WO2006107063A1 - 酵素活性測定方法及び化合物の評価方法 - Google Patents

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WO2006107063A1
WO2006107063A1 PCT/JP2006/307171 JP2006307171W WO2006107063A1 WO 2006107063 A1 WO2006107063 A1 WO 2006107063A1 JP 2006307171 W JP2006307171 W JP 2006307171W WO 2006107063 A1 WO2006107063 A1 WO 2006107063A1
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reaction
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acceptor
molecule
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Shigeru Tokita
Ken Shimamura
Yasuhisa Miyamoto
Hidefumi Kitazawa
Akio Kanatani
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the activity of an enzymatic reaction that produces a fat-soluble reaction product.
  • Biochemical and cell biological evaluation systems based on the properties of biomolecules targeted for drug discovery (for example, enzyme assembly systems and binding assembly systems) to identify many candidate compounds. Screen by evaluating. The probability of selecting one development candidate compound is said to be one of several tens of thousands of compounds, and it is essential for efficient drug development to consider a large number of development candidate compounds by improving the screening speed. It is.
  • HTS High Through-put Screening
  • the reaction product of the enzyme may be a fat-soluble substance.
  • the reaction product is extracted using an organic solvent for quantification and qualitative analysis, and then HPLC (high performance chromatography to GC), GC (gas chromatography) and TLC (thin l ayer chromatography) etc. had to be combined for analysis.
  • JP-A-2003-212790 when extracting a fat-soluble component derived from agaricus mushroom as an effective component for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases, the fraction is applied to a silica gel column after extraction with aceton and chloroform. The method of obtaining is described.
  • Patent Document 1 JP 2003-212790 A
  • the conventional method requires an organic solvent extraction process when extracting a fat-soluble substance, and requires a multi-step process from the enzyme reaction to the measurement of enzyme activity.
  • the conventional method requires an organic solvent extraction process when extracting a fat-soluble substance, and requires a multi-step process from the enzyme reaction to the measurement of enzyme activity.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned problems of the prior art, and can be processed in a simple process from enzyme reaction to measurement of enzyme activity, and can be applied to an HTS evaluation system. It aims at providing the measuring method of activity.
  • the present inventors have mixed a substance (an acceptor) that binds to a fat-soluble substance produced by an enzyme reaction into an enzyme reaction solution, and through the acceptor.
  • an acceptor an acceptor
  • the inventors By detecting the reaction product, the inventors have found a method capable of measuring enzyme activity without extracting the reaction product, and have completed the present invention.
  • the activity measurement method of the present invention is a method for measuring the activity of an enzyme reaction that catalyzes an addition reaction between two or more substrates to produce a fat-soluble reaction product, and is a label for labeling any one substrate
  • a reaction step in which an enzyme reaction is performed in the presence of an enzyme, all substrates and an acceptor, and a labeled molecule and a molecule to be detected are brought close to each other via the acceptor, and energy generated from the labeled molecule is transferred to the molecule to be detected.
  • a detection step of detecting a reaction product by performing the step.
  • the activity measurement method of the present invention is a method for measuring the activity of an enzyme reaction that catalyzes an addition reaction between two or more substrates to produce a fat-soluble reaction product, and any one substrate is labeled.
  • a labeling step a reaction step in which an enzyme reaction is carried out in the presence of the enzyme and all substrates, a mixing step in which the enzyme reaction solution is mixed with an acceptor that binds to the reaction product, and an acceptor
  • the acceptor is specific to a reaction product. It is preferable that the substance binds to each other. By using such an acceptor, the enzyme activity can be measured with higher accuracy.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound acting on an enzyme that catalyzes an addition reaction between two or more substrates, a labeling step for labeling any one substrate, an enzyme,
  • the reaction process in which the enzyme reaction is performed in the presence of all substrates, acceptor and test compound, and the labeled molecule and the detected molecule are brought close to each other via the acceptor, and the energy generated from the labeled molecule is detected molecule.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on an enzyme that catalyzes an addition reaction between two or more kinds of substrates, and includes a labeling step for labeling any one substrate, an enzyme, A reaction step in which an enzyme reaction is performed in the presence of all substrates and a test compound, a mixing step in which an acceptor that binds to a reaction product is mixed in the enzyme reaction solution, and a labeled molecule and a target to be detected via the acceptor A detection step of detecting a reaction product by bringing a molecule into proximity and transferring energy generated from the labeled molecule to a molecule to be detected.
  • the acceptor is preferably a substance that specifically binds to a reaction product.
  • the enzyme activity measurement kit of the present invention is characterized by comprising an enzyme that catalyzes a fat-soluble reaction product, a substrate of the enzyme, and an acceptor.
  • the process from enzyme reaction to measurement of enzyme activity can be processed in a simple process, and it is possible to provide a method for measuring enzyme activity that can be applied to an HTS evaluation system. Further, by using the activity measurement method of the present invention, it becomes possible to evaluate compounds acting on the enzyme (measurement of compound activity, screening, etc.) Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 shows the results of measuring the enzyme activity of LCE by the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of measuring the enzyme activity of hEl ovl 3 by the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of measuring the enzyme activity of hE 1 ov 11 by the method of the present invention.
  • the “enzyme” according to the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that catalyzes a reaction that generates a fat-soluble substance as a product of the enzyme reaction.
  • LCE accession number: A 027031
  • FAS fat ty ac id synthase
  • Elovl l desame as BC000618, NM_022821
  • El ovl 2 desame as BC060809
  • Elovl3 (same as BC034344)
  • Elov as AY037298
  • ⁇ ⁇ Fatty acid id elongase such as AF338241
  • Acy ⁇ CoA synthase such as AF338241
  • Acy ⁇ CoA synthase such as AF338241
  • Acy ⁇ CoA synthase such as AF338241
  • Acy ⁇ CoA synthase such as AF338241
  • examples of the enzyme according to the present invention include various membrane proteins, various phospholipids, and neutral lipid synthesizing / metabolizing enzymes.
  • Specific examples of such enzymes include: acyl transferase, acetyl hydrase, lipase, glycerol kinase (accession number: NM_033214) and choline phosphotransferase (same: NM_202244).
  • membrane proteins such as various cholesterol synthesis or metabolic enzymes are also included in the enzyme according to the present invention.
  • the “substrate” according to the present invention is not particularly limited as long as it is a substrate of the enzyme.
  • the enzyme catalyzes the addition reaction of two substrates, for example, when the enzyme is LCE, it is long.
  • short- or medium-chain fatty acid acyl-CoA which is a substrate of FAS and malonyl CoA
  • saturated ultra-long-chain fatty acid acyl CoA which is a substrate of Elovls
  • Saturated fatty acid asil CoA a short-chain or long-chain fatty acid that is a substrate of a acyl CoA synthase and Activated CoA
  • medium- or long-chain fatty acid acyl CoA and glycerol 3-phosphate which are substrates of GPAT
  • medium- or long-chain fatty acid acyl CoA and daricerol 3-phosphate lysophospholipid, which are substrates of phospholipid synthase
  • Mention may be made of medium or long chain fatty acid acyl CoA and diacylglycerol, which are DGAT substrates, or medium chain or long chain fatty acid acyl CoA and monoacylglycerol, which are MGAT substrate
  • any one of the “substrates” according to the present invention needs to be modified so as to be detectable in the detection step.
  • the mode of such modification There is no particular limitation on the mode of such modification, and it may be modified to a suitable mode depending on the detection method.
  • FRET Fluorescence resonance energy trans fer
  • fluorescent dye labeling fluorescent dye labeling
  • SPA Sc int ill at In the case of ion proximity assay
  • a radioisotope label can be mentioned.
  • the “fat-soluble reaction product” is not particularly limited as long as it is a fat-soluble substance produced by the enzyme reaction of the above-mentioned enzyme.
  • acyl-CoA Acy ⁇ CoA
  • medium- or long-chain fatty acids and medium- or long-chain fatty acids resulting from enzymatic reactions of FAS and saturated super-long-chain, long-chain fatty acids or unsaturated fatty acids and saturated super-saturated resulting from enzymatic reactions of CoA and Elovls Long-chain, long-chain fatty acid or unsaturated fatty acid asil CoA
  • Acy ⁇ CoA produced by enzymatic reaction of Acy ⁇ CoA synthase
  • Lyso PA produced by enzymatic reaction of GPAT
  • triacylglycerol produced by the enzymatic reaction of DGAT and diacylglycerol produced by the enzymatic reaction
  • the “acceptor” according to the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that binds to the “fat-soluble substance produced by the enzyme reaction”.
  • an antibody against the fat-soluble substance the fat-soluble substance Examples thereof include membrane-type receptors having affinity for substances, nuclear receptors, and lipid transport proteins.
  • the acceptor according to the present invention is preferably a substance that specifically binds to a fat-soluble substance.
  • ACBP Acyl-CoA Binding Protein for LCE enzyme reaction product
  • Acyl-CoA Binding Protein Acyl-CoA Binding Protein
  • Lyso PA binding protein for Lyso-PA an enzyme reaction product of GPAT
  • Phosphoipid binding protein for hosphol ipid an enzyme reaction product of PL synthesizing enzyme.
  • the phosphatidylcholine transport protein is an acceptor. By using such an acceptor that specifically binds, it is possible to accurately measure enzyme activity without detecting noise due to nonspecific binding.
  • the activity measurement method of the present invention is a method for measuring the activity of an enzyme reaction that catalyzes an addition reaction between two or more substrates to produce a fat-soluble reaction product, and is a labeling step for labeling any one of the substrates And a reaction step in which an enzyme reaction is performed in the presence of an enzyme, all substrates, and an acceptor, and the labeled molecule and the molecule to be detected are brought close to each other via the acceptor, and energy generated by the label molecule is transferred to the molecule to be detected. And a detection step of detecting a reaction product.
  • the substrate is labeled so that it can be detected in a subsequent detection step.
  • the mode of labeling may be appropriately selected depending on the detection method, and examples thereof include radioisotope and labeling with a fluorescent dye.
  • the labeling method is not particularly limited, and may be performed by a known method (see, for example, Biochemistry, Vol. 43, pp. 2484, 2004).
  • the substrate thus labeled causes the enzyme reaction to proceed by allowing the enzyme and the remaining unlabeled substrate to coexist in the next reaction step. Further, the reaction may be carried out in the presence of an acceptor in the reaction solution.
  • the enzyme reaction conditions may be appropriately set in consideration of the optimum temperature, optimum pH, etc. of the enzyme to be used. For example, the conditions are similar to those of a living body, 35 to 40 ° C, pH 6.5. ⁇ 7.5 can be used as a suitable condition.
  • a buffer suitable for the reaction may be used as appropriate depending on the enzyme to be used. For example, a tris-HCl buffer, a phosphate buffer, or an acetate buffer can be used. Also, this These buffers may be used by appropriately adjusting various conditions such as salt concentration.
  • the enzyme reaction solution that has undergone the reaction step then proceeds to the mixing step.
  • an acceptor is added and mixed after the enzyme reaction.
  • an acceptor is added to the enzyme reaction solution. This step is not necessary when the enzyme reaction is carried out in the coexistence. Enzymatic reactions produce fat-soluble reaction products.
  • the method of addition and mixing is not particularly limited. For example, a solution containing an acceptor may be prepared, added to the enzyme reaction solution, stirred, and mixed. There are no particular restrictions on the mixing conditions, and conditions suitable for binding the reaction product and the substance that binds to the reaction product can be appropriately selected. This binds to the reaction product, resulting in a reaction product-acceptor complex.
  • the reaction in the reaction step, may be performed in a state where an acceptor is also present in an enzyme reaction solution containing an enzyme and a substrate of the enzyme.
  • the acceptor is sequentially bound to the reaction product that has been subjected to the enzymatic reaction in the solution. Therefore, it is possible to proceed to the detection process without going through the mixing process.
  • the complex produced in the mixing step contains a label derived from the substrate in a detectable manner. Therefore, in the next detection step, the presence of the reaction product is confirmed by detecting the label.
  • a suitable detection method can be appropriately employed in the detection step depending on the type of label. Specifically, for example, when the label is a fluorescent dye, it can be detected by a medium or device that detects fluorescence (for example, FRET system, top count).
  • the label is a radioisotope
  • it can be detected by a medium or device that detects the radioisotope (for example, SPA system, scintillation counter, CCD camera).
  • a standard curve is prepared using various standard enzyme products prepared by separately synthesizing or purifying, specifically, for example, various standard enzyme products labeled with fluorescent dyes, radioisotopes, etc. and various acceptors.
  • various standard enzyme products prepared by separately synthesizing or purifying, specifically, for example, various standard enzyme products labeled with fluorescent dyes, radioisotopes, etc. and various acceptors.
  • the enzyme activity is measured without going through the step of extracting the lipophilic reaction product generated by the enzyme reaction with an organic solvent or the like. be able to. Since extraction with an organic solvent requires multiple steps of mixing, stirring, and extraction, the reaction product can be extracted without going through such steps, allowing rapid extraction in a very simple process. As a result, it becomes possible to measure and evaluate the activity of many test substances in a short time. In addition, extraction with organic solvents often uses solvents that are harmful to the environment and the human body, and processing waste liquids is time consuming and expensive, so it is possible to perform activity measurements without using organic solvents. Is very big.
  • the method for evaluating a compound of the present invention is a method for evaluating a compound that acts on an enzyme that catalyzes an addition reaction between two or more kinds of substrates, a labeling step for labeling any one substrate, an enzyme, and all substrates
  • a detection step of detecting a reaction product by
  • test compound is not particularly limited as long as it is a compound that targets the “enzyme” according to the present invention.
  • examples of the compound that targets the enzyme include an enzyme agonist, an antagonist, and an impulsagonist.
  • the binding mode between the enzyme and the test compound is not particularly limited. For example, in the case of an inhibition reaction, it may be competitive inhibition or non-competitive inhibition.
  • the compound evaluation method of the present invention is carried out by further allowing the fc test compound to coexist in the reaction step of the aforementioned activity measurement method of the present invention and allowing the enzyme reaction to proceed in that state.
  • the test compound exerts some action on the enzyme, and as a result, a change in the activity of the enzyme reaction caused by inhibiting or accelerating the enzyme reaction is detected in the detection step, thereby detecting the test sample.
  • the compound can be evaluated.
  • the procedure of the evaluation method of the compound of this invention is demonstrated.
  • a substrate is labeled so that it can be detected in a subsequent detection step.
  • the mode of labeling may be appropriately selected according to the detection method, and examples thereof include radioisotope and labeling with a fluorescent dye.
  • a signage method There is no particular limitation, and it may be carried out by a known method (see, for example, Biochemistry, 43, 244, 1984, 2000).
  • the substrate to be labeled may be only one of two or more substrates.
  • the substrate thus labeled is allowed to coexist with the enzyme, the unlabeled substrate and the test compound in the next reaction step, thereby allowing the enzyme reaction to proceed.
  • the reaction may be carried out in the presence of an acceptor in the reaction solution.
  • Conditions for the enzyme reaction may be set as appropriate in consideration of the optimum temperature, optimum pH, etc. of the enzyme to be used. For example, the conditions are similar to those of living organisms.
  • 6.5 to 7.5 can be used as a suitable condition, and a buffer suitable for the reaction may be used as appropriate depending on the enzyme used, for example, Tris-HCl buffer, phosphate buffer, acetic acid Buffer solutions can be used, and these buffer solutions may be used by appropriately adjusting the salt concentration and the like.
  • the enzyme reaction solution that has undergone the reaction step then proceeds to the mixing step.
  • the mixing step is a step of adding and mixing an acceptor after the enzyme reaction when the enzyme reaction is carried out in the presence of two or more kinds of substrates and enzymes alone.
  • the acceptor is added to the enzyme reaction solution. This step is unnecessary when an enzyme reaction is carried out in the presence of. Enzymatic reactions produce fat-soluble reaction products.
  • the method of addition and mixing is not particularly limited. For example, a solution containing an acceptor may be prepared, added to the enzyme reaction solution, stirred, and mixed. There are no particular restrictions on the mixing conditions, and conditions suitable for the binding of the reaction product and the substance bound thereto can be appropriately selected. As a result, the acceptor binds to the reaction product to form a complex.
  • the reaction may be performed in a state where an acceptor is also present in an enzyme reaction solution containing a test compound, an enzyme, and a substrate of the enzyme.
  • the acceptor is sequentially bound to the reaction product that has been subjected to the enzymatic reaction in the solution. Therefore, it is possible to proceed to the detection process without going through the mixing process.
  • the complex produced in the mixing step contains a label derived from the substrate in a detectable manner. Therefore, in the next detection step, the presence of the reaction product is confirmed by detecting the label.
  • a suitable detection method can be appropriately employed in the detection step depending on the type of label. Specifically, for example, when the label is a fluorescent dye, It can be detected by a medium or device that detects light (eg, FRET system, top count).
  • the label when the label is a radioisotope, it can be detected by a medium or a device that detects the radioisotope (for example, a SPA system, a scintillation county, a CCD camera).
  • test compound for example, when multiple types of test compounds are evaluated using LCE as an enzyme, the enzyme activity of LCE is suppressed in the presence of a certain test compound, As a result, if the amount of fat-soluble substance (eg Acyl_CoA) produced by the enzymatic reaction is reduced compared to the control group (in the state where no test compound coexists), the test compound is LCE It is recognized to function as an inhibitor. Since LCE has a function of promoting fatty acid synthesis by extending the carbon chain of fatty acid, inhibiting this inhibits synthesis of fatty acid and consequently suppresses synthesis of fat. That is, the test compound can be considered as a compound exhibiting an anti-obesity effect.
  • fat-soluble substance eg Acyl_CoA
  • the enzyme activity can be measured without going through the step of extracting the fat-soluble reaction product generated by the enzyme reaction with an organic solvent or the like. It is possible to evaluate a test compound that acts on the reaction and exerts an effect such as “promotion of the reaction” or inhibition. Extraction with an organic solvent requires multiple steps of mixing, stirring, and extraction. By extracting reaction products without going through these steps, rapid extraction can be achieved with a very simple process. As a result, it becomes possible to measure and evaluate many test compounds in a short time. In addition, the extraction of organic solvents often uses solvents that are harmful to the environment and the human body, and the treatment of waste liquid is time consuming and expensive. Therefore, the activity can be measured without using organic solvents. The merit of the evaluation method of the compound of the invention is very great.
  • a cDNA sequence encoding human ACBP protein (Biochimica et biophysica acta, 1441, vol. 150, 1999) was amplified by RT-PCR using human liver mRNA (Clontech) as a saddle.
  • the amplified product was cloned into the histidine-tagged expression vector PET-14b (Novagen), and a human long-chain fatty acid coenzyme A-binding protein (hereinafter referred to as N-Tag-hACBP) with a histidine tag added to the N-terminus.
  • N-Tag-hACBP human long-chain fatty acid coenzyme A-binding protein
  • the resulting transformant is cultured in a medium supplemented with isopropyl 1 beta 1 D-thiogalactoside to induce N-Tag- hACBP expression.
  • His-Bind Kits (manufactured by Novagen) are derived from the cytoplasmic fraction of the cells. ) was used to purify N-Tag-hACBP. Purified N-Tag-hACBP was used in the following experiments.
  • the hLCE-encoding cDNA sequence (Journal of biological chemistry, 276, 45358, 2001: accession number AK027031) was amplified by RT-PCR using human liver mRNA (Clontech), and the expression vector pPICZo It was cloned into (manufactured by Invitrogen).
  • the obtained expression vector was transformed into the host yeast Pichia pastris (manufactured by Invitrogen) by the electopore method, and a microsome preparation was obtained from the transformed yeast by a conventional method.
  • Yeast microsome preparation IM rotenone (manufactured by Sigma), ImM NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, Sigma), 20 M fatty acid-free urine serum albumin (manufactured by Sigma), long Atsey buffer (lOOmM sodium chloride, lOOmM Tris buffer) containing the chain fatty acid Coenzym A (Shitama) and 50,000dpm of 60 M Malonyl Coenzyme A (Sigma, Muromachi Pharmaceutical) The solution, ⁇ ⁇ 6 ⁇ 5), was incubated in a 96 well plate (Packard) at 37 ° C for 2 hours, and then the reaction was stopped by adding 0.25% octyl ⁇ -darcoside.
  • IM rotenone manufactured by Sigma
  • ImM NADPH reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • 20 M fatty acid-free urine serum albumin manufactured by Sigma
  • n is also added with a human alcylenzyme A binding protein with a His tag added to the N-terminus and 500 g SM resin (PVT Copper His—Tag SPA Beads, manufactured by Amersham), and 37 ° (:, Incubated for 30 minutes.
  • SM resin PVT Copper His—Tag SPA Beads, manufactured by Amersham
  • hElovl3 activity In the same manner as the LCE activity measurement method described in Example 1, an attempt was made to measure hElovl3 activity.
  • a cDNA sequence encoding hElovl3 (accession number: BC034344) was amplified from human visceral mRNA (Clontech) by RT-PCR and then cloned into the expression vector pCMV-Tag2B (Stratagene).
  • the resulting expression vector was transfected into the host cell HEK293 using the host cationic lipid method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987) A chromosome preparation was obtained.
  • BC034344 human visceral mRNA
  • pCMV-Tag2B Stratagene
  • the cDNA sequence encoding hElovl3 was amplified by RT-PCR from human liver mRNA (manufactured by Kuguchintuku), and then cloned into the expression vector pCMV-Tag2B (manufactured by Stratagene).
  • the obtained expression vector was transfected into the host cell HEK293 using the host cationic lipid method (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987), and microscopically extracted from the expressed cells. I got the Zome standard.
  • HE 1 ov 13 or hE 1 ov 11 cell microsome preparation obtained by the above preparation method 1 ⁇ rotenone (manufactured by Sigma), ImM NADPH (reduced nicotinamide adenine dinucleotidic acid, Sigma), 20 M fatty acid free urine serum albumin (manufactured by Sigma), 40 M long chain fatty acid coenzyme A (manufactured by Sigma, Apanti), 50, OOOdpm 60 pm Muromachi Pharmaceutical Chemical Co., Ltd.) in an Atsey buffer solution (100 sodium chloride, lOOmM Tris buffer, H6.5). After the incubation at 37 ° C for 2 hours, the reaction was stopped by adding 0.25% octyl] 8-darcoside.
  • Atsey buffer solution 100 sodium chloride, lOOmM Tris buffer, H6.5
  • an expression vector in which each enzyme was not cloned was transfected into the host cell HEK293 by the host cationic lipid method, and compared with a microphone mouthsome sample obtained from the expressed cell by a conventional method.

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Description

明 細 書
酵素活性測定方法及び化合物の評価方法 技 術 分 野
本発明は、 脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定方法に関する。 背 景 技 術
医薬は、 創薬標的となる生体内分子の性質に基づいた生化学的、 細胞生物学的な 評価系 （例えば、 酵素アツセィ系、 結合アツセィ系） を用いて候補となる多くの化 合物を評価することによりスクリーニングされる。 一つの開発候補化合物が選択さ れる確率は、 数万化合物に一つと言われており、 スクリーニングのスピードを向上 させることにより大量の開発候補化合物を検討することが効率的な医薬の開発には 必須である。
このような状況の下、 スクリーニングを極めて効率化した HTS (High Through- pu t Screening) と呼ばれる評価系を構築し、短期間で数万〜数十万種の化合物の評価 を行い、 開発候補化合物を選択することが行われている。
しかし、 HTSに適用する生化学的、細胞生物学的な評価系の構築は評価者が行う必 要があり、 かかる評価系の完成度が効率的且つ有効なスクリーニングに大きな影響 を及ぼすと言える。
一方、 ある種の酵素を創薬標的とした場合に、 酵素の反応生成物が脂溶性の物質 である場合がある。 反応生成物が脂溶性物質の場合、 その定量や定性分析を行う際 に、 有機溶媒を用いて抽出した後、 HPLC (high per formance l iquid chromatograp hy) 、 GC (gas chromatography) 及び TLC (thin l ayer chromatography) 等を組み 合わせて分析する必要があった。
例えば、特開 2003- 212790号公報には、神経変性疾患の予防及び治療に有効な成分 としてャマブシタケ由来の脂溶性成分を抽出する際に、 ァセトン及びクロロホルム で抽出した後、 シリカゲルカラムにかけて画分を得る方法が記載されている。 特許文献 1 ：特開 2003-212790号公報
しかしながら、 従来の方法では、 脂溶性物質の抽出の際に有機溶媒による抽出ェ 程を経る必要があり、 酵素反応から酵素活性の測定まで多段階の工程が必要となる ことから、 多大な労力や時間を費やすばかりでなく、 マイクロプレート中で一連の 反応、反応生成物の処理、測定を行う HTSの評価系には使用できないという問題があ つた。 発 明 の 開 示
本発明は、 上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、 酵素反応か ら酵素活性の測定までを単純な工程で処理することが可能であり、 HTS の評価系に 適応可能な酵素活性の測定方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、 酵素反応によって 生じた脂溶性物質に結合する物質 （ァクセプター） を酵素反応溶液に混合し、 かか るァクセプタ一を介して反応生成物の検出を行うことにより、 反応生成物の抽出を 行うことなく酵素活性の測定が可能となる方法を見出し、 本発明を完成した。 すなわち、 本発明の活性測定方法は、 2種以上の基質同士の付加反応を触媒して 脂溶性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、 いずれか一つの基質 を標識する標識工程と、 酵素、 全ての基質及びァクセプターの存在下で酵素反応を させる反応工程と、 ァクセプ夕ーを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 当該 標識分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を 検出する検出工程と、 を含むことを特徴とする。
また、 本発明の活性測定方法は、 2種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶 性の反応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、 いずれか一つの基質を標 識する標識工程と、 酵素及び全ての基質の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、 当該酵素反応溶液に、 反応生成物に結合するァクセプ夕ーを混合する混合工程と、 ァクセプ夕一を介して標識分子と被検出分子を近接させ、 当該標識分子より生じる エネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、 を含むことを特徴とする。 ·
ここで、 本発明の活性測定方法において、 前記ァクセプターが反応生成物に特異 的に結合する物質であることが好ましい。 かかるァクセプ夕ーを使用することによ り、 より精度の高い酵素活性の測定が可能となる。
また、 本発明の化合物の評価方法は、 2種以上の基質同士の付加反応を触媒する 酵素に作用する化合物の評価方法であって、 いずれか一つの基質を標識する標識ェ 程と、 酵素、 全ての基質、 ァクセプ夕一及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせ る反応工程と、 ァクセプ夕ーを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 当該標識 分子より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出 する検出工程と、 を含むことを特徴とする。
さらに、 本発明の化合物の評価方法は、 2種以上の基質同士の付加反応を触媒す る酵素に作用する化合物の評価方法であって、 いずれか一つの基質を標識する標識 工程と、酵素、全ての基質及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、 当該酵素反応溶液に、 反応生成物に結合するァクセプターを混合する混合工程と、 ァクセプ夕ーを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 当該標識分子より生じる エネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と、 を含むことを特徴とする。
ここで、 本発明の化合物の評価方法においては、 前記ァクセプ夕一が反応生成物 に特異的に結合する物質であることが好ましい。 かかるァクセプターを使用するこ とにより、 より精度の高い酵素活性の測定が可能となり、 結果的に、 より精度の高 い化合物の評価が可能となる。
また、 本発明の酵素活性測定キットは、 脂溶性の反応生成物を触媒する酵素、 該 酵素の基質及びァクセプ夕ーを含むことを特徴とする。 かかるキットを使用するこ とにより、脂溶性物質を生じる酵素反応の活性測定が簡便に実施できるようになり、 また、 このような酵素反応を標的とする化合物の評価、 スクリーニング等が簡便に 実施できることとなる。
酵素反応から酵素活性の測定までを単純な工程で処理でき、 HTS の評価系に適応 可能な酵素活性の測定方法を提供することが可能となる。 また、 本発明の活性測定 方法を利用することにより、 酵素に作用する化合物の評価 （化合物の活性測定ゃス クリ一ニング等） が可能となる ' 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の方法により LCEの酵素活性を測定した結果を示す図である。 図 2は、本発明の方法により hEl ovl 3の酵素活性を測定した結果を示す図である。 図 3は、本発明の方法により hE 1 ov 11の酵素活性を測定した結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
先ず、 本発明において使用する語句について説明する。
本発明に係る 「酵素」 は、 酵素反応の生成物として脂溶性物質を生じる反応を触 媒する酵素であれば特に制限はないが、 例えば、 LCE (ァクセッションナンバー： A 027031) 、 FAS (fat ty ac id synthase) (同： BC063242) 、 Elovl l (同： BC000618 、 NM_022821) 、 El ovl 2 (同： BC060809) 、 Elovl3 (同： BC034344) 、 Elov (同： AY037298) 、 Εΐ ονΐ δ (同： AF338241) 等の脂肪酸伸長酵素 (Fat ty ac i d el ongase) , Acy卜 CoA合成酵素、 GPAT (同： AL833061) 、 DGAT1 (同： AF059202) 又は MGAT (同 ： AF384163) 、 ACAT (同： L21934) 、 LCAT (同：履_000229) を挙げることができる。 また、 本発明に係る酵素としては、 上記に挙げたもの以外にも、 例えば、 種々の 膜タンパク質や各種リン脂質又は中性脂質合成 ·代謝酵素も本発明に係る酵素とし て挙げられる。 このような酵素としては、 具体的には、 例えば、 ァシルトランスフ エラーゼ、 ァセチルハイド口レース、 リパーゼ、 グリセロールキナーゼ （ァクセッ シヨンナンバー： NM_033214) 、 コリンホスホトランスフェラ一ゼ （同： NM_202244 ) が挙げられる。 また、 各種コレステロール合成又は代謝酵素等の膜タンパク質も 本発明に係る酵素に含まれる。
また、 本発明に係る 「基質」 は、 前記酵素の基質であれば特に制限はないが、 当 該酵素は 2種の基質の付加反応を触媒するため、 例えば、 酵素が LCEの場合では、 長鎖脂肪酸 （例えば、 パルミトイル CoA) と、 当該長鎖脂肪酸に付加してより長鎖 の脂肪酸を生成する基質 （例えば、 マロニル CoA) の 2種の基質が挙げられる。 ま た、 他の酵素の場合であれば、 例えば、 FAS の基質である短鎖又は中鎖脂肪酸ァシ ル- CoA及びマロニル CoA、 El ovl sの基質である飽和超長鎖脂肪酸ァシル CoA又は不 飽和脂肪酸ァシル CoA、 ァシル CoA合成酵素の基質である短鎖又は長鎖脂肪酸及び 活性化 CoA、 GPATの基質である中鎖又は長鎖脂肪酸ァシル CoA及びグリセロール 3 リン酸及、 リン脂質合成酵素の基質である中鎖又は長鎖脂肪酸ァシル CoA及びダリ セロール 3リン酸、リゾリン脂質、 DGATの基質である中鎖又は長鎖脂肪酸ァシル CoA 及びジァシルグリセロール、 又は MGATの基質である中鎖又は長鎖脂肪酸ァシル CoA 及びモノァシルグリセロールを挙げることができる。 さらに、 酵素がグリセ口一ル キナーゼの場合には、 グリセロール及び ATPが基質となり、 また、 コリンホスホト ランスフエラーゼの場合には、ジァシルグリセロール及び CDPコリンが基質となる。 ここで、 本発明に係る 「基質」 のいずれか一方は、 検出工程で検出可能に修飾さ れている必要がある。 かかる修飾の態様としては特に制限はなく、 検出方法によつ て好適な態様に修飾すればよいが、 例えば、 FRET (Fluorescence resonance energy trans fer)であれば蛍光色素標識、 SPA (Sc int i l l at ion proximi ty assay)であればラ ジオアイソトープ標識を挙げることができる。
また、 本発明に係る 「脂溶性の反応生成物」 は、 前記の酵素の酵素反応により生 じた脂溶性物質であれば特に制限はないが、 例えば、 LCE の酵素反応によって生じ るァシル CoA (Acy卜 CoA)、 FASの酵素反応によって生じる中鎖又は長鎖脂肪酸及び中 鎖又は長鎖脂肪酸及ァシル CoA、 Elovl sの酵素反応によって生じる飽和超長鎖、 長 鎖脂肪酸又は不飽和脂肪酸及び飽和超長鎖、長鎖脂肪酸又は不飽和脂肪酸ァシル CoA 、 Acy卜 CoA合成酵素の酵素反応によって生じる Acy卜 CoA、 GPATの酵素反応によつ て生じる Lyso PA、 リン脂質合成酵素の酵素反応によって生じるリン脂質、 DGATの 酵素反応によって生じるトリァシルグリセロール、 MGATの酵素反応によって生じる ジァシルグリセロールを挙げることができる。 さらに、 酵素がグリセロールキナー ゼの場合には、 グリセロール 3リン酸及び ADPが反応生成物となり、 また、 コリン ホスホトランスフェラーゼの場合には、 ホスファチジルコリンが基質となる。
また、 本発明に係る 「ァクセプター」 は、 前記の 「酵素反応により生じた脂溶性 物質」 に結合する物質であれば特に制限はないが、 例えば、 当該脂溶性物質に対す る抗体、 当該脂溶性物質に対して親和性を有する膜存在型受容体、 核内受容体、 脂 質輸送タンパク質などを挙げることができる。 さらに、 本発明に係るァクセプ夕ー は、 脂溶性物質に特異的に結合する物質であることが好ましい。 具体的には、 例え ば、 LCEの酵素反応産物であるァシル CoAに対する ACBP (Acyl-CoA Binding Pro te in ) 、 GPAT の酵素反応産物である Lyso- PA に対する Lyso PA binding protein, PL synthes iz ing enzymeの酵素反応産物である hosphol ipidに対する phosphol ipid binding proteinが挙げられる。 また、 コリンホスホトランスフェラーゼの場合に は、 ホスファチジルコリン輸送タンパク質がァクセプ夕一となる。 かかる特異的な 結合をするァクセプ夕ーを使用することにより、 非特異的結合によるノイズを検出 することなく、 正確な酵素活性の測定を行うことが可能となる。
(活性測定方法）
次に、 本発明の活性測定方法について説明する。
本発明の活性測定方法は、 2種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反 応生成物を生じる酵素反応の活性測定法であって、 いずれか一つの基質を標識する 標識工程と、 酵素、 全ての基質及びァクセプターの存在下で酵素反応をさせる反応 工程と、 ァクセプタ一を介して標識分子と被検出分子を近接させ、 当該標識分子に より生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する 検出工程と、 を含むことを特徴とする。
以下、 本発明の活性測定方法の手順について説明する。
本発明の活性測定方法においては、 まず、 基質を後の検出工程で検出できるよう 標識する。 標識の態様は、 検出方法に応じて適宜選択すればよく、 例えば、 ラジオ アイソトープ、 蛍光色素による標識を挙げることができる。 標識の方法としても特 に制限はなく、 公知の方法によって実施すればよい （例えば、 Biochemis try, 4 3 巻、 2 4 8 4頁、 2 0 0 4年参照） 。
また、 標識する基質は、 2種類以上基質がある場合でもそのうちいずれか一つの みでよい。
こうして標識した基質は、 次の反応工程において酵素、 標識されていない残りの 基質を共存させることにより、 酵素反応を進行させる。 また、 この反応溶液にァク セプタ一を共存させて反応させてもよい。 酵素反応の条件は、 使用する酵素の至適 温度、 至適 p H等を考慮して適宜設定すればよく、 例えば、 生体と近似した条件で ある 3 5〜4 0 °C、 pH 6 . 5〜7 . 5が好適な条件として使用可能である。 また、 反応時の緩衝液も使用する酵素によつて適宜好適なものを使用すればよぐ例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液を使用することができる。 また、 こ れらの緩衝液は塩濃度等の種々の条件を適宜調整して使用してもよい。
反応工程を経た酵素反応溶液は、 次に、 混合工程へ進む。 混合工程は、 2種以上 の基質及び酵素のみの存在下で酵素反応を行った場合に、 酵素反応に次いでァクセ プターを添加、 混合する工程であり、 反応工程において酵素反応溶液にァクセプ夕 一を共存させて酵素反応を行った場合には本工程は不要である。 酵素反応により脂 溶性の反応生成物が生じる。 ここで、 添加及び混合の方法は特に制限されず、 例え ば、 ァクセプ夕一を含む溶液を準備し、 酵素反応溶液に添加し、 攪拌、 混合すれば よい。 また、 混合条件についても特に制限はなく、 反応生成物と、 それに結合する 物質との結合に好適な条件を適宜選択することができる。 これにより、 反応生成物 に結合し、 反応生成物ーァクセプター複合体が生じる。
また、 上述したように、 反応工程において、 酵素及び当該酵素の基質を含む酵素 反応溶液にァクセプタ一をも共存させた状態で反応を行ってもよい。 この場合、 溶 液中で酵素反応が終了した反応生成物にァクセプターが順次結合する。 従って、 混 合工程を経ることなく検出工程に進むことが可能となる。
混合工程で生じた複合体には検出可能なかたちで基質由来の標識が含まれる。 従 つて、 次の検出工程においては、 かかる標識を検出することにより、 反応生成物の 存在を確認することとなる。 反応生成物は、 基質由来の蛍光色素、 ラジオアイソト ープ等で標識されているため、 検出工程においては、 標識の種類に応じて適宜好適 な検出方法を採ることができる。 具体的には、 例えば、 標識が蛍光色素の場合、 蛍 光を検出する媒体や装置 （例えば、 FRETシステム、 トップカウント） により検出す ることができる。 また、 標識がラジオアイソトープの場合、 ラジオアイソトープを 検出する媒体や装置 （例えば、 SPAシステム、 シンチレ一シヨンカウンタ、 CCDカメ ラ） により検出することができる。
また、別途合成又は精製して準備した各種標準酵素生成物、具体的には、例えば、 蛍光色素、 ラジオアイソトープ等で標識された各種標準酵素生成物及び各種ァクセ プターを用いて検量線を作成することにより、 上述のアツセィにおいて検出された 値よりアツセィ系に含まれる酵素活性を定量することが可能である。
以上説明したような本発明の活性測定方法によれば、 酵素反応によって生じた脂 溶性の反応生成物を有機溶媒等で抽出する工程を経ることなく酵素活性を測定する ことができる。 有機溶媒による抽出には、 混合、 攪拌、 抽出の多工程が必要である ことから、 このような工程を経ることなく反応生成物の抽出を行うことにより、 非 常に簡易な工程で迅速な抽出が可能となり、 結果として、 短時間で多くの被検物質 の活性測定や評価を行うことが可能となる。 また、 有機溶媒による抽出には環境や 人体に有害な溶媒を使用することが多く、 廃液の処理にも手間と費用がかかること から、 有機溶媒を使用することなく活性測定を行うことができるメリットは非常に 大きい。
(化合物の評価方法）
次に、 本発明の化合物の評価方法について説明する。
本発明の化合物の評価方法は、 2種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に 作用する化合物の評価方法であって、 いずれか一つの基質を標識する標識工程と、 酵素、 全ての基質、 ァクセプ夕ー及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応 工程と、 ァクセプ夕ーを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 該標識分子より 生じるエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出 工程と、 を含むことを特徴とする。
ここで、 本発明に係る 「被検化合物」 とは、 本発明に係る 「酵素」 を標的とする 化合物であればその種類は特に制限されない。 ここで、 酵素を標的とする化合物と しては、 例えば、 酵素のァゴニスト、 アンタゴニスト又はインパースァゴニストが 挙げられ 。 また、 酵素と被検化合物との結合態様も特に制限はなく、 例えば、 阻 害反応の場合では競争阻害であってもよく、 非競争阻害であってもよい。
本発明の化合物の評価方法は、 前述した本発明の活性測定方法の反応工程におい てさら fc被検化合物を共存させ、 その状態で酵素反応を進行させることにより実施 する。 こうすることにより、 被検化合物が酵素になんらかの作用を及ぼしめ、 その 結果、 酵素反応を阻害又は促進することによって生じる酵素反応の活性の変化を検 出工程にて検出することにより、 当該被検化合物の評価をすることができる。 以下、 本発明の化合物の評価方法の手順について説明する。
本発明の化合物の評価方法においては、 まず、 基質を後の検出工程で検出できる よう標識する。 標識の態様は、 検出方法に応じて適宜選択すればよく、 例えば、 ラ ジォアイソトープ、 蛍光色素による標識を挙げることができる。 標識の方法として も特に制限はなく、 公知の方法によって実施すればよい （例えば、 Biochemis try, 4 3巻、 2 4 8 4頁、 2 0 0 4年参照） 。
また、 標識する基質は、 2種以上ある基質のうちいずれか一つのみでよい。 こうして標識した基質は、 次の反応工程において酵素、 標識されていない基質及 び被検化合物と共存させることにより、 酵素反応を進行させる。 また、 この反応溶 液にァクセプターを共存させて反応させてもよい。 当該酵素反応の条件は、 使用す る酵素の至適温度、 至適 P H等を考慮して適宜設定すればよく、 例えば、 生体と近 似した条件である 3 5〜4 0 ° (：、 pH 6 . 5〜7 . 5が好適な条件として使用できる 。また、反応時の緩衝液も使用する酵素によって適宜好適なものを使用すればよく、 例えば、 トリス塩酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液を使用することができる。 また、 これらの緩衝液は塩濃度等を適宜調整して使用してもよい。
反応工程を経た酵素反応溶液は、 次に、 混合工程へ進む。 混合工程は、 2種類以 上の基質及び酵素のみの存在下で酵素反応を行った場合に、 酵素反応に次いでァク セプターを添加、 混合する工程であり、 反応工程において酵素反応溶液にァクセプ ターを共存させて酵素反応を行った場合には本工程は不要である。 酵素反応により 脂溶性の反応生成物が生じる。 ここで、 添加及び混合の方法は特に制限されず、 例 えば、 ァクセプターを含む溶液を準備し、 酵素反応溶液に添加し、 攪拌、 混合すれ ばよい。 また、 混合条件についても特に制限はなく、 反応生成物と、 それに結合す る物質との結合に好適な条件を適宜選択することができる。 これにより、 反応生成 物にァクセプターが結合し、 複合体が生じる。
また、 反応工程において、 被検化合物、 酵素及び当該酵素の基質を含む酵素反応 溶液にァクセプ夕ーをも共存させた状態で反応を行ってもよい。 この場合、 溶液中 で酵素反応が終了した反応生成物にァクセプ夕一が順次結合する。 従って、 混合ェ 程を経ることなく検出工程に進むことが可能となる。
混合工程で生じた複合体には検出可能なかたちで基質由来の標識が含まれる。 従 つて、 次の検出工程においては、 かかる標識を検出することにより、 反応生成物の 存在を確認することとなる。 反応生成物は、 基質由来の蛍光色素、 ラジオアイソト ープ等で標識されているため、 検出工程においては、 標識の種類に応じて適宜好適 な検出方法を採ることができる。 具体的には、 例えば、 標識が蛍光色素の場合、 蛍 光を検出する媒体や装置 （例えば、 FRETシステム、 トップカウント） により検出す ることができる。 また、 標識がラジオアイソトープの場合、 ラジオアイソトープを 検出する媒体や装置 （例えば、 SPAシステム、 シンチレーシヨンカウン夕、 CCDカメ ラ） により検出することができる。
また、別途合成又は精製して準備した各種標準酵素生成物、具体的には、例えば、 蛍光色素、 ラジオァイソトープ等で標識された各種標準酵素生成物及び各種ァクセ プタ一を用いて検量線を作成することにより、 上述のアツセィにおいて検出された 値よりアツセィ系に含まれる酵素活性を定量することが可能である。
被検化合物の評価の具体例としては、 例えば、 酵素として LCEを用いて複数種の 被検化合物の評価を行った際に、 ある被検化合物の存在下では LCEの酵素活性が抑 制され、 結果的に酵素反応によって生じた脂溶性物質 （例えば Acyl_CoA) の産生量 が対照区（被検化合物を共存させていない状態）と比較して減少している場合には、 当該被検化合物は LCEの阻害剤として機能すると認められる。 LCEは脂肪酸の炭素 鎖を伸長して脂肪酸合成を促進する機能を有するため、 これを阻害することにより 脂肪酸の合成が抑制され、 結果的に脂肪の合成を抑制することになる。 すなわち、 前記被検化合物は抗肥満の効果を呈する化合物と考えることができる。
以上説明したような本発明の化合物の評価方法によれば、 酵素反応によって生じ た脂溶性の反応生成物を有機溶媒等で抽出する工程を経ることなく酵素活性を測定 することができることから、 酵素に作用して反応の促進 '阻害といった影響を及ぼ す被検化合物の評価を行うことが可能となる。 有機溶媒による抽出には、 混合、 攪 拌、 抽出の多工程が必要であることから、 このような工程を経ることなく反応生成 物の抽出を行うことにより、 非常に簡易な工程で迅速な抽出が可能となり、 結果と して、 短時間で多くの被検化合物の活性測定や評価を行うことが可能となる。 また、 有機溶媒の抽出には環境や人体に有害な溶媒を使用することが多く、 廃液 の処理にも手間と費用がかかることから、 有機溶媒を使用することなく活性測定を 行うことができる本発明の化合物の評価方法のメリットは非常に大きい。
(実施例）
以下、 実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、 本発明は、 以下の実 施例に限定されるものではない。 実施例 1
(N末端に His (ヒスチジン）タグが付加したヒト長鎖脂肪酸コェンザィム A結合 タンパク質の調製）
ヒト ACBPタンパク質をコードする cDNA配列（Biochimica et biophysica acta 、 1441巻、 150頁、 1999年） を、 ヒト肝臓 mRNA (クロンテック社製） を铸型にして RT-PCRにより増幅した。
次に、 増幅産物をヒスチジンタグ付加発現ベクター PET— 14b (ノバジェン社製） にクローニングし、 N末端にヒスチジンタグが付加したヒト長鎖脂肪酸コェンザィ ム A結合タンパク （以下、 N— Tag— hACBP と呼ぶ） を発現する発現ベクターを構築 した。 得られた発現ベクターを塩化カルシウム法によって宿主大腸菌に導入し、 形 質転換体を得た。 ·
得られたトランスフォーマントをイソプロピル一ベータ一 D—チォガラクトシド を添加した培地で培養することにより N— Tag— hACBPの発現を誘導し、 菌体の細胞 質画分より His—Bind Kits (ノバジェン社製） を用いて N— Tag— hACBPの精製を 行った。 精製した N— Tag— hACBPを以下の実験に用いた。
(hLCE (ヒト Long chain fatty acyl elongase の調製)
hLCEをコードする cDNA配列 (Journal of biological chemistry, 276巻、 45358 頁、 2001年：ァクセッションナンバー AK027031) をヒト肝臓 mRNA (クロンテック 社製） を用いた RT— PCRにより増幅した後、 発現ベクター pPICZo! (インビトロジェ ン社製） にクローニングした。
得られた発現ベクターを宿主酵母 Pichia pastris (インビトロジェン社製） にェ レクト口ポレーシヨン法によつて形質転換し、 形質転換酵母から定法によりマイク ロソーム標品を得た。
(N— Tag— hACBPを用いた LCE活性測定法）
上記酵母マイクロソーム標品、 I M ロテノン （シグマ社製） 、 ImM NADPH (還 元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、 シグマ社製） 、 20 M 脂肪酸 未含有ゥシ血清アルブミン （シグマ社製） 、 長鎖脂肪酸コェンザィム A (シ ダマ社製） 及び 50，000dpmの 60 M マロニルコェンザィム A (シグマ社製、 室町 薬品化学社） を含むアツセィ緩衝液 （lOOmM 塩化ナトリウム、 lOOmM トリス緩衝 液、 ρΗ6·5) を、 96ゥエルォプティプレート （パッカード社） 中で 37°C、 2時間ィ ンキュベ一シヨンした後、 0.25% ォクチル β -ダルコシドを加え反応を止めた。 次に、 nも N末端に His tagが付加したヒトァシルコェンザィム A結合タンパ ク及び 500 g SM樹脂 （PVT Copper His—Tag SPA Beads、 アマシャム社製） を加 え、 37° (：、 30分間インキュベーションした。
インキュベーション後の溶液を 3, ΟΟΟΠΜΙで遠心後、 トップカウント ひ、°ッカード 社） にて活性を求めた。 ここで、 特異的活性を評価する為に hLCEをクローニングし ていない発現べクタ一をエレクトロポレーション法により宿主酵母 Pichia pastris に導入し形質転換酵母を得た。 得られた形質転換酵母から定法に従ってマイクロソ 一ム標品を得、 N— Tag_hACBP が導入された形質転換酵母由来のマイクロソーム標 品の活性と比較した。
図 1に示すとおり、 パルミトイルコェンザィム Aを基質とし、 N—Tag— hACBP ミ クロソーム標品を反応に加えた場合にのみ特異的なシグナルの増強が観察され、 非 基質であるステアリルコェンザィム Aを基質とした場合、 又は、 hLCE非発現株より 調製したミクロゾーム標品を酵素として用いた場合はシグナルの増強は観察されな かった。 図 1中、 rHuLCEは組換えヒト LCEを表し、 Mockはコントロールを表す。 以上より、 本発明の方法により、 hLCE特異的活性が測定できたことが確認できた 実施例 2及び 3
(hElovl3 (ヒト Elongase of very long chain Fatty acids-like 3) の調製方 法）
実施例 1に記載の LCEの活性測定法と同様に、 hElovl3の活性測定を試みた。 先ず、 hElovl3をコードする cDNA配列 （ァクセッションナンバー： BC034344) を ヒト 臓 mRNA (クロンテック社製） より RT- PCRにより増幅した後、 発現ベクター pCMV-Tag2B (ストラタジーン社製） にクローニングした。 得られた発現ベクターを 宿主カチオン性脂質法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、 第 84巻、 7413頁、 1987 年） を用いて宿主細胞 HEK293にトランスフエク卜し、発現細胞から定法によりマイ クロソーム標品を得た。 ·
(hElovll (ヒト Elongase of very long chain Fatty acids-like 1) の調製方 法）
hElovl3をコードする cDNA配列 （ァクセッションナンバー NMJ22821) をヒト 肝臓 mRNA (ク口ンテツク社製）より RT-PCRにより増幅した後、発現べクター pCMV- Tag2B (ストラタジーン社製） にクローニングした。 得られた発現ベクターを宿主カチォ ン性脂質法 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 第 84巻、 7413頁、 1987年) を用い て宿主細胞 HEK293にトランスフエクトし、発現細胞から定法によりマイクロゾーム 標品を得た。
(N-Tag-hACBPを用いた Ε1ον13' (実施例 2 ) 及び hElovll (実施例 3) の活性測 定）
上記調製方法によつて得られた hE 1 ov 13又は hE 1 ov 11細胞マイクロソーム標品、 1 βΜ ロテノン （シグマ社製） 、 ImM NADPH (還元型ニコチンアミドアデニンジヌク レオチドリン酸、 シグマ社製） 、 20 M 脂肪酸未含有ゥシ血清アルブミン （シグマ 社製）、 40 M 長鎖脂肪酸コェンザィム A (シグマ社製、ァパンティ社製）、 50， OOOdpm の 60 Μ マロエルコェンザィム Α (シグマ社製、 室町薬品化学社） をアツセィ緩 衝液 （100 塩化ナトリウム、 lOOmM トリス緩衝液、 H6.5) 中で 96ゥ工ルォプ ティプレート ひ、。ッカード社製） において、 37°C、 2 時間インキュベーションした 後、 0.25% ォクチル ]8 -ダルコシドを加え反応を止めた。
次に、 反応液に 2tig N末端ヒスタグ付加ヒトァシルコェンザィム A結合タンパ ク、 500 g SPA樹脂 (PVT Copper His-Tag SPA Beads, アマシャム社製） を加え、 37°C、 30分間インキュベーションし、 3， OOOrpmで遠心後、 トップカウント （パッカ ード社） にて活性を求めた。
特異的活性を評価する為に各酵素をクローニングしていない発現ベクターを宿主 細胞 HEK293に宿主カチオン性脂質法によってトランスフエクトし、発現細胞から定 法により得たマイク口ゾーム標品と比較した。
その結果、 hElovl3 の場合、 基質としてステアロイルコェンザィム Aを、 ァクセ プ夕一として N- Tag- hACBP (ミクロソーム標品として反応液に添加） を用いた場合 にのみ特異的なシグナルの増強が観察された （図 2) 。 また、 hElovll の場合、 基 質としてァラキドイルコェンザィ厶 Aを、 ァクセプターとして N- Tag- hACBP (ミク 口ゾーム標品として反応液に添加） を用いた場合にのみ特異的なシグナルの増強が 06 307171
14
観察された （図 3 ) 。 一方、 hElovl 3及び hElovl lのいずれについても、 非基質で あるリグノセロイルコェンザィム Aを基質として用いた場合、 又は、 hElovl3 又は hElovl l 非発現細胞より調製したミクロソームを酵素として用いた場合はシグナル の増強は観察されなかった。これらの結果より、本発明の酵素活性測定方法により、 hElovl3及び hElovl l特異的活性を測定できることが確認できた。 産業上の利用可能性
酵素反応から酵素活性の測定までを単純な工程で処理でき、 HTSの評価系に適応 可能な酵素活性の測定方法を提供することが可能となる。 その結果、 被検化合物の 評価を簡易 ·迅速に実施できることとなる。

Claims

請 求 の 範 囲
( 1 ) 2種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素 反応の活性測定法であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素、 全ての基質及びァクセプターの存在下で酵素反応をさせる反応工程と、 ァクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 該標識分子により生じ るエネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程 と、
を含むことを特徴とする活性測定方法。
( 2 ) 2種以上の基質同士の付加反応を触媒して脂溶性の反応生成物を生じる酵素 反応の活性測定法であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素及び全ての基質の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、
該酵素反応溶液に、 反応生成物に結合するァクセプターを混合する混合工程と、 ァクセプタ—を介して標識分子と被検出分子を近接させ、 該標識分子より生じる エネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と を含むことを特徴とする活性測定方法。
( 3 )前記酵素が LCE (Long chain fat ty acid elongase)であることを特徴とする請 求項 1又は 2に記載の活性測定方法。
( 4) 前記ァクセプターが反応生成物に特異的に結合する物質であることを特徴と する請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の活性測定方法。
( 5 )前記検出工程における検出手段が SPAであることを特徴とする請求項 1 ~ 4の いずれか一項に記載の活性測定方法。
( 6 ) 2種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法 であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、 酵素、 全ての基質、 ァクセプター及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反 応工程と、
ァクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 該標識分子より生じる エネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と 、
を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
( 7 ) 2種以上の基質同士の付加反応を触媒する酵素に作用する化合物の評価方法 であって、
いずれか一つの基質を標識する標識工程と、
酵素、 全ての基質及び被検化合物の存在下で酵素反応をさせる反応工程と、 該酵素反応溶液に、 反応生成物に結合するァクセプターを混合する混合工程と、 ァクセプターを介して標識分子と被検出分子を近接させ、 該標識分子より生じる エネルギーを被検出分子に転移させることにより反応生成物を検出する検出工程と を含むことを特徴とする化合物の評価方法。
( 8 )前記酵素が LCE (Long chain fat ty acid elongase)であることを特徴とする請 求項 6又は 7に記載の化合物の評価方法。
( 9 ) 前記ァクセプタ一が反応生成物に特異的に結合する物質であることを特徴と する請求項 6〜 8のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
( 1 0 )前記検出工程における検出手段が SPAであることを特徴とする請求項 6〜9 のいずれか一項に記載の化合物の評価方法。
( 1 1 ) 脂溶性の反応生成物を触媒する酵素、 該酵素の基質及びァクセプタ一を含 むことを特徴とする酵素活性測定キット。
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