WO2007029415A1 - 電位活性化型プロトンチャネルを構成するタンパク質及びその利用法 - Google Patents

電位活性化型プロトンチャネルを構成するタンパク質及びその利用法 Download PDF

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proton channel
voltage
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Inventor
Yasushi Okamura
Original Assignee
Inter-University Research Institute Corporation National Institutes Of Natural Sciences
Sasaki, Mari
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)

Definitions

  • the present invention relates to a protein constituting a voltage-active proton channel of mammals such as humans and mice, and a method for using the same.
  • VSOP voltage-gated proton channel
  • the production of active oxygen in these cells is known to play an important role in inflammatory reactions, infection protection, apoptosis, removal of cancer cells, and the like.
  • the expression in osteoblasts may be deeply related to the formation of osteoporosis, which has become a social problem with the increase of the elderly.
  • lung epithelial cells play an important role in respiratory efficiency by controlling intracellular pH, and may become an important target for improvement of chronic respiratory diseases and respiratory failure in end-stage cancer.
  • brain microglial expression may be related to the development of senile dementia and brain degenerative diseases.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Voltage-gated proton channels were first reported in the conch-euron (Non-Patent Documents 1 and 2), followed by mammalian lung epithelial cells (Non-Patent Document 3), macrophages (Non-Patent Document 4), granulocytes ( (Non-patent literature 5), osteoblasts (non-patent literature 6), microglia (non-patent literature 7), etc., have been confirmed to be involved in the regulation of intracellular pH and production of active oxygen (non-patent literature (Non-patent literature 6)). Patent Documents 8, 9).
  • Non-Patent Document 1 Nature 299, 826-8. (1982)
  • Non-Patent Document 2 J Physiol 351, 199-216. (1984)
  • Non-Patent Document 3 Biophys J 60, 1243-53. (1991)
  • Non-Patent Document 4 J Gen Physiol 102, 729-60. (1993)
  • Non-Patent Document 5 J. Physiol. 496, 299-316 (1996)
  • Non-Patent Document 6 J Bone Miner Res 18, 2069-76 (2003)
  • Non-Patent Document 7 Physiol Rev 83, 475-579. (2003)
  • Non Patent Literature 8 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 288, L398- 408 (2005)
  • Patent Literature 9 Nature 422, 531-4 (2003)
  • the present invention was completed in the course of research to elucidate the molecular basis of voltage-gated proton channels in mammals such as humans and mice, and its purpose is to provide an industrial application method. To do.
  • the present inventors conducted a search based on the DNA sequence of the known squirt VSP (potential sensitive phosphatase, Non-Patent Document 1) of Genome Kashiwa and others to search for molecules that are candidates for mammalian proton channels. It was. As a result, a novel cDNA showing a sequence similar to the structure of voltage-gated channels S1 to S4 (Fig. 1) was found from mouse and human cDNA information (mouse cDNA NA RIKEN cDNA 0610039P13 (SEQ ID NO: 3)).
  • the inventors of the present invention have incorporated the mVSOPl cDNA into a vector, forcedly expressed it in a human cell line, and measured the current, and found that this current has the following characteristics.
  • the present invention relates to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids (for example, 5% of all amino acids) are deleted, substituted or added in the amino acid sequence.
  • a protein having activity as a proton channel, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4, or one or several amino acids in the amino acid sequence (for example, 5% of all amino acids) deleted, substituted or The protein has an added amino acid sequence capability and has activity as a potential-active proton channel.
  • the 205th amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the 201st amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 may be substituted with another amino acid.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding this protein or 1 to 1 of SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide is at least 90% homologous to the nucleotide sequence represented by the 822th position or the 1st to 810th positions of SEQ ID NO: 3.
  • the present invention is a recombinant vector containing this polynucleotide. Further, the present invention is a transformant into which this polynucleotide is introduced. Furthermore, the present invention provides the activity of inhibiting or inhibiting the activity of a potential-active proton channel by introducing the above-mentioned polynucleotide into an animal cell or tissue for transformation, allowing the agent to act on the cell or tissue. This is a screening method for a drug that activates or suppresses the function of a proton channel, which comprises assaying its action.
  • the present invention is also a method for expressing a protein constituting a proton channel, which comprises introducing the polynucleotide or the vector into a host cell and culturing the host cell.
  • Voltage-dependent proton channels have been found so far in mammalian blood cells (granulocytes, macrophages, lymphocytes), osteoblasts, microglia, and lung epithelial cells. It has been shown to be important for oxygen production. The production of active oxygen in these cells is known to play an important role in inflammatory reactions, defense against infection, apoptosis, and removal of cancer cells. The expression in osteoblasts may become a social problem with the increase in the number of elderly people! /, And may be deeply involved in the establishment of osteoporosis! /. To lung epithelial cells It plays an important role in respiratory efficiency by controlling intracellular pH, and may be an important target for improvement of chronic respiratory disease and respiratory failure in end-stage cancer. The expression of brain microglia may be related to the development of senile dementia and brain degenerative diseases.
  • the protein of the present invention is a polypeptide having voltage-dependent proton channel characteristics. As shown in FIG. 1, this proton channel is a four-transmembrane type and has S1 to S4 transmembrane regions. As will be apparent from the examples described later, the 205th amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the 20th amino acid of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is arginine (Arg) having a positive charge. It is located in the transmembrane region S4 and is an important part for controlling the gate so that the proton channel does not flow current inward.
  • the nature of the proton channel can be mutated by substituting Arg with another amino acid. For example, by substituting Arg with a negatively charged amino acid (Glu, Asp, etc.) or an uncharged amino acid (Gln, Asn, etc.), the function of the proton channel can be weakened or inhibited.
  • the present invention is also a polynucleotide (SEQ ID NOs: 1 and 3) encoding a voltage-dependent proton channel.
  • a polynucleotide that is at least 80%, preferably 90%, more preferably 95% homologous to the nucleotide sequence represented by positions 1 to 822 of SEQ ID NO: 1 or 1 to 810 of SEQ ID NO: 3 is used. be able to.
  • the recombinant vector of the present invention may be a vector used for in vitro translation or a vector used for recombinant expression.
  • a recombinant vector a plasmid, phage, cosmid or the like can be used.
  • a promoter sequence is appropriately selected to express the polynucleotide of the present invention, and a vector in which this and the polynucleotide of the present invention are incorporated into various plasmids or the like may be used as an expression vector. ,.
  • the expression vector of the present invention contains an expression control region (for example, promoter 1, terminator 1, and Z or origin of replication) depending on the type of host.
  • promoters for bacterial expression vectors ⁇ -specific promoters (for example, trc promoter, tac promoter, lac promoter, etc.) are used.
  • yeast promoters for example, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is used.
  • promoter for filamentous fungi include amylase and trpC.
  • animal cell host promoters include viral promoters (eg, SV40 early promoter, SV40 late promoter, etc.).
  • the expression vector can be prepared according to a conventional method using a restriction enzyme and Z or ligase. Transformation of the host with the expression vector can also be performed according to conventional techniques.
  • culture isotonic force conventional techniques (for example, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography,
  • the target protein can be recovered and purified according to ion exchange chromatography.
  • the expression vector preferably contains at least one selectable marker.
  • One such example is the resistance to dihydrofolate reductase or neomycin for eukaryotic cell culture, and the tetracytalin resistance gene or ampicillin resistance gene for culture in E. coli and other bacteria. It is done.
  • the polypeptide of the present invention may be expressed as a fusion polypeptide.
  • GFP may be used as a marker, and the polypeptide of the present invention may be expressed as a GFP fusion polypeptide.
  • the host cell is not particularly limited, and various conventionally known cells can be preferably used.
  • bacteria such as Escherichia coli, yeast (budding yeast Sacchar omyces cerevisiae, force, fissure mother Schizosaccnaromyces pombe, nematode (a aenorhabditis el egans), Xenopus laevis oocyte Etc.
  • a method of introducing the above expression vector into a host cell that is, a transformation method is not particularly limited, and a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a ribosome method, or a DEAE dextran method is preferably used. be able to.
  • a conventionally known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a ribosome method, or a DEAE dextran method is preferably used. be able to.
  • an expression system using baculovirus may be used.
  • a method for introducing a vector for transformation is not particularly limited, and a known genetic engineering technique can be used. Specific examples include the use of a competent cell, the electroporation method, the lipofussion method, the microinjection method, infection with viruses, the agrobatterium method, and the particle gun method.
  • the proton channel polynucleotide (mVSOPl or hVSOPl) of the present invention is introduced into an animal cell or tissue for transformation, and a drug as a test substance is allowed to act on the cell or tissue to produce a potential-active type.
  • a drug as a test substance is allowed to act on the cell or tissue to produce a potential-active type.
  • the cDNA of the proton channel is introduced into cultured cells, and current recording or imaging recording using a pH-sensitive fluorescent dye is performed by the notch clamp method. By doing so, the signal change at the time of administration of the test substance can be quantitatively detected.
  • “activity as a proton channel” can be measured by detecting the change in intracellular pH by the force of measuring the proton current flowing through the cell membrane by the Notch clamp method or by fluorescence imaging.
  • the mammalian proton channel of the present invention is compared with the squirt proton channel ( 1) High sensitivity to heavy metals, (2) Slow activation, (3) Mutation It shows characteristics such as that a molecule into which can be introduced can be expressed with high efficiency.
  • the difference between (1) and (2) means that pharmacological properties vary considerably depending on animal species when screening for drugs that target the proton channel. It is impossible to clean.
  • (3) In the future, research on investigating the structure and function of proton channels and the effects of drugs is more suitable for human-mouse proton channel cDNA clones than for ascidian proton channels! /, The
  • the proton channel of the mammal of the present invention can be used as follows.
  • Plasmids incorporating mouse or human VSOP cDNA can be used in vitro, for example, after recovering immune system cells that are weakly protected against infection in cells from the terminal stage of cancer from bone marrow or blood. By introducing a gene into the plasmid to increase the active oxygen production efficiency and returning it to the patient again, it becomes possible to remove cancer cells and protect against infection. At this time, if a mutation can be introduced into the VSOP sequence to change it into a proton channel with enhanced proton transport capability, the above effect can be further enhanced.
  • the proton channel can be used in reverse to remove cells that are detrimental to survival.
  • the proton channel in which 201 arginine is replaced with glutamine carries protons inward near the resting membrane potential of the pH, so that the pH in the cell becomes acidic and the cell viability decreases.
  • cancer cells can be removed by selectively introducing this VSOP into cancer cells.
  • Proton channels are essential for the production of active oxygen in blood cells, and the production of active oxygen in blood cells is known for many biological and physiological phenomena. If drugs that specifically inhibit the proton channel of blood cells are developed by the screening method of the present invention, these suppress the production of active oxygen and slow the progression of brain degenerative diseases and arteriosclerosis. It becomes possible. On the other hand, the development of drugs that activate proton channels will help to protect against infection and treat cancer by improving natural immunity.
  • RIKEN cDNA 0610039P13 (RIKEN Mouse FANTOM (TM) cDNA ⁇ GenBank accession number BC021548), which contains an insert showing homology with nucleic acid sequences, from Hoya VSP (voltage-sensitive phosphatase, non-patent document 1) is purchased from Dnaform and expressed in mammals Plasmid DNA was prepared by integrating into pcD NA3 (Invitrogen) or pIRES2-EGFP (BD Bioscience clontech), which are vectors for use.
  • pcD NA3 Invitrogen
  • pIRES2-EGFP BD Bioscience clontech
  • PCR primers were designed based on the GenBank sequence (BC009731), amplified from human THP1 cell cDNA by RT-PCR, and subcloned into pcDNA3.
  • the PCR primer sequence was 5 and CAGGAATCCAGAAACCAAGACGCAGAG-3,) (SEQ ID NO: 5), r (5, -GACAAGCTTCCGGGTCTAGTTCACTTC-3,) (SEQ ID NO: 6), and the conditions for DNA amplification were 94 ° C for 50 seconds, 55 ° C55 seconds, 72 ° C 60 seconds, 28 cycles.
  • the insert was inserted into the EcoRl and Hindlll sites of pBluescript, and then reinserted into the EcoRl and Xho 1 sites of pcDNA3. The sequence of the insert was confirmed on the strands in both directions using a DNA sequencer.
  • the cells were cultured under two conditions. These cells were transfected with hVSOP (SEQ ID NO: 1) using the calcium phosphate method and mVSOP (SEQ ID NO: 3) using the polyphetate method (Qiagen).
  • GFP coding region force P-EGFP-C1 (BD Bioscience), which is a plasmid incorporated downstream of the CMV promoter, was gene-transferred together and fluorescent as in the case of mouse VSOP. Cells transfected with the gene were identified by microscopic observation.
  • Mouse VSOP was introduced into COS7 cells using polyphetate (Qiagen), fixed with 10% formalin, washed with PBS, and the peptide sequence of the extracellular domain of mouse VSOP (IEPDEQDYAVTAFH) (SEQ ID NO: A specific antibody (rabbit polyclonal antibody) against 4) 107-120) was reacted as the primary antibody (no surfactant), and the fluorescence signal was detected using texas red labeled anti-rabbit as the secondary antibody.
  • the VSOP protein localized in the cell membrane was specifically fluorescently labeled. Once the gene was introduced, it was ugly! The cells were strong enough to detect such fluorescent signals.
  • electrophysiology measurement of the cell membrane was performed by the patch clamp method.
  • EPC9 HEKA elektronik
  • AxoPatch200B Molecular Devices
  • Pulse HEKA elektronik
  • Pclamp Molecular Devices
  • the output signal was a 4-pole Bessel filter that reduced noise with a cutoff frequency of 3.3 kilohertz and was captured by an AD converter at a frequency of 11-1.8 kHz.
  • the glass pipette had a resistance of 7-15 ⁇ using a 100 L calibrated pipetshad, Drummond bcientinc Company. Series resistance was compensated about 75% or more. All experiments were performed at room temperature (26-27 ° C) except for the temperature sensitivity tests.
  • NMDG solution 75 mM N-methyl D-glucamine (NMDG), 1 mM CaCl, 1 mM
  • NMDG solution in patch electrode 65 mM NMDG, 3 mM MgCl, 1 mM EGTA, 0-70 mM
  • Glucose 150-183 mM MES (pH5.4-6.1) or HEPES (pH7.0) was used. The osmotic pressure and pH were adjusted using glucose and methanesulfonic acid.
  • Intracellular normal solution 30 mM NaCl, 100 mM KC1, 3 mM MgCl, 1 mM EGTA, 100 m
  • the solution interface potential was 4 mV or less, which was not compensated in the analysis.
  • Fig. 3 shows an example of recording an outward proton current activated by a depolarization pulse of 3 seconds, with a step potential of 10mV from -30mV to lOOmV at a holding potential of -60mV.
  • NMDG solution is used for both intracellular and extracellular fluids, and pHin / pHout is 7.0 / 7.0.
  • Figure 4 shows the measured current value (vertical axis) with respect to the pulse voltage (horizontal axis) captured in this measurement.
  • BCECF-AM (2 ', 7'- b is— (2—carboxyethyl) — 5— (6) —carboxyfluorescein, acetoxymetnyl ester
  • HEK293 cells were transfected with mVSOP / pCDNA3 or pCDNA3 vector and a CD8 encoding plasmid.
  • the cells were placed in DMEM (without serum) for 30 minutes in the presence of 2 ⁇ g / ml BCECF-AM (Molecular Probe), then PSS solution (140 mM NaCl, 5 mM KC1, 5 mM glucose, 1 mM Washed 3 times with CaCl, 1 mM MgCl, 20 mM Tris pH 7.5) .
  • PSS solution 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 5 mM glucose, 1 mM Washed 3 times with CaCl, 1 mM MgCl, 20 mM Tris pH 7.5.
  • the transfected cells were marked with CD8 beads (Dynabeads M-450 CD8, DYN AL).
  • the cells were treated with NH C1 / NMDG solution (100 mM NMDG, 40 mM NH CI, 5 mM KCl, 5 mM
  • the intracellular pH was measured every 30 seconds by measuring the ratio of BCECF fluorescence intensity at 490 nm and 440 nm.
  • ARGUS / HiSCA (Hamamatsu Photonics) was used for data acquisition.
  • the standardization of intracellular pHi was measured by making a pH concentration gradient in lO ⁇ g / ml nigericin (Sigma) in a high potassium solution.
  • Fig. 5 shows a comparison between the reversal potential obtained from the repolarization current and the equilibrium potential (E) of the proton calculated by Nernst's formula force.
  • the solid line in Fig. 5 shows the regression of the measured value of the reversal potential with a straight line with a slope of 54.9 mV / ⁇ , and the broken line shows a straight line with the equilibrium potential E calculated from the Nernst equation (59.3 mV / ⁇
  • Figure 6 shows the results of estimating intracellular pH by measuring the ratio of BCECF fluorescence intensities at 490 nm and 440 nm in cells forcibly expressing mVSOPl.
  • the arrow indicates when the pH was changed by adding potassium solution.
  • Group A is a gene-expressed cell, indicating that it responds to a change in pH
  • Group B is a cell that does not express and does not respond to a change in pH.
  • the 201st arginine is an important site that controls the gate so that the proton channel does not flow current inward.
  • mVSOPl and hVSOPl are proton channel bodies that are not modifiers that activate proton channels or increase expression.
  • FIG. 1 shows the membrane topology of a proton channel polypeptide.
  • the right sequence shows the transmembrane region S4. + Indicates Arg with positive charge.
  • FIG. 2 is a diagram showing the detection of gene products with specific antibodies that recognize the surface of mouse VSOP.
  • (1) shows mouse VSOP gene introduced into COS7 cells, fixed with formalin, and immunostained (red) using mouse VSO P specific antibody.
  • (2) shows a differential interference image in bright field.
  • (3) shows a superposition of (1) and (2).
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of current measurement of cells into which mVSOP (SEQ ID NO: 3) has been introduced by the patch clamp method.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of current measurement of cells into which mVSOP (SEQ ID NO: 3) has been introduced by the patch clamp method. 4 is a current-voltage curve of the trace of FIG.
  • FIG. 5 A comparison of the reversal potential obtained from the repolarization current with the proton equilibrium potential determined from the Nernst equation.
  • the vertical axis is the repolarization current (mV)
  • the horizontal axis is the difference in pH between inside and outside the cell (mV)
  • FIG. 6 is a graph showing the ratio measurement of the fluorescence intensity of BCECF at 490 nm and 440 nm in cells forcibly expressing mVSOP1.
  • the vertical axis shows the ratio of BCECF fluorescence intensity (490nm / 440nm).
  • the arrow indicates the time when the potassium solution was added.
  • FIG. 7 shows the results of electrophysiological measurements performed using cDNA (R201Q) in which the 201st arginine of mVSOPl cDNA (SEQ ID NO: 3) is replaced with glutamine.

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Abstract

　【課題】　　ヒトやマウス等の哺乳類の電位依存性プロトンチャネルの分子基盤を解明するための研究の過程で完成されたものであり、ヒトやマウス等の哺乳類の電位依存性プロトンチャネルの産業上の利用方法を提供する。 　【解決手段】　　本発明者らは、ゲノムから公知のホヤVSP（電位感受性ホスファターゼ、非特許文献１）のＤＮＡ配列をもとにサーチを行い、哺乳類のプロトンチャネルの候補となる分子の検索をおこなった結果、電位依存性チャネルのＳ１～Ｓ４の構造（図１）に類似した配列を示す新規cDNAをマウス及びヒトのcDNA情報から見出した。このmVSOP1（マウスの電位依存性プロトンチャネル）のcDNAをベクターに組み込んで、ヒト株化細胞へ強制発現させ電流計測を行ったところ、mVSOP1が電位依存性プロトンチャネルであると結論された。 　

Description

明 細 書
電位活性化型プロトンチャネルを構成するタンパク質及びその利用法 技術分野
[0001] この発明は、ヒト及びマウス等の哺乳類の電位活性ィ匕型プロトンチャネルを構成す るタンパク質及びその利用法に関する。
背景技術
[0002] 哺乳類の血液系細胞 (顆粒球、マクロファージ、リンパ球）、骨芽細胞、ミクログリア、 肺上皮細胞に見られる電位依存性プロトンチャネル (以下「VSOP」ともいう。）は、細 胞内の pHの制御や活性酸素の産生に重要であることが知られている。
これらの細胞での活性酸素の産生は、炎症反応、感染防御、アポトーシス、がん細 胞の除去などに、重要な働きがあることが知られている。また、骨芽細胞での発現は 、老人の増加に伴って社会的な問題になっている骨粗鬆症の成立に深く関わってい る可能性がある。また、肺上皮細胞においては細胞内 pHの制御により呼吸効率に重 要な役割を果たしており、慢性呼吸器疾患や末期がんでの呼吸器不全の改善に重 要なターゲットとなる可能性がある。更に、脳のミクログリアでの発現は、老人性痴呆 や脳変性疾患の成立と関係がある可能性がある。
電位依存性プロトンチャネルは、巻貝の-ユーロンにおいて最初に報告され (非特 許文献 1、 2)、その後、哺乳類の肺上皮細胞 (非特許文献 3)、マクロファージ (非特 許文献 4)、顆粒球 (非特許文献 5)、骨芽細胞 (非特許文献 6)、ミクログリア (非特許 文献 7)などで存在が確認され、細胞内 pHの制御や活性酸素の産生に関わることが 報告されてきた (非特許文献 8, 9)。
[0003] 非特許文献 1： Nature 299, 826-8. (1982)
非特許文献 2 : J Physiol 351, 199-216. (1984)
非特許文献 3 : Biophys J 60, 1243-53. (1991)
非特許文献 4 : J Gen Physiol 102, 729-60. (1993)
非特許文献 5 : J. Physiol. 496, 299-316 (1996)
非特許文献 6 : J Bone Miner Res 18, 2069-76 (2003) 非特許文献 7 : Physiol Rev 83, 475-579. (2003)
非特許文献 8 : Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 288, L398- 408 (2005) 非特許文献 9 : Nature 422, 531-4 (2003)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 電位依存性プロトンチャネルは、上記のような重要な機能を持っているにも関わら ず、その分子基盤は明らかにされてこなかった。
本発明は、ヒトゃマウス等の哺乳類の電位依存性プロトンチャネルの分子基盤を解 明するための研究の過程で完成されたものであり、その産業上の利用方法を提供す ることを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、ゲノムカゝら公知のホヤ VSP (電位感受性ホスファターゼ、非特許文献 1)の DNA配列をもとにサーチを行い、哺乳類のプロトンチャネルの候補となる分子 の検索をおこなった。その結果、電位依存性チャネルの S1〜S4の構造（図 1)に類 似した配列を示す新規 cDNAをマウス及びヒトの cDNA情報から見出した（マウスの cD NA RIKEN cDNA 0610039P13 (配列番号 3)、ヒトの cDNA (配列番号 1)、以下それぞ れ「mVSOPl」、「hVSOPl」という。 ) 0これらのアミノ酸配列は（配列番号 2, 4)、発明 者らが同時に見出したホヤのプロトンチャネル（特願 2005-154598)のアミノ酸配列と 4 0%程度の相同性を示した。
[0006] 本発明者らは、 mVSOPlの cDNAをベクターに組み込んで、ヒト株化細胞へ強制発 現させ電流計測を行ったところ、この電流が以下のような特徴を持つことを見出した。
(1)反転電位が細胞内外の pHの差に応じて Nernstの式から予測される形で移動す る。
(2)電位活性ィ匕型プロトンチャネルの特長である外向き整流特性が明確である。
(3)内外の pHの差（Delta pH=pHo-pHi)を感知して、ゲーティングの電位依存性カー ブがシフトし、そのシフトの方向は、 Delta pHが正であるほど過分極側である。
測定された電流がこのような特徴を持つことから、 mVSOPlが電位依存性プロトンチ ャネルであると結論された。また、ヒトの遺伝子力もこれと相同な分子を見出した。 [0007] 即ち、本発明は、配列番号 2で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個（例えば、全アミノ酸の 5%)のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され たアミノ酸配列力 成りプロトンチャンネルとしての活性を有するタンパク質、又は配 列番号 4で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個（例え ば、全アミノ酸の 5%)のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列力も成 り電位活性ィ匕型プロトンチャネルとしての活性を有するタンパク質である。
また、このたんぱく質において、配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 205番目又は 配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 201番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて ちょい。
また本発明は、このタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号 1の 1〜
822番目又は配列番号 3の 1〜810番目で表される塩基配列と少なくとも 90%の相 同性をポリヌクレオチドである。
更に、本発明は、このポリヌクレオチドを含有する組換えベクターである。 また、本発明は、このポリヌクレオチドが導入された形質転換体である。 更に、本発明は、動物の細胞又は組織に上記ポリヌクレオチドを導入して形質転換 し、該細胞又は組織に薬剤を作用させ、電位活性ィ匕型プロトンチャネルの活性に対 する活性ィ匕又は抑制作用を検定することから成る、プロトンチャンネルの機能を活性 化又は抑制する薬剤のスクリーニング方法である。
また、本発明は、上記ポリヌクレオチド又は上記ベクターを宿主細胞に導入し、該宿 主細胞を培養することから成るプロトンチャンネルを構成するタンパク質を発現させる 方法である。
発明の効果
[0008] 電位依存性プロトンチャネルは、これまで哺乳類の血液系細胞（顆粒球、マクロファ ージ、リンパ球）、骨芽細胞、ミクログリア、肺上皮細胞に見られ、細胞内の pHの制御 や活性酸素の産生に重要であることが示されてきた。これらの細胞での活性酸素の 産生は、炎症反応、感染防御、アポトーシス、がん細胞の除去などに、重要な働きが あることが知られている。骨芽細胞での発現は、老人の増加に伴って社会的な問題 になって!/、る骨そしょう症の成立に深く関わって!/、る可能性がある。肺上皮細胞にお いては細胞内 pHの制御により呼吸効率に重要な役割を果たしており、慢性呼吸器 疾患や末期がんでの呼吸器不全の改善に重要なターゲットとなる可能性がある。脳 のミクログリアでの発現は、老人性痴呆や脳変性疾患の成立と関係がある可能性が ある。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明のタンパク質 (配列番号 2及び 4)は、電位依存的なプロトンチャネル特性を 有するポリペプチドである。このプロトンチャネルは、図 1に示すように、 4回膜貫通型 であって、 S1〜S4の膜貫通領域を持つ。後記の実施例でも明らかになるが、配列番 号 2で表されるアミノ酸配列の 205番目又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列の 20 1番目のアミノ酸は正電荷を持つアルギニン (Arg)であり、膜貫通領域 S4に位置し、 プロトンチャネルが内向きに電流を流さないようにゲートを制御する重要な部位であ る。この Argを他のアミノ酸に置換することにより、プロトンチャネルの性質を変異させ ることができる。例えば、この Argを負電荷を持つアミノ酸 (Glu、 Asp等)や無電荷の アミノ酸 (Gln、 Asn等）に置換することにより、プロトンチャネルの機能を弱め又は阻 害することができる。
[0010] 一方、プロトンチャネルの機能を強める方法は見いだされていないが、カリウムチヤ ネルの場合に知られているように、 S4に陽性のチャージを導入するような変異を入れ ることで、膜電位依存性を高めることはできると考えられる。またホヤのプロトンチヤネ ルは、活性化スピードが速いので、ホヤのプロトンチャネルと哺乳類のプロトンチヤネ ルのキメラ分子を作成するなどで、活性ィ匕速度を速めたプロトンチャネルの作成が可 能である。このような分子を、重篤ながんの患者などの免疫系細胞に遺伝子導入を 行って、免疫機能を強化することができれば、有効な治療法として発展できる。
[0011] また、本発明は電位依存的プロトンチャネルをコードするポリヌクレオチド (配列番号 1及び 3)である。本発明では、配列番号 1の 1〜822番目又は配列番号 3の 1〜810 番目で表される塩基配列と少なくとも 80%、好ましくは 90%、より好ましくは 95%相 同であるポリヌクレオチドを用いることができる。
[0012] 本発明の組換えベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発 現に用いるベクターであってもよ 、。 組換えベクターとしてプラスミド、ファージ、コスミド等を用いることができる。
ベクターは、宿主細胞の種類に応じて、本発明のポリヌクレオチドを発現させるため に適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明のポリヌクレオチドを各種プラスミド 等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればょ 、。
本発明の発現ベクターは、宿主の種類に応じた発現制御領域 (例えば、プロモータ 一、ターミネータ一、及び Z又は複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプ 口モーターとしては、 '眞用的なプロモーター（例えば、 trcプロモーター、 tacプロモー ター、 lacプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセ ルアルデヒド 3リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、 PH05プロモーター等が挙げら れ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、 trpC等が挙げられる。また 動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウィルス性プロモーター（例えば、 SV40初 期プロモーター、 SV40後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は 、制限酵素及び Z又はリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。 発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる
[0013] 上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培又は飼育した後、 培養物等力 慣用的な手法 (例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロ マトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従って、 目的タンパク質を回収、精 製することができる。
[0014] 発現ベクターは、少なくとも 1つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマ 一力一としては、例えば真核生物細胞培養につ 、てはジヒドロ葉酸レダクターゼ又は ネオマイシン耐性、及び E. coli及び他の細菌における培養についてはテトラサイタリ ン耐性遺伝子又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
上記選択マーカーにより、本発明のポリヌクレオチドが宿主細胞に導入された力否 力 さらには宿主細胞中で確実に発現している力否かを確認することができる。ある いは、本発明のポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよぐ例えば、 GF Pをマーカーとして用い、本発明のポリペプチドを GFP融合ポリペプチドとして発現さ せてもよい。 [0015] 上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなぐ従来公知の各種細胞を好適に 用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌等の細菌、酵母（出芽酵母 Sacchar omyces cerevisiae、力、裂醉母 Schizosaccnaromyces pombeノ、線虫 (し aenorhabditis el egans)、アフリカッメガエル（Xenopus laevis)の卵母細胞等を挙げることができる。
[0016] 上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定さ れるものではなぐ電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リボソーム法、 DEAEデキストラ ン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明のポリ ペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウィルスを用 V、た発現系を用 ヽ ればよい。
形質転換をするためのベクターの導入方法は特に限定されるものではなぐ公知の 遺伝子工学的手法を用いることができる。具体的には、コンビテントセルの使用、エレ タトロポレーシヨン法、リポフエクシヨン法、マイクロインジェクション法、ウィルスによる 感染、ァグロバタテリゥム法、パーティクルガン法等が挙げられる。
[0017] 本発明のプロトンチャンネルのポリヌクレオチド（mVSOPlや hVSOPl)を動物の細胞 又は組織に導入して形質転換し、この細胞又は組織に被検物質としての薬剤を作用 させ、電位活性ィ匕型プロトンチャネルの活性に対する活性ィ匕又は抑制作用を検定す ることにより、プロトンチャンネルの機能を活性ィ匕又は抑制する薬剤のスクリーニング を行うことができる。
プロトンチャンネルに対する被験物質の活性ィ匕又は抑制作用を検定する方法とし て、培養細胞などにプロトンチャネルの cDNAを遺伝子導入し、ノ ツチクランプ法にて 電流記録又は pH感受性蛍光色素を用いたイメージング記録を行うことにより、被験 物質の投与時での信号変化を定量的に検出することができる。
また「プロトンチャンネルとしての活性」は、ノツチクランプ法により細胞膜を流れる プロトン電流を計測する力、又は蛍光イメージングによって細胞内の pHの変化を検 出することにより、測ることができる。
[0018] なお、本発明者らは、すでに海産動物ホヤのプロトンチャネルを見出しているが（特 願 2005-154598)、本発明の哺乳類のプロトンチャネルは、ホヤのプロトンチャネルと 比較して、（1)重金属感受性が高いこと、（2)活性化がゆっくりしていること、（3)変異 を導入した分子が高効率で発現できること等の特徴を示す。 （1)と (2)の差は、プロト ンチャネルをターゲットとする薬物をスクリーニングするときには、薬理学的な性質が 動物種によりかなり違うことを意味しており、ホヤのプロトンチャネルでは適切なスクリ 一-ングが不可能である。 (3)は、今後プロトンチャネルの構造や機能の情報、薬剤 の効果を調べるための研究には、ホヤのプロトンチャネルよりもヒトゃマウスのプロトン チャネルの cDNAクローンの方がより適して!/、る。
[0019] 本発明の哺乳類のプロトンチャネルは以下のように利用することができる。
(1)マウスやヒトの VSOPの cDNAを組み込んだプラスミドは、たとえば癌の末期の患者 の細胞で感染防御機能が弱体ィヒした免疫系細胞を骨髄や血液から回収した後、 in V itroでこのプラスミドを遺伝子導入して活性酸素産生効率を上昇させておき、再び患 者に戻してやることで、癌細胞の除去や、感染の防御を行うことが可能になる。このと き、 VSOPの配列に変異を導入して、プロトンの輸送能力を増強したプロトンチャネル に改変することができれば、上記の効果はさらに増強される。
(2)プロトンチャネルを逆に、生存にとって有害な細胞を除去するのに使うことができ る。 201のアルギニンをグルタミンに置換したプロトンチャネルは、 pHの静止膜電位付 近において内向きにプロトンを運ぶため細胞内の pHが酸性になり、細胞の生存率が 低下する。例えば、癌細胞に選択的にこの VSOPを遺伝子導入することにより癌細胞 の除去が可能である。
(3)プロトンチャネルは、血液系細胞での活性酸素の産生に必須であり、血液系細 胞の活性酸素産生は、多くの生物現象、生理現象で知られている。本発明のスクリ 一二ング方法により、血液系細胞のプロトンチャネルを特異的に抑制する薬物を開発 すれば、これらは活性酸素の産生を抑制し、脳変性疾患や動脈硬化の進行を遅くす ることが可能になる。一方、プロトンチャネルを活性させる薬物を開発すれば、自然免 疫能を向上させることにより、感染防御や癌治療に役に立つ。
[0020] 以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものでは ない。
実施例 1
[0021] 本実施例では、ヒト及びマウスの電位活性化型プロトンチャネルの cDNAをクロー二 ングして培養細胞に導人した。
ホヤ VSP (電位感受性ホスファターゼ、非特許文献 1)と核酸配列の相同性を示した インサートを含む RIKEN cDNA 0610039P13 (RIKEN Mouse FANTOM(TM)cDNAゝ G enBank登録番号 BC021548)を Dnaformより購入し、哺乳類発現用ベクターである pcD NA3(Invitrogen)又は pIRES2- EGFP(BD Bioscience clontech)に組み込みプラスミド D NAを作成した。
ヒトの VSOP1は、 GenBankの配列（BC009731)をもとに PCRプライマーをデザインし、 ヒト THP1細胞の cDNAから RT- PCRにより増幅し pcDNA3へサブクロー-ングを行った 。 PCRプライマーの配列は 5し CAGGAATCCAGAAACCAAGACGCAGAG- 3，) (配 列番号 5)、 r(5，- GACAAGCTTCCGGGTCTAGTTCACTTC- 3，) (配列番号 6)を用い 、 DNA増幅の条件は、 94°C50秒、 55°C55秒、 72°C60秒、 28サイクルで行った。インサ ートを pBluescriptの EcoRlと Hindlllのサイトへ挿入し、その後、 pcDNA3の EcoRlと Xho 1のサイトに挿入し直した。インサートの配列は、 DNAシークェンサ一により両方向の ストランドにぉ 、て確認を行なった。
その結果、ヒトのプロトンチャネルの cDNA配列（配列番号 1)とアミノ酸配列（配列番 号 2)、及びマウスのプロトンチャネルの cDNA配列（配列番号 3)とアミノ酸配列（配列 番号 4)を得た。ヒトの VSOPがデータベース登録されて!、る塩基配列（BC009731)と 同じであることを確認した。
[0022] tsA201細胞と HEK293細胞を 10% FCSを含む DMEM(Sigma)中で、 37°C 5% CO濃
2 度の条件で培養した。これらの細胞に、 hVSOP (配列番号 1)は、カルシウムリン酸法 を用いて、 mVSOP (配列番号 3)はポリフエタト法 (Qiagen)を用いて、それぞれ遺伝子 導入を行った。
[0023] マウス VSOPの場合は、 pIRES2- EGFPベクター（Invitrogen社製）を用いて、同じ CM V (サイトメガロウィルス)プロモーターから読まれる GFP蛋白の発現を指標として、蛍 光顕微鏡下にて遺伝子導入された細胞から記録を行った。又は、 CD8の発現プラス ミドベクターを混ぜて遺伝子導入し、抗 CD8抗体にビーズがついたもの (製品名 Dyna Beads M450 CD8,メーカー名 DYNAL)で細胞をラベルして、遺伝子導入されている ことを確認した。 ヒト VSOPの場合は、 GFPのコード領域力 CMVプロモーターの下流に組み込まれた プラスミドである P-EGFP-C1 (BD Bioscience社製）を、いっしょに遺伝子導入し、マウ ス VSOPの場合と同様に蛍光顕微鏡観察により遺伝子導入された細胞を同定した。
[0024] COS7細胞にマウス VSOPをポリフエタト（キアゲン）を用いて遺伝子導入した後、 10 %ホルマリンにて固定し、 PBSで wash後、マウス VSOPの細胞外ドメインのペプチド配 列（IEPDEQDYAVTAFH) (配列番号 4の 107-120)に対する特異抗体（ゥサギポリポリ クローナル抗体)を一次抗体として反応させ (界面活性剤はなし)、 2次抗体として texa s red標識 anti-rabbitを用いて蛍光信号を検出した。その結果、図 2に示すように細 胞膜に局在する VSOP蛋白が特異的に蛍光標識された。遺伝子導入されて!ヽな!、細 胞ではこのような蛍光信号は検出できな力つた。ほとんどの実験を行った tsA201細胞 においては、免疫染色実験が適さないためにこの確認は行っていない。 COS7細胞 に遺伝子導入した場合にも、 tsA201細胞に遺伝子導入した際に見られる電流と全く 区別できな 、電流が誘導されることから、 VSOP蛋白が tsA201細胞にお!、ても COS7 細胞の場合と同様に発現して 、ると 、える。
実施例 2
[0025] 本実施例では、パッチクランプ法により細胞膜の電気生理学計測を行った。
実施例 1で得た mVSOPlの cDNA (配列番号 3)を導入した tsA201細胞の表面にガラ ス製ピペットの先端を当てて吸引し、細胞膜内外に荷電し、膜に含まれるイオンチヤ ンネルを通る電流を計測した (全電流パッチクランプ法)。
[0026] この計測にお 、て、 EPC9(HEKA elektronik)又は AxoPatch200B (Molecular Device s)を増幅器として用い、 Pulse(HEKA elektronik)又は Pclamp (Molecular Devices)を 刺激とデータ取得のソフトウェアとしてもち 、た。出力信号は 4ポールベッセル型フィ ルターで、 3.3キロへルツのカットオフ周波数でノイズを減少させ、 ADコンバーターに より 11-1.8 kHzの取り込み周波数で、パソコンへ取り込んだ。ガラスピペットは 100 L calibrated pipetshad, Drummond bcientinc Companyを用 ヽての抵抗 ί 7— 15Μ Ωで あった。直列抵抗の補償を 75%程度以上行った。全ての実験は温度感受性を調べる 実験以外は、室温 (26〜27°C)で行った。
[0027] また、この計測にぉ 、て以下の溶液を用いた。 —細胞外 NMDG溶液： 75 mM N- methyl D- glucamine (NMDG), 1 mM CaCl , 1 mM
2
MgCl , 10-100 mM glucose, 100—200 mM Mes (pH6.1) or HEPES (pH7.0, 7.8)を用
2
いた。
—パッチ電極内の NMDG溶液： 65 mM NMDG, 3 mM MgCl , 1 mM EGTA, 0-70 mM
2
glucose, 150-183 mM MES (pH5.4- 6.1) or HEPES (pH7.0)を用いた。浸透圧と pHは グルコースとメタンスルフォン酸を用いて調整した。
細胞外通常溶液: 160 mM NaCl, 2 mM KC1, 1 mM MgCl , ImM CaCl , 0—40 mM
2 2 glucose, 100 mM MES (pH6.0) or HEPES (pH7.0, 7.8).
細胞内通常溶液 :30 mM NaCl, 100 mM KC1, 3 mM MgCl , 1 mM EGTA, 100 m
2
M HEPES (pH7.0).
溶液界面電位は 4 mV以下であり、解析においては補償しなカゝつた。
[0028] 電流計測の結果を図 3と図 4に示す。
図 3は、保持電位- 60mVで、 - 30mVから lOOmVまで 10mV毎のステップパルスを与 えて、 3秒の脱分極パルスで活性ィ匕する外向きプロトン電流を記録した例を示す。細 胞内液、細胞外液ともに、 NMDG溶液を使用し、 pHin/pHoutは 7.0/7.0である。 図 4は、この計測においてカ卩えたパルスの電圧 (横軸）に対する測定された電流値（ 縦軸)を示す。
これらから、この細胞にぉ 、て電位依存的かつ時間依存的なイオン電流が認めら れた。
実施例 3
[0029] 本実施例では、 mVSOPにより発現が誘導されたチャネルが細胞内の pHを制御する 能力があるかどうかを検討するため、 pH感受性蛍光色素である BCECF-AM (2',7'-b is— (2— carboxyethyl)— 5— (6)— carboxyfluorescein, acetoxymetnyl ester)を用いて [tf像解 析を行つい、細胞内 pHの計測を行った。
HEK293細胞を、 mVSOP/pCDNA3又は pCDNA3 vectorと CD8をコードするプラスミ ドを用いてトランスフエクシヨンした。この細胞を 2 μ g/mlの BCECF-AM (Molecular Pr obe)存在下で DMEM (血清なし）中 30分間置いた後、 PSS溶液 (140 mM NaCl, 5 m M KC1, 5 mM glucose, 1 mM CaCl , 1 mM MgCl , 20mM Tris pH7.5)で 3回洗浄した 。遺伝子導入を行った細胞は CD8ビーズでマークした (Dynabeads M-450 CD8, DYN AL)。
この細胞を NH C1/NMDG溶液（100 mM NMDG, 40 mM NH CI, 5 mM KCl, 5 mM
4 4
glucose, 1 mM CaCl , 1 mM MgCl , 20 mM Tris, pH7.3)で 20分間還流し、アンモ-
2 2
ァを含まない溶液 (140 mM NMDG, 5 mM KCl, 5 mM glucose, 1 mM CaCl , 1 mM M
2 gCl , 20 mM Tris, pH7.4)で還流して、すばやく細胞内の酸を増加させた。
2
細胞内 pHは 30秒おきに、 BCECFの 490 nmと 440 nmの蛍光強度の比率を計測して 行った。データ取得には ARGUS/HiSCA (Hamamatsu Photonics)を用いた。細胞内 p Hiの標準化は、高カリウム溶液中で、 lO ^ g/ml nigericin (Sigma)を用いて pH濃度勾 配を作り、計測した。
[0030] 異なる細胞外 pHの条件で、 lOOmVの脱分極の後で様々なレベルの電位に戻した ときの再分極電流を計測した。細胞内 pHは 7.0で行った。再分極電流から求めた反 転電位を、ネルンストの式力 もとめたプロトンの平衡電位 (E )との比較を図 5に示す
H
。図 5の実線は反転電位の実測値を傾き 54.9 mV/ Δ ρΗの直線で回帰したものを示 し、破線はネルンストの式から計算される平衡電位 Eによる直線を示す (59.3 mV/ Δ ρ
H
H)。これらが一致することから、 mVSOPの発現により出現する電流がプロトン電流で あるといえる。
図 6は、 mVSOPlを強制発現させた細胞において、 BCECFの 490 nmと 440 nmの蛍 光強度の比率計測により、細胞内 pHを推定した結果を示す。矢印はカリウム溶液を 加えて pHを変化させた時点を示す。 A群は遺伝子発現した細胞であり、 pHの変化 に反応することを示しており、 B群は発現しな力つた細胞であり、 pHの変化に反応し なかったことを示している。
実施例 4
[0031] 本実施例では、 mVSOPlの cDNA (配列番号 3)の 201番目のアルギニンをグルタミン に置換した cDNA(R201Q)を用いて、実施例 2と同様に、ノツチクランプ法により細胞 膜の電気生理学計測を行った。その結果を図 7に示す。
細胞外 pHを 6.0にして、電流を計測した。正常 VSOP(WT)は 10mV置きに、 3秒間与 え、 R201Qでは 500msで、 5mV置きに与えた。保持電位は、 - 60mVであった。 NMDG 溶液を用いて行い、細胞内の pHは 7.0であった。正常 VSOP1の電流では内向きには 電流が認められないが、 R201Qでは明らかな内向き電流が認められる（図 7 (b) )。 記録した複数の細胞について電流密度の平均値を正常の VSOPl(n=8)と R201Q変 異分子 (n=12)で比較した結果を図 7 (c)に示す。
従って、 201番目のアルギニンは、プロトンチャネルが内向きに電流を流さないよう にゲートを制御する重要な部位であることが明らかになった。
このことは、 mVSOPl及び hVSOPlがプロトンチャネルを活性化したり発現を増加さ せたりする修飾因子ではなぐプロトンチャネル本体であることを示して 、る。
図面の簡単な説明
[図 1]プロトンチャネルのポリペプチドの膜トポロジーを示す図である。右の配列は膜 貫通領域 S4を示す。 +は正電荷を持つ Argを示す。
[図 2]遺伝子産物をマウス VSOPの表面を認識する特異抗体で検出した図である。 ( 1)はマウス VSOPを COS7細胞に遺伝子導入し、ホルマリンによる固定後、マウス VSO Pの特異抗体を用いて免疫染色 (赤色)を行ったものを示す。（2)は明視野での微分 干渉像を示す。 (3)は（1)と（2)とを重ね合わせたものを示す。
[図 3]mVSOP (配列番号 3)を導入した細胞をパッチクランプ法により電流計測をした 結果を示す図である。
[図 4]mVSOP (配列番号 3)を導入した細胞をパッチクランプ法により電流計測をした 結果を示す図である。図 3のトレースの電流電圧曲線である。
[図 5]再分極電流から求めた反転電位を、ネルンストの式からもとめたプロトンの平衡 電位 ）と比較した図である。縦軸は再分極電流 (mV)、横軸は細胞内外の pHの差（
H
細胞外の pHの値から細胞内の pHの値を差し引 1、た値）を示す。
[図 6]mVSOPlを強制発現させた細胞における BCECFの 490 nmと 440 nmの蛍光強度 の比率計測を示す図である。縦軸は BCECFの蛍光強度の比率 (490nm/440nm)を示 す。矢印はカリウム溶液を加えた時点を示す。
[図 7]mVSOPlの cDNA (配列番号 3)の 201番目のアルギニンをグルタミンに置換した c DNA(R201Q)を用いて行った電気生理学計測の結果を示す図である。

Claims

請求の範囲
[1] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において 1若しくは数個のァ ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列から成りプロトンチャンネルとして の活性を有するタンパク質、又は配列番号 4で表されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸 配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列 力も成り電位活性ィ匕型プロトンチャネルとしての活性を有するタンパク質。
[2] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 205番目又は配列番号 4で表されるアミノ酸配 列の 201番目のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された請求項 1に記載のタンパク質。
[3] 請求項 1又は 2に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[4] 配列番号 1の 1〜822番目又は配列番号 3の 1〜810番目で表される塩基配列と少 なくとも 90%の相同性をポリヌクレオチド。
[5] 請求項 3又は 4に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
[6] 請求項 3又は 4に記載のポリヌクレオチドが導入された形質転換体。
[7] 動物の細胞又は組織に請求項 3又は 4に記載のポリヌクレオチドを導入して形質転 換し、該細胞又は組織に薬剤を作用させ、電位活性ィ匕型プロトンチャネルの活性に 対する活性ィ匕又は抑制作用を検定することから成る、プロトンチャンネルの機能を活 性化又は抑制する薬剤のスクリーニング方法。
[8] 請求項 3又は 4に記載のポリヌクレオチド又は請求項 5に記載のベクターを宿主細胞 に導入し、該宿主細胞を培養することから成るプロトンチャンネルを構成するタンパク 質を発現させる方法。
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