WO2006135109A1 - Method for treatment of proliferative disease utilizing inhibition of formation of synoviolin homooligomer - Google Patents

Method for treatment of proliferative disease utilizing inhibition of formation of synoviolin homooligomer Download PDF

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WO2006135109A1
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synoviolin
disease
allergic
therapeutic agent
ubiquitination
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Toshihiro Nakajima
Tadayuki Yamadera
Tetsuya Amano
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening at least one therapeutic agent selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases. Still, this report includes a substance that inhibits synoviolin auto-ubiquitination as an active ingredient.
  • It relates to at least one therapeutic agent selected from the group consisting of fertility diseases, nervous system diseases and allergic diseases.
  • RA synovium in rheumatoid arthritis
  • the present invention provides at least one therapeutic agent selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases, comprising as an active ingredient a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination. .
  • the synoviolin-to-phase action can be attributed to the formation of a synopioline penetrating protein homotetramer.
  • the substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination is Sino-Gamma; Orishime RING ⁇ By binding to the domain.
  • ⁇ includes mutant Synoviolin and / or E. coli derived protein.
  • Proliferative diseases are selected from the group consisting of arthropathy, rheumatoid arthritis, fibrosis, arteriosclerosis and cancer.
  • the nervous system disease includes at least one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy and spinal cord injury.
  • As an allergic disease trachea ⁇ asthma,. Allelenetic rhinitis, a: lelegy 3 ⁇ 4 conjunctivitis,.: Pi: unisexual skin:.: Flame, anaphylaxis shock, danarenoregi single car, hay fever and food all ' At least one selected from the group consisting of ruby diseases.
  • a method for treating and preventing at least one selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases, and allergic diseases by administering to a patient a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination.
  • the proliferative disease includes at least one selected from the group consisting of arthropathy, rheumatoid arthritis, fibrosis, arteriosclerosis and cancer.
  • the nervous system disease includes at least one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy and spinal cord injury.
  • the allergic disease includes at least one selected from the group consisting of bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylactic shock, tick allergic disease, pollinosis and food allergic disease. It is done.
  • the candidate substance is contacted with synoviolin to evaluate whether the candidate substance inhibits synoviolin self-ubiquitination, and the candidate substance that inhibited synoviolin self-ubiquitination is regarded as a proliferative disease, nervous system disease and A screening method for the therapeutic agent, wherein the therapeutic agent is selected as at least one therapeutic agent selected from the group consisting of allergic diseases.
  • Figure 1 shows the GSH-Sepharose resin purified fraction (GSH) and Ni-NTA agarose resin purified fraction (GSH / Ni) of wild type and C307S mutants separated by 10% SDS-PAGE and stained with CBB. is there.
  • FIG. 2 shows GST, GST-Syno ATM wild-type or C307S mutant GSH-sepharose resin purified fraction (GSH) and Ni-NTA agarose resin purified fraction (GSH / Ni) as MBP or MBP-Syno ATM- It is a figure which shows having performed the pull-down assay using GSH Sepharose resin in combination with His.
  • Figure 3 shows the analysis of the Syno ⁇ wild-type Superdex 200 column fraction obtained by thrombin treatment using Western blotting and silver staining.
  • Figure 4 shows a Syno A TM oligomer by cross-linking reaction with dartal aldehyde It is a figure which shows having detected.
  • Figure 5 shows the deletion mutants used to determine the amino acid region required for in vitro binding activity between GST-Syno A TM and MBP-Synoviolin ⁇ TM.
  • FIG. 6 shows that in vitro binding between GST-Syno ⁇ TM and MBP-Synoviolin ⁇ TM: 5: determination of the amino acid region essential for activity was performed. .
  • FIG. 7 shows GST-Syno ⁇ and MBP-Synoviolin ⁇ and in vitro binding: FIG. 7 shows the effect of EDTA on activity. ,.
  • proliferative disease is: a substance that inhibits a-oxidation of ::: bi; ⁇ -phosphorus: effective, consisting of: proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases Select from the group: at least: at least: 1 treatment. (Hereinafter sometimes referred to as treatment for proliferative diseases, etc.). Further, the present invention, proliferative disease, nervous system disease and array
  • synoviolin is also known from the protein structure prediction system to encode ⁇ 3 ubiquitin virus having a RING finger motif with self-ubiquitination activity.
  • the base sequence for coding synoviolin is shown by SEQ ID NO: 1
  • the anoic acid sequence constituting synoviolin is shown by SEQ ID NO: 2. .
  • Ubiquitination refers to ubiquitin-activating enzyme: (E1), ubiquitin-conjugating enzyme, rate (E: 2 ), and biquitin ligase (E3), etc. Tampering means the process of combining ubiquitin one after another.
  • Gono ⁇ ' The physiological significance of biquitination has traditionally been recognized as a tag modification for delivery to the proteosomal proteolytic machinery. In subsequent studies, the significance of ubiquitination at present is positioned as a reversible protein modification system that controls protein function.
  • self-ubiquitination means that synoviolin itself has a ubiquitin lyase activity, so that synoviolin itself becomes a substrate protein for ubiquitination and binds ubiquitin by itself without any other ubiquitin ligase. To do. Synoviolin self-ubiquitination is not only observed in the full-length molecule of endogenous synoviolin, but also occurs in synoviolin in which only the intracellular part of synoviolin and the tag protein are fused.
  • synoviolin is an enzyme that catalyzes the reaction of adding ubiquitin to its substrate protein, and direct interaction between synoviolins in the RING domain is important for synoviolin ubiquitination. .
  • the following describes the synoviolin self-ubiquitination reaction at the molecular level by biochemical analysis of the interaction between recombinant synoviolins.
  • synoviolin transmembrane domain deletion region (Syno ATM) wild type (wt) with GST tag at the N-terminus and His tag at the C-terminus, and mutants with mutations in the RING domain, eg, synoviolin
  • mutants in which the 307th cysteine is mutated to serine (C307S mutant) are prepared.
  • synoviolin and mutant synoviolin or protein derived from E. coli are:: .. chitin 3 ⁇ 4 activity.
  • Self-biotics ::,: non-inhibition is inhibited. . ;.
  • Synoviolin forms a homotetramer.
  • the above analysis method can be employed for screening substances that inhibit synoviolin auto-ubiquitination.
  • a candidate substance is contacted with Synoviolin to evaluate whether the candidate substance inhibits synopioline self-ubiquitination.
  • Candidate substances that inhibit synoviolin auto-ubiquitination can be selected as therapeutic agents for proliferative diseases and the like.
  • the C307S mutant or the E. coli-derived protein described later is selected as a substance that inhibits synoviolin auto-ubiquitination.
  • Self-ubiquitination can also be measured by contacting a candidate substance with a cell that secretes synoviolin.
  • a method for confirming whether or not self-ubiquitination has occurred is to measure the interaction between synoviolins.
  • An example of a method for measuring the interaction between synoviolins is a method for confirming the formation of synoviolin tetramers.
  • Tetramer formation can be confirmed by measuring molecular weight as described above.
  • synoviolin protein may be fractionated on a gel filtration column and its molecular weight measured.
  • Synoviolin interaction can also be measured by preparing synoviolin with different tags and expressing them in cells to confirm the presence of the tag. In this case, it can be said that synoviolin interaction occurred when multiple tags were found in one protein.
  • Synoviolin forms a homotetramer: Therefore, the Sino ':.: Biori: by inhibiting the formation of homo-tetramer of emissions, it is possible to inhibit self-Interview Bikichin of Shinopiorin..
  • Candidate substances that inhibit synoviolin self-ubiquitination are not limited to the following: • Naturally or artificially synthesized peptides, proteins,. : ; Nucleic acids (DA, RNA, etc.) Rigonucleotide (siRNA, etc.), peptide nucleic acid (PNA),.
  • DA Naturally or artificially synthesized peptides, proteins,. : ; Nucleic acids (DA, RNA, etc.) Rigonucleotide (siRNA, etc.), peptide nucleic acid (PNA),.
  • DA Naturally or artificially synthesized peptides, proteins,. : ; Nucleic acids (DA, RNA, etc.) Rigonucleotide (siRNA, etc.), peptide nucleic acid (PNA),.
  • PNA peptide nucleic acid
  • a mutated synoviolin that can interact with synoviolin or a contaminating protein such as a protein derived from E. coli is selected as a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination.
  • Mutant Synoviolin refers to a C-terminal-deficient peptide produced during the synthesis of a full-length Synopioline proteolytic enzyme or Synoviolin protein.
  • amino acid sequence of Synoviolin smells:
  • the present invention which is a drug that inhibits the direct interaction of the present invention: 25 drugs are based on the inhibition of synoviolin enzyme activity.
  • Sexually ill, Nervous system friend Useful as at least one treatment selected from the group consisting of allergic diseases. ,
  • Arthropathy is a disease that affects the joints and includes the neuropathic arthropathy that is found in diabetes, such as diabetic arthropathy, Jaku arthritis, osteoarthritis, and spinal spondyloarthropathy. It is not limited to.
  • RA is a systemic inflammatory disease with abnormal growth in the synovial tissue of the joint.
  • Synovial cells are fibroblast-like cells that form 1 to 6 epithelial-like layers in the synovium of the joint, and are considered to supply proteoglycans and hyaluronan to synovial fluid. Yes.
  • Symptoms such as synovial tissue proliferation, the resulting multilayered structure, and infiltration of synovial cells into other tissues are observed in the joints of RA patients.
  • the etiology of RA which is considered as one of cell proliferative diseases, remains unclear.
  • steroids and non-steroids are both temporary and rarely cure RA even if joint pain and swelling are suppressed. It is.
  • the therapeutic agent for proliferative diseases and the like of the present invention is also characterized by suppression of cell growth, and since it has an incomplete length of synoviolin or the like as an active ingredient, it has no side effects and is preferable as an RA therapeutic agent.
  • Fibrosis refers to a disease in which fibrous tissue is formed as a repair or reaction process, as opposed to the formation of fibrous tissue, which is a normal component of organs and tissues.
  • Arteriosclerosis is a phenomenon in which the arteries become hard, and includes, but is not limited to, atherosclerosis, m0nckeberg arteriosclerosis, arteriosclerosis.
  • Cancer is a collective term for various malignant neoplasms, such as brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, knee cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, Child Vaginal cancer, egg yolk cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, soft: ⁇ : osteosarcoma, skin fistula, various leukemias (eg acute myeloid.
  • various malignant neoplasms such as brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, knee cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, Child Vaginal cancer, egg yolk cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma,
  • Leukemia acute lymphoblastic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, malignant lymphoma), and the like. . Even if the cancer is the primary lesion,
  • V-p53 is known as a depression gene. When normal cells are exposed to ultraviolet rays or the like, p53 in the cells is activated, and as a result, cell growth is inhibited. By increasing the concentration of p53, the growth of cancer cells can be stopped. 'In fact, p53 is rarely found in cells of normal IE individuals, but about half of the 10 cells from cancer patients have this p53 deletion mutation. In addition, such mutations One Oko 3 ⁇ 4 a ⁇ in the case; also .. ⁇ :.. Because control mechanism what Kano 3 ⁇ 4 different raw: Te:: tumor suppressor function has been lost. Therefore, to suppress the progression of cancer, it is necessary to make p53 function effectively.
  • the inventors previously made a Synoviolin homonoc: xamp product and inhibited the function of Sisopione, which promotes the characterization of p53, which is deeply involved in apoptosis, and the function of Synopioline. I found that inhibition leads to the cancer deity.
  • Therapeutic agents such as proliferative diseases of the present invention, self- ⁇ Bikichi ;; ⁇ down the:., By inhibiting, Shinopio:. Inhibit the function of phosphorus, :: Roh 'promote the activation of 3 The Cell : Because it can, it is also useful as an anticancer agent. ::
  • Nnoviolin interacts with a protein called herp (homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1) whose expression is induced by endoplasmic reticulum stress: 25 (Kokame K, Kato H, Miyata T. Homocysteine-respondent Genes in Vascular Endothelial ⁇ — Ceils Identified by Differential: Displa Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22; 271 (47): 29659-665): Her Is a family gene, a single disease (FAD) and is considered to be a causative gene: il presenilin.
  • herp homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1
  • (PS) interacts with : mochi] 3 -Amyloprotein: ( ⁇ ⁇ ⁇ ) increases the activity of ⁇ -secretase -secretase), a proteolytic enzyme involved in intramembrane cleavage (Sai X, Kawamura Y, Kokame K, Yamaguchi H, Shiraishi H, Suzuki R, Suzuki T, Kawaichi M, Miyata T, Kitamura T, Strooper BD, Yanagisawa K, Komano HJ Biol. Chem. 277 (15): 12915-12920).
  • a substance that inhibits the interaction of synoviolin is preferable as a therapeutic agent for nervous system diseases such as Alzheimer's disease because it promotes the sensitivity of the secretase inhibitor.
  • Allergic diseases include but are not limited to bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylactic shock, tick allergic disease, pollinosis and food allergic disease. .
  • the present inventors previously generated a Synoviolin hetero knockout animal and analyzed it in detail, and found that IL-4 and IgE production was suppressed as compared to the wild type. That is, it was found that inhibition of synoviolin function suppresses the production of IL-4 and IgE, which are deeply involved in allergic diseases, and inhibition of synoviolin function leads to treatment of allergic diseases. Therefore, a substance that inhibits the interaction of synopioline is preferable as a therapeutic agent for allergic diseases.
  • the application site is not particularly limited, and it is applied to blood vessels, joints, skin, eyes, nose, tumors and the like. Further, in the present invention, the type of the disease is not limited to one, and even a combination of multiple types of diseases is applicable.
  • the therapeutic agent for proliferative diseases and the like of the present invention can also be administered to mammals that need to suppress abnormal cell growth.
  • Mammals to be administered include, for example, humans, domestic animals such as horses, horses, hidges, goats, pets such as dogs, cats, mice, rats, guinea pigs, rabbits, etc. However, it is not limited to these animals.
  • the dosage form of the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention is either oral or parenteral. But it is possible.
  • oral administration such as tablets, capsules, granules,: dispersion; V::: agent or is capable of administration by white-flop agent.
  • parenteral administration sprays, suppositories, eye drops, etc., pulmonary dosage forms (for example, those using nephriser, etc.), nasal dosage forms, transdermal dosage forms (for example, ointments, creams) ) And the like.
  • injection form it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection of dots, drops, etc., intramuscular injection, intraperitoneal injection,. 'These preparations are made using pharmaceutically acceptable additives such as excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, and diluents. It is manufactured by a known method. '
  • Coating Agent includes, for example, ethyl cellulose, droxypropyl cellulose, hydroxypropinoremethinolecellulose, shellac, talc, calsuba wax, paraffin and the like.
  • binder examples include polyburpi-glyphidone,: macrogol and the above-mentioned compound. :,:
  • Disintegrants include, for example, the same compounds as in the excipient :: Gross Carmelo 'V zunatrium, canolepoxymethyl starch sodiumtrim,
  • Li Chemically modified starch such as dong. Cellulose. .
  • Stabilizers such as methylparaben, propylparaben, etc.
  • N E perfume acid ::, N E perfume acid; Kubota butanol, Nozil gorgool, Alcohol, etc .; Le cetylanol, etc .; Salt benzalkonium; 7 Enol, cresol, etc. Examples include phenols, and thimerosal; dehydrated acetic acid; and sorbic acid.
  • flavoring agents include, for example, commonly used sweeteners, acidulants, and fragrances.
  • a solvent for producing a liquid agent ethafur, .phenol, chlorol resole, purified water, distilled water, etc. can be used. : ⁇ .
  • Surfactants or emulsifiers include, for example, polysorbate 80, stearin Polyoxyl 40, Lauromacrogol, etc. can be mentioned.
  • the above additives and the like are selected from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention.
  • a solvent for example, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • Tween 80, Tween 20, gelatin, human blood What added clean albumin etc. can be used.
  • it may be freeze-dried to obtain a dosage form that dissolves before use.
  • sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
  • the dosage of the therapeutic agent for proliferative diseases and the like of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, and dosage form.
  • the administration method is appropriately selected according to the patient's age and symptoms.
  • the effective dose is 0.1 / ig to 100 mg / kg body weight, preferably 1 to 10 g / kg body weight.
  • the therapeutic agents for the above proliferative diseases are not limited to these doses.
  • the effect of the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention can be examined by examining as follows.
  • Various concentrations of therapeutic agents for proliferative diseases of the present invention are added to cultured cells. After incubation for a certain period of time, the cells are collected, and after protein separation by SDS-PAGE, inhibition of synoviolin polymer formation can be observed by Western blotting.
  • the cultured cells can be appropriately selected from synovial cells, cancer cells and the like.
  • the present invention may be useful as a drug aimed at protecting nerve cells by controlling synoviolin homotetramer formation. Specifically, it is useful for the treatment of nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy, and spinal cord injury. .::.
  • nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy, and spinal cord injury. .::.
  • nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy, and spinal cord injury. .::.
  • the present invention is not limited to these examples.
  • the purpose of this example is to estimate the molecular weight of Synoviolin ⁇ wild-type by gel filtration column chromatography and to analyze the existing state in the solution.
  • Proteins contained in the obtained fraction were separated by 10% SDS-PAGE, transferred onto a PVDF membrane, and detected by Western blotting using an anti-Syno 10Da antibody (FIG. 3A).
  • the purified fractions were separated by 10% SDS-PAGE and stained by silver staining (Fig. 3B). : As a result, elution was observed in the 25th fraction, which is the elution position of 180: kDa, in all cases ( Figure 3A, 3B). .
  • Syno ⁇ TM oligomer by cross-linking reaction using glutaraldehyde K we investigated the formation of synoviolin: ligomer by cross-linking reaction with glutardehyde: intermolecular interaction between synoviolin ⁇ . The purpose is to analyze this.
  • synoviolin ubiquitination direct interaction between synoviolins is important. Since at least one therapeutic agent selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases, and allergic diseases of the present invention is a drug that inhibits the direct interaction between synoviolins, it inhibits the enzyme activity of synoviolin. It is useful as an RA treatment based on harm.

Abstract

Disclosed is a therapeutic agent for at least one disease selected from the group consisting of a proliferative disease, a neurogenic disease and an allergic disease which can inhibit the self-ubiquitination of synoviolin. Also disclosed is a method for screening a therapeutic agent for at least one disease selected from the group consisting of a proliferative disease, a neurogenic disease and an allergic disease, the method comprising contacting a candidate substance with synoviolin, determining whether or not the candidate substance inhibits the self-ubiquitination of synoviolin, and selecting the candidate substance as the therapeutic agent when the candidate substance inhibits the self-ubiquitination of synoviolin.

Description

. シノ ビオリンのホモ.オリゴマ一形成阻害を利用した増殖性疾患治療法 ：  Treatment of proliferative diseases using inhibition of synoviolin homo-oligomer formation:
5 術分野 5 Surgery field
： ：本発明は、 増殖性疾患 .神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群かち選 ばれる少なぐとも 1つの治療剤のスグリーニ グ方法に関する。 まだ、 本 ¾明 はシノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する物質を有効成分として含む、 増 明  The present invention relates to a method for screening at least one therapeutic agent selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases. Still, this report includes a substance that inhibits synoviolin auto-ubiquitination as an active ingredient.
殖性疾患、 神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なく と 10 も 1つの治療剤に関する。  It relates to at least one therapeutic agent selected from the group consisting of fertility diseases, nervous system diseases and allergic diseases.
. 背景技術. ' 書 Background art.
関節リゥ チ （rheumatoid arthritis 、 以下 RAともいう） における滑膜 の異常増殖は、 関節破壊の中心的な役割を果たしているため、 その自立的な 15 増殖のメカニズムを解明することは、 RA の根本的治療に重要であると考え られる。 そこで発明者らは、 そのメカュズムを解明することを目的として、 ：: ； 抗滑膜細胞抗体を作製し、 ヒ ト滑膜細膽 cDNAライブラリーよりスグリ一二； . ： ングを.行つた。 その結某、 小胞体上でタンパグ質の品質管寧に関連する ' RING-H2:型 E3ュビキチンリガーゼである 「シノビォリン」 のクローニシグ 20 Jこ成功した (WO02/052007)。  Since the abnormal growth of synovium in rheumatoid arthritis (hereinafter also referred to as RA) plays a central role in joint destruction, it is essential to elucidate the mechanism of autonomous growth of RA. It is considered important for treatment. In order to elucidate the mechanism, the inventors made an anti-synovial cell antibody and performed a currant from a human synovial cell cDNA library. As a result of this ligation, the 'RING-H2: type E3 ubiquitin ligase “Synoviolin”, which is related to the quality control of the protein on the endoplasmic reticulum, has been successfully performed (WO02 / 052007).
； ^ · ノビ :リ：ンを:過剰発現ざせた:マウスは、 ：の約 に滑膜細 増 mを 伴う関節症を自然発症した。 それに対して、 シノビオリンのヘテロ KOマウ . スは、 2 型ユラ一ゲン誘導関節炎に対して抵抗性を示し、 これが滑膜細胞の • アポ 一、ンス亢進に起因していることが示されだ。 これらのことから、 発明 : 25 ·者らほ、 滑膜細胞の異常増殖が、 シノビォリンに依存した小胞体関連タンパ： ク質分解 （ERAD) の機能亢進に由来し、 その結果として関節炎に至るとい うモデルを提唱した。 実際、 シオビォリンが E3： キチンライゲースの特 ^ · Novi: Ly :: Overexpressed: Mice spontaneously developed arthropathy with synovial hyperplasia m in about:. Synoviolin hetero KO mice, on the other hand, showed resistance to type 2 julagen-induced arthritis, which was shown to be due to increased synaptic cell apoptosis. Based on these facts, the invention: 25 · They say that the abnormal growth of synovial cells is derived from synoviolin-dependent endoplasmic reticulum-related tampering: hyperactivity of keratolysis (ERAD), resulting in arthritis I proposed a model. In fact, Cioviolin is E3:
：: 癍のびとつである自己^ビキチンィ.ヒ.活性を有するこ：とが証 され:でいる。へそ: , して、 遺伝チ改変動 も用いた研究により、 シノビオリンは 節; ヴマチ ' 発.症に必須の分子であることが判明した。 しかし、 自己ュビキチン化とシノ : ：:ピオ.リンとの関係は不明な点も多かった。 .： " . ： ■ 発明の閑示. :: It has been proved that it has an activity of self-biquity, which is a kind of cocoon. Navel:, And by research using genetic modification, Synoviolin is a clause; It was found to be an essential molecule for carcinogenesis. However, self-Yubikichin of the Sino:::. Pio relationship between phosphorus there were many questions. .: ".: ■ Invention of invention.
5 ； 本発明は、 シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する物質を有効成分と して含む、 増殖性疾患、 神経系疾患及びァレルギ一性疾患からなる'群から選 ばれる少なくとも 1つの治療剤を提供する。  5; The present invention provides at least one therapeutic agent selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases, comprising as an active ingredient a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination. .
本発明者は、 上記課題を解決するために鋭意研究を行った。 そレて、 シノ ：ビオリン同士の直接的な相互作用であるホモ 4量体が形成されることにより、 10 シノビォリンのュビキチン化が起こることが確認され、 シノビォリンの酵素 : :活性（ &已 キチン^活性及 ¾質ュ キ:チシ化活性)を阻害す.,ることが、 : : 増殖个生疾患の治療に有用であることを見出し、 本発明を完成するに至った。 ： すなわち、 本発朋は以下のとおりである。 The present inventor has intensively studied to solve the above problems. It Te, Sino: By homotetramer Biorin a direct interaction with each other is formed, it is confirmed that Yubikichin of 10 Shinobiorin occurs, enzymes Shinobiorin: active (&已chitin ^ It has been found that it is useful for the treatment of proliferative individual diseases, and the present invention has been completed. : In other words, this is as follows.
( 1 ) シスビォリンの自己ュビキチンィ匕を阻害する物質を有効成分として含 15 む、 増殖性疾患、 神経系疾患及びァレ /レギー性疾患からなる群から選ばれる ： ..少なく とも : l の治療剤。  (1) selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases and allegy / reggie diseases, containing as an active ingredient a substance that inhibits cisbioline's self-ubiquitin: at least: therapeutic agent for l .
：シノ オリンの自己ュビキチン化は、 例えばシ ビオリン同士の相互作用 '. : により.生じるものを例示することがで る。 さら:に、 シノビオリン同士の相 . 作用と.：してほ、 シノピオリン胰貫通タンパク質めホモ 4量体の形成が挙げ 20 ちれる。 ここで、; シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害する物質は、 シノ Γふ; :？ オリシめ RING ^ドメインに結合することによ. 'り生じるも で:あ:っ^もよい。： シノビ^リ ンの自己ュビキチン化を阻害する物質とし τは、 変異型シノビォ リン及び/又は大腸菌由来タンパグ質などが挙げられる。.また、 増殖性疾患ど しては、 関節'症、 関節リウマチ、 線維症、 動脈硬化及び癌からなる群から選 .: Self Yubikichin of Sino Olin, for example interaction between sheet Biorin ':. By Ru De be exemplified those resulting.. Furthermore, the synoviolin-to-phase action can be attributed to the formation of a synopioline penetrating protein homotetramer. Where: the substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination is Sino-Gamma; Orishime RING ^ By binding to the domain. : As a substance that inhibits the self-ubiquitination of Synobilin, τ includes mutant Synoviolin and / or E. coli derived protein. Proliferative diseases are selected from the group consisting of arthropathy, rheumatoid arthritis, fibrosis, arteriosclerosis and cancer.
25 ばれる少な:く とも 1つが挙げられる。 神経系疾患としては、.アルツハイマー： 病、 パーキンソン病、 ハンチントン舞踏病、 末梢神経障害及び脊髄損傷かち . .なる群から選ばれる少なぐとも 1つが挙げられる。 ァレルギ一性疾患として 、 気管 ^喘 、、.ァレノレギー性鼻炎、 ア:レレギー ¾結膜炎、: . ピ:一性皮膚：. ： 炎、 アナフィラキシーショック、 ダニァレノレギ一疾車、 花粉症及び食物ァレ' ルギー疾患からなる群から選ばれる少なく とも 1つが挙げられる。 There are at least one. The nervous system disease includes at least one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy and spinal cord injury. As an allergic disease, trachea ^ asthma,. Allelenetic rhinitis, a: lelegy ¾ conjunctivitis,.: Pi: unisexual skin:.: Flame, anaphylaxis shock, danarenoregi single car, hay fever and food all ' At least one selected from the group consisting of ruby diseases.
( 2 ) シノ ビオリンの自己ュビキチン化を阻害する物質を患者に投与するこ とにより、 増殖性疾患、 神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群から選 ばれる少なく とも 1つを治療及び予防する方法。  (2) A method for treating and preventing at least one selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases, and allergic diseases by administering to a patient a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination.
ここで、 増殖性疾患としては、 関節症、 関節リウマチ、 線維症、 動脈硬化 及び癌からなる群から選ばれる少なくとも 1つが挙げられる。 神経系疾患と しては、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン舞踏病、 末梢神 経障害及び脊髄損傷からなる群から選ばれる少なく とも 1つが挙げられる。 アレルギー性疾患としては、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー性 結膜炎、 ア トピー性皮膚炎、 アナフィラキシーショ ック、 ダニアレルギー疾 患、 花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なくとも 1つ が挙げられる。  Here, the proliferative disease includes at least one selected from the group consisting of arthropathy, rheumatoid arthritis, fibrosis, arteriosclerosis and cancer. The nervous system disease includes at least one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy and spinal cord injury. The allergic disease includes at least one selected from the group consisting of bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylactic shock, tick allergic disease, pollinosis and food allergic disease. It is done.
( 3 ) シノビオリンに候補物質を接触させて候補物質がシノビオリンの自己ュ ビキチン化を阻害するか否かを評価し、 シノビオリンの自己ュビキチン化を阻 害した候補物質を増殖性疾患、 神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群か ら選ばれる少なく とも 1つの治療剤として選択することを特徴とする、 前記治 療剤のスク リーニング方法。 図面の簡単な説明  (3) The candidate substance is contacted with synoviolin to evaluate whether the candidate substance inhibits synoviolin self-ubiquitination, and the candidate substance that inhibited synoviolin self-ubiquitination is regarded as a proliferative disease, nervous system disease and A screening method for the therapeutic agent, wherein the therapeutic agent is selected as at least one therapeutic agent selected from the group consisting of allergic diseases. Brief Description of Drawings
図 1は、野生型及び C307S変異体の GSH-セファロース樹脂精製画分（GSH) 及び Ni-NTA ァガロース樹脂精製画分 （GSH/Ni) を 10% SDS-PAGEで分離 し、 CBB染色した図である。  Figure 1 shows the GSH-Sepharose resin purified fraction (GSH) and Ni-NTA agarose resin purified fraction (GSH / Ni) of wild type and C307S mutants separated by 10% SDS-PAGE and stained with CBB. is there.
図 2は、 GST、 GST-Syno ATM野生型あるいは C307S変異体の GSH-セフ ァロース樹脂精製画分（GSH)及び Ni-NTA ァガロース樹脂精製画分（GSH/Ni) を MBPあるいは MBP-Syno ATM-Hisと組み合わせて、 GSH セファロース樹 脂を用いたプルダウンァッセィを行ったことを示す図である。  Figure 2 shows GST, GST-Syno ATM wild-type or C307S mutant GSH-sepharose resin purified fraction (GSH) and Ni-NTA agarose resin purified fraction (GSH / Ni) as MBP or MBP-Syno ATM- It is a figure which shows having performed the pull-down assay using GSH Sepharose resin in combination with His.
図 3は、 トロンビン処理で得た Syno ΔΤΜ 野生型の Superdex 200カラム画 分を、 ウェスタンブロッ ト法及び銀染色法を用いて解析した図である。  Figure 3 shows the analysis of the Syno ΔΤΜ wild-type Superdex 200 column fraction obtained by thrombin treatment using Western blotting and silver staining.
図 4は、ダルタルアルデヒ ドを用いた架橋反応による Syno A TMオリゴマー . . の検出を行ったことを示す図である。 Figure 4 shows a Syno A TM oligomer by cross-linking reaction with dartal aldehyde It is a figure which shows having detected.
： 図 5:は.、 GST-Syno A TMと MBP-シノビオリン Δ TMとのイン—ビトロ結合活 性に必要なアミノ酸領域の決定に用いた欠失変異体を示す図である。  Figure 5: shows the deletion mutants used to determine the amino acid region required for in vitro binding activity between GST-Syno A TM and MBP-Synoviolin Δ TM.
図 6は、 GST-Syno Δ TM と MBP-シノビオリン Δ TM とのインビトロ結合 :5 : 活性に必荽なアミノ酸領域の^定を行ったことを示す図である。.  FIG. 6 shows that in vitro binding between GST-Syno ΔTM and MBP-Synoviolin ΔTM: 5: determination of the amino acid region essential for activity was performed. .
； 図 7ほ、 GST-Syno Δ ΤΜ と MBP-シノビオリン Δ ΤΜと インビトロ結合 ： . .活性における EDTAの影響を調べた図である。. ，.  FIG. 7 shows GST-Syno ΔΤΜ and MBP-Synoviolin ΔΤΜ and in vitro binding: FIG. 7 shows the effect of EDTA on activity. ,.
10 発明を実施するための最良の形態 '10 Best Mode for Carrying Out the Invention ''
;： ^発;明は、 · ·:シ :ビ;^リン:の a キ 化 阻害す 物質 .有効成 と.： . して含む、 増殖性疾患、 神経系疾患及びァレルギ一性疾患からなる群から選 . ： ばれる少なく:とも: 1つの治療.剤 （以下、 増殖性疾患等の治療剤と記載する場 合も'ある。 ）. に関する。 .また、 本発明 、 増殖性疾患、 神経系疾患及びァレ ;: ^ ;; light is: a substance that inhibits a-oxidation of ::: bi; ^-phosphorus: effective, consisting of: proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases Select from the group: at least: at least: 1 treatment. (Hereinafter sometimes referred to as treatment for proliferative diseases, etc.). Further, the present invention, proliferative disease, nervous system disease and array
15 . ルギー性疾患からなる群から選ばれる少なぐとも 1つの治療剤のスクリー二:： ： ..ング方法に関する。 以下に、 .本発明を詳細に説朋する。 15. Screening of at least one therapeutic agent selected from the group consisting of ruby disease ::. Hereinafter, the present invention will be described in detail.
' ·■〔 · .くシ入ピオリンの自己ュビキチシイ : ポモ 4量体形.成〉 '： ' :. '· ■ [- KushiIri Piorin of self Yubikichishii:.. Pomo 4 amount of body shape formed>': ':.
： ：举 ¾ ^の增. ¾性疾患等の治療剤ほ、 シノビォリンのき己ュビキチン化を阻 :: 20 : 寄.する,こと：を 徴:とする。 . . ::.举¾ ^ of增ho therapeutic agent such as ¾ diseases, inhibitory trees yourself Yubikichin of Shinobiorin:: 20:. Nearest to it: a butterfly: to. ..
Γ ·：: どォ:リ.:ン. は、. RA患者の：獪膜組織^発現:じているタンパク ¾τ?あり.、 .  Γ · :: doo: ri.: N. Is for RA patients: capsular tissue ^ expression: protein ¾τ?
RA 疾患の主因である滑膜組織の異常増 に密接に関連している。 また、 シ • ノビオリンは、 タンパク質構造予測システムから、 自己ュビキチン化活性が ある RINGフィンガーモチーフを有する Ε3ュビキチンヲィゲ スをコード： 25 することが分かっている。 シノビオリンをコ一ドする塩基配列を配列番号 1 ：で示し、 シノビォリンを構成するァ ノ酸配列を配列番号 2で示しだ。 . It is closely related to the abnormal increase in synovial tissue, which is the main cause of RA disease. Synoviolin is also known from the protein structure prediction system to encode Ε3 ubiquitin virus having a RING finger motif with self-ubiquitination activity. The base sequence for coding synoviolin is shown by SEQ ID NO: 1, and the anoic acid sequence constituting synoviolin is shown by SEQ ID NO: 2. .
「ュビキチン化」 とは.、 ュビキチン活性化酵素. : (E1) 、 ュビキチン結合酵 . ノ 率 （E:2) .及び ビキチンリガーゼ . (E3) などの酵素が協同し 基質とな · ：：るタンパ.'タ ¾にュビキチンを次々と結合 せていく過程を意味す.る。 ごの^ ' ： ビキチン化の生理的意義は、 従来、' プロテオソーム系のタンパク質分解機構 へ送られるためのタグ修飾として認識されていた。 そして、 そ 後の研究に より、 現時点でのュビキチン化の意義は、 タンパク質機能を制御する可逆的 タンパク質修飾システムとして位置づけられている。 "Ubiquitination" refers to ubiquitin-activating enzyme: (E1), ubiquitin-conjugating enzyme, rate (E: 2 ), and biquitin ligase (E3), etc. Tampering means the process of combining ubiquitin one after another. Gono ^ ': The physiological significance of biquitination has traditionally been recognized as a tag modification for delivery to the proteosomal proteolytic machinery. In subsequent studies, the significance of ubiquitination at present is positioned as a reversible protein modification system that controls protein function.
本明細書において 「自己ュビキチン化」 とは、 シノビォリンがュビキチン リ ーゼ活性を有することにより、 シノビオリン自体がュビキチン化の基質 タンパク質となり、 他のュビキチンリガーゼによることなく 自らュビキチン を結合させることを意味する。 また、 シノビォリンの自己ュビキチン化は、 内在性のシノビオリンの完全長の分子で観察されるだけでなく、 シノビオリ ンの細胞内部分のみとタグタンパク質の融合したシノビオリンにおいても生 起される。  In this specification, “self-ubiquitination” means that synoviolin itself has a ubiquitin lyase activity, so that synoviolin itself becomes a substrate protein for ubiquitination and binds ubiquitin by itself without any other ubiquitin ligase. To do. Synoviolin self-ubiquitination is not only observed in the full-length molecule of endogenous synoviolin, but also occurs in synoviolin in which only the intracellular part of synoviolin and the tag protein are fused.
このように、 シノビオリンは、 その基質タンパク質に対してュビキチンを 付加する反応を触媒する酵素であり、シノビオリンのュビキチン化反応には、 RING ドメインにおける、 シノビオリン同士の直接的な相互作用が重要であ る。 以下に、 組換えシノビオリン同士の相互作用の生化学的な解析による、 シノビオリンの自己ュビキチン化反応を分子レベルで説明する。  Thus, synoviolin is an enzyme that catalyzes the reaction of adding ubiquitin to its substrate protein, and direct interaction between synoviolins in the RING domain is important for synoviolin ubiquitination. . The following describes the synoviolin self-ubiquitination reaction at the molecular level by biochemical analysis of the interaction between recombinant synoviolins.
シノビオリンと変異型シノビオリン又は大腸菌由来タンパク質などの夾雑 タンパク質との間に、 相互作用が存在し、 それには、 RING ドメインが関与 する。 このことを確認するためには、 以下の方法を用いることができる。 す なわち、 N末端に GSTタグ、 C末端に Hisタグが付加されたシノビオリン の膜貫通ドメイン欠失領域 （Syno ATM) 野生型 （wt) 、 及び RING ドメイ ンに変異を有する変異体、例えばシノビオリンのアミノ酸配列において第 307 番目のシスティンがセリ ンに変異した変異体 （C307S変異体） をそれぞれ作 製する。  There is an interaction between Synoviolin and contaminating proteins such as mutant Synoviolin or E. coli-derived proteins, which involve the RING domain. To confirm this, the following method can be used. In other words, synoviolin transmembrane domain deletion region (Syno ATM) wild type (wt) with GST tag at the N-terminus and His tag at the C-terminus, and mutants with mutations in the RING domain, eg, synoviolin In this amino acid sequence, mutants in which the 307th cysteine is mutated to serine (C307S mutant) are prepared.
これらについて、 GSH レジンによる精製後に Ni-NTA レジンによる精製 を行い、 精製度の変化を観察すればよい。 この方法によれば、 野生型について、 GSH レジンによる精製後に Ni-NTA レジンによる精製を行っても、 精製度の変化は認められないにも関わらず、 ― . C307S変異体は、 大きな精製度の上昇が認められる。 For these, purify with Ni-NTA resin after purification with GSH resin, and observe the change in purity. According to this method, even though the wild type was purified with GSH resin and purified with Ni-NTA resin, no change in the purity was observed. -The C307S mutant shows a significant increase in purity.
：: まだ、. 上記のとおりシノビォリンのュビキチン化反応は、 以下のように確 ， 認することもできる。 ■  :: Still. As described above, the synoviolin ubiquitination reaction can also be confirmed as follows. ■
すなわち、 亜鉛イオンの配位を除去して RING ドメインの機能を阻害した . 5 ： ときに、 シノ ビォリン同士で相互作用が起こるか否かを検出すればよい。 亜ノ ；鉛ィォンを除去するには、 EDTA等のキレート剤を用いることができ.る。 こ のよう.なキレー小剤存在下でプルダウンアツセィを行うことにより、 その:ァ ッセィ結果から.シソピオリン同士の相互作用の有無を観察することができる。  That is, the coordination of zinc ions was removed to inhibit the function of the RING domain. 5: Sometimes it is only necessary to detect whether or not synoviolins interact with each other. To remove lead ions, chelating agents such as EDTA can be used. By performing a pull-down assay in the presence of such a cleansing agent, it is possible to observe the presence or absence of interaction between the sosopiolines from the assay results.
10 ここで、 シノビオリンと、 変異型シノビオリン又は大腸菌由来タンパク質 と：の^互作甩は : : .^キチン ¾活性 .自己 ビ^チ.:：, : ノ ン化が,阻害されることになる。; . 10 Here, synoviolin and mutant synoviolin or protein derived from E. coli are:: .. chitin ¾ activity. Self-biotics ::,: non-inhibition is inhibited. . ;.
： このことを確認するためには、 それらの精製画分の自己ュビキチン化活性 を比較すればよい。 この方法によれば、..野^型については大きな変化は見ら 15 れないが、 C307S変異体については、 : GSH精製画分に自己ュビキチン化活.: 性が検出ざれなかったにも関わらず、 GSH/Ni精製画分 弱いながらも活性 ： 力検出:される。 GSH/Ni精製画分に活性が検出ざれることは、 GSH精製画分 ： ； ' に共存して：レ、たシノ ビ.:^リ ン 分解産物あるいは大腸菌由来たんぱく質が C307 &変異体と相互作用し、 自己ュビキチ^化 阻害することを意味する.。 , 20 さちに、 シノビォリン同士の直接的な結合を MBP Syno ΔΤΜ-Hisとのプ :: リ :ンァ セ により解析す:るこ ;とおでき:る:。:. ΓΜΒΡ-Syno ΔΪ -Hisj と ： .は、 N耒に MBPタグ、 C末に Hisタグ.が付加ざれたシノピオリンの膜貫通 . ： ドメイン欠失領域 (Syno Δ ΤΜ)を意味する。 野生型については、 両画分によ り同程度の MBPrSyno ATM-Hisの沈降がみられる。 一方、 C307S変異体に： 25 ついては、 GSH精製画分ではほとんど MBP-Syno ΔΤΜ-Hisの沈降が検出ざ '. ： れないにも関わらず、 GSH/Ni精製 I 分を用いた場合は、 わずかに沈降が認 . めちれる。 このことは、 C307S変異によりシノビオリン同: tの相互作用が弱 まり、:夾雑タンパク質と:の弱い相 S作用 影響がュ キチン化^応に阻害的:' に働いていること、. また、 夾雑ダンパク寳 除がれるこどによ::15不完全では ： あるがシノビオリン同士の相互作用が復帰し、 反応に適した構造をとること を示すものである。 : To confirm this, the self-ubiquitination activity of the purified fractions should be compared. According to this method, .. field ^ but large changes are not mirror 15 for the mold, for C307S mutant: Self Yubikichin Kakatsu to GSH purified fractions:. Property though not play detection GSH / Ni purified fraction Weak but active: Force detection: No activity is detected in the GSH / Ni purified fraction, coexisting with the GSH purified fraction:; ': Le, tainobi.:^phosphorine degradation products or E. coli-derived proteins interact with C307 & mutants. It means acting and inhibiting self-ubiquitination. , To 20 Sachi, up :: Li with a direct coupling between the Shinobiorin MBP Syno ΔΤΜ-His: be analyzed by Na Se: Turkey; and can you: Ru:. :. ΓΜΒΡ-Syno ΔΪ-Hisj and: means transmembrane domain of synopioline with MBP tag at N 耒 and His tag at C-end.: Domain deletion region (Syno Δ ΤΜ). For the wild type, the same amount of MBPrSyno ATM-His sedimentation is observed in both fractions. On the other hand, for the C307S mutant: 25, almost no precipitation of MBP-Syno ΔΤΜ-His was detected in the GSH-purified fraction. Sedimentation is observed. This is because the C307S mutation weakens the synoviolin interaction: t, weak protein: and weak phase S action influences on ubiquitination and inhibition: '. Dampaku に よ According to the child to be removed :: 1 5 Incomplete: However, it shows that the interaction between Synoviolins is restored and a structure suitable for the reaction is taken.
さらに、 シノビオリンはホモ 4量体を形成している。 このことを確認する ためには、 Syno Δ ΤΜ 野生型をゲルろ過カラムで分画し、 その分子量を測 定すればよい。 Syno Δ ΤΜ の計算上の分子量は約 40,300であるので、 Syno 厶 が約.180kDaの位置に溶出すれば、 Syno A TMは、 ホモ 4量体を形成 しているといえる。 以上の解析手法は、 シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する物質をス クリーニングするために採用することができる。  In addition, Synoviolin forms a homotetramer. In order to confirm this, it is only necessary to fractionate the Syno Δ 野生 wild-type using a gel filtration column and measure the molecular weight. Since the calculated molecular weight of Syno Δ 約 is about 40,300, Syno A TM can be said to form a homotetramer if Syno 溶出 elutes at a position of about 180 kDa. The above analysis method can be employed for screening substances that inhibit synoviolin auto-ubiquitination.
例えば、 シノビォリンに候補物質を接触させて、 当該候補物質がシノピオ リンの自己ュビキチン化を阻害するか否かを評価する。 シノビォリンの自己 ュビキチン化を阻害した候補物質は、 増殖性疾患等の治療剤として選択する ことができる。 上記 C307S変異体、 あるいは後述する大腸菌由来タンパク質 などは、シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する物質として選択される。 また、 シノビオリンを分泌する細胞に候補物質を接触させて自己ュビキチン 化を測定することもできる。 自己ュビキチン化が起こったか否かを確認する 方法としては、 シノビオリン同士の相互作用を測定することが挙げられる。 シノビオリン同士の相互作用を測定する方法として、 シノビオリンの 4量体 形成を確認する方法が挙げられる。 4量体形成は、 上記のように、 分子量を 測定することにより確認できる。 例えば、 シノビオリンタンパク質をゲルろ 過カラムで分画し、 その分子量を測定すればよい。 また、 異なるタグをつけ たシノビオリンを調製して細胞内で発現させて、 タグの存在を確認すること によっても、 シノビォリ ンの相互作用を測定することもできる。 この場合、 1つのタンパク質から複数のタグの存在が見出された場合に、 シノビオリン の相互作用が起こったといえる。  For example, a candidate substance is contacted with Synoviolin to evaluate whether the candidate substance inhibits synopioline self-ubiquitination. Candidate substances that inhibit synoviolin auto-ubiquitination can be selected as therapeutic agents for proliferative diseases and the like. The C307S mutant or the E. coli-derived protein described later is selected as a substance that inhibits synoviolin auto-ubiquitination. Self-ubiquitination can also be measured by contacting a candidate substance with a cell that secretes synoviolin. A method for confirming whether or not self-ubiquitination has occurred is to measure the interaction between synoviolins. An example of a method for measuring the interaction between synoviolins is a method for confirming the formation of synoviolin tetramers. Tetramer formation can be confirmed by measuring molecular weight as described above. For example, synoviolin protein may be fractionated on a gel filtration column and its molecular weight measured. Synoviolin interaction can also be measured by preparing synoviolin with different tags and expressing them in cells to confirm the presence of the tag. In this case, it can be said that synoviolin interaction occurred when multiple tags were found in one protein.
<シノビオリンの自己ュビキチン化を阻害する物質〉 <Substances that inhibit synoviolin self-ubiquitination>
上記のように、 シノビオリンの自己ュビキチン化のメカニズムの特徴とし . ては、 シノビォリンがホモ 4量体を形成する：ことである。 従って、 このシノ '.: : ビオリ:ンのホモ 4 量体の形成を阻害することにより、シノピオリンの自己ュ . ビキチン化を阻害することができる。 As mentioned above, the mechanism of synoviolin self-ubiquitination For example, Synoviolin forms a homotetramer: Therefore, the Sino ':.: Biori: by inhibiting the formation of homo-tetramer of emissions, it is possible to inhibit self-Interview Bikichin of Shinopiorin..
シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害する候補物質としては、 特に限定 ■•5 されるもめではなく、 天然又は入ェ的に合成されたペプチド、 タンパク質、 . :；核酸 (D A, RNA等).、ォリゴヌクレオチド (siRNA等)、ぺプチド核酸 (PNA)，. Candidate substances that inhibit synoviolin self-ubiquitination are not limited to the following: • Naturally or artificially synthesized peptides, proteins,. : ; Nucleic acids (DA, RNA, etc.) Rigonucleotide (siRNA, etc.), peptide nucleic acid (PNA),.
/ あるいは低分子又は高分子有機化合物等を例示することができる。  / Or a low molecular or high molecular organic compound etc. can be illustrated.
上記したように、シノビォリンと相互作用しうる変異型シノビオリンあるい は大腸菌由来タンパク質などの夾雑タンパク質は、 シノビオリンの自己ュビ 10 キチン化を阻害する物質として選択される。  As described above, a mutated synoviolin that can interact with synoviolin or a contaminating protein such as a protein derived from E. coli is selected as a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination.
：: ：こ で、 夾雑 ^ノ ク質とは 完全長 ； ゼォリンあるレ、:は完全長の.シノ : ォリン細胞質領域以外のタンパク質をいう。  ：: ： Contamination ^ Nortex is full-length; zeolin is, and: is full-length. Sino: Protein other than oline cytoplasmic region.
： . . 変異型シノビオリンとは、 完全長シノピオリンのタンパク質分解酵素によ る分解産物あるいはシノビオリンタンパグ質合成途上で生じる C末^欠損べ 15 プチドをいう。 例えば、 シノビオリンのアミノ酸配列 （配列番号 2 ) におい :  :. Mutant Synoviolin refers to a C-terminal-deficient peptide produced during the synthesis of a full-length Synopioline proteolytic enzyme or Synoviolin protein. For example, the amino acid sequence of Synoviolin (SEQ ID NO: 2) smells:
_ て第 339〜第 617番目のアミノ酸残基が欠失したペプチドが挙げられるがこ:： ：:： れらに:嗎:定されない。  _ The peptide from which the 339th to 617th amino acid residues are deleted is mentioned here.
' 大腸菌由来タンパク質とは、 シノビ^リンタ パグ質以外 タンパク質で ：二あって Vシノビオリンに相互作用:することで *に精製されてくる大腸菌のタ :： 20… ンパク質をレ、う ό . 'The E. coli-derived protein, Shinobi ^ printer pug quality than in the protein: Two there is interaction in V synoviolin: purified to be in * to come of E. coli data:: 20 ... Les the protein, cormorants ό.
'く増殖性疾患等の治療剤〉 . 'Treatment for proliferative diseases, etc.>
シノビォリンのュビキチン化反応には、 シノビオリン同士の直接的な相互 作用が重要であるため、 その直接的な相互作用を阻害する薬剤である本発明： 25 の薬剤は、 シノビオリン酵素活性阻害に基づいた増殖性疾患、 神経系疾患友 : ぴアレルギー性疾患からなる群から選ばれる少なく とも 1つの治療 として . 有用である。 , Since the direct interaction between synoviolins is important for the synoviolin ubiquitination reaction, the present invention, which is a drug that inhibits the direct interaction of the present invention: 25 drugs are based on the inhibition of synoviolin enzyme activity. Sexually ill, Nervous system friend : Useful as at least one treatment selected from the group consisting of allergic diseases. ,
. ( 1 ) :堉殖性疾患と.:は、 上記の::よ :う.に:細胞 異常增殖が原因^宪症する疾 :· 患をいい、 ^えば、 関節リ ウマチ、 ^維症、 動脈硬化又は'癌な. が挙げられ るが、 これらに限定されるものではない。 (1) : With fertility disease .: Above :: Yo : U .: Cell Abnormal growth caused by abnormal growth : · Diseases, for example, rheumatoid arthritis, ^ fibrosis Atherosclerosis or 'cancerous'. However, it is not limited to these.
関節症とは、関節を侵す疾患であり、糖尿病に見られる神経障害性関節症で ある糖尿病性関節症、 ジャクー関節症、 変形性関節症、 脊髄ろう性関節症な どが挙げられるが、 これらに限定されない。  Arthropathy is a disease that affects the joints and includes the neuropathic arthropathy that is found in diabetes, such as diabetic arthropathy, Jaku arthritis, osteoarthritis, and spinal spondyloarthropathy. It is not limited to.
RA は、 関節の滑膜組織に異常な増殖が見られる全身性の炎症性疾患である。 滑膜細胞 （synovial cell) は、 関節の滑膜で 1〜 6層の上皮様層を形成する繊維 芽細胞様の細胞であり、滑液にプロテオグリカンゃヒアル口ン酸を供給するもの とされている。 RA患者の関節では、 滑膜組織の増殖、 その結果として引き起 こされる多層構造、 滑膜細胞の他の組織への浸潤といったような症状が観察 される。 しかしながら、細胞の増殖性疾患のひとつとして考えられている RA の病因は、 未解明のままである。 また、 現在、 市販されている RA治療薬の うち、 ステロイ ド薬、 非ステロイ ド薬は、 いずれも効果は一時的で関節の痛 みや腫れは抑えられても、 RA 自体が治癒することはまれである。 また、 抗 リウマチ薬は、 RA を劇的に改善するものの、 副作用に留意して使用する必 ' 要がある。 本発明の増殖性疾患等の治療剤は、 細胞の増殖の抑制をも特徴と するものであり、 不完全長のシノビオリン等を有効成分とするため、 副作用 がなく、 RA治療薬として好ましい。  RA is a systemic inflammatory disease with abnormal growth in the synovial tissue of the joint. Synovial cells are fibroblast-like cells that form 1 to 6 epithelial-like layers in the synovium of the joint, and are considered to supply proteoglycans and hyaluronan to synovial fluid. Yes. Symptoms such as synovial tissue proliferation, the resulting multilayered structure, and infiltration of synovial cells into other tissues are observed in the joints of RA patients. However, the etiology of RA, which is considered as one of cell proliferative diseases, remains unclear. In addition, among the currently available RA treatments, steroids and non-steroids are both temporary and rarely cure RA even if joint pain and swelling are suppressed. It is. In addition, antirheumatic drugs dramatically improve RA, but should be used with attention to side effects. The therapeutic agent for proliferative diseases and the like of the present invention is also characterized by suppression of cell growth, and since it has an incomplete length of synoviolin or the like as an active ingredient, it has no side effects and is preferable as an RA therapeutic agent.
線維症とは、器官や組織の正常な成分である線維組織の形成とは対照的に、 修復又は反応過程として線維組織が形成される疾患をいい、 先天性線維症、 囊胞性線維症、 心内膜線維症、 間質性線維症、 肺線維症、 軟膜線維症、 縦隔 線維症、 結節性表皮下線維組織増殖症、 口腔粘膜下線維症、 中心静脈周囲線 維化、 パイプ軸線維症、 置換性線維形成、 後腹膜線維症、 外膜下線維症、 シ ンマーズ線維症、 アフリカ心内膜線維症などが挙げられるが、 これらに限定 されない。  Fibrosis refers to a disease in which fibrous tissue is formed as a repair or reaction process, as opposed to the formation of fibrous tissue, which is a normal component of organs and tissues. Congenital fibrosis, cystic fibrosis, heart Endometrial fibrosis, interstitial fibrosis, pulmonary fibrosis, puffy fibrosis, mediastinal fibrosis, nodular subepidermal fibrosis, oral submucosal fibrosis, central venous fibrosis, pipe axis fibrosis Replacement fibrosis, retroperitoneal fibrosis, subepicardial fibrosis, Simmers fibrosis, African endocardial fibrosis, and the like, but are not limited thereto.
動脈硬化とは、 動脈が固くなる現象をいい、 ァテローム性動脈硬化症、 m0nckeberg動脈硬化症、 細動脈硬化症などが挙げられるが、 これらに限定 されない。  Arteriosclerosis is a phenomenon in which the arteries become hard, and includes, but is not limited to, atherosclerosis, m0nckeberg arteriosclerosis, arteriosclerosis.
癌とは、 様々な悪性新生物の総称であり、 脳腫瘍、 舌癌、 咽頭癌、 肺癌、 乳 癌、 食道癌、 胃癌、 膝臓癌、 胆道癌、 胆嚢癌、 十二指腸癌、 大腸癌、 肝癌、 子 .宫癌、 卵巢癌、 前立腺癌、 腎癌、膀胱癌、 横紋筋肉腫、 線維肉腫、 骨肉腫、.軟 ： · :：骨肉腫、.皮膚瘁、.各種白血病. (例えば急性骨髄性.白血病、急性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型 T細胞白血病、悪性リンパ腫）、 などが挙げられるが、 これらに限定されなレ、。。上記癌は、原発巣であっても、Cancer is a collective term for various malignant neoplasms, such as brain tumor, tongue cancer, pharyngeal cancer, lung cancer, breast cancer, esophageal cancer, stomach cancer, knee cancer, biliary tract cancer, gallbladder cancer, duodenal cancer, colon cancer, liver cancer, Child Vaginal cancer, egg yolk cancer, prostate cancer, renal cancer, bladder cancer, rhabdomyosarcoma, fibrosarcoma, osteosarcoma, soft: · : osteosarcoma, skin fistula, various leukemias (eg acute myeloid. Leukemia, acute lymphoblastic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic lymphocytic leukemia, adult T-cell leukemia, malignant lymphoma), and the like. . Even if the cancer is the primary lesion,
5 : 転移したものであっても、 他の疾患と併発したものであっても い。 5: It may have metastasized or be associated with other diseases.
：. 筠抑剁遺伝子として V - p53が知られている。 正常細胞を紫外線等にさらす 、 細胞内の p53 が活性化じて、 その結果細胞増殖が阻止されることかち、 p53の濃度を上昇させることにより、 癌細胞の増殖を止めることができる。' 事実、 p53は IE常な個体の細胞にはほとんど見られないが、 癌患者由来の細 10 胞の約半数においてはこの p53の欠損変異が起こっている。 また、 このよう 変異が起こつ ¾ な^場合で;も. .. ^ :め制御機構 何 かの ¾異が生 :て.: : 癌抑制機能が失われている。 したがって、 癌の進行を抑えるには p53を有効 , に機能させる：ことが必要である。 発明者らは 前、 シノビオリンホモノック： ァゥト ¾物を作製し、. シソピオ ンの機能を阻害す.ると、 アポトーシスに深 15 く関与している p53の ¾性化が促進ざれ、 シノピオリンの機能阻害が癌神制: ： につながること.を見出した。本発明の増殖性疾患等の治療剤は、自己^ビキチ .；；■ ン化を:阻害することにより、 シノピオ:リンの機能を阻害し、 3の活性化を ::ノ ' . 促進ざせる:こと^できるため、 抗癌剤 しても有用である。 :: : V-p53 is known as a depression gene. When normal cells are exposed to ultraviolet rays or the like, p53 in the cells is activated, and as a result, cell growth is inhibited. By increasing the concentration of p53, the growth of cancer cells can be stopped. 'In fact, p53 is rarely found in cells of normal IE individuals, but about half of the 10 cells from cancer patients have this p53 deletion mutation. In addition, such mutations One Oko ¾ a ^ in the case; also .. ^:.. Because control mechanism what Kano ¾ different raw: Te:: tumor suppressor function has been lost. Therefore, to suppress the progression of cancer, it is necessary to make p53 function effectively. The inventors previously made a Synoviolin homonoc: xamp product and inhibited the function of Sisopione, which promotes the characterization of p53, which is deeply involved in apoptosis, and the function of Synopioline. I found that inhibition leads to the cancer deity. Therapeutic agents such as proliferative diseases of the present invention, self-^ Bikichi ;; ■ down the:., By inhibiting, Shinopio:. Inhibit the function of phosphorus, :: Roh 'promote the activation of 3 The Cell : Because it can, it is also useful as an anticancer agent. ::
. （2 ) . : 神経某疾患は、 神経の障害、 外傷に起因する疾患であり、 ァルツ ： 20: : ' イマ一病: .パーキン.ジン病、 ハンチントジ舞踏病:、 末梢神経障害及び脊髄 に:: リ損翁な：どが;挙げ れる^、 これらに限定されなレ: ； ： . (2):. Neurological certain diseases, neurological disorders, a disease caused by trauma, Arutsu: 20:: 'one more disease:.. Perkin Gin disease, Hanchintoji chorea:, peripheral neuropathy and spinal cord :: 翁 翁 ：: ど;; 挙 げ 挙 げ な な さ れ さ れ:
、ンノ ビォリ ンは、 小胞体ス トレスによつて発現が誘導される Herp (homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1)とよばれるタンパク質と相互作用を有する： 25 ことが知られている ( Kokame K, Kato H, Miyata T. Homocysteine - respondent Genes in Vascular Endothelial ■— Ceils Identified by Differential: Displa Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22； 271(47): 29659- 665) : Her は、 家族桂ァノ ッ,、イ 一病 (FAD) ·め^因遺伝子と されて:ぃるプレセニリン. (PS) と相互作 を :もち ]3 -ァミロィ タ パク質: (Α· β ) の膜内切断に関わるタンパク質分解酵素である γ -セク レターゼ -secretase ) の活'性を上昇させる （ Sai X， Kawamura Y， Kokame K, Yamaguchi H, Shiraishi H, Suzuki R, Suzuki T, Kawaichi M, Miyata T, Kitamura T, Strooper BD, Yanagisawa K, Komano H. J. Biol. Chem. 277(15):12915-12920) 。 ところで、 セクレターゼの酵素活性を阻害する物 質は.、 アルツハイマー病等の神経系疾患の治療薬として注目され、 世界中で スク リーニングが行われている。 従って、 シノ ビォリ ンの相互作用を阻害す るような物質は、 セクレターゼ阻害剤の感受性を促進するため、 ァルツハイ マー病等の神経系疾患の治療剤として、 好ましい。 Nnoviolin interacts with a protein called herp (homocysteine-indusible endoplasmic reticulum stress-indusible ubiquitin-like domain member 1) whose expression is induced by endoplasmic reticulum stress: 25 (Kokame K, Kato H, Miyata T. Homocysteine-respondent Genes in Vascular Endothelial ■ — Ceils Identified by Differential: Displa Analysis. J. Biol. Chem. 1996 Nov 22; 271 (47): 29659-665): Her Is a family gene, a single disease (FAD) and is considered to be a causative gene: il presenilin. (PS) interacts with : mochi] 3 -Amyloprotein: (Α · β) increases the activity of γ -secretase -secretase), a proteolytic enzyme involved in intramembrane cleavage (Sai X, Kawamura Y, Kokame K, Yamaguchi H, Shiraishi H, Suzuki R, Suzuki T, Kawaichi M, Miyata T, Kitamura T, Strooper BD, Yanagisawa K, Komano HJ Biol. Chem. 277 (15): 12915-12920). By the way, substances that inhibit the enzyme activity of secretase are attracting attention as therapeutic agents for nervous system diseases such as Alzheimer's disease and are being screened all over the world. Therefore, a substance that inhibits the interaction of synoviolin is preferable as a therapeutic agent for nervous system diseases such as Alzheimer's disease because it promotes the sensitivity of the secretase inhibitor.
( 3 ) アレルギー性疾患は、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー 性結膜炎、 ア トピー性皮膚炎、 アナフィラキシーショ ック、 ダニアレルギー 疾患、 花粉症及び食物アレルギー疾患などが挙げられるがこれらに限定され ない。 本発明者らは、 以前シノビォリンへテロノックアウト動物を作製し、 詳細に解析したところ、 野生型に比して IL-4及び IgEの産生が抑制される ことを見出した。 すなわち、 シノビォリンの機能を阻害すると、 アレルギー 性疾患に深く関与している IL-4及び IgE の産生が抑制され、 シノビオリン の機能阻害がアレルギー性疾患治療につながることを見出した。 従って、 シ ノピオリンの相互作用を阻害するような物質はァレルギ一性疾患の治療剤と して好ましい。  (3) Allergic diseases include but are not limited to bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylactic shock, tick allergic disease, pollinosis and food allergic disease. . The present inventors previously generated a Synoviolin hetero knockout animal and analyzed it in detail, and found that IL-4 and IgE production was suppressed as compared to the wild type. That is, it was found that inhibition of synoviolin function suppresses the production of IL-4 and IgE, which are deeply involved in allergic diseases, and inhibition of synoviolin function leads to treatment of allergic diseases. Therefore, a substance that inhibits the interaction of synopioline is preferable as a therapeutic agent for allergic diseases.
( 4 ) 本発明の増殖性疾患等の治療剤を使用する場合は、 適用部位は特に 限定されず、 血管、 関節、 皮膚、 目、 鼻、 腫瘍等を対象として適用される。 また、本発明において、上記疾患の種類は 1種類に限定されるものではなく、 複数種の疾患が併発したものでも、 適用の対象となる。  (4) When the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention is used, the application site is not particularly limited, and it is applied to blood vessels, joints, skin, eyes, nose, tumors and the like. Further, in the present invention, the type of the disease is not limited to one, and even a combination of multiple types of diseases is applicable.
本発明の増殖性疾患等の治療剤は、 異常な細胞の増殖を抑制する必要があ る哺乳動物にも投与することができる。投与の対象となる哺乳動物としては、 例えばヒ トのほか、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 ャギ等の家畜、 ィヌ、 ネコ等の愛 玩動物、 マウス、 ラッ ト、モルモッ ト、 ゥサギ等の実験動物が挙げられるが、 これらの動物に限定されるものではない。  The therapeutic agent for proliferative diseases and the like of the present invention can also be administered to mammals that need to suppress abnormal cell growth. Mammals to be administered include, for example, humans, domestic animals such as horses, horses, hidges, goats, pets such as dogs, cats, mice, rats, guinea pigs, rabbits, etc. However, it is not limited to these animals.
本発明の増殖性疾患等の治療剤の投与形態は、 経口、 非経口投与のいずれ ,でも可能で.ある。 経口投与の場合 、 例えば錠剤、 カプセル剤、 顆粒剤、： 散 ； V： : :剤もしくはシロ プ剤等による投与が可能である。 非経口投与 場合は、 ¾ 射剤、 座剤もしくは点眼剤等、 経肺剤型 (例えばネフライザ一などを用いたも の)、経鼻投与剤型、経皮投与剤型 (例えば軟膏、クリーム剤)等が挙げられる。 5 ： 注射剤型の場合は、 例えば点、滴等の静脈内注射、 筋肉内注射、 腹腔内注射、 . : :■ ：皮下注射等により全身又-は局部的に投与することができる。'これらの製剤は、 . ' . . .賦形剤、. 滑沢剤、.結合剤、 崩壊剤、 安定剤、 矯味矯臭剤、. 希釈剤などの ¾薬 上許容される添加剤を用いて周知の方法で製造される。 ' The dosage form of the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention is either oral or parenteral. But it is possible. For oral administration, such as tablets, capsules, granules,: dispersion; V::: agent or is capable of administration by white-flop agent. For parenteral administration, sprays, suppositories, eye drops, etc., pulmonary dosage forms (for example, those using nephriser, etc.), nasal dosage forms, transdermal dosage forms (for example, ointments, creams) ) And the like. 5: In the case of injection form, it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection of dots, drops, etc., intramuscular injection, intraperitoneal injection,. 'These preparations are made using pharmaceutically acceptable additives such as excipients, lubricants, binders, disintegrants, stabilizers, flavoring agents, and diluents. It is manufactured by a known method. '
： ： 賦形剤としてば、 例えば、 バレイショデンプン、 トウモロコシデンプン等 10 のデンプン、 乳糖、 結晶セルロース、 リン酸水素カルシウム等を挙げること :，:ノ: . :でき:る。' '::： :: If as excipients, for example, potato starch, starch corn starch 10, lactose, crystalline cellulose, and calcium hydrogen phosphate, etc.:,: Bruno:.: Can: Ru. '':::
+ ノ 滑沢斉 U. (コーティング剤） としては、 例えば、 ェチルセルロース、 ドロ キシプロピルセルロース、ヒ ドロキシプロピノレメチノレセルロース、セラック、 タルク、 カルすゥバロウ、 パラフィン等を挙げることができる。  + Norizawa Sai U. (Coating Agent) includes, for example, ethyl cellulose, droxypropyl cellulose, hydroxypropinoremethinolecellulose, shellac, talc, calsuba wax, paraffin and the like.
: 15 ... 結合剤としては、 例えばポリビュルピ口リ ドン、:マクロゴール及び前記賦. '： ： :' ,形剤と同様の化合物を挙げることができる。： 、 : : 15 ... Examples of the binder include polyburpi-glyphidone,: macrogol and the above-mentioned compound. :,:
/崩壊剤としては、 例えば前記賦形剤::と同様の化合物及びグロスカルメロ一 ' V ズナトリゥム、 カノレポキシメチルスターチナトリゥム、 架檫ポリビニルピ  / Disintegrants include, for example, the same compounds as in the excipient :: Gross Carmelo 'V zunatrium, canolepoxymethyl starch sodiumtrim,
リ :ドン等の化学修飾されたデンプン .セルロース類を挙げることができる。. Li: Chemically modified starch such as dong. Cellulose. .
： 安定剤 .しては、 例えばメチルパラベン、 プロピルパラベン等のパラォキ: Stabilizers such as methylparaben, propylparaben, etc.
：:、ン E香酸 ズ ル類； ク口ロブタノ一ノレ、 ベ^ジルァルゴ—ル、 . 工 ル ェチルァノレ "ル等のアルコール類 ；塩ィヒベンザルコニゥム ； 7エノ一ル、 クレゾール等のフエエノール類が挙げられ、 さらに、 チメロサール；デヒ ド 口酢酸；及びソルビン酸を挙げることができる。 ：:, N E perfume acid; Kubota butanol, Nozil gorgool, Alcohol, etc .; Le cetylanol, etc .; Salt benzalkonium; 7 Enol, cresol, etc. Examples include phenols, and thimerosal; dehydrated acetic acid; and sorbic acid.
25 矯眛矯臭剤としては、 例えば通常使用される、 甘味料、 酸味料、 香料等を ：挙げることができる。 ―  25 Examples of flavoring agents include, for example, commonly used sweeteners, acidulants, and fragrances. -
. また、 液剤を製造す.るための溶媒としては、 エタフール、. .フエノール、 ク 'ロロク'レゾ—レ、. 精製水、 蒸留水等 ¾r使用:する.ことができ 。: ^.  In addition, as a solvent for producing a liquid agent, ethafur, .phenol, chlorol resole, purified water, distilled water, etc. can be used. : ^.
：： 界面活性剤又は乳化剤としては、 例えば、 ポリソルベー ·ト 80、ステアリン 酸ポリォキシル 40、 ラウロマクロゴール等を挙げることができる。 :: Surfactants or emulsifiers include, for example, polysorbate 80, stearin Polyoxyl 40, Lauromacrogol, etc. can be mentioned.
上記添加物等は、 本発明の増殖性疾患等の治療剤の剤型に応じて上記の中 から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる。 例えば、 注射用製剤として使用 する場合、 精製された本発明の有効成分を溶剤 (例えば生理食塩水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等）に溶解し、 これに Tween 80、 Tween 20、 ゼラチン、 ヒ ト血 清アルブミン等を加えたものを使用することができる。 あるいは、 使用前に 溶解する剤形とするために凍結乾燥したものであってもよい。 凍結乾燥用賦 形剤としては、 例えば、 マンニトール、 ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を 使用することができる。  The above additives and the like are selected from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention. For example, when used as an injectable preparation, the purified active ingredient of the present invention is dissolved in a solvent (for example, physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.), and then Tween 80, Tween 20, gelatin, human blood What added clean albumin etc. can be used. Alternatively, it may be freeze-dried to obtain a dosage form that dissolves before use. As an excipient for freeze-drying, for example, sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose can be used.
本発明の増殖性疾患等の治療剤の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、 投与回数、 剤型によって異なる。 投与方法は、 患者の年齢、 症状により適宜 選択する。 有効投与量は、 一回につき体重 lkgあたり 0.1 /i g〜： 100 mg、 好 ましくは 1〜： 10 gである。 但し、 上記増殖性疾患等の治療剤はこれらの投 与量に制限されるものではない。  The dosage of the therapeutic agent for proliferative diseases and the like of the present invention varies depending on age, sex, symptom, administration route, administration frequency, and dosage form. The administration method is appropriately selected according to the patient's age and symptoms. The effective dose is 0.1 / ig to 100 mg / kg body weight, preferably 1 to 10 g / kg body weight. However, the therapeutic agents for the above proliferative diseases are not limited to these doses.
本発明の増殖性疾患等の治療剤の効果は、 以下のように試験を行い、 検討 することができる。  The effect of the therapeutic agent for proliferative diseases of the present invention can be examined by examining as follows.
培養細胞に種々の濃度の本発明の増殖性疾患等の治療剤を添加する。 一定 時間培養後、 細胞を回収し、 SDS-PAGEにてタンパク分離後、 ウェスタンブ 口ッティングによりシノビオリンのポリマー形成阻害を観察することができ る。 培養細胞は滑膜細胞、 ガン細胞など適宜選択することができる。  Various concentrations of therapeutic agents for proliferative diseases of the present invention are added to cultured cells. After incubation for a certain period of time, the cells are collected, and after protein separation by SDS-PAGE, inhibition of synoviolin polymer formation can be observed by Western blotting. The cultured cells can be appropriately selected from synovial cells, cancer cells and the like.
このように、 シノビオリン同士の直接的な結合である、 RING ドメインに おけるホモ 4量体の形成を阻害することにより、 シノビオリ ンの自己ュビキ チン化が阻害されシノ ビオリンの発現が阻害される。 シノ ビオリンの発現が 抑制されると、 細胞において小胞体ス トレス誘導性のアポトーシスが亢進す ることが知られている。 したがって、 本発明は、 シノビォリンのホモ 4量体 形成を制御することにより、 神経細胞を保護することを目的とした薬剤とし ても有用であり うる。 具体的には、 神経系疾患である、 アルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン舞踏病、 末梢神経障害、 脊髄損傷などの治療 に有用である。 .: : .以下、 '実施 により本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明はこ れらの実施例に限定されるものではない。 Thus, by inhibiting the formation of homotetramers in the RING domain, which is a direct bond between synoviolins, synoviolin self-ubiquitination is inhibited, and synoviolin expression is inhibited. It is known that endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis is enhanced in cells when synoviolin expression is suppressed. Therefore, the present invention may be useful as a drug aimed at protecting nerve cells by controlling synoviolin homotetramer formation. Specifically, it is useful for the treatment of nervous system diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy, and spinal cord injury. .::. Hereinafter, 'more specifically illustrate the present invention. However, the present invention is not limited to these examples.
5 ： [実施例.1 ] . . . . 5: [Example 1]...
, GST-Svno A TM-His 生型及び C307S変異体の自己ュビキチン化活性' ；. ： 本実施例は、 大腸菌を用い fこタンパク質発現系により発現した GST- : ノ ピオリン ΔΤΜ-His野生型, C307S及び K303R変異体の GSH-セファ口ース 樹脂精製画分 （GSH) 及び Ni-NTAァガロース樹脂精製画分 （GSH/Ni) に , GST-Svno A TM-His biotype and auto-ubiquitination activity of C307S mutant ';.: This example shows GST- : nopioline ΔΤΜ-His wild type expressed in E. coli using f protein expression system, C307S and K303R mutant GSH-Sephamouth resin purified fraction (GSH) and Ni-NTA agarose resin purified fraction (GSH / Ni)
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Figure imgf000015_0001
( 2 ) GST、 GST-Syno Δ ΤΜ野生型あるレ、は. C307S変異体 GSH-セフ ： アロース:榭 旨精製画分. （GSH) ¾び: Ni，NTA: .ァ::ガ口一ス樹脂精製画分 (GSH/Ni) (各 l g) を MBPあるいは MBP-Syno Δ ΤΜΉΐβ (l^ g) 組み合わせて、 GSH セファロース樹脂を用いたプルダウンアツセィを行つ た。 反応後、 タンパク質を 10% SDS-PAGEにより分離し、 PVDF膜上に転 写して PVDF膜を CBB染色した （図 2 ) 。 (2) GST, GST-Syno Δ ΤΜ wildtype some les, the C307S mutant GSH- Joseph:. Allose:.榭fact purified fraction (GSH) ¾ Beauty: Ni, NTA:. § :: gas outlet Ichisu Refining resin fraction (GSH / Ni) (each lg) into MBP or MBP-Syno Δ ΤΜΉΐβ (l ^ g) In combination, a pull-down assay using GSH Sepharose resin was performed. After the reaction, the protein was separated by 10% SDS-PAGE, transferred onto the PVDF membrane, and the PVDF membrane was stained with CBB (Fig. 2).
その結果、 GST-Syno Δ TM'His野生型の GSH精製画分あるいは GSH/Ni 精製画分と MBP-Syno Δ TM-His を組み合わせた場合に MBP-Syno 厶 TM-Hisの沈降が認められた。 一方、 GST-Syno Δ TM-His C307S変異体に ついては、 GSH精製画分を用いた場合に沈降が認められなかつたにも関わら ず、 GSH/Ni精製画分を用いた場合に弱いながらも MBP-Syno Δ ΤΜ-Hisの 沈降が認められた （図 2 ) 。  As a result, when GST-Syno ΔTM'His wild-type GSH purified fraction or GSH / Ni purified fraction was combined with MBP-Syno Δ TM-His, precipitation of MBP-Syno 厶 TM-His was observed. . On the other hand, for the GST-Syno Δ TM-His C307S mutant, although precipitation was not observed when using the GSH purified fraction, MBP was weak when using the GSH / Ni purified fraction. -Syno Δ ΤΜ-His sedimentation was observed (Fig. 2).
これらの結果は、 C307S変異によりシノビオリン同士の相互作用が弱まり、 夾雑タンパク質との弱い相互作用の影響がュビキチン化反応に阻害的に働い ていること、 また、 夾雑タンパク質が除かれることにより不完全ではあるが シノビオリン同士の相互作用が復帰し、 反応に適した構造をとることを意味 する。  These results indicate that the interaction between Synoviolins is weakened by the C307S mutation, and that the influence of weak interactions with contaminating proteins acts in an inhibitory manner on the ubiquitination reaction. However, it means that the interaction between synoviolins is restored and a structure suitable for the reaction is taken.
[実施例 2 ] [Example 2]
Svno Δ ΤΜ野生型の分子量の推定  Estimating the molecular weight of Svno Δ ΤΜ wild type
本実施例は、 シノビオリン ΔΤΜ野生型の分子量を、 ゲルろ過カラムクロ 'マトグラフィ一により推定し、 それらの溶液中における存在状態についての 解析を行うことを目的とする。  The purpose of this example is to estimate the molecular weight of Synoviolin ΔΤΜ wild-type by gel filtration column chromatography and to analyze the existing state in the solution.
GST-Syno Δ TM野生型（wt)、 C307S及び K303R変異体（C307S、K303R) を GSH セファロース樹脂に吸着、洗浄後、 トロンビンを添加した。反応後、 得られた反応液（各 0.13 mg/ml,75 μ ΐ,ΐθ μ g)を、 Superdex 200 10/300 GL (bed vol.24 ml) カラムにかけ、 カラム用緩衝液 （20 mM Tris-HCKpH 7.5), 200 mM NaCl,0.1% NP-40)を用いて分画した（流速 0.5 ml/min,0.5 ml)。 得られた画分中に含まれるタンパク質を 10% SDS-PAGEにより分離し、 PVDF 膜上に転写して抗 Syno 10Da抗体を用いたウェスタンブロット法により検出 した （図 3 A) 。 また、 それらの精製画分を 10% SDS-PAGEにより分離し、 銀染色法により染色した （図 3 B) 。 ：その結果、 いずれの場令も 180:kDaの溶出位置である 25番目の画分.をピ 一久と-して溶出が認められた （図 3 A、, . 3 B) 。 . GST-Syno ΔTM wild type (wt), C307S and K303R mutants (C307S, K303R) were adsorbed on GSH Sepharose resin, washed, and then thrombin was added. After the reaction, the obtained reaction solution (each 0.13 mg / ml, 75 μΐ, ΐθ μg) was applied to a Superdex 200 10/300 GL (bed vol.24 ml) column, and the column buffer (20 mM Tris- It fractionated using HCKpH 7.5), 200 mM NaCl, 0.1% NP-40) (flow rate 0.5 ml / min, 0.5 ml). Proteins contained in the obtained fraction were separated by 10% SDS-PAGE, transferred onto a PVDF membrane, and detected by Western blotting using an anti-Syno 10Da antibody (FIG. 3A). The purified fractions were separated by 10% SDS-PAGE and stained by silver staining (Fig. 3B). : As a result, elution was observed in the 25th fraction, which is the elution position of 180: kDa, in all cases (Figure 3A, 3B). .
これらの結果は、 シノビオリンはホモ 4量体を形成していることを意味す る。' ■·  These results indicate that Synoviolin forms a homotetramer. '■ ·
： [^^例 3 .] ., . : [^^ Example 3.].,.
グルタルアルデヒ Kを用いた架橋反応による Syno Δ TMオリゴマーの検出 本実施例は、 グルタルアルデヒ：ドを用レ、た架橋反応によるシノビオリンのォ ：リゴマー形成について検討し、 シノビオリン ΔΤΜ同士の分子間相互作用の 解析を目的とする。 Detection of Syno Δ TM oligomer by cross-linking reaction using glutaraldehyde K In this example, we investigated the formation of synoviolin: ligomer by cross-linking reaction with glutardehyde: intermolecular interaction between synoviolin ΔΤΜ. The purpose is to analyze this.
:：. GST-Syno Δ ΤΜ : ト口シ ^：処理して:獰ちれた. : Syno ;：厶 TM 領域を、.：： Super dex 200 ラムを用いて精製した。 精製画分を終濃度 0.1%となるよう■ に NP-40を添加した PBS 1 Lを用いて透析後、 14,000 rpm、 10分、 4。Cで 遠心分離し、 ..得られた上清を試料とした。 試料 10 ίにダルタルアルデヒ ド を添加し （各終濃度 0.01、 0 02 ¾び 0.04° / 、 25 :°Cで反応時間 （0.5、 1及 び 2時間)を変化させて反応させた。この場合の反応液量は 12.5 M 1である。 反応後:、 タンパク質を 7,5% SDS-PAGEにより分離し、 抗 Syno 10Da抗体 を用いたゥ: スタンブロッ ト法により検出した （図 4 ) 。 :: GST-Syno Δ ΤΜ: Preparative port Shi ^: process to:獰Chi the:.. Syno;: a厶TM region was purified using :: Super dex 200 ram.. The purified fraction is dialyzed with 1 L of PBS to which NP-40 has been added to give a final concentration of 0.1%, and then 14,000 rpm, 10 minutes, 4. Centrifugation was performed at C, and the resulting supernatant was used as a sample. Dartal aldehyde was added to sample 10 ί (each final concentration was 0.01, 0 02 ¾ and 0.04 ° /, 25: ° C, and the reaction time was changed (0.5, 1 and 2 hours). The reaction volume was 12.5 M 1. After the reaction: the protein was separated by 7,5% SDS-PAGE and detected by the Stan blot method using an anti-Syno 10Da antibody (FIG. 4).
: ：その秸果、いずれのグルタルアルデヒ ド濃度、反^時間においても約 WO kDa 位置に.シグナル:が検出された。「また、 グルタルアルデヒ ド濃度が 0.02及び の場合に ； さらに 25Q :H)a ;以上の泳動位置お ダナルが^:出された (図 4 ) :。 .これにより； 130 kDa及び 250 kDaのシグナルから、 グルタルァ ルデヒ ドによりそれぞれ Syno Δ ΤΜの二量体及び四量体が形成されたことが 示ざれた。 :: Signal: was detected at the WO kDa position at any fruit concentration, glutaraldehyde concentration, and reaction time. “In addition, when glutaraldehyde concentration is 0.02 and; further 25Q: H) a ; more than the migration position ^: was issued (Fig. 4) : .. From the results, it was shown that dimers and tetramers of Syno ΔΤΜ were formed by glutaraldehyde, respectively.
[実施例 4 ] : [Example 4] :
GST-Svno A TM:と MBP-シノビォリン Δ TM-His .とのインビトロ結合活性に 必要なアミノ :酸領 決定. . : Determination of amino : acid region required for in vitro binding activity between GST-Svno A TM: and MBP-synovolin Δ TM-His.
フ レダウンァッセィで検出される GST-Syno Δ ΤΜと . MBP，シソピオリ ン 厶 TM-Hisとのインビトロ結合活性に必要なァミノ酸領域を決定し、 その相 互作用様式及び意義を解明することを目的とする。 GST-Syno Δ さ れ る detected by free passage and .MBP, Sisopiolin 。 The purpose is to determine the amino acid region necessary for in vitro binding activity with TM-His and to elucidate its interaction mode and significance.
( 1 ) GST-Syno Δ ΤΜと MBP-Syno Δ TM(236.617)-His及びその欠失変 異体 (236-338、 339-478、 479-617、 dPro) (図 5 ) を各 100 ngずつ用いて、 GSHセファロース樹脂によるプルダウンアツセィを行った。 反応後、 タンパ ク質を 10% SDS-PAGEにより分離後して PVDF膜上に転写し、 抗 MBP抗 体 （図 6 A) 及び CBB染色 （図 6 B) を行って検出した。  (1) Using 100 ng each of GST-Syno Δ ΤΜ and MBP-Syno Δ TM (236.617) -His and its deletion mutants (236-338, 339-478, 479-617, dPro) (Fig. 5) A pull-down assay using GSH Sepharose resin was performed. After the reaction, the protein was separated by 10% SDS-PAGE, transferred onto a PVDF membrane, and detected by anti-MBP antibody (Fig. 6A) and CBB staining (Fig. 6B).
( 2 ) GST-Syno Δ TMと MBP-シノビオリン Δ TM Hisとのインビトロ結 合活性における EDTAの影響を検討するため、 GST-Syno Δ ΤΜと MBP-Syno Δ ΤΜ-Hisのプルダウンァッセィ系に濃度を変化させた EDTA (各 30、 100、 300、 1000、 3000 M) を添加した。 反応後、 タンパク質を 10% SDS-PAGE により分離して PVDF膜上に転写し、 抗 MBP抗体 （図 7 A) 及び CBB染色 (2) In order to investigate the effect of EDTA on the in vitro binding activity between GST-Syno Δ TM and MBP-Synoviolin Δ TM His, a pull-down assay system of GST-Syno Δ ΤΜ and MBP-Syno Δ ΤΜ-His was used. EDTA with varying concentrations (30, 100, 300, 1000, 3000 M each) was added. After the reaction, the protein was separated by 10% SDS-PAGE, transferred onto a PVDF membrane, stained with anti-MBP antibody (Fig. 7 A) and CBB.
(図 7 B) を行って検出した。 (Fig. 7B) was detected.
その結果、 GST-Syno Δ ΤΜと MBP-Syno Δ TM(236-617)-His及び RING ドメインを含む MBP-Syno Δ TM(236-338)-Hisを用いた場合にシグナルが 検出された （図 6 ) 。 プルダウンアツセィで検出される GST-Syno Δ ΤΜと MBP-Syno Δ TM-His との相互作用は、 30 μ Mの EDTAの存在により阻害 された。 このことから RING ドメインに配位される亜鉛イオンが相互作用に 重要であることが示された （図 7 ) 。 産業上の利用可能性  As a result, signals were detected when GST-Syno Δ (, MBP-Syno Δ TM (236-617) -His, and MBP-Syno Δ TM (236-338) -His containing the RING domain were used (Fig. 6). The interaction between GST-Syno ΔΤΜ and MBP-Syno ΔTM-His detected by pull-down assay was inhibited by the presence of 30 μM EDTA. This indicates that zinc ions coordinated to the RING domain are important for the interaction (Fig. 7). Industrial applicability
シノビォリンのュビキチン化反応には、 シノビオリン同士の直接的な相互 作用が重要である。 本発明の増殖性疾患、 神経系疾患及びアレルギー性疾患 からなる群から選ばれる少なく とも 1つの治療剤は、 このシノビオリン同士 の直接的な相互作用を阻害する薬剤であるため、 シノビォリンの酵素活性阻 害に基づいた RA治療薬として有用である。  In synoviolin ubiquitination, direct interaction between synoviolins is important. Since at least one therapeutic agent selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases, and allergic diseases of the present invention is a drug that inhibits the direct interaction between synoviolins, it inhibits the enzyme activity of synoviolin. It is useful as an RA treatment based on harm.

Claims

：.: 請 求 の 範： 囲 1 . シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害する物質を有効成分として含. む、. 増殖性疾患、 神経系疾患及びアレルギー性疾患からなる群かち選ば : Scope of request: Scope 1. Contains a substance that inhibits synoviolin self-ubiquitination as an active ingredient, selected from the group consisting of proliferative diseases, nervous system diseases and allergic diseases
： れる少なくとも 1つの治療剤。 At least one therapeutic agent.
2 . .. シノビォリンの自己 ^ビキチン化がシノビオリン同士の相互作用によ 生じる.ものである、 請求項 1記載の治療剤。 . .  2. The therapeutic agent according to claim 1, wherein synoviolin self-biquitination is caused by interaction between synoviolins. ..
3 . シノビォリン同士の相互作用が、 シノビオリン膜貫通タンパク質のホ モ 4量体の形成である、 請求項 2記載の治療剤。' 3. The therapeutic agent according to claim 2, wherein the interaction between synoviolins is formation of a synoviolin transmembrane protein homotetramer. '
4 . シノビォリンの自己ュビキヂン化の阻害は、 シノビォリ ンの自己ュビ ； キチ ^化を阻害 る物質が : ォビォリ の; RING.ド イ^に結合する：: ことにより生じるものである、 請求項 1〜3のいずれか 1項記載の治療 .. 剤。：： ； : . 4 Inhibition of self Yubikidjin of Shinobiorin is Shinobiori down self Interview bi; Eat ^ of Ru inhibitors are:. Obiori of; is RING those caused by :: binding to de Lee ^, claim 1 The treatment according to any one of to 3.. ::;:
5 . . シノビす:リンの自己ュビキチン化を阻害する物質が、 変異型 ノピオ : リン及び/又は大腸菌由来タンパク質である、 請求項 1〜4 のいずれか 1 ： 項記載の治;^剤。  5.. Synobis: The agent according to any one of claims 1 to 4, wherein the substance that inhibits self-ubiquitination of phosphorus is a mutant Nopio: protein derived from phosphorus and / or Escherichia coli.
6：·. . 増殖性疾患が関節症、 関節リウ:マチ、：線維症、 動脈硬化及び癌からな ； る群から選ばれる少なく とも 1つである請求項 1〜5のいずれか 1項記 6. The proliferative disease is at least one selected from the group consisting of arthropathy, rheumatoid arthritis: machi, fibrosis, arteriosclerosis, and cancer.
：: ,载©治療剤。 . . :::, © © Therapeutics. ..
7 . 神経系疾專がアルツハイマー病、 パーキンソン病、. ハンチン:ドン舞踏 ：; 病:、 :.末梢神 障害 ¾び脊髄損傷からなる'群から遴ば る少な^とも · 1つ · ； である請求項：!〜 5のいずれか 1項記載の治療剤。 ： . 7 nervous system疾專Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Hanchin: Don Ball:;. Disease:,:. Peripheral God consisting of failure ¾ beauty spinal cord injury 'small Ru遴place from the group ^ Tomo-one-; a Claims: The therapeutic agent according to any one of! To 5. :
8 . ァレルギ一性疾患が、 気管支喘息、 ァレルギ一性鼻炎、 .ァレルギ一性 結膜炎、 ァトビ ^"性皮膚炎、 アナフィラキ:シー ョ：ック、 ダニアレルギ ■ —疾患、 花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少なく とも 1つである請求項 1〜5のいずれか 1項記载の治療剤。  8. Allergic diseases include bronchial asthma, allergic rhinitis, .allergic conjunctivitis, atobi ^ "sexual dermatitis, anaphylaxis: shio: cuk, mite allergic ■ —disease, hay fever and food allergy The therapeutic agent according to any one of claims 1 to 5, which is at least one selected from the group.
9 . シノビォリンの自己ュビキチン化を阻害す.る物質を患者 (こ投与するこ によ.り'、：增殖性疾患、,:神経系病患及びアレルギー性疾患 も:なる群力 ら選ばれる少なく とも 1.つを治療及び/又は 防する方法。 :: . : . 9. Patients who inhibit substances that inhibit synoviolin self-ubiquitination (by administration of this substance): proliferative diseases ,: nervous system diseases and allergic diseases: Both 1. How to treat and / or prevent one ::.
1 0 . 増殖性疾患が関節症、 関節リウマチ、 線維症、 及び動脈硬化及び癌 からなる群から選ばれる少なく とも 1つである請求項 9記載の方法。10. The method according to claim 9, wherein the proliferative disease is at least one selected from the group consisting of arthropathy, rheumatoid arthritis, fibrosis, and arteriosclerosis and cancer.
1 1 . 神経系疾患がアルツハイマー病、 パーキンソン病、 ハンチントン舞 踏病、 末梢神経障害及び脊髄損傷からなる群から選ばれる少なく とも 1 つである請求項 9記載の治療剤。 11. The therapeutic agent according to claim 9, wherein the nervous system disease is at least one selected from the group consisting of Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, peripheral neuropathy and spinal cord injury.
1 2.. アレルギー性疾患が、 気管支喘息、 アレルギー性鼻炎、 アレルギー 性結膜炎、 ア トピー性皮膚炎、 アナフィラキシーショ ック、 ダニアレル ギー疾患、 花粉症及び食物アレルギー疾患からなる群から選ばれる少な く とも 1つである請求項 9記載の方法。  1 2 .. The allergic disease is at least selected from the group consisting of bronchial asthma, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, atopic dermatitis, anaphylactic shock, mite allergic disease, hay fever and food allergic disease 10. The method of claim 9, wherein the number is one.
1 3 . シノ ビォリ ンに候補物質を接触させて候補物質がシノ ビォリンの自己 ュビキチン化を阻害するか否かを評価し、 シノビォリンの自己ュビキチン 化を阻害した候補物質を増殖性疾患、 神経系疾患及びァレルギ一性疾患か らなる群から選ばれる少なくとも 1つの治療剤として選択することを特徴 とする、 前記治療剤のスクリ一ニング方法。 1 3. The candidate substance is contacted with synoviolin to evaluate whether the candidate substance inhibits synoviolin auto-ubiquitination, and the candidate substance that inhibits synoviolin auto-ubiquitination is used as a proliferative disease or nervous system disease. And at least one therapeutic agent selected from the group consisting of allergic diseases, and a screening method for the therapeutic agent.
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