WO2007042319A1 - Image processing device for recording the intensity and time behaviour of fluorescent dyes - Google Patents

Image processing device for recording the intensity and time behaviour of fluorescent dyes Download PDF

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WO2007042319A1
WO2007042319A1 PCT/EP2006/009918 EP2006009918W WO2007042319A1 WO 2007042319 A1 WO2007042319 A1 WO 2007042319A1 EP 2006009918 W EP2006009918 W EP 2006009918W WO 2007042319 A1 WO2007042319 A1 WO 2007042319A1
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WO
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image
image processing
charge
time
intensity
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PCT/EP2006/009918
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French (fr)
Inventor
Joachim Ihlefeld
Oliver Vietze
Original Assignee
Baumer Optronic Gmbh
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Definitions

  • Image processing device for detecting the intensity / time course of fluorescent dyes
  • Fluorescence analysis and, in particular, fluorescence spectroscopy have made significant progress in image analysis in the field of medicine and biology, but also in technical problems.
  • the analysis of the intensity distributions of the phosphorescence in the time and spectral range allows a pictorial representation of the spatial distribution of certain chemical compounds by the direct relationship between the immediate environment of Fluophors and the nature of Phosphoreszenzabfalls.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a stroboscopic method is used.
  • the sensor integrates repetitive with a very low exposure time, it is used only a small part of the exposure. Therefore, image intensifiers and cooled CCD cameras are used. The recording process is tedious.
  • the method requires very precisely controlled and expensive lasers, so that the time range used for the integration on the sensor with respect to the excitation pulse can be precisely defined.
  • Another disadvantage is that the method described requires a mono-exponential decay function of the phosphorescence. However, this condition is not given in particular in technical applications of the process by simultaneously existing bonds with different energy levels. In this case, superpositions of phosphorescence decay functions with different time constants result. Furthermore, there is the disadvantage, in particular for technical applications, that the object must be at rest.
  • the object of the invention is therefore to provide a simple and robust imaging arrangement and a classifier for phosphorescence with multi-exponential decay functions and at the same time a
  • the invention provides an image processing apparatus, in particular for detecting the intensity / time course of fluorescent dyes, which a
  • Pulse light source and an imaging sensor is adapted to store in a defined time sequence based on the light pulse three or more images of the imaging sensor in an image memory of the device and for associated pixels, the temporal sequence of samples with at least one predetermined intensity / time course to correlate a dye to be detected and store the correlation values thus determined for each intensity / time course as a picture matrix in a memory.
  • the measured values of the phosphorescence decay are now completely determined after each light pulse and in a short measuring phase after the light pulse
  • Light pulse stored as a sequence of images in a memory This memory may also be the imaging sensor itself.
  • the temporal correlation of all measurements reduces the measurement error and reduces to the same time offset for all measured values.
  • the measured values belonging to a pixel are subsequently read out in an ordered chronological order and statistical moments ⁇ nm are calculated. Thereafter, the probability of membership of the considered pixel is calculated to each of the models to be compared and mapped in a color vector. In the event that an automatic segmentation is to be performed, the probability of belonging to a target class can be mapped and subsequently evaluated.
  • the integration and transport mechanism can be coupled in a particularly advantageous manner so that the complete information about the temporal course of the phosphorescence can be displayed in a single charge image.
  • the local resolution is partly transposed into temporal resolution.
  • the field of view of the camera can first be limited by a field diaphragm so that only a strip of the photosensitive surface of the sensor is exposed.
  • the field stop can also be omitted.
  • the charge on the photodiodes can be deleted after the end of the light pulse and after a first time interval after deletion of the charges in the photodiodes accumulated charge transferred to the transport registers and then pushed in rapid succession over a plurality of n lines. After expiration of a second or further time intervals, the charge accumulated in the photodiodes can be transferred again into the transport registers and subsequently pushed over n lines in rapid succession. Thus, several laterally shifted frames are stored on the CCD chip after the end of this sequence.
  • the fluorescence signals of a plurality of light pulses of a light source can also be stored in a single charge image on a CCD sensor for further processing.
  • One possibility for implementing this embodiment of the invention is based on the fact that a repetitively driven pulse source is used, with each integration pulse after a light pulse, the charge image is pushed on a CCD sensor by one line and after a specified Number Nz pushed by exactly this number of lines in the opposite direction, with the next light pulse, this process described re-executed, and after a number of light pulses, the entire charge image is read in a frame memory.
  • Another particularly advantageous embodiment of the imaging sensor can be achieved by a preferably cellular mask, or a corresponding line-shaped grid in the beam path.
  • a preferably cellular mask or a corresponding line-shaped grid in the beam path.
  • N-I lines are covered by a mask and 1 line is opened.
  • the mask can be coupled in an advantageous embodiment of the invention with a cylindrical lens array.
  • the charge image After exposure of the object by a light pulse, the charge image is first deleted. Subsequently, after a first integration interval, the charge image is transported into the shift registers, after which n clocks are pushed and the second charge image is generated, after which this image is also transmitted.
  • CMOS sensors which can be coupled with image intensifiers if required, is also particularly advantageous.
  • CMOS sensors which can be coupled with image intensifiers if required, is also particularly advantageous.
  • an imaging sensor in particular a CMOS sensor with more than one charge storage per photodiode can be used. In this case, those within the
  • Fig. 1 shows a typical decay curve of mono- and multi-exponential fluors
  • Fig. 3 shows a typical signal / time function with optimal
  • 4 shows a CCD sensor with mask
  • 5A shows a CCD sensor with a line-shaped grating mask
  • FIG. 5B is a schematic view of a development of the embodiment shown in Fig. 5A with a cylindrical lens array
  • FIG. 7 shows an embodiment of the real-time capable control and computing unit with imaging sensor and image memory
  • Fig. 8 is a circuit diagram of a possible realization of a
  • Fig. 1 shows typical decay curves of a mono-exponential (bottom) and a multi-exponential (top) fluorophore.
  • the time constants of the decay curves can vary over a wide time range from a few nanoseconds to milliseconds. It is known that there is a close relationship between the chemical bonds present in the vicinity of the fluorophore and the signal curve, so that the presence of certain phosphorescence / time courses and specific wavelength intervals on the
  • FIG. 2 shows the optimum integration time for a typical decay function as a function of the image index.
  • the integration time increases with increasing number of shots.
  • a control of the integration time adapted to the typical decay function perform so that the image signal for the typical decay function in the sub-images or frames is approximately constant.
  • a device having a pulsed light source radiating in the required spectral range for exciting the fluorophores, an imaging sensor and a control and computing unit is used.
  • the control and processing unit synchronizes the components so that immediately at the beginning of a light pulse, the photodiodes of the image sensor are deleted, immediately after the end of the light pulse, the integration is released.
  • pulse light source gas discharge lamps, LEDs or lasers can be used.
  • FIGS. 1 and 3 show that the very similar curves in FIG. 1 can lead, despite their similarity in the linear time domain, to measurement vectors which can be distinguished well from their shapes by an optimal time sampling.
  • Each of these line-shaped areas covers NI lines of the imaging sensor, in the areas 25 one line is left free.
  • N sample points of the fluorescence decay are then obtained by sequentially exposing and sliding the accumulated image, and after each transfer of a charge image, the accumulated image in the shift registers is shifted one pixel at a time in the vertical direction.
  • the timing diagram can also be used in the same way for a recording with an imaging sensor 1 according to FIG. 4.
  • the recording of the individual images with the image index i takes place in each case according to the rectangular pulse shown on the time axes.
  • Fig. 5B is a schematic view of a development of the arrangement shown in Fig. 5A is shown.
  • a microlens array with cylindrical lenses 27 which focus the incident fluorescent light onto the uncovered lines 25 of the sensor 1 to improve the photosensitivity of the device.
  • FIG. 7 shows a block diagram of an embodiment of a real-time capable controller 3 of a device according to the invention, which processes the charge image of the imaging sensor 1.
  • the sensor interface 4 of the measurement engine 5 provides the measured values of the phosphorescence distribution in digitized form.
  • the registers 12, 13, 14 and 15 required takeover signals ready and is synchronized from the control unit 8.
  • Embodiments is limited, but rather can be varied in many ways.
  • the features of the individual embodiments can also be combined with each other.

Abstract

The invention relates to an image processing device, in particular for recording the intensity and time behaviour of fluorescent dyes. The device comprises a pulse light source and an imaging sensor and is configured to store three or more images of the imaging sensor in an image memory in a defined temporal sequence in relation to the light pulse and to correlate the temporal sequence of scanned values with one or several predetermined intensity or time behaviour patterns of a dye to be detected. The correlation values that have been determined in this manner are stored, preferably for each intensity and time behaviour pattern, as an image matrix in a memory.

Description

Bildverarbeitungsvorrichtung zur Erfassung des Intensitäts- / Zeitverlaufs fluoreszierender FarbstoffeImage processing device for detecting the intensity / time course of fluorescent dyes
Beschreibungdescription
Durch die Fluoreszenzanalyse und insbesondere die Fluoreszenzspektroskopie wurden wesentliche Fortschritte bei der Bildauswertung im Bereich der Medizin und Biologie, aber auch bei technischen Aufgabenstellungen erreicht. Insbesondere die Analyse der Intensitätsverteilungen der Phosphoreszenz im Zeit- und Spektralbereich gestattet durch den direkten Zusammenhang zwischen der unmittelbaren Umgebung des Fluophors und der Natur des Phosphoreszenzabfalls eine bildhafte Darstellung der Ortsverteilung bestimmter chemischer Verbindungen.Fluorescence analysis and, in particular, fluorescence spectroscopy have made significant progress in image analysis in the field of medicine and biology, but also in technical problems. In particular, the analysis of the intensity distributions of the phosphorescence in the time and spectral range allows a pictorial representation of the spatial distribution of certain chemical compounds by the direct relationship between the immediate environment of Fluophors and the nature of Phosphoreszenzabfalls.
Das technische Verfahren wird anschaulich in dem Artikel "Development of a Time-Resolved Fluorometric Method for Observing Hybridization in Living Cells Using Fluorescence Resonance Energy Transfer, Akihiko Tsuji, Yoshihiro Sato,The technical process is clearly illustrated in the article "Development of a Time-Resolved Fluorometric Method for Observing Hybridization in Living Cells Using Fluorescence Resonance Energy Transfer", Akihiko Tsuji, Yoshihiro Sato.
Masahiko Hirano, Takayuki Suga, Hiroyuki Koshimoto, Takeshi Taguchi, and Shinji Ohsuka", Biophys J, JuIy 2001, p. 501- 515, Vol. 81, No. 1 beschrieben.Masahiko Hirano, Takayuki Suga, Hiroyuki Koshimoto, Takeshi Taguchi, and Shinji Ohsuka ", Biophys J, Juicy 2001, pp. 501-515, Vol. 81, No. 1.
Durch präzise, schnelle Laserimpulse werden Moleküle in lebenden Zellen zur Autofluoreszenz nach dem FRET - Verfahren (fluorescence resonance energy transfer ) angeregt. Wenige Nanosekunden nach Ende der mit hoher Frequenz anliegenden Laserimpulse wird durch einen schnellen elektronischen Shutter mit einer programmierbaren Integrationszeit eine CCD- Kamera belichtet. Dieser Vorgang wird mit zwei unterschiedlichen Verzögerungen zu den Laserimpulsen wiederholt, so dass zwei Bilder entstehen, das Ergebnisbild wird aus dem Quotienten beider Bilder gewonnen. Mit der beschriebenen Anordnung ist es möglich, DNA- Abschnitte lebender Zellen zu visualisieren .Precise, fast laser pulses stimulate molecules in living cells to autofluorescence according to the fluorescence resonance energy transfer (FRET) method. A few nanoseconds after the end of the high-frequency laser pulses, a CCD camera is exposed by a fast electronic shutter with a programmable integration time. This process is associated with two different delays the laser pulses repeated, so that two images are formed, the result image is obtained from the quotient of both images. With the described arrangement it is possible to visualize DNA sections of living cells.
Im beschriebenen Stand der Technik wird ein stroboskopisches Verfahren eingesetzt. Der Sensor integriert repetierend mit einer sehr geringen Belichtungszeit, es wird nur ein geringer Teil der Belichtung verwendet. Deshalb werden Bildverstärker und gekühlte CCD- Kameras eingesetzt. Der Aufnahmevorgang ist langwierig. Ferner setzt das Verfahren sehr präzise gesteuerte und teure Laser voraus, damit der für die Integration auf dem Sensor verwendete Zeitbereich bezüglich des Anregungspulses exakt definiert werden kann. Ein weitere Nachteil besteht darin, dass das beschriebene Verfahren eine monoexponentielle Abklingfunktion der Phosphoreszenz voraussetzt. Diese Bedingung ist jedoch insbesondere bei technischen Anwendungen des Verfahrens durch gleichzeitig vorhandene Bindungen mit unterschiedlichen Energieniveaus nicht gegeben. In diesem Fall ergeben sich Überlagerungen von Abklingfunktionen der Phosphoreszenz mit unterschiedlichen Zeitkonstanten. Ferner besteht insbesondere für technische Anwendungen der Nachteil, dass das Objekt sich im Ruhezustand befinden muß.In the described prior art, a stroboscopic method is used. The sensor integrates repetitive with a very low exposure time, it is used only a small part of the exposure. Therefore, image intensifiers and cooled CCD cameras are used. The recording process is tedious. Furthermore, the method requires very precisely controlled and expensive lasers, so that the time range used for the integration on the sensor with respect to the excitation pulse can be precisely defined. Another disadvantage is that the method described requires a mono-exponential decay function of the phosphorescence. However, this condition is not given in particular in technical applications of the process by simultaneously existing bonds with different energy levels. In this case, superpositions of phosphorescence decay functions with different time constants result. Furthermore, there is the disadvantage, in particular for technical applications, that the object must be at rest.
Die Aufgabe der Erfindung besteht deshalb darin, eine einfache und robuste bildgebende Anordnung und einen Klassifikator für Phosphoreszenz mit multiexponentiellen Abklingfunktionen zu schaffen und gleichzeitig eineThe object of the invention is therefore to provide a simple and robust imaging arrangement and a classifier for phosphorescence with multi-exponential decay functions and at the same time a
Erweiterung für toleranzbehaftete Impulslichtquellen und bewegte Objekte vorzunehmen.Extension for toleranced impulse light sources and moving objects.
Diese Aufgabe wird bereits in höchst überraschend einfacher Weise durch den Gegenstand der unabhängigen Ansprüche angegeben. Vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Demgemäß sieht die Erfindung eine Bildverarbeitungsvorrichtung, insbesondere zur Erfassung des Intensitäts/-Zeitverlaufs fluoreszierender Farbstoffe vor, welche eineThis object is already achieved in a surprisingly simple manner by the subject matter of the independent claims specified. Advantageous embodiments and further developments are specified in the dependent claims. Accordingly, the invention provides an image processing apparatus, in particular for detecting the intensity / time course of fluorescent dyes, which a
Impulslichtquelle und einen bildgebenden Sensor umfaßt und dazu eingerichtet ist, in einer definierten zeitlichen Folge bezogen auf den Lichtimpuls drei oder mehr Bilder des bildgebenden Sensors in einem Bildspeicher der Vorrichtung abzulegen und für zugeordnete Bildpunkte die zeitliche Folge der Abtastwerte mit zumindest einem vorgegebenen Intensitäts/-Zeitverlauf eines zu detektierenden Farbstoffes zu korrelieren und die so ermittelten Korrelationswerte für jeden Intensitäts/-Zeitverlauf als Bildmatrix in einem Speicher abzulegen.Pulse light source and an imaging sensor and is adapted to store in a defined time sequence based on the light pulse three or more images of the imaging sensor in an image memory of the device and for associated pixels, the temporal sequence of samples with at least one predetermined intensity / time course to correlate a dye to be detected and store the correlation values thus determined for each intensity / time course as a picture matrix in a memory.
Im Unterschied zu den bekannten Verfahren wird also keine stroboskopische Messung vorgenommen, sondern es werden zu dem Signal eines einzelnen Lichtimpulses bereits mehrere Aufnahmen in schneller Folge innerhalb des Zeitraums, in dem das Fluoreszenzsignal vollständig abklingt, abgespeichert. Überdies werden die Abtastwerte mit einem oder mehreren Modellen für das Abklingverhalten zu detektierender Farbstoffe verglichen, so daß auch unterschiedliche Abklingverhalten bedingt durch eineIn contrast to the known methods, therefore, no stroboscopic measurement is made, but several images are already stored for the signal of a single light pulse in rapid succession within the period in which the fluorescence signal completely decays. Moreover, the samples are compared with one or more models for the decay behavior of dyes to be detected, so that also different decay behavior caused by a
Überlagerung mehrerer Zeitkonstanten analysiert werden können. Auf diese Weise kann insbesondere auch die räumliche Verteilung mehrerer verschiedener Fluorophore ermittelt werden.Overlay several time constants can be analyzed. In this way, in particular, the spatial distribution of several different fluorophores can be determined.
Der Nachteil der bisher eingesetzten, auf dem Stroboskopprinzip basierenden Lösungen besteht in der zwingenden Verwendung zeitlich hochkonstanter Impulslichtquellen. Ferner dürfen die Objekte während der gesamten Aufnahmephase nicht bewegt werden. Technisch einfacher und robuster und für viele Anwendungen ausreichend ist demgegenüber die Verwendung von Gasentladungslampen, wie z.B. von Xenon- Blitzlampen, die jedoch den Nachteil einer geringen zeitlichen Konstanz der Entladung aufweisen. Derartige Lampen können aber mittels der Erfindung ohne weiteres eingesetzt werden.The disadvantage of the previously used, based on the stroboscope principle solutions is the compelling use of temporally highly constant pulsed light sources. Furthermore, the objects must not be moved during the entire recording phase. Technically In contrast, the use of gas discharge lamps, such as xenon flash lamps, which however have the disadvantage of a low temporal constancy of the discharge, is simpler, more robust and sufficient for many applications. However, such lamps can be readily used by means of the invention.
Erfindungsgemäß werden nun die Messwerte des Phosphoreszenzabfalls nach jedem Lichtimpuls vollständig ermittelt und in einer kurzen Messphase nach demAccording to the invention, the measured values of the phosphorescence decay are now completely determined after each light pulse and in a short measuring phase after the light pulse
Lichtimpuls als Bildfolge in einem Speicher abgelegt. Dieser Speicher kann auch der bildgebende Sensor selbst sein.Light pulse stored as a sequence of images in a memory. This memory may also be the imaging sensor itself.
Durch die zeitliche Korrelation sämtlicher Messungen verringert sich der Messfehler und reduziert sich auf einen für sämtliche Messwerte gleichen zeitlichen Offset. Aus dieser Bildfolge werden anschließend die zu einem Bildpunkt gehörenden Meßwerte in geordneter zeitlicher Reihenfolge ausgelesen und statistische Momente μnm berechnet. Danach wird die Wahrscheinlichkeit der Zugehörigkeit des betrachteten Pixel zu jedem der zu vergleichenden Modelle berechnet und in einem Farbvektor abgebildet. Für den Fall, dass eine automatische Segmentierung durchgeführt werden soll, kann die Wahrscheinlichkeit der Zugehörigkeit zu einer Sollklasse abgebildet und anschließend ausgewertet werden.The temporal correlation of all measurements reduces the measurement error and reduces to the same time offset for all measured values. From this image sequence, the measured values belonging to a pixel are subsequently read out in an ordered chronological order and statistical moments μ nm are calculated. Thereafter, the probability of membership of the considered pixel is calculated to each of the models to be compared and mapped in a color vector. In the event that an automatic segmentation is to be performed, the probability of belonging to a target class can be mapped and subsequently evaluated.
Für den Fall, dass als bildgebender Sensor ein CCD- Sensor verwendet wird, kann in besonders vorteilhafter Weise der Integrations- und Transportmechanismus so verkoppelt werden, dass in einem einzigen Ladungsbild die vollständige Information über den zeitlichen Verlauf der Phosphoreszenz abgebildet werden kann. In diesem Prozess wird die örtliche Auflösung teilweise in zeitliche Auflösung transponiert. Hierzu kann zunächst das Gesichtsfeld der Kamera durch eine Feldblende so eingeschränkt werden, dass nur ein Streifen der lichtempfindlichen Fläche des Sensors belichtet wird. Für den Fall, dass ein nur kleines phosphoreszierendes Objekt auf dunklem Hintergrund abgebildet wird, kann die Feldblende auch entfallen.In the event that a CCD sensor is used as the imaging sensor, the integration and transport mechanism can be coupled in a particularly advantageous manner so that the complete information about the temporal course of the phosphorescence can be displayed in a single charge image. In this process, the local resolution is partly transposed into temporal resolution. For this purpose, the field of view of the camera can first be limited by a field diaphragm so that only a strip of the photosensitive surface of the sensor is exposed. In the event that a small phosphorescent object is displayed on a dark background, the field stop can also be omitted.
Um die vollständige Information mehrerer nacheinander während des Abklingens der Fluoreszenz aufgenommener Einzelbilder in einem einzigen Ladungsbild abzuspeichern, kann gemäß einer Weiterbildung der Erfindung nach Ende des Lichtpulses die Ladung auf den Photodioden gelöscht und nach Ablauf eines ersten Zeitintervalls nach dem Löschen der Ladungen die in den Photodioden akkumulierte Ladung in die Transportregister übertragen und anschließend in schneller Folge über eine Vielzahl von n Zeilen geschoben werden. Nach Ablauf eines zweiten oder weiterer Zeitintervalle kann die in den Photodioden akkumulierte Ladung nochmals in die Transportregister übertragen und anschließend in schneller Folge über n Zeilen geschoben werden. Damit sind auf dem CCD-Chip nach Ende dieser Sequenz mehrere lateral verschobene Einzelbilder gespeichert .In order to store the complete information of a plurality of individual images recorded successively during the decay of the fluorescence in a single charge image, the charge on the photodiodes can be deleted after the end of the light pulse and after a first time interval after deletion of the charges in the photodiodes accumulated charge transferred to the transport registers and then pushed in rapid succession over a plurality of n lines. After expiration of a second or further time intervals, the charge accumulated in the photodiodes can be transferred again into the transport registers and subsequently pushed over n lines in rapid succession. Thus, several laterally shifted frames are stored on the CCD chip after the end of this sequence.
Mit der Erfindung können auch mehrfache Belichtungen durchgeführt werden, um eine verbesserte Statistik zu erhalten. Insbesondere können die Fluoreszenzsignale mehrerer Lichtimpulse einer Lichtquelle auch in einem einzelnen Ladungsbild auf einem CCD-Sensor für die Weiterverarbeitung gespeichert werden. Eine Möglichkeit zur Realisierung dieser Ausführungsform der Erfindung basiert darauf, daß eine repetierend angesteuerte Impulsquelle eingesetzt wird, mit jedem Integrationsimpuls nach einem Lichtimpuls das Ladungsbild auf einem CCD- Sensor um eine Zeile geschoben wird und nach Ablauf einer festgelegten Anzahl Nz um exakt diese Anzahl von Zeilen in die entgegengesetzte Richtung geschoben, mit dem nächsten Lichtimpuls dieser beschriebene Prozeß erneut ausgeführt, und nach einer Anzahl von Lichtimpulsen das gesamte Ladungsbild in einem Bildspeicher ausgelesen wird.With the invention, multiple exposures can also be performed to obtain improved statistics. In particular, the fluorescence signals of a plurality of light pulses of a light source can also be stored in a single charge image on a CCD sensor for further processing. One possibility for implementing this embodiment of the invention is based on the fact that a repetitively driven pulse source is used, with each integration pulse after a light pulse, the charge image is pushed on a CCD sensor by one line and after a specified Number Nz pushed by exactly this number of lines in the opposite direction, with the next light pulse, this process described re-executed, and after a number of light pulses, the entire charge image is read in a frame memory.
Eine weitere besonders vorteilhafte Ausführung des bildgebenden Sensors kann durch eine vorzugsweise zellenförmige Maske, beziehungsweise ein entsprechendes linienförmiges Gitter im Strahlengang erreicht werden. Hierbei werden beispielsweise in einem Zwischenbild oder auf dem CCD- Sensor selbst (N-I) Zeilen durch eine Maske abgedeckt und 1 Zeile geöffnet. Damit ist es möglich, N Abtastpunkte des Fluoreszenzabfalls zu erhalten, wenn nach jeder Übertragung eines Ladungsbilds das akkumulierte Bild in den Schieberegistern um jeweils um einen Bildpunkt in vertikaler Richtung verschoben wird.Another particularly advantageous embodiment of the imaging sensor can be achieved by a preferably cellular mask, or a corresponding line-shaped grid in the beam path. In this case, for example, in an intermediate image or on the CCD sensor itself (N-I), lines are covered by a mask and 1 line is opened. Thus, it is possible to obtain N sampling points of the fluorescence decay when, after each transfer of a charge image, the accumulated image in the shift registers is shifted by one pixel each in the vertical direction.
Zur Verbesserung der Empfindlichkeit kann die Maske in vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung auch mit einem Zylinderlinsenarray gekoppelt werden.To improve the sensitivity, the mask can be coupled in an advantageous embodiment of the invention with a cylindrical lens array.
Nach Belichtung des Objekts durch einen Lichtimpuls wird das Ladungsbild zunächst gelöscht. Anschließend wird nach einem ersten Integrationsintervall das Ladungsbild in die Schieberegister transportiert, danach werden n Takte geschoben und das zweite Ladungsbild generiert, anschließend wird dieses Bild ebenfalls übertragen.After exposure of the object by a light pulse, the charge image is first deleted. Subsequently, after a first integration interval, the charge image is transported into the shift registers, after which n clocks are pushed and the second charge image is generated, after which this image is also transmitted.
Am Ende dieses Prozesses liegen m streifenförmige Bilder in der Schieberegisterstruktur der CCD- Transportregister vor. Sowohl Frame- als auch Interlinetransfer kann erfindungsgemäß eingesetzt werden.
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
dargestellt. Das so ermittelte Digitalbild image(x,y) kann nachfolgend mit einem Mustererkennungsverfahren nachbearbeitet werden.At the end of this process, there are m striped images in the shift register structure of the CCD transport registers. Both frame and interlinear transfer can be used according to the invention.
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
Figure imgf000011_0001
shown. The thus determined digital image image (x, y) can subsequently be reworked with a pattern recognition method.
Besonders vorteilhaft ist auch der Einsatz von CMOS - Sensoren, die bei Bedarf mit Bildverstärkern gekoppelt werden können. Dazu kann in vorteilhafter Weiterbildung der Erfindung als bildgebender Sensor insbesondere eine CMOS- Sensor mit mehr als einem Ladungsspeicher pro Photodiode verwendet werden. In diesem Fall können die innerhalb derThe use of CMOS sensors, which can be coupled with image intensifiers if required, is also particularly advantageous. For this purpose, in an advantageous embodiment of the invention as an imaging sensor, in particular a CMOS sensor with more than one charge storage per photodiode can be used. In this case, those within the
Integrationszeitintervalle auf jeder Photodiode generierten Ladungen in einfacher Weise sequentiell auf die zugeordneten Ladungsspeicher aufteilt und anschließend ausgelesen werden.Integrationszeitintervals generated on each photodiode charges in a simple manner sequentially divided into the associated charge storage and then read out.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele und unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Dabei verweisen gleiche Bezugszeichen auf gleiche oder ähnliche TeileThe invention will be explained in more detail below with reference to preferred embodiments and with reference to the accompanying drawings. The same reference numbers refer to the same or similar parts
Es zeigen:Show it:
Fig. 1 eine typische Abklingkurve von mono- und multiexponentiellen FluophorenFig. 1 shows a typical decay curve of mono- and multi-exponential fluors
Fig. 2 die optimale Integrationszeit als Funktion des Bildindex für monoexponentielles und multiexponentielles Abklingverhalten,2 shows the optimal integration time as a function of the image index for mono-exponential and multi-exponential decay behavior,
Fig. 3 eine typische Signal/ Zeitfunktion mit optimalerFig. 3 shows a typical signal / time function with optimal
IntegrationszeitSteuerung,Integration time control,
Fig.4 einen CCD- Sensor mit Maske, Fig.5A einen CCD- Sensor mit linienförmiger Gittermaske,4 shows a CCD sensor with mask, 5A shows a CCD sensor with a line-shaped grating mask,
Fig. 5B in schematischer Ansicht eine Weiterbildung der in Fig. 5A gezeigten Ausführungsform mit einem Zylinderlinsen-Array,5B is a schematic view of a development of the embodiment shown in Fig. 5A with a cylindrical lens array,
Fig.6 ein Belichtungszeitdiagramm,6 shows an exposure time diagram,
Fig.7 ein Ausführungsbeispiel der echtzeitfähigen Steuer- und Recheneinheit mit bildgebenden Sensor und Bildspeicher,7 shows an embodiment of the real-time capable control and computing unit with imaging sensor and image memory,
Fig .8 ein Schaltbild einer möglichen Realisierung einerFig. 8 is a circuit diagram of a possible realization of a
Berechnungseinheit für eine Steuer- und Recheneinheit gemäß Fig. 7.Calculation unit for a control and computing unit according to FIG. 7.
Fig .1 zeigt typische Abklingkurven eines monoexponentiellen (unten) und eines multiexponentiellen (oben) Fluophors . Die Zeitkonstanten der Abklingkurven können in einem weiten Zeitbereich von einigen Nanosekunden bis zu Millisekunden variieren. Es ist bekannt, dass ein enger Zusammenhang zwischen den in der Umgebung des Fluophors vorhandenen chemischen Bindungen und dem Signalverlauf besteht, so dass aus der Anwesenheit bestimmter Phosphoreszenz/ Zeitverläufe und bestimmter Wellenlängenintervalle auf dieFig. 1 shows typical decay curves of a mono-exponential (bottom) and a multi-exponential (top) fluorophore. The time constants of the decay curves can vary over a wide time range from a few nanoseconds to milliseconds. It is known that there is a close relationship between the chemical bonds present in the vicinity of the fluorophore and the signal curve, so that the presence of certain phosphorescence / time courses and specific wavelength intervals on the
Ortsverteilung bestimmter Verbindungen geschlossen werden kann.Location distribution of certain connections can be closed.
In Fig. 2 ist die optimale Integrationszeit für eine typische Abklingfunktion als Funktion des Bildindex dargestellt. Die Integrationszeit steigt mit steigender Anzahl von Aufnahmen an. Um ein annähernd konstantes Bildsignal in den Einzelbildern zu erhalten, ist es gemäß einer Weiterbildung daher vorgesehen, eine an die typische Abklingfunktion angepasste Steuerung der Integrationszeit durchzuführen, so dass das Bildsignal für die typische Abklingfunktion in den Teil- oder Einzelbildern annähernd konstant ist.FIG. 2 shows the optimum integration time for a typical decay function as a function of the image index. The integration time increases with increasing number of shots. In order to obtain an approximately constant image signal in the individual images, it is therefore provided according to a development, a control of the integration time adapted to the typical decay function perform so that the image signal for the typical decay function in the sub-images or frames is approximately constant.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung mit einer im benötigten Spektralbereich zur Anregung der Fluorophore strahlenden Impulslichtquelle, einem bildgebenden Sensor und einer Steuer- und Recheneinheit angewendet. Die Steuer- und Recheneinheit synchronisiert die Komponenten so, dass unmittelbar zu Beginn eines Lichtimpulses die Photodioden des Bildsensors gelöscht werden, unmittelbar nach Ende des Lichtimpulses wird die Integration freigegeben. Als Impulslichtquelle können Gasentladungslampen, LED' s oder Laser verwendet werden.According to the invention, a device having a pulsed light source radiating in the required spectral range for exciting the fluorophores, an imaging sensor and a control and computing unit is used. The control and processing unit synchronizes the components so that immediately at the beginning of a light pulse, the photodiodes of the image sensor are deleted, immediately after the end of the light pulse, the integration is released. As pulse light source, gas discharge lamps, LEDs or lasers can be used.
Zur Erkennung der Zeitstruktur der Phosphoreszenzverteilung wird diese mehrfach im Zeitbereich abgetastet. Hierbei ist eine auf die zu klassifizierenden Phophoreszenzverläufe optimierte zeitliche Abtastung erforderlich, Fig.2. Auf der Abszisse sind die Bildaufnahmen mit dem Index 1 bis 10 aufgetragen, auf der Ordinate eine mit dem Abtastindex steigende Integrationszeit. Bei Verwendung programmierbarer optimaler Integrationsintervalle ti entsteht für jeden Messpunkt ein Vektor mit N (im Beispiel 10) Abtastwerten. Die Integrationsintervalle wurden hierbei so gewählt, dass ein optimaler, möglichst rauscharmer Kontrast zwischen unterschiedlichen Vektoren entsteht.To detect the time structure of the phosphorescence distribution, it is scanned several times in the time domain. In this case, an optimized on the to be classified Phophoreszenzverläufe temporal scanning is required, Fig.2. On the abscissa the image recordings are plotted with the index 1 to 10, on the ordinate a rising with the scanning index integration time. When using programmable optimal integration intervals ti, a vector with N (in the example 10) sample values is produced for each measurement point. The integration intervals were chosen in such a way that an optimal, preferably low-noise contrast arises between different vectors.
Die Signalverarbeitung erfordert eine sichere Klassifizierung unterschiedlicher Signal/- Zeitprofile. Im Ausführungsbeispiel zeigen Fig. 1 und Fig. 3, dass die sehr ähnlichen Kurven in Fig. 1 durch eine optimale zeitliche Abtastung trotz ihrer Ähnlichkeit im linearen Zeitbereich zu an ihren Formen gut unterscheidbaren Messwertvektoren führen können.
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bildgebenden Sensors 1 abdecken. Jeder dieser linienförmigen Bereiche deckt dabei N-I Zeilen des bildgebenden Sensors ab, in den Bereichen 25 ist jeweils eine Zeile freigelassen. Bei der Vermessung eines Fluoreszenzabfalls werden dann durch sequentielles Belichten und Schieben des akkumulierten Bildes N Abtastpunkte des Fluoreszenzabfalls erhalten, wobei nach jeder Übertragung eines Ladungsbilds das akkumulierte Bild in den Schieberegistern um jeweils um einen Bildpunkt in vertikaler Richtung verschoben wird. Ein Beispiel einesSignal processing requires a secure classification of different signal / time profiles. In the exemplary embodiment, FIGS. 1 and 3 show that the very similar curves in FIG. 1 can lead, despite their similarity in the linear time domain, to measurement vectors which can be distinguished well from their shapes by an optimal time sampling.
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cover imaging sensor 1. Each of these line-shaped areas covers NI lines of the imaging sensor, in the areas 25 one line is left free. In the measurement of fluorescence decay, N sample points of the fluorescence decay are then obtained by sequentially exposing and sliding the accumulated image, and after each transfer of a charge image, the accumulated image in the shift registers is shifted one pixel at a time in the vertical direction. An example of one
Timing-Diagramms für die Aufnahme der einzelnen Teilbilder mit Bildindex i=l bis i=5=N nach dem Ende des Lichtpulses 30 ist in Fig. 6 dargestellt. Das Timing-Diagramm kann in gleicher Weise auch für eine Aufnahme mit einem bildgebenden Sensor 1 gemäß Fig. 4 angewendet werden. Die Aufnahme der Einzelbilder mit dem Bildindex i erfolgt jeweils nach dem auf den Zeitachsen dargestellten Rechteckimpuls .Timing diagram for the recording of the individual partial images with image index i = 1 to i = 5 = N after the end of the light pulse 30 is shown in FIG. The timing diagram can also be used in the same way for a recording with an imaging sensor 1 according to FIG. 4. The recording of the individual images with the image index i takes place in each case according to the rectangular pulse shown on the time axes.
In Fig. 5B ist in schematischer Ansicht eine Weiterbildung der in Fig. 5A gezeigten Anordnung dargestellt. Zusätzlich zu der in Fig. 5A gezeigten Anordnung sind über den Schlitzen in der linienförmigen Maske 22 ein Mikrolinsenarray mit Zylinderlinsen 27 angeordnet, welche das einfallenden Fluoreszenzlicht auf die nicht abgedeckten Zeilen 25 des Sensors 1 bündeln, um die Lichtempfindlichkeit der Anordnung zu verbessern.In Fig. 5B is a schematic view of a development of the arrangement shown in Fig. 5A is shown. In addition to the arrangement shown in Fig. 5A, above the slits in the line mask 22 are disposed a microlens array with cylindrical lenses 27 which focus the incident fluorescent light onto the uncovered lines 25 of the sensor 1 to improve the photosensitivity of the device.
Fig. 7 zeigt ein Blockschaltbild eines Ausführungsbeispiels eines echtzeitfähigen Controllers 3 einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, der das Ladungsbild des bildgebenden Sensors 1 verarbeitet. Je nach verwendetem bildgebenden Sensor stellt das Sensorinterface 4 der Measurement Engine 5 die Messwerte der Phosphoreszenzverteilung in digitalisierter Form zur Verfügung.
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die Registern 12, 13, 14 und 15 benötigten Übernahmesignale bereit und wird aus der Steuereinheit 8 synchronisiert.7 shows a block diagram of an embodiment of a real-time capable controller 3 of a device according to the invention, which processes the charge image of the imaging sensor 1. Depending on the imaging sensor used, the sensor interface 4 of the measurement engine 5 provides the measured values of the phosphorescence distribution in digitized form.
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the registers 12, 13, 14 and 15 required takeover signals ready and is synchronized from the control unit 8.
Es ist dem Fachmann ersichtlich, dass die Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen beispielhaftenIt will be apparent to those skilled in the art that the invention is not limited to the exemplary ones described above
Ausführungsformen beschränkt ist, sondern vielmehr in vielfältiger Weise variiert werden kann. Insbesondere können die Merkmale der einzelnen Ausführungsbeispiele auch miteinander kombiniert werden. Embodiments is limited, but rather can be varied in many ways. In particular, the features of the individual embodiments can also be combined with each other.

Claims

Patentansprüche claims
1. Bildverarbeitungsvorrichtung, insbesondere zur Erfassung des Intensitäts/- Zeitverlaufs fluoreszierender Farbstoffe, mit einer Impulslichtquelle und einem bildgebenden1. Image processing apparatus, in particular for detecting the intensity / time course of fluorescent dyes, with a pulse light source and an imaging
Sensor, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eingerichtet ist, in einer definierten zeitlichen Folge bezogen auf denSensor, characterized in that the device is set up in a defined time sequence with respect to the
Lichtimpuls drei oder mehr Bilder des bildgebendenLight pulse three or more pictures of the imaging
Sensors in einem Bildspeicher abzulegen und für zugeordnete Bildpunkte die zeitliche Folge der Abtastwerte mit einem oder mehreren vorgegebenenStore sensors in an image memory and for associated pixels, the temporal sequence of the samples with one or more predetermined
Intensitäts/-Zeitverlauf eines zu detektierendenIntensity / time course of a detected
Farbstoffes zu korrelieren und die so ermittelten Korrelationswerte für vorzugsweise jeden Intensitäts/-Zeitverlauf als Bildmatrix in einemDye to correlate and thus determined correlation values for preferably each intensity / -Zeitverlauf as image matrix in a
Speicher abzulegen.Store memory.
2. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch dass als ein bildgebender Sensor ein CCD-Sensor verwendet wird, wobei nach Ende des Lichtpulses die Ladung auf den Photodioden gelöscht wird und nach Ablauf eines ersten Zeitintervalls nach dem Löschen der Ladungen die in den Photodioden akkumulierte Ladung in die Transportregister übertragen wird und anschließend in schneller Folge über n Zeilen geschoben wird und dass nach Ablauf eines zweiten oder weiterer Zeitintervalls die in den Photodioden akkumulierte Ladung nochmals in die Transportregister übertragen wird und anschließend in schneller Folge über n Zeilen geschoben wird.2. Image processing apparatus according to claim 1, characterized in that a CCD sensor is used as an imaging sensor, wherein after the end of the light pulse, the charge on the photodiodes is deleted and after a first time interval after deletion of the charges accumulated in the photodiodes charge is transferred into the transport register and is then pushed in rapid succession over n lines and that after a second or further time interval, the charge accumulated in the photodiodes transferred again in the transport register is pushed and then in rapid succession over n lines.
3. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch dass als bildgebender Sensor ein CMOS-Sensor mit mehr als einem Ladungsspeicher pro Photodiode verwendet wird und dass die innerhalb der Integrationszeitintervalle auf jeder Photodiode generierten Ladungen sequentiell auf die zugeordneten Ladungsspeicher aufgeteilt und anschließend ausgelesen werden.3. The image processing apparatus according to claim 1, characterized in that as a sensor imaging a CMOS sensor with more than one charge storage per photodiode is used and that within the integration time intervals generated on each photodiode charges are sequentially divided into the associated charge storage and then read out.
4. Bildverarbeitungsvorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch dass, im Strahlengang vor dem bildgebenden Sensor eine Maske mit einem Gitter angeordnet ist.4. Image processing apparatus according to one of the preceding claims, characterized in that, in the beam path in front of the imaging sensor, a mask is arranged with a grid.
5. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch dass vor dem Gitter ein Mikrolinsenarray angeordnet ist.5. An image processing apparatus according to claim 4, characterized in that a microlens array is arranged in front of the grid.
6. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch dass ein oder mehrere Modelle der Abklingfunktionen der erwarteten Fluophore abgespeichert und in Vektorform dargestellt werden und dass aus der Bildfolge für jeden Pixel (x,y) der Vektor der Abklingfunktion f,{x,y,t,) gemessen wird und dass aus Modellvektor und dem dem jeweiligen Pixel zugeordneten Vektoren f,(x,y,t,) eine oder mehrere6. The image processing device according to claim 1 to 5, characterized in that one or more models of the decay functions of the expected Fluophore be stored and represented in vector form and that from the image sequence for each pixel (x, y) of the decay function f, {x, y , t,) and that from the model vector and the respective pixels associated vectors f, (x, y, t,) one or more
Potentialfunktionen berechnet und als Bild abgespeichert werden. Potential functions are calculated and stored as a picture.
7. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch dass eine an die typische Abklingfunktion angepasste Steuerung der Integrationszeit vorgenommen wird, so dass das Bildsignal für die typische Abklingfunktion in den betrachteten Teilbildern annähernd konstant ist.7. An image processing device according to claim 1 to 6, characterized in that adapted to the typical decay function control of the integration time is made so that the image signal for the typical decay function in the observed fields is approximately constant.
8. Bildverarbeitungsvorrichtung nach Anspruch 4, gekennzeichnet dadurch dass eine repetierend angesteuerte Impulsquelle eingesetzt wird, und dass mit jedem Integrationsimpuls nach einem Lichtimpuls das Ladungsbild auf einem CCD- Sensor um eine Zeile geschoben wird und nach Ablauf einer festgelegten Anzahl Nz um exakt diese Anzahl von8. The image processing apparatus according to claim 4, characterized in that a repetitively controlled pulse source is used, and that with each integration pulse after a light pulse, the charge image is pushed on a CCD sensor by one line and after expiration of a fixed number Nz by exactly this number of
Zeilen in die entgegengesetzte Richtung geschoben wird und dass mit dem nächsten Lichtimpuls der beschriebene Prozeß erneut ausgeführt wird und dass nach einer Anzahl von Lichtimpulsen das gesamte Ladungsbild in einem Bildspeicher ausgelesen wird.Lines is pushed in the opposite direction and that with the next light pulse, the process described is carried out again and that after a number of light pulses, the entire charge image is read in an image memory.
9. Bildverarbeitungsvorrichtung nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine vorzugsweise in einem FPGA realisierte Steuer- und Recheneinheit umfasst, welche eine Potentialfunktion des Ladungsbildes aus dem Bildspeicher bestimmt und in Echtzeit auswertet und klassifiziert .9. An image processing device according to one of the preceding claims, characterized in that the device comprises a preferably realized in a FPGA control and processing unit which determines a potential function of the charge image from the image memory and evaluates and classifies in real time.
10. Bildverarbeitungssystem gemäß einem der vorstehenden10. Image processing system according to one of the preceding
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung zur Berechnung der Momente Claims, characterized in that the device for calculating the moments
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eingerichtet ist. is set up.
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