WO2006115181A1 - 植物の形質改変方法 - Google Patents

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WO2006115181A1
WO2006115181A1 PCT/JP2006/308356 JP2006308356W WO2006115181A1 WO 2006115181 A1 WO2006115181 A1 WO 2006115181A1 JP 2006308356 W JP2006308356 W JP 2006308356W WO 2006115181 A1 WO2006115181 A1 WO 2006115181A1
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WO
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plant
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sequence
amino acid
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Toshiharu Ohba
Mariko Nishimura
Tatsuya Ando
Kahoko Umeda
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
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Takara Bio Inc
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Takara Bio Inc
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8298—Brassinosteroids

Definitions

  • the present invention relates to a novel nucleotide sequence for efficiently producing fertile plants using gene recombination technology, a vector for inducing gene knockdown, a plant, and a method and plant for producing the plant
  • the present invention relates to a method for efficiently finding a transcription factor and a regulatory factor related to the trait modification.
  • Known examples of fertility traits resulting from the knockout of a single gene include gene knockouts of plant hormone receptors and biosynthetic enzymes.
  • Brassinosteroids are known as plant hormones related to the control of plant cell division and elongation and the basic control mechanism of cartilage plant growth. Brassinosteroid-deficient plants such as biosynthetic systems Enzyme gene det2 (AGI code: At2g38050; see Non-Patent Document 1, for example) knockout plant and brassinosteroid receptor BRI1 (AGI code: At4g39400; see Non-Patent Document 2, for example) lacking plant Show traits. However, these genes are involved in the synthesis and reception of phytohormones that act, and are not functional factors or transcription factors that regulate downstream of the signal transduction from the receptors. In addition, these genes are too fertile for practical use.
  • brassinosteroid-deficient plants have the advantage that germination and vegetative growth are maintained and they are unlikely to be lethal, although their morphology is very clear.
  • the knockout plant of the biosynthetic enzyme gene det2 shows characteristics such as an increase in the number of stems associated with a decrease in the top bud dominance caused by the power of fertile traits and dark green leaves. This reduces the damage caused by storms such as typhoons by providing lodging resistance due to fertility, and increases the yield by increasing the yield due to the increase in the efficiency of fruit harvesting and harvesting in fruit culm. it is conceivable that.
  • BEE1 ⁇ 3 (AGI code: Atlgl8400, At4g36540, Atlg738 30; see Non-Patent Document 3, for example) has been found on a differential display, but no sufficient character has been found yet.
  • BRH1 AGI code: At3g61460: see, for example, Non-Patent Document 4
  • Komatsu et al. Also reported on rice OsBLEl, 2 genes affected by brassinosteroids by suppressing the expression of these genes (Non-Patent Document). (Ref. 5, 6 and Patent Document 1).
  • XTR7 the relationship between the gene and the XTR7 gene.
  • Non-Patent Document l Plant Cell, III, 445-459 (1991)
  • Non-Patent Document 2 Plant Physiology, 111, 671-678 (1996)
  • Non-Patent Document 3 Genetics, No. 162, 1445- 1456 ⁇ (2002)
  • Non-Patent Document 4 Planta, 215, 127-133 (2002)
  • Non-Patent Document 5 Plant Mol Biol. 52 (4), 843-854 (2003)
  • Non-Patent Document 6 Plant Physiol Biochem. 42 (1), 1-6 (2004) Patent Document 1: US 2003Z0217390 Publication
  • the object of the present invention has been made in view of the above prior art, and is a brassinosteroid-related gene that directly causes a functional factor, cell elongation, which is downstream from the middle stream of the signal transduction pathway.
  • the object is to provide a nucleotide sequence, a vector for gene knockdown induction, a plant, and a method for producing the plant. It also provides a method for efficiently finding transcription factors and regulatory factors related to plant trait modification.
  • the present invention was completed by finding a method for efficiently producing plants having various traits.
  • a first invention of the present invention is a method for modifying a plant trait, the expression of which varies in response to brassinosteroid stimulation in a plant individual, and the correlation between XTR7 (At4gl4130) and expression variation is high and
  • the present invention relates to a plant trait modification method characterized by suppressing the expression of a gene encoding a polypeptide having a ring 'finger' domain.
  • the following force can be selected. ;
  • the method of the first invention of the present invention may be a plant trait modification method characterized by suppressing expression of the following gene in a plant individual. :
  • the method of the first invention of the present invention may be a plant trait modification method that suppresses gene expression by RNA interference.
  • a nucleic acid having the base sequence described in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing or a fragment thereof and a nucleic acid having the base sequence of Z or its complementary strand can be used.
  • the second invention of the present invention is a gene involved in alteration of any trait such as fertility, an increase in the number of stems or dark greening of leaves as compared with a wild type plant;
  • a third invention of the present invention is a nucleic acid that suppresses the expression of a gene involved in modification of a trait of a plant individual, the nucleic acid having the following characteristics;
  • nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a gene encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 of the sequence listing or a complementary strand thereof;
  • nucleic acid having the base sequence described in SEQ ID NO: 9 in the Sequence Listing, the base sequence of the fragment, and the base sequence of Z or its complementary strand can be preferably used.
  • a fourth invention of the present invention relates to a plant having a modified trait, which is prepared in the first invention of the present invention.
  • a plant having the following ability to modify the selected trait S can be produced. ;
  • the fifth invention of the present invention is (1) a step of searching for a gene that responds to stimulation by brassinosteroid;
  • the present invention relates to a method for searching for genes useful for modification of plant traits.
  • the present invention provides plant varieties that have acquired traits such as fertility, increased number of stems, and dark greening of leaves, which are important agricultural traits.
  • the plant is particularly useful in the field of agricultural production because the improvement in varieties and yields increases insect resistance.
  • Gene useful for plant trait modification of the present invention and method for searching for the gene
  • the gene useful for plant trait modification of the present invention varies in expression relative to brassinosteroid stimulation in plant individuals.
  • a gene coding for a polypeptide having a high correlation between expression variation and a gene responsible for cell wall remodeling and having a ring finger domain is preferable.
  • a gene whose expression varies with brassinosteroid stimulation is a value calculated by the Fold Change method of 1.5 times or more, preferably 1.8 times or more, particularly preferably 2 times or more. Say things. Even if the variable gene is calculated by another calculation method, if the numerical value calculated by the Fold Change method is within the above range, its expression will fluctuate with respect to the brassinosteroid stimulation defined in this specification. It goes without saying that it is a gene that does.
  • the gene responsible for cell wall reconstruction refers to a gene related to cell wall expansion and contraction reconstruction.
  • cell wall-related enzyme EXGT gene etaspancin gene related to cell elongation, biosynthesis and metabolism of brassinosteroid And genes and their family genes.
  • XTR7 et4gl 4130
  • a gene responsible for cell wall remodeling and a gene with a high correlation between expression fluctuations are genes whose expression changes depending on the expression behavior of the gene responsible for cell wall remodeling by analyzing the expression using a microarray or the like. Say that.
  • a gene having a high correlation with the expression variation of the XTR7 (At4gl4130) gene can be mentioned.
  • the correlation between the expression fluctuations can be displayed by, for example, a cosine correlation coefficient, and the correlation coefficient is 0.2 or more, preferably 0.25 or more, particularly preferably 0.3 or more. Is said to be highly correlated. It should be noted that even if a gene has a high correlation between expression variation and XTR7 (At4gl4130) calculated by other calculation methods, if the value calculated by the cosine variation coefficient calculation method is within the above range, It goes without saying that the correlation between the defined expression XTR7 (At4gl4130) and expression variation is high, and it is a gene.
  • the polypeptide having the ring 'finger domain is not particularly limited, but examples include those belonging to the ubiquitin protein ligase (E3) in the ubiquitin proteasome system.
  • E3 is an enzyme that determines the specificity of the substrate for ubiquitylation and determines the metabolic stability of the protein in the cell, and is linked to HE CT (homologous to E6—AP carboxyl terminus) type E3. It is roughly divided into the finger type E3 family.
  • Ring 'finger domains are C3HC4— and C3H2C3—types, 40- to 60-residue Zn-finger that binds two zinc atoms and is presumed to be involved in protein-protein interactions .
  • any of those having C3HC4-type and C3H2C3-type domains can be preferably used.
  • Swiss-Prot database http: ZZ www.expasy. Uniprot. OrgZ
  • Accession has a C3HC4 type ring finger domain of Q9SK92 protein, more preferably C3 HC4 type ring finger of Q9SK92 protein.
  • Those having a domain and a PfamB domain before and after this sequence are preferred.
  • Information on the C3HC4 type ring finger domain possessed by the Swiss-Prot database Accession Q9SK92 protein is, for example, [http: ZZus. Ex pasy.
  • the PfamB domain is preferably a Pfam database [http: Z / www. Sanger, ac. Uk / SoftwareZPfamZ] that can be searched with UniProt Identifier Q9SK92.
  • the gene useful for the trait modification of the plant of the present invention includes (1) a step of searching for a gene that responds to stimulation by brassinosteroid;
  • the function of the gene selected in the step (2) can be obtained by a search method characterized by including a step of creating and confirming a transformed plant in which the expression of the gene is controlled.
  • the method of searching for the target gene in the step (1) is not particularly limited as long as it can comprehensively analyze gene expression.
  • DNA chip method, microbead array method (megasort method, MPSS method), Any RT-PCR method can be suitably used.
  • the above search method for example, it can be obtained from Arabidopsis thaliana by the following steps.
  • a microarray in which cDNA fragments derived from Arabidopsis thaliana are immobilized for example, Arabidopsis DNA microarray (manufactured by Takarano)]
  • cell wall-related genes controlled by brassinosteroids cell wall-related genes controlled by brassinosteroids
  • biosynthesis of brassinosteroids and metabolism-related genes Screen for modulatory factors. That is, Arabidopsis wild strain (Colombia strain) and brassinosteroid biosynthetic knockout seedlings were extracted from brassinolide-treated and untreated sections, and total RNA was extracted and DNA microarray hybridization was performed. It is thus possible to find genes that are up- and down-regulated by brassinolide.
  • genes responsible for cell wall reconstruction such as genes expected to be associated with fertility (details) Focusing on cell wall-related enzyme EXGT gene, etaspancin gene related to cell elongation, brassinosteroid biosynthesis and metabolism related genes and their family genes), gene expression ratio in various other tissues, environments and conditions
  • EXGT gene Focusing on cell wall-related enzyme EXGT gene, etaspancin gene related to cell elongation, brassinosteroid biosynthesis and metabolism related genes and their family genes
  • gene expression ratio in various other tissues, environments and conditions
  • Gene expression ratio data may be anything that targets Arabidopsis thaliana, other than brassinosteroid treatment! /, And other microarrays published It may be a thing.
  • AFGC Arabid opsis t unctional Genomics and onsortium
  • a gene having a high correlation coefficient with the gene of interest with respect to the variation in gene expression can be selected from the gene group that is up- and down-regulated by brassinolide.
  • Genes useful in the present invention can also be selected from amino acids encoding the ring 'finger' domain and Z or nucleic acid homology.
  • the amino acid level may be 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more, under the conditions allowing similar amino acids.
  • the nucleic acid level is 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more.
  • the gene useful in the present invention may be displayed in the BLAST search program score instead of the homology display, but is not particularly limited, but for example, at the amino acid level, the BLASTP score is 150 or more, Preferably 300 or more, more preferably 350 or more can be suitably used.
  • the biological function of the selected gene can be examined by preparing a plant body in which gene expression is knocked down and confirming its phenotype.
  • an inverted repeat nucleic acid construct is created and introduced into the plant so that double-stranded RNA (dsRNA) of the target gene is generated to cause RNA interference (RNAi).
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNAi RNA interference
  • Any method may be used, such as a method of performing an antisense method, a method of using a sense strand and using co-suppression.
  • the vector to be introduced into a plant is not particularly limited as long as it can introduce a desired gene into a plant individual.
  • RNA having a part of the base sequence of the gene that is desired to be knocked down (target gene) is generated.
  • target gene a double-stranded RNA having a part of the base sequence of the gene that is desired to be knocked down
  • a known method suitable for the vector to be used may be used.
  • a transformed product can be prepared by infecting Arabidopsis thaliana with a vector containing a vector using the improved in planta method (spider infection method).
  • the mRNA amount of the target gene in this plant is quantified, and a plant that is a homozygous individual in which the gene is knocked down is selected. be able to.
  • the gene of Atlg22500 was selected by the above method as an AGI code and the plant body acquired fertility by knockdown.
  • the nucleotide sequence (cDNA) of this gene is shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence of the polypeptide encoded by the above base sequence is shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing.
  • the polypeptide encoded by this gene is thought to be a C3HC4-type RING finger family protein by sequence prediction, but its biological function is unknown.
  • the initial letter of the brassinolide “response” ring finger protein gene is referred to as the BRR1 gene.
  • genes useful in the present invention include genes such as AGI code: At5g27420, At5g41400, etc. in addition to the BRR1 (AGI code: Atlg22500). Furthermore, there are no particular limitations on plants other than Shiloununa, as long as they are genes derived from the target plant and have the same function as the above gene. Examples include ESSION: AAV43794 gene, Rice GenBank ACCESSION: XM— 483 020 gene, or Rice GenBank ACCESSION: XM—450948 gene.
  • the gene is produced by preparing several independent transformants for knockdown and examining the appearance of a similar phenotype, and this phenotype is due to the knockdown of the gene. I can confirm that. If individuals with different knockdown efficiencies are obtained by this operation, it is possible to see the correlation between the strength of the phenotype and the knockdown technique, such as the vector used.
  • Arabidopsis thaliana in which the gene of Atlg22500, which is a gene useful in the present invention, is knocked down, is characterized by characteristic trait modifications such as an increase in the number of stems and dark greening of leaves. Indicates. This is similar to the traits of knockout plants of brassinosteroid biosynthetic enzymes, but the gene is expected to be a functional factor, transcription factor 'regulatory factor located downstream from the midstream of signal transduction. This is the first time a strong phenotype has been identified for a gene in this category.
  • Atlg22500 is presumed to be the first example that strongly links the functional regulation by proteolysis by the ubiquitin system and the signal transduction of brassinosteroid.
  • the plant trait modification method of the present invention is characterized by using a nucleic acid capable of suppressing the gene described in (1) above.
  • the expression changes in response to brassinosteroid stimulation in plants, and the correlation between XTR7 (At4gl4130) and the expression change is high and the ring. Suppresses the expression of the gene encoding the polypeptide having a finger domain.
  • a plant trait modification method characterized by the above. Examples of the gene include a gene known as AGI code: Atlg22500 found in Arabidopsis thaliana, or a gene encoding a polypeptide having the same function as the polypeptide encoded by the gene.
  • AGI code: Atlg22500 gene is targeted
  • a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions to a gene encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the sequence listing or a complementary strand thereof and (2) a sequence in the sequence listing.
  • the nucleic acid to be used is not particularly limited.
  • the term "Haiburidizu to a strict condition of" specifically ⁇ mosquitoes such a limitation of the present invention 0. 5 0/0 SDS, 0.1 0/0 ⁇ shea serum Anorebumin, 0.1 0 / 0 Polyvinylenolepyrrolidone, 0.1% Huycol 400, 0.01% 3 ⁇ 4 '
  • the above method is V, a so-called target gene knockdown method, and is not particularly limited! /, Force RNA interference method, antisense method, co-subpression method and the like.
  • V a so-called target gene knockdown method
  • Force RNA interference method antisense method, co-subpression method and the like.
  • the nucleic acid that can be used in the RNA interference method is preferably a nucleic acid having a base sequence that is not homologous to other genes.
  • the chain length is preferably in the range of 20 to L000 bases, preferably 100 to 500 bases. The range is more preferably 250 to 350 bases. Particularly preferably, a chain having a chain length of about 300 bases and high sequence specificity for the target gene is exemplified.
  • a nucleic acid having a base sequence of SEQ ID NO: 9 in the sequence listing and a base sequence of a fragment thereof and a base sequence of Z or a complementary strand thereof can be used.
  • the fragment include, but are not particularly limited to, nucleic acids having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing and the base sequence of Z or its complementary strand.
  • the salt Either method can be used for any method that can convert a nucleic acid having a base sequence and a base sequence of Z or its complementary strand into RNA, or RNA corresponding to the nucleic acid is used.
  • RNA corresponding to the nucleic acid having the base sequence described in SEQ ID NO: 11 in the sequence list corresponds to the nucleic acid having the base sequence described in SEQ ID NO: 11 in the sequence list and the base sequence of its complementary strand according to the co-subtraction method.
  • RNA can be used for RNA interference
  • a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing can be used for antisense.
  • the plant individual exhibits a phenotype such as fertility, an increase in the number of stems, and dark greening of leaves.
  • a phenotype such as fertility
  • an increase in the number of stems and dark greening of leaves.
  • the plant of the present invention can be prepared by the method described in (2) above, targeting the gene described in (1) above.
  • Examples of the plant of the present invention include (a) fertility, (b) increased number of stems, and Z or (c) dark green leaves.
  • fertility means that the height of the plant individual is lower than that of a wild body.
  • the increase in the number of stems means that the number of stems of the plant individual is larger than that of the wild body.
  • dark greening of the leaves means that the color of the leaves of the plant individual is darker than that of the wild body.
  • fertile individuals can be produced by knocking down the BRR1 gene as described above.
  • BRR1 the gene that influences expression fluctuations, and also produces fertile individuals by knocking down another gene that encodes a protein with a ring 'finger domain. Examples that can be
  • Example 1 Collection of genes that respond to brassinosteroids Using Arabidopsis DNA microarray (manufactured by Takara Bio Inc.), cell wall-related genes controlled by brassinosteroids and regulators of brassinosteroid biosynthesis and metabolism-related genes were screened.
  • Arabidopsis wild strain (Colombia strain) and brassinosteroid biosynthesis knockout line det2-1 seeds (ABRC: seeds distributed from the Arabidopsis Biological Resource Center, stock No. CS6159, http: Z / www. Biosci. Ohio — After sterilizing state. EduZ to plantbioZFacilitiesZabrcZabrchome.htm), 100 grains or more were placed in a 9cm diameter deep type dish containing 1Z2 MS liquid medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) and Sucrose concentration 1.5% (vZv). . After 2 days of vernalization at 4 ° C in the dark, the plants were cultivated for 7 days at 22 ° C under illumination (24 hours continuous lighting, 3000 lux).
  • the seedlings were collected separately from the group treated with 3 hours (manufactured by Daiichi Fine Chemical Co., final concentration 10 nM) and the control group treated 3 hours with DMSO (final concentration 0.1%, vZv) as a simulation test. After extracting total RNA from each using Trizol reagent (Gibcone), genomic DNA was removed using RNase free DNasel (Takara Bio).
  • RNA Transcript SureLABEL TM Core Kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • wild strain Colombia strain
  • det2 strain the control group was labeled with Cy3 and the brassinolide-treated group was labeled with Cy5.
  • Competitive noise derivatization was performed according to the Takara DNA chip protocol.
  • wild strain Colombia strain
  • det2 strain we found a group of genes that are up- and down-regulated by brassinolide. It was confirmed that the 1488 gene fluctuated by brassinolide treatment when selection was made with a double variation.
  • Example 2 Search for functional factors, transcription factors, and regulatory factors that are located downstream from the middle stream of signal transduction using gene expression ratio data
  • AFGC Arabidopsis Functional Genomics
  • TAIR The Arabidopsis Information Resource
  • FTP site ftp://ftp.arabidopsis.org/home/tair/Microarrays/analyzed-data/no; g et afgc —data— 397—061703.zip it can.
  • the cell wall-related enzyme EXGT gene family At—XTH15 also known as XTR7 (AGI code: At4gl4130) and At—XTH16 (AGI code: At3g23730)
  • EXGT gene family At—XTH15 also known as XTR7 (AGI code: At4gl4130) and At—XTH16 (AGI code: At3g23730)
  • cell elongation Focusing on etaspancin gene EX PL1 AGI code: At3g45970
  • brassinosteroid biosynthesis and metabolism-related gene CPD AGI code: At5g05690
  • sequence designs and DNA fragments were made that were not similar to other genes. That is, first, EST clustering and assembly were performed using all EST sequences including the sequence of cDNA clones of Arabidopsis thaliana and ORF sequences from genomic information. As a result, 25,397 were classified. This created a transcription sequence database without overlap. As a result, the sequence of the cDNA clone was estimated. Similarity analysis using the BLAST homology search algorithm was performed for each gene sequence and for the entire transcription sequence or genome based on the transcription sequence database.
  • the gene-specific DNA fragment prepared in Example 3 was used as a cage, and a DNA fragment of about 3 OObp was amplified by PCR using a primer (manufactured by Invitrogen) having the base sequence shown in SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • a primer manufactured by Invitrogen
  • the BP reaction was carried out according to the protocol to produce an entry clone.
  • an LR reaction was performed using Gateway LR Clonase Enzyme Mix (manufactured by Invitrogen) according to the protocol, and a neutral vector plasmid in which the target gene was inserted into the pKRHlOl vector in the antisense and sense directions was prepared.
  • the binary vector plasmid is shown in FIG.
  • the pKRHlOl vector is a vector prepared for gene expression knockdown by RNA interference in plants, and was prepared by the following procedure.
  • the RfC. 1 cassette of Gateway Vector Conversion System (Invitrogen) was ligated to the plasmid obtained by cleaving pBI221 plasmid (Clontech) with restriction enzyme Xbal and then branding and dephosphorylation.
  • Plasmid pBI221-R in which a cassette was inserted in the direction of attRl ⁇ CmR ⁇ ccdB ⁇ attR2 ⁇ GUS was prepared.
  • the plasmid fragment obtained by cleaving the pBI221-R plasmid with SnaBI and Sacl and removing the 3 'side of the GUS sequence has blunt ends and a Sacl site at the end of the RfC.1 cassette prepared by the following procedure. Ligation of cassette and loop structure at 5 ′ side of GUS sequence RfC. 1 Plasmid pBI221—R2 with inverted repeat structure was made.
  • RfC. 1 cassette has a blunt end and a Sacl site.
  • the Sacl site is attRl-CmR-ccdB -A plasmid in which a cassette was inserted in the direction of the attR2-Hindlll site was prepared, this was digested with Hindlll, branded, and then further digested with Sacl.
  • a binary vector pi G121—Hm plasmid (Ohtas., Mita S., Hattori T., Nakamura ⁇ ., ⁇ lant Cell Physiol., 31, 805— 813, 1990) was cleaved with Hindlll and Sacl, the 35S promoter—intron—GUS sequence was removed, and the pBI221—R2 plasmid was cleaved with Hindlll and Sacl and purified to the Hindlll site—35S promoter- attRl-CmR-ccdB- Plasmid pKRH101 was prepared by ligating the DNA fragment of attR2-GUS-attR2-ccdB-CmR-attRl-Sacl site.
  • Agrobacterium EHA105 was transformed with the plasmid obtained in (1) above, and in an LB agar medium containing 100 ⁇ g / ml kanamycin, 100 g / ml igromycin, Static culture was performed at 28 ° C for 2 hours. Colony PCR was performed using primers having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 and 6, and SEQ ID NOs: 7 and 8, and agrobacterium containing the transgene was selected, and transformed agrobacterium. Was made.
  • Arabidopsis thaliana was infected with the recombinant Agrobacterium teratrum prepared in Example 4 above.
  • Agrobataterum for gene knockdown of BRR1 (AGI code: Atlg22500) described in SEQ ID NOs: 9 (base sequence) and 10 (amino acid sequence) in the sequence listing infects 2 pots of plants. They were named 209-1 and 209-2, respectively.
  • the base sequence inserted into the binary vector is shown in SEQ ID NO: 11 in the sequence listing.
  • the infection was caused by recombinant agrobacterium cultivated at 28 ° C in an LB liquid medium containing kanamycin (final concentration 100 ⁇ g / ml), no, idalomycin (final concentration 100 ⁇ g / ml).
  • kanamycin final concentration 100 ⁇ g / ml
  • idalomycin final concentration 100 ⁇ g / ml
  • Plants after infection were cultivated under long-day conditions.
  • Seeds obtained by self-pollination of infected plants are transferred onto MS0 medium containing 50 ⁇ g / ml kanamycin, 10 g / ml hygromycin, and 100 g / ml carbecillin for germination and growth.
  • Active T1 individuals (209-1-1 to 209-1-4 and 209-2-1-209-2-3) were selected, transplanted to rock wool and grown.
  • T2 seeds After the selected transgenic T1 plant seeds (T2 seeds) are transplanted to the same selective medium as in (3) above, T2 plants that have been predicted to be homozygous for vigorous growth are found. Raised, acquired T3 seeds.
  • Fig. 2 shows the morphology of T1 plants grown from T1 plants, that is, the seed strength cultivated from 209-1-4 and 209-2-1.
  • Wild indicates a wild strain
  • 209 indicates a 209-1-4 T2 plant.
  • T2 seeds obtained by self-pollination of T2 plants 209-1-4-3 and 209-2-2-1-1 that were predicted to be homogenous were grown for 11 days under blue'red light irradiation .
  • Figure 3 shows the results. [0053] As shown in Fig. 3, it was confirmed that the plant body of the present invention had a shorter hypocotyl length than the non-transformant (wild type).
  • Real-time PCR was performed to examine RNA interference of the target gene in the knockdown line of the present invention.
  • Reverse transcription reaction and real-time PCR were performed using SYBR (registered trademark) RT-PCR Kit (Perfect Real Time, manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached protocol. That is, single-stranded cDNA was synthesized by a reverse transcription reaction using wild strains and total RNAs of 209-1-4-3 and 209-2-1-1 as a saddle and Random hexamer as a primer. The wild-type total RNA was serially diluted for the preparation of a calibration curve. Next, a single-stranded cDNA prepared from two strains, a wild strain and a knockdown line, was used as a cage, and real-time PCR was performed using the Smart Cycler II System.
  • SYBR registered trademark
  • RT-PCR Kit Perfect Real Time, manufactured by Takara Bio Inc.
  • primers having the base sequences described in SEQ ID NOS: 12 and 13 in the Sequence Listing were used.
  • For the BRR1 gene there are three regions: a part of the introduced DNA sequence (A: within the introduced region) and a site away from the introduced sequence ( ⁇ : 5 'side or C: 3' side).
  • a primer having a base sequence described in SEQ ID NOs: 14 and 15 in the sequence listing was used.
  • primer For the amplification of the site away from the gene introduction sequence, a primer having the base sequence described in SEQ ID NO: 16 or 17 in the sequence listing (hereinafter referred to as the 5 ′ primer outside the introduction region) and SEQ ID NO: 18 or 19 in the sequence listing The base sequence described The primer (hereinafter referred to as out-of-introduction region 3, referred to as primer) was used.
  • the obtained Ct values were substituted into the respective calibration curves to calculate the initial template amount.
  • the relative RNA content of the BRR1 gene in the two knockdown lines that is, the RNA content when the expression level in the wild strain was taken as 100 was calculated.
  • the results are shown in Fig. 4.
  • the vertical axis indicates the relative amount% of BRR1 gene RNA expression relative to the wild type, and the horizontal axis indicates the type of knockdown line.
  • RNA expression level of the gene sequence itself introduced into the plant body was increased.
  • the RNA expression level of the region other than the introduced sequence was suppressed to less than half, and was suppressed to a maximum of 27%. It was. Therefore, it was considered that RNA expression of BRR1 gene was suppressed by the action of RNA interference.
  • RNA expression suppression is high, 209-143, the hypocotyl length of Example 5 is about 5 mm, and the efficiency of RNA expression suppression is slightly low. Since it was about 7.5 mm and the wild type was about 9 mm, it was confirmed that the degree of RNA expression suppression was closely correlated with the hypocotyl length phenotype.
  • Northern analysis was performed on wild-type and knockdown line seeded total RNA using DIG-labeled PCR probes. Northern analysis was performed according to a conventional method. As a result, only in the knockdown line, a band was detected around 20 nt, confirming the generation of siRNA derived from BRR1.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a binary vector used in the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a comparison of the form of the knockdown line of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a comparison of hypocotyl lengths of the knockdown line of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing RNA interference of the knockdown line of the present invention.
  • fertile plants that are important traits in agriculture can be efficiently produced. Moreover, the yield of the target plant can be increased. Furthermore, any Transcription factors related to genes and regulatory factors of arbitrary genes can be found efficiently. In other words, it is possible to efficiently create fertile plants that are important traits for agriculture by an artificial single gene mutation, which is a useful technique in the field of useful crop production.
  • SEQ ID No: l A sequence of designed oligonucleotiae PCR primer for amplifying B RR1 gene
  • SEQ ID No: 2 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying B RR1 gene
  • SEQ ID No: 3 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for using Gateway system
  • SEQ ID No: 4 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for using Gateway system
  • SEQ ID No: 5 A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No: 6; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No: 7; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No: 8; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No: ll; A fragment of BRR1 gene for inserting binary vector
  • SEQ ID No: 12 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying 18S rRNA
  • SEQ ID No: 13 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying 18S rRNA
  • SEQ ID No: 14 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRR1 gene
  • SEQ ID No: 15 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRR1 gene
  • SEQ ID No: 18 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRRl gene
  • SEQ ID No: 19 A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRRl gene

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Abstract

【課題】 　農業上重要な形質である矮性の植物体を効率よく生産するための新規ポリヌクレオチド配列、遺伝子ノックダウンの誘導用のベクター、植物体、および該植物体を作成する方法を提供すること。また、植物の形質改変に関連する転写因子や調節因子を効率的に見出す方法を提供すること。 【解決手段】 　植物個体中でブラシノステロイド刺激に対してその発現が変動し、ＸＴＲ７（Ａｔ４ｇ１４１３０）と発現変動の相関が高く、かつリング・フィンガー・モチーフを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することを特徴とする植物の形質改変方法、当該方法に用いられる核酸、当該方法を用いて作成された植物体、及び形質改変方法のターゲットとなる遺伝子の探索方法。

Description

明 細 書
植物の形質改変方法
技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子組換え技術を用いた矮性植物体を効率よく生産するための新規 ヌクレオチド配列、遺伝子ノックダウンの誘導用のベクター、植物体、および該植物体 を作成する方法と植物の形質改変に関連する転写因子や調節因子を効率的に見出 す方法に関する。
背景技術
[0002] 人口増加、耕地面積の減少により、あと数十年後には地球上の人類を十分に養う 量の食糧は不足する。この問題を解決するには、単位耕地面積あたりの植物の収量 をあげるしかない。しかし、単位耕地面積あたりの植物の収量を上げてきた化学肥料 の原料である石油をはじめとする化石エネルギーの埋蔵量は、有限である。よって、 育種による植物の機能をあげることは重要である。
また、エネルギー問題を考えると、現代の生活を維持するならば、数十年後には石 油の枯渴が予想される。そういった中で、人類の使用する化石エネルギーの総使用 量は、あと植物の機能を 10%あげるとまかなえる量であるといわれている。そこで、機 能をあげた植物を開発し現代の生活を維持しつつもエネルギー収支のあう循環型社 会が構想されている。
[0003] 植物はそのポテンシャルを環境や病害によって十分に引き出されていないといわ れている。その中で、 20世紀におきた"緑の革命"は、たった一つの遺伝子の突然変 異に基づく育種母体があった力 なされた。よって、収量増加を期待できる、育種母 体として利用できる植物体の作成技術は、非常に重要な技術である。その中で矮性 形質は、環境力 の植物の形質をひきあげるための重要な農業形質である。
1つの遺伝子のノックアウトによって矮性形質が現れる例としては、植物ホルモンの レセプターや生合成系酵素などの遺伝子ノックアウトが知られている。
[0004] 植物の細胞の分裂や伸長の制御と!/、う植物成長の基本制御機構に関る植物ホル モンとしてブラシノステロイドがある。ブラシノステロイド欠損植物体、例えば生合成系 酵素の遺伝子 det2 (AGIコード: At2g38050 ;例えば、非特許文献 1参照）のノック アウト植物体やブラシノステロイドレセプター BRI1 (AGIコード： At4g39400 ;例えば 、非特許文献 2参照)欠損植物体は著しい矮性の形質を示す。しかしながら、これら の遺伝子は作用を示す植物ホルモンの合成やその受容にかかわるものであり、受容 体からのシグナル伝達の中流力 下流に位置するような機能性因子、転写因子'調 節因子ではない。また、これらの遺伝子は実用的には矮性の形質が強すぎる。さらに シグナル伝達の上流に位置するために他の有用形質にも影響を与えて!/、る可能性 が高い。さらに、他のシグナル伝達系とのクロストークなどにより簡単にその形質が復 帰したりすると考えられる。よって、シグナル伝達系の中流から下流に位置する機能 性因子、細胞伸長を直接的に起こす細胞壁関連酵素遺伝子や液胞へのトランスポ ート関連遺伝子を直接的に制御するような転写因子 ·調節因子などが期待されるが、 強 、形質を示すものは 、ままで同定されて 、なかった。
[0005] 実際、小麦の"緑の革命"の原因となった遺伝子はジベレリンのシグナル伝達系の 転写因子であることが最近明らかになり、転写因子の突然変異体による矮性形質は 、実用的に利用されることがわ力 ている。
[0006] また、ブラシノステロイド欠損植物体は、他の植物ホルモンの場合と異なり、形態は 非常に明瞭でありながらも発芽や栄養成長は維持され致死にはなりにくいという利点 がある。さらに生合成系酵素の遺伝子 det2のノックアウト植物体をみると矮性形質ば 力りでなぐ頂芽優勢の低下に伴う茎数の増加、葉の暗緑色などの特徴を示す。これ は、矮性による耐倒伏性を付与することによる台風など暴風雨による被害の軽減や 果榭では摘果 ·収穫作業効率のアップに伴う収量の増加ば力りでなぐ直接的な収 量の増加をもたらすと考えられる。
[0007] このため、ブラシノステロイド関連の遺伝子、特に転写因子の突然変異植物体は、 農業育種の現場で育種母体としてのより利用価値が高いと考えられるが、弱い形質 を示す遺伝子として BEE1〜3 (AGIコード: Atlgl8400, At4g36540, Atlg738 30 ;例えば、非特許文献 3参照）がディファレンシャルディスプレイで見出されてはい るが、十分な形質のものはまだ発見されていない。
[0008] 最近、ブラシノステロイドで遺伝子発現が抑制され合成変異体 cpdで発現が上昇し ている遺伝子として、 BRH1 (AGIコード: At3g61460 :例えば、非特許文献 4参照） が同定された。これは RING— H2 finger (C3H2C3 - type RING finger)をも つポリペプチドをコードして!/ヽる。前記の遺伝子をアンチセンス法で抑制した場合に は明瞭に遺伝子発現の抑制は確認されるが、矮性の形質は示さない。また、小松ら は、ブラシノステロイドによって影響を受けるイネの OsBLEl、 2遺伝子について、当 該遺伝子の発現を抑制することによるイネのゎ 、ィ匕にっ 、て報告して 、る（非特許文 献 5, 6及び特許文献 1参照)。し力しながら、前記遺伝子の塩基配列には、リング'フ インガー'ドメイン部位は存在しない。また、前記遺伝子と XTR7遺伝子との関係につ いても記載はない。
[0009] 非特許文献 l : Plant Cell、第 3卷、 445— 459頁（1991)
非特許文献 2 : Plant Physiology,第 111卷、 671— 678頁（1996)
非特許文献 3 : Genetics、第 162卷、 1445- 1456^ (2002)
非特許文献 4: Planta、第 215卷、 127— 133頁（2002)
非特許文献 5 : Plant Mol Biol.第 52卷（4)、 843— 854頁（2003)
非特許文献 6 : Plant Physiol Biochem.第 42卷（1)、 1— 6頁（2004) 特許文献 1 :米国第 2003Z0217390号公開公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明の目的は、上記従来技術を鑑みて行われたものであり、ブラシノステロイドの 関連遺伝子で、シグナル伝達経路の中流から下流にある機能性因子、細胞伸長を 直接的に起こす細胞壁関連酵素遺伝子や膨圧を起こす関連遺伝子を直接的に制 御するような転写因子'調節因子を発見し、農業上重要な形質である矮性の植物体 を効率よく生産するために、新規ポリヌクレオチド配列、遺伝子ノックダウンの誘導用 のベクター、植物体、および該植物体を作成する方法を提供することにある。また、 植物の形質改変に関連する転写因子や調節因子を効率的に見出す方法を提供す ることにめる。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者らは、鋭意研究を行った結果、ブラシノステロイドによる刺激に応答する遺 伝子群にぉ 、て、リング'フィンガー ·ドメインを有するポリペプチドをコードする機能 未知の遺伝子の発現を制御することにより、植物個体に矮性、茎数の増加、葉の暗 緑色化等の農業上重要な形質がもたらされることを見出した。また、ブラシノステロィ ドによる刺激に応答する遺伝子を DNAマイクロアレイを用いて探索する過程、得られ た遺伝子群より網羅的遺伝子発現解析データを利用して注目機能 (例えば細胞壁 再構築、ブラシノライド代謝)を担う遺伝子との間に遺伝子発現比の相関の高い遺伝 子を集める過程、こうして選択された遺伝子の機能を、前記遺伝子の発現を制御した 形質転換植物を作成して確認する過程を通して、農業上重要な形質を有する植物 体を効率よく作成する方法を見出し、本発明を完成させた。
本発明の第一の発明は、植物の形質を改変する方法であって、植物個体中でブラ シノステロイド刺激に対してその発現が変動し、 XTR7 (At4gl4130)と発現変動の 相関が高ぐかつリング'フィンガー 'ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子 の発現を抑制することを特徴とする植物の形質改変方法に関する。
本発明の第一の発明の方法において、野生型植物と比較して、下記力 選択され る形質の改変力 Sもたらされる植物の形質改変方法であってもよ 、。；
(a)矮性
(b)茎数の増カロ；および
(c)葉の暗緑色化。
また、本発明の第一の発明の方法において、植物個体中で下記の遺伝子の発現 を抑制することを特徴とする植物の形質改変方法であってもよ 、。：
(1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 遺伝子；
(2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子で あって、植物個体中での発現が抑制されると植物の形質が改変される遺伝子；およ び
(3) (1)または（2)のポリペプチドをコードする遺伝子の相補鎖に厳密な条件下でノヽ イブリダィズする遺伝子であって、植物個体中での発現が抑制されると植物の形質が 改変される遺伝子。
また、本発明の第一の発明の方法において、 RNA干渉により遺伝子の発現を抑制 する植物の形質改変方法であってもよい。特に限定はされないが例えば、配列表の 配列番号 9記載の塩基配列あるいはその断片を有する核酸及び Zまたはその相補 鎖の塩基配列を有する核酸を使用することができる。
[0013] 本発明の第二の発明は、野生型植物と比較して、矮性、茎数の増加あるいは葉の 暗緑色化の 、ずれかの形質の改変に関与する遺伝子であって；
(1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 遺伝子；
(2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子； および
(3) (1)または（2)のポリペプチドをコードする遺伝子の相補鎖に厳密な条件下でノヽ イブリダィズする遺伝子に関する。
[0014] 本発明の第三の発明は、植物個体の形質の改変に関与する遺伝子の発現を抑制 する核酸であって、下記特徴を有する核酸；
(1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 遺伝子又はその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダィズする核酸;及び
(2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子 又はその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダィズする核酸に関する。
本発明の第三の発明にお 、て、配列表の配列番号 9記載の塩基配列ある 、はそ の断片の塩基配列及び Z又はその相補鎖の塩基配列を有する核酸が好適に使用 できる。
[0015] 本発明の第四の発明は、本発明の第一の発明で作成された、形質が改変された植 物に関する。本発明の第四の発明において、下記力 選択される形質の改変力 Sもた らされている、植物が作成できる。；
(a)矮性 (b)茎数の増カロ；および
(c)葉の暗緑色化。
[0016] 本発明の第五の発明は、（1)ブラシノステロイドによる刺激に応答する遺伝子を探 索する工程；
(2)上記（1)工程で得られた遺伝子群より細胞壁の再構築を担う遺伝子との間に遺 伝子発現比の相関の高 、遺伝子を集める工程；および
(3)上記（2)工程で選択された遺伝子の機能を、前記遺伝子の発現を制御した形質 転換植物を作成して確認する工程を包含することを特徴とする、前記細胞壁の再構 築に関連する植物の形質改変に有用な遺伝子の探索方法に関する。
発明の効果
[0017] 本発明により、農業上の重要形質である矮性、茎数の増加、および葉の暗緑色化 等の形質を獲得した植物品種が提供される。前記植物は品種や収量の向上ゃ耐虫 性増加が見られることから、農業生産分野において特に有用である。
発明を実施するための最良の形態
[0018] 以下に本発明につ 、て詳細に説明する。
(1)本発明の植物の形質改変に有用な遺伝子及び当該遺伝子の探索方法 本発明の植物の形質改変に有用な遺伝子は、植物個体中でブラシノステロイド刺 激に対してその発現が変動し、細胞壁の再構築を担う遺伝子と発現変動の相関が高 く、かつリング ·フィンガー ·ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子であるも のが好適である。
[0019] ブラシノステロイド刺激に対してその発現が変動する遺伝子とは、 Fold Change法 で算出した数値が 1. 5倍以上、好ましくは、 1. 8倍以上、特に好ましくは、 2倍以上 のものを言う。なお、他の計算方法で算出された変動遺伝子であっても、 Fold Cha nge法で算出した数値が上記範囲内であれば、本明細書で定義されるブラシノステ ロイド刺激に対してその発現が変動する遺伝子であることは言うまでもない。
[0020] また、細胞壁の再構築を担う遺伝子とは、細胞壁の伸縮等の再構築に関連する遺 伝子のことを言う。特に限定はされないが、例えば細胞壁関連酵素 EXGT遺伝子、 細胞伸長に関係あるエタスパンシン遺伝子、ブラシノステロイドの生合成と代謝関連 遺伝子やこれらのファミリー遺伝子等が挙げられる。特に好ましくは、 XTR7 (At4gl 4130)である。また、細胞壁の再構築を担う遺伝子と発現変動の相関が高い遺伝子 とは、マイクロアレイ等による発現解析にぉ ヽて前記細胞壁の再構築を担う遺伝子の 発現挙動に応じてその発現が変化する遺伝子のことを言う。特に限定はされないが、 例えば XTR7 (At4gl4130)遺伝子の発現変動と相関が高い遺伝子等が挙げられ る。前記、発現変動の相関は、例えばコサインの相関係数によって表示することがで き、その相関係数が 0. 2以上、好ましくは、 0. 25以上、特に好ましくは、 0. 3以上の ものを相関が高いと言う。なお、他の計算方法で算出された XTR7 (At4gl4130)と 発現変動の相関が高い遺伝子であっても、コサインの変動係数算出法で算出した数 値が上記範囲内であれば、本明細書で定義される XTR7 (At4gl4130)と発現変動 の相関が高 、遺伝子であることは言うまでもな 、。
さらに、前記リング'フィンガー ·ドメインを有するポリペプチドとは、特に限定はされ な 、が、例えばュビキチンプロテアソームシステムにおけるュビキチンタンパク質リガ ーゼ（E3)に属するものが例示される。当該 E3は、 ubiquitylationのために基質の 特異性を決定して、細胞内での蛋白質の代謝的安定性を決定する酵素であり、 HE CT (homologous to E6— AP carboxyl terminus)型 E3とリング 'フィンガー 型 E3のファミリーに大別される。リング'フィンガ一 ·ドメインには、 C3HC4—タイプと C3H2C3—タイプがあり、亜鉛の 2つの原子を結合する 40〜60残基の Zn— finger の一種で、タンパク質タンパク質相互作用に関わると推定される。本発明においては 、 C3HC4—タイプと C3H2C3—タイプのドメインを有するもののいずれもが好適に 使用できる。特に限定はされないが例えば、 Swiss— Protデータベース（http : ZZ www. expasy. uniprot. orgZ)の Accessionが Q9SK92蛋白質のもつ C3HC4 タイプリングフィンガードメインを有するもの、さらに好ましくは Q9SK92蛋白質の C3 HC4タイプリングフィンガードメインとこの配列の前後にある PfamBドメインを有する ものが好ましい。なお、 Swiss— Protデータベースの Accessionが Q9SK92蛋白質 のもつ C3HC4タイプリングフィンガードメインの情報は、例えば、 [http : ZZus. ex pasy. org/ Exp a syHunt/ ]で Swiss― Protァータベースの Accession力 Q9SK 92として検索できる。 また、 PfamBドメインは、 Pf amデータベース [http： Z / www. Sanger, ac. uk/ SoftwareZPfamZ]で UniProt Identifierが Q9SK92として検索できるものが好 ましい。
[0022] 特に限定はされないが例えば、 Zf— C3HC4ドメインを示すアミノ酸番号が 118〜1 59である場合において、 Zf— C3HC4ドメイン、当該ドメインより前のアミノ酸番号 36 〜117の PfamBドメイン、 Zf— C3HC4ドメインより後のアミノ酸番号 161〜380の Pf amBドメイン、特にアミノ酸番号 241〜290の PfamBドメインを含むポリペプチドが好 適である。
[0023] 本発明の植物の形質改変に有用な遺伝子は、（1)ブラシノステロイドによる刺激に 応答する遺伝子を探索する工程；
(2)上記（1)工程で得られた遺伝子群より細胞壁の再構築を担う遺伝子との間に遺 伝子発現比の相関の高 、遺伝子を集める工程；および
(3)上記（2)工程で選択された遺伝子の機能を、前記遺伝子の発現を制御した形質 転換植物を作成して確認する工程を包含することを特徴とする探索方法により取得 することができる。上記（1)の工程において目的の遺伝子を探索する方法としては、 遺伝子の発現を網羅的に解析できるものであれば特に限定はなぐ DNAチップ法、 マイクロビーズアレイ法 (メガソート法、 MPSS法）、 RT— PCR法のいずれもが好適 に使用できる。上記探索方法を用いて、例えばシロイヌナズナから下記工程により取 得することができる。
すなわち、シロイヌナズナ由来の cDNA断片が固定ィ匕されたマイクロアレイ [例えば ァラビドプシス DNAマイクロアレイ（タカラノィォ製） ]を用いて、ブラシノステロイドで 制御される細胞壁関連遺伝子やブラシノステロイドの生合成と代謝関連遺伝子の調 節因子をスクリーニングする。すなわち、シロイヌナズナの野性株（コロンビア株）とブ ラシノステロイドの生合成のノックアウトラインの芽生えをブラシノライド処理したものと 無処理区とから全 RNAを抽出、 DNAマイクロアレイによるハイブリダィゼーシヨンを 実施する、こうしてブラシノライドによってアップレギュレートおよびダウンレギュレート される遺伝子群を見出すことができる。
次に、細胞壁の再構築を担う遺伝子、例えば矮性との関連が期待される遺伝子 (細 胞壁関連酵素 EXGT遺伝子、細胞伸長に関係あるエタスパンシン遺伝子、ブラシノ ステロイドの生合成と代謝関連遺伝子やこれらのファミリー遺伝子）に注目して、他の さまざまな組織や環境、条件下での遺伝子発現比データを使用して細胞壁の再構 築を担う遺伝子と関連の強い遺伝子を探索することができる。
[0024] 他の遺伝子発現比データは、シロイヌナズナを対象としたものであれば何でもよぐ ブラシノステロイド処理以外で自ら行ったものでもよ!/、し、他のマイクロアレイを用いた 公開されているものでもよい。例えば、公開されているデータとして、 AFGC (Arabid opsis t unctional Genomics し onsortium、
http： / / www. arabidopsis. org/ info/ 2010― projects/ comp― projZ A FGC/RevisedAFGC/site 1L. htm)が行ったマイクロアレイプロジェクトのデー タが上げられる。このデータは、 TAIR (The Arabidopsis Information Resour ce ;http : Z / www. arabidopsis. org/ home, html)の FTPサイト (ftp : Z / ftp . arabidopsis. org/home/ tair/ Microarrays/ analyzed一 dataZ)力らダウ ンロード可能である。
こうして、ブラシノライドによってアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺 伝子群のうちから、遺伝子発現の変動に関して注目遺伝子との間に高い相関係数を 有する遺伝子を選択することができる。
[0025] 本発明に有用な遺伝子は、前記リング'フィンガー 'ドメインをコードするアミノ酸及 び Z又は核酸の相同性からも選択することができる。特に限定はされないが、ァミノ 酸レベルでは、類似アミノ酸を許容する条件で 40%以上、好ましくは 50%以上、さら に好ましくは 60%以上のものが挙げられる。また、核酸レベルでは、 60%以上、好ま しくは 70%以上、さらに好ましくは 80%以上のものが挙げられる。
[0026] さらに、本発明に有用な遺伝子は、前記相同性表示に変えて BLAST検索プログ ラムのスコアで表示されたものでも良ぐ特に限定はされないが例えばアミノ酸レベル で BLASTPのスコアが 150以上、好ましくは 300以上、さらに好ましくは 350以上の ものが好適に使用できる。
[0027] 選択された遺伝子の生物学的機能は、遺伝子発現のノックダウンされた植物体を 作製し、その表現型を確認して調べることができる。 ノックダウンの方法には、 RNA干渉 (RNAi)を起こすためにターゲット遺伝子の二 本鎖 RNA (dsRNA)が生成されるようにインバーテッドリピート形の核酸構築物を作 製して植物体に導入、発現する方法、アンチセンス法、センス鎖をいれてコ'サブレツ シヨン（co— suppression)を利用する方法などがある力 いずれでもかまわない。 植物に導入するベクターは、所望の遺伝子を植物個体に導入できるものであれば 特に限定はな 、。例えばノックダウンすることが望まれる遺伝子 (ターゲット遺伝子）の 配列の塩基配列の一部を有する二本鎖 RNAが生成されるように、インバーテッドリピ ート型で発現できるベクターに挿入して構築したァグロバタテリゥム用のバイナリーべ クタ一を用 、ることができる。
植物への導入方法には、使用するベクターに適した公知の方法を用いればよい。 例えば、改良した in planta法（蕾感染法）を用いてシロイヌナズナにベクターを保有 するァグロパクテリゥムを感染させて、形質転 ^¾物を作製することができる。
表現型として矮化が確認された形質転換植物が得られた場合には、この植物体に おけるターゲット遺伝子の mRNA量を定量して前記遺伝子がノックダウンされたホモ 個体である植物体を選択することができる。
[0028] 本発明に有用な遺伝子として、特に限定はされないが、シロイヌナズナの場合、上 記の方法により AGIコードで Atlg22500の遺伝子がそのノックダウンによって植物 体が矮性を獲得するものとして選択された。この遺伝子の（cDNAの）塩基配列を配 列表の配列番号 9に示す。また、前記の塩基配列にコードされているポリペプチドの アミノ酸配列を配列表の配列番号 10に示す。この遺伝子がコードする前記ポリぺプ チドは配列からの予測で C3HC4— type RING finger family proteinと考えら れているが、生物学的機能は未知であった。以下本明細書において、植物体が矮性 の形質を示すことより機能が明らかになつたので、ブラシノライド'レスポンス 'リングフ インガー蛋白質遺伝子の頭文字をとつて BRR1遺伝子と称する。
[0029] 本発明において有用な遺伝子としては、上記 BRR1 (AGIコード: Atlg22500)以 外に AGIコード: At5g27420、 At5g41400等の遺伝子が例示される。さらにシロイ ヌナズナ以外の植物については、 目的の植物に由来する、前記遺伝子と同一の機 能を有する遺伝子であれば特に限定はなぐ例えばマスクメロンの GenBank ACC ESSION:AAV43794の遺伝子、ライスの GenBank ACCESSION :XM— 483 020の遺伝子、あるいはライスの、 GenBank ACCESSION :XM— 450948の遺 伝子等が挙げられる。
[0030] 前記遺伝子は、ノックダウンするためのいくつかの独立した形質転換体を作製して 同様な表現型が出現することを調べ、この表現型が前記遺伝子のノックダウンに起因 するものであることを確認することができる。この操作によりノックダウン効率の異なる 個体が得られれば、表現型の強弱とノックダウンの手法、例えば使用されたベクター 等との相関を見ることも可能である。
[0031] 本発明において有用な遺伝子である Atlg22500の遺伝子がノックダウンされたシ ロイヌナズナは、矮ィ匕の形質ば力りでなぐ茎数の増加、葉の暗緑色化などの特徴的 な形質改変を示す。これは、ブラシノステロイドの生合成系酵素のノックアウト植物の 形質と似て 、るが、前記遺伝子はシグナル伝達の中流から下流に位置する機能性 因子、転写因子'調節因子と予想されることから、このようなカテゴリーの遺伝子で強 い表現型が確認された初めてのケースである。また、 C3HC4—タイプのリング'フィ ンガ一'ドメインを有する点で RING— H2 finger (C3H2C3 -type RING finge r)を有する前記の BRH1のノックアウト形態とも異なる。すなわち、 Atlg22500の遺 伝子は、ュビキチンィ匕システムによる蛋白質分解による機能調節とブラシノステロイド のシグナル伝達を強く結びつける最初の例であると推測される。
[0032] (2)本発明の植物の形質改変方法
本発明の植物の形質改変方法は、上記（1)記載の遺伝子を抑制することができる 核酸を用いることを特徴とする。例えば、植物個体中でブラシノステロイド刺激に対し てその発現が変動し、 XTR7 (At4gl4130)と発現変動の相関が高ぐかつリング. フィンガー ·ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することを 特徴とする植物の形質改変方法である。前記遺伝子の例としては、シロイヌナズナで 見出された、 AGIコード: Atlg22500として知られている遺伝子、もしくは該遺伝子 のコードするポリペプチドと同一の機能を有するポリペプチドをコードする遺伝子が挙 げられる。
当該方法に用いられる核酸としては、 AGIコード: Atlg22500遺伝子をターゲット とする場合、例えば（1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリべ プチドをコードする遺伝子又はその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダィズする核 酸、（2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置 換、欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝 子又はその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダィズする核酸であれば特に限定はさ れない。
[0033] 前記「厳密な条件化でハイブリダィズする」とは、特に本発明を限定するものではな ヽカ 0. 50/0SDS、 0. 10/0ゥシ血清ァノレブミン、 0. 10/0ポリビニノレピロリドン、 0. 1% フイコール 400、 0. 01%¾'|4^-^ϋ^-ϋΝΑ^ϋ>6 X SSC (1 X SSC«, 0. 15M NaCl、 0. 015M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0である）中、 65。Cにて 12〜20時間 インキュベートした後、 0. 5%SDSを含む 2 X SSC中、 65°Cにて 30分間洗浄を行つ ても、本発明にお 、て有用な遺伝子の相補鎖の全部ある 、はその一部とハイブリダ ィズしていることを言う。
[0034] 上記方法は、 V、わゆるターゲット遺伝子のノックダウン方法であり、特に限定はな!/、 力 RNA干渉法、アンチセンス法、コ'サブレッシヨン法等が例示される。下記実施例 にも記載のとおり、シロイヌナズナの場合には、ターゲット遺伝子の塩基配列の一部 がアンチセンス、センス方向の両方で挿入されたバイナリ一ベクタープラスミドを導入 されたァグロバタテリゥムを感染させることにより、ターゲット遺伝子の一部の塩基配列 を有する二本鎖 RNAが植物個体内で発現され、 RNA干渉が起こる。
前記 RNA干渉法において使用できる核酸としては、他の遺伝子との間に相同性の ない塩基配列を有するものが好ましぐその鎖長は 20〜： L000塩基の範囲、好ましく は 100〜500塩基の範囲、さらに好ましくは、 250〜350塩基の範囲である。特に好 ましくは、 300塩基程度の鎖長であって目的の遺伝子に対する配列特異性が高いも のが例示される。例えば配列表の配列番号 9記載の塩基配列ある 、はその断片の塩 基配列及び Z又はその相補鎖の塩基配列を有する核酸を使用することができる。前 記断片として特に限定はな 、が配列表の配列番号 11記載の塩基配列及び Z又は その相補鎖の塩基配列を有する核酸が例示される。
[0035] 配列表の配列番号 11記載の塩基配列をノックダウン方法に利用する場合、当該塩 基配列及び Z又はその相補鎖の塩基配列を有する核酸を RNAに変換できるような 任意の方法に使用するか、あるいは前記核酸に対応する RNAを使用するかの 、ず れの方法であってもよい。例えば、配列表の配列番号 11記載の塩基配列を有する 核酸に対応する RNAはコ'サブレッシヨン法に、配列表の配列番号 11記載の塩基配 列及びその相補鎖の塩基配列を有する核酸に対応する RNAは RNA干渉法に、ま た配列表の配列番号 11記載の塩基配列の相補的な塩基配列はアンチセンス法に 利用できる。
前述の RNA干渉による目的遺伝子の発現抑制の結果、前記植物個体は矮性、茎 数の増加、葉の暗緑色化等の表現型を示すこととなる。こうして、本発明を利用する ことにより、優良形質を備えた商業的に価値のある新規な植物品種を創製することが できる。
[0036] (3)本発明の植物体
本発明の植物体は、前記（1)記載の遺伝子をターゲットとし、前記（2)記載の方法 で作成することができる。本発明の植物体は、（a)矮性、（b)茎数の増カ卩、及び Z又 は（c)葉の暗緑色化して 、るものが例示される。
本発明にお 、て、矮性とは当該植物個体の丈が野生体に比較して低 、ことを言う。 また、茎数の増加とは当該植物個体の茎数が野生体に比較して多いことを言う。さら に葉の暗緑色化とは当該植物個体の葉の色が野生体に比較して濃い緑色になるこ とを言う。
例えば、シロイヌナズナの場合、上記のとおり BRR1遺伝子をノックダウンすることに より、矮性の個体を作製することができる。同様に、ブラシノライドにレスポンスして、 X TR7と発現変動に相関があり、さらにリング'フィンガー ·ドメインをもつ蛋白質をコード する別の遺伝子をノックダウンすることによつても矮性の個体を作製することができる 実施例
[0037] 以下に実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲 内に限定されるものではない。
[0038] 実施例 1 ブラシノステロイドにレスポンスする遺伝子の収集 ァラビドプシス DNAマイクロアレイ（タカラバイオ社製）を用いて、ブラシノステロイド で制御される細胞壁関連遺伝子やブラシノステロイドの生合成と代謝関連遺伝子の 調節因子をスクリーニングした。
(1)試料の調製
シロイヌナズナの野性株 (コロンビア株）とブラシノステロイドの生合成のノックアウト ライン det2— 1の種子（ABRC :Arabidopsis Biological Resource Centerより 種子を分与、ストック No. CS6159、 http : Z/ www. biosci. ohio— state. eduZ 〜plantbioZFacilitiesZabrcZabrchome. htm)を殺菌後、 100粒以上を 1Z2 MS液体培地 (和光純薬社製）、 Sucrose濃度 1. 5% (vZv)を入れた 9cm径深型シ ヤーレに入れた。 4°C、暗所 2日間の春化処理後、 22°C、照光下（24時間連続照明、 3000ルクス）で 7日間栽培した。
[0039] 7日目の芽生えを用いて、 DMSO (終濃度 0. 1%, v/v)に溶力したブラシノライド
(第一ファインケミカル社製、終濃度 10nM)で 3h処理した区と、模擬試験として DM SO (終濃度 0. 1%, vZv)で 3h処理した対照区と別々に芽生えを回収した。各々を トリゾル試薬（ギブコネ土製）により全 RNAを抽出した後、 RNase free DNasel (タカ ラバイオ社製）によりゲノム DNAを除去した。
[0040] (2) DNAマイクロアレイによるハイブリダィゼーシヨン
RNA Transcript SureLABEL™ Core Kit (タカラバイオ社製）を用いて、野 性株 (コロンビア株）と det2株のそれぞれについて、対照区を Cy3標識、ブラシノライ ド処理区を Cy5標識した。タカラ DNAチッププロトコールにしたがって、競合ノヽイブリ ダイゼーシヨンを行った。野性株（コロンビア株）と det2株のそれぞれについて、ブラ シノライドによってアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子群を見出 した。 2倍の変動を閾値にして選択すると 1488遺伝子がブラシノライド処理で変動す ることが確認できた。
[0041] 実施例 2 遺伝子発現比データを用いたシグナル伝達の中流から下流に位置するよ うな機能性因子、転写因子 ·調節因子の探索
シロイヌナズナにお 、て、さまざまな組織や環境刺激に対してのアレイ実験に基づ く網羅的発現解析データとして、 AFGC (Arabidopsis Functional Genomics Consortium)が行ったマイクロアレイプロジェクトのデータを利用した。このデータは 、TAIR(The Arabidopsis Information Resource)の FTPサイト（ftp : //ftp . arabidopsis. org/home/ tair/ Microarrays/ analyzed― data/ノ； gら afgc —data— 397— 061703. zipとして入手できる。
この 397のアレイ実験に基づく発現比データを用いて、細胞壁関連酵素 EXGT遺 伝子ファミリーである At— XTH15,別名、 XTR7 (AGIコード: At4gl4130)と At— XTH16 (AGIコード: At3g23730)、細胞伸長に関係あるエタスパンシン遺伝子 EX PL1 (AGIコード: At3g45970)、ブラシノステロイドの生合成と代謝関連遺伝子 CP D (AGIコード: At5g05690)に注目して、上記実施例 1で発現変動のあった遺伝子 群との相関係数を求めた。
その結果、ブラシノライドで 2倍以上レスポンスして、注目遺伝子に相関係数が 0. 3 以上で相関している遺伝子を 57種類見出した。
[0042] 実施例 3 遺伝子特異的に発現ノックダウンする配列の設計と作成
上記実施例 2の 57種類の遺伝子に対して遺伝子ノックダウンを行うため、遺伝子特 異的な配列の設計および DNA断片を作製した。
(1)遺伝子特異的な配列の設計
遺伝子特異的なノックダウンを起こすために、他の遺伝子と類似性のな 、配列の設 計および DNA断片を作製した。すなわち、まず、シロイヌナズナの cDNAクローンの 配列を含む全 EST配列、ゲノム情報からの ORF配列を用いて、 ESTクラスタリングと アセンブルを行った結果、 25, 397個に分類された。これにより重なりのない転写配 列データベースを作成した。この結果力も cDNAクローンに関しては配列を推定した 。 BLASTのホモロジ一サーチアルゴリズムを用いた類似性の解析を遺伝子配列毎 に、転写配列データベースをもとに転写配列全体またはゲノム全体に対して行なつ た。その結果を配列の各塩基に対してポイントを与えていき、このポイント評価により 最もホモロジ一の低 、領域を決定し、ノックダウンに用いるターゲット領域配列 (長さ 約 300塩基）とした。また、 cDNAクローンのない遺伝子に関しては、ゲノム配列から 遺伝子特異的配列 (長さ約 300塩基)を設計した。
[0043] (2) DNA断片の作製 シロイヌナズナ cDNAクローン DNAあるいはシロイヌナズナゲノム DNAを铸型に、 それぞれの遺伝子のターゲット領域の両末端の 20base配列に M4配列、 RV配列を 付加したプライマー（例えば、 BRR1遺伝子用としては、配列表の配列番号 1及び 2 記載の塩基配列を有する）を用いて、 PCRあるいは ICAN法で遺伝子増幅して作製 した。得られた各 DNA断片は、ァガロースゲル電気泳動で純度を、吸光度で収量を 確認した。また、各 DNA断片を MegaBaseシークェンサ一を用いて配列解析を行つ たところ、 目的のターゲット領域の配列が確認された。
[0044] 実施例 4 植物への遺伝子導入のためのァグロバタテリゥム作製
(1) Gateway system (インビトロジェン社製）を用いたコンストラクト作製
上記実施例 3で作製した遺伝子特異的 DNA断片を铸型とし、配列番号 3及び 4で 示される塩基配列を有するプライマー (インビトロジェン社製)を用いた PCRにより約 3 OObpの DNA断片を増幅した。 PCR Cloning System with Gateway Tech nology (インビトロジェン社製）を用いてそのプロトコールに従って、 BP反応を行いェ ントリークローンを作製した。次に、 Gateway LR Clonase Enzyme Mix (インビ トロジェン社製）を用いてそのプロトコールに従って、 LR反応を行い、 pKRHlOlベタ ターにターゲット遺伝子がアンチセンス、センス方向で挿入されたノイナリーベクター プラスミドを作製した。そのバイナリーベクタープラスミドを図 1に示す。
[0045] 上記 pKRHlOlベクターは、植物での RNA干渉による遺伝子発現ノックダウン用に 作製したベクターであり、以下の手順で作製した。
まず、 pBI221プラスミド (クロンテック社製)を制限酵素 Xbalで切断後ブランティン グ、脱リン酸化したプラスミドに、 Gateway Vector Conversion System (インビ トロジェン社製）の RfC. 1カセットをライゲーシヨンして、 35S promoter -attRl - CmR - ccdB - attR2 - GUSの向きにカセットが挿入されたプラスミド pBI221— R を作製した。
次に、 pBI221—Rプラスミドを SnaBIと Saclで切断して GUS配列の 3'側の部分を 取り除いたプラスミド断片に、次の手順で作製した RfC. 1カセットの末端が平滑末端 と Saclサイトを持つカセットをライゲーシヨンして、 GUS配列の 5'側の部分をループ 構造とする RfC. 1カセットがインバーティドリピート構造をとるプラスミド pBI221— R2 を作製した。
[0046] RfC. 1カセットの末端が平滑末端と Saclサイトを持つカセットは、 pUCl 9プラスミド
(タカラバイオ社製)を Sphlと Kpnlで切断した後ブランティング、脱リン酸ィ匕したブラ スミドに、 Gateway Vector Conversion Systemの RfC. 1カセットをライゲーシ ヨンして、 Saclサイト一 attRl - CmR-ccdB - attR2 - Hindlllサイトの向きにカセ ットが挿入されたプラスミドを作製し、これを Hindlllで切断後ブランティングし、その 後さらに Saclで切断することにより作製した。
最後に、植物への導入用のバイナリーベクターとするために、バイナリーベクター pi G121— Hmプラスミド（Ohta s. , Mita S. , Hattori T. , Nakamura Κ. , Ρ lant Cell Physiol. , 31, 805— 813, 1990)を Hindlllと Saclで切断し、 35S promoter— intron— GUSの配列を除き、そこに pBI221—R2プラスミドを Hindlll と Saclで切断し精製した Hindlllサイト— 35S promoter- attRl - CmR - ccdB - attR2 - GUS - attR2 - ccdB - CmR - attRl - Saclサイトの DNA断片をライ ゲーションしてプラスミド pKRH 101を作製した。
[0047] (2)ァグロバタテリゥムの形質転換
エレクト口ポレーシヨン法を用いて、上記（1)で得られたプラスミドによるァグロバクテ リウム EHA105の形質転換を行 、、カナマイシン 100 μ g/ml、ノ、ィグロマイシン 100 g/mlを含む LB寒天培地にて、 28°C、 2晚、静置培養を行った。配列表の配 列番号 5及び 6、さらに配列番号 7及び 8記載の塩基配列を有するプライマーを用い てコロニー PCRを行い、導入遺伝子を有するァグロパクテリゥムを選抜し、形質転換 ァグロバタテリゥムを作製した。
[0048] 実施例 5 ノックダウン植物の作製
(1)シロイヌナズナの播種、育成
シロイヌナズナ（コロンビア株）の種子をロックウール (ァラシステム社製）に播種し、
24時間 明条件にて約 3週間栽培後、摘心を行い、 16時間明、 8時間 暗条件で数 日から一週間放置した。
[0049] (2)ァグロバタテリゥムの感染
上記実施例 4で作製した組換えァグロバタテリゥムをシロイヌナズナに感染させた。 配列表の配列番号 9 (塩基配列）及び 10 (アミノ酸配列）記載の BRR1 (AGIコード： Atlg22500)の遺伝子ノックダウン用のァグロバタテリゥムは、 2鉢の植物体に感染 し、植物体をそれぞれ 209— 1と 209— 2と命名した。上記バイナリーベクターに挿入 した塩基配列を配列表の配列番号 11に示す。
感染は、カナマイシン (最終濃度 100 μ g/ml)、ノ、イダロマイシン (最終濃度 10 0 μ g/ml)を含む LB液体培地にて 28°C ニ晚培養した組み換えァグロバタテリゥム の菌体を回収後、湿潤用懸濁培地（1Z2 X MS塩、 l/2 X Gamborg B5ビタミン、 5%ショ糖 (vZv)、 0. 5gZL— MES)に懸濁し、つぼみに適下することにより行った 。感染後の植物体を長日条件にて栽培した。
[0050] (3) T1種子の選抜
感染した植物体の自家受粉により得られた種子を、カナマイシン 50 μ g/ml、ハ ィグロマイシン 10 g/ml、カルべ-シリン 100 g/mlを含む MS0培地上に移 植し、発芽 ·生育が旺盛な T1個体（209— 1— 1〜209— 1— 4および 209— 2— 1〜 209— 2— 3)を選抜、ロックウールに移植し、育成した。
(4) T2植物体の選抜と T3種子の取得
選抜されたトランスジ ニック T1植物体の種子 (T2種子）を、上記（3)と同様の選択 培地に移植し、著しく生育旺盛な遺伝子型がホモであると予想された T2植物体を選 抜後、育成し、 T3種子を取得した。
T1植物体、すなわち 209— 1—4および 209— 2—1より得られた種子力 栽培した T2植物体の形態について図 2に示す。図中、「Wild」は野生株、「209」は 209— 1 - 4の T2植物体を示す。
[0051] 図 2に示したように、栽培した非形質転換植物体 (wild type,野生型）に比較して 、本発明の植物体のいずれもが著しく背丈が低ぐ茎の量が多い表現型を示すこと が確認できた。
[0052] (5) T3植物体の表現型
遺伝子型がホモであると予想された T2植物体 209— 1—4— 3、 209— 2—1— 1の 自家受粉により得られた T3種子を、青色'赤色光照射下で 11日間育成した。その結 果を図 3に示す。 [0053] 図 3に示したように、非形質転換体 (wild type,野生型）と比較して、本発明の植 物体は、胚軸長が短くなつていることが確認できた。
また、上記（3)と同様の選択培地プレートで栽培したところ、すべての種子が旺盛 に生育したので、導入遺伝子型がホモであることが同定された。
[0054] 実施例 6 ノックダウンラインにおけるターゲット遺伝子発現量の確認
本発明のノックダウンラインにおけるターゲット遺伝子の RNA干渉を調べるためにリ アルタイム PCRを行つた。
(1)試料の調製
青赤光下で 12日間生育させたシロイヌナズナ野生株、ノックダウンライン 209— 1— 4— 3ならびに 209— 2— 1—1より、芽生えを回収した。トリゾル試薬 (ギブコネ土製）に より全 RN Aを抽出した後、 RNase free DNasel (タカラバイオ社製）によりゲノム D NAを除去した。
[0055] (2)逆転写反応およびリアルタイム PCR
逆転写反応およびリアルタイム PCRは、 SYBR (登録商標） RT— PCR Kit (Pe rfect Real Time、タカラバイオ社製）を用い、添付のプロトコールに従って行った 。すなわち、野生株および 209— 1—4— 3、 209— 2— 1—1の全 RNAを铸型とし、 Random hexamerをプライマーに用 、た逆転写反応により一本鎖 cDNAを合成し た。なお、野生株の全 RNAについては、検量線作成用として、段階希釈したものを 用いた。次に、野生株およびノックダウンラインの 2個体力も調製した一本鎖 cDNAを 铸型とし、 Smart Cycler II Systemによるリアルタイム PCRを行った。
[0056] 増幅のターゲットとした 18S rRNA遺伝子の増幅には、配列表の配列番号 12、 1 3記載の塩基配列を有するプライマーを用いた。また、 BRR1遺伝子については、 3 つの領域、すなわち導入 DNA配列の一部 (A:導入領域内）、および導入配列から 離れた部位 (Β : 5'側、または C : 3'側の領域)を増幅のターゲットとした。当該導入配 列の増幅には、配列表の配列番号 14、 15記載の塩基配列を有するプライマー（以 下、導入領域内プライマーと呼ぶ)を用いた。遺伝子導入配列から離れた部位の増 幅には、配列表の配列番号 16、 17記載の塩基配列を有するプライマー（以下、導入 領域外 5'プライマーと呼ぶ）、および配列表の配列番号 18、 19記載の塩基配列を 有するプライマー（以下、導入領域外 3，プライマーと呼ぶ)を用いた。
上記プライマー対を用いてリアルタイム PCR実施後、得られた Ct値をそれぞれの 検量線に代入し、初期铸型量を算出した。 18S rRNAの発現量により、個体間の R NA量を補正した後、ノックダウンライン 2個体における BRR1遺伝子の RNAの相対 量、すなわち野生株における発現量を 100とした場合の RNA含量を算出した。その 結果を図 4に示す。図 4中、縦軸は野生株に対する BRR1遺伝子の RNA発現量の 相対量％を示し、横軸は、ノックダウンラインの種類を示す。
[0057] 図 4に示したように、植物体に導入した遺伝子配列自身の RNA発現量は増加した 力 導入配列以外の領域の RNA発現量は、半分以下に抑えられ、最大 27%に抑え られていた。従って、 RNA干渉の作用により、 BRR1遺伝子の RNA発現が抑制され たと考えられた。
また、 RNA発現抑制の効率が高 、209— 1 4 3にお 、て上記実施例 5の胚軸 長が約 5mm、 RNA発現抑制の効率がやや低い 209— 2— 1 1の胚軸長が約 7. 5 mm、野生型が約 9mmであることから、 RNA発現抑制の度合いと胚軸長の表現型と は密接に相関していることが確認できた。
(3)ノーザンブロッテイング解析
さらに野生株、ノックダウンラインの芽生え Total RNAについて、 DIG標識した PC Rプローブを用いたノザン解析を行なった。ノザン解析は、常法に従って行った。そ の結果、ノックダウンラインでのみ、 20 nt付近にバンドが検出され、 BRR1由来の si RNAの生成が確認できた。
図面の簡単な説明
[0058] [図 1]本発明で用いるバイナリーベクターの模式図である。
[図 2]本発明のノックダウンラインの形態の比較を示す図である。
[図 3]本発明のノックダウンラインの胚軸長の比較を示す図である。
[図 4]本発明のノックダウンラインの RNA干渉を示すグラフである。
産業上の利用可能性
[0059] 本発明により、農業上重要な形質である矮性の植物体を効率よく生産することがで きる。また、目的の植物の収量を増加させることができる。さらに本発明により任意の 遺伝子に関連する転写因子や任意の遺伝子の調節因子を効率的に見出すことがで きる。すなわち、人為的な単一の遺伝子変異により効率的に農業上重要な形質であ る矮性の植物体を作成することが可能となり、有用農作物生産の分野において有用 な技術である。
配列表フリーテキスト
SEQ ID No:l; A sequence of designed oligonucleotiae PCR primer for amplifying B RR1 gene
SEQ ID No:2; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying B RR1 gene
SEQ ID No:3; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for using Gatew ay system
SEQ ID No:4; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for using Gatew ay system
SEQ ID No:5; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No:6; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No:7; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No:8; A sequence of designed oligonucleotide primer for using colony PCR SEQ ID No:l l; A fragment of BRR1 gene for inserting binary vector
SEQ ID No: 12; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying 18S rRNA
SEQ ID No: 13; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying 18S rRNA
SEQ ID No: 14; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRR1 gene
SEQ ID No: 15; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRR1 gene
SEQ ID No: 16; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRR1 gene SEQ ID No: 17; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRRl gene
SEQ ID No: 18; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRRl gene
SEQ ID No: 19; A sequence of designed oligonucleotide PCR primer for amplifying BRRl gene

Claims

請求の範囲 [1] 植物の形質を改変する方法であって、植物個体中でブラシノステロイド刺激に対して その発現が変動し、 XTR7 (At4gl4130)と発現変動の相関が高ぐかつリング'フィ ンガー ·ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することを特 徴とする植物の形質改変方法。 [2] 野生型植物と比較して、下記力 選択される形質の改変がもたらされる請求項 1記載 の植物の形質改変方法； (a)矮性 (b)茎数の増カロ；および (c)葉の暗緑色化。 [3] 植物個体中で下記の遺伝子の発現を抑制することを特徴とする請求項 1または 2記 載の植物の形質改変方法：
(1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 遺伝子；
(2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子で あって、植物個体中での発現が抑制されると植物の形質が改変される遺伝子；およ び
(3) (1)または（2)のポリペプチドをコードする遺伝子の相補鎖に厳密な条件下でノヽ イブリダィズする遺伝子であって、植物個体中での発現が抑制されると植物の形質が 改変される遺伝子。
[4] RNA干渉により遺伝子の発現を抑制する請求項 1〜3いずれかに記載の植物の形 質改変方法。
[5] 配列表の配列番号 9記載の塩基配列あるいはその断片の塩基配列及び Z又はその 相補鎖の塩基配列を有する核酸を使用する請求項 4記載の植物の形質改変方法。
[6] 野生型植物と比較して、矮性、茎数の増加あるいは葉の暗緑色化の 、ずれかの形 質の改変に関与する遺伝子であって；
(1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 遺伝子；
(2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子； および
(3) (1)または（2)のポリペプチドをコードする遺伝子の相補鎖に厳密な条件下でノヽ イブリダィズする遺伝子。
[7] 植物個体の形質の改変に関与する遺伝子の発現を抑制する核酸であって、下記特 徴を有する核酸；
(1)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする 遺伝子又はその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダィズする核酸;及び
(2)配列表の配列番号 10に示されるアミノ酸配列に 1〜数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、または挿入がなされたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子 又はその相補鎖に厳密な条件下でハイブリダィズする核酸。
[8] 配列表の配列番号 9記載の塩基配列あるいはその断片の塩基配列及び Z又はその 相補鎖の塩基配列を有する請求項 7記載の核酸。
[9] 請求項 1〜5 ヽずれか記載の方法で作成された、形質が改変された植物。
[10] 下記力 選択される形質の改変力あたらされて!、る、請求項 9記載の植物；
(a)矮性
(b)茎数の増カロ；および
(c)葉の暗緑色化。
[11] (1)ブラシノステロイドによる刺激に応答する遺伝子を探索する工程；
(2)上記（1)工程で得られた遺伝子群より細胞壁の再構築を担う遺伝子との間に遺 伝子発現比の相関の高 、遺伝子を集める工程；および
(3)上記（2)工程で選択された遺伝子の機能を、前記遺伝子の発現を制御した形質 転換植物を作成して確認する工程を包含することを特徴とする、前記細胞壁の再構 築に関連する植物の形質改変に有用な遺伝子の探索方法。
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