darstellungen einer Gq-gekoppelten Aktivierung mit nachfolgender Translokation eines Biosensors PLCδ;16 shows representations of a Gq-coupled activation with subsequent translocation of a biosensor PLCδ;
Fig. 17 Darstellungen einer Gs-gekoppelten Signalkaskade, die zur Translokation eines speziell entwickelten Biosensors führt;17 shows representations of a Gs-coupled signal cascade leading to the translocation of a specially developed biosensor;
Fig. 18 Darstellungen einer mittels Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen vermittelten Translokation von Grb2; undFIG. 18 depicts a translocation of Grb2 mediated by activation of receptor tyrosine kinases; FIG. and
Fig. 19 Darstellungen für eine Stimulation des endogenen EGF-Rezeptors in vaskulären glatten Muskelzellen und nachfolgende Translokation des Biosensors GRPl(PH).19 shows representations for a stimulation of the endogenous EGF receptor in vascular smooth muscle cells and subsequent translocation of the biosensor GRP1 (PH).
Im folgenden wird unter Bezugnahme auf die Fig. 1 bis 14 ein Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters D für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium beschrieben. Hierbei wird das Verfahren zunächst in allgemeiner Weise erläutert, um es anschließend auf experimentelle Meßergebnisse anzuwenden. Das nachfolgend erläuterte Verfahren zum Ermitteln des Bewegungsparameters D aus den experimentell gewonnenen Meßdaten trifft und erfordert keine Annahmen über Durchmesser, Form und Quantität des ausgeblichenen Bereiches in der untersuchten Meßprobe oder die darin enthaltenen Fluorochrome. Deshalb kann der geblichene Bereich beliebige Formen und Größen aufweisen.In the following, with reference to FIGS. 1 to 14, a method for determining a motion parameter D for fluorochromes in a surrounding medium in a computer-based evaluation, in particular for determining a diffusion coefficient, using measurement results of a photobleach test on a sample with the fluorochromes in described the surrounding medium. Here, the method is first explained in general terms, to then apply it to experimental measurement results. The method explained below for determining the motion parameter D from the experimentally obtained measured data does not make any assumptions about the diameter, shape and quantity of the faded area in the test sample or the fluorochromes contained therein. Therefore, the bleached area may have any shapes and sizes.
Es werden orts- und zeitaufgelöste Meßdaten einer Fluorochrom-Signalintensität eines oder mehrerer gleich schnell beweglicher Fluorochrome unterschiedlicher Farbe während und nach einem selektiven Ausbleichen eines der aufgezeichneten Fluorochrome gemessen und als e- lektronische Daten aufgezeichnet. Bleichimpulse können hierbei auch wiederholt appliziert werden, wobei in der nachfolgenden Auswertung der experimentell ermittelten Meßdaten jedem Bleichimpuls eine unabhängige Bestimmung des Diffusionskoeffizienten zugeordnet werden kann.There are measured spatially and time resolved measurement data of a fluorochrome signal intensity of one or more equally fast moving fluorochromes of different color during and after a selective fading of one of the recorded fluorochromes and recorded as e- lektronische data. In this case, bleaching pulses can also be applied repeatedly, wherein in the subsequent evaluation of the experimentally determined measurement data each bleaching pulse can be assigned an independent determination of the diffusion coefficient.
Bei gleichzeitiger Datenerfassung mehrerer, farblich getrennter Fluorochrome erfolgt eine „ratiometrische Normierung" der Fluorochrome zum Eliminieren einer lokalen Inhomogenität der Fluorochrom-Konzentration. Bei Nutzung nur eines Fluorochroms kann anstelle der ratiometrischen Normierung auf Intensitäten eines Referenz-Fluorochroms eine Normierung auf das anfängliche Intensitätsprofil des einzelnen Fluorochroms vor Applikation des Bleichimpulses treten. Letzteres wird im Folgenden mit dem Begriff „interne Normalisierung" bezeichnet.Simultaneous data acquisition of several fluorochromes in different colors results in a "ratiometric normalization" of the fluorochromes to eliminate local inhomogeneity of the fluorochrome concentration, using normal fluorochrome instead of ratiometric standardization on intensities of a reference fluorochrome standardization to the initial intensity profile of the individual fluorochrome Fluorochromes occur before application of the bleaching pulse, the latter being referred to below as "internal normalization".
Die ortsaufgelöste Bestimmung der Fluorochrom-Signalintensität erfolgt vorzugsweise in einem Fluoreszenzmikroskop mit Laser-Abtastverfahren, durch CCD-Kameras oder vergleichbare Linien- oder Flächensensoren. Die Zeitauflösung der Datenerfassung sollte hierbei genügend hoch sein, um in Relation zur Erholungsgeschwindigkeit der Fluorochrom-Signalintensität nach dem Bleichimpuls möglichst mehrere Datensätze oder Meßreihen zu erfassen. Bei gleichzeitiger optischer Erfassung zweier Fluorochrome wird eines der Flurochrome möglichst selektiv ausgeblichen, während das andere oder die anderen Fluorochrome als Referenzen dienen, die sich in der selben Weise verteilen wie das auszubleichende Fluorochrom und die sich mit gleicher Bewegungsgeschwindigkeit bewegen. Ein typisches Anwendungsbeispiel sind fluoreszierende Fusionsproteine, wobei das selbe Protein mit unterschiedlichen Farbvarianten der aus Aequora victoria oder Discosoma spp. abgeleiteten fluoreszierenden Proteine verknüpft wird. Alternativ kann auch eine Doppelfusion mit zwei verschiedenfarbig fluoreszierenden Proteinen eingesetzt werden, wobei dann die Stöchiometrie beider Fluoreszenzproteine fixiert ist und die ratiometrische Normalisierung (zum Beispiel Akzeptorfluoreszenz / Donorfluores- zenz) durch Fluoreszenzresonanz-Energietransfer zu einer weiteren Verstärkung der ratiometrisch ermittelten Gradienten nach Ausbleichen des Akzeptors führt.The spatially resolved determination of the fluorochrome signal intensity is preferably carried out in a fluorescence microscope using a laser scanning method, by CCD cameras or comparable line or area sensors. In this case, the time resolution of the data acquisition should be sufficiently high in order to record several data sets or measurement series as possible in relation to the rate of recovery of the fluorochrome signal intensity after the bleaching pulse. With simultaneous optical detection of two fluorochromes one of the flurochromes is bleached as selectively as possible, while the other or the other fluorochromes serve as references which are distributed in the same way as the fluorochrome to be leached and which move at the same speed of movement. A typical application example is fluorescent fusion proteins, wherein the same protein with different color variants of those from Aequora victoria or Discosoma spp. derived fluorescent proteins is linked. Alternatively, a double fusion with two different colored fluorescent proteins can be used, in which case the stoichiometry of both fluorescence proteins is fixed and the ratiometric normalization (eg acceptor fluorescence / donor fluorescence) by fluorescence resonance energy transfer to a further amplification of the ratiometrically determined gradients after fading of the acceptor leads.
Typischerweise wird der Bleichimpuls mittels eines Laser erzeugt, der beispielsweise mit Hilfe eines Akusto-optischen Filters (AOTF) in seiner Intensität moduliert werden kann. Ein Laser-Scanning-Mikroskop ist hierfür eine geeignete Umgebung, das gezeigte Anwendungsbeispiel wurde mit einem Laser-Scanning-Mikroskop und AOTF-gesteuerter Laserintensität aufgezeichnet.Typically, the bleaching pulse is generated by means of a laser, which can be modulated in intensity, for example with the aid of an acousto-optical filter (AOTF). A laser scanning microscope is a suitable environment for this, the application example shown was recorded with a laser scanning microscope and AOTF-controlled laser intensity.
Bei Verwendung zweier oder mehrerer Fluorochrome werden die Meßdatensätze spektral getrennt aufgezeichnet, wobei die Fluorochrom-Separation in der Anregungs- oder / und E- missionsdomäne mittels geeigneter Anregungs- und Emissionswellenlängen geschehen kann. Bei unvollständiger spektraler Trennbarkeit der von den verschiedenfarbigen Fluorochromen generierten Fluoreszenzsignale kann entweder eine einfache Quotientenbildung zwischen Meßdatensätzen, die vorwiegend das geblichene bzw. das Referenz-Fluorochrom repräsentieren oder eine vorgelagerte spektrale Entmischung (vgl. beispielsweise DE 199 15 137) und nachfolgende Quotientenbildung stattfinden.When using two or more fluorochromes, the measured data sets are recorded spectrally separated, wherein the fluorochrome separation in the excitation or / and E- mission domain can be done by means of suitable excitation and emission wavelengths. In the case of incomplete spectral separability of the fluorescence signals generated by the differently colored fluorochromes, either a simple quotient formation can take place between measurement data sets which predominantly represent the bleached or reference fluorochrome or an upstream spectral separation (cf., for example, DE 199 15 137) and subsequent quotient formation.
Im Fall einer „internen Normalisierung" ist bei wiederholter Applikation von Bleichimpulsen darauf zu achten, daß vor Applikation eines weiteren Bleichpulses und erneuter „interner Normalisierung" eine nahezu vollständige Erholung der lokalen Fluoreszenz aufgrund der lateralen Beweglichkeit der Fluorochrome stattgefunden hat, da sonst in den Folgezyklen die Äquilibrierung scheinbar schneller ablaufen und somit die laterale Beweglichkeit überschätzt würde. Diese Einschränkung gilt nicht bei Normalisierung auf eine gleich schnell bewegliches Referenzfluorochrom.In the case of "internal normalization", repeated application of bleaching pulses should ensure that, before application of another bleaching pulse and renewed "internal normalization", almost complete recovery of local fluorescence has taken place due to the lateral mobility of the fluorochromes, otherwise in subsequent cycles the equilibration seems to proceed faster and thus the lateral mobility would be overestimated. This restriction does not apply to normalization to an equally fast moving reference fluorochrome.
Bei der Ermittlung des Bewegungsparameters D aus experimentellen Ergebnissen einer Pho- tobleich-Untersuchung mittels einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, bei der es sich beispielsweise um einen Personalcomputer handelt, wird davon ausgegangen, daß das für ein Volumenelement oder ein Flächenelement (Pixel) des Untersuchungsmediums erfaßte Intensi- tätssignal den dort befindlichen und im Volumen- / Flächenelement konzentrierten Fluoroch- romen proportional ist. Ein Intensitätsprofil einer Meßreihe setzt sich demnach aus einer Summierung der in Einzelpixeln jeweils idealisiert konzentriert liegenden Signale zusammen. Für langsame Bewegungen muss die Diffusionsgleichung für eine ausgedehnte Quelle für die Bestimmung der Diffusionsverteilung berücksichtigt werden. Für hinreichend schnelle Prozesse, kann eine Konzentration der gemessenen Pixelintensitäten in einem Punkt angenommen werden, was zu einer vereinfachten Lösung der Diffusionsgleichung und damit zu einer Minimierung des Rechenaufwandes fuhrt. In diesem Fall stellt die Diffusionsverteilungsfunktion eine Gaußverteilung dar entspechend G(x, y, t) = l/AπDt • exp(- (x2 + y2)/4Dt) .When determining the movement parameter D from experimental results of a photobleach examination by means of a computer-based evaluation device, which is for example a personal computer, it is assumed that the intensity recorded for a volume element or a surface element (pixel) of the examination medium. signal is proportional to the fluorochrome present there and concentrated in the volume / area element. Accordingly, an intensity profile of a series of measurements is composed of a summation of the signals which are idealized in each case in individual pixels. For slow motions, the diffusion equation for an extended source for determining the diffusion distribution must be taken into account. For sufficiently fast processes, a concentration of the measured pixel intensities can be assumed in one point, which leads to a simplified solution of the diffusion equation and thus to a minimization of the computational effort. In this case, the diffusion distribution function is a Gaussian distribution corresponding to G (x, y, t) = 1 / AπDt • exp (- (x 2 + y 2 ) / 4Dt).
Fig. 1 zeigt eine grafische Darstellung einer Verteilung von Fluoreszenzintensitäten /," ( xt , t" ), zu einem Meßzeitpunkt t" im eindimensionalen Fall über Abstände x; , die bestimmteFIG. 1 shows a graphic representation of a distribution of fluorescence intensities /, "(x t , t"), at a measurement time t "in the one-dimensional case over distances x ;
Orte in dem bei der Photobleich-Untersuchung gemessenen Untersuchungsbereiches definieren. Deutlich erkennbar ist in Fig. 1 ein geblichener Bereich der Verteilung, in welchem die Intensitäten geringer als außerhalb des geblichenen Bereiches sind.Define locations in the examination area measured during the photobleaching study. Clearly visible in Fig. 1 is a bleached area of distribution in which the intensities are less than outside the bleached area.
Für die Ermittlung des Bewegungsparameters D der untersuchten Fluorochrome können weiterhin die gemessenen Zeitskalen und die bekannten Abstände xt zwischen den Untersuchungsorten genutzt werden, um zu berechnen, wie sich die Fluorochrome nach einem Zeitintervall, welches dem tatsächlichen Aufzeichnungsintervall entspricht, verteilen müßten. Zur Simulation einer solchen diffusionsbedingten Verteilung wird eine Gauß-Funktion G verwendet. Die Gauß-Funktion G ist unmittelbar von dem Bewegungsparameter D abhängig:For determining the motion parameter D of the fluorochromes investigated, the measured time scales and the known distances x t between the examination sites can furthermore be used to calculate how the fluorochromes would have to disperse after a time interval which corresponds to the actual recording interval. To simulate such a diffusion-related distribution, a Gaussian function G is used. The Gaussian function G is directly dependent on the motion parameter D:
G(x, t) = l/ • exp(- x2 /4Dt) .G (x, t) = l / • exp (- x 2 / 4Dt).
Die Verteilung wird nun für Abstandsschritte x, ermittelt, die den bei der Photobleich- Untersuchung verwendeten Pixel- / Meßabständen entsprechen.The distribution is now determined for distance steps x, which correspond to the pixel / measurement distances used in the photobleach test.
Die Verteilungsermittlung wird nun über alle Pixel / Intensitäten der Meßreihe aus Fig. 1 durchgeführt (vgl. Fig. 3), wobei die ermittelten Werte für alle Abstände aufsummiert werden, so daß sich ein erstes simuliertes Profil ergibt, was in Fig. 4 dargestellt ist. An den Rändern der Profile wird als Randbedingung eine Reflexion simuliert oder alternativ die Intensität des / der äußersten, innerhalb des untersuchten Bereiches liegenden Meßdaten über den Aufzeichnungsbereich hinaus fortgeführt (Fig. 5) oder bei normierten Meßreihen den außerhalb des Meßbereiches liegenden Pixeln der Wert 1 zugewiesen. Es wird so eine hochgenaue Simulation der Diffusion über den gesamten Meßbereich bei einem vorgegebenen Diffusionskoeffizienten erhalten, wobei die Form und die Homogenität der ausgeblichenen Region unerheblich ist.The distribution determination is now carried out over all the pixel / intensities of the measurement series from Fig. 1 (see Fig. 3), wherein the determined values are summed for all distances, so that a first simulated profile results, which is shown in Fig. 4 , At the edges of the profiles, a reflection is simulated as a boundary condition or, alternatively, the intensity of the outermost measurement data lying within the examined range continues beyond the recording range (FIG. 5) or, in the case of standardized measurement series, the value 1 is assigned to the pixels outside the measuring range , It is thus obtained a highly accurate simulation of the diffusion over the entire range at a given diffusion coefficient, the shape and the homogeneity of the faded region is irrelevant.
Um einen Fluorochrom- Verlust durch Ausbleichen der gesamten Zelle oder der gemessenen Region zu kompensieren, wird die Summe der in der Simulation erhaltenen Intensitäten gebildet, und die Simulationsdaten werden auf die Summe der in der Messung gefundenen Fluoreszenzsignale normiert. Somit ergeben sich keine Summendifferenzen, die zu einem Offset der Signalhöhe gegenüber den Meßdaten führen könnten.In order to compensate for fluorochrome loss by fading the entire cell or the measured region, the sum of the intensities obtained in the simulation is formed, and the simulation data is normalized to the sum of the fluorescence signals found in the measurement. Thus, there are no sum differences that could lead to an offset of the signal height compared to the measured data.
Die Simulationsprozedur wird für alle der ersten Meßreihe folgenden Meßreihen durchgeführt, wobei die erste Meßreihe als Ausgangspunkt für die Simulation zu unterschiedlichen Zeiten dient. Alternativ kann auch der jeweils gemessene Datensatz oder der zuvor simulierte Datensatz als Vorlage dienen, wobei hier die Simulation für nur einen Zeitschritt, nämlich der Zeitdifferenz zwischen dem Erheben der Meßreihen erfolgt. Hierbei ist allerdings zu beachten, daß ein hohes Meßrauschen einen störenden Einfluß hätte oder sich Rundungsfehler aufsummieren könnten.The simulation procedure is carried out for all the series of measurements following the first series of measurements, the first series of measurements serving as a starting point for the simulation at different times. Alternatively, the respectively measured data set or the previously simulated data set can serve as a template, whereby the simulation is performed for only one time step, namely the time difference between the elevation of the measurement series. It should be noted, however, that a high measurement noise would have a disturbing influence or accumulate rounding errors.
Als Meß- und Simulationszyklen können unterschiedliche Zeitbereiche in die Analyse eingeschlossen werden, wobei bei einer einfachen Diffusion beispielsweise alle Meßintervalle einbezogen werden sollten, innerhalb derer etwa 50% bis 90% der Äquilibrierung eines von dem Bleichimpuls erzeugten Intensitätsgradienten vollzogen werden.As measuring and simulation cycles, different time ranges can be included in the analysis, whereby in a simple diffusion, for example, all measuring intervals should be included, within which about 50% to 90% of the equilibration of an intensity gradient generated by the bleaching pulse is performed.
Liegen für alle in die Berechnung einzuschließenden Meßreihen simulierte Datensätze vor, wird die Summe der Abweichungsquadrate der Simulation von den zugehörigen experimentellen Meßdaten gebildet.If simulated data sets are present for all measurement series to be included in the calculation, the sum of the deviation squares of the simulation is formed by the associated experimental measurement data.
Zur Bestimmung des optimalen Bewegungsparameters D wird der vorgegebene Bewegungsparameter D' so variiert, dass die Summe der Abweichungsquadrate minimal wird. Hierzu werden Minimierungsverfahren verwendet, wie sie beispielsweise von Brent (R. P. Brent: Algorithms for minimization without derivatives, in Prentice-Hall series in automatic conαpu- tation), Kapitel 3 / 4, Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall (1973)) vorgeschlagen wurden.To determine the optimal motion parameter D, the predetermined motion parameter D 'is varied so that the sum of the deviation squares becomes minimal. For this purpose, minimization methods are used, as described, for example, by Brent (RP Brent: Algorithms for minimization without derivatives, in Prentice-Hall series in automatic configuration), Chapter 3/4, Englewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall (1973)).
Werden in den Messungen die Bleichimpulse wiederholt oder / und in verschiedenen Bereichen des Untersuchungsmediums appliziert, so wird die Ermittlung des lateralen Diffusionskoeffizienten für alle Bleichimpulse und / oder alle Bereiche durchgeführt, um im Ergebnis einen Zeitverlauf der Molekülbeweglichkeit oder eine statistische Bestimmung der Mobilität in verschiedenen Bereichen zu erreichen, zum Beispiel in mehreren Zellen oder in verschiedenen Zellkompartimenten. Beim Auftreten mehrerer verschiedener Bewegungsparameter bietet sich hierbei eine globale Analyse aller Bleichimpulse bezüglicher der Werte der mehreren Bewegungsparameter an, während die Amplituden der jeweiligen Bewegungsparameter für jeden Bleichimpuls separat bestimmt werden.If the bleaching pulses are repeated in the measurements and / or applied in different areas of the examination medium, the determination of the lateral diffusion coefficient for all bleaching pulses and / or all areas is carried out, as a result of a time course of molecular mobility or a statistical determination of the mobility in different areas reach, for example in several cells or in different cell compartments. When several different movement parameters occur, a global analysis of all bleaching pulses with respect to the values of the several movement parameters is offered, while the amplitudes of the respective movement parameters are determined separately for each bleaching pulse.
Im folgenden wird die Nutzung des beschriebnen Verfahrens anhand von experimentellen Ergebnissen für eine Photobleich-Untersuchung an einer lebenden Fibroblasten-Zelle erläutert.In the following, the use of the described method will be explained on the basis of experimental results for a photobleaching study on a living fibroblast cell.
In einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop wurde eine lebende Fibroblasten-Zelle, die ein intramolekular fusioniertes CFP -YFP -Fusionsprotein exprimierte, mit einem Argon-Mehrlinien-Laser bei 458 nm über ein 100 x 1.45 Objektiv angeregt, und die Fluoreszenzemission wurde nach Durchgang durch eine konfokale Lochblende bei acht verschiedenen Emissionswellenlängen im Bereich zwischen 482 nm und 566 nm aufgezeichnet und mittels spektralem Entmischen in die Signale der CFP- und YFP-Fluorochrome getrennt (vgl. Fig. 6).In a confocal laser scanning microscope, a live fibroblast cell expressing an intramolecularly fused CFP -YFP fusion protein was excited with a 458 nm argon multi-line laser through a 100 x 1.45 objective, and fluorescence emission was observed after passage recorded by a confocal pinhole at eight different emission wavelengths in the range between 482 nm and 566 nm and separated by spectral segregation into the signals of CFP and YFP fluorochromes (see Fig. 6).
Die in der Folge in schneller Bildrate abgetasteten Bildanteile überstrichen einen inhomogenen Anteil des Zytosols („Meßbereich" in Fig. 6), der bereits ohne Bleichimpuls zu einem nicht horizontalen Intensitätsprofil der Einzelfluorochrome führt (vgl. eingezeichnete horizontal ausgerichtete Region in Fig. 6). Nach jeweils 30 Bildzyklen wurde für kurze Zeit in der Bildmitte eine Region mit maximaler Intensität der 488 nm und 514 nm Linien des Argon- Lasers bestrahlt („geblichener Bereich" in Fig. 6), um lokal und selektiv die Fluoreszenz des YFP-Anteils im Fusionsprotein zu bleichen.The image components scanned in rapid succession in the sequence covered an inhomogeneous portion of the cytosol ("measuring range" in FIG. 6), which already leads without bleaching pulse to a non-horizontal intensity profile of the individual fluorochromes (see the drawn horizontally aligned region in FIG. After every 30 image cycles, a region of maximum intensity of the 488 nm and 514 nm lines of the argon laser was irradiated for a short time in the center of the image ("bleached area" in Fig. 6) to locally and selectively fluoresce the YFP content in the Bleach fusion protein.
Daraufhin wurde die Bildaufzeichnung fortgesetzt, wobei die YFP-Fluoreszenzintensität im geblichenen Bereich im jeweiligen Folgezyklus um etwa 40% reduziert wurde (entsprechend „Region 1" in Fig. 7). Eine am rechten Rand des Profils gelegene Region ist zum Vergleich und als Nachweis der lokalen Ausbleichwirkung des Lasers mit dargestellt („Region 2" in Fig. 7). Fig. 8 zeigt eine solche Messung für die CFP-Fluoreszenzintensität mit leichter Zunahme der Fluoreszenzintensität in der geblichenen „Region 1" nach Bleichen des YFP als FRET-Akzeptor.Thereafter, imaging was continued with the YFP fluorescence intensity in the bleached area being reduced by about 40% in the respective subsequent cycle (corresponding to FIG A region located at the right edge of the profile is also shown for comparison and as proof of the local fading effect of the laser ("Region 2" in Fig. 7). Figure 8 shows such a measurement for CFP fluorescence intensity with a slight increase in fluorescence intensity in the bleached "Region 1" after bleaching the YFP as a FRET acceptor.
Die über die Bildhöhe gemittelten Fluoreszenzintensitäten ergeben Intensitätsprofile, welche durch zelluläre Kompartimente und Zellgrenzen sowohl für das in der Bildmitte partiell ausgeblichene YFP (Fig. 9) als auch für das nicht geblichene CFP (Fig. 10) eine stark gewellte Form aufweisen und somit ungeeignet für eine rein Intensitäts-gestützte FRAP-Analyse sind. Dargestellt sind die Meßzyklen direkt nach dem zweiten Bleichimpuls sowie einige darauf folgende Meßzyklen. Nach Bildung eines Quotienten der beiden Fluorochrom-Signale gleichen sich die Inhomogenitäten aus (Fig. 11), und der Meßdatensatz kann als Vorlage für die Simulation dienen.The fluorescence intensities averaged over the image height yield intensity profiles which have a strongly corrugated shape due to cellular compartments and cell boundaries both for the partially bleached YFP in the middle of the image (FIG. 9) and for the non-bleached CFP (FIG. 10) and thus unsuitable for are a purely intensity-based FRAP analysis. Shown are the measuring cycles directly after the second bleaching pulse and some subsequent measuring cycles. After forming a quotient of the two fluorochrome signals, the inhomogeneities equalize (Figure 11), and the measurement data set can serve as a template for the simulation.
Die Simulation des zweiten von insgesamt 22 sequentiell applizierten Bleichimpulsen in diesem Experiment ist exemplarisch für den Erholungsvorgang über sieben Zeitintervalle dargestellt (Fig. 12), wobei der mit den Meßdaten am besten übereinstimmende Wert λ(x) von 5,9 μm herangezogen wurde. Trägt man die Abweichungen der simulierten Daten von dem Meßdaten als Summe der Abweichungsquadrate über die laterale Beweglichkeit λ(x) auf, so erkennt man daß die Funktion ein globales Minimum aufweist, welches den korrekten Wert für λ(x) ausweist, der im genannten Fall bei 5,9 μm (bezogen auf 1 s) lag (Fig. 13). Da die Funktion der Summe der Abweichungsquadrate über die Beweglichkeit in diesem Verfahren stets ein einziges Minimum ausweist, ist die Bestimmung des optimalen Wertes für λ(x) (bezogen auf t - 1 s) und des Diffüsionskoeffizienten D = λ(x)2 / 2t) eindeutig.The simulation of the second of a total of 22 sequentially applied bleaching pulses in this experiment is shown as an example for the recovery process over seven time intervals (FIG. 12), whereby the value λ (x) of 5.9 μm, which most closely matches the measured data, was used. If one plots the deviations of the simulated data from the measured data as the sum of the deviation squares over the lateral mobility λ (x), it can be seen that the function has a global minimum which indicates the correct value for λ (x), in this case at 5.9 μm (based on 1 s) (FIG. 13). Since the function of the sum of the squares of deviation over the mobility in this method always has a single minimum, the determination of the optimum value for λ (x) (with respect to t-1 s) and the diffusion coefficient D = λ (x) is 2 / 2t ) clearly.
Wird das Analyseverfahren sequentiell über alle in der Messung enthaltenen Bleichimpulse appliziert, so wird ein Zeitverlauf der lateralen Beweglichkeit des Fluorochroms bzw. des damit verknüpften Makromoleküls erhalten. Die Auswertung aller einzelner Bleichimpulse der in den Fig. 7 gezeigten Messungen ist in Fig. 14 als Funktion der lateralen Verschiebungsquadrate über die Zeit aufgetragen.If the analysis method is applied sequentially over all the bleaching pulses contained in the measurement, then a time course of the lateral mobility of the fluorochrome or of the macromolecule associated therewith is obtained. The evaluation of all individual bleaching pulses of the measurements shown in FIG. 7 is plotted in FIG. 14 as a function of the lateral displacement squares over time.
Das beschriebene Verfahren kann auch in einer zweidimensionalen Version ausgeführt werden. Die Faltung erfolgt dann mit der Lösung der zweidimensionalen Diffusionsgleichung. Weiterhin kann das Verfahren auf die Bestimmung mehrerer Bewegungsparameter, nämlich die Bestimmung von Diffusionskoeffizienten von spektral identischen Fluorochromen, die mit unterschiedlicher Geschwindigkeit diffundieren, erweitert werden. Hierbei wird die Lösung der Diffusionsgleichung für verschiedene Diffusionskoeffizienten mit der ersten Meßreihe P1 gefaltet.The method described can also be carried out in a two-dimensional version. The convolution then takes place with the solution of the two-dimensional diffusion equation. Furthermore, the method can be extended to the determination of several motion parameters, namely the determination of diffusion coefficients of spectrally identical fluorochromes which diffuse at different speeds. In this case, the solution of the diffusion equation for different diffusion coefficients is folded with the first measurement series P 1 .
Im folgenden wird unter Bezugnahme auf Fig. 15 bis 19 die Nutzung des vorangehend erläuterten Verfahrens für eine Ausführungsform zur Ermittlung zweier Diffusionskoeffizienten näher erläutert. Als Meßdaten dienten zweidimensionale Bilder, die mit Hilfe eines konfokalen Laserscanningmikroskopes ermittelt wurden. In den dargestellten Ausführungsbeispielen werden mittels des vorangehend beschriebenen Verfahrens jeweils zwei Diffusionskoeffizien- ten für wiederholte FRAP-Messungen bestimmt. Die untersuchten fluoreszierenden Proteine, die als Biosensoren für verschiedene Signalwege dienen, können in diesen Fällen in zwei verschiedenen Organellen lokalisiert sein, wo sich aufgrund der unterschiedlichen lokalen Viskosität jeweils ein unterschiedlicher Diffusionskoeffizient ergibt. Werden die Diffusionskoeffizienten global für alle FRAP-Messungen in einer Zelle und die Anteile der Diffusionskoeffϊ- zienten für jede einzelne der repetitven Messungen bestimmt, so ergibt sich ein quantitatives Bild, das die Translokation des jeweiligen Biosensors und damit die Aktivierung eines Signalweges beschreibt.The use of the method explained above for an embodiment for determining two diffusion coefficients is explained in more detail below with reference to FIGS. 15 to 19. The measured data were two-dimensional images, which were determined with the aid of a confocal laser scanning microscope. In the illustrated embodiments, in each case two diffusion coefficients for repeated FRAP measurements are determined by means of the method described above. The investigated fluorescent proteins, which serve as biosensors for different signaling pathways, can in these cases be localized in two different organelles, where a different diffusion coefficient results due to the different local viscosities. If the diffusion coefficients are determined globally for all FRAP measurements in a cell and the proportions of the diffusion coefficients for each of the repetitive measurements, a quantitative image results which describes the translocation of the respective biosensor and thus the activation of a signal path.
Eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen führt zu Umverteilungen von Proteinen in der Zelle, dazu gehören die Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sowie Rezeptor- tyrosinkinasen. Da sich die Beweglichkeit von Proteinen, zum Beispiel zwischen Zytoplasma und der Plasmamembran, sehr stark unterscheidet, können diese Umverteilungen durch Messung des Diffusionskoeffizienten sensitiv analysiert werden. Zur Ermittlung der Diffusionskoeffizienten die vorangehend erläuterten Fluoreszenz-Messungen, die mittels Bestimmung zweier Bewegungsparameter eine Zuordnung der Anteile von zytoplasmatischer (schnelle Diffusion) und membranärer (langsame Diffusion) Fraktion ermöglichen.A variety of signal transduction pathways lead to redistribution of proteins in the cell, including the activation of G protein-coupled receptors and receptor tyrosine kinases. Since the mobility of proteins, for example between the cytoplasm and the plasma membrane, differs greatly, these redistributions can be sensitively analyzed by measuring the diffusion coefficient. In order to determine the diffusion coefficients, the above-explained fluorescence measurements allow the assignment of the proportions of cytoplasmic (fast diffusion) and membranous (slow diffusion) fractions by determining two movement parameters.
Weitere Signalwege, die nicht intrinsisch zu einer Umverteilung von Proteinen führen, können mittels genetischer Modifikation eines Bindungspartners, beispielsweise einer erzwungenen Membranbindung, dem Verfahren zugänglich gemacht werden. Damit kann der Effekt eines Agonisten und der Anstieg von Botenstoffen in der Zelle unmittelbar gemessen werden. Es sind als Beispiel verschiedene Signaltransduktionswege gezeigt, die durch die Umverteilung fluoreszierender Biosensoren vom Zytosol zur Plasmamembran oder entgegengesetzt beobachtet werden können.Other signaling pathways that do not intrinsically lead to protein redistribution can be made accessible to the process by genetic modification of a binding partner, such as forced membrane binding. Thus, the effect of an agonist and the increase of messenger substances in the cell can be measured directly. By way of example, various signal transduction pathways are shown which can be observed by the redistribution of fluorescent biosensors from the cytosol to the plasma membrane or vice versa.
In den Fig. 15 bis 19 sind die Signaltransduktionswege jeweils im oberen Teil schematisch gezeigt. Für die untersuchten Signalwege sind dann gemessene Fluoreszenzbilder zu verschiedenen Zeiten vor (0 min) bzw. nach der Stimulation mit dem entsprechenden Agonisten gezeigt (Balken entspricht 5 μm) dargestellt. Die einzelnen Signalwege wurden dann nach dem oben beschriebenen Verfahren analysiert. Dazu ist für jeweils eine repräsentative Messung der Verlauf der Membranassoziation, die sich aus diesem Modell für den jeweiligen Biosensor ergibt, dargestellt. Dieser Anteil entspricht der Amplitude des langsameren Diffusionskoeffizienten, der mit dem oben beschriebenen Verfahren global ermittelt wurde. Der Zeitpunkt der Zugabe des Agonisten ist in diesen Darstellungen mit einem Pfeil gekennzeichnet.In FIGS. 15 to 19, the signal transduction pathways are shown schematically in the upper part, respectively. Measured fluorescence images at different times before (0 min) or after stimulation with the corresponding agonist (bar corresponds to 5 μm) are then shown for the investigated signal paths. The individual signaling pathways were then analyzed by the method described above. For each representative measurement, the course of the membrane association resulting from this model for the respective biosensor is shown. This proportion corresponds to the amplitude of the slower diffusion coefficient, which was determined globally by the method described above. The time of addition of the agonist is indicated in these representations with an arrow.
Fig. 15 zeigt Darstellungen für ein Ausführungsbeispiel, bei dem HEK293 -Zellen mit Plasmiden für YFP-GRPl(PH), die plOl und plOlγ Untereinheiten der PI3 Kinase γ und den fMLP Rezeptor transfϊziert wurden. Der fluoreszierende Biosensor YFP-GRPl (PH) ist in ruhenden Zellen hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert und wird nach Stimulation mit 1 μM fMLP (Aktivierung von Gßγ) an in der Plasmamembran entstehendes PI(3,4,5)P3 gebunden, von wo er sich im Laufe des Experiments in das Zytoplasma rückverteilte. Für die gezeigte Kurve ergaben sich Diffusionskoeffizienten von 19 μm2/s für die zytosolische und 0.39 μm2/s für die plasmamembranäre Fraktion.Fig. 15 shows illustrations of an embodiment in which HEK293 cells were transfected with plasmids for YFP-GRP1 (PH), plO1 and plOIγ subunits of PI3 kinase γ and the fMLP receptor. The fluorescent biosensor YFP-GRP1 (PH) is mainly located in the cytoplasm in quiescent cells and, after stimulation with 1 μM fMLP (activation of Gβγ), is bound to PI (3,4,5) P3 formed in the plasma membrane, from where it is redistributed to the cytoplasm during the course of the experiment. For the curve shown there were diffusion coefficients of 19 μm 2 / s for the cytosolic and 0.39 μm 2 / s for the plasma membrane fraction.
Fig. 16 zeigt Darstellungen für das Stimulieren von HEK293 Zellen, die YFP-PLδ(PH) und den Gq-gekoppelten Histamin Hl -Rezeptor expreimierten, mit 5 μM Histamin, was zu einer vorübergehenden Umverteilung des Biosensors von der Plasmamembran zum Zytoplasma führte. Als Bewegungsparameter ergaben sich dabei Diffusionskoeffizienten von 20 μm2/s für die schnelle zytosolische Fraktion und 0.61 μrnVs für an die langsamere membranassozierte Fraktion.Figure 16 shows plots for stimulating HEK293 cells expressing YFP-PLδ (PH) and the Gq-coupled histamine HI receptor with 5 μM histamine, resulting in a transient redistribution of the biosensor from the plasma membrane to the cytoplasm. Diffusion coefficients of 20 μm 2 / s for the fast cytosolic fraction and 0.61 μrnVs for the slower membrane-associated fraction were obtained as motion parameters.
Fig. 17 zeigt Darstellungen eines Biosensors, der die Stimulation der cAMP abhängigen Proteinkinase (PKA) durch Umverteilung anzeigt. Ein Plasmid, das die katalytische Untereinheit der PKA kodiert, wurde dazu mit einem CAAX-Motif modifiziert, so daß es über eine Lipi- dierung mit der Plasmamembran assoziert ist. In unstimulierten Zellen formen je zwei kataly- tische und zwei regulatorische Untereinheiten der PKA ein Tetramer, so daß eine fluoreszenzmarkierte katalytische Untereinheit dann auch membrangebunden ist. Erfolgt eine Ausschüttung des sekundären Botenstoffes cAMP, dissoziert das Heterotetramer und die als Biosensor dienende aktivierte katalytische Untereinheit verteilt sich in das Zytosol. Um dies messen zu können, wurden HEK293 Zellen neben den beschriebenen Plasmiden mit dem Gs- gekoppelten Vasopressin- V2-Rezeptor transfiziert. Nach Zugabe von 1 μM AVP verteilte sich der fluoreszierende Biosensor YFP-PKA (katalytische Untereinheit α) von der Plasmamembran (Diffusionskoeffizient von 0.3 μm2/s) in das Zytosol (Diffusionskoeffizient von 6.5 μm2/s) um.Fig. 17 shows representations of a biosensor indicating the stimulation of cAMP-dependent protein kinase (PKA) by redistribution. A plasmid encoding the catalytic subunit of PKA was modified with a CAAX motif to give it a lipid tion is associated with the plasma membrane. In unstimulated cells, two catalytic and two regulatory subunits of PKA each form a tetramer, so that a fluorescently labeled catalytic subunit is then membrane-bound. If the secondary messenger cAMP is secreted, the heterotetramer dissociates and the biosensor activated catalytic subunit is distributed into the cytosol. In order to be able to measure this, HEK293 cells were transfected in addition to the described plasmids with the Gs-coupled vasopressin V2 receptor. After addition of 1 μM AVP, the fluorescent biosensor YFP-PKA (catalytic subunit α) was redistributed from the plasma membrane (diffusion coefficient of 0.3 μm 2 / s) into the cytosol (diffusion coefficient of 6.5 μm 2 / s).
Fig. 18 zeigt Darstellungen für Grb2, was als Beispiel für ein durch eine Rezeptortyrosinkina- se umverteiltes Protein dient und das mit YFP fluoreszenzmarkiert wurde. Zusätzlich zu einem Plasmid für dieses Protein wurde ein Expressionsplasmid für den EGF-Rezeptor in HEK293 Zellen transfiziert. Der Biosensor ist in unstimulierten Zellen im Zytoplasma und Nukleus lokalisiert und wird nach Stimulation mit 100 ng/ml EGF an den EGF-Rezeptor und damit an die Plasmamembran gebunden. Für die gezeigte Umverteilungskurve wurden Diffusionskoeffizienten von 6.5 μm2/s für die zytoplasmatische und 0.43 μm2/s für die membranassoziierte Fraktion ermittelt.FIG. 18 shows representations of Grb2, which serves as an example of a protein redistributed by a receptor tyrosine kinase and which has been fluorescently labeled with YFP. In addition to a plasmid for this protein, an expression plasmid for the EGF receptor was transfected into HEK293 cells. The biosensor is located in unstimulated cells in the cytoplasm and nucleus and, after stimulation with 100 ng / ml EGF, is bound to the EGF receptor and thus to the plasma membrane. For the redistribution curve shown, diffusion coefficients of 6.5 μm 2 / s were determined for the cytoplasmic fraction and 0.43 μm 2 / s for the membrane-associated fraction.
Fig. 19 zeigt Darstellungen für eine Stimulation des endogenen EGF-Rezeptors in vaskulären glatten Muskelzellen, was wiederum durch Transfektion mit fluoreszierender GRPl-PH- Dornäne nachgewiesen werden konnte. Auch hier wurde nach Zugabe von 100 ng/ml EGF eine zeitweilige Membranassoziation erreicht, das Grpl an das entsehende PI(3,4,5)P3 bindet. Die Diffusionskoeffizienten lagen hier bei 16 μm2/s für die zytosolische Fraktion und 0.51 μm2/s für membrangebundenes Protein.Figure 19 shows plots for stimulation of the endogenous EGF receptor in vascular smooth muscle cells which, in turn, could be detected by transfection with fluorescent GRPL-PH spike. Again, after addition of 100 ng / ml EGF, a temporary membrane association was achieved, which binds Grpl to the resulting PI (3,4,5) P3. The diffusion coefficients here were 16 μm 2 / s for the cytosolic fraction and 0.51 μm 2 / s for membrane-bound protein.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen von Bedeutung sein. The features of the invention disclosed in the foregoing description, in the claims and in the drawing may be of importance both individually and in any combination for the realization of the invention in its various embodiments.

Claims

Ansprüche claims
1. Verfahren zum Ermitteln eines Bewegungsparameters (D) für Fluorochrome in einem Umgebungsmedium in einer computerbasierten Auswerteeinrichtung, insbesondere zum Bestimmen eines Diffusionskoeffizienten, unter Verwendung von Meßergebnissen einer Photobleich-Untersuchung an einer Meßprobe mit den Fluorochromen in dem Umgebungsmedium, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:A method for determining a motion parameter (D) for fluorochromes in a surrounding medium in a computer-based evaluation device, in particular for determining a diffusion coefficient, using measurement results of a photobleach test on a test sample with the fluorochromes in the surrounding medium, the method comprising the following steps comprising:
- Bereitstellen von experimentell ermittelten Meßreihen P"={/"y } (n = 1, 2, ...; z = 1, 2, ...; / = 1, 2, ...) der Photobleich-Untersuchung in der Auswerteeinrichtung, wobei die experimentell ermittelten Meßreihen Pn={I"j } für unterschiedliche Meßzeitpunkte f jeweils Fluoreszenzwerte I"j (xt , y . , t" ) für verschiedene Positionen (JC;, , yj) in einem Untersuchungsbereich des Umgebungsmediums umfassen,- Providing experimentally determined series of measurements P "= {/" y } (n = 1, 2, ..., z = 1, 2, ..., / = 1, 2, ...) of the photobleach investigation in the evaluation device, wherein the series of measurements P n = {I experimentally determined "j} f for different measuring times each fluorescence values I" j (. x t, y, "t) for different positions (JC;, yj) in an examination region of the surrounding medium include,
- Bereitstellen einer Diffusionsverteilungsfunktion G, die von den verschiedenen Positionen (Xj1 , yj) , der Zeit t und einem zu optimierenden Bewegungsparameter D ' abhängt;Providing a diffusion distribution function G which depends on the different positions (Xj 1 , yj), the time t and a motion parameter D 'to be optimized;
- Ermitteln von Werten für die Diffusionsverteilungsfunktion G für die zu untersuchenden Bewegung der Fuorchrome in dem Umgebungsmedium für den zu optimierenden Bewegungsparameter D ' ,Determining values for the diffusion distribution function G for the movement of the Fuorchrome in the surrounding medium for the motion parameter D 'to be optimized,
- Erweitern einer ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 auf mindestens eine doppelte Breite,Expanding a first experimentally determined series of measurements P 1 to at least twice the width,
- mathematisches Falten der erweiterten, ersten experimentell ermittelten Meßreihe P1 mit der ermittelten Diffusionsverteilungsfunktion gemäßmathematical convolution of the extended, first experimentally determined measurement series P 1 with the determined diffusion distribution function according to
P'/ = /1(x,^/) = ∑∑G0--x,y-j,/,D1)-/0< 3y,l),P ' / = / 1 (x, ^ /) = ΣΣG0 - x, yj, /, D 1 ) - / 0 < 3 y, l),
um simulierte Meßreihen zu ermitteln,to determine simulated series of measurements,
- Bestimmen des Bewegungsparameters D aus einem Vergleich der experimentellen Meßreihen mit den simulierten Meßreihen unter Verwendung eines Minimierungsver- fahrens für die Differenz zwischen den experimentellen Meßreihen und den simulierten Meßreihen und - Ausgeben einer den ermittelten Bewegungsparameter D anzeigenden Information durch die computerbasierte Auswerteeinrichtung..Determining the motion parameter D from a comparison of the experimental measurement series with the simulated measurement series using a minimization method for the difference between the experimental measurement series and the simulated measurement series and - Issuing a the movement parameter D indicating information by the computer-based evaluation ..
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß als die Diffusionsverteilungsfunktion G eine mehrdimensionale Diffusionsverteilungsfunktion oder eine Gaußverteilung verwendet wird.2. The method according to claim 1, characterized in that a multi-dimensional diffusion distribution function or a Gaussian distribution is used as the diffusion distribution function G.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Mini- mierungsverfahren Abweichungsquadrate minimiert werden.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that in the minimization minimization method least squares are minimized.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Bewegungsparameter ermittelt werden, bei denen es sich wahlweise um Diffusionskoeffizienten für die Fluorochrome handelt. 4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that a plurality of movement parameters are determined, which are optionally to diffusion coefficients for the fluorochromes.
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