WO2007060372A1 - Methode de criblage de modulateurs de recepteurs nucleaires - Google Patents

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WO2007060372A1
WO2007060372A1 PCT/FR2006/051229 FR2006051229W WO2007060372A1 WO 2007060372 A1 WO2007060372 A1 WO 2007060372A1 FR 2006051229 W FR2006051229 W FR 2006051229W WO 2007060372 A1 WO2007060372 A1 WO 2007060372A1
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WO
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nid
polypeptide
cof
lbd
interaction
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/051229
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English (en)
Inventor
Stéphane HELLEBOID
Romain Gineste
Alexis Aquilina
Original Assignee
Genfit
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genfit filed Critical Genfit
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Publication of WO2007060372A1 publication Critical patent/WO2007060372A1/fr

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins

Definitions

  • the present invention relates to screening methods for selecting, identifying and / or characterizing compounds capable of modulating the binding of a nuclear receptor to one or more cofactors.
  • Nuclear receptors belong to a structurally and functionally defined family of transcription factors that are ligand-activated and bind to specific DNA sequences, called response elements, located near the genes they regulate. This family includes nuclear receptors for steroid hormones derived from cholesterol (glucocorticoids, estrogens, progesterone, etc.) and nuclear receptors for thyroid hormones, vitamin D3 or retinoic acid. The family of nuclear receptors, which includes more than fifty different genes, also includes many receptors for which no ligand has been described and called "orphan receptors".
  • Tamoxifen known to inhibit estrogen receptor activity
  • SERM selective ER Modulators
  • the estrogen receptor interacts with DNA via its DNA Binding Domain (DBD) at a specific response element (called RE).
  • DBD DNA Binding Domain
  • RE specific response element
  • the estrogen receptor then interacts with "co-activating" proteins to form a multimeric complex that activates transcriptional machinery and increases the expression of its target genes by remodeling DNA and forming stable pre-initiation complexes. transcription .
  • LBD Ligand Binding Domain
  • nuclear receptors By attaching SNuRMs ligands that modulate the activity of nuclear receptors by allowing differential recruitment of cofactors, nuclear receptors offer the possibility to control more precisely the expression of genes. There is therefore a real interest in the development of methods for identifying this type of ligand.
  • GST-pull down techniques as described for example in the article Krogsdam et al., Biochem. J. 363, 157-165 (2002), use GST-cofactor fusion proteins coupled to beads bearing glutathione and incubated with the nuclear receptor (or part of the nuclear receptor such as LBD) radioactively labeled, in the presence or absence of the ligand to be tested. The interaction is visualized by autoradiography.
  • This technique has disadvantages: the necessary purification of the nuclear receptor is difficult to implement, particularly with the PPAR, LXR and FXR receptors, because of the low purification efficiency due to accumulation in the bacterial inclusion bodies. These purification problems lead to the use of expensive transcription and translation systems.
  • the application EP1267171 describes for example a method for detecting modulators of the PPAR gamma receptor, using (i) on the one hand a polypeptide comprising the domain of a cofactor (for example SRC-1 or TIF-2) which interacts with the nuclear receptor (NID) and which is linked to GST (Glutathione S Transferase), and (ii) a polypeptide comprising the ligand binding domain (LBD or Ligand Binding Domain) of the nuclear receptor (NR) studied, fused to a polyhistidine marker (6xHis).
  • a cofactor for example SRC-1 or TIF-2
  • NID nuclear receptor
  • GST Glutathione S Transferase
  • LBD Ligand Binding Domain
  • the GST-CoF-NID polypeptide is attached to beads carrying glutathione and then incubated in the presence of the other polyHis-NR-LBD polypeptide. Western blots are then made with anti-polyhistidine antibodies.
  • the main disadvantage of this technique lies in the necessary purification of the LBD (or the entire nuclear receptor), which proves to be difficult to implement.
  • the inventors of the present application propose here an alternative to known detection methods, which does not have these disadvantages.
  • the proposed method avoids the use of radioactivity and is both very sensitive and easy to implement.
  • the main advantage of the present invention lies in the fixation of the nuclear receptor on a support: only the cofactor is therefore to be purified, which makes the invention easier to implement.
  • the amount of cofactor used in the screening tests of the present application can therefore be precisely quantified, which makes it possible to ensure a more precise visualization of the differential recruitment of cofactors by the nuclear receptor. In addition, it ensures reproducibility and comparison of results.
  • the inventors have developed a new method for identifying compounds that modulate the interaction of a nuclear receptor with one or more cofactors. This method makes it possible to discriminate the compounds that are useful for the differential recruitment of cofactors and can be carried out in a high-throughput screening format for compounds, in High Throughput Screening (HTS) or in Medium Throughput Screening (MTS).
  • HTS High Throughput Screening
  • MTS Medium Throughput Screening
  • the invention thus provides an in vitro method for screening compounds that modulate a nuclear receptor, comprising contacting a test compound with
  • NR-LBD ligand-binding domain of a nuclear receptor
  • CoF-NID co-factor interaction domain
  • the NR-LBD polypeptide comprises at least one ligand-binding domain (LBD) of a nuclear receptor (NR). Preferably, it is an entire nuclear receptor, which allows to get as close as possible to in vivo conditions.
  • the nuclear receptors preferentially used are the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor (PPAR) alpha, beta and gamma receptors, LXR (Liver X Receptor) alpha and beta, FXR (Famesoid X Receptor) and ROR (Retinoid-related Orphan Receptor) alpha, beta and gamma.
  • PPAR gamma, LXR alpha and LXR beta receptors are particularly preferred.
  • the CoF-NID polypeptide comprises at least one CoF (CoF) interaction domain (NID) with the nuclear receptor.
  • CoF CoF
  • NID CoF interaction domain
  • the cofactor is preferably chosen from members of the p160 family (NCoA1 / SRC-1, NCoA2 / TIF-2 / SRC-2,
  • DRIP205 / TRAP220 / PBP NCoR / RIP13
  • SMRT / TRAC2 SMRT / TRAC2
  • RIP140 PGC1 alpha and beta
  • TRRAP TReP-132
  • CBP CBP / p300
  • cofactors SRC-1, TIF-2, DRIP205 and NCoR are particularly preferred.
  • the support carries glutathione - the NR-LBD polypeptide then comprising a Glutathione S-Transferase (GST) -, streptavidin -the NR-LBD polypeptide then being biotinylated, or any supports coated with an antibody directed against a specific marker, the NR-LBD polypeptide then comprising this marker, etc.
  • GST Glutathione S-Transferase
  • streptavidin the NR-LBD polypeptide then being biotinylated
  • any supports coated with an antibody directed against a specific marker the NR-LBD polypeptide then comprising this marker, etc.
  • the use of a GST or a biotinylation-inducing factor for binding said NR-LBD polypeptide to a support allows the binding of said NR-LBD polypeptide to be oriented to facilitate interaction with CoF-NID.
  • the support preferentially used for the implementation of the method according to the invention is a plate, a ball, or a chip.
  • the level of interaction measured by the method according to the invention can be compared to a control carried out in the absence of the test compound or to a control carried out with a ligand known to the nuclear receptor.
  • the CoF-NID polypeptide is linked to an antigenic marker and the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide is effected through a detectably labeled antibody. and directed against said antigenic marker.
  • the antigenic marker is preferably selected from a polyhistidine amino acid sequence (polyHis), a cMyc element, Flag or an isolated sequence of haemagglutinin or V5 protein.
  • the method comprises contacting a test compound with an NR-LBD polypeptide comprising an LBD domain fused to a GST or a biotinylation-inducing marker, said NR-LBD polypeptide being attached to beads or a plate respectively carrying glutathione or streptavidin, and a CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to a polyHis sequence, revealing an interaction between the NR-LBD polypeptide LBD and the CoF-NID polypeptide being made through an anti-polyHis antibody coupled to a detectable label, preferably horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the CoF-NID polypeptide is linked to a fluorescent marker and the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide is carried out by fluorometry.
  • the screening test can then be advantageously carried out in a multiplexed manner: the test compound is then brought into contact at the same time with several CoF-NID polypeptides each comprising at least one NID domain of a cofactor, these cofactors being able to be different from each other.
  • each CoF-NID polypeptide is bound to a different fluorescent label.
  • the CoF-NID polypeptide is linked to an enzymatic marker, such as BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase) and the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-polypeptide.
  • NID is carried out by fluorometry, luminescence or colorimetry, depending on the substrate used during the enzymatic reaction.
  • the method comprises contacting a test compound with an NR-LBD polypeptide comprising an LBD domain fused to a GST or a biotinylation-inducing marker, said NR-LBD polypeptide being attached to beads or a plate respectively bearing glutathione or streptavidin, and a CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to BAP, revealing an interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-polypeptide.
  • NID being made by fluorescence, luminescence or colorimetry depending on the substrate of the BAP used.
  • the NR-LBD polypeptide is the entire nuclear receptor (NR) and the contacting of the test compound with said NR and CoF-NID is carried out in the presence of a nucleic acid representing the element of response (RE) of this nuclear receptor.
  • RE element of response
  • the subject of the present invention is also the ligands identified by the screening method described above, useful as medicaments.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one ligand identified by the screening method according to the invention, optionally in combination with one or more other therapeutic active ingredients and / or cosmetics. It is advantageously a pharmaceutical composition for the treatment of a pathology in which nuclear receptors such as LXR, PPAR, FXR or ROR are involved.
  • the invention also relates to the use of a ligand identified by the screening method according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition as described above.
  • the nuclear receptors have a common structure and organization with a variable amino-terminal end, a DNA Binding Domain (DBD) and a Ligand Binding Domain (LBD). carboxy terminal end.
  • the common structure of nuclear receptors can be divided into different domains: LBD contains in particular an AF-2 domain, responsible for ligand-dependent transcriptional regulation through binding to different cofactors.
  • the AF-2 domain therefore allows the differential recruitment of cofactors and the dimerization (homodimerization or heterodimerization of the receptor with RXR).
  • Some nuclear receptors have an AF-1 domain responsible for the independent transcriptional regulation of the ligand.
  • the nuclear receptor referred to in the invention is preferably chosen from PPAR, FXR, LXR and ROR receptors.
  • the PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) family consists of three distinct members, designated PPAR alpha, PPAR beta and PPAR each encoded by a different gene and having a different expression profile according to the tissues.
  • Activated PPARs are found in the cell as heterodimers with the receptor-cis retinoic acid 9 (for RXR Retinoic acid X receptor) and bind to specific response elements of I 1 DNA, PPRE (Peroxisome Proliferator Response Element) thus allowing the control of target gene transcription.
  • PPARs are involved in the regulation of lipid metabolism, PPAR alpha controlling the oxidation of fatty acids in the liver and PPAR gamma controlling the storage of lipids in the adipocyte. Beyond the direct role played by PPAR ligands on the regulation of lipids and carbohydrates, these molecules have a pleiotropic action spectrum due to the great diversity of PPAR target genes. Recent findings show that PPARs would be involved in the regulation of the expression of many genes involved in major biological processes such as inflammation, angiogenesis, proliferation and cell differentiation, apoptosis, the activities of Nitric Oxide Synthases "(NOS) and metalloproteases (MMPs), etc.
  • NOS Nitric Oxide Synthases
  • MMPs metalloproteases
  • PPAR therapeutic targets of interest for the treatment of diseases such as metabolic diseases, obesity, diabetes, vascular occlusive diseases (atherosclerosis, etc.), cerebral ischemia, hypertension, diseases related to neovascularization (diabetic retinopathies, etc.), inflammatory and autoimmune diseases (Crohn's disease, psoriasis, multiple sclerosis, asthma, etc.), neoplastic diseases (carcinogenesis, etc.), etc. .
  • diseases such as metabolic diseases, obesity, diabetes, vascular occlusive diseases (atherosclerosis, etc.), cerebral ischemia, hypertension, diseases related to neovascularization (diabetic retinopathies, etc.), inflammatory and autoimmune diseases (Crohn's disease, psoriasis, multiple sclerosis, asthma, etc.), neoplastic diseases (carcinogenesis, etc.), etc. .
  • LXR orphan receptor exists in two forms: LXR alpha (NR1 H3) and LXR beta (NR1 H2).
  • LXR beta LXR alpha
  • LXR alpha is mainly expressed in the liver, intestine, kidney, adipose tissue and macrophages.
  • Both forms of LXR use the RXR nuclear receptor as a heterodimerization partner and bind to response elements called LXRE (LXR Response Element), thereby enabling the transcription of ligand-dependent specific genes. It has been shown that LXR is activated by a specific class of oxidized cholesterol derivatives: oxysterols such as 22 (R) -hydroxycholesterol and
  • LXR regulates the expression of various genes in macrophages such as ABCs transporters (ABCA1, G1, G5, G8), apolipoproteins (ApoE, CI, C-IV, C-III) and LipoProtein Lipase (LPL).
  • LXR has activity in hepatic regulation of bile acid synthesis, participates in the maintenance of cholesterol homeostasis, regulates the metabolism of fatty acids and glucose and has anti-inflammatory activity.
  • the FXR receiver (Famesoid X Receptor), also known as RIP14 or NR1 H4, was originally identified as the famesoid receptor. Additional studies have concluded that FXR is primarily the bile acid receptor. FXR is expressed in the liver, intestine, kidney and adrenal gland. It acts by forming a heterodimer with the RXR receptor. Recently, it has been demonstrated that several bile acids, such as Cheneo-DeoxyCholic Acid (CDCA) or DeoxyCholic Acid (DCA) and, to a lesser extent, LithoCholic Acid (LCA), are the true ligands of FXR and that these compounds activate the FXR receptor.
  • CDCA Cheneo-DeoxyCholic Acid
  • DCA DeoxyCholic Acid
  • LCA LithoCholic Acid
  • FXR binds preferentially to a response element consisting of an inverted repetition of two AGGTCA motifs separated by a nucleotide. It also binds to repeats of the AGGTCA motif separated by 2, 4 or 5 nucleotides (DR-2, DR-4, DR-5).
  • DR-2, DR-4, DR-5 2, 4 or 5 nucleotides
  • FXR target genes have been identified such as SHP, CYP7A1 and CYP8B, involved in bile acid synthesis.
  • ROR The Orphan Retinoid-related Orphan Receptor
  • ROR exists in three forms: ROR alpha, ROR beta, and ROR gamma.
  • ROR binds as a monomer, via a RORE response element composed of a single six-base pair sequence of hemipalindromic AGGTCA motif, preceded by an A / T rich region. Under certain conditions, ROR can also bind to DNA as a homodimer.
  • Each ROR gene generates different isoforms that differ only in their amino-terminal part: for example, ROR alpha has four isoforms.
  • ROR alpha appears to be involved in lipid metabolism, inflammation control, bone metabolism and myocyte differentiation.
  • MMR beta is restricted to different parts of the neuroendocrine system such as the pineal gland, retina and suprachiasmatic nucleus, suggesting a role of MMR beta in the circadian cycle.
  • MMR gamma is strongly expressed in the thymus and plays an important role in thymopoiesis.
  • ROR alpha NM_134261, P35398; beta BC051830, Q92753; gamma NM_005060, P51449 "LBDs" or "Ligand Binding Domain” represent the ligand binding domains of the nuclear receptor. With regard to PPAR, FXR, LXR and ROR, these domains fall between the residues:
  • the LBD sequence used for certain nuclear receptors may include a portion of the hinge region between DBD and LBD.
  • these domains are defined by the following limits:
  • DBDs or "DNA Binding domain” represent the DNA binding domains of the nuclear receptor.
  • Nuclear receptor activity is regulated by cofactors, such as members of the p160 family (SRC-1, TIF-2, ACTR, etc.), DRIP205, NCoR,
  • SMRT SMRT
  • RIP140 PGC1 alpha and beta
  • TRRAP TReP-132
  • CBP / p300 CBP / p300
  • Coactivators interact with activated receptors and stimulate transactivation significantly without altering basal transcriptional activity.
  • Co-activators make it possible, among other things, to reshape chromatin and to recruit transcriptional machinery, while co-repressors (CoR) condense chromatin and prevent accessibility to the transcriptional machinery.
  • CoA Co-activators
  • CoR co-repressors
  • Coactivators have the ability to activate transcription when recruited near a transcription initiation site.
  • the coactivators are members of the p160 DRIP205, RIP140, PGC1 alpha and beta family, TRRAP, TReP-132 and CBP / p300.
  • co-repressors such as NCoR and SMRT, have I / LXXII / L motifs involved in the interaction with the receptor.
  • NID nuclear receptor Interaction Domain
  • This domain most often contains one or more LXXLL motifs for co-activators or I / LXXII for co-repressors, necessary for this interaction.
  • sequences of the NIDs used for the implementation of the methods according to the invention are between the residues: • SRC-1: 570 to 782 • TIF-2: 413 to 812
  • TRRAP 580 to 900 or 901 to 1394
  • TReP-132 1 to 456 or 461 to 1200
  • the NR-LBD and CoF-NID polypeptides used in the method of the invention may be prepared by any technique known to those skilled in the art, in particular by artificial synthesis and more particularly by solid phase synthesis or by any biological technique. , genetic or enzymatic.
  • the polypeptides are fusion proteins, obtained by expression of a recombinant nucleic acid vector expressing said polypeptides in a host, such as a bacterium, a yeast, an insect or mammalian cell.
  • Recombinant production in a bacterial system for example in Escherichia coli, is particularly easy to achieve.
  • the NR-LBD polypeptide is attached to a solid support which can be of any kind.
  • a solid support which can be of any kind.
  • Plates in particular microplates and in particular microplates of polystyrene or polypropylene, paramagnetic beads, particles or solid beads may be used.
  • beads for example Sepharose
  • a plate coated with an affine substance to which the optionally modified NR-LBD polypeptide binds for example, it is possible to use beads (for example Sepharose) or a plate coated with an affine substance to which the optionally modified NR-LBD polypeptide binds.
  • the CoF-NID polypeptide comprises a label, preferably in a form fused to the NID domain of the cofactor.
  • the labeling may be antigenic, fluorescent or enzymatic, but preferably is not radioactive.
  • the antigenic marker or the enzyme is preferably cloned in fusion with CoF-NID.
  • the CoF-NID polypeptide is linked to a fluorescent label to form the CoF-NID-Fluo polypeptide and the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide is carried out by fluorometry.
  • the fluorescent labeling may be direct or indirect, the fluorophore being attached directly to the CoF-NID or via another marker.
  • the fluorescent label may be, for example, fluorescein, RPE (R-Phycoerythrin), GFP (Green Fluorescent Protein), APC (AlloPhycoCyanin), cyanines or Europium.
  • the fluorescent labeling is carried out via a previously cloned marker in fusion with CoF-NID [Lumio-Tag TM (invitrogen), SNAP TM (Covalys), Intine] and connected to a fluorophore to form the Fluo-CoF-NID polypeptide.
  • CoF-NID Lio-Tag TM (invitrogen), SNAP TM (Covalys), Intine
  • Inteine-CoF-NID polypeptide Intein is able to self-inactivate and generates a chemical group that reacts with a cysteine labeled with a fluorophore.
  • the coF-NID polypeptide labeled with a cysteine-fluorophore group is thus obtained.
  • Lumio TM -Tag-CoF-NID polypeptide Lumio TM -Tag reacts with a Lumio TM reagent [Lumio-Green TM or Lumio-Red TM (Invitrogen)], this reagent becoming fluorescent during the formation of the complex.
  • a CoF-NID polypeptide labeled with a fluorophore is thus obtained.
  • SNAP TM -Tag-CoF-NID polypeptide In the SNAP TM -Tag-CoF-NID polypeptide, SNAP TM -Tag (Covalys) cleaves para-substituted benzylguanines bound to a fluorophore or biotin and covalently binds these groups. The labeled CoF-NID polypeptide is thus obtained.
  • a CoF-NID-Fluo polypeptide is obtained.
  • the screening test is carried out in a multiplex: the test compound is then brought into contact with the NR-LBD and several CoF-NID polypeptides each comprising at least one NID domain of a cofactor, these cofactors being able to be different from each other. .
  • each CoF-NID polypeptide is bound to a different fluorescent label.
  • the CoF-NID polypeptide is linked to an antigenic marker and the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide is effected via an antibody detectably labeled and directed against said antigenic marker.
  • This antigenic marker can be any type of marker known to those skilled in the art and can be chosen in particular from a polyhistidine amino acid sequence (polyHis), a cMyc element, Flag or an isolated sequence of haemagglutinin or the V5 protein.
  • the polyHis sequence preferably contains from 4 to 6 Histidine residues.
  • the antigenic marker is a polyhistidine amino acid sequence (polyHis).
  • the antibodies used to detect this antigenic marker may be polyclonal or monoclonal. They can be produced by conventional techniques known to those skilled in the art. These may be commercial antibodies. Among these, one can quote the penta-His HRP conjugate antibody (QIAGEN), His Abcam anti-6x His rabbit antibody 9108, HRPC (horseradish peroxidase) -6x His rabbit antibody Abcam 1187, mouse anti-5x antibody His Qiagen 34698, mouse anti-poly-His Sigma H-1029 antibody.
  • Antibodies can be coupled to detectable markers known to those skilled in the art, such as enzymes (eg horseradish peroxidase)
  • the antibody is coupled to the HRP
  • the immunodetection can be carried out by any suitable technique, for example a Western Blot, Dot Blot, etc.
  • the method comprises contacting a test compound with an NR-LBD polypeptide comprising an LBD domain fused to a GST or a biotinylation-inducing marker, said NR-LBD polypeptide being attached to beads or a plate respectively bearing glutathione or streptavidin, and a CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to a polyHis sequence, revealing an interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF polypeptide -NID being carried out by means of an anti-polyHis antibody coupled to a detectable marker, preferably horseradish peroxidase (HRP).
  • HRP horseradish peroxidase
  • the CoF-NID polypeptide is linked to an enzymatic marker and the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide is carried out by fluorometry, luminescence or colorimetry, depending on the substrate used during the enzymatic reaction.
  • the CoF-NID polypeptide is linked to BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase).
  • the revelation of an interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide may especially be carried out using a colorimetric substrate (p-nitrophenyl phosphate or pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate or FDP) or luminescent ( Lumi-Phos TM), the measurement of the interaction then being carried out respectively by spectrophotometry at 405 nm, by fluorimetry (exitation: 485 nm, emission: 535 nm) or by luminescence.
  • a colorimetric substrate p-nitrophenyl phosphate or pNPP
  • fluorescent Fluorescein DiPhosphate or FDP
  • Lumi-Phos TM luminescent
  • the method comprises contacting a test compound with an NR-LBD polypeptide comprising an LBD domain fused to a GST or a biotinylation-inducing marker, said NR-LBD polypeptide being attached to beads or a plate respectively bearing glutathione or streptavidin, and a CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to BAP, revealing an interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-polypeptide.
  • NID being made by fluorescence, luminescence and colorimetry depending on the substrate of the BAP used.
  • the NR-LBD polypeptide is the entire nuclear receptor (NR) and the contacting of the test compound with said NRs and CoF-NIDs is performed in the presence of a nucleic acid representing the response element. (RE) of this nuclear receptor.
  • RE response element
  • Compounds that interfere with the binding of a nuclear receptor to a cofactor can then be selected in a DNA dependent manner.
  • the response element is biotinylated and attached to a carrier (ball, plate, chip, etc.) carrying streptavidin.
  • the double-stranded nuclear receptor response element is attached to the streptavidin coated plates.
  • the plate is then incubated in the presence of a specific ligand and a nuclear extract of NR overexpressing cells, preferentially PPAR, LXR or FXR, and its heterodimerization partner, preferentially RXR, labeled with an antigenic tag (Tag), enzymatic or fluorescent.
  • a specific ligand and a nuclear extract of NR overexpressing cells, preferentially PPAR, LXR or FXR, and its heterodimerization partner, preferentially RXR, labeled with an antigenic tag (Tag), enzymatic or fluorescent.
  • the CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to another antigenic, enzymatic or fluorescent label is then added and the incubation is prolonged.
  • the revelation of the NR / RXR and NR / CoF-NID interaction is carried out by means of an immunodetection method, enzymatic or fluorescent.
  • the bringing into contact is then carried out in the presence of the heterodimerization partner of the nuclear receptor (for example RXR for the PPAR, LXR and FXR receptors), which makes it possible to show that the binding with the cofactor is dependent on the heterodimer.
  • the heterodimerization partner of the nuclear receptor for example RXR for the PPAR, LXR and FXR receptors
  • Compounds likely to be identified using the method according to the invention may be compounds of various nature, structure and origin, in particular biological compounds, chemical compounds, synthetic compounds, etc.
  • the test compound can be any product which is in an isolated form or in admixture with other products.
  • the compound can be defined in terms of structure and / or composition or be defined functionally.
  • the compound may, for example, be an isolated and structurally defined product, an isolated product of indefinite structure, a mixture of known and characterized products or an indefinite composition comprising one or more products.
  • One or more compounds can thus be tested, in admixture or separately.
  • Such indefinite compositions may be, for example, tissue samples, biological fluids, cell supernatants, plant preparations, etc.
  • the test compounds may be chosen from an inorganic or organic product and in particular a chemical or biological compound.
  • the compound can be of natural or synthetic origin and include a combinatorial library.
  • the present invention is particularly suitable for the selection, identification or characterization of a large number of compounds. This simple and efficient screening can be accomplished in a very short time.
  • the described methods can be partially automated, thus enabling efficient and simultaneous screening of various and diverse compounds, either as a mixture or in separate form.
  • the method according to the invention is carried out in HTS (High
  • a support of the plate or chip type is preferably used, said support preferably bearing streptavidin and the NR-LBD then being biotinylated.
  • the invention is based on the demonstration of the ability of SNuRMs ligands to modulate the activity of nuclear receptors by allowing the differential recruitment of cofactors, which offers the possibility of controlling more finely the expression of the target genes of the nuclear receptors.
  • SNuRMs are indeed agonists or antagonists of nuclear receptors (NR) that induce a different response depending on the cellular or tissue context (Smith and O'Malley, 2004).
  • the screening method according to the invention preferably makes it possible to quantify the interaction induced by each ligand and for each cofactor in comparison with a reference ligand.
  • the compound of SNuRM is then demonstrated when this compound induces a defect of recruitment (co-activators) or release (co-repressors) of one or more cofactors.
  • the method according to the invention allows the implementation of studies of structure / activity type: the ligand causes indeed structural changes of the nuclear receptor, especially at the level of LBD. These modifications reflect the activity of the ligand and the differential recruitment of cofactors and are therefore of major interest.
  • the level of interaction measured with the method according to the invention is compared with a control carried out in the absence of the test compound or with a control carried out with a known ligand of the nuclear receptor.
  • the subject of the present invention is also the ligands identified by the screening method described above, useful as medicaments.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable carrier, at least one ligand identified by the screening method according to the invention, optionally in combination with one or more other therapeutic active ingredients and / or cosmetics.
  • a pharmaceutical composition for the treatment of a pathology in which nuclear receptors such as LXR, PPAR, FXR or ROR are involved.
  • LXR nuclear receptors
  • PPAR nuclear receptors
  • FXR or ROR nuclear receptors
  • diseases related to disorders of lipid and / or carbohydrate metabolism hyperlipidemia, hyperglycemia, etc.
  • pathologies associated with syndrome X atherosclerosis
  • cardiovascular diseases may be mentioned.
  • the other therapeutic and / or cosmetic agents may be chosen from:
  • hypolipidemic and / or hypocholesterolemic molecules antihypertensive agents and hypotensive agents
  • antioxidants agents used in the treatment of heart failure
  • corticosteroids used in the treatment of skin pathologies, vasodilators and / or anti-ischemic agents.
  • the invention also relates to the use of a ligand identified by the screening method according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition as described above.
  • the invention also relates to a method of treating the pathologies mentioned above comprising the administration to a subject, in particular human, of an effective amount of a compound or a pharmaceutical composition as defined above. Treatment means both preventive and curative treatment.
  • compositions according to the invention advantageously comprise one or more excipients or vehicles, which are pharmaceutically acceptable and are well known to those skilled in the art.
  • excipients or vehicles which are pharmaceutically acceptable and are well known to those skilled in the art.
  • the modes and routes of administration and the doses may be adapted by those skilled in the art depending on the patient and the pathology.
  • FIG. 1 schematic diagram of the pull-down reaction with immunodetection, carried out with a NR-LBD polypeptide comprising a LBD domain fused to a GST, said NR-LBD polypeptide being attached to beads carrying glutathione and with a polypeptide CoF-NID comprising a NID domain fused to a polyHis sequence.
  • CoF-NID is performed through an anti-polyHis antibody coupled to a detectable marker, horseradish peroxidase (HRP for HorseRadish Peroxidase).
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIG. 2 Schematic diagram of the BAP enzymatic detection pull-down reaction, carried out with a NR-LBD polypeptide comprising a LBD domain fused to a GST, said NR-LBD polypeptide being attached to beads carrying glutathione and with a CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to the BAP.
  • the revelation of the interaction between the NR-LBD polypeptide and the CoF-NID polypeptide is achieved by means of a colorimetric, luminescent or fluorescent reaction, depending on the substrate used for BAP.
  • Figure 3 schematic diagram of the DNA-dependent pull-down reaction carried out with the NR / RXR heterodimer.
  • the double stranded nuclear receptor response element is attached to the streptavidin coated plates.
  • the plate is incubated in the presence of a specific ligand and a nuclear extract of cells overexpressing the full-length NR and its partner RXR labeled with an antigenic, enzymatic or fluorescent tag.
  • the CoF-NID polypeptide comprising a NID domain fused to another antigenic, enzymatic or fluorescent label is then added and the incubation is prolonged.
  • the revelation of the NR / RXR and NR / CoF-NID interaction is carried out by means of an immunodetection method, enzymatic or fluorescent.
  • Figure 4 Results of the in vitro study of the interaction of PPAR gamma and cofactors DRIP205, TIF-2 and SRC-1.
  • the GST-LBD PPAR gamma polypeptide bound to beads coated with glutathione is incubated in the presence of purified His-CoF NID (His-DRIP205 NID, His-SRC-1 NID, His-TIF-2 NID) in the presence of DMSO (0.1 %,), rosiglitazone (10 5 M) and ligands A, B and C (10 5 M).
  • the beads are then washed and the GST-LBD PPAR gamma polypeptides are eluted in the presence of glutathione.
  • the whole is then fixed on a nitrocellulose membrane and the Dot Blot is developed using an anti-His Tag antibody.
  • LXR alpha or beta bound to glutathione-coated beads is incubated in the presence of purified His-CoF NID (His-DRIP205 NID, His-TIF-2 NID) in the presence of DMSO (0.1% ;, T0901317 (10 6 M) and GW3965 (10 6 M).
  • the beads are then washed and the GST-LBD LXR alpha and beta polypeptides are eluted in the presence of glutathione.
  • the assembly is then fixed on a nitrocellulose membrane and the Dot Blot is developed at the same time. help with anti-His Tag antibodies.
  • Figure 6 Results of the in vitro study of the interaction of PPAR gamma and cofactors TIF-2 and DRIP205.
  • the GST-LBD PPAR gamma polypeptide bound to glutathione-coated beads is incubated in the presence of purified CoF-NID-BAP (DRIP205-NID-BAP, TIF-2-NID-BAP) in the presence of DMSO
  • Figure 7 Results of the in vitro study of the interaction of PPAR gamma and NCoR corepressor.
  • the GST-LBD PPAR gamma polypeptide bound to glutathione-coated beads is incubated in the presence of purified NCoR-NID-BAP in the presence of DMSO (0.1%), different concentrations of rosiglitazone and different concentrations of the GW9662 antagonist.
  • the beads are then washed and incubated in the presence of Lumi-Phos TM (Pierce), a luminescent substrate of BAP. The measurement is then made with the luminometer.
  • Lumi-Phos TM Pulierce
  • Figure 8 Results of the in vitro study of the interaction of PPAR alpha and coactivator SRC1.
  • the biotinylated LBD PPAR alpha polypeptide is bound to a streptavidin-coated 96-well plate that is incubated in the presence of purified SRC1-NID-BAP in the presence of DMSO (0.1%), and fenofibrate (PPARalpha ligand).
  • the plate is then washed and incubated in the presence of a luminescent substrate of the BAP. The measurement is then made with the luminometer.
  • NID-BAP purified in the presence of DMSO (0.1%), and CDCA (ligand of FXR). The plate is then washed and incubated in the presence of a luminescent substrate of the BAP. The measurement is then made with the luminometer.
  • the GST-NR-LBD fusion proteins were generated by cloning the LBD of each human nuclear receptor (PPAR alpha, beta and gamma, FXR, LXR alpha, beta, ROR alpha and gamma) downstream of the coding region of Glutathione S-Transferase (GST) in the plasmid pGEX4T.
  • the cloned sequence includes a portion of the hinge region between the DBD and the LBD.
  • the GST-PPAR alpha, GST-PPAR gamma, GST-PPAR delta, GST-LXR alpha, GST-LXR beta, GST-FXR, GST-ROR alpha and GST-ROR gamma polypeptides are generated by respectively cloning the region between residues 180-468, 209-505, 135-441, 207-447, 213-461, 215-472, 84-468 and 97-518.
  • the NIDs of the various cofactors used were cloned in fusion with a His- Tag (containing 6 His residues (6xHis)).
  • the cofactors used are of the p160 family (NCoA1 / SRC-1, NCoA2 / TIF-2 / SRC-2, NCOA3 / ACTR / AIB1 / PCIP / TRAM-1 / SRC-3, etc.), DRIP205 / TRAP220 / PBP , NCoR / RIP13, SMRT / TRAC2, RIP140, alpha and beta PGC1, TRRAP, TReP-132 and CBP / p300.
  • polypeptides His-SRC-1-NID, His-TIF-2-NID, His-ACTR-NID, His-DRIP205-NID, His-NCoR-NID, His-SMRT-NID, His-RIP140-NID, His-PGC1alpha-NID, His-PGC1 beta-NID, His-TRRAP-NID, His-TRePI 32-NID and His-CBP / p300-NID are generated by cloning respectively the region between residues 570 to 782, 413 to 812, 601 to 780, 514 to 775, 1853 to 2440, 2131 to 2351, 476 to 705, 1 to 206, 1 to 462, 580 to 900 or 901 to 1394, 1 to 456 or 461 to 1200, 1 to 452.
  • the plasmid constructs obtained are transfected into an E. coli BL21 bacterial strain which allows the expression of these recombinant proteins.
  • the bacteria are lysed by sonication in a phosphate buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 10% glycerol, pH 8.0), incubated for 30 minutes on ice and centrifuged for 20 minutes at 6000 g. The supernatant is then incubated in the presence of a nickel-NTA coated resin (QIAGEN). Elution of the proteins retained by the resin in the presence of 250 mM of imidazole makes it possible to obtain a purified fraction of the different cofactor NIDs.
  • the proteins are assayed and stored at -2O 0 C.
  • 3 to 15 micrograms of GST-NR-LBD are incubated with different amounts of His-CoF-NID proteins in the presence or absence of ligands specific for the different receptors (PPAR alpha: fenofibrate; PPAR gamma: A, B, C, E, F, rosiglitazone, PPAR delta: GW501516, LXR: T0901317 and GW3965, FXR: CDCA (chenodeoxycholate), GW4064, ROR: cholesterol sulfate) for 2 hours in interaction buffer (15 mM Tris-HCl, 15% Glycerol, EDTA 0.1 mM, 0.04% NP40, 75 mM KCl, 0.25 g / l BSA, 1 mM DTT, 1 mM benzamidine, protease inhibitor cocktail tablet (Roche), pH 8.0). The whole is then washed 4 times using the same buffer.
  • PPAR alpha fenofi
  • the beads are rinsed 4 times with the interaction buffer and then added with a volume of Laemmli buffer (BIORAD # 161-0737) and heated for 5 min at 95 ° C.
  • the extract is then deposited on an SDS-PAGE gel. at 12% then the proteins are transferred to nitrocellulose membrane.
  • the washed beads are incubated in an elution buffer (50 mM Tris-HCl, 10% glycerol, 150 mM KCl, 0.5 mM EDTA, Glutathione: 3 mg / ml, pH 8.0) for 30 min.
  • the eluate is directly transferred to a nitrocellulose membrane using a BIO-DOT TM (BIORAD) device.
  • the interaction is then quantified by Westem-Blot: the nitrocellulose membrane is then incubated in the presence of an anti-His antibody coupled to HRP for 2 hours in a TBS buffer (20 mM Tris-HCl 500 mM NaCl, 5% skim milk, pH 7.4) then washed in wash buffer (20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4) 3 times for 10 min.
  • the HRP activity is then revealed using the ECL TM Western Blotting Reagent Detection Kit (Amersham Biosciences), as directed by the applicant.
  • This method makes it possible to quantify the interaction induced by each ligand and for each cofactor in comparison with a reference ligand.
  • the compound described SNuRM is then highlighted when this compound induces a defect of recruitment (co-activators) or release (co-repressors) of one or more cofactors.
  • results of the experiments performed with PPAR gamma and the cofactors DRIP205, TIF-2 and SRC-1, shown in FIG. 4, show a differential recruitment of cofactors as a function of the ligand used (A, B, C or rosiglitazone).
  • the ligands A, B, C and rosiglitazone induce a recruitment of equivalent DRIP205 whereas the recruitment of SRC-1 is at least 4 times lower with the ligands B and C compared to the recruitment induced by the ligand A and rosiglitazone.
  • ligand C induces recruitment 2 1-fold lower TIF-2 compared with ligand B.
  • These 4 ligands thus induce a differential recruitment of cofactors. They can therefore be considered as selective modulators of PPAR receptors (ligands designated "SPPARM", for Selective PPAR Modulators).
  • LXR beta the recruitment of the 2 cofactors DRIP205 and TIF-2 seems to be similar for the 2 ligands. In the same way as for LXR alpha, the recruitment of DRIP205 is less than that of TIF-2.
  • This method makes it possible to quantify the interaction induced by each ligand and for each cofactor in comparison with a reference agonist ligand (termed “full agonist”).
  • the SNuRM ligand compound is then detected when this compound induces a defect in recruitment (co-activators) or release (co-repressors) of one or more cofactors.
  • results of the experiments carried out with PPAR gamma and the cofactors DRIP205 and TIF-2, presented in FIG. 6, show a differential recruitment of the cofactors with the ligands E or F.
  • the ligands E or F induce a recruitment of DRIP205 while that the recruitment of TIF-2 is observed only with the ligand E.
  • the latter can therefore be considered as a selective modulator of the PPAR receptor.
  • FIG. 7A The results of the experiments carried out with PPAR gamma and with the NCoR corepressor in the presence of different concentrations of rosiglitazone are shown in FIG. 7. It can be seen in FIG. 7A that rosiglitazone is capable of inducing the release of NCoR from the PPAR complex. gamma-NCoR.
  • FIG. 7B shows that, unlike rosiglitazone (agonist), a PPAR gamma antagonist (GW9662) is capable of inducing an increase in the interaction between PPAR gamma and NCoR. This method therefore makes it possible to demonstrate the inverse agonist activity of a ligand.
  • GW9662 PPAR gamma antagonist
  • Example 3 Pull-down with Medium Flow Enzyme Detection (MTS).
  • the GST-NR-LBD fusion proteins (cf Example 1) or biotinylated NR-LBD fusion proteins (Biotin-NR-LBD) were generated by cloning the LBD of each nuclear receptor (PPAR alpha, beta and gamma, FXR, LXR alpha, beta, human ROR alpha and gamma) in the plasmid pRSET downstream of the GST or the coding region of the BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein) sequence of the BCCP / FabE protein (X14825, AA 70-156) ⁇ 'Esherichia coli .
  • BCCP sequence allows the biotinylation of the protein (Biotin-LBD) during expression.
  • the coding sequences of the NR-LBDs are identical to those described in Example 1. These proteins are produced and purified as described in Example 1.
  • CoF-NID-BAP polypeptides are cloned and produced as described in Example 2.
  • Streptavidin-coated 96-well plates (Pierce) are incubated with the purified Biotin-NR-LBD polypeptide in binding buffer (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20 pH 7.2) for 2 hours. The plate is then rinsed using the same buffer.
  • Example 4 Pull-down with fluorescence detection in multiplexed medium throughput (MTS).
  • Biotin-NR-LBD are cloned as described in Example 3.
  • the CoF-NIDs are cloned with different markers allowing a subsequent fluorescent labeling: Intein, Lumio TM -Tag (Invitrogen) and SNAP TM -Tag (Covalys).
  • Intein the CoF-NID polypeptide is cloned in fusion with the intein.
  • Lumio TM system the CoF-NID polypeptide is cloned in fusion with a 6-residue marker (Cys-Cys-Pro-Gly-Cys) (Lumio TM -Tag).
  • the CoF-NID is cloned in fusion with the SNAP TM -Tag.
  • the production and purification of the proteins are described in Example 3.
  • the fluorescent marking of CoF-NID is carried out as follows: • In the Inteine-CoF-NID polypeptide, Intein is autoclaved under certain conditions and generates a chemical group that reacts with a cysteine labeled with a fluorophore. The coF-NID polypeptide labeled with a cysteine-fluorophore group is thus obtained. • In the Lumio TM -Tag-CoF-NID polypeptide, Lumio TM -Tag reacts with a Lumio TM reagent (Lumio-Green TM or Lumio-Red TM (Invitrogen)), this reagent becoming fluorescent during complex formation. A CoF-NID polypeptide labeled with a fluorophore is thus obtained.
  • SNAP TM -Tag-CoF-NID polypeptide • In the SNAP TM -Tag-CoF-NID polypeptide, SNAP TM -Tag (Covalys) cleaves para-substituted benzylguanines bound to a fluorophore or biotin. The labeled CoF-NID polypeptide is thus obtained.
  • the plates are then incubated with several CoF-NIDs labeled with different fluorophores within the same well (multiplexing) in the interaction buffer and then rinsed as described in Example 2.
  • Example 5 Detection method of the interaction of the receptor with the cofactor in the presence of DNA (target gene response element of the NR considered). 1- Cloning of recombinant NR and CoF-NID proteins
  • the NRs are cloned in full length in the plasmid pcDNA3.
  • RXR is cloned in phase with an N-terminal, luminescent or fluorescent labeling immunogenic marker.
  • the CoF-NIDs are cloned and produced as described in Examples 1 to 4.
  • CoF-NID-Fluo 2- Marking of recombinant CoF-NID proteins (CoF-NID-Fluo) and nuclear Ivates
  • Complementary oligonucleotides corresponding to different ERs derived from the sequences of different promoters of target genes are made double-stranded in hybridization buffer (25mM Tris-HCl, 125mM KCl, 2mM MgCl 2 , 10mM DTT, PH8.0). Streptavidin-coated 96-well plates (Pierce) are incubated with each double-stranded oligonucleotide in binding buffer. The plate is then rinsed using the same buffer.

Abstract

La présente invention concerne des méthodes de criblage permettant de sélectionner, d'identifier et/ou de caractériser des composés SNuRMs capables de moduler la liaison d'un récepteur nucléaire à un ou plusieurs cofacteurs. Ces composés induisent une réponse différente en fonction du contexte cellulaire ou tissulaire ce qui offre la possibilité de contrôler finement l'expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires.

Description

Méthode de criblage de modulateurs de récepteurs nucléaires
La présente invention concerne des méthodes de criblage permettant de sélectionner, d'identifier et/ou de caractériser des composés capables de moduler la liaison d'un récepteur nucléaire à un ou plusieurs cofacteurs.
Les récepteurs nucléaires appartiennent à une famille structurellement et fonctionnellement définie de facteurs de transcription qui sont activés par un ligand et se fixent sur des séquences d'ADN spécifiques, appelées éléments de réponse, situées à proximité des gènes qu'elles régulent. Cette famille comprend les récepteurs nucléaires des hormones stéroïdes dérivées du cholestérol (glucocorticoïdes, oestrogènes, progestérone, etc.) et les récepteurs nucléaires des hormones thyroïdiennes, de la vitamine D3 ou de l'acide rétinoïque. La famille des récepteurs nucléaires, qui regroupe plus d'une cinquantaine de gènes différents, comprend également de nombreux récepteurs pour lesquels aucun ligand n'a été décrit et que l'on nomme "récepteurs orphelins".
En modulant la transcription de gènes cibles en réponse à leur propre ligand et à d'autres signaux afférents, notamment le recrutement ligand-dépendant de cofacteurs qui peuvent diminuer (co-répresseur) ou accroître (co-activateur) leur activité transcriptionnelle, ils jouent des rôles physiologiques clés dans la régulation du développement et du métabolisme cellulaire, d'où leur implication dans de nombreuses pathologies telles que les pathologies métaboliques, les maladies cardio-vasculaires, le cancer, l'obésité, le diabète, l'infertilité, etc.
Le tamoxifène, connu pour inhiber l'activité du récepteur aux oestrogènes
(ER), a été largement utilisé dans le traitement et la prévention du cancer du sein. Une étude des effets sélectifs du tamoxifène (effet œstrogène dans l'utérus et effet anti-œstrogène dans le sein) a conduit à l'émergence du concept de « Sélective ER Modulators » ou SERMs. Ce concept a par la suite été étendu aux autres récepteurs nucléaires : les « Sélective Nuclear Receptors Modulators (SNuRMs) » sont des agonistes ou des antagonistes de récepteurs nucléaires (NR) qui induisent une réponse différente en fonction du contexte cellulaire ou tissulaire (Smith et O'Malley, Endocrine Reviews, 25(1 ), 45-71 , (2004)). Le mécanisme d'action des SERMs et SNuRMs a été beaucoup étudié. Comme la plupart des récepteurs nucléaires, le récepteur aux oestrogènes (ER) interagit avec l'ADN par l'intermédiaire de son domaine de liaison à l'ADN (DNA Binding Domain ou DBD) au niveau d'un élément de réponse spécifique (appelé RE). Le récepteur aux oestrogènes interagit alors avec des protéines « co- activatrices » pour former un complexe multimérique qui active la machinerie transcriptionnelle et augmente l'expression de ses gènes cibles en remodelant l'ADN et en formant des complexes stables de pré-initiation de la transcription .
Des expériences utilisant des anticorps dirigés contre différents épitopes ainsi que des expériences de digestion ménagée ont par la suite montré que différentes classes de ligands induisaient une changement conformationel différent de la partie du récepteur se liant au ligand ou « Ligand Binding Domain (LBD) ». Plus récemment, les régions du LBD qui interagissent avec les co- activateurs ont été identifiées et qualifiées de « NR boxes ». Ces dernières sont en fait constituées de sillons formés par le rapprochement de différentes hélices du LBD. L'utilisation d'agonistes et d'antagonistes partiels du récepteur aux oestrogènes, comme le raloxifène, a montré que l'orientation d'une des hélices masquait partiellement le sillon de fixation des co-activateurs, ce qui avait pour conséquence un blocage de l'interaction de certains co-activateurs avec le LBD du récepteur nucléaire (Smith et O'Malley, 2004).
Grâce à la fixation de ligands SNuRMs qui modulent l'activité des récepteurs nucléaires en permettant notamment le recrutement différentiel de cofacteurs, les récepteurs nucléaires offrent la possibilité de contrôler plus finement l'expression des gènes. Il existe donc un réel intérêt pour le développement de méthodes d'identification de ce type de ligand.
La mise en œuvre de tests de criblage permettant d'identifier des composés SNuRMs utiles pour le recrutement de cofacteurs n'est pas aisée : en effet, la liaison des récepteurs nucléaires avec un ou plusieurs cofacteurs est difficile à mettre en évidence.
Des techniques dites « GST-pull down » classiques, telles que décrites par exemple dans l'article Krogsdam et al, Biochem. J. 363, 157-165 (2002), utilisent des protéines de fusion GST-cofacteur du récepteur couplées à des billes portant du glutathion et incubées avec le récepteur nucléaire (ou une partie du récepteur nucléaire telle que le LBD) marqué radioactivement, en présence ou en absence du ligand à tester. L'interaction est visualisée par autoradiographie. Cette technique présente des désavantages : la purification nécessaire du récepteur nucléaire est difficile à mettre en œuvre, notamment avec les récepteurs PPAR, LXR et FXR, du fait du faible rendement de purification dû à une accumulation dans les corps d'inclusion bactériens. Ces problèmes de purification conduisent à utiliser des systèmes de transcription et de traduction coûteux. De plus, l'utilisation d'un marquage radioactif présente le désavantage d'être potentiellement dangereux. Enfin, l'absence de sensibilité de ces techniques représente un inconvénient majeur, notamment car certaines interactions, telles que des interactions faibles entre un cofacteur et un récepteur nucléaire comme SRC-1 et PPAR (Upenberg A et al. EMBO J., May 2004; 23: 2083 - 2091 ) ne peuvent pas être mises en évidence.
Des variantes de ce protocole existent. La demande EP1267171 décrit par exemple une méthode de détection de modulateurs du récepteur PPAR gamma, mettant en œuvre (i) d'une part un polypeptide comprenant le domaine d'un cofacteur (par exemple SRC-1 ou TIF-2) qui interagit avec le récepteur nucléaire (NID) et qui est lié à de la GST (Glutathion S Transferase), et (ii) d'autre part un polypeptide comprenant le domaine de liaison au ligand (LBD ou Ligand Binding Domain) du récepteur nucléaire (NR) étudié, fusionné à un marqueur polyhistidine (6xHis). Le polypeptide GST-CoF-NID est fixé à des billes portant du glutathion puis incubé en présence de l'autre polypeptide polyHis-NR-LBD. Des Western blots sont ensuite réalisés avec des anticorps anti-polyhistidine. De la même manière que pour les techniques utilisant la radioactivité, le principal désavantage de cette technique réside dans la purification nécessaire du LBD (ou du récepteur nucléaire entier), qui s'avère être difficile à mettre en œuvre.
Les inventeurs de la présente demande proposent ici une alternative aux méthodes de détection connues, qui ne présente pas ces inconvénients. La méthode proposée évite ainsi l'utilisation de la radioactivité et se montre à la fois très sensible et facile à mettre en œuvre. De plus, le principal avantage de la présente invention réside dans la fixation du récepteur nucléaire sur un support : seul le cofacteur est donc à purifier ce qui rend l'invention plus facile à mettre en œuvre. La quantité de cofacteur utilisée dans les tests de criblage de la présente demande peut donc être quantifiée de manière précise ce qui permet d'assurer une visualisation plus fine du recrutement différentiel de cofacteurs par le récepteur nucléaire. De plus, cela permet d'assurer la reproductibilité et la comparaison des résultats.
Les inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode d'identification de composés modulant l'interaction d'un récepteur nucléaire avec un ou plusieurs cofacteurs. Cette méthode permet de discriminer les composés utiles pour le recrutement différentiel de cofacteurs et peut être réalisée dans un format de criblage à haut débit de composés, en HTS (High Throughput Screening) ou en MTS (Médium Throughput Screening).
L'invention fournit donc une méthode in vitro de criblage de composés modulateurs d'un récepteur nucléaire, comprenant la mise en contact d'un composé test avec
(i) un polypeptide désigné « NR-LBD » fixé à un support solide et comprenant au moins un domaine (LBD) de liaison au ligand d'un récepteur nucléaire (NR), et
(ii) un polypeptide désigné « CoF-NID » lié à un marqueur et comprenant au moins un domaine (NID) d'interaction d'un cofacteur (CoF) avec le récepteur nucléaire; et la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID.
Le polypeptide NR-LBD comprend au moins un domaine (LBD) de liaison au ligand d'un récepteur nucléaire (NR). Préférentiel lement, il s'agit d'un récepteur nucléaire entier, ce qui permet de se rapprocher au maximum des conditions in vivo. Les récepteurs nucléaires préférentiellement mis en œuvre sont les récepteurs PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) alpha, bêta et gamma, LXR (Liver X Receptor) alpha et bêta, FXR (Famesoid X Receptor) et ROR (Retinoid-related Orphan Receptor) alpha, bêta et gamma. Les récepteurs PPAR gamma, LXR alpha et LXR bêta sont tout particulièrement préférés.
Le polypeptide CoF-NID comprend au moins un domaine (NID) d'interaction d'un cofacteur (CoF) avec le récepteur nucléaire. Avantageusement, il s'agit du cofacteur entier. Le cofacteur est préférentiellement choisi parmi les membres de la famille p160 (NCoA1/SRC-1 , NCoA2/TIF-2/SRC-2,
NCoAS/ACTR/AIBI/pCIP/TRAM-i/SRC-S, etc.), DRIP205/TRAP220/PBP, NCoR/RIP13, SMRT/TRAC2, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. Les cofacteurs SRC-1 , TIF-2, DRIP205 et NCoR sont particulièrement préférés.
De manière préférentielle, le support porte du glutathion - le polypeptide NR-LBD comprenant alors une Glutathion S-Transférase (GST)- , de la streptavidine -le polypeptide NR-LBD étant alors biotinylé-, ou tous supports recouverts d'un anticorps dirigé contre un marqueur spécifique, - le polypeptide NR-LBD comprenant alors ce marqueur-, etc. L'utilisation d'une GST ou d'un facteur induisant la biotinylation pour la fixation dudit polypeptide NR-LBD sur un support permet d'orienter la fixation dudit polypeptide NR-LBD afin de faciliter l'interaction avec le CoF-NID.
Le support préférentiellement utilisé pour la mise en œuvre de la méthode selon l'invention est une plaque, une bille, ou une puce.
Le niveau d'interaction mesuré par la méthode selon l'invention peut être comparé à un contrôle réalisé en l'absence du composé test ou à un contrôle réalisé avec un ligand connu du récepteur nucléaire.
Dans un mode de réalisation particulier, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur antigénique et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par le biais d'un anticorps marqué de manière détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique.
Le marqueur antigénique est préférentiellement choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la protéine V5.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par le biais d'un anticorps anti-polyHis couplé à un marqueur détectable, de préférence la peroxidase de raifort (HRP).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie.
Le test de criblage peut être alors être réalisé, de manière avantageuse, en multiplexe: le composé test est alors mis en contact en même temps avec plusieurs polypeptides CoF-NID comprenant chacun au moins un domaine NID d'un cofacteur, ces cofacteurs pouvant être différents entre eux. Dans ce cas, chaque polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent différent.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur enzymatique, tel que la BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase) et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique.
Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par fluorescence, luminescence ou colorimétrie en fonction du substrat de la BAP utilisé. Dans une variante de l'invention, le polypeptide NR-LBD est le récepteur nucléaire (NR) entier et la mise en contact du composé test avec lesdits NR et CoF-NID est réalisée en présence d'un acide nucléique représentant l'élément de réponse (RE) de ce récepteur nucléaire. On peut alors sélectionner les composés modulant la liaison d'un récepteur nucléaire à un cofacteur de manière dépendante de l'ADN.
La présente invention a aussi pour objet les ligands identifiés par la méthode de criblage décrite ci-dessus, utiles à titre de médicaments.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un véhicule acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention, éventuellement en association avec un ou plusieurs autres principes actifs thérapeutiques et/ou cosmétiques. Il s'agit avantageusement d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une pathologie dans laquelle les récepteurs nucléaires tels que LXR, PPAR, FXR ou ROR sont impliqués.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus.
Récepteurs nucléaires et cofacteurs
Les récepteurs nucléaires ont une structure et une organisation communes avec une extrémité amino-terminale variable, un domaine de liaison à l'ADN (DBD pour DNA Binding Domain) et un domaine de liaison au ligand (LBD pour Ligand Binding Domain) à l'extrémité carboxy-terminale. La structure commune des récepteurs nucléaires peut être divisée en différents domaines : le LBD contient notamment un domaine AF-2, responsable de la régulation transcriptionnelle dépendante du ligand au travers de la liaison aux différents cofacteurs. Le domaine AF-2 permet donc le recrutement différentiel des cofacteurs et la dimérisation (homodimérisation ou hétérodimérisation du récepteur avec RXR). Certains récepteurs nucléaires présentent un domaine AF-1 responsable de la régulation transcriptionnelle indépendante du ligand.
Le récepteur nucléaire visé dans l'invention est de préférence choisi parmi les récepteurs PPAR, FXR, LXR et ROR.
La famille des récepteurs PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) se composent de trois membres distincts, désignés PPAR alpha, PPAR bêta et PPAR gamnr^ chacun codé par un gène différent et présentant un profil d'expression différent selon les tissus. Les PPAR activés se trouvent dans la cellule sous forme d'hétérodimères avec les récepteurs de l'acide 9-cis rétinoïque (RXR pour Retinoic acid X receptor) et se fixent sur des éléments de réponse spécifiques de I1ADN, les PPRE (Peroxisome Proliferator Response Elément) permettant ainsi le contrôle de la transcription de gènes cibles. Les PPAR sont impliqués dans la régulation du métabolisme des lipides, PPAR alpha contrôlant l'oxydation des acides gras dans le foie et PPAR gamma contrôlant le stockage des lipides dans l'adipocyte. Au-delà du rôle direct joué par les ligands PPAR sur la régulation des lipides et des glucides, ces molécules ont un spectre d'action pléïotropique dû à la grande diversité des gènes cibles des PPAR. Des découvertes récentes montrent que les PPAR seraient impliqués dans la régulation de l'expression de nombreux gènes participant à des processus biologiques majeurs tels que l'inflammation, l'angiogenèse, la prolifération et la différenciation cellulaire, l'apoptose, les activités des « Nitric Oxide Synthases » (NOS) et des métalloprotéases (MMPs), etc. Ces multiples propriétés font des PPAR des cibles thérapeutiques d'intérêt pour le traitement de maladies comme les maladies métaboliques, l'obésité, le diabète, les maladies occlusives vasculaires (athérosclérose, etc.), l'ischémie cérébrale, l'hypertension, les maladies liées à une néo-vascularisation (rétinopathies diabétiques, etc.), les maladies inflammatoires et auto-immunes (maladie de Crohn, psoriasis, sclérose en plaques, asthme, etc.), les maladies néoplasiques (carcinogenèse, etc.), etc.
Le récepteur orphelin LXR (Liver X Receptor) existe sous deux formes : LXR alpha (NR1 H3) et LXR bêta (NR1 H2). L'expression de LXR bêta est ubiquitaire tandis que LXR alpha est principalement exprimé dans le foie, l'intestin, le rein, le tissu adipeux et les macrophages. Les deux formes de LXR utilisent le récepteur nucléaire RXR comme partenaire d'hétérodimérisation et se fixent à des éléments de réponses nommés LXRE (LXR Response Elément), ce qui permet ainsi d'activer la transcription de gènes spécifiques de façon ligand dépendante. Il a ainsi été démontré que LXR est activé par une classe spécifique de dérivés oxydés du cholestérol : les oxysterols tels que le 22(R)-hydroxycholesterol et le
24(S),25-epoxycholesterol. LXR régule l'expression de gènes variés dans les macrophages comme les transporteurs ABCs (ABCA1 , G1 , G5, G8), les apolipoprotéines (ApoE, C-I, C-IV, C-III) et la LipoProtéine Lipase (LPL). LXR présente une activité dans la régulation hépatique de la synthèse d'acides biliaires, participe au maintien de l'homéostasie du cholestérol, régule le métabolisme des acides gras et du glucose et possède une activité antiinflammatoire.
Le récepteur FXR (Famesoid X Receptor), également connu comme RIP14 ou NR1 H4, a été initialement identifié comme étant le récepteur aux famesoïdes. Des études supplémentaires ont permis de conclure que FXR est principalement le récepteur des acides biliaires. FXR est exprimé dans le foie, l'intestin, le rein et la glande adrénale. Il agit en formant un hétérodimère avec le récepteur RXR. Récemment, il a été démontré que plusieurs acides biliaires tels que l'Acide ChénoDéoxyCholique (CDCA) ou l'Acide DéoxyCholique (DCA) ainsi que, dans une moindre mesure, l'Acide LithoCholique (LCA), sont les ligands véritables de FXR et que ces composés activent le récepteur FXR. FXR se lie préférentiel lement sur un élément de réponse constitué d'une répétition inversée de deux motifs AGGTCA séparés d'un nucléotide. Il se lie également à des répétitions du motif AGGTCA séparées de 2, 4 ou 5 nucléotides (DR-2, DR-4, DR-5). Plusieurs gènes cibles de FXR ont été identifiés tels que SHP, CYP7A1 et CYP8B, impliqués dans la synthèse des acides biliaires.
Le récepteur orphelin ROR (Retinoid-related Orphan Receptor) existe sous trois formes : ROR alpha, ROR bêta et ROR gamma. ROR se lie sous forme de monomère, via un élément de réponse RORE composé d'une unique séquence de six paires de bases de motif hémipalindromique AGGTCA, précédée d'une région riche en A/T. Dans certaines conditions, ROR peut également se lier à l'ADN sous forme d'homodimère. Chaque gène ROR génère différents isoformes qui diffèrent seulement au niveau de leur partie amino-terminale : par exemple, ROR alpha possède quatre isoformes. ROR alpha semble impliqué dans le métabolisme lipidique, le contrôle de l'inflammation, le métabolisme osseux et la différenciation des myocytes. Parmi les gènes cibles de ROR alpha, on peut citer les gènes Rev- Erb alpha, IK-Balpha, laminin B1 , N-myc, etc. L'expression de ROR bêta est restreinte aux différentes parties du système neuroendocrine telles que la glande pinéale, la rétine et le noyau suprachiasmatique, ce qui suggère un rôle de ROR bêta dans le cycle circadien. ROR gamma est exprimé fortement dans le thymus et joue un rôle important dans la thymopoïèse.
Les séquences des ARNm et les séquences protéiques des récepteurs nucléaires humains PPAR, FXR, LXR et ROR sont disponibles sur banques de données Genbank, sous les numéros d'accès suivants:
• PPAR: alpha : AY206718, Q07869 ; gamma : U79012, P37231 ; delta : AY919140, Q03181
• FXR: NM_005123, NM_021745 et Q96RI1
• LXR : alpha : U22662, Q13133; beta : NM_007121 , P55055
• ROR : alpha NM_134261 , P35398; bêta BC051830, Q92753; gamma NM_005060, P51449 Les « LBD » ou « Ligand Binding Domain » représentent les domaines de liaison au ligand du récepteur nucléaire. En ce qui concerne PPAR, FXR, LXR et ROR, ces domaines sont compris entre les résidus :
• PPAR: alpha : 281-468, gamma : 318-505, delta : 254-441
• FXR: 215-472 • LXR : alpha : 215-447 ; bêta : 231-461
• ROR : alpha : 305-556; bêta : 211-459; gamma : 269-518.
Dans le cadre de la mise en œuvre de la présente invention, la séquence du LBD utilisée pour certains récepteurs nucléaires peut inclure une partie de la région charnière comprise entre le DBD et le LBD. Ainsi, ces domaines sont définis par les bornes suivantes :
• PPAR: alpha : résidus 180-468; gamma : résidus 209-505 ; delta : résidus 135-441
• FXR: résidus 215-472
• LXR : alpha : résidus 207-447; bêta : résidus 213-461 • ROR : alpha : résidus 171-556; bêta : résidus 83 à 459; gamma : résidus 96-518
II est entendu que ces bornes ne sont pas fixes et qu'une modification des bornes de la séquence utilisée peut être effectuée par l'homme du métier. Les DBD ou « DNA Binding domain » représentent les domaines de liaison à l'ADN du récepteur nucléaire.
L'activité des récepteurs nucléaires est régulée par des cofacteurs, tels que les membres de la famille p160 (SRC-1 , TIF-2, ACTR, etc.), DRIP205, NCoR,
SMRT, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. Ceux-ci peuvent diminuer ou abolir (on parle alors de co-répresseur) ou augmenter (on parle alors de co-activateur) leur activité transcriptionnelle.
Les « co-activateurs » interagissent avec les récepteurs activés et stimulent la transactivation de façon significative sans altérer l'activité transcriptionnelle basale. Les co-activateurs (CoA) permettent entre autres de remodeler la chromatine et de recruter la machinerie transcriptionnelle, alors que les co- répresseurs (CoR) condensent la chromatine et empêchent l'accessibilité à la machinerie transcriptionelle. Plus d'une dizaine de co-activateurs des récepteurs nucléaires ont été clones depuis dix ans. Un grand nombre interagit avec le domaine AF-2 des récepteurs nucléaires, par l'intermédiaire de séquences peptidiques LXXLL ou I/LXXII/L (L : leucine ; X: acide aminé quelconque ; I : isoleucine), motif connu pour créer une surface hydrophobe capable d'interagir avec le LBD des récepteurs nucléaires. Les co-activateurs présentent la capacité d'activer la transcription lorsqu'ils sont recrutés à proximité d'un site d'initiation de la transcription. Parmi les co-activateurs, on peut citer les membres de la famille p160 DRIP205, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300.
De la même manière, les co-répresseurs, tels que NCoR et SMRT, présentent des motifs I/LXXII/L mis en cause dans l'interaction avec le récepteur.
Le « NID » ou « Nuclear receptor Interaction Domain » désigne le domaine du cofacteur permettant l'interaction avec le récepteur nucléaire. Ce domaine contient le plus souvent un ou plusieurs motifs LXXLL pour les co-activateurs ou I/LXXII pour les co-répresseurs, nécessaire(s) à cette interaction.
Préférentiellement, les séquences des NID utilisées pour la mise en œuvre des méthodes selon l'invention sont comprises entre les résidus : • SRC-1 : 570 à 782 • TIF-2 : 413 à 812
• ACTR : 601 à 780
• DRIP205 : 514 à 775
• NCoR : 1853 à 2440 • SMRT : 2131 à 2351
• RIP140 : 476 à 705
• PGC-1 alpha : 1 à 206
• PGC-1 bêta : 1 à 462
• TRRAP : 580 à 900 ou 901 à 1394 • TReP-132 : 1 à 456 ou 461 à 1200
• CBP/p300 : 1 à 452.
Il est entendu que ces bornes ne sont pas fixes et qu'une modification des bornes de la séquence utilisée peut être effectuée par l'homme du métier.
Production des polypeptides
Les polypeptides NR-LBD et CoF-NID utilisés dans la méthode de l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme de l'art, notamment par synthèse artificielle et plus particulièrement par synthèse en phase solide ou par toute technique biologique, génétique ou enzymatique. De préférence les polypeptides sont des protéines de fusion, obtenues par expression d'un vecteur d'acide nucléique recombinant exprimant lesdits polypeptides dans un hôte, tel qu'une bactérie, une levure, une cellule d'insecte ou de mammifère.
Une production par voie recombinante dans un système bactérien, par exemple dans Escherichia coli, est particulièrement facile à réaliser.
Fixation du polvpeptide NR-LBD sur un support
Le polypeptide NR-LBD est fixé à un support solide qui peut être de toute sorte. Des plaques, notamment des microplaques et en particulier des microplaques de polystyrène ou de polypropylène, des billes paramagnétiques, des particules ou des billes solides peuvent être utilisées. On peut par exemple utiliser des billes (par exemple de Sépharose) ou une plaque recouvertes d'une substance affine à laquelle se fixe le polypeptide NR- LBD éventuellement modifié.
Test de criblage : détection de l'interaction
Le polypeptide CoF-NID comprend un marqueur, de préférence sous forme fusionné au domaine NID du cofacteur.
Le marquage peut être de type antigénique, fluorescent ou enzymatique, mais de préférence n'est pas radioactif. Pour les marquages antigéniques ou enzymatiques, le marqueur antigénique ou l'enzyme sont de préférence clones en fusion avec le CoF-NID.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF- NID est lié à un marqueur fluorescent pour former le polypeptide CoF-NID-Fluo et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF- NID est effectuée par fluorométrie. Le marquage fluorescent peut être direct ou indirect, le fluorophore étant fixé directement sur le CoF-NID ou par l'intermédiaire d'un autre marqueur. Le marqueur fluorescent peut être par exemple la fluorescéine, la RPE (R-Phycoerythrin), la GFP (Green Fluorescent Protein), l'APC (AlloPhycoCyanin), les cyanines ou l'Europium. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le marquage fluorescent est réalisé par l'intermédiaire d'un marqueur préalablement clone en fusion avec le CoF-NID [Lumio-Tag™ (invitrogen), SNAP™ (Covalys), Intéine] et relié à un fluorophore pour former le polypeptide Fluo-CoF-NID. Le marquage fluorescent du CoF-NID se passe de la manière suivante :
• Dans le polypeptide Inteine-CoF-NID, l'Inteine est capable de s'autocliver et génère un groupement chimique qui réagit avec une cystéine marquée avec un fluorophore. Le polypeptide CoF-NID marqué avec un groupement cystéine-fluorophore est ainsi obtenu. • Dans le polypeptide Lumio™-Tag-CoF-NID, le Lumio™-Tag réagit avec un réactif Lumio™ [Lumio-Green ™ ou Lumio-Red ™ (Invitrogen)], ce réactif devenant fluorescent lors de la formation du complexe. Un polypeptide CoF-NID marqué avec un fluorophore est ainsi obtenu. • Dans le polypeptide SNAP™-Tag-CoF-NID, le SNAP™-Tag (Covalys) clive les benzylguanines para substituées liées à un fluorophore ou à une biotine et fixe ces groupements de manière covalente. Le polypeptide CoF-NID marqué est ainsi obtenu.
Dans les trois cas, on obtient un polypeptide CoF-NID-Fluo. La possibilité d'utiliser différentes molécules fluorescentes permet la mise en place d'une analyse d'interaction en multiplexe. Préférentiel lement, le test de criblage est réalisé en multiplexe: le composé test est alors mis en contact avec le NR-LBD et plusieurs polypeptides CoF-NID comprenant chacun au moins un domaine NID d'un cofacteur, ces cofacteurs pouvant être différents entre eux. Dans ce cas, chaque polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent différent.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur antigénique et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par le biais d'un anticorps marqué de manière détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique. Ce marqueur antigénique peut être tout type de marqueur connu de l'homme du métier et peut être notamment choisi parmi une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou d'une séquence isolée de l'hémaglutinine ou de la protéine V5. La séquence polyHis contient de préférence de 4 à 6 résidus Histidine. Préférentiellement, le marqueur antigénique est une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis).
L'utilisation d'une séquence d'acides aminés polyhistidine permet d'assurer à la fois la purification et le marquage dudit polypeptide CoF-NID.
Les anticorps utilisés pour détecter ce marqueur antigénique peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Ils peuvent être produits par des techniques conventionnelles connues de l'homme du métier. Il peut s'agir d'anticorps commerciaux. Parmi ceux-ci, on peut citer l'anticorps penta-His HRP conjugate (QIAGEN), l'anticorps de lapin anti-6x His Abcam 9108, l'anticorps de lapin -6x His marqué à la HRP (peroxidase de raifort) Abcam 1187, l'anticorps de souris -anti- 5x His Qiagen 34698, l'anticorps de souris -anti-poly-His Sigma H-1029.
Les anticorps peuvent être couplés à des marqueurs détectables, connus de l'homme du métier, tels que des enzymes (par exemple la peroxidase de raifort
HRP), des marqueurs radioactifs, des agents fluorescents, des particules magnétiques, etc. Préférentiellement, l'anticorps est couplé à la HRP
(HorseRadish Peroxydase).
L'immunodétection peut être réalisée par n'importe quelle technique adaptée, par exemple un Western Blot, Dot Blot, etc.
Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par le biais d'un anticorps anti-polyHis couplé à un marqueur détectable, de préférence la peroxidase de raifort (HRP).
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur enzymatique et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique. Préférentiellement, le polypeptide CoF-NID est lié à la BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase).
La révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID peut notamment être effectuée à l'aide d'un substrat colorimétrique (p-Nitrophenyl Phosphate ou pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-Phos™), la mesure de l'interaction étant alors effectuée respectivement par spectrophotomètrie à 405 nm, par fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence. Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, la méthode comprend la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par fluorescence, luminescence et colorimétrie en fonction du substrat de la BAP utilisé.
Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide NR-LBD est le récepteur nucléaire (NR) entier et la mise en contact du composé test avec lesdits NR et CoF-NID est réalisée en présence d'un acide nucléique représentant l'élément de réponse (RE) de ce récepteur nucléaire. On peut alors sélectionner les composés qui interfèrent avec la liaison d'un récepteur nucléaire à un cofacteur de manière dépendante de l' ADN. Préférentiel lement, l'élément de réponse est biotinylé et fixé à un support (bille, plaque, puce, etc.) portant de la streptavidine. Selon un exemple de réalisation de l'invention, l'élément de réponse au récepteur nucléaire bicaténaire est fixé aux plaques recouvertes de streptavidine. La plaque est alors incubée en présence d'un ligand spécifique et d'un extrait nucléaire de cellules surexprimant le NR, préférentiellement PPAR, LXR ou FXR, et son partenaire d'hétérodimérisation, préférentiellement RXR, marqué avec un marqueur (Tag) antigénique, enzymatique ou fluorescent. Le polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à un autre marqueur antigénique, enzymatique ou fluorescent est ensuite ajouté et l'incubation est prolongée. La révélation de l'interaction NR/RXR et NR/CoF-NID est réalisée par le biais d'une méthode d'immunodétection, enzymatique ou fluorescente. La mise en contact est alors effectuée en présence du partenaire d'hétérodimérisation du récepteur nucléaire (par exemple RXR pour les récepteurs PPAR, LXR et FXR) ce qui permet de montrer que la liaison avec le cofacteur est dépendante de l'hétérodimère.
Composé test
Les composés susceptibles d'être identifiés à l'aide de la méthode selon l'invention peuvent être des composés de nature, structure et origine variées, notamment des composés biologiques, des composés chimiques, synthétiques, etc.
La présente invention peut donc être appliquée à tout type de composé test. Ainsi, le composé test peut être tout produit qui se présente sous une forme isolée ou en mélange avec d'autres produits. Le composé peut être défini en termes de structure et/ou de composition ou être défini sur le plan fonctionnel. Le composé peut, par exemple, être un produit isolé et structurellement défini, un produit isolé de structure indéfinie, un mélange de produits connus et caractérisés ou une composition indéfinie comprenant un ou plusieurs produits. Un ou plusieurs composés peuvent ainsi être testés, en mélange ou de manière séparée. De telles compositions indéfinies peuvent être, par exemple, des échantillons de tissus, des fluides biologiques, des surnageants cellulaires, des préparations végétales, etc. Les composés test peuvent être choisis parmi un produit inorganique ou organique et notamment un composé chimique ou biologique.
Le composé peut être d'origine naturelle ou synthétique et inclure une banque combinatoire.
La présente invention est particulièrement adaptée à la sélection, l'identification ou la caractérisation d'un nombre important de composés. Ce criblage simple et efficace peut être accompli en un laps de temps très court. Les méthodes décrites peuvent en particulier être partiellement automatisées, autorisant ainsi le criblage efficace et simultané de composés divers et nombreux, soit sous forme de mélange soit sous forme séparée. Préférentiellement, la méthode selon l'invention est réalisée en HTS (High
Throughput Screening) ou en MTS (Médium Throughput Screening). Pour un criblage à haut débit (HTS ou MTS) ou pour un criblage en multiplexe notamment, on utilise de préférence un support de type plaque ou puce, ledit support portant préférentiellement de la streptavidine et le NR-LBD étant alors biotinylé.
Utilisation des composés tests Comme indiqué, l'invention repose sur la mise en évidence de la capacité de ligands SNuRMs à moduler l'activité des récepteurs nucléaires en permettant le recrutement différentiel de cofacteurs, ce qui offre la possibilité de contrôler plus finement l'expression des gènes cibles des récepteurs nucléaires. Les SNuRMs sont en effet des agonistes ou des antagonistes de récepteurs nucléaires (NR) qui induisent une réponse différente en fonction du contexte cellulaire ou tissulaire (Smith et O'Malley, 2004).
La méthode de criblage selon l'invention permet préférentiel lement de quantifier l'interaction induite par chaque ligand et pour chaque cofacteur en comparaison avec un ligand de référence. Le composé qualifié de SNuRM est alors mis en évidence lorsque ce composé induit un défaut de recrutement (co- activateurs) ou de relarguage (co-répresseurs) de un ou plusieurs cofacteurs.
L'analyse du profil du ligand SNuRM, c'est à dire de la capacité du composé à recruter de manière différentielle des cofacteurs, permet ensuite de tester ces ligands afin de déterminer les effets physiologiques associés.
De plus, la méthode selon l'invention permet la mise en place d'études de type structure/activité : le ligand entraine en effet des modifications de structure du récepteur nucléaire, notamment au niveau du LBD. Ces modifications sont le reflet de l'activité du ligand et du recrutement différentiel de cofacteurs et présentent donc un intérêt majeur.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le niveau d'interaction mesurée avec la méthode selon l'invention est comparé à un contrôle réalisé en l'absence du composé test ou à un contrôle réalisé avec un ligand connu du récepteur nucléaire. Ceci permet de générer un « classement » des ligands SNuRMs et, en fonction des effets physiologiques désirés, de sélectionner la classe de SNuRMs ou les profils de recrutement associés à ces effets désirés. Il est alors avantageux d'utiliser les tests correspondants à ces profils pour trouver les composés SNuRMs possédant ces effets physiologiques recherchés sans effets secondaires indésirables.
La présente invention a aussi pour objet les ligands identifiés par la méthode de criblage décrite ci-dessus, utiles à titre de médicaments. La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique, au moins un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention, éventuellement en association avec un ou plusieurs autres principes actifs thérapeutiques et/ou cosmétiques. Il s'agit avantageusement d'une composition pharmaceutique pour le traitement d'une pathologie dans laquelle les récepteurs nucléaires tels que LXR, PPAR, FXR ou ROR sont impliqués. On peut citer par exemple le diabète, les dyslipidémies, lïnsulino-résistance, les pathologies liées aux dérèglements du métabolisme lipidique et/ou glucidique (hyperlipidémie, hyperglycémie, etc.), les pathologies associées au syndrome X, l'athérosclérose, les maladies cardiovasculaires, l'obésité, l'hypertension, les maladies inflammatoires (asthme, etc.), les maladies prolifératives (cancers, etc.), etc.
A titre d'exemple (et de manière non limitative), les autres agents thérapeutiques et/ou cosmétiques, commercialisés ou en développement, peuvent être choisis parmi:
- des anti-diabétiques,
- l'insuline,
- des molécules hypolipémiantes et/ou hypocholestérolémiantes, - des agents anti-hypertenseurs et les agents hypotenseurs,
- des agents anti-plaquettaires,
- des agents anti-obésité,
- des agents anti-inflammatoires,
- des agents anti-oxydants, - des agents utilisés dans le traitement de l'insuffisance cardiaque,
- des agents utilisés pour le traitement de l'insuffisance coronaire,
- des anticancéreux,
- des anti-asthmatiques,
- des corticoïdes utilisés dans le traitement des pathologies de la peau, - des vasodilatateurs et/ou des agents anti-ischémiques.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un ligand identifié par la méthode de criblage selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus. L'invention concerne également une méthode de traitement des pathologies mentionnées ci-dessus comprenant l'administration à un sujet, notamment humain, d'une quantité efficace d'un composé ou d'une composition pharmaceutique tels que définis ci-avant. Par traitement, on entend aussi bien le traitement préventif que curatif.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention comprennent avantageusement un ou plusieurs excipients ou véhicules, acceptables sur le plan pharmaceutique et bien connus de l'homme du métier. Les modes et voies d'administration ainsi que les doses peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction du patient et de la pathologie.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée. FIGURES • Figure 1 : schéma de principe de la réaction pull-down avec immunodétection, réalisée avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes portant du glutathion et avec un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis. La révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide
CoF-NID est réalisée par le biais d'un anticorps anti-polyHis couplé à un marqueur détectable, la peroxidase de raifort (HRP pour HorseRadish Peroxydase).
• Figure 2 : schéma de principe de la réaction pull-down avec détection enzymatique BAP, réalisée avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes portant du glutathion et avec un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP. La révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est réalisée par le biais d'une réaction colorimétrique, luminescente ou fluorescente, en fonction du substrat utilisé pour la BAP. • Figure 3 : schéma de principe de la réaction pull-down ADN-dépendant, réalisé avec l'hétérodimère NR/RXR. L'élément de réponse au récepteur nucléaire bicaténaire est fixé aux plaques recouvertes de streptavidine. La plaque est incubée en présence d'un ligand spécifique et d'un extrait nucléaire de cellules surexprimant le NR pleine longueur et son partenaire RXR marqué avec un marqueur (Tag) antigénique, enzymatique ou fluorescent. Le polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à un autre marqueur antigénique, enzymatique ou fluorescent est ensuite ajouté et l'incubation est prolongée. La révélation de l'interaction NR/RXR et NR/CoF-NID est réalisée par le biais d'une méthode d'immunodétection, enzymatique ou fluorescente.
• Figure 4 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR gamma et de cofacteurs DRIP205, TIF-2 et SRC-1. Le polypeptide GST-LBD PPAR gamma lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de His-CoF NID purifié (His-DRIP205 NID, His-SRC-1 NID, His-TIF-2 NID) en présence de DMSO (0.1 %,), de rosiglitazone (105 M) et des ligands A, B et C (105 M). Les billes sont ensuite lavées et les polypeptides GST-LBD PPAR gamma sont élues en présence de glutathion. L'ensemble est alors fixé sur une membrane de nitrocellulose et le Dot Blot est développé à l'aide d'un anticorps anti-His Tag.
• Figure 5 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de LXR alpha et de LXR bêta et des cofacteurs DRIP205 et TIF-2. Le polypeptide GST-LBD
LXR alpha ou bêta lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de His-CoF NID purifié (His-DRIP205 NID, His-TIF-2 NID) en présence de DMSO (0.1 %;, de T0901317 (106 M) et de GW3965 (106 M). Les billes sont ensuite lavées et les polypeptides GST-LBD LXR alpha et bêta sont éluée en présence de glutathion. L'ensemble est alors fixé sur une membrane de nitrocellulose et le Dot Blot est développé à l'aide d'anticorps anti-His Tag. • Figure 6 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR gamma et des cofacteurs TIF-2 et DRIP205. Le polypeptide GST-LBD PPAR gamma lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de CoF-NID- BAP purifié (DRIP205-NID-BAP, TIF-2-NID-BAP) en présence de DMSO
(0.1 %) et de différentes concentrations des ligands E et F. Les billes sont ensuite lavées et incubées en présence de Lumi-Phos™ (Pierce), un substrat luminescent de la BAP. La mesure est ensuite réalisée au luminomètre.
• Figure 7 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR gamma et du corépresseur NCoR. Le polypeptide GST-LBD PPAR gamma lié à des billes couvertes de glutathion est incubé en présence de NCoR-NID-BAP purifié en présence de DMSO (0.1 %), de différentes concentrations de rosiglitazone et de différentes concentrations de l'antagoniste GW9662. Les billes sont ensuite lavées et incubées en présence de Lumi-Phos™ (Pierce), un substrat luminescent de la BAP. La mesure est ensuite réalisée au luminomètre.
• Figure 8 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de PPAR alpha et du coactivateur SRC1. Le polypeptide LBD PPAR alpha biotinylé est lié à une plaque 96 puits recouverte de streptavidine qui est incubée en présence de SRC1 -NID-BAP purifié en présence de DMSO (0.1 %), et de fenofibrate (ligand de PPARalpha). La plaque est ensuite lavée et incubée en présence d'un substrat luminescent de la BAP. La mesure est ensuite réalisée au luminomètre.
• Figure 9 : Résultats de l'étude in vitro de l'interaction de FXR et du coactivateur SRC1. Le polypeptide BCCP-LBD FXR est lié à une plaque 96 puits recouverte de streptavidine qui est incubée en présence de SRC1-
NID-BAP purifié en présence de DMSO (0.1 %), et de CDCA (ligand de FXR). La plaque est ensuite lavée et incubée en présence d'un substrat luminescent de la BAP. La mesure est ensuite réalisée au luminomètre.
EXEMPLES
Exemple 1 : Pull-down avec immunodétection
1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID
Les protéines de fusion GST-NR-LBD ont été générées en clonant le LBD de chaque récepteur nucléaire (PPAR alpha, bêta et gamma, FXR, LXR alpha, bêta, ROR alpha et gamma) humain en aval de la région codante de la Glutathion S- Transferase (GST) dans le plasmide pGEX4T. Pour certains NR, la séquence clonée inclut une partie de la région charnière comprise entre le DBD et le LBD. Ainsi, les polypeptides GST-PPAR alpha, GST-PPAR gamma, GST-PPAR delta, GST-LXR alpha, GST-LXR bêta, GST-FXR, GST-ROR alpha et GST-ROR gamma sont générés en clonant respectivement la région comprise entre les résidus 180-468, 209-505, 135-441 , 207-447, 213-461 , 215-472, 84-468 et 97- 518. Les NID des différents cofacteurs utilisés ont été clones en fusion avec un His-Tag (contenant 6 résidus His (6xHis)). Les cofacteurs utilisés sont de la famille p160 (NCoA1/SRC-1 , NCoA2/TIF-2/SRC-2, NCOA3/ACTR/AIB1/PCIP/TRAM-1/SRC-3, etc.), DRIP205/TRAP220/PBP, NCoR/RIP13, SMRT/TRAC2, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300. Ainsi, les polypeptides His-SRC-1-NID, His-TIF-2-NID, His-ACTR-NID, His-DRIP205-NID, His-NCoR-NID, His-SMRT-NID, His-RIP140-NID, His-PGC1alpha-NID, His-PGC1 bêta-NID, His-TRRAP-NID, His- TRePI 32-NID et His-CBP/p300-NID sont générés en clonant respectivement la région comprise entre les résidus 570 à 782, 413 à 812, 601 à 780, 514 à 775, 1853 à 2440, 2131 à 2351 , 476 à 705, 1 à 206, 1 à 462, 580 à 900 ou 901 à 1394, 1 à 456 ou 461 à 1200, 1 à 452.
2- Production des protéines recombinantes CoF-NID
Les constructions plasmidiques obtenues sont transfectées dans une souche bactérienne E. coli BL21 qui permet l'expression de ces protéines recombinantes. Les bactéries sont lysées par sonication dans un tampon phosphate (NaH2PO4 50 mM, NaCI 300 mM, Imidazole 10 mM, 10% glycerol, PH 8.0), incubées 30 min sur glace et centrifugées 20 min à 6000 g. Le surnageant est ensuite incubé en présence d'une résine recouverte Nickel-NTA (QIAGEN). L'élution des protéines retenues par la résine en présence de 250 mM d'imidazole permet d'obtenir une fraction purifiée des différents NID de cofacteur. Les protéines sont dosées et conservées à -2O0C.
3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Les culots issus des cultures de bactéries BL21 transformées avec les plasmides codant pour les protéines de fusion GST-NR-LBD ont été lysés par sonication dans un tampon de lyse (PBS 1x, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, 0.1% NP-40, PH 7.4), incubés 30 min sur glace et centrifugés 20 min à 6000 g. Le lysat clarifié est ensuite incubé pendant 3 heures en présence de billes recouvertes avec du glutathion (Amersham Biosciences). Ces billes sont rincées plusieurs fois dans le tampon de lyse puis stockées à 40C. La quantité de protéine en fusion avec la GST liée sur les billes est déterminée par SDS-PAGE.
4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID en présence du liqand
3 à 15 microgrammes de GST-NR-LBD sont incubés avec différentes quantités de protéines His-CoF-NID en présence ou en absence de ligands spécifiques des différents récepteurs (PPAR alpha : fénofibrate ; PPAR gamma : A, B, C, E, F, rosiglitazone ; PPAR delta : GW501516 ; LXR : T0901317 et GW3965 ; FXR : CDCA (chenodeoxycholate), GW4064 ; ROR : cholestérol sulfate) pendant 2 heures dans un tampon d'interaction (Tris-HCI 15 mM, Glycerol 15%, EDTA 0.1 mM, NP40 0.04%, KCI 75 mM, BSA 0.25 g/l, DTT 1 mM, benzamidine 1 mM, protease inhibitor cocktail tablet (Roche), pH 8.0). L'ensemble est ensuite lavé 4 fois à l'aide du même tampon.
5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID La mise en évidence de l'interaction de la protéine His-CoF-NID avec la protéine GST-NR-LBD est réalisée à l'aide d'une méthode immunologique avec un anticorps anti His-Tag couplé à l'HRP (QIAGEN).
Les billes sont rincées 4 fois avec le tampon d'interaction puis additionnées d'un volume de tampon de Laemmli (BIORAD #161-0737) et chauffées 5 min à 950C. L'extrait est alors déposé sur un gel SDS-PAGE à 12% puis les protéines sont transférées sur membrane de nitrocellulose.
Dans une autre alternative, les billes lavées sont incubées dans un tampon d'élution (50 mM Tris-HCI, 10% glycérol, 150 mM KCI, EDTA 0.5 mM, Glutathion : 3mg/ml, PH 8.0) pendant 30 min. L'éluat est directement transféré sur membrane de nitrocellulose à l'aide d'un appareil BIO-DOT ™ (BIORAD). Dans les deux cas, l'interaction est alors quantifiée par Westem-Blot: la membrane de nitrocellulose est alors incubée en présence d'un anticorps anti-His couplé à l'HRP pendant 2 heures dans un tampon TBS (Tris-HCI 20 mM, 500 mM NaCI, 5% de lait écrémé, pH 7,4) puis lavée dans un tampon de lavage (Tris-HCI 20 mM, 500 mM NaCI, Tween 20 0.05%, pH 7,4) 3 fois pendant 10 min. L'activité HRP est alors révélée à l'aide du Kit ECL™ Western blotting détection reagent (Amersham Biosciences), selon les indications du déposant.
6- Résultats
Cette méthode permet de quantifier l'interaction induite par chaque ligand et pour chaque cofacteur en comparaison avec un ligand de référence. Le composé qualifié de SNuRM est alors mis en évidence lorsque ce composé induit un défaut de recrutement (co-activateurs) ou de relarguage (co-répresseurs) de un ou plusieurs cofacteurs.
Les résultats des expériences réalisées avec PPAR gamma et les cofacteurs DRIP205, TIF-2 et SRC-1 , présentés sur la figure 4, montrent un recrutement différentiel de cofacteurs en fonction du ligand utilisé (A, B, C ou rosiglitazone). En effet, les ligands A, B, C et la rosiglitazone induisent un recrutement de DRIP205 équivalent tandis que le recrutement de SRC-1 est au moins 4 fois plus faible avec les ligands B et C par rapport au recrutement induit par le ligand A et la rosiglitazone. De plus, nous constatons que le ligand C induit un recrutement 2 fois plus faible de TIF-2 en comparaison avec le ligand B. Ces 4 ligands induisent donc un recrutement différentiel des cofacteurs. Ils peuvent donc être considérés comme des modulateurs sélectifs des récepteurs PPAR (ligands désignés « SPPARM » , pour Sélective PPAR Modulators).
Les résultats des expériences réalisées avec les récepteurs nucléaires LXR alpha et LXR bêta et avec les cofacteurs TIF-2 et DRIP205, en présence des ligands T0901317 et GW3965, sont présentés sur la figure 5. On constate, pour LXR alpha, que le T0901317 entraîne un recrutement légèrement supérieur à GW3965, quel que soit le cofacteur et que le recrutement de DRIP205 par les 2 ligands est moindre que celui de TIF-2.
Pour LXR bêta, le recrutement des 2 cofacteurs DRIP205 et TIF-2 semble être similaire pour les 2 ligands. De la même manière que pour LXR alpha, le recrutement de DRIP205 est moindre que celui de TIF-2.
Exemple 2 : Pull-down avec détection enzymatique
1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID
Le clonage de protéines NR-LBD et CoF-NID est effectué de la manière décrite dans l'exemple 1 , le CoF-NID étant cette fois clone en fusion (C Terminal) avec la Bacterial Alkaline Phosphatase (BAP) dans le plasmide pRSET (CoF-NID-BAP).
2- Production des protéines recombinantes CoF-NID-BAP Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1.
3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1.
4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID-BAP en présence du liqand
Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 1 , les billes étant lavées dans un tampon Tris-HCI, KCI 100 mM Ph 8.0. 5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID Les rinçages après incubation sont réalisés dans un tampon Tris-HCI additionné de KCI. Les billes sont alors incubées à l'aide d'un substrat colorimétrique (p- Nitrophenyl Phosphate ou pNPP), fluorescent (Fluorescein DiPhosphate ou FDP) ou luminescent (Lumi-Phos™):
• Pendant 3 heures dans une solution de pNPP (SIGMA substrat coloré à 10 mM / Tris-HCI 100 mM PH 8.0)
• Pendant 1 heure dans une solution de FDP (Euromedex, substrat fluorescent) à 30 microM ; ou • Pendant 30 min dans une solution de Lumi-Phos™ WB (Pierce), l'interaction relative de chaque cofacteur avec le récepteur nucléaire étant alors mesurée respectivement par spectrophotomètrie à 405 nm, par fluorimétrie (exitation : 485 nm ; émission : 535 nm) ou par luminescence.
6- Résultats
Cette méthode permet de quantifier l'interaction induite par chaque ligand et pour chaque cofacteur en comparaison avec un ligand agoniste de référence (qualifié de « full agonist »). Le composé ligand SNuRM est alors mis en évidence lorsque ce composé induit un défaut de recrutement (co-activateurs) ou de relarguage (co- répresseurs) de un ou plusieurs cofacteurs.
Les résultats des expériences réalisées avec PPAR gamma et les cofacteurs DRIP205 et TIF-2, présentés sur la figure 6, montrent un recrutement différentiel des cofacteurs avec les ligands E ou F. En effet, les ligands E ou F induisent un recrutement de DRIP205 tandis que le recrutement de TIF-2 n'est observé qu'avec le ligand E. Ce dernier peut donc être considéré comme un modulateur sélectif du récepteur PPAR.
Les résultats des expériences réalisées avec PPAR gamma et avec le corepresseur NCoR en présence de différentes concentrations de rosiglitazone sont présentés sur la figure 7. On constate, sur la figure 7A, que la rosiglitazone est capable d'induire la libération de NCoR du complexe PPAR gamma-NCoR. D'autre part, la figure 7B montre que, contrairement à la rosiglitazone (agoniste), un antagoniste de PPAR gamma (GW9662) est capable d'induire une augmentation de l'interaction entre PPAR gamma et NCoR. Cette méthode permet donc de mettre en évidence l'activité agoniste inverse d'un ligand.
Exemple 3 : Pull-down avec détection enzymatique à moyen débit (MTS).
1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID-BAP
Les protéines de fusion GST-NR-LBD (cf exemple 1 ) ou NR-LBD biotinylées (Biotin-NR-LBD) ont été générées en clonant le LBD de chaque récepteur nucléaire (PPAR alpha, bêta et gamma, FXR, LXR alpha, bêta, ROR alpha et gamma) humain dans le plasmide pRSET en aval de la GST ou de la région codante de la séquence BCCP (Biotin Carboxyl Carrier Protein) de la protéine BCCP/FabE (X14825, AA 70-156) ά'Esherichia coli. La séquence BCCP permet la biotinylation de la protéine (Biotin-LBD) lors de l'expression. Les séquences codantes des NR-LBD sont identiques à celles décrites dans l'exemple 1. Ces protéines sont produites et purifiées de la manière décrite dans l'exemple 1.
2- Production des protéines recombinantes CoF-NID-BAP
Les polypeptides CoF-NID-BAP sont clones et produits de la manière décrite dans l'exemple 2.
3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support
Des plaques 96 puits recouvertes avec de la streptavidine (Pierce) sont incubées avec le polypeptide Biotin-NR-LBD purifié dans un tampon de liaison (Tris-HCI 20 mM, NaCI 150 mM, 0.05% Tween 20 pH 7.2) pendant 2 heures. La plaque est alors rincée en utilisant le même tampon.
4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID-BAP en présence du liqand Les plaques sont ensuite incubées avec différents CoF-NID-BAP dans le tampon d'interaction de la manière décrite dans l'exemple 2.
5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID La plaque subit alors une nouvelle série de lavage et l'interaction avec chaque cofacteur est mesurée de la manière décrite dans l'exemple 2. La mesure de l'interaction du NR avec différents cofacteurs permet ainsi une mise en œuvre de l'invention à plus haut débit.
6- Résultats
Cette méthode permet d'amener les expériences décrites dans l'exemple 2 à un débit compatible avec le format 96 puits classiquement utilisé pour cribler des banques de composés. Les résultats des expériences réalisées avec PPAR alpha (figure 8) ou FXR (figure 9) et le NID du cofacteur SRC1 couplé à la BAP, montrent un recrutement de ce cofacteur en présence des ligands spécifiques des deux récepteurs (le fenofibrate pour PPAR alpha et le CDCA pour FXR). Ces résultats indiquent que la fixation des protéines BCCP-NR biotynylées sur des plaques recouvertes de streptavidine permet d'obtenir une induction de recrutement comparable à celle observée avec les billes recouvertes de glutathion de l'exemple 3.
Exemple 4 : Pull-down avec détection par fluorescence en multiplexe à moyen débit (MTS).
1- Clonage des protéines recombinantes NR-LBD et CoF-NID
Les Biotin-NR-LBD sont clones de la manière décrite dans l'exemple 3.
Les CoF-NID sont clones avec différents marqueurs permettant un marquage fluorescent ultérieur: Intein, Lumio™-Tag (Invitrogen) et SNAP™-Tag (Covalys). Pour le système Intein, le polypeptide CoF-NID est clone en fusion avec l'intéine. Pour le système Lumio™ (Invitrogen), le polypeptide CoF-NID est clone en fusion avec un marqueur comportant 6 résidus (Cys-Cys-Pro-Gly-Cys) (Lumio™-Tag).
Pour le système SNAP™ (Covalys), le CoF-NID est clone en fusion avec le SNAP™-Tag. La production et la purification des protéines sont décrites dans l'exemple 3.
2- Marquage des protéines recombinantes CoF-NID
Le marquage fluorescent du CoF-NID se réalise de la manière suivante : • Dans le polypeptide Inteine-CoF-NID, l'Inteine s'autoclive sous certaines conditions et génère un groupement chimique qui réagit avec une cystéine marquée avec un fluorophore. Le polypeptide CoF-NID marqué avec un groupement cystéine-fluorophore est ainsi obtenu. • Dans le polypeptide Lumio™-Tag-CoF-NID, le Lumio™-Tag réagit avec un réactif Lumio™ (Lumio-Green ™ ou Lumio-Red ™ (Invitrogen)), ce réactif devenant fluorescent lors de la formation du complexe. Un polypeptide CoF-NID marqué avec un fluorophore est ainsi obtenu.
• Dans le polypeptide SNAP™-Tag-CoF-NID, le SNAP™-Tag (Covalys) clive les benzylguanines para substituées liées à un fluorophore ou à une biotine. Le polypeptide CoF-NID marqué est ainsi obtenu.
Dans les trois cas, on obtient un polypeptide CoF-NID-Fluo et la possibilité d'utiliser différentes molécules fluorescentes permet la mise en place d'une analyse d'interaction en multiplexe.
3- Fixation des protéines recombinantes NR-LBD sur un support Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 3.
4- Interaction des protéines recombinantes NR-LBD ou CoF-NID en présence du liqand
Les plaques sont ensuite incubées avec plusieurs CoF-NID marqués avec des fluorophores différents au sein d'un même puit (multiplexage) dans le tampon d'interaction puis rincées de la manière décrite dans l'exemple 2.
5- Quantification de l'interaction du NR-LBD avec le CoF-NID-Fluo L'interaction relative de chaque cofacteur avec le récepteur nucléaire est alors mesurée par fluorimétrie. L'excitation et l'émission varient en fonction du fluorophore à détecter.
Exemple 5 : Méthode de détection de l'interaction du récepteur avec le cofacteur en présence d'ADN (élément de réponse de gènes cibles du NR considéré). 1- Clonage des protéines recombinantes NR et CoF-NID
Les NR sont clones en pleine longueur dans le plasmide pcDNA3. RXR est clone en phase avec un marqueur immunogène en N-terminal, luminescent ou permettant un marquage fluorescent.
Les CoF-NID sont clones et produits de la manière décrite dans les exemples 1 à 4.
2- Marquage des protéines recombinantes CoF-NID (CoF-NID-Fluo) et des Ivsats nucléaires
Cette étape s'effectue de la manière décrite dans l'exemple 4.
3- Synthèse des éléments de réponse (RE) au NR
Des oligonucléotides complémentaires correspondants à différents RE issus des séquences de différents promoteurs de gènes cibles sont rendus bicaténaires dans un tampon d'hybridation (Tris-HCI 25OmM, 125 mM KCI, MgCI2 2mM, DTT 1OmM, PH8.0). Des plaques 96 puits recouvertes avec de la streptavidine (Pierce) sont incubées avec chaque oligonucléotide double-brin dans un tampon de liaison. La plaque est alors rincée en utilisant le même tampon.
4- Interaction des protéines NR avec l'ADN et les CoF-NID en présence du ligand Les plaques sont alors incubées en présence d'un lysat nucléaire de cellules préalablement transfectées à l'aide des plasmides pcDNA3-RXR (partenaire d'hétérodimerization de PPAR, LXR et FXR) pleine longueur marqués et pcDNA3- NR pleine longueur en présence de ligands spécifiques des récepteurs nucléaires considérés dans un tampon HEPES [ 20 mM HEPES, KCL 150 mM, MgCI2 5 mM, Triton 0.1%, NP40 0.1%, Gelatin 0.1%, benzamidine 1 mM, protease inhibitor cocktail tablet (Roche), pH 8.0] pendant 2 heures. Puis les polypeptides CoF-NID sont ajoutés et l'incubation est prolongée d' 1 h. Les plaques sont ensuite rincées dans le même tampon.
5- Quantification de l'interaction ADN / NR et ADN / NR / CoF-NID L'interaction du NR avec RXR et avec les polypeptides CoF-NID est mesurée de la manière décrite dans les exemples 1 à 4.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode in vitro de criblage de composés modulateurs d'un récepteur nucléaire, comprenant la mise en contact d'un composé test avec :
(i) un polypeptide désigné « NR-LBD » fixé à un support solide et comprenant au moins un domaine (LBD) de liaison au ligand d'un récepteur nucléaire (NR), et (ii) un polypeptide désigné « CoF-NID » lié à un marqueur et comprenant au moins un domaine (NID) d'interaction d'un cofacteur (CoF) avec le récepteur nucléaire; et la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID.
2. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le récepteur nucléaire est choisi parmi les récepteurs PPAR, LXR, FXR et ROR.
3. Méthode selon les revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que le cofacteur est choisi parmi les membres de la famille p160, DRIP205, NCoR,
SMRT, RIP140, PGC1 alpha et bêta, TRRAP, TReP-132 et CBP/p300.
4. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce que le cofacteur est un membre de la famille p160 choisi parmi SRC-1 , TIF-2, et ACTR.
5. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support porte du glutathion, le polypeptide NR-LBD comprenant alors une Glutathion S-Transférase (GST) ou de la streptavidine, le polypeptide NR-LBD étant alors biotinylé.
6. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit support est une plaque, une bille ou une puce.
7. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le niveau d'interaction mesuré est comparé à un contrôle réalisé en l'absence du composé test ou à un contrôle réalisé avec un ligand connu du récepteur nucléaire.
8. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur antigénique, la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF- NID étant alors effectuée par le biais d'un anticorps marqué de manière détectable et dirigé contre ledit marqueur antigénique.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit marqueur antigénique est choisi parmi une une séquence d'acides aminés polyhistidine (polyHis), un élément cMyc, Flag ou un fragment de l'hémaglutinine ou de la protéine V5.
10. Méthode selon la revendication 9, comprenant la mise en contact du composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à une séquence polyHis, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR- LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par le biais d'un anticorps anti- polyHis couplé à un marqueur détectable.
11. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur fluorescent et la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie.
12. Méthode selon la revendication 11 , caractérisée en ce que ledit marqueur fluorescent est la fluoresceine, la RPE (R-Phycoerythrin), la GFP (Green Fluorescent Protein), l'APC (Allophycocyanin), les cyanines ou l'Europium.
13. Méthode selon l'une des revendications 11 ou 12, caractérisée en ce que le marqueur fluorescent est lié au polypeptide CoF-NID par le biais d'un autre marqueur, tel que l'inteine, le Lumio™-Tag ou le SNAP™-Tag.
14. Méthode selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'elle est réalisée en multiplexe : le composé test est alors mis en contact en même temps avec plusieurs polypeptides CoF-NID comprenant chacun au moins un domaine NID d'un cofacteur, ces cofacteurs pouvant être différents entre eux.
15. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est lié à un marqueur enzymatique et en ce que la révélation de l'interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID est effectuée par fluorométrie, luminescence ou colorimétrie, en fonction du substrat utilisé lors de la réaction enzymatique.
16. Méthode selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit marqueur enzymatique est la BAP (Bacterial Alkaline Phosphatase).
17. Méthode selon la revendication 16, comprenant la mise en contact d'un composé test avec un polypeptide NR-LBD comprenant un domaine LBD fusionné à une GST ou à un marqueur induisant la biotinylation, ledit polypeptide NR-LBD étant fixé à des billes ou à une plaque portant respectivement du glutathion ou de la streptavidine, et un polypeptide CoF-NID comprenant un domaine NID fusionné à la BAP, la révélation d'une interaction entre le polypeptide NR-LBD et le polypeptide CoF-NID étant réalisée par fluorescence, luminescence ou colorimétrie en fonction du substrat de la BAP utilisé.
18. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide CoF-NID est le cofacteur entier.
19. Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le polypeptide NR-LBD est le récepteur nucléaire (NR) entier.
20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que la mise en contact du composé test avec lesdits NR et CoF-NID est réalisée en présence d'un acide nucléique représentant l'élément de réponse (RE) de ce récepteur nucléaire.
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