WO2007069453A1 - 心電図ｑｔ時間延長作用の評価法 - Google Patents

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Hiroshi Kato
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
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    • A61B5/318—Heart-related electrical modalities, e.g. electrocardiography [ECG]
    • A61B5/346—Analysis of electrocardiograms
    • A61B5/349—Detecting specific parameters of the electrocardiograph cycle
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    • A61B5/41—Detecting, measuring or recording for evaluating the immune or lymphatic systems
    • A61B5/411—Detecting or monitoring allergy or intolerance reactions to an allergenic agent or substance

Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the effect of extending the electrocardiogram QT time.
  • Electrocardiogram QT time is the time from the start of ventricular depolarization to the end of repolarization.
  • a polymorphic ventricular frequency type called torsades de pointes (TdP) Beats may be triggered.
  • TdP torsades de pointes
  • the extension of the electrocardiogram QT time means that the action potential duration of the ventricular muscle is extended.
  • the ionic current involved in the repolarization of the ventricular muscle action potential is the delayed rectification cur- rent current (I). When I is suppressed, the action potential duration is prolonged.
  • E4031 which is supposed to selectively suppress Kr
  • rabbits, guinea pigs, rats, and mice As a result of examination under anesthesia, it was found that in Usagi and guinea pigs, E4031 showed an increase in QT time, which was not observed in rats and mice.
  • Usagi was also sensitive to TdP-like ventricular tachycardia, and was judged to be a highly sensitive animal. However, it was considered unsuitable for evaluation of multiple specimens with large body weight (approximately 2 kg).
  • Non-Patent Document 1 J. Toxicol. Sci., 23, 344, 1998
  • an object of the present invention is to provide an in vivo evaluation method for extending electrocardiogram QT time using a small animal.
  • the present inventor can anesthetize a hamster under conditions where the end of the T wave is clarified on the electrocardiogram, thereby facilitating the measurement of the QT time, and the nomstar anesthetized under such conditions.
  • the inventors have found that the effects of terfenadine, an agent for allergic diseases, and cisapride, a gastrointestinal motility activation regulator, which are recognized to have a long action, are the same as those of humans under anesthesia, and thus completed the present invention.
  • an anesthetized mouse or muster is prepared under the condition that the end of the T-wave is clarified on the electrocardiogram, and the test substance is analyzed by comparing the electrocardiogram QT time of the hamster before and after administration of the test substance.
  • Electrocardiogram Provides an evaluation method for the ECG QT time prolongation effect of the test substance, including the evaluation of the QT time prolongation effect.
  • the condition of anesthesia is, for example, mixed anesthesia of pentobarbital and xylazine.
  • FIG. 1-1 ECG of a hamster under pentobarbital single anesthesia. From the top, standard lead I ECG, lead II ECG, lead III ECG, VR lead ECG, VL lead ECG, and VF lead ECG (chart photo).
  • FIG. 1-2 ECG of a hamster under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine. From the top, standard lead I ECG, lead II ECG, lead III ECG, VR lead ECG, VL lead ECG, and VF lead ECG (chart photo).
  • FIG. 2 Standard electrocardiogram of a hamster under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine (chart photo).
  • FIG. 3 Standard lead ECG of hamster under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine (chart) (upper) and basic waveform of human ECG (lower).
  • FIG. 4 Relationship between electrocardiogram QT time and RR time in hamsters under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine (one case).
  • FIG. 5 Effect of E4031 on ECG in hamsters under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine (chart photo).
  • the broken lines in the figure indicate the QRS start point and the T wave end point before administration of E4031.
  • FIG. 6 Effect of E4031 on ECG parameters in hamsters under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine.
  • FIG. 7-1 Effect of terfenadine on ECG parameters in hamsters under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine.
  • FIG. 7-2 Effect of cisapride on ECG parameters in hamsters under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine.
  • FIG. 7-3 Effect of E4031 on ECG parameters in hamsters under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine.
  • the evaluation method of the present invention provides an anesthesia condition in which the end of the T wave is clarified on an electrocardiogram, for example, a nomster anesthetized with a combination of bentvalpital and xylazine, and the hamster before and after administration of the test substance. It is characterized by evaluating the electrocardiogram QT time prolonging effect of the test substance by comparing the electrocardiogram QT time.
  • the hamster used in the evaluation method of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to use a hamster supplied as an experimental animal in terms of breeding management.
  • the hamster used is not particularly limited as long as it has grown to an extent suitable for electrocardiogram measurement, but it is usually 4 to 30 weeks old.
  • the condition that the terminal part of the electrocardiogram T wave becomes clear and the QT time can be measured may be selected.
  • Such a condition can be selected by using as an index that the heart rate does not increase.
  • pentobarbital anesthesia single anesthesia results in a relatively high sympathetic activity and a high heart rate, and the end of the ECG T wave overlaps with the next P wave, making it difficult to distinguish. It is suitable for time measurement, but in mixed anesthesia with xylazine anesthesia, the heart rate decreased compared to pentobarbital alone anesthesia, and the end of the electrocardiogram T wave separated from the next P wave and clearly It becomes possible to measure the QT time.
  • Anesthesia is not particularly limited as long as the terminal part of the electrocardiogram T wave becomes clear and the QT time can be measured.
  • a specific anesthesia method for example, a mixture of pentobarbital and xylazine is used. Examples include anesthesia, mixed anesthesia of ketamine and xylazine, urethane anesthesia, hypochlorose anesthesia, inhalation anesthesia of halothane and isoflurane, and preferably mixed anesthesia of pentobarbital and xylazine.
  • An example of pentobarbital is 30 to 70 mg / kg administered intraperitoneally.
  • Xylazine is, for example, injected by muscle injection at 1 to 3 mg / kg.
  • Pettinger et al. (Pettinger WA, Tanaka K., Keeton ⁇ ., Campbell WB, and Bro oks SN: Renin release, an artifact of anesthesia and its implications in rats. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 148, 625-630, 1975) reported that urethane anesthesia had a tendency to slightly increase heart rate in rats, but the increase in heart rate was small compared to pentobarbital compared at the same time. Urethane anesthesia is also applicable to this method.
  • ⁇ -chloralose anesthesia has no effect on heart rate (Marullaz RD, ombre A., and Boucher M .: omparison of the effects of pentobarbital and chloral ose on the cardiac rhythms of the dog in chronic atrio— ventricular heart block. Eur. J. Pharmacol., 32, 393-395, 1975) and reports of increased heart rate (Boucher M., Dubray C, Li JH, Paire M., and Duchene— Marullaz P .: Influence of pentobarbital and chloralose anesthesia on quinidine— induce effects on atrial refractoriness and he art rate in the dog.J. Cardiovasc. Pharmacol. 17, 199-206, 1991), but the latter report also compares with pentobarbital. Therefore, the increase in heart rate is applicable to this method.
  • halothane and isoflurane have been reported to have a direct action on sinus nodules that suppresses the ability to automate, that is, reduces heart rate (Bosnjak ZJ, and Kampine JP: mfects of halothane, enflurane, ana isoflurane on the 3 ⁇ 4A node. Anesthesiol., 58, 314-321, 1983).
  • the induction in the measurement of the electrocardiogram is not particularly limited, but body surface induction is preferable, more preferably standard limb induction I or II, or unipolar limb induction VR is preferable, and standard limb induction II is particularly preferable.
  • the position of the hamster at the time of measurement is not particularly limited, but the supine position or the prone position is preferable.
  • the supine position is preferable.
  • the apparatus used for the measurement of the electrocardiogram may be a normal electrocardiogram measurement apparatus except that the measurement conditions such as sensitivity and frequency characteristics are adjusted for hamster electrocardiogram measurement.
  • ECG measurement device May be a commercially available one or a combination of an amplifier and a recorder.
  • Preferred device characteristics include sensitivity: 10 to: LOOmm / mV, frequency characteristics: 0.08 Hz to: -6 dB at LkHz.
  • ECG measurements of hamsters are as follows: Basic Res. Cardiol, 98, 367-379, 2003, J. Pharma col. Exp. Ther, 284, 125-135, 1998, Heart Vessels, 8, 186-193, 1993 , Jap. J. Physiol., 41, 629-651, 1991, Cardiovas. Res., 25, 49-57, 1991, Jap. J. Antibio., 34, 231 -252, 1986, Jap. Cir. J ., 46, 1305-1312, 1982, etc.
  • the report that the R wave is bimodal was strong.
  • the human electrocardiograph did not recognize the bimodality of the R wave, and had good frequency characteristics, and the bimodal R wave was recorded by the combination of the biological amplifier and the thermal array recorder. Therefore, the difference in the waveform of the R wave is considered to be the difference in the recording conditions.
  • the R wave waveform may vary depending on the measurement conditions. The measurement conditions are not limited as long as the electrocardiogram QT time can be measured in a hamster that has undergone mixed anesthesia.
  • Measurement of electrocardiogram QT time and administration of a test substance may be carried out according to ordinary methods. Usually, a hamster under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine is prepared, the electrocardiogram QT time of the hamster is measured, the test substance is administered to the hamster, and the electrocardiogram QT time of the hamster after administration is measured. Thus, the electrocardiogram QT time of the hamster before and after administration of the test substance can be obtained. By comparing the electrocardiogram QT time of the hamster before and after administration, the electrocardiogram QT time prolonging effect of the test substance can be evaluated.
  • the positive control is not particularly limited as long as it is a substance known to have an electrocardiogram QT time prolonging action, and examples thereof include E4031.
  • the dose was lOOOO / z g / kgd mL / kg).
  • Pentobarbital sodium (Nembutal (registered trademark)) used for animal anesthesia was purchased from Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. (Osaka).
  • Xylazine hydrochloride (Seractal (registered trademark)) was purchased from Bayer Corporation (Tokyo).
  • Seractal (registered trademark) was a 20 mg / mL solution as xylazine, and was diluted 20-fold with physiological saline at the time of administration and intramuscularly injected at 1 mg / kg (l mL / kg).
  • Limb lead electrocardiogram (standard limb lead and monopolar lead) is an electrocardiograph (ECG-6403, Nikko Measurement and recording using a Denki Kogyo Co., Ltd., Tokyo), or measurement using a bioelectric amplifier (AB-65 1J (S-1516), Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo) WS-682G, Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo).
  • ECG-6403 electrocardiograph
  • AB-65 1J (S-1516) Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo
  • WS-682G Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo
  • An example of atrial pacing was using a ventilator for small animals (SAR-830P, CWE Inc., Ardmore, PA, USA). Was done.
  • an electrical stimulator (SEN-7203682G, Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo) and an isolator (SS-403J, Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo) were used. Stimulated with a large square wave.
  • the electrocardiogram waveform recorded in a state where the hamster was anesthetized with sodium pentobarbital 50 mg / kg, ip and kept in the supine position is shown in Fig. 1-1.
  • This electrocardiogram waveform was measured and recorded using a bioelectric amplifier and a thermal array recorder.
  • the leads for which each wave on the ECG was clearly recorded were standard limb leads I and II and unipolar limb lead VR, but standard limb lead I is susceptible to respiration (see 5 in Figure 1-1). And 6th beat), and monopolar limb guidance VR is recorded with reversed polarity and is difficult to read. Therefore, the standard limb lead II (standard lead II electrocardiogram) was the lead for which the ECG parameters were easy to evaluate. However, in these inductions, the end of the T wave overlapped with the P wave (the waveform will be described later), and it was impossible to measure the QT time.
  • Fig. 12 shows an electrocardiogram waveform after intramuscular injection of 2 mg / kg of xylazine to this animal.
  • the heart rate decreased, that is, the RR time was prolonged, the end of the T wave became clear, and the QT time became measurable. Therefore, the following study was conducted under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine.
  • Fig. 2 shows the difference between electrocardiogram measurement devices.
  • the upper row shows the standard induced electrocardiogram recorded with a human electrocardiograph, and the lower row shows the standard II electrocardiogram waveform measured and recorded using a bioamplifier and a thermal array recorder.
  • the electrocardiograph for humans has a low high frequency response of 35 Hz (-3 dB under the condition that the myoelectric filter is ON) and a high frequency response of 100 Hz (-3 dB) of the recording unit. Bimodality cannot be recorded.
  • the sensitivity is as low as 20 mm / mV at the maximum, the start and end points of the P and T waves are difficult to read. Therefore, an electrocardiogram was recorded using a bio-amplifier and a thermal array recorder having characteristics suitable for hamster electrocardiogram measurement.
  • Fig. 3 shows the standard lead II ECG waveform and measurement parameters.
  • the lower part schematically shows the human electrocardiogram waveform.
  • the time axes were made almost equal.
  • the characteristics of the hamster electrocardiogram were as follows.
  • PQ time From the start point of the P wave to the start point of the R wave
  • QRS time (or QRS width): From the start point to the end point of the R wave
  • the value of a parameter at a certain point in time is basically the average of 2 beats or 4 beats, or the value of 1 beat. In some cases, the current parameter values were used.
  • FIG. 5 shows the standard lead II ECG when E4031 was administered intravenously to a hamster under mixed anesthesia with pentobarbital and xylazine.
  • force-Eureka placed in the external jugular vein was also administered intravenously.
  • the doses were 10, 100, and 1000 / z g / kg, and were administered intravenously at 10 minute intervals.
  • Each record in FIG. 5 is a standard lead II electrocardiogram 1 minute after administration.
  • QT time was prolonged after lO ⁇ u g / kg administration, and QT time was further prolonged after 100 / z g / kg administration. At 1 mg / kg, P waves disappeared and it was judged that sinoatrial block occurred.
  • Fig. 6 summarizes the results of studying the effects of E4031 on ECG parameters in 5 hamsters by reducing the minimum dose of E4031 to 1 ⁇ g / kg.
  • the figure on the left is an absolute value, and the right figure is expressed as a percentage change from the pre-dose value. Since only one patient was administered intravenously with saline alone, statistical analysis was powerful.
  • E4031 After the administration of 1 mg / kg, sinoatrial block was observed in all patients, so ECG parameters were not measured. It was.
  • E4031 was a change of about 10% of the force that was slightly extended at 100 g / kg with respect to the PQ time, and it was considered that there was no significant effect. There was little effect on QRS time. On the other hand, a significant prolongation effect was observed on QT time. Although statistical analysis was not performed, an extension of about 10% was observed at 1 ⁇ g / kg. The RR time was also extended at 10 g / kg or more.
  • a 10% PEG solution was used as a solvent, and equimolar hydrochloric acid was dissolved.
  • the administration method is intravenous, the dose is 10-1000 [0048] [Chemical 2]
  • the administration method was intravenous administration, and the dosage was 1 to 100 g / kg (l mL / kg).
  • the dose was lOO / z g / kgd mL / kg).
  • Standard II ECGs were measured using a bioelectric amplifier (AB-651J (S-1516), Nihon Kohden Co., Ltd., Tokyo), and a thermal array recorder (WS-682G, Nihon Kohden Co., Ltd., Recorded in Tokyo).
  • the hamster was anesthetized with sodium pentobarbital 50 mg / kg, ip, and then intramuscularly injected with 1 mg / g of xylazine.
  • the patient was held in the supine position, and needle electrodes were inserted into the right forelimb and bilateral hindlimbs, and the lead ECG was measured.
  • the neck skin was incised, and force-yure was placed in the external jugular vein for intravenous administration.
  • Terfenadine was intravenously administered at 10, 100, and 1000 g / kg, and cisapride and E4031 were intravenously administered at approximately 10 minute intervals at 1, 10, and 100 / z g / kg.
  • 1 mL / kg of 10% PEG solution was intravenously administered 3 times at 10-minute intervals.
  • Example number is Telhue
  • Figures 7-1, 7-2, and 7-3 show the electrocardiograms of terfenadine, cisapride, and E4031, respectively. The effect on diagram parameters is shown. Terfenadine was observed to prolong QT time after administration of 1 mg / kg. The extent of extension was approximately 20%. At the same time, the PQ time was extended. There was no significant effect on QRS time and RR time.
  • Cisapride showed an increase in QT time at 100 ⁇ g / kg, which was about 20%. There was no significant effect on PQ time, QRS time, and RR time.
  • E4031 significantly prolonged the QT time at 10 ⁇ g / kg, which was about 20%. This dose had no significant effect on the RR time. At 100 g / kg, the QT time was further extended, showing a 50-60% increase. An extension of RR time was also observed. The PQ and QRS times were almost unaffected.
  • the required amount of the test substance is small.

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Abstract

心電図上T波終末部が明確になる条件で麻酔したハムスターを準備し、被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図QT時間の比較により、被検物質の心電図QT時間延長作用を評価することを含む、被検物質の心電図QT時間延長作用の評価法。

Description

明 細 書
心電図 QT時間延長作用の評価法
技術分野
[0001] 本発明は、心電図 QT時間延長作用の評価法に関する。
背景技術
[0002] 現在、薬剤による心電図 QT時間の延長が問題になっており、 ICHのガイドラインに もあるように、医薬品開発の早期の段階でその作用の有無に関する評価が求められ ている。心電図 QT時間は、心室の脱分極の開始から再分極の終了までの時間であ る力 QT時間が薬剤等によって延長した場合に torsades de pointes (TdP)と言われ るタイプの多形性心室頻拍が誘発される場合がある。この不整脈が誘発された際に は失神発作を起こし、また、心室細動へ移行し致命的となる場合もある。薬剤投与に よる QT時間の延長と TdPの誘発は、 Vaugham Williams分類の la群に属する抗不整脈 薬について多く報告されていた力 近年、エリスロマイシン等の抗生物質、テルフエ ナジンゃァステミゾールといった抗ヒスタミン剤等の非循環薬による QT時間の延長と TdPの発生が報告されてきて 、る。さらに薬物相互作用で TdPが発生する場合もある 。したがって、ヒト用医薬品として開発途中にあるすベての化合物について、安全性 薬理試験の一環として心電図 QT時間に及ぼす影響を検討する必要がある。
[0003] 心電図 QT時間が延長するということは、心室筋の活動電位持続時間が延長するこ とを意味する。心室筋活動電位の再分極に関与して 、るイオン電流は遅延整流カリ ゥム電流 (I )であり、 Iを抑制すると活動電位持続時間は延長する。心電図 QT時間
K K
を延長する薬剤の大部分は、 Iの速いコンポーネント（I )を通過させる HERGチヤネ
K Kr
ルを抑制するものとされる。
[0004] 心電図 QT時間延長の in vivo評価系としては、麻酔ィヌ、及び覚醒ィヌでの評価が 安全性薬理試験として行なわれている。しかし、探索段階の化合物の in vivo評価の 場合には、ィヌの使用は、実験技術面及びィ匕合物の必要量の点から困難である。そ こで、より小動物での心電図評価が検討された (非特許文献 1)。 I
Krを選択的に抑制 するとされる E4031に対する作用を、ゥサギ、モルモット、ラット、及びマウスを用いて 麻酔下で検討した結果、ゥサギ及びモルモットにお!ヽては E4031による QT時間の延 長が認められた力 ラット及びマウスでは認められな力つた。
[0005] ラット及びマウスでは、 QT時間に関与するイオンチャンネルがヒトとは異なることが、
QT延長の評価には使えない理由であると考えられ、同じげつ歯類であるハムスター も同様であろうと考えられて ヽた。
[0006] また、モルモットでは QT時間の延長の程度が小さぐ感受性が低いと考えられた。
ゥサギは感受性が高ぐ TdP様の心室頻拍も認められ、感度良い評価動物であると判 断されたが、体重 (約 2kg)が大きぐ多検体評価には不向きと考えられた。
非特許文献 1 :J. Toxicol. Sci., 23, 344, 1998
発明の開示
[0007] 心電図 QT時間延長の in vivo評価系につ!/、ては、探索段階での化合物量が少な!/、 時点での評価を考えると、より小動物での評価系が望まれる。従って、本発明は、小 動物を用いた心電図 QT時間延長の in vivo評価方法の提供を目的とする。
[0008] 本発明者は、ハムスターを、心電図上 T波終末部が明確になる条件で麻酔でき、そ れにより QT時間の測定が容易になること、及び、この様な条件で麻酔したノヽムスター における QT時間に対する、 I 選択的抑制剤の E4031、ならびに、臨床で QT時間延
Kr
長作用が認められている、アレルギー性疾患用剤のテルフエナジン及び消化管運動 賦活調整剤のシサプリドの効果が、ヒトゃ麻酔下のィヌと同様であることを見出し、本 発明を完成した。
[0009] 本発明は、心電図上 T波終末部が明確になる条件で麻酔したノ、ムスターを準備し、 被検物質の投与の前後における前記ハムスターの心電図 QT時間の比較により、被 検物質の心電図 QT時間延長作用を評価することを含む、被検物質の心電図 QT時 間延長作用の評価法を提供する。
[0010] 麻酔の条件は、例えば、ペントバルビタールおよびキシラジンの混合麻酔である。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1-1]ペントバルビタール単独麻酔下のハムスターの心電図。上段より標準第 I誘導 心電図、第 II誘導心電図、第 III誘導心電図、 VR誘導心電図、 VL誘導心電図、及び VF誘導心電図（チャートの写真)。 [図 1-2]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターの心電図。上段 より標準第 I誘導心電図、第 II誘導心電図、第 III誘導心電図、 VR誘導心電図、 VL誘 導心電図、及び VF誘導心電図 (チャートの写真)。
[図 2]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターの標準誘導心電図 (チャートの写真)。 a)ヒト用の心電計で記録した標準肢誘導心電図 上段から標準 第 I誘導心電図 (LI)、標準第 II誘導心電図 (LII)、標準第 III誘導心電図 (LIII) 増幅 部高域周波数特性： 35 Hz (-3 dB、筋電フィルタ ONの条件下） 記録部周波数特 性： 0.05〜 100 Hz (-3 dB)、感度： 20 mm/mV。 b)生体用アンプ及びサーマルアレ ィレコーダで測定、記録した標準第 II誘導心電図 生体用アンプの周波数特性： 0.0
8〜 300 Hz、サーマルアレイレコーダの周波数特性： DC〜 2.8 k Hz、感度： 70 m
[図 3]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターの標準第 II誘導心 電図 (チャートの写真）（上段)及びヒトの心電図の基本波形 (下段)。
[図 4]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図 QT 時間と RR時間との関係（1例)。
[図 5]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図に 及ぼす E4031の影響 (チャートの写真)。 図中の破線は、 QRSの開始点及び E4031 投与前の T波の終点の位置を示す。
[図 6]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図パ ラメータに及ぼす E4031の影響。
[図 7-1]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図 パラメータに及ぼすテルフエナジンの影響。 黒三角：テルフエナジン、白丸：対照 (CO ntrol)、各値は、 5例の平均値士標準誤差で表した。 * :pく 0.05 vs control。
[図 7-2]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図 パラメータに及ぼすシサプリドの影響。 黒四角：シサプリド、白丸：対照 (control)、各 値は、 5例の平均値士標準誤差で表した。 * :pく 0.05 vs controlo
[図 7-3]ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターにおける心電図 パラメータに及ぼす E4031の影響。 黒丸： E4031、白丸：対照 (control),各値は、 5 例の平均値士標準誤差で表した。 * : pく 0.05 vs controlo
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明の評価方法は、心電図上 T波終末部が明確になる麻酔条件、例えばベント バルピタール及びキシラジンの組合せで麻酔したノヽムスターを準備し、被検物質の 投与の前後における前記ハムスターの心電図 QT時間の比較により、被検物質の心 電図 QT時間延長作用を評価することを特徴とする。
[0013] 本発明の評価方法において用いられるハムスターは、特に限定されないが、実験 動物として供給されているハムスターを用いることが、飼育管理の点では好ましい。用 いるハムスターは、心電図の測定に適する程度まで成長していれば、特に限定され ないが、通常には、 4〜30週齢である。
[0014] 麻酔は、心電図 T波の終末部が明確になって QT時間が計測可能になる条件を選 択すればよい。このような条件は、心拍数が増カロしないことを指標にして選択できる。 例えばペントバルビタール麻酔の場合、単独麻酔では交感神経活性が相対的に高 くなつて心拍数が高い状態になり、心電図 T波の終末部が次の P波に重なり判別し難 くなつて心電図 QT時間の計測には適さな 、が、これにキシラジン麻酔をカ卩えた混合 麻酔では、ペントバルビタール単独麻酔に比べ心拍数が減少して心電図 T波の終末 部が次の P波と分離し明確になって QT時間の計測を可能にすることができる。
[0015] 麻酔は、心電図 T波の終末部が明確になって QT時間が計測可能になる条件であ れば特に限定されないが、具体的な麻酔方法としては、例えば、ペントバルビタール とキシラジンの混合麻酔、ケタミンとキシラジンの混合麻酔、ウレタン麻酔、 ひ -クロラロ ース麻酔、ハロセンやイソフルレンの吸入麻酔等が挙げられ、好ましくはペントバルビ タールとキシラジンの混合麻酔が望ましい。ペントバルビタールは、例えば、 30〜70 mg/kgを腹腔内投与することが挙げられる。キシラジンは、例えば、 l〜3mg/kgを筋 肉注射することが挙げられる。
[0016] 上記に挙げた麻酔方法の中で、ケタミンとキシラジンの混合麻酔は、ィヌに対して、 キシラジン 1.0 mg/kg, ivで心拍数が低下し、その後ケタミン 10 mg/kg ivにより、キシ ラジン投与前のレベル以上に一過性に心拍数が上昇する力 その後徐々に低下し、 キシラジン投与前のレベル前後に落ち着くことが報告されている（Haskins S. C, Patz J. D., and Farver T. B.: Xylazine and xylazine— ketamine in dogs. Am. J. Vet. Res, 47, 636-641, 1986)ことから、本方法に適用可能である。
[0017] また Pettingerら（Pettinger W. A., Tanaka K., Keeton Κ., Campbell W. B.， and Bro oks S. N.: Renin release, an artifact of anesthesia and its implications in rats. Proc. Soc.Exp.Biol. Med., 148, 625-630, 1975)は、ウレタン麻酔が、ラットにおいてわずか に心拍数を上昇させる傾向があると報告している力 同時に比較されているペントバ ルビタールと比較して心拍数の上昇は小さぐウレタン麻酔も本方法に適用可能であ る。
[0018] α -クロラロース麻酔については、心拍数に影響しないという報告（Marullaz R. D., し ombre A., and Boucher M.: し omparison of the effects of pentobarbital and chloral ose on the cardiac rhythms of the dog in chronic atrio— ventricular heart block. Eur. J. Pharmacol., 32, 393-395, 1975)と、心拍数を上昇させるという報告（Boucher M.， Dubray C, Li J. H., Paire M., and Duchene— Marullaz P.: Influence of pentobarbital and chloralose anesthesia on quinidine— induce effects on atrial refractoriness and he art rate in the dog. J. Cardiovasc. Pharmacol. 17, 199-206, 1991)があるが、後者の 報告でもペントバルビタールと比較して心拍数の上昇は小さぐ本方法に適用可能 である。
[0019] またハロセン及びイソフルレンは、洞結節に対する直接作用としては、自動能を抑 制、つまり心拍数を低下させる作用があると報告されている（Bosnjak Z. J., and Kamp ine J. P.: mfects of halothane, enflurane, ana isoflurane on the ¾A node. Anesthesiol ., 58, 314-321, 1983)ことから、本方法に適用可能である。
[0020] 心電図の測定における誘導は、特に限定されないが、体表面誘導が好ましぐ更に 好ましくは標準肢誘導 I若しくは II、又は単極肢誘導 VRが好ましぐ特に標準肢誘導 II が好ましい。
[0021] 測定時のハムスターの体位は、特に限定されな 、が、仰臥位又は伏臥位が好ましく
、更には仰臥位が好ましい。
[0022] 心電図の測定に用いる装置は、感度や周波数特性などの測定条件を、ハムスター の心電図測定用に調整する他は、通常の心電図測定装置でよい。心電図測定装置 は、市販のものでもよいし、アンプやレコーダを組合せて構成してもよい。好ましい装 置の特性としては、感度： 10〜： LOOmm/mV、周波数特性： 0. 08Hz〜： LkHzで— 6dB が挙げられる。
[0023] ハムスターの心電図の測定は、 Basic Res. Cardiol, 98, 367-379, 2003、 J. Pharma col. Exp. Ther, 284, 125-135, 1998、 Heart Vessels, 8, 186-193, 1993、 Jap. J. Physi ol., 41, 629-651, 1991、 Cardiovas. Res., 25, 49-57, 1991、 Jap. J. Antibio., 34, 231 -252, 1986、 Jap. Cir. J., 46, 1305-1312, 1982等で報告されている。それらの心電図 波形と、後記実施例で記録された心電図波形とを比較すると、 P波の波形には差が 認められな力つた。しかし、 R波が二峰性である報告はな力つた。文献では、心電図 記録条件の記載がない報告もあった力 その心電図記録のほとんどがヒト用の心電 計〖こよるものと考えられる。後記実施例においてもヒト用心電計では R波の二峰性は 認められず、周波数特性の良 、生体アンプとサーマルアレイレコーダの組み合わせ で二峰性の R波が記録された。したがって R波の波形の違いは記録条件の違 、であ ると考えられる。このように測定条件により R波の波形は相違し得る力 混合麻酔を施 したハムスターにおいて心電図 QT時間が測定できる限り測定条件は限定されない。
[0024] 心電図 QT時間の測定、および、被検物質の投与は、通常の方法に従って行えば よい。通常には、ペントバルビタールおよびキシラジンの混合麻酔下のハムスターを 準備し、前記ハムスターの心電図 QT時間を測定し、被検物質を前記ハムスターに投 与し、投与後のハムスターの心電図 QT時間を測定することにより、被検物質の投与 の前後における前記ハムスターの心電図 QT時間を得ることができる。投与の前後に おける前記ハムスターの心電図 QT時間の比較により、被検物質の心電図 QT時間延 長作用を評価することができる。
[0025] また、試験間のバラツキを考慮するため、評価の際には陽性対照を用いることが好 ましい。陽性対照としては、心電図 QT時間延長作用を有することが知られている物 質であれば、特に限定されず、例えば、 E4031が挙げられる。
[0026] 続いて実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なおこれらは実施の一例 をして示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また以下 の記載に用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくもので ある。
実施例 1
[0027] 1. 動物、試薬、及び機器
1. 1. 供試動物
シリアン 'ノ、ムスター（体重： 122〜150 g、週齢： 7又は 9〜10)を用いた。 ハムスターは日本エスエルシー株式会社 (浜松、静岡）から購入した。温度 (23±2 °C)、湿度 (55± 10 %RH)、照明（12時間明暗照明）の管理下で予備飼育した後に実 験に供した。 飼育中、実験動物用固形飼料 MF (オリエンタル酵母工業株式会社（ 東京)）、及び水道水を自由摂取させた。
[0028] 1. 2. 被験物質及び試薬
1. 2. 1. E4031
生理食塩水に溶解して静脈内投与した。
投与量は l lOOO /z g/kgd mL/kg)とした。
[0029] [化 1]
Figure imgf000008_0001
[0030] 1. 2. 2. その他の試薬
動物の麻酔に用いたペントバルビタールナトリウム (ネンブタール (登録商標)）は大 日本製薬株式会社 (大阪)から購入した。また、塩酸キシラジン (セラクタール (登録商 標)）はバイエル株式会社 (東京)から購入した。セラクタール (登録商標)は、キシラジ ンとして 20 mg/mLの溶液であり、投与時には生理食塩水で 20倍希釈し、 1 mg/kg(l mL/kg)を筋注した。
[0031] 1. 3. 機器及び器具
四肢誘導心電図 (標準肢誘導及び単極肢誘導)は、心電計 (ECG-6403、 日本光 電工業株式会社、東京）を用いて測定及び記録、または、生体電気用アンプ (AB-65 1J (S-1516)、日本光電工業株式会社、東京）を用いて測定し、サーマルアレイレコー ダ (WS-682G、日本光電工業株式会社、東京）上に記録した。心房ぺーシングした例 は、小動物用人工呼吸器（SAR- 830P、 CWE Inc., Ardmore, PA, USA)を用い、 1回 換気量: 3 mL、呼吸回数: 30回 Z分の条件で人工呼吸を行なった。心房ぺーシング には電気刺激装置 (SEN-7203682G、日本光電工業株式会社、東京)及びアイソレ ータ（SS-403J、 日本光電工業株式会社、東京）を用い、幅 1 ms、閾値の 2倍の大きさ の矩形波で刺激した。
[0032] 2. 方法及び結果
2. 1. 心電図記録法に関する検討
ハムスターをペントバルビタールナトリウム 50 mg/kg, ip.により麻酔し、仰臥位に保 定した状態で記録した心電図波形を図 1—1に示した。この心電図波形は、生体電 気用アンプ及びサーマルアレイレコーダを用いて測定、記録したものである。心電図 上の各波が明確に記録された誘導は、標準肢誘導 I、 II、及び単極肢誘導 VRであつ たが、標準肢誘導 Iは呼吸の影響を受けやすく（図 1—1の 5及び 6拍目）、また、単極 肢誘導 VRは極性が逆に記録され判読し難い。したがって、心電図上のパラメータが 評価しやすい誘導は標準肢誘導 II (標準第 II誘導心電図)であった。しかし、これらの 誘導において T波終末部が P波に重なり（波形については後述）、 QT時間の計測は 不可能であった。
[0033] この動物にキシラジン 2 mg/kgを筋注した後の心電図波形を図 1 2に示した。キ シラジン投与により心拍数が低下、すなわち RR時間が延長し、 T波終末部が明確に なり、 QT時間が計測可能となった。そこで以下の検討は、ペントバルビタールとキシ ラジンの混合麻酔下で行なうこととした。
[0034] 次に、動物の体位を変えつつ心電図記録をし、心電図波形に及ぼす体位の影響 を検討した。図には示さないが、仰臥位力も伏臥位に変えても心電図上の変化は認 められな力つた。 右横臥位にした際には、 T波が二相性となり T波終末部の決定が 困難となった。左横臥位にした場合には、標準肢誘導 I及び IIの S波の上昇が認めら れた。 T波終末部の見やすさ、及び操作のしゃすさから、仰臥位で記録することとし た。
[0035] 図 2に心電図の測定装置の違いを示した。上段はヒト用心電計で記録した標準誘 導心電図、下段は生体用アンプとサーマルアレイレコーダを用いて測定、記録した 標準第 II誘導心電図波形を示した。ヒト用心電計は、増幅部の高域周波数特性が 35 Hz (-3 dB、筋電フィルター ONの条件下）、記録部の高域周波数特性が 100Hz (-3dB )と低いため、 R波の二峰性も記録できない。また、感度も最大で 20 mm/mVと低いた め、 P波及び T波の始点及び終点が判読し難い。したがって、ハムスターの心電図測 定に適した特性を有して 、た生体用アンプとサーマルアレイレコーダを用いて心電 図記録を行なった。
[0036] 2. 2. ハムスターの心電図波形の特徴
図 3の上段に標準第 II誘導心電図波形及び計測パラメータを示した。下段にはヒト の心電図波形を模式的に表した。これらの図は、時間軸がほぼ等しくなるようにした。 ハムスターの心電図 (標準第 II誘導心電図）の特徴は次のとおりであった。
[0037] (1) Q波が認められない（正常なヒトの標準第 II誘導心電図でも Q波は認められない）
(2) R波が二峰性
(3) S波が認められない
(4) T波のピークが R波に近い
(5) T波終末部がなだらかに基線に戻る
(6) RR間隔が短い
[0038] したがって、心電図上のパラメータの計測は次のように行なった。
PQ時間（または PQ間隔）： P波の開始点から R波の開始点まで
QRS時間（または QRS巾）： R波の開始点から終点まで
QT時間（または QT間隔）： R波の開始点から T波の終点まで
[0039] 以下の検討においては、ある時点でのパラメータの値は、基本的には連続する 3拍 の値の平均値とした力 2拍または 4拍の平均値、あるいは 1拍の値をその時点でのパ ラメータ値とした場合もあった。
[0040] 2. 3. 心電図 QT時間の性質に関する検討
QT時間の頻度依存性について検討した。ィヌ、ゥサギ、及びモルモットにおいては 、 QT時間は心拍数が上昇する（RR時間が短縮する）と短縮することが知られている。 ハムスターをペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下に開胸し、心房ぺー シングすることで RR時間を短縮しつつ標準第 II誘導心電図を記録し QT時間を計測し た。洞調律時の RR時間が 400 msであったので、ぺーシングの周期長を 400 msから 50 msずつ 250 msまで短縮した。 200 msは不応期に入り、ぺーシング不能であった。各 周期長のベーシングを 30秒以上行なった後に標準第 II誘導心電図を記録した。その 際の QT時間と RR時間の関係を図 4上段に示した。 ぺーシング周期長を短縮し RR 時間を短くすると QT時間も短縮した。ヒトにおいても QT時間は RR時間に影響され、 それを補正するために Bazettの補正式（QTc = QT/ (RR(s)))が用いられている。図 4下段には、 Bazettの式で補正した QTc時間を示した。この例では、 Bazettの式で比 較的補正できている、と考えられる。したがって、ペントバルビタール及びキシラジン の混合麻酔下のハムスターにおいては、 RR時間が短縮すると QT時間が短縮し、この 性質は、ィヌ、ゥサギ、及びモルモットと定性的には同様であると言える。
[0041] 次に、遅延整流外向きカリウム電流の速い成分である I を選択的に抑制する E4031
Kr
の影響を検討した。ヒトにおける薬剤性の QT延長の主因は I 抑制によるものとされて
Kr
いる。動物の場合、ィヌ、ゥサギ、及びモルモットにおいては E4031により QT時間の延 長が認められる力 マウス及びラットでは QT延長は認められないことが知られている 。図 5に、ペントバルビタール及びキシラジン混合麻酔下のハムスターに E4031を静 脈内投与した際の標準第 II誘導心電図を示す。 E4031は、外頸静脈に留置した力- ユーレカも静脈内投与した。投与量は、 10、 100、及び 1000 /z g/kgとし、 10分間隔で 静脈内投与した。図 5の各記録は、投与 1分後の標準第 II誘導心電図である。 lO ^u g/ kg投与後に QT時間の延長が認められ、 100 /z g/kg投与後に QT時間はさらに延長し た。 1 mg/kg投与では P波が消失し、洞房ブロックが生じたと判断した。
[0042] E4031の最少投与量を 1 μ g/kgに下げ、心電図パラメータに及ぼす影響を 5例のハ ムスターで検討した結果を図 6にまとめた。左側の図は絶対値で、右側は投与前値 に対する％変化で表した。生理食塩水のみを静脈内投与したコントロールは、 1例しか 行なわなかったため、統計学的解析は行なわな力つた。 E4031 1 mg/kg投与後は全 例にお 、て洞房ブロックが認められたため、心電図パラメータの計測は行なわなかつ た。 E4031は、 PQ時間に対して、 100 g/kgでわずかに延長が認められた力 10%程 度の変化であり、大きな影響はないと考えた。 QRS時間に対してはほとんど影響しな かった。一方、 QT時間に対しては著明な延長作用が認められた。統計学的解析は 行なっていないが、 1 μ g/kgで 10%程度の延長が認められた。また、 RR時間に対して も 10 g/kg以上で延長が認められた。
[0043] これらの結果から、ペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下のハムスター の心電図 QT時間は、 RR時間が短縮するに伴い短縮し、 I 抑制により延長する性質
Kr
を有することが明ら力となった。これらの性質は、ヒト、ィヌ、ゥサギ、及びモルモットと 類似のものであり、マウスやラットとは異なるものである。
[0044] 混合麻酔ノヽムスターにおけるこの QT時間の延長の程度を、以前に報告されている 麻酔モルモット、麻酔ゥサギ、麻酔及び覚醒のィヌの結果（日薬理誌、 121、 384-392 、 2003)と比較すると、麻酔ノヽムスターの感受性は、麻酔モルモットよりも高ぐ麻酔ゥ サギゃ麻酔ィヌに匹敵するものであった。しかし、麻酔ゥサギのような TdP様の不整 脈の誘発は認められな力つた。したがって、ペントバルビタール及びキシラジンの混 合麻酔下のハムスターは、 I
Kr抑制作用を検出する評価系になると考えられる。さらに
、 RR時間の延長が認められない用量から QT時間の延長が認められた。従って、 QT 時間が RR時間に影響される、 t ヽうことを考慮しなくてもよ!ヽ条件で評価を実施できる という利点が認められた。
実施例 2
[0045] ペントバルビタール及びキシラジンの混合麻酔下のハムスターにおける心電図 QT時 間に及ぼすテルフエナジン、シサプリド及び E4031の影響
[0046] 1. 実験方法
1. 1. 供試動物
シリアン 'ノ、ムスター（体重： 90〜119 g、週齢： 6又は 7)を用いた。
ハムスターは日本エスエルシー株式会社 (浜松、静岡）から購入した。温度 (23±2 °C)、湿度 (55± 10 %RH)、照明（12時間明暗照明）の管理下で予備飼育した後に実 験に供した。 飼育中、実験動物用固形飼料 MF (オリエンタル酵母工業株式会社（ 東京)）、及び水道水を自由摂取させた。 [0047] 1. 2. 被験物質及び試薬
1. 2. 1. テルフエナジン (terfenadine)
10 % PEG 溶液を溶媒とし、等モル強の塩酸をカ卩ぇ溶解した。
200
投与方法は静脈内投与、投与量は 10〜1000
Figure imgf000013_0001
(1 mL/kg)とした [0048] [化 2]
Figure imgf000013_0002
[0049] 1. 2. 2. シサプリド (cisapride)
10 % PEG 溶液を溶媒とし、 2〜3倍モルのクェン酸を加え溶解した c
200
投与方法は静脈内投与、投与量は 1〜100 g/kg (l mL/kg)とした。
[0050] [化 3]
Figure imgf000013_0003
[0051] 1. 2. 3. E4031
10 % PEG 溶液に溶解して静脈内投与した c
200
投与量は l lOO /z g/kgd mL/kg)とした。
[0052] [化 4]
Figure imgf000014_0001
[0053] 1. 2. 4. その他の試薬
実施例 1と同様であった。
[0054] 1. 3. 機器及び器具
標準第 II誘導心電図は、生体電気用アンプ (AB-651J (S-1516)、 日本光電工業株 式会社、東京）を用いて測定し、サーマルアレイレコーダ (WS-682G、 日本光電工業 株式会社、東京）上に記録した。
[0055] 1. 4. 実験手順
ハムスターをペントバルビタールナトリウム 50 mg/kg, ip.により麻酔した後、キシラジ ン 1 mg/gを後肢に筋注した。仰臥位に保定し、右側前肢及び両側後肢に針電極を 刺入し第 II誘導心電図を測定した。頸部皮膚を切開し、外頸静脈に力-ユーレを留 置し、静脈内投与用とした。テルフエナジンは、 10、 100、及び 1000 g/kgを、シサプ リド及び E4031は、 1、 10、及び 100 /z g/kgを、約 10分間隔で静脈内投与した。対照群 は、 10% PEG 溶液 1 mL/kgを 10分間隔で 3回静脈内投与した。例数は、テルフエ
200
ナジン投与群、シサプリド投与群、 E4031投与群、及び対照群の各群 5例とし、総 20 匹の動物を用いた。なお、割り付けは例数のみを考慮した無作為で行なった。
[0056] 1. 5 実験データ解析
統計検定には、 SAS 6.12 (株式会社 SASインスティチュートジャパン、東京）を組み 込んだ統計解析支援システムを使用した。心電図上のパラメータの解析は、経時型 分散分析を行なった後、対応のない t検定を用い、同一時点におけるコントロール群 との比較を行なった。 Pく 0.05の場合に有意な差とした。
[0057] 2. 結果
図 7— 1、 7— 2、 7— 3にそれぞれ、テルフエナジン、シサプリド、及び E4031の心電 図パラメータに及ぼす影響を示した。テルフエナジンは 1 mg/kg投与後に QT時間の 延長が認められた。延長の程度はおよそ 20%であった。同時に PQ時間の延長も認め られた。 QRS時間及び RR時間に対しては有意な影響を及ぼさなカゝつた。
[0058] シサプリドは、 100 μ g/kgで QT時間の延長が認められ、その程度は約 20%であった 。 PQ時間、 QRS時間、及び RR時間に対しては有意な影響を及ぼさな力 た。
[0059] E4031は、 10 μ g/kgで QT時間を有意に延長し、その程度は約 20%であった。この投 与量では RR時間に対して有意な影響を及ぼさな力つた。 100 g/kgでは QT時間はさ らに延長し、 50〜60%の延長を示した。また、 RR時間の延長も認められた。 PQ、 QRS 時間に対しては、ほとんど影響しな力つた。
[0060] 麻酔下のィヌを用い、単相性活動電位の持続時間を指標にして、テルフエナジン、 シサプリド、及び E4031の QT延長作用を検討した報告がある（Xenobiotica, 31, 633- 650, 2001)。その報告の結果から、単相性活動電位の持続時間を 10%延長させる静 脈内単回投与量を算出すると、テルフエナジンが 300 /z g/kg、シサプリドが 100 g/k g、 E4031が 10 g/kgであり、本実施例の結果とほぼ一致するものであった。したがつ て、ペントバルビタールとキシラジンの混合麻酔下のハムスターは、 I 抑制に基づく Q
Kr
τ延長作用を検討する評価系として、麻酔ィヌとほぼ同じ感度であると言える。なお、 テルフヱナジンの 1 mg/kg投与後に PQ時間の延長も認められた力 これはテルフエ ナジンが有する Ca拮抗作用（Cir. Res., 81, 202-210, 1997)によるものと考えられる
[0061] 以上の結果は、混合麻酔下のハムスターは、これらの薬剤に対して、ヒトゃ麻酔下 のィヌと同様の性質を有することを示して 、る。
産業上の利用可能性
[0062] 本発明の評価方法は、小動物であるハムスターが使用されるので、被検物質の必 要量が少ない。特に、探索段階の化合物の in vivo評価の場合のように、化合物量が 少ない時点での評価に有利である。また、実験技術的に容易に、従来一般に使用さ れているィヌよりも多くの検体を試験することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 心電図上 τ波終末部が明確になる条件で麻酔したハムスターを準備し、被検物質の 投与の前後における前記ハムスターの心電図 QT時間の比較により、被検物質の心 電図 QT時間延長作用を評価することを含む、被検物質の心電図 QT時間延長作用 の評価法。
[2] 麻酔がペントバルビタールおよびキシラジンの混合麻酔である、請求項 1に記載の評 価法。
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