WO2007045755A1 - Procede de fabrication d'un biocapteur a detection integree - Google Patents

Procede de fabrication d'un biocapteur a detection integree Download PDF

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WO2007045755A1
WO2007045755A1 PCT/FR2006/002327 FR2006002327W WO2007045755A1 WO 2007045755 A1 WO2007045755 A1 WO 2007045755A1 FR 2006002327 W FR2006002327 W FR 2006002327W WO 2007045755 A1 WO2007045755 A1 WO 2007045755A1
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WO
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photodetectors
filter
biosensor
excitation
rejection
Prior art date
Application number
PCT/FR2006/002327
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English (en)
Inventor
Houtaï CHOUMANE
Claude Weisbuch
Henri Benisty
Khoi-Nguyen Ha
Original Assignee
Genewave
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Publication date
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Priority to EP06820224A priority patent/EP1946080A1/fr
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6452—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates
    • G01N21/6454—Individual samples arranged in a regular 2D-array, e.g. multiwell plates using an integrated detector array

Definitions

  • the invention relates to a method for manufacturing a biosensor with integrated detection, as well as the biosensor obtained by carrying out this method.
  • An integrated detection biosensor comprises a chromophore element support substrate and a set of photodetectors for sensing light emitted from the chromophore elements in response to a light excitation, the photodetector assembly being associated with the substrate and forming a unitary assembly with this one.
  • WO 02/16912 discloses a biosensor of this type in which an interference mirror and an absorbing layer are arranged in the substrate in order to reject the excitation light of the chromophores and to prevent it from "noising" the photodetectors applied. on the back side of the substrate.
  • WO 2004/042376 also discloses an integrated luminescence biosensor with evanescent excitation, the substrate of which can be associated with a set of photodetectors and comprises at the surface a planar waveguide containing photoluminescent constituents which are illuminated by a primary excitation light and which themselves emit excitation light chromophores deposited on the waveguide.
  • the arrangement of a set of photodetectors on the rear face of the substrate or face opposite to that carrying the chromophores allows a collection efficiency of the luminous flux emitted by the chromophores which is several tens of times greater than that of a standard imager placed at the above chromophores.
  • an integrated detection biosensor comprising a substrate intended to carry chromophore elements that emit light in response to a light excitation at a given wavelength, and a set of photodetectors associated with the substrate for capturing the light emitted by the chromophore elements inside the substrate, this process being characterized in that it consists in depositing on the set of photodetectors thin layers constituting both the aforementioned substrate and a omnidirectional rejection filter of the excitation light of the chromophoric elements and transmission of the light emitted by these elements, this filter ensuring a transmission of the excitation light of the order of 10 "6 or less, preferably of about 10 "8, and a level of autofluorescence 10" 6 or less.
  • the method according to the invention makes it possible to produce an ultrasensitive detection biosensor, which is integrated and which does not include an objective or optical components, and in which biological probes can be deposited directly on a thin-film rejection filter which covers a set of photodetectors. It is thus possible to produce miniaturized and low-cost biosensors, using known techniques for the mass production of microelectronic components, these biosensors having a sensitivity of the order of one chromophore / ⁇ m 2 .
  • the rejection filter comprises at least one thin layer absorbing the excitation wavelength of the chromophore elements.
  • This absorbent layer is provided to provide omni-directional absorption of the light excitation independent of the illumination angle of the biosensor or the scattering angle of the exciting light.
  • This absorbent layer may be produced by any known means, for example by the sol-gel process or by deposition and spreading of a dyestuff layer optionally dispersed in an inorganic or polymeric matrix, by a spin coating process or by soaking by a dip coating process.
  • the rejection filter comprises, in combination with the absorbing filter, a Bragg mirror formed of thin layers of transparent materials at the wavelength of the emission by the chromophores, or an interference filter formed for example of thin layers of superimposed polymers.
  • This Bragg mirror or this interference filter covers at least one absorbent layer which is deposited on the set of photodetectors. It is the combination of a Bragg mirror or an interference filter and an absorbent layer that is likely to give the best results in terms of rejection of the excitation light of the chromophoric elements.
  • the Bragg mirror produces an effect of amplification of the excitation by constructive interference and a pure rejection effect of the excitation (directional), the rejection being however mainly ensured by the absorbing layer. Rejection by the Bragg mirror provides further reduction of the fluorescence level of the absorbent layer.
  • the biosensor comprises an opaque surface layer, for example metal, in which holes are formed, this layer making it possible to limit the overall luminous flux on the biosensor.
  • the invention provides in one embodiment for forming on the set of photodetectors a plurality of superposed superimposed thin layers of different natures. , in which a lower layer (closer to the photodetectors) is intended to absorb the autofluorescence of an upper layer.
  • This cascading arrangement of the thin absorbing layers is all the more advantageous as the spectral difference between the excitation wavelength of the chromophore elements and the central wavelength of the light emitted by the chromophoric elements is large.
  • the rejection filter comprises a Bragg mirror formed of a series of superimposed thin layers having an optical thickness equal to a quarter of the excitation wavelength, this Bragg mirror ensuring a rejection of 0.025 of the excitation (ie 0.1 in pure rejection).
  • this structure interferential effects on the surface of the substrate make it possible to increase by a factor on the order of 4 the energy of the excitation electromagnetic field, which leads to an amplification of the photoexcitation rate by a factor of 4.
  • the transmission of the excitation energy through these layers this corresponds to an equivalent optical density of 1, 6.
  • This Bragg mirror is associated with an absorbing layer having an optical density of 6.4, and an autofluorescence level of less than 10 '6 ' 4 times the intensity of the excitatory light, the rejection filter having an equivalent optical density total equal to 8, resulting in a rejection rate of 10 "8.
  • the sensitivity of the detection is then of a chromophore element / 2 .mu.m, for common chromophores.
  • the biosensor according to the invention can be produced by deposition of one or more absorbent thin layers on a matrix of photodetectors, then by deposition (if any) of thin layers intended to form a Bragg mirror or an interference filter, the different layers. being deposited or formed successively on each other.
  • the method according to the invention consists in producing the rejection filter on an initial substrate, then in depositing the assembly formed by the filter and the initial substrate on a set of photodetectors, the filter lying between this set of photodetectors and the initial substrate, and finally to remove the initial substrate.
  • the rejection filter is fixed to the set of photodetectors by adhesion, either by virtue of its own adhesion, or by means of a layer of suitable adhesive material.
  • the rejection filter that is initially formed on the initial substrate comprises an absorbent film, or a reflective film, or the combination of an absorbent film and a reflective film.
  • an absorbent film or a reflective film, or the combination of an absorbent film and a reflective film.
  • a reflective film such as a Bragg mirror, which involves operations. annealing which would not be well supported by the photodetectors and the absorbing film, and then deposit on the Bragg mirror the thin layer or set of thin layers forming the absorbent film.
  • the rejection filter and the initial substrate can form a flexible film that is easy to store and use, for example in the form of a roll.
  • the Bragg mirror or the interference filter may be formed on an initial substrate and the absorbent film may be formed on another initial substrate, which then makes it possible to produce the biosensor according to the invention by transferring the absorbing film to a set of photodetectors, then by transfer of the Bragg mirror or the interference filter on the absorbing film.
  • probes possibly comprising fluorescent markers are deposited in the liquid phase on determined zones, for example in a network, on the rejection filter of the biosensor (technique known as "spotting"). After drying, the biosensor is stored for a duration that can be long.
  • the probes may include fluorescent markers.
  • an aqueous buffer liquid containing a surfactant is used for depositing the probes on the rejection filter, the surface of which can be very hydrophobic.
  • the biosensor carrying the probes is finally encapsulated in a housing which can then be used for the hybridization of the probes, this housing comprising at least one inlet and one liquid outlet which are connected in the housing by a channel extending over the surface of the filter carrying the probes, at least one observation window and / or illumination of the probes by the excitation light being formed in the face of the housing which covers the probes.
  • the opposite face of the housing which is located on the side of the photodetectors, allows access to an electronic interface for connecting the photodetectors to information processing means.
  • the set of photodetectors used is a matrix of CCD or CMOS photodetectors, the front face of which is covered by the rejection filter.
  • the photodetector matrices CCD illuminated by the front face have a reduced sensitivity of the order of one half in the visible spectrum, compared to that of photodetector matrices lit by the back face, because of the absorption of photons by polysilicon transfer grids.
  • the use of backlighting in illumination requires a delicate thinning of the silicon substrate.
  • openings are formed in one or more of the layers of the rejection filter opposite some of the photodetectors for the calibration of the rejection of the excitation light by these layers.
  • FIG. 1 is a partial schematic sectional view of a biosensor according to the invention.
  • FIG. 2 is a partial schematic sectional view of an alternative embodiment of this biosensor
  • FIG. 3 is a schematic sectional view showing a biosensor according to the invention mounted in a hybridization box;
  • FIG. 4 diagrammatically illustrates four steps of producing a biosensor according to the invention
  • FIG. 5 is a partial schematic sectional view of a biosensor according to the invention with a CCD photodetector matrix illuminated by the rear face;
  • FIG. 6 is a partial schematic sectional view of a biosensor according to another variant of the invention.
  • FIG. 7 is a partial schematic view of a matrix of photodetectors with pixels of different sizes;
  • Figure 8 is a schematic sectional view of an alternative embodiment of the invention.
  • the biosensor of FIG. 6 is a partial schematic sectional view of a biosensor according to another variant of the invention.
  • FIG. 7 is a partial schematic view of a matrix of photodetectors with pixels of different sizes;
  • Figure 8 is a schematic sectional view of an alternative embodiment of the invention.
  • chromophore elements located in ranges or " spots »16 on the surface of the biosensor, the chromophore elements emitting a light centered on a wavelength ⁇ f when they are excited by a luminous radiation of wavelength ⁇ e ( ⁇ f being for example equal to 570 nm and ⁇ e to 532 nm when the chromophore elements are markers Cy3), the excitation wavelength being chosen in the visible spectrum (about 400-750nm) or in the near infrared (750-2500nm approximately).
  • Absorbent layer 14 may be formed of a single layer of absorbent material, or a plurality of superimposed absorbent layers of different natures to reduce the autofluorescence of this layer caused by the excitation light.
  • an absorbing layer n located under an absorbing layer n + 1 has a determined nature to absorb the autofluorescence of the absorbing layer n + 1, while allowing the light flux to pass at the wavelength ⁇ f towards the photodetectors 12.
  • the same photodetector can receive light signals coming from different points or zones, which generates a spurious signal of crosstalk, all the greater as the spacing or vertical distance between these points or areas and the photodetector is large.
  • this spacing is small and the spurious signal is reduced to a minimum.
  • the diameter of these points or zones is 400 .mu.m and their spacing with the photodetectors is 10 .mu.m, so that the parasitic signal is minimal.
  • the crosstalk signal can be large and likely to reduce the sensitivity of the detection.
  • computer processing of deconvolution of the parasitized image well known to those skilled in the art, makes it possible to recover the useful signal by suppressing the parasitic signal.
  • the absorbent layer 14 may be prepared and deposited on the photodetectors 12 in the following manner: - a dye solution having a rejection compatible with the light emission of the fluorescent markers used, that is to say which stops the light, is prepared; of excitation and lets pass a part of the emission spectrum of the markers. Dyes meeting these criteria include metal complexes based on chromium or cobalt and ligands formed by organic molecules based on azo derivatives.
  • a mixture of a dye (having a light excitation absorption function) can be used with another component which suppresses or stops the fluorescence of the absorbing molecule.
  • the dye solution is prepared by dissolving one gram of the dye in one ml of DMF (Dimethyl Formamide). After stirring, the The solution obtained is filtered and mixed with 1.5 ml of a solution of polyimide (marketed by HD Microsystems under the reference Pl 2555) or with butylcyclobenzene.
  • the final solution has a dye mass concentration of about 400 mg / ml and has a molar extinction coefficient of about 9 ⁇ 10 3 cm -1 .
  • this dye solution is deposited on the photodetectors of a CCD matrix sensor, the protection window of which has been removed and the metal contacts of which have been protected, for example by localized deposition of a coating resin capable of ensuring good sealing and mechanical and chemical resistance during thermal annealing or photopolymerization steps necessary for the development of the biosensor.
  • a coating resin capable of ensuring good sealing and mechanical and chemical resistance during thermal annealing or photopolymerization steps necessary for the development of the biosensor.
  • EPOTEK resin T7139 from POLYTEC Pl SA can be used.
  • the dye solution is spread by "spin coating" with a rotation speed of 3000 revolutions per minute, the spread being followed by a pre-annealing at 100 ° C. for 30 minutes in the oven, then annealing. at 210 ° C. in an oven for 1 h 30, these temperatures being supported by the matrix of photodetectors.
  • the dye film obtained has a thickness of the order of 10 ⁇ m and an optical density equal to 9 at the wavelength of 532 nm, which corresponds to a transmission of 10 -9 .
  • Biological probes are then deposited on the surface of the absorbent layer 14 by a known technique of "spotting" to form the aforementioned ranges 16. Since the absorbent layer 14 is of a very hydrophobic nature, it is necessary to use for the deposition of the biological probes a buffer liquid containing a relatively high amount of a surfactant of the SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) type to form 16 with a size of about 400 ⁇ m (or less depending on the application). It will be noted in this connection that the relative dimensions of the different elements shown in FIG. 1 have not been respected in the drawing for the sake of clarity.
  • SDS sodium Dodecyl Sulfate
  • the tracks 16 have dimensions of 100 to 400 ⁇ m for example, the absorbent layer 14 has a thickness of the order of ten microns, the photodetectors 12 have unit dimensions of the order of ten microns, the ranges 16 thus covering one or more tens of photodetectors.
  • a functionalization layer 18 is formed on the upper surface of the layer 14 on which the biological probes are deposited, this functionalization layer for fixing the probes.
  • the photodetectors 12 of the sensor 10 are covered by a plurality of thin absorbing layers 14 of different nature, making it possible to reduce the influence of the autofluorescence of the dyes used in these absorbent layers, and by a Bragg mirror 20 formed of a plurality of superimposed thin layers 22 of dielectric material, having refractive indices which are respectively high and low and which are arranged alternately, in a manner well known to those skilled in the art.
  • These thin alternating layers 22 have an optical thickness equal to one quarter of the excitation wavelength ⁇ e, to increase by a factor
  • these layers reduce the intensity of the light excitation on the absorbing filter, thus reducing the autofluorescence of the filter.
  • the Bragg mirror 20 may not be exactly centered on the excitation wavelength ⁇ e, in order to increase the total rejection slope of the filter constituted by the Bragg mirror 20 and by the multilayer absorbent 14. It is necessary to however, the centering of the Bragg filter is performed relatively accurately on the excitation wavelength ⁇ e to ensure significant amplification (greater than 3) of the light excitation.
  • the alternating thin layers 22 of the Bragg mirror 20 can be deposited by any known method, for example by physical deposition techniques, by a sol-gel process, or by extrusion. Then, a functionalization layer 18 is formed on the upper surface of the Bragg mirror 20, then 16 pads containing biological probes can be deposited and fixed on this layer 18 as previously described for the biosensor of Figure 1.
  • a semi-transparent metal mirror can play the role of a first filter.
  • the Bragg mirror 20 deposited on the absorbent layers 14 may be replaced by an interference filter formed of superimposed thin layers of polymers having alternately high and low refractive indices, the technique of manufacturing these interference filters being known to those skilled in the art and described in particular in document US 6737154.
  • the biosensor according to the invention on which the tracks 16 containing the biological probes have been formed, can be finally encapsulated in a housing or a hybridisation cartridge 24 (FIG. 3), a front face 26 of which comprises at least one opening 28. liquid inlet and a liquid outlet opening 30, interconnected by a channel 32 allowing the liquid entering through the opening 28 to flow on the face of the biosensor bearing the 16 depositing beaches of biological probes.
  • the front face 26 of the cartridge 24 comprises at least one other opening 34, formed facing the 16 depositing beaches of the biological probes and allowing illumination of these ranges by the excitation light of the chromophoric elements.
  • An electronic interface 36 associated with the rear face of the set of photodetectors 10 is accessible via the rear face of the Hybridization cartridge 24 and makes it possible to transfer the data captured by the photodetectors to means 38 for processing the information.
  • the rejection filter which covers the photodetector assembly 10 comprises a Bragg mirror 20 and absorbent layers 14.
  • the invention proposes a method of manufacturing the biosensor comprising the essential steps a, b, c and d represented in FIG. 4, this process consisting, in step a, in first forming the Bragg mirror. 20 (or an interference filter) on an initial substrate 40 of a conventional type, then depositing or forming the absorbent layer (s) 14 on the Bragg mirror.
  • step a in first forming the Bragg mirror. 20 (or an interference filter) on an initial substrate 40 of a conventional type, then depositing or forming the absorbent layer (s) 14 on the Bragg mirror.
  • This makes it possible to subject the layers 22 of the Bragg mirror (or interference filter) to the annealing required without worrying about the influence of this annealing on the other components of the biosensor.
  • step b the assembly formed by the substrate 40, the mirror of
  • Bragg 20 and the absorbent layer 14 is transferred to the set 10 of photodetectors by being turned over so that the absorbent layer 14 is applied to the photodetectors 12 of the assembly 10.
  • step c the initial substrate 40 is removed and a biosensor of the type shown in FIG. 2 is obtained.
  • the next step d consists in depositing on the Bragg mirror 20 the tracks 16 containing the biological probes.
  • the Bragg mirror 20 (or the interference filter) on an initial substrate 40 and the absorbent layer or layers 14 on another initial substrate, and to deposit them alternately on the whole 10 photodetectors by first placing the layer (s) Absorbents 14 on the photodetectors 12 and removing the initial substrate carrying these absorbent layers, then depositing the Bragg mirror 20 on the absorbent layer (s) 14 and removing the initial substrate 40 carrying the Bragg mirror.
  • the absorbent layer (s) 14 may also be formed or deposited directly on the photodetectors 12 of the assembly 10, and in parallel form a Bragg mirror 20 on an initial substrate 40, then return the assembly obtained to deposit the Bragg mirror. On the absorbent layer or layers 14 carried by the photodetector assembly 10 and remove the initial substrate 40.
  • the polymer layer stack interference filter manufacturing technology described in US 6737154 is well suited to this transfer manufacturing method, the absorbent layer or layers and the interference filter being fixed by bonding.
  • it is the absorbent layers 14 which are formed first on an initial substrate 40 and then an interference filter or a Bragg mirror is formed on the absorbent layers, after which the absorbent layer assembly 14 and Bragg mirror or interference filter is removed from the initial substrate 40 and deposited and glued on the set 10 of photodetectors.
  • This technology makes it possible to produce the absorbent layer (s) 14 and the Bragg mirror 20 or the interference filter in the form of films, which may be flexible films, deposited on an initial substrate 40 which also consists of a flexible film.
  • the whole of the initial substrate 40, the interference filter or the Bragg mirror 20 and the absorbent filter 14 then constitutes a flexible film that can be stored in the form of a roll.
  • particles or nano-fibers such as for example fullerenes, carbon nanotubes, glass fibers ... may be embedded in this film to enhance its mechanical properties.
  • micrometric sized inclusions of polymers having a glass transition temperature above room temperature can be incorporated in this film so that the film can be made flexible by heating at the time of removal of the initial substrate 40 and become rigid once again. it is deposited on all 10 photodetectors.
  • the filter for rejection of the excitation light at the wavelength ⁇ e can be deposited, not on the front face of the set of photodetectors 12 as shown. in Figures 1 to 4, but on its rear face as shown in Figure 5, that is to say on its face opposite to that comprising the photodetectors 12.
  • the silicon substrate is thinned up to ten of ⁇ m to avoid the absorption of photons by silicon. This even thinned substrate forms an extra thickness which distances the light points from the plane of the photodetectors and can increase the parasitic signal of crosstalk.
  • Computer processing of the data based on a deconvolution of the noisy image, makes it possible to suppress the parasitic signal.
  • the or all absorbing layers 14 are covered by a layer 42 of p-doped silicon which is itself covered by a n-doped silicon layer 44 over which The detection pads 16 of the biological probes 16 are formed on the lower face of the Bragg mirror 20 or the interference filter and are illuminated by the excitation light at the wavelength ⁇ e.
  • This notably makes it possible to gain a factor of 2 on the sensitivity, because the sets 10 of CCD photodetectors illuminated on their front face (on the side of the photodetectors 12) have a reduced sensitivity in the visible spectrum because of the absorption of the photons by the grids of polysilicon transfer which are at the level of photodetectors 12.
  • the chromophores may be organic or inorganic nanocrystals incorporated in the surface layer of the biosensor, as described in document WO 2004005590. According to another characteristic of the invention shown in FIG.
  • one or more openings 46 can be formed in the upper layer or layers 14, 20 of the biosensor for the calibration of one or more of the following elements: Bragg mirror (or interference filter), absorbent layer pre-deposited biological material, the surface of the biosensor is illuminated with the excitation light and the signals supplied by the photodetectors 12 located at these openings are compared with the signals supplied by photodetectors located outside the these openings, to calibrate the rejection of the excitation light by the Bragg mirror, the absorbent layer, the Bragg mirror-absorbing layer assembly, etc.
  • Bragg mirror or interference filter
  • absorbent layer pre-deposited biological material the surface of the biosensor is illuminated with the excitation light and the signals supplied by the photodetectors 12 located at these openings are compared with the signals supplied by photodetectors located outside the these openings, to calibrate the rejection of the excitation light by the Bragg mirror, the absorbent layer, the Bragg mirror-absorbing layer assembly, etc.
  • the openings 46 may be formed in the same region or in different regions and occupy only a few percent of the useful area of the biosensor.
  • a matrix 10 of photodetectors 12a, 12b having different sizes. This makes it possible to have duplicate chromophores on top of pixels of different sizes, in order to benefit from a different dynamic at the level of the signals supplied by these pixels, which is advantageous in the case of very weak or very strong signals.
  • a metal film 48 having openings 50 of very small size, of a size less than the length of the wave of light emitted by chromophores.
  • openings delimit very small viewing volumes (for example of a diameter of 150 nm) for the detection and observation of individual chromophores in high concentration solutions. These apertures further amplify the light emitted by the chromophores in their immediate vicinity.
  • the metallic (or opaque) film 48 is deposited on the biosensor of FIG. 6 and the holes formed in this film have larger dimensions and are opposite openings 46 formed in the different layers of the rejection filter.
  • the biosensor according to the invention can be used in the usual way in immobile fluorescent solutions. But it is also usable in fluorescent solutions in motion, in particular in microfluidic circuits.

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Abstract

Procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, ce biocapteur comprenant un ensemble (10) de photodétecteurs (12) du type CCD ou CMOS sur lesquels est déposé ou formé un filtre de réjection d'une lumière d'excitation λe comprenant au moins une couche absorbante (14) et un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, formant un support d'éléments chromophores destinés à être éclairés par la lumière d'excitation λe.

Description

Procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée
L'invention concerne un procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, ainsi que le biocapteur obtenu par exécution de ce procédé.
Un biocapteur à détection intégrée comprend un substrat de support d'éléments chromophores et un ensemble de photodétecteurs destinés à capter la lumière émise par les éléments chromophores en réponse à une excitation lumineuse, l'ensemble de photodétecteurs étant associé au substrat et formant un ensemble unitaire avec celui-ci.
On connaît, par le document WO 02/16912, un biocapteur de ce type dans lequel un miroir interférentiel et une couche absorbante sont agencés dans le substrat pour rejeter la lumière d'excitation des chromophores et l'empêcher de « bruiter » les photodétecteurs appliqués sur la face arrière du substrat. On connaît aussi, par le document WO 2004/042376, un biocapteur à luminescence intégrée et à excitation évanescente, dont le substrat peut être associé à un ensemble de photodétecteurs et comprend en surface un guide d'onde planaire contenant des constituants photoluminescents qui sont éclairés par une lumière d'excitation primaire et qui émettent eux-mêmes une lumière d'excitation des chromophores déposés sur le guide d'onde.
Ces structures ont l'avantage d'améliorer la sensibilité de la détection grâce à une augmentation très significative de l'efficacité de la collecte de la lumière émise par les chromophores et à une réduction de la capture de la lumière d'excitation ainsi qu'à une réduction de la fluorescence parasite provenant du milieu ambiant : on sait qu'environ 80 % de la lumière émise par les chromophores est transmise dans le substrat et qu'un objectif associé à une matrice de photodétecteurs CCD placée au- dessus des chromophores dans l'air ne peut capter qu'une faible fraction des 20 % du flux lumineux émis dans l'air. De ce fait, la sensibilité maximale de la détection est typiquement de l'ordre de 10 chromophores/μm2. La disposition d'un ensemble de photodétecteurs sur la face arrière du substrat ou face opposée à celle portant les chromophores permet une efficacité de collecte du flux lumineux émis par les chromophores qui est plusieurs dizaines de fois supérieure à celle d'un imageur standard placé au-dessus des chromophores.
On connaît par ailleurs, par les documents US 2002/081716 et WO 2004/059006, des biocapteurs à détection intégrée comprenant des filtres optiques arrêtant la longueur d'onde d'excitation lumineuse des chromophores et laissant passer la fluorescence émise par les chromophores, mais ces filtres sont réalisés dans des matériaux autofluorescents et la lumière qu'ils émettent est suffisante pour masquer la fluorescence émise par les chromophores. Cet inconvénient est encore aggravé lorsque la lumière d'excitation a une longueur d'onde dans l'ultraviolet, comme décrit dans ces deux documents antérieurs. La présente invention a pour but d'éviter ces inconvénients et de perfectionner encore le biocapteur à détection intégrée décrit dans le document WO 02/16912.
Elle propose à cet effet un procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, le biocapteur comprenant un substrat destiné à porter des éléments chromophores qui émettent une lumière en réponse à une excitation lumineuse à une longueur d'onde donnée, et un ensemble de photodétecteurs associé au substrat pour capter la lumière émise par les éléments chromophores à l'intérieur du substrat, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il consiste à déposer sur l'ensemble de photodétecteurs des couches minces constituant à la fois le substrat précité et un filtre de rejection omnidirectionnel de la lumière d'excitation des éléments chromophores et de transmission de la lumière émise par ces éléments, ce filtre assurant une transmission de la lumière d'excitation de l'ordre de 10"6 ou moins, de préférence d'environ 10"8, et un niveau d'autofluorescence de 10"6 ou moins. Pour limiter davantage l'autofluorescence du filtre, il est avantageux d'utiliser une excitation lumineuse ayant une longueur d'onde dans le spectre visible ou dans le proche infrarouge.
Le procédé selon l'invention permet de réaliser un biocapteur à détection ultrasensible, qui est intégré et qui ne comprend pas d'objectif ou de composants optiques, et dans lequel des sondes biologiques peuvent être déposées directement sur un filtre de rejection à couches minces qui recouvre un ensemble de photodétecteurs. On peut ainsi réaliser des biocapteurs miniaturisés et à faible coût, en utilisant les techniques connues de fabrication en grande série des composants de la microélectronique, ces biocapteurs ayant de plus une sensibilité de l'ordre d'un chromophore/μm2.
Dans une première forme de réalisation de l'invention, le filtre de rejection comprend au moins une couche mince absorbant la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores.
Cette couche absorbante est prévue pour assurer une absorption omnidirectionnelle de l'excitation lumineuse, indépendante de l'angle d'éclairage du biocapteur ou de l'angle de diffusion de la lumière excitatrice. Cette couche absorbante peut être réalisée par tout moyen connu, par exemple par le procédé sol-gel ou par dépôt et étalement d'une couche de colorant éventuellement dispersé dans une matrice inorganique ou polymérique, par un procédé du type « spin coating » ou par trempage par un procédé du type « dip coating ». Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le filtre de rejection comprend, en combinaison avec le filtre absorbant, un miroir de Bragg formé de couches minces de matériaux transparents à la longueur d'onde de l'émission par les chromophores, ou un filtre interférentiel formé par exemple de couches minces de polymères superposées. Ce miroir de Bragg ou ce filtre interférentiel recouvre au moins une couche absorbante qui est déposée sur l'ensemble de photodétecteurs. C'est la combinaison d'un miroir de Bragg ou d'un filtre interférentiel et d'une couche absorbante qui est susceptible de donner les meilleurs résultats en terme de rejection de la lumière d'excitation des éléments chromophores. Le miroir de Bragg produit un effet d'amplification de l'excitation par interférence constructive et un effet de rejection pure de l'excitation (directionnelle), la rejection étant toutefois principalement assurée par la couche absorbante. La rejection par le miroir de Bragg assure une réduction supplémentaire du niveau de fluorescence de la couche absorbante. Dans une variante, le biocapteur comprend une couche de surface opaque, par exemple métallique, dans laquelle sont formés des trous, cette couche permettant de limiter le flux lumineux global sur le biocapteur.
Pour réduire l'autofluorescence des molécules qui assurent l'absorption de la lumière d'excitation dans la couche absorbante, l'invention prévoit dans un mode de réalisation de former sur l'ensemble de photodétecteurs une pluralité de couches minces absorbantes superposées de natures différentes, dans lesquelles une couche inférieure (plus proche des photodétecteurs) est destinée à absorber l'autofluorescence d'une couche supérieure. Cette disposition en cascade des couches minces absorbantes est d'autant plus avantageuse que la différence spectrale entre la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores et la longueur d'onde centrale de la lumière émise par les éléments chromophores est grande.
Dans tous les cas, le choix du matériaux de la ou des couches absorbantes est fondamental pour le bon fonctionnement du biocapteur.
Dans un exemple de réalisation de l'invention, le filtre de rejection comprend un miroir de Bragg formé d'une série de couches minces superposées ayant une épaisseur optique égale au quart de la longueur d'onde d'excitation, ce miroir de Bragg assurant une rejection de 0,025 de l'excitation (soit 0,1 en rejection pure). Dans cette structure, des effets interférentiels à la surface du substrat permettent d'augmenter d'un facteur de l'ordre de 4 l'énergie du champ électromagnétique d'excitation, ce qui conduit à une amplification du taux de photo-excitation par un facteur 4. Pour ce qui concerne la transmission de l'énergie d'excitation à travers ces couches, cela correspond à une densité optique équivalente de 1 ,6. Ce miroir de Bragg est associé à une couche absorbante ayant une densité optique de 6,4, et un niveau d'autofluorescence inférieur à 10'6'4 fois l'intensité de la lumière excitatrice, le filtre de rejection ayant une densité optique équivalente totale égale à 8, donnant lieu à un taux de rejection de 10"8. La sensibilité de la détection est alors d'un élément chromophore/μm2, pour les chromophores usuels.
Le biocapteur selon l'invention peut être réalisé par dépôt d'une ou de plusieurs couches minces absorbantes sur une matrice de photodétecteurs, puis par dépôt (éventuel) de couches minces destinées à former un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, les différentes couches étant déposées ou formées successivement les unes sur les autres.
Dans une variante de réalisation, le procédé selon l'invention consiste à réaliser le filtre de rejection sur un substrat initial, puis à déposer l'ensemble formé par le filtre et le substrat initial sur un ensemble de photodétecteurs, le filtre se trouvant entre cet ensemble de photodétecteurs et le substrat initial, et enfin à retirer le substrat initial.
Dans ce cas, le filtre de rejection est fixé sur l'ensemble de photodétecteurs par adhérence, soit grâce à son adhérence propre, soit au moyen d'une couche de matière adhésive appropriée.
Le filtre de rejection qui est initialement formé sur le substrat initial comprend un film absorbant, ou un film réfléchissant, ou l'association d'un film absorbant et d'un film réfléchissant. Par rapport à un procédé de fabrication directe des différentes couches sur le capteur, on s'affranchit de contraintes liées à diverses opérations de recuit ou de traitement et on élargit les possibilités de conception et d'intégration. Cela permet notamment de former d'abord, sur le substrat initial, un film réfléchissant tel qu'un miroir de Bragg, qui implique des opérations de recuit qui ne seraient pas bien supportées par les photodétecteurs et par le film absorbant, et de déposer ensuite sur le miroir de Bragg la couche mince ou l'ensemble de couches minces formant le film absorbant.
Avantageusement, le filtre de rejection et le substrat initial peuvent former un film souple, facile à stocker et à utiliser, par exemple sous forme de rouleau.
Dans une variante, le miroir de Bragg ou le filtre interférentiel peut être formé sur un substrat initial et le film absorbant peut être formé sur un autre substrat initial, ce qui permet ensuite de réaliser le biocapteur selon l'invention par report du film absorbant sur un ensemble de photodétecteurs, puis par report du miroir de Bragg ou du filtre interférentiel sur le film absorbant. Lorsque ce biocapteur est réalisé, des sondes comportant éventuellement des marqueurs fluorescents, sont déposées en phase liquide sur des zones déterminées, par exemple en réseau, sur le filtre de rejection du biocapteur (technique connue de « spotting »). Après séchage, le biocapteur est stocké, pour une durée qui peut être longue. Les sondes peuvent comporter des marqueurs fluorescents.
Eventuellement, un liquide tampon aqueux contenant un agent tensioactif est utilisé pour le dépôt des sondes sur le filtre de rejection, dont la surface peut être très hydrophobe.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le biocapteur portant les sondes est finalement encapsulé dans un boîtier utilisable ensuite pour l'hybridation des sondes, ce boîtier comprenant au moins une entrée et une sortie de liquide qui sont reliées dans le boîtier par un canal s'étendant sur la surface du filtre portant les sondes, au moins une fenêtre d'observation et/ou d'éclairage des sondes par la lumière d'excitation étant formée dans la face du boîtier qui recouvre les sondes.
La face opposée du boîtier, qui est située du côté des photodétecteurs, permet l'accès à une interface électronique de liaison des photodétecteurs à des moyens de traitement de l'information. Typiquement, l'ensemble de photodétecteurs utilisé est une matrice de photodétecteurs CCD ou CMOS, dont la face avant est recouverte par le filtre de rejection.
En variante, il peut être avantageux d'utiliser une matrice de photodétecteurs CCD ou CMOS éclairée par la face arrière, pour gagner un facteur 2 sur la sensibilité.
En effet, les matrices de photodétecteurs CCD à éclairage par la face avant (du côté des photodétecteurs) ont une sensibilité réduite de l'ordre de la moitié dans le spectre visible, par rapport à celle des matrices de photodétecteurs éclairées par la face arrière, en raison de l'absorption des photons par des grilles de transfert en polysilicium. A l'inverse, l'utilisation en éclairage par la face arrière nécessite un amincissement délicat du substrat en silicium.
Selon une autre caractéristique de l'invention, on forme des ouvertures dans une ou plusieurs des couches du filtre de rejection en regard de quelques uns des photodétecteurs pour l'étalonnage de la rejection de la lumière d'excitation par ces couches.
L'invention sera mieux comprise et d'autres caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 est une vue schématique partielle en coupe d'un biocapteur selon l'invention ;
- la figure 2 est une vue schématique partielle en coupe d'une variante de réalisation de ce biocapteur ;
- la figure 3 est une vue schématique en coupe représentant un biocapteur selon l'invention monté dans une boîte d'hybridation ;
- la figure 4 illustre schématiquement quatre étapes de la réalisation d'un biocapteur selon l'invention ; - la figure 5 est une vue schématique partielle en coupe d'un biocapteur selon l'invention à matrice de photodétecteurs CCD éclairée par la face arrière ;
- la figure 6 est une vue schématique partielle en coupe d'un biocapteur selon une autre variante de l'invention ; la figure 7 est une vue schématique partielle d'une matrice de photodétecteurs à pixels de tailles différentes ; la figure 8 est une vue schématique en coupe d'une variante de réalisation de l'invention. Le biocapteur de la figure 1 comprend un ensemble matriciel 10 de photodétecteurs 12 du type CCD ou CMOS sur lesquels est déposée une couche 14 d'une matière destinée à absorber une radiation lumineuse d'excitation d'éléments chromophores, localisés dans des plages ou « spots » 16 à la surface du biocapteur, les éléments chromophores émettant une lumière centrée sur une longueur d'onde λf lorsqu'ils sont excités par une radiation lumineuse de longueur d'onde λe (λf étant par exemple égale à 570 nm et λe à 532 nm quand les éléments chromophores sont des marqueurs Cy3), la longueur d'onde d'excitation étant choisie dans le spectre visible (environ 400-750nm) ou dans le proche infrarouge (750-2500nm environ).
Environ 80 % du flux lumineux émis par les éléments chromophores passent dans la couche absorbante 14 et sont captés par les photodétecteurs 12, le flux lumineux d'excitation à la longueur d'onde λe étant absorbé par la couche 14. Celle-ci a de préférence une densité optique au moins égale à 6 à la longueur d'onde considérée, pour assurer une sensibilité de détection de 1 élément chromophore par μm2. La couche absorbante 14 peut être formée d'une seule couche de matière absorbante, ou d'une pluralité de couches absorbantes superposées de natures différentes pour réduire l'autofluorescence de cette couche provoquée par la lumière d'excitation. Dans ce cas, une couche absorbante n située sous une couche absorbante n+1 a une nature déterminée pour absorber l'autofluorescence de la couche absorbante n+1 , tout en laissant passer le flux lumineux à la longueur d'onde λf vers les photodétecteurs 12.
En raison de l'absence d'élément imageur entre les chromophores et les photodétecteurs, un même photodétecteur peut recevoir des signaux lumineux en provenance de points ou zones différentes ce qui génère un signal parasite de diaphonie, d'autant plus grand que l'espacement ou distance verticale entre ces points ou zones et le photodétecteur est grande. Dans une réalisation préférée de l'invention, cet espacement est faible et le signal parasite est réduit à un minimum. Par exemple, le diamètre de ces points ou zones est de 400μm et leur espacement avec les photodétecteurs est de 10μm, de sorte que le signal parasite est minimal. Lorsque leur espacement avec les photodétecteurs est plus important et atteint 100μm, Ie signal de diaphonie peut être important et de nature à réduire la sensibilité de Ia détection. Dans ce cas, un traitement informatique de déconvolution de l'image parasitée, bien connu de l'homme du métier, permet de récupérer le signal utile en supprimant le signal parasite.
La couche absorbante 14 peut être préparée et déposée sur les photodétecteurs 12 de la façon suivante : - on prépare une solution de colorant ayant une rejection compatible avec l'émission lumineuse des marqueurs fluorescents utilisés, c'est-à-dire qui arrête la lumière d'excitation et laisse passer une partie du spectre d'émission des marqueurs. Les colorants répondant à ces critères comprennent les complexes métalliques à base de chrome ou de cobalt et des ligands formés par des molécules organiques à base de dérivés azoïques.
En variante, on peut utiliser un mélange d'un colorant (ayant une fonction d'absorption de l'excitation lumineuse) avec un autre composant qui supprime ou arrête la fluorescence de la molécule absorbante. La solution de colorant est préparée par dissolution d'un gramme du colorant dans un ml de DMF (Diméthyl Formamide). Après agitation, la solution obtenue est filtrée et mélangée avec 1 ,5 ml d'une solution de polyimide (commercialisée par HD Microsystems sous la référence Pl 2555) ou avec du butylcyclobenzène. La solution finale a une concentration massique en colorant d'environ 400mg/ml et a un coefficient d'extinction molaire égal à 9.103 cm"1 environ.
- cette solution de colorant est déposée sur les photodétecteurs d'un capteur matriciel CCD, dont la fenêtre de protection a été retirée et dont les contacts métalliques ont été protégés, par exemple par dépôt localisé d'une résine d'enrobage capable d'assurer une bonne étanchéité et une tenue mécanique et chimique lors des étapes de recuit thermique ou de photopolymérisation nécessaires à l'élaboration du biocapteur. Par exemple, on peut utiliser la résine EPOTEK T7139 de la société POLYTEC Pl SA. La solution de colorant est étalée par « spin coating » avec une vitesse de rotation de 3000 tours par minute, l'étalement étant suivi d'un pré-recuit à 1000C pendant 30 minutes à l'étuve, puis d'un recuit à 2100C à l'étuve pendant 1 h30, ces températures étant supportées par la matrice de photodétecteurs.
Le film de colorant obtenu a une épaisseur de l'ordre de 10 μm et une densité optique égale à 9 à la longueur d'onde de 532 nm, ce qui correspond à une transmission de 10"9.
Des sondes biologiques sont ensuite déposées sur la surface de la couche absorbante 14 par une technique connue de « spotting » pour former les plages 16 précitées. Comme la couche absorbante 14 est de nature très hydrophobe, il est nécessaire d'utiliser pour le dépôt des sondes biologiques un liquide tampon contenant une quantité relativement élevée d'un agent tensio-actif du type SDS (Sodium Dodécyl Sulfate) pour former des plages 16 d'une dimension d'environ 400 μm (ou moins en fonction de l'application). On remarquera à ce propos que les dimensions relatives des différents éléments représentés en figure 1 n'ont pas été respectées dans le dessin, pour plus de clarté. En réalité, les plages 16 ont des dimensions de 100 à 400 μm par exemple, la couche absorbante 14 a une épaisseur de l'ordre de la dizaine de μm, les photodétecteurs 12 ont des dimensions unitaires de l'ordre de la dizaine de μm, les plages 16 couvrant donc une ou plusieurs dizaines de photodétecteurs.
Dans le cas général, une couche de fonctionnalisation 18 est formée sur la surface supérieure de la couche 14 sur laquelle on dépose les sondes biologiques, cette couche de fonctionnalisation permettant la fixation des sondes.
Dans la variante de réalisation de la figure 2, les photodétecteurs 12 du capteur 10 sont recouverts par une pluralité de couches minces absorbantes 14 de nature différente, permettant de réduire l'influence de l'autofluorescence des colorants utilisés dans ces couches absorbantes, et par un miroir de Bragg 20 formé d'une pluralité de couches minces superposées 22 de matériau diélectrique, ayant des indices de réfraction qui sont respectivement haut et bas et qui sont disposées en alternance, d'une façon bien connue de l'homme du métier.
On peut par exemple utiliser des couches alternées 22 de matériau ayant des indices de réfraction égaux à 1 ,45 (bas indice) et 1 ,95 (haut indice), le nombre de couches dépendant du rapport de ces deux indices et étant par exemple égal à 20 lorsque la densité optique recherchée du miroir de Bragg est égale à 1.
Ces couches minces alternées 22 ont une épaisseur optique égale au quart de la longueur d'onde d'excitation λe, pour augmenter d'un facteur
4, par interférences constructives, l'intensité du flux lumineux d'excitation au niveau des éléments chromophores et donc l'intensité de la lumière émise par les éléments chromophores en réponse à cette excitation.
De plus, ces couches réduisent l'intensité de l'excitation lumineuse sur le filtre absorbant, en réduisant ainsi l'autofluorescence du filtre.
Le miroir de Bragg 20 peut ne pas être exactement centré sur la longueur d'onde d'excitation λe, afin d'augmenter la pente de rejection totale du filtre constitué par Ie miroir de Bragg 20 et par l'absorbant multicouche 14. Il faut cependant que le centrage du filtre de Bragg soit réalisé de manière relativement précise sur la longueur d'onde d'excitation λe pour assurer une amplification significative (supérieure à 3) de l'excitation lumineuse.
Les couches minces alternées 22 du miroir de Bragg 20 peuvent être déposées par tout procédé connu, par exemple par des techniques de dépôt physique, par un procédé sol-gel, ou encore par extrusion. Ensuite, une couche de fonctionnalisation 18 est formée sur la surface supérieure du miroir de Bragg 20, puis des plages 16 contenant des sondes biologiques peuvent être déposées et fixées sur cette couche 18 comme précédemment décrit pour le biocapteur de la figure 1. Dans une variante de réalisation, un miroir métallique semi-transparent peut jouer le rôle d'un premier filtre.
Dans une variante de réalisation, le miroir de Bragg 20 déposé sur les couches absorbantes 14 peut être remplacé par un filtre interférentiel formé de couches minces superposées de polymères ayant alternativement des indices de réfraction haut et bas, la technique de fabrication de ces filtres interférentiels étant connue de l'homme du métier et décrite notamment dans le document US 6737154.
Le biocapteur selon l'invention, sur lequel ont été formées les plages 16 contenant les sondes biologiques, peut être finalement encapsulé dans un boîtier ou une cartouche d'hybridation 24 (figure 3) dont une face avant 26 comporte au moins une ouverture 28 d'entrée de liquide et une ouverture 30 de sortie de liquide, reliées entre elles par un canal 32 permettant au liquide entrant par l'ouverture 28 de circuler sur la face du biocapteur portant les plages 16 de dépôt des sondes biologiques.
La face avant 26 de la cartouche 24 comporte au moins une autre ouverture 34, formée en regard des plages 16 de dépôt des sondes biologiques et permettant l'éclairage de ces plages par la lumière d'excitation des éléments chromophores. Une interface électronique 36 associée à la face arrière de l'ensemble 10 de photodétecteurs est accessible par la face arrière de la cartouche d'hybridation 24 et permet de transférer les données captées par les photodétecteurs à des moyens 38 de traitement de l'information.
Lorsque le filtre de réjection qui recouvre l'ensemble 10 de photodétecteurs comprend un miroir de Bragg 20 et des couches absorbantes 14, des difficultés peuvent être rencontrées pendant la fabrication du miroir de Bragg dans la mesure où celle-ci nécessite un recuit à température relativement élevée afin de densifier les couches 22 et d'éviter leurs déformations ultérieures alors que l'ensemble 10 de photodétecteurs et les colorants utilisés dans les couches absorbantes 14 doivent en général être protégées des températures élevées.
Pour éviter ces inconvénients, l'invention propose un procédé de fabrication du biocapteur comportant les étapes essentielles a, b, c et d représentées en figure 4, ce procédé consistant, à l'étape a, à former d'abord le miroir de Bragg 20 (ou un filtre interférentiel) sur un substrat initial 40 d'un type classique, puis à déposer ou former la ou les couches absorbantes 14 sur le miroir de Bragg. Cela permet de soumettre les couches 22 du miroir de Bragg (ou du filtre interférentiel) au recuit nécessaire sans se soucier de l'influence de ce recuit sur les autres composants du biocapteur. Ensuite, à l'étape b, l'ensemble formé par le substrat 40, le miroir de
Bragg 20 et la couche absorbante 14 est reporté sur l'ensemble 10 de photodétecteurs en étant retourné de sorte que la couche absorbante 14 soit appliquée sur les photodétecteurs 12 de l'ensemble 10.
A l'étape suivante c, on retire le substrat initial 40 et on obtient un biocapteur du type de celui représenté en figure 2.
L'étape suivante d consiste à déposer sur le miroir de Bragg 20 les plages 16 contenant les sondes biologiques.
En variante, il est bien entendu possible de former le miroir de Bragg 20 (ou le filtre interférentiel) sur un substrat initial 40 et la ou les couches absorbantes 14 sur un autre substrat initial, et de les déposer tour à tour sur l'ensemble 10 de photodétecteurs en plaçant d'abord la ou les couches absorbantes 14 sur les photodétecteurs 12 et en retirant le substrat initial portant ces couches absorbantes, puis en déposant le miroir de Bragg 20 sur la ou les couches absorbantes 14 et en retirant Ie substrat initial 40 portant le miroir de Bragg. On peut aussi former ou déposer directement la ou les couches absorbantes 14 sur les photodétecteurs 12 de l'ensemble 10, et en parallèle former un miroir de Bragg 20 sur un substrat initial 40, puis retourner l'ensemble obtenu pour déposer le miroir de Bragg 20 sur la ou les couches absorbantes 14 portées par l'ensemble 10 de photodétecteurs et retirer le substrat initial 40.
La technologie de fabrication de filtres interférentiels par empilement de couches de polymères, décrite dans le document US 6737154 est bien adaptée à ce procédé de fabrication par report, la ou les couches absorbantes et le filtre interférentiel étant fixés par collage. Dans encore une autre variante de ce procédé, ce sont les couches absorbantes 14 qui sont formées d'abord sur un substrat initial 40 puis un filtre interférentiel ou un miroir de Bragg est formé sur les couches absorbantes, après quoi l'ensemble couches absorbantes 14 et miroir de Bragg ou filtre interférentiel est retiré du substrat initial 40 et déposé et collé sur l'ensemble 10 de photodétecteurs. Dans ce cas, il est possible, après fonctionnalisation de la surface, de former les plages 16 contenant les sondes biologiques sur le miroir de Bragg 20 ou sur le filtre interférentiel avant de reporter cet ensemble sur l'ensemble 10 de photodétecteurs.
Cette technologie permet de réaliser la ou les couches absorbantes 14 et le miroir de Bragg 20 ou le filtre interférentiel sous forme de films qui peuvent être des films souples, déposés sur un substrat initial 40 lui aussi constitué d'un film souple. L'ensemble du substrat initial 40, du filtre interférentiel ou du miroir de Bragg 20 et du filtre absorbant 14 constitue alors un film souple qui peut être stocké sous forme de rouleau. Si nécessaire, des particules ou des nano-fibres telles par exemple que des fullerènes, des nano-tubes de carbone, des fibres de verre... peuvent être incorporées dans ce film pour renforcer ses propriétés mécaniques.
Inversement, on peut incorporer dans ce film des inclusions de taille micrométrique de polymères ayant une température de transition vitreuse supérieure à la température ambiante de telle sorte que le film puisse être rendu flexible par chauffage au moment du retrait du substrat initial 40 et redevenir rigide quand il est déposé sur l'ensemble 10 de photodétecteurs.
Dans tous les modes de réalisation du biocapteur selon l'invention, le filtre de rejection de la lumière d'excitation à la longueur d'onde λe peut être déposé, non pas sur la face avant de l'ensemble 10 de photodétecteurs 12 comme représenté au figures 1 à 4, mais sur sa face arrière comme représenté en figure 5, c'est-à-dire sur sa face opposée à celle comportant les photodétecteurs 12. Dans ce cas, le substrat de silicium est aminci jusqu'à une dizaine de μm pour éviter l'absorption des photons par le silicium. Ce substrat même aminci forme une surépaisseur qui éloigne les points lumineux du plan des photodétecteurs et peut augmenter le signal parasite de diaphonie. Un traitement informatique des données, basé sur une déconvolution de l'image parasitée, permet de supprimer le signal parasite.
Dans l'exemple de réalisation de la figure 5, la ou l'ensemble de couches absorbantes 14 est recouverte par une couche 42 de silicium dopé p qui est recouverte elle-même par une couche 44 de silicium dopé n au- dessus de laquelle se trouvent les photodétecteurs 12. Les plages 16 de dépôt des sondes biologiques sont formées sur la face inférieure du miroir de Bragg 20 ou du filtre interférentiel et sont éclairées par la lumière d'excitation à la longueur d'onde λe. Cela permet notamment de gagner un facteur 2 sur la sensibilité, car les ensembles 10 de photodétecteurs CCD éclairés sur leur face avant (du côté des photodétecteurs 12) ont une sensibilité réduite dans le spectre visible en raison de l'absorption des photons par les grilles de transfert en polysilicium qui se trouvent au niveau des photodétecteurs 12. Dans tous les modes de réalisation de l'invention, les chromophores peuvent être des nanocristaux organiques ou inorganiques incorporés dans la couche superficielle du biocapteur, comme décrit dans le document WO 2004005590. Selon une autre caractéristique de l'invention représentée en figure
6, on peut former une ou plusieurs ouvertures 46, par exemple rectangulaires, dans la ou les couches supérieures 14, 20 du biocapteur pour la calibration d'un ou de plusieurs des éléments suivants : miroir de Bragg (ou filtre interférentiel), couche absorbante,, matériel biologique pré- déposé, ... On éclaire la surface du biocapteur avec la lumière d'excitation et on compare les signaux fournis par les photodétecteurs 12 situés au niveau de ces ouvertures avec les signaux fournis par des photodétecteurs situés en dehors de ces ouvertures, pour étalonner la réjection de la lumière d'excitation par le miroir de Bragg, par la couche absorbante, par l'ensemble miroir de Bragg-couche absorbante, etc....
Les ouvertures 46 peuvent être formées soit dans une même région, soit dans de régions différentes et n'occupent que quelques pourcents de la surface utile du biocapteur.
Comme représenté en figure 7, on peut utiliser dans le biocapteur selon l'invention une matrice 10 de photodétecteurs 12a, 12b ayant des tailles différentes. Cela permet de disposer des chromophores dupliqués au-dessus de pixels de tailles différentes, pour bénéficier d'une dynamique différente au niveau des signaux fournis par ces pixels, ce qui est avantageux dans le cas de signaux très faibles ou très forts. Dans la variante de réalisation de la figure 8, on a disposé, à la surface du biocapteur, sur le filtre de réjection précité, un film métallique 48 comportant des ouvertures 50 de très petite taille, d'une dimension inférieure à la longueur d'onde de la lumière émise par les chromophores. Ces ouvertures délimitent des volumes d'observation très petits (par exemple d'un diamètre de 150 nm) pour la détection et l'observation de chromophores individuels dans des solutions à concentration élevée. Ces ouvertures amplifient de plus la lumière émise par les chromophores se trouvant dans leur voisinage immédiat.
En variante, le film métallique (ou opaque) 48 est déposé sur le biocapteur de la figure 6 et les trous formés dans ce film ont des dimensions plus importantes et sont en regard des ouvertures 46 formées dans les différentes couches du filtre de réjection.
Le biocapteur selon l'invention est utilisable de la façon habituelle dans des solutions fluorescentes immobiles. Mais il est aussi utilisable dans des solutions fluorescentes en mouvement, en particulier dans des circuits microfluidiques.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fabrication d'un biocapteur à détection intégrée, ce biocapteur comprenant un substrat destiné à porter des éléments chromophores qui émettent une lumière en réponse à une excitation lumineuse à une longueur d'onde donnée, et un ensemble (10) de photodétecteurs (12) associé au substrat pour capter la lumière émise par les éléments chromophores vers l'intérieur du substrat, caractérisé en ce qu'il consiste à déposer sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) des couches minces (14, 22) constituant à la fois le substrat précité et un filtre de réjection omnidirectionnel de la lumière d'excitation des éléments chromophores et de transmission de la lumière émise par ces éléments, ce filtre ayant une réjection de la lumière d'excitation d'au moins 10"6 et de préférence d'environ 10"8, et un niveau d'autofluorescence de 10'6 ou moins, la longueur d'onde de l'excitation lumineuse étant comprise dans le spectre visible ou dans le proche infrarouge.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend au moins une couche mince (14) absorbant la longueur d'onde d'excitation.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend également un miroir de Bragg (20) formé de couches minces (22) transparentes à la longueur d'onde émise par les éléments chromophores , ayant respectivement des indices de réfraction haut et bas et disposées en alternance.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les couches minces (22) du miroir de Bragg (20) ont une épaisseur optique sensiblement égale au quart de la longueur d'onde d'excitation.
5. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un filtre interférentiel formé d'une série de couches minces de polymère superposées ayant des indices de réfraction haut et bas respectivement et disposées en alternance.
6. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend une série de couches minces (22) formant un miroir de Bragg (20) ou un filtre interférentiel et recouvrant au moins une couche absorbante (14) déposée sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12).
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend une pluralité de couches minces absorbantes (14) superposées de natures différentes, dans lesquelles une couche inférieure (plus proche des photodétecteurs) est destinée à absorber l'autofluorescence d'une couche supérieure.
8. Procédé selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que la ou les couches minces absorbantes du filtre de réjection ont une densité optique au moins égale à 6,4 environ à la longueur d'onde d'excitation.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4 et 6 à 8, caractérisé en ce que les couches minces du filtre de réjection sont réalisées par procédé sol-gel.
10. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins une couche mince (14) absorbant la longueur d'onde d'excitation est déposée ou formée sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12), puis des couches minces formant un miroir de Bragg (20) ou un filtre interférentiel sont déposées ou formées successivement sur la couche mince absorbante (14).
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le filtre de réjection est formé sur un substrat initial (40), puis est reporté sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12), le filtre se trouvant entre l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) et le substrat initial (40), ce substrat initial (40) étant ensuite retiré.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que le filtre de réjection est fixé sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) par adhérence.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que le filtre de réjection et le substrat initial (40) forment un film souple.
14. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un film absorbant (14) et un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, qui sont posés ensemble sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12).
15. Procédé selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisé en ce que le filtre de réjection comprend un film absorbant (14) et un miroir de Bragg ou un filtre interférentiel, qui sont posés séparément sur l'ensemble (10) de photodétecteurs (12).
16. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche absorbante (14) est réalisée par dissolution d'un colorant dans un solvant, mélange de la solution de colorant avec une solution de polyimide ou de butylcyclobenzène, dépôt de ce mélange sur un substrat ou sur l'ensemble de photodétecteurs (12), et recuit par passage dans une étuve du substrat ou de l'ensemble de photodétecteurs portant la couche absorbante, cette couche absorbante ayant une épaisseur de l'ordre de 10μm ou supérieure et une densité optique au moins égale à 6 environ à la longueur d'onde d'excitation.
17. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que des sondes comportant éventuellement des marqueurs fluorescents sont ensuite déposées en plages (16) sur le filtre de réjection.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'un liquide tampon contenant un agent tensio-actif est utilisé pour le dépôt des sondes sur le filtre de réjection.
19. Procédé selon la revendication 17 ou 18, caractérisé en ce que le biocapteur portant les sondes est encapsulé dans une cartouche ou un boîtier (24) utilisable pour l'hybridation des sondes et comprenant au moins une entrée (28) et une sortie (30) de liquide reliées par un canal (32) s'étendant sur la surface du filtre portant les sondes, et au moins une fenêtre (34) d'observation et/ou d'éclairage des sondes par la lumière d'excitation, l'ensemble (10) de photodétecteurs comportant une interface électronique (36) de liaison à des moyens (38) de traitement de l'information, qui est accessible par la face arrière du boîtier ou de la cartouche.
20. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) est une matrice de photodétecteurs (12) du type CCD ou CMOS, dont la face avant porte le filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation.
21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce que l'ensemble (10) de photodétecteurs (12) est une matrice de photodétecteurs du type CCD ou CMOS, dont la face arrière porte le filtre de réjection de la longueur d'onde d'excitation.
22. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'on forme des ouvertures (46) dans des couches (14, 22) du filtre de réjection en regard de photodétecteurs (12) pour l'étalonnage de la réjection de la lumière d'excitation par ces couches.
23. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que la matrice (10) de photodétecteurs comprend des photodétecteurs (12a, 12b) de taille différente.
24. Procédé selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il consiste à disposer à la surface du biocapteur un film métallique (48) comportant des ouvertures (50) d'une dimension inférieure à la longueur d'onde émise par les chromophores.
25. Utilisation d'un biocapteur fabriqué selon le procédé décrit dans l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le biocapteur est dans une solution fluorescente immobile ou en mouvement, comme par exemple dans un circuit microfluidique, et en ce que la longueur d'onde d'excitation des éléments chromophores est comprise dans le spectre visible ou dans le proche infrarouge.
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