WO2006064813A1 - 核酸構築物及びそれを利用した標的領域への変異導入方法 - Google Patents

核酸構築物及びそれを利用した標的領域への変異導入方法 Download PDF

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WO2006064813A1
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base sequence
nucleic acid
stranded dna
acid construct
stranded
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Hiroyuki Kamiya
Hideyoshi Harashima
Hiroyuki Tsuchiya
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Hokkaido University NUC
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Hokkaido University NUC
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid construct having a single-stranded DNA and a single-stranded nucleic acid annealed to the single-stranded DNA, a method for introducing a mutation into a target region using the nucleic acid construct, and the like.
  • the Small Fragment Homologous Replacement (SFHR) method converts a mutant gene into a normal form by introducing a heat-denatured PCR product containing a normal sequence into a cell. (Non-Patent Documents 1 to 3).
  • Rad51 which is involved in homologous recombination in mammalian cells, is known as an indispensable protein for repairing errors in DNA replication that occur during cell division because the knockout animal is lethal to embryos.
  • Rad51 prefers single-stranded DNA as a substrate rather than double-stranded in in vitro homologous recombination reaction (Non-patent Documents 6 and 7). ).
  • Rad51 is known to use Tailed Duplex, which has a double-stranded structure in a part of single-stranded DNA, as a substrate for better homologous recombination reaction compared to normal single-stranded DNA (non-patented). Reference 7).
  • Non-Patent Document 1 Kunzelmann K. et al., “Gene targeting of CFTR DNA in CF epitherial cells. J, Gene Ther., 1996, III, pages 859-867
  • Non-Patent Document 2 Goncz K et al., "Targeted replacement of normal and mutant CFTR seq uences in human airway epithelial cells using DNA fragments.” Hum Mol Genet., 19 1998, pp. 713-1919
  • Non-Patent Document 3 Colosimo A et al., "Targeted correction of a defective selectable marker gene in human epithelial cells by small DNA fragments.”, Mol Ther "2001, III, pp. 178-185
  • Non-Patent Document 4 West SC., “Molecular views of recombination proteins and their controls. J, Nature Rev. Mol. Cell Biol., 2003, IV, pp. 435-445
  • Patent Document 5 Bertrand P et al., “P53's double life: transactivation-indipendent repressi on of homologous recombination.”, Trends Genet., 2004, Vol. 20, pp 235-243
  • Non-Patent Document 6 Baumann P et al, ⁇ Human rad51 protein promotes ATP-dependent horn ologous pairing and strand transfer reactions in vitro. ", Cell, 1996, 87 ⁇ , 757-766.
  • Non-Patent Document 7 Mazin AV et al., “Tailed duplex DNA is the preferred substrate for prote in-mediated homologous pairing.”, EMBO J., 2000, No. 19, pages 1148-1156 Disclosure of the Invention
  • the present invention relates to a nucleic acid construct capable of introducing a mutation into a target region of double-stranded DNA in a cell, a method for introducing a mutation into a target region using the nucleic acid construct, and the nucleic acid construct introduced It is an object of the present invention to provide an isolated cell, an individual organism having the cell, and the like.
  • the present invention relates to a base sequence of a sense strand side region or an antisense strand side region of a target region existing in a double stranded DNA in a cell.
  • a single nucleotide comprising a nucleotide sequence in which a plurality of bases are deleted, substituted, inserted or added, and has a homology of 90% or more with the nucleotide sequence of the sense strand side region or the antisense strand side region.
  • a nucleic acid construct comprising a strand DNA and a single-stranded nucleic acid comprising a base sequence complementary to a part of the single-stranded DNA and annealed to the single-stranded DNA.
  • the present invention provides a therapeutic agent for a disease caused by an abnormal base sequence contained in a target region present in intracellular double-stranded DNA, comprising the nucleic acid construct of the present invention. provide.
  • the present invention comprises a cell individual or non-human organism individual that does not constitute an organism individual.
  • a method for introducing a mutation into a base sequence of a target region present in a double-stranded DNA in a cell comprising the step of introducing the nucleic acid construct of the present invention into the cell.
  • the present invention provides a cell into which the nucleic acid construct of the present invention has been introduced.
  • the present invention provides a non-human organism individual having the cell of the present invention.
  • the number of bases of the single-stranded DNA is preferably 300 to 3000, and the number of bases of the single-stranded nucleic acid is preferably 15 to 100.
  • the single-stranded nucleic acid is deleted, substituted, inserted or added to the sense strand side region or the antisense strand side region of the single-stranded DNA.
  • the single-stranded nucleic acid is deleted, substituted, inserted or added to the sense strand side region or the antisense strand side region of the single-stranded DNA. It is preferable to anneal to a portion located 5 ′ or 3 ′ from any of the bases.
  • the single-stranded nucleic acid comprises a base sequence complementary to the base sequence of the 5 'end side portion or 3' end side portion of the single stranded DNA, and the single strand It is preferable to anneal to the 5 'end part or 3' end part of DNA.
  • nucleic acid construct of the present invention the single-stranded nucleic acid is represented by the following formula (I):
  • A represents a base sequence composed of two or more arbitrary bases
  • B represents a salt represented by A.
  • the single-stranded nucleic acid has the following formula (II):
  • A represents a base sequence composed of two or more arbitrary bases
  • B represents a base sequence complementary to the base sequence represented by A, consisting of three or more arbitrary bases
  • C represents a base sequence complementary to the base sequence represented by A
  • D represents the single-stranded D
  • a partial force consisting of the base sequence represented by A and a partial force consisting of the base sequence represented by A are annealed to form a hairpin structure.
  • any one of the bases deleted, substituted, inserted or added to the sense strand side region or the antisense strand side region is 5% of the single-stranded DNA. It is preferred that it is not present in the 'terminal part or 3' terminal part.
  • the nucleic acid construct of the present invention has a plurality of single-stranded nucleic acids annealed to the single-stranded DNA, and each of the plurality of single-stranded nucleic acids has a base sequence of a different part of the single-stranded DNA. It is preferable to include a complementary base sequence.
  • the target region contains an abnormal base sequence causing a disease
  • the single-stranded DNA is a sense strand side region or an antisense strand side region of the target region.
  • the base sequence comprises a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted, inserted or added so that the abnormal base sequence becomes a normal base sequence.
  • FIG. 1 is a schematic view showing an embodiment of the nucleic acid construct of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the configuration of pTENHEX.
  • FIG. 3 Nucleic acid construct Sl consisting of fragment 1 alone, fragment 2 annealed to fragment 1 and fragment 2, nucleic acid construct S2 consisting of fragment 3 annealed to fragment 1 and fragment 1, and fragment 1 annealed to fragment 1 and fragment 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the repair efficiency of the HygEGFP gene.
  • the nucleic acid construct of the present invention has one or more bases in the base sequence of the sense strand side region or the antisense strand side region of the target region present in the double stranded DNA in the cell.
  • a single-stranded DNA consisting of a base sequence that has been deleted, substituted, inserted or added, and whose homology with the base sequence of the sense strand side region or antisense strand side region is 90% or more, and A single-stranded nucleic acid containing a base sequence complementary to a part of the base sequence and annealed to single-stranded DNA.
  • the region containing the base sequence to be mutated is the target region. Since double-stranded DNA is composed of a sense strand and an antisense strand, the target region is composed of a sense strand side region and an antisense strand side region.
  • the base sequence of the sense strand side region and the base sequence of the antisense strand side region are complementary, and the number of bases in the sense strand side region and the antisense strand side region is the same, usually 300 to 3000, preferably 300 to 1500. More preferably, it is 300-900.
  • the double-stranded DNA in which the target region exists may be an endogenous double-stranded DNA (genomic DNA), or an exogenous double-stranded DNA (foreign DNA introduced into the cell). ), but preferably it is endogenous double-stranded DNA (genomic DNA).
  • the target region may be any region of the intracellular double-stranded DNA, but is preferably a region containing an abnormal base sequence that causes a disease.
  • An abnormal base sequence is a base in which one or more bases are deleted, substituted, inserted or added in the normal base sequence. Is an array. Examples of mutations that cause disease include Huntington's disease
  • Examples include long-chain insertion mutations due to CAG repeats, long-chain deletion mutations in the dystrophin gene of muscular dystrophy, and single nucleotide substitutions in the factor 9 gene of hemophilia.
  • the target region for example, a region including part or all of a structural gene region, a regulatory gene region and the like can be selected.
  • the structural gene region is a region that defines the amino acid sequence of a protein, and the eukaryotic structural gene region includes both exons and introns.
  • Examples of the regulatory gene region include an operator region, a promoter region, and a attenuation region.
  • the number of bases deleted, substituted, inserted or added to the base sequence of the sense strand side region or antisense strand side region is the base sequence of the sense strand side region or antisense strand side region.
  • the number is not particularly limited, but is usually 1 to 10, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3.
  • Single-stranded DNA is linear and its ends are unmodified. That is, single-stranded DNA is natural DNA and does not include non-natural DNA with modified ends, such as phosphorothioate DNA.
  • the position of the base that is deleted, substituted, inserted or added to the base sequence of the sense strand side region or the antisense strand side region is not particularly limited, but the target region is the source of the disease. If the base sequence in the sense strand side region or the antisense strand side region is included, one or more bases are missing so that the abnormal base sequence becomes a normal base sequence. It is preferably deleted, substituted, inserted or added.
  • the homology between the nucleotide sequence of the single-stranded DNA and the nucleotide sequence of the sense strand side region or the antisense strand side region is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more. is there. If the base sequence of the single-stranded DNA has 90% or more homology with the base sequence of the sense strand side region, the single-stranded DNA is considered to be capable of homologous substitution with the sense strand side region. If the base sequence of the strand DNA has 90% or more homology with the base sequence of the antisense strand side region, the single-stranded DNA is considered to be capable of homologous substitution with the antisense strand side region. Homologous substitution with the sense strand side region or antisense strand side region of single-stranded DNA is one of the mechanisms for introducing a mutation into the base sequence of the target region by the nucleic acid construct of the present invention. Can be considered.
  • the number of bases of single-stranded DNA varies depending on the mutation added to the base sequence of the sense strand side region or antisense strand side region. Usually 300 to 3000, preferably 300 to 1500, more preferably Is 300-900.
  • the single-stranded nucleic acid may be any of DNA, RNA, nucleic acid derivatives, nucleic acid analogs and the like.
  • nucleic acid derivatives or analogs include phosphorothioate DNA, phosphoroate RNA, 2'-0_Me-RNA, LNA (Locked nucleic acid), PNA (peptide nucleic acid), ENA (Ethylene-bridged nucleic acid), etc. Be bald.
  • the single-stranded nucleic acid may contain a base sequence 1J complementary to the base sequence of any part of the single-stranded DNA as long as it can be annealed to the single-stranded DNA.
  • the mutation to the target region Introduction efficiency can be improved.
  • the 5 'end portion of the single-stranded DNA is a portion comprising a base sequence containing a base located at the 5' end of the single-stranded DNA, and the 3 'end portion of the single-stranded DNA is This part consists of a base sequence containing a base located at the 3 'end of the double-stranded DNA.
  • the single-stranded DNA In the single-stranded DNA, the relationship between the position of the base deleted, substituted, inserted or added to the sense-strand region or the antisense-strand region and the position where the single-stranded nucleic acid anneals.
  • the single-stranded nucleic acid has been deleted, substituted, inserted or added to the sense strand region or the antisense strand region of the single-stranded DNA. It contains a base sequence that is complementary to the base sequence of the part that does not contain any of the bases, and is deleted, substituted, inserted, or added to the sense strand side region or antisense strand side region of single-stranded DNA. It is recommended to anneal the part, and not to include any deviations.
  • the single-stranded nucleic acid is 5 'from the base that is deleted, substituted, inserted, or added to the sense strand side region or the antisense strand side region of the single strand DNA or
  • the single-stranded nucleic acid is deleted, substituted, inserted, or inserted into the sense strand side region or the antisense strand side region of the single strand DNA. Is annealed to a portion that does not contain any of the added bases, such a nucleic acid construct can improve the efficiency of introducing a mutation into the target region.
  • the single-stranded nucleic acid is located 3 ′ of any single-stranded DNA that is deleted, substituted, inserted, or added to the sense strand side region or the antisense strand side region. According to the nucleic acid construct annealed to the portion to be converted, the efficiency of introducing a mutation into the target region can be improved.
  • the single-stranded nucleic acid anneals to the 5 'end side portion or 3' end side portion of the single-stranded DNA, and the nucleic acid construct has a sense strand side region or an anti-antigenic region. If any base deleted, substituted, inserted or added to the sense strand side region is not present in the 5 ′ end portion or 3 ′ end portion of the single stranded DNA, the single stranded nucleic acid In such a single-stranded DNA, it will anneal to a portion that does not contain any bases deleted, substituted, inserted or added to the sense strand side region or the antisense strand side region. According to the nucleic acid construct, the efficiency of introducing a mutation into the target region can be improved.
  • the base number of the base sequence complementary to a part of the base sequence of the single-stranded DNA contained in the single-stranded nucleic acid is usually 15 to 100, preferably 20 to 70, more preferably 20 to 50. .
  • the single-stranded nucleic acid may consist only of a base sequence complementary to a part of the base sequence of the single-stranded DNA, or any arbitrary sequence at the 5 'end and / or 3' end of the base sequence. It may consist of a base sequence with a base sequence attached.
  • the single-stranded nucleic acid consists of a base sequence that has a base sequence complementary to a part of the base sequence of single-stranded DNA and an arbitrary base sequence added to the Z or 3 'end
  • the single-stranded nucleic acid Among nucleic acids, a part consisting of a base sequence complementary to a part of the base sequence of single-stranded DNA is annealed to the corresponding part of single-stranded DNA.
  • Nucleotide base sequence is usually 25 to 130, preferably 25 to 100, more preferably 25 to 80.
  • a single-stranded nucleic acid consists of a base sequence complementary to a part of the base sequence of single-stranded DNA
  • the nucleic acid construct 10a is composed of a single-stranded DNA 20 and a base sequence complementary to the 5 'terminal portion 21 of the single-stranded DNA 20, and is a single-stranded DNA.
  • a single-stranded nucleic acid 30a annealed to the 5 'end portion 21 of DNA 20.
  • the nucleic acid construct 10b is composed of a single-stranded DNA 20 and a base sequence complementary to the 3 'terminal portion 22 of the single-stranded DNA 20, And a single-stranded nucleic acid 30b annealed to 20 '3' terminal portion 22.
  • A represents an arbitrary base sequence composed of two or more bases. Represented by A
  • the upper limit of the number of bases in the base sequence is not particularly limited, but is usually 30, preferably 20, and more preferably 10.
  • the base sequence represented by A is not particularly limited
  • the CG content is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • B is a group that does not include a base sequence complementary to the base sequence represented by A, 3
  • the limit value is not particularly limited, but is usually 10, preferably 7, and more preferably 5.
  • the base sequence represented by B does not include a base sequence complementary to the base sequence represented by A.
  • the base sequence is not particularly limited, but can form a thermally stable loop.
  • the single-stranded nucleic acid is DNA
  • it is preferably gaa, gxya, gxay (x and y represent arbitrary bases) and the like.
  • C represents a base sequence complementary to the base sequence represented by A.
  • D is a base sequence complementary to the base sequence of the 5 ′ end portion of the single-stranded DNA.
  • the base sequence represented by D usually has 15 bases.
  • Fig. 1 (c) shows an embodiment of the nucleic acid construct of the present invention in the case where the single-stranded nucleic acid consists of a base sequence represented by the formula (I).
  • the nucleic acid construct 10c is composed of a single-stranded DNA 20 and a base sequence represented by the formula (I) annealed to the single-stranded DNA 20.
  • the hairpin structure is formed by annealing the portion consisting of the sequence.
  • An example is a single-stranded nucleic acid that anneals to a base sequence portion to form a hairpin structure.
  • A represents an arbitrary base sequence composed of two or more bases. Represented by A
  • the upper limit of the number of bases in the base sequence is not particularly limited, but is usually 30, preferably 20, and more preferably 10.
  • the base sequence represented by A is not particularly limited
  • the CG content is usually 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more.
  • B does not include a base sequence complementary to the base sequence represented by A, 3
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually 10, preferably 7, and more preferably 5.
  • the base sequence represented by B includes a base sequence complementary to the base sequence represented by A.
  • the base sequence is not particularly limited as long as it is not limited, but can form a thermally stable loop.
  • ⁇ IJ for example, gaa, gxya, gxay (x and y represent any base) when the single-stranded nucleic acid is DNA is preferable.
  • C represents a base sequence complementary to the base sequence represented by A.
  • D represents a base sequence complementary to the base sequence of the 3 ′ end portion of the single-stranded DNA.
  • the number of bases of the base sequence represented by D is usually 15-100, preferably 20-70, and more preferably 20-50.
  • Fig. 1 (d) shows an embodiment of the nucleic acid construct of the present invention in the case where the single-stranded nucleic acid has a base sequence represented by the formula (II).
  • the nucleic acid construct 10d has a single-stranded DNA 20 and a single-stranded nucleic acid 30d comprising a base sequence represented by the formula ( ⁇ ), and is single-stranded.
  • nucleic acid 30d the portion consisting of base sequence IJ represented by D is annealed to the 3 ′ end side portion 24 of single-stranded DNA 20, and the portion consisting of the base sequence represented by A is C
  • the hairpin structure is formed by annealing the portion consisting of the base sequence represented by
  • the number of single-stranded nucleic acids annealed to single-stranded DNA is not particularly limited, and may be singular or plural.
  • each of the multiple single-stranded nucleic acids contains a base sequence complementary to the base sequence of a different part of the single-stranded DNA. Annealing to a different part of chain DN A.
  • the region of single-stranded DNA that is annealed by one single-stranded nucleic acid and the region that is annealed by another single-stranded nucleic acid are continuous. It can be discontinuous.
  • FIGS. 1 (e) and 1 (f) are schematic diagrams showing one embodiment of the nucleic acid construct of the present invention when two single-stranded nucleic acids are annealed to single-stranded DNA.
  • the nucleic acid construct 10e is composed of a single-stranded DNA 20 and a base sequence complementary to the 5'-end portion 25 of the single-stranded DNA 20, It consists of a single-stranded DNA that is complementary to the single-stranded nucleic acid 30e annealed to the 5'-end portion 25 of the DNA and the portion 26 adjacent to the 5'-end portion 25 of the single-stranded DNA 20. Part 26 of the single-stranded nucleic acid 31e annealed. Of the single-stranded DNA, the 5 ′ end portion 25 and the 5 ′ end portion 25 The part 26 adjacent to is continuous.
  • the nucleic acid construct 10f is composed of a single-stranded DNA 20 and a base sequence complementary to the 5 'terminal portion 27 of the single-stranded DNA 20, and is a single-stranded DNA. It consists of a single-stranded nucleic acid 30f annealed to the 5'-end part 27 of DNA and a base sequence complementary to the part 28 located in the vicinity of the 5'-end part 27 of single-stranded DNA 20. A single-stranded nucleic acid 31f annealed to portion 28 of the strand DNA. In the single-stranded DNA, the 5 ′ end portion 27 and the portion 28 located in the vicinity of the 5 ′ end portion 27 are discontinuous.
  • Single-stranded DNA and single-stranded nucleic acid can be prepared using a known chemical synthesis method. At this time, it is possible to synthesize a plurality of short strands (for example, about 100 bases in length) and connect them by a known ligation method to produce single-stranded DNA and single-stranded nucleic acid of the desired base length. it can.
  • Single-stranded DNA is prepared by restriction enzyme treatment of phage or phagemid DNA prepared by a mutagenesis-type PCR using a double-stranded DNA having a target region as a cage or a commercially available mutagenesis kit. be able to.
  • the therapeutic agent of the present invention is a therapeutic agent for a disease caused by an abnormal base sequence contained in a sense strand side region or an antisense strand side region in a target region present in intracellular double-stranded DNA.
  • a therapeutic agent comprising the nucleic acid construct of the present invention.
  • the therapeutic agent of the present invention preferably contains the nucleic acid construct in a form capable of being introduced into cells.
  • a form capable of being introduced into cells include a form dispersed in an appropriate solvent (for example, water), a form encapsulated inside a hollow nanoparticle, a ribosome, and a complex with a cationic polymer.
  • the method of the present invention is a method for introducing a mutation into the base sequence of a target region present in double-stranded DNA in a cell, the method comprising introducing the nucleic acid construct of the present invention into a cell. is there.
  • the cell may be either a cell that does not constitute an organism individual or a cell that constitutes an organism individual.
  • the species of cells from which the cells can be eukaryotic or prokaryotic.
  • the biological species from which the cells are derived may be, for example, mammals, animals such as birds, insects, plants, microorganisms, etc., but mammals that are preferably animals are more preferable. .
  • mammals for example Examples include humans, monkeys, rabbits, hidges, goats, horses, pigs, rabbits, dogs, cats, rats, mice, guinea pigs, and the like.
  • prokaryotic microorganisms that can be either prokaryotic microorganisms or eukaryotic microorganisms include, for example, Gram-positive bacteria (for example, Micrococcus genus, Staphylo coccus j3 ⁇ 4, Bacillus genus, Clostridium genus, Lactobacillus ⁇ , and orynebactermmj3 ⁇ 4, Strepto myces moths), ghhum negative moths (eg, Rhodopseudomonas moth, Pseudomonas moth, Esheri chia genus, Salmonella genus, Nitrobacter genus, Thiobacillus genus, Neisseria genus etc.) Examples thereof include fungi such as filamentous fungi (molds) and yeast.
  • Gram-positive bacteria for example, Micrococcus genus, Staphylo coccus j3 ⁇ 4, Bacillus genus, Clostridium genus
  • the type of cell is not particularly limited, and examples include somatic cells, germ cells, stem cells, or cultured cells thereof.
  • somatic cells include neurological tissues such as the brain and spinal cord; sensory organs such as retinal cells and olfactory cells; digestive organs such as the esophagus, stomach, small intestine, and large intestine; respiratory organs such as the lung and trachea; Genital organs such as testis, ovary, uterus and placenta; urinary organs such as kidney and bladder; hematopoietic organs such as bone marrow cells and blood cells; muscle tissues such as skeletal muscle, smooth muscle and heart muscle; osteoblasts and osteoclasts Bone tissue; various tissues such as skin tissues such as skin and hair root cells; living cells isolated from organs thereof or cultured cells thereof can be mentioned.
  • germ cells include eggs, sperm or cultured cells thereof.
  • stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), trophoblast
  • nucleic acid construct of the present invention As a method for introducing the nucleic acid construct of the present invention into a cell, for example, it is possible to use an electoporation method, a calcium phosphate method, a lipofusion method, a microinjection method and the like.
  • the sense strand side region or the antisense strand side region of the target region present in the double stranded DNA in the cell is included in the nucleic acid construct of the present invention. Mutation similar to that of homologous substitution with single-stranded DNA (deletion, substitution, insertion or addition of one or more bases) occurs in one of the sense strand and antisense strand regions.
  • the other region is modified to be complementary to the other region, and as a result, mutations are introduced into both the sense strand side region and the antisense strand side region.
  • the target region contains an abnormal base sequence causing a disease
  • the target region is changed to an abnormal base sequence.
  • a disease caused by the abnormal base sequence can be treated.
  • Cells into which mutations have been introduced into the target region and individual organisms that possess the cells are useful as screening systems, disease models, and the like that differ from normal types in sensitivity to specific compounds.
  • the individual organism having the nucleic acid construct of the present invention may be an individual organism into which the nucleic acid construct of the present invention has been introduced into cells constituting the individual organism, or the nucleic acid construct of the present invention is introduced. It may be an individual organism transplanted with the transplanted cells.
  • HygEGFP is a fusion gene of a hygromycin resistance gene (Hyg) and a green fluorescent protein (EGFP) gene.
  • oligonucleotide Xho (5 cggcacctcgagcacgcggat: SEQ ID NO:
  • the Xhol site was introduced using 1) to prepare pALHEX. At this time, the codon 195 of the normal HygEGFP gene did not affect the force S changing from Val to Glu and the quantification of the gene repair reaction.
  • a PmaCI site serving as a gene marker was introduced into codon 34 of the normal HygEGFP gene using oligonucleotide Silent (5'-gcgaagaatcacgtgctttca-3 ': SEQ ID NO: 2) to prepare pALHEXP.
  • an opal mutation was introduced into codon 34 of the normal HygEGFP gene using oligonucleotide Opal (5′-ggcgaagaatgacgtgctttc-3 ′: SEQ ID NO: 3) to pALHEXP to prepare pALHEXB.
  • the previously introduced PmaCI site is removed, and a BmgBI site is introduced instead as a marker for the mutant HygEGFP gene.
  • the phagemids pBSHES / AntiSense and pBSHES / Sense were prepared by introducing the Xhol fragment of pTENHES into the Xhol site of pBluescript II SK + (Stratagene).
  • the Xhol fragment is inserted in the opposite direction to the p Bluescript II SK + fl ori, and the single-stranded circular DNA obtained from pBSHES / AntiSense and pBSHES / Sense is the normal type, respectively. It contains the antisense strand and the sense strand of the HygEGFP gene. Each insertion direction was confirmed by restriction enzymes Nael and PmaCI.
  • the phagemid is introduced into E. coli strain JM105, cultured in 2 X YT medium (containing 50 ig / mL ampicillin (Amp)) and then transferred to 5 mL of 500 mL of 2 X YT medium (containing 50 ⁇ g / mL Amp). The cells were cultured at 37 ° C with vigorous stirring. After 1 hour, kanamycin was added to 25 ⁇ g / mL, and the culture was continued again. After 23 hours, phagemid was separated from E. coli by centrifugation (2.15 ⁇ 10 3 g, 15 minutes).
  • the circular single-stranded DNA lpmol (l. l ⁇ g) obtained from pBSHES / Sense was digested with 5 U of Xhol, and the 606 ⁇ fragment was separated on a 3.5% low melting point agarose gel. Recovered by Rum extraction.
  • an oligonucleotide S5 ⁇ — ccccctcgaggtgccg— 3: complementary to the 5 ′ and 3 ′ Xhol sites of pBSHES / Sense is used to make the double strand around the Xhol site.
  • the recovered fragment was purified by gel filtration (NAP5 column, manufactured by Amersham Biosciences).
  • SEQ ID NO: 8 shows the base sequence of the single-stranded DNA (fragment 1) comprising the sense sequence thus prepared.
  • the base for introducing mutation into the target region (hereinafter referred to as “mutant introduction base”) is the 126th 128th base (tea) in SEQ ID NO: 8.
  • Fragment 2 consisting of a base sequence complementary to the 5 ′ end portion of fragment 1 (SEQ ID NO: 9)
  • Fragment 3 consisting of a base sequence complementary to the 3 ′ end portion of fragment 1 (SEQ ID NO: 10)
  • fragment 6 SEQ ID NO: 16
  • base sequence portion consisting of the 286 320th base in SEQ ID NO: 8
  • Fragment 4 (SEQ ID NO: 11) containing a base sequence complementary to the 5 'end portion of fragment 1 and fragment 5 (SEQ ID NO: 12) containing a base sequence complementary to the 3' end portion of fragment 1 Made by chemical synthesis. Chemical synthesis was outsourced to Hokkaido System Science.
  • Fragment 4 has the following formula:
  • FD is ggcggctccggggatctcga (base sequence complementary to the base sequence at the 5 ′ end of fragment 1)
  • FC is gc
  • FB is gaaa
  • FA is gc.
  • the FA part can anneal to the FC part to form a hairpin structure.
  • Fragment 5 has the following formula: 5 '-FA FB— FC— FD— 3'
  • FA is gc
  • FB is gaaa
  • FC is gc
  • FD is ggtgccggacttcggggca
  • lOpmol fragment 1 10 times the amount (lOOpmol) of each fragment was mixed in 20 ⁇ L of TE buffer in consideration of annealing efficiency.
  • the DNA was denatured by heating at 95 ° C for 5 minutes and then rapidly cooled in ice for 5 minutes. After further heating at 80 ° C for 5 minutes, it is gradually cooled.
  • the cells cultured for 48 hours were trypsinized, washed with lmL PBS, and then collected by centrifugation. Suspend this in 100 / i L TEG (25 mM Tris-HCl, lOmM EDTA, 5 OmM Glc, pH 8.0), and after adding 200 ⁇ L 0.2N NaOH / 1% SDS, gently agitate And left at room temperature for 5 minutes. Add 150 ⁇ L of 8M AcONH and cool at 4 ° C for 15 minutes.
  • Plasmid DNA was dissolved in 20 ⁇ L of water and stored at ⁇ 20 ° C. until use.
  • the recovered plasmid DNA was introduced into Escherichia coli DH-5 strain using the electopore position method.
  • Gene Pulser II manufactured by Bio-Rad laboratories
  • C 1.8 kV, 25 ⁇ F, 200 ⁇ .
  • the DH-5a strain was cultured in ImL SOC medium for 1 hour, diluted with LB medium supplemented with 50 ⁇ g / mL Amp, and cultured overnight. At this time, a part of the E.
  • coli DH_5 ct strain was taken and seeded on LB agar medium, and the force S measured for the erect mouth position efficiency by the number of colonies, no significant difference was observed. The next day, the E. coli DH-5 ⁇ strain was recovered by centrifugation and resuspended in 100 ⁇ L of TEG. To this was added 200 x L of 0.2N NaOH / 1% SDS, and after gently stirring, 150 ⁇ l of this was added, and Sol III (3M potassium acetate, 11.5% acetic acid) was added, and left on ice for 5 minutes. The centrifuged supernatant was treated with phenol / chloroform (1/1), and plasmid DNA was recovered by ethanol precipitation.
  • E. coli BL21 (DE3) strain using the electopore position method.
  • transformation into E. coli BL21 (DE) was carried out by the same procedure as for E. coli DH-5 strain. After transformation, add ImL of SOC medium, incubate at 37 ° C for 1 hour, take 50 ⁇ L, and use ImL of LB medium containing 50 ⁇ g / mL Amp and 10 ⁇ M IPTG at 37 ° C. For 3 hours.
  • HygO 50 ig / mL Amp, 10 / i M IPTG
  • the configuration of pTENHEX is shown in FIG. 2, and the nucleotide sequence of the mutant HygEGFP gene contained in pTENHEX and the amino acid sequence encoded by it are shown in SEQ ID NO: 13.
  • the base sequence consisting of the 1st to 36th bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 13 is the base sequence added when the mutant HygEGFP gene is introduced into pTENHEX, and the base sequence of the mutant HygEGFP gene is In fact, it starts with the 37th base.
  • Codon 34 of normal HygEGFP gene is tea and coding for Ser Mutant HygEGFP gene codon 34 has a termination mutation (TGA) introduced, so the HygEGFP gene can be expressed normally. I can't.
  • TGA termination mutation
  • Figure 3 shows fragment 1 alone ("Tailed_Duplex 1" in the figure), nucleic acid construct S1 consisting of fragment 1 and fragment 2 annealed to fragment 1 ("Tailed-Duplex 2" in the figure), annealing to fragment 1 and fragment 1
  • nucleic acid construct S2 fragment-Duplex 3 in the figure
  • fragment 6 fragment-Duplex 6
  • nucleic acid constructs Sl, S2 and S5 showed 1.3, 1.8 and 1.8 times higher repair efficiency than fragment 1 alone (repair efficiency of nucleic acid construct S1 2.6). %, Nucleic acid construct S2 repair efficiency 3.7%, nucleic acid construct S5 repair efficiency 3.7%). The repair efficiency of the nucleic acid constructs S2 and S5 was significantly higher than the repair efficiency of the nucleic acid construct S1.
  • Fig. 4 shows fragment 1 alone ("Looped-Duplex 1" in the figure), nucleic acid construct S3 consisting of fragment 1 and fragment 4 annealed to fragment 1 ("Looped_Duplex 4" in the figure), and fragment 1 and fragment 1 shows the repair efficiency of the mutant HygEG FP gene contained in pTENHEX when the nucleic acid construct S4 consisting of fragment 5 annealed in 1 (“Looped_Duplex 5” in the figure) is used.
  • nucleic acid constructs S3 and S4 showed a repair efficiency that was 1.4 times and 1.9 times higher than that of fragment 1 alone (repair efficiency of nucleic acid construct S3, 2.7%, nucleic acid construct, respectively). S4 repair efficiency 3.7%).
  • nucleic acid construct S4 showed high repair efficiency although it was not significant, compared to the repair efficiency of the nucleic acid construct S3.
  • Nucleic acid constructs S3 and S4, in which fragments 4 and 5 form a hairpin structure showed the same gene repair efficiency as nucleic acid constructs S1 and S2, which form a more stable 35-base pair duplex.
  • nucleic acid analogs such as 2'-0_Me-RNA and PNA that are resistant to intracellular nucleases and can be efficiently annealed to DNA It can be expected that the efficiency of gene repair is further improved by using.
  • the mutant HygEG FP gene was repaired by the conventional SFHR method using PCR products. As a result, the conversion efficiency was 0.16%.
  • the PCR product was amplified using primer 1 (5-gagatccccggagccg-3: item K number ⁇ 4) and Huima 1 (o-gaggtgccggacttcgg ⁇ ⁇ ': SEQ ID NO: 15) and Taq polymerase (manufactured by Tokyobo).
  • the 3 ′ end was blunted with Blunting High Kit (manufactured by Tokyobo) and purified by 3.5% low melting point agarose electrophoresis.

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Abstract

　細胞内の二本鎖DNAのうち、標的領域に変異を導入することができる核酸構築物を提供することを目的とし、この目的を達成するために、細胞内の二本鎖DNAに存在する標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列において、１又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域の塩基配列との相同性が90％以上である一本鎖DNAと、前記一本鎖DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖DNAにアニーリングした一本鎖核酸とを有する核酸構築物を提供する。

Description

明 細 書
核酸構築物及びそれを利用した標的領域への変異導入方法
技術分野
[0001] 本発明は、一本鎖 DNAと該一本鎖 DNAにアニーリングした一本鎖核酸とを有する 核酸構築物、該核酸構築物を利用した標的領域への変異導入方法等に関する。 背景技術
[0002] 近年のヒトゲノム計画の進展や大量遺伝子サンプノレのスクリーニング方法の開発に よって、個人の遺伝子情報をより詳細かつ簡便に調べることが可能になった。このよう な技術の進歩とともに、個々の患者の遺伝子情報に合わせて、変異の入った異常配 列を直接正常配列に戻す遺伝子修復法は、テーラーメード医療として、非常に期待 できる技術である。
[0003] 遺伝子修復法の一つである Small Fragment Homologous Replacement (SFHR)法 は、正常配列を含む、熱変性させた PCR産物を細胞へ導入することによって、変異遺 伝子を正常型へ変換することを目的としている（非特許文献 1〜3)。
[0004] 哺乳動物細胞において相同組換えに関与する Rad51は、そのノックアウト動物が胎 生致死であることから、細胞分裂時に生じる DNA複製の誤りを修復するために必要 不可欠な蛋白質として知られてレ、る（非特許文献 4及び 5)。
[0005] これまでの Rad51の生化学的な解析から、 in vitro相同組換え反応において Rad51 が二本鎖よりも一本鎖 DNAを基質として好むことが知られている（非特許文献 6及び 7 )。また、 Rad51が、一本鎖 DNAの一部に二本鎖構造を持つ Tailed Duplexを、通常の 一本鎖 DNAと比べ、良い相同組換え反応の基質とすることが知られている（非特許 文献 7)。
非特許文献 1： Kunzelmann K.等, 「Gene targeting of CFTR DNA in CF epitherial c ells. J , Gene Ther. , 1996年，第 3卷， 859-867頁
非特許文献 2 : Goncz K 等， 「Targeted replacement of normal and mutant CFTR seq uences in human airway epithelial cells using DNA fragments.」 Hum Mol Genet ., 19 98年，第 7卷， 1913- 1919頁 非特許文献 3 : Colosimo A等, 「Targeted correction of a defective selectable marker gene in human epithelial cells by small DNA fragments.」, Mol Ther" 2001年，第 3卷, 178- 185頁
非特許文献 4 : West SC., 「Molecular views of recombination proteins and their contr ol.J , Nature Rev. Mol. Cell Biol., 2003年，第 4卷， 435-445頁
特許文献 5： Bertrand P等, 「p53's double life: transactivation - indipendent repressi on of homologous recombination.」 , Trends Genet., 2004年，第 20卷， 235-243頁 非特許文献 6： Baumann P等, Γ Human rad51 protein promotes ATP-dependent horn ologous pairing and strand transfer reactions in vitro.」, Cell, 1996年， 87卷, 757- 766頁
非特許文献 7 : Mazin AV等， 「Tailed duplex DNA is the preferred substrate for prote in-mediated homologous pairing.」， EMBO J., 2000年，第 19卷， 1148-1156頁 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明は、細胞内の二本鎖 DNAのうち、標的領域に変異を導入することができる核 酸構築物、該核酸構築物を利用した標的領域への変異導入方法、該核酸構築物が 導入された細胞、該細胞を保有する生物個体等を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上記課題を解決するために、本発明は、細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領 域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列にぉレ、て、 1又は複 数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加された塩基配列からなり、前記センス鎖側 領域又は前記アンチセンス鎖側領域の塩基配列との相同性が 90%以上である一本 鎖 DNAと、前記一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一 本鎖 DNAにアニーリングした一本鎖核酸とを有する核酸構築物を提供する。
[0008] また、本発明は、細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域に含まれる異常塩基配 列が原因となる疾患の治療剤であって、本発明の核酸構築物を含む治療剤を提供 する。
[0009] さらに、本発明は、生物個体を構成していない細胞内又はヒト以外の生物個体を構 成している細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域の塩基配列に変異を導入する 方法であって、前記細胞内に本発明の核酸構築物を導入する工程を含む方法を提 供する。
[0010] さらに、本発明は、本発明の核酸構築物が導入された細胞を提供する。
[0011] さらに、本発明は、本発明の細胞を保有するヒト以外の生物個体を提供する。
[0012] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖 DNAの塩基数が 300〜3000であり、前 記一本鎖核酸の塩基数が 15〜100であることが好ましい。
[0013] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、前記一本鎖 DNAのうち、前記 センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加 された前記塩基のいずれをも含まない部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、 前記一本鎖 DNAのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対し て欠失、置換、揷入又は付加された前記塩基のいずれをも含まない部分にァニーリ ングしていることが好ましい。
[0014] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、前記一本鎖 DNAのうち、前記 センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加 された前記塩基のいずれよりも 5'側又は 3'側に位置する部分にアニーリングしている ことが好ましい。
[0015] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、前記一本鎖 DNAの 5'末端側 部分又は 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分にアニーリングしてレ、ることが好ましレ、。
[0016] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、次式 (I)：
5し D - C - B -A _ 3，
1 1 1 1
[式中、 Aは、 2個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、 Bは、 Aで表される塩
1 1 1
基配列と相補的な塩基配列を含まない、 3個以上の任意の塩基からなる塩基配列を 表し、 Cは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、 Dは、前記一本鎖 D
1 1 1
NAの 5'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配歹 1Jを表す。]
で表される塩基配列からなり、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される
1 1 塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成していることが好ましい [0017] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖核酸が、次式 (II)：
5'— A B— C D— 3'
[式中、 Aは、 2個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、 Bは、 Aで表される塩 基配列と相補的な塩基配列を含まない、 3個以上の任意の塩基からなる塩基配列を 表し、 Cは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、 Dは、前記一本鎖 D
NAの 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配歹 1Jを表す。]
で表される塩基配列からなり、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される 塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成していることが好ましい
[0018] 本発明の核酸構築物において、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側 領域に対して欠失、置換、揷入又は付加された前記塩基のいずれもが、前記一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分に存在しなレ、ことが好ましレ、。
[0019] 本発明の核酸構築物において、前記一本鎖 DNAにアニーリングした複数の一本鎖 核酸を有し、前記複数の一本鎖核酸がそれぞれ前記一本鎖 DNAの異なる部分の塩 基配列と相補的な塩基配列を含むことが好ましい。
[0020] 本発明の核酸構築物において、前記標的領域に疾患の原因となる異常塩基配列 が含まれており、前記一本鎖 DNAが、前記標的領域のうちセンス鎖側領域又はアン チセンス鎖側領域の塩基配列にぉレ、て、前記異常塩基配列が正常塩基配列となる ように、 1又は複数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなるこ とが好ましい。
図面の簡単な説明
[0021] [図 1]本発明の核酸構築物の実施形態を示す模式図である。
[図 2]pTENHEXの構成を示す模式図である。
[図 3]フラグメント 1単独、フラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 2 からなる核酸構築物 Sl、フラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 3 からなる核酸構築物 S2、及びフラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメ ント 6からなる核酸構築物 S5を用いた場合の、 pTENHEXに含まれる変異型 HygEGF P遺伝子の修復効率を示す図である。
[図 4]フラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 4からなる核酸構築物 S3、及びフラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 5からなる核酸構 築物 S4を用いた場合の、 pTENHEXに含まれる変異型 HygEGFP遺伝子の修復効率 を示す図である。
符号の説明
[0022] 10a, 10b, 10c, 10d, lOe, lOf' ' '核酸構築物
20 本鎖 DNA
30a, 30b, 30c, 30d, 30e, 31e, 30f, 31f 本鎖核酸
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本発明の核酸構築物は、細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域のうちセンス 鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列にぉレ、て、 1又は複数個の塩基が 欠失、置換、揷入又は付加された塩基配列からなり、センス鎖側領域又はアンチセン ス鎖側領域の塩基配列との相同性が 90%以上である一本鎖 DNAと、一本鎖 DNAの 一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖 DNAにアニーリングした一本鎖 核酸とを有する。
[0024] 細胞内の二本鎖 DNAのうち、変異を導入したい塩基配列を含む領域が標的領域 である。二本鎖 DNAはセンス鎖とアンチセンス鎖とから構成されているので、標的領 域はセンス鎖側領域とアンチセンス鎖側領域とから構成されてレ、る。センス鎖側領域 の塩基配列及びアンチセンス鎖側領域の塩基配列は相補的であり、センス鎖側領域 及びアンチセンス鎖側領域の塩基数は同一であり、通常 300〜3000、好ましくは 300 〜1500、さらに好ましくは 300〜900である。
[0025] 標的領域が存在する二本鎖 DNAは、内因性の二本鎖 DNA (ゲノム DNA)であっても ょレ、し、外因性の二本鎖 DNA (細胞内に導入された外来 DNA)であってもよレ、が、内 因性の二本鎖 DNA (ゲノム DNA)であることが好ましレ、。
[0026] 標的領域は、細胞内の二本鎖 DNAのうち、いずれの領域であってもよレ、が、疾患の 原因となる異常塩基配列が含まれる領域であることが好ましい。異常塩基配列は、正 常塩基配列において 1又は複数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加された塩基 配列である。疾患の原因となる変異としては、例えば、ハンチントン舞踏病で見られる
CAGリピートによる長鎖挿入変異、筋ジストロフィーのジストロフィン遺伝子における 長鎖欠失変異、血友病の第 9因子遺伝子における一塩基置換等が挙げられる。
[0027] 標的領域としては、例えば、構造遺伝子領域、調節遺伝子領域等の一部又は全部 を含む領域を選択することができる。なお、構造遺伝子領域は、タンパク質のアミノ酸 配列を規定している領域であり、真核細胞の構造遺伝子領域には、ェクソン及びイン トロンの両者が含まれる。調節遺伝子領域としては、例えば、オペレーター領域、プロ モーター領域、ァテニユエ一ター領域等が挙げられる。
[0028] センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列にぉレ、て欠失、置換、揷入 又は付加される塩基の個数は、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配 歹 IJとの相同性が 90%以上である限り特に限定されるものではなレ、が、通常 1〜10個、 好ましくは 1〜5個、さらに好ましくは 1〜3個である。
[0029] 一本鎖 DNAは直鎖状であり、その端部は非修飾である。すなわち、一本鎖 DNAは 天然型 DNAであり、ホスホロチォエート DNA等のように端部が修飾された非天然型 D NAは含まれなレ、。
[0030] センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列にぉレ、て欠失、置換、挿入 又は付加される塩基の位置は特に限定されるものではないが、標的領域に疾患の原 因となる異常塩基配列が含まれてレ、る場合、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側 領域の塩基配列において、異常塩基配列が正常塩基配列となるように、 1又は複数 個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加されていることが好ましい。
[0031] 一本鎖 DNAの塩基配列とセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列と 相同性は 90%以上であるが、好ましくは 95%以上であり、さらに好ましくは 99%以上 である。なお、一本鎖 DNAの塩基配列がセンス鎖側領域の塩基配列と 90%以上の 相同性を有する場合、一本鎖 DNAはセンス鎖側領域と相同置換可能であると考えら れ、一本鎖 DNAの塩基配列がアンチセンス鎖側領域の塩基配列と 90%以上の相同 性を有する場合、一本鎖 DNAはアンチセンス鎖側領域と相同置換可能であると考え られる。一本鎖 DNAのセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域との相同置換は、 本発明の核酸構築物による標的領域の塩基配列への変異導入メカニズムの一つと して考えられる。
[0032] 一本鎖 DNAの塩基数は、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域の塩基配列 に対して加えられた変異に応じて異なる力 通常 300〜3000、好ましくは 300〜1500、 さらに好ましくは 300〜900である。
[0033] 一本鎖核酸は、 DNA、 RNA、核酸誘導体、核酸類似体等のいずれであってもよい。
核酸誘導体又は類似体としては、例えば、ホスホロチォエート DNA、ホスホロチォェ ート RNA、 2'-0_Me-RNA、 LNA (Locked nucleic acid)、 PNA (ペプチド核酸）、 ENA ( Ethylene-bridged nucleic acid)等 举げられる。
[0034] 一本鎖核酸は、一本鎖 DNAにアニーリングできる限り、一本鎖 DNAのいずれの部 分の塩基配列と相補的な塩基配歹 1Jを含んでいてもよいが、一本鎖核酸は、一本鎖 D NAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本 鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分にアニーリングしていることが好ましぐ一 本鎖 DNAの 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖 DNAの 3' 末端側部分にアニーリングしていることがさらに好ましい。一本鎖核酸が、一本鎖 DN Aの一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分、特に 3'末端側部分にァニーリン グした核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。
[0035] 一本鎖 DNAの 5'末端側部分は、一本鎖 DNAの 5'末端に位置する塩基を含む塩基 配列からなる部分であり、一本鎖 DNAの 3'末端側部分は、一本鎖 DNAの 3'末端に位 置する塩基を含む塩基配列からなる部分である。
[0036] 一本鎖 DNAのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置 換、挿入又は付加された塩基の位置と、一本鎖核酸がアニーリングする位置との関 係は特に限定されるものではなレ、が、一本鎖核酸は、一本鎖 DNAのうち、センス鎖側 領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、揷入又は付加された塩基のい ずれをも含まない部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖 DNAのうち、 センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、揷入又は付加され た塩基のレ、ずれをも含まなレ、部分にアニーリングしてレ、ることが好ましレ、。一本鎖 DN Aのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、揷入又は 付加された塩基の位置と、一本鎖核酸がアニーリングする位置とが異なる核酸構築 物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。
[0037] 例えば、一本鎖核酸が、一本鎖 DNAのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側 領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基のいずれよりも 5'側又は 3'側に 位置する部分にアニーリングした核酸構築物においては、一本鎖核酸が、一本鎖 D NAのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、揷入又 は付加された塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングしているので、このような 核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。特に、 一本鎖核酸が、一本鎖 DNAのうち、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対 して欠失、置換、揷入又は付加された塩基のいずれよりも 3'側に位置する部分にァ ニーリングした核酸構築物によれば、標的領域への変異導入効率を向上させること ができる。
[0038] また、一本鎖核酸が、一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分にァニーリン グしてレ、る核酸構築物にぉレ、ては、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域に対 して欠失、置換、挿入又は付加されたいずれの塩基も、一本鎖 DNAの 5'末端側部分 又は 3'末端側部分に存在しなければ、一本鎖核酸が、一本鎖 DNAのうち、センス鎖 側領域又はアンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された塩基の いずれをも含まない部分にアニーリングすることとなるので、このような核酸構築物に よれば、標的領域への変異導入効率を向上させることができる。
[0039] 一本鎖核酸に含まれる一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の塩基 数は、通常 15〜100、好ましくは 20〜70、さらに好ましくは 20〜50である。
[0040] 一本鎖核酸は、一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列のみからなつ ていてもよいし、当該塩基配列の 5'末端及び/又は 3'末端に任意の塩基配列が付 カロされた塩基配列からなっていてもよレ、。一本鎖核酸が、一本鎖 DNAの一部の塩基 配列と相補的な塩基配列の 5'末端及び Z又は 3'末端に任意の塩基配列が付加され た塩基配列からなる場合、一本鎖核酸のうち、一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補 的な塩基配列からなる部分が一本鎖 DNAの対応部分にアニーリングする。一本鎖核 酸が、一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の 5'末端及び/又は 3'末 端に任意の塩基配列が付加された塩基配列からなる場合、一本鎖核酸の塩基配列 の塩基数は通常 25〜130、好ましくは 25〜100、さらに好ましくは 25〜80である。
[0041] 一本鎖核酸が一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列からなる場合の
、本発明の核酸構築物の一実施形態を図 1 (a)及び (b)に示す。
[0042] 図 1 (a)に示すように、核酸構築物 10aは、一本鎖 DNA 20と、一本鎖 DNA 20の 5'末 端側部分 21と相補的な塩基配列からなり、一本鎖 DNA 20の 5'末端側部分 21にァニ 一リングした一本鎖核酸 30aとを有する。
[0043] 図 1 (b)に示すように、核酸構築物 10bは、一本鎖 DNA 20と、一本鎖 DNA20の 3'末 端側部分 22と相補的な塩基配列からなり、一本鎖 DNA 20の 3'末端側部分 22にァニ 一リングした一本鎖核酸 30bとを有する。
[0044] 一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の 3'末端に任意の塩基配列が 付加された塩基配列からなる一本鎖核酸としては、例えば、次式 (I)：
5し D - C - B -A _ 3，
1 1 1 1
で表される塩基配列からなり、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される
1 1 塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している一本鎖核酸が 挙げられる。
[0045] 式 (I)におレ、て、 Aは、 2個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。 Aで表さ
1 1 れる塩基配列の塩基数の上限値は特に限定されるものではないが、通常 30、好まし くは 20、さらに好ましくは 10である。 Aで表される塩基配列は特に限定されるものでは
1
ないが、 CG含有率が高い塩基配列であることが好ましい。 Aで表される塩基配列に
1
おける CG含有率は通常 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 である。
[0046] 式 (I)において、 Bは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まなレ、、 3個
1 1
以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。 Bで表される塩基配列の塩基数の上
1
限値は特に限定されるものではなレ、が、通常 10、好ましくは 7、さらに好ましくは 5であ る。 Bで表される塩基配列は、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まな
1 1
い限り特に限定されるものではないが、熱的に安定なループを形成可能な塩基配列
、例えば、一本鎖核酸が DNAである場合には gaa、 gxya、 gxay (x及び yは任意の塩基 を表す。）等であることが好ましい。 [0047] 式 (I)におレ、て、 Cは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を表す。
1 1
式 (I)において、 Dは、一本鎖 DNAの 5'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配
1
列を表す。 Dで表される塩基配列の塩基数は、通常 15
1 〜100、好ましくは 20〜70、さ らに好ましくは 20〜50である。
[0048] 一本鎖核酸が式 (I)で表される塩基配列からなる場合の、本発明の核酸構築物の 一実施形態を図 1 (c)に示す。
[0049] 図 1 (c)に示すように、核酸構築物 10cは、一本鎖 DNA 20と、一本鎖 DNA 20にァニ 一リングした、式 (I)で表される塩基配列からなる一本鎖核酸 30cと有し、一本鎖核酸
30cのうち、 Dで表される塩基配列からなる部分力 一本鎖 DNA 20の 5'末端側部分 2
2
3にアニーリングしており、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される塩基
1 1
配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している。
[0050] 一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列の 5'末端に任意の塩基配列が 付加された塩基配列からなる一本鎖核酸としては、例えば、次式 (Π)：
5'— A B — C D — 3'
2 2 2 2
で表される塩基配列からなり、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される
2 2
塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している一本鎖核酸が 挙げられる。
[0051] 式 (Π)におレ、て、 Aは、 2個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。 Aで表さ
2 2 れる塩基配列の塩基数の上限値は特に限定されるものではないが、通常 30、好まし くは 20、さらに好ましくは 10である。 Aで表される塩基配列は特に限定されるものでは
2
ないが、 CG含有率が高い塩基配列であることが好ましい。 Aで表される塩基配列に
2
おける CG含有率は通常 70%以上、好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以上 である。
[0052] 式 (Π)において、 Bは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を含まない、 3
2 2
個以上の塩基からなる任意の塩基配列を表す。 Bで表される塩基配列の塩基数の
2
上限値は特に限定されるものではないが、通常 10、好ましくは 7、さらに好ましくは 5で ある。 Bで表される塩基配列は、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を含ま
2 2
ない限り特に限定されるものではないが、熱的に安定なループを形成可能な塩基配 歹 IJ、例えば、一本鎖核酸が DNAである場合には gaa、 gxya、 gxay (x及び yは任意の塩 基を表す。）等であることが好ましい。
[0053] 式 (Π)におレ、て、 Cは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を表す。
式 (Π)において、 Dは、一本鎖 DNAの 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配 列を表す。 Dで表される塩基配列の塩基数は、通常 15〜100、好ましくは 20〜70、さ らに好ましくは 20〜50である。
[0054] 一本鎖核酸が式 (II)で表される塩基配列からなる場合の、本発明の核酸構築物の 一実施形態を図 1 (d)に示す。
[0055] 図 1 (d)に示すように、核酸構築物 10dは、一本鎖 DNA 20と、式（Π)で表される塩 基配列からなる一本鎖核酸 30dと有し、一本鎖核酸 30dのうち、 Dで表される塩基配 歹 IJからなる部分は、一本鎖 DNA 20の 3'末端側部分 24にアニーリングしており、 Aで 表される塩基配列からなる部分が、 Cで表される塩基配列からなる部分にァニーリン グし、ヘアピン構造を形成している。
[0056] 本発明の核酸構築物において、一本鎖 DNAにアニーリングしている一本鎖核酸の 数は特に限定されるものではなぐ単数であってもよいし、複数であってもよい。一本 鎖 DNAに複数の一本鎖核酸がアニーリングしている場合、複数の一本鎖核酸はそれ ぞれ、一本鎖 DNAの異なる部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、一本鎖 DN Aの異なる部分にアニーリングしている。一本鎖 DNAに複数の一本鎖核酸がァニーリ ングしている場合、一本鎖 DNAのうち、ある一本鎖核酸がアニーリングする領域と、他 の一本鎖核酸がアニーリングする領域とが連続してレ、てもよレ、し、不連続であっても よい。
[0057] 一本鎖 DNAに 2つの一本鎖核酸がアニーリングしている場合の、本発明の核酸構 築物の一実施形態を示す模式図を図 1 (e)及び (f)に示す。
[0058] 図 1 (e)に示すように、核酸構築物 10eは、一本鎖 DNA 20と、一本鎖 DNA 20の 5' 末端側部分 25と相補的な塩基配列からなり、一本鎖 DNAの 5'末端側部分 25にァニ 一リングした一本鎖核酸 30eと、一本鎖 DNA20の 5'末端側部分 25に隣接する部分 2 6と相補的な塩基配列からなり、一本鎖 DNAの部分 26にアニーリングした一本鎖核 酸 31eとを有する。なお、一本鎖 DNAのうち、 5'末端側部分 25と、 5'末端側部分 25 に隣接する部分 26とは連続している。
[0059] 図 1 (f)に示すように、核酸構築物 10fは、一本鎖 DNA 20と、一本鎖 DNA 20の 5'末 端側部分 27と相補的な塩基配列からなり、一本鎖 DNAの 5'末端側部分 27にァニーリ ングした一本鎖核酸 30fと、一本鎖 DNA 20の 5'末端側部分 27の近傍に位置する部 分 28と相補的な塩基配列からなり、一本鎖 DNAの部分 28にアニーリングした一本鎖 核酸 31fとを有する。なお、一本鎖 DNAのうち、 5'末端側部分 27と、 5'末端側部分 27 の近傍に位置する部分 28とは不連続である。
[0060] 一本鎖 DNA及び一本鎖核酸は、公知の化学合成法を用いて作製することができる 。この際、短鎖（例えば 100塩基長程度）のものを複数合成し、それらを公知のライゲ ーシヨン法により連結し、 目的の塩基長の一本鎖 DNA及び一本鎖核酸を作製するこ とができる。また、一本鎖 DNAは、標的領域を有する二本鎖 DNAを铸型とした変異導 入型 PCR、市販の変異導入キット等により調製したファージ又はファージミド DNAを制 限酵素処理することにより作製することができる。
[0061] 本発明の治療剤は、細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域のうち、センス鎖側 領域又はアンチセンス鎖側領域に含まれる異常塩基配列が原因となる疾患の治療 剤であって、本発明の核酸構築物を含む治療剤である。
[0062] 本発明の治療剤は、核酸構築物を細胞内に導入可能な形態で含むことが好ましい 。細胞内に導入可能な形態としては、適当な溶媒 (例えば水）に分散させた形態、中 空ナノ粒子、リボソーム等の内部に封入した形態、カチオン性ポリマーとの複合体等 が挙げられる。
[0063] 本発明の方法は、細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域の塩基配列に変異を 導入する方法であって、細胞内に本発明の核酸構築物を導入する工程を含む方法 である。
[0064] 細胞は、生物個体を構成していない細胞又は生物個体を構成している細胞のいず れであってもよい。細胞は真核細胞又は原核細胞のいずれであってもよぐ細胞が由 来する生物種は特に限定されるものではなレ、。細胞が由来する生物種としては、例 えば、哺乳類、鳥類、昆虫類等の動物、植物、微生物等のいずれであってもよいが、 動物であることが好ましぐ哺乳類であることがさらに好ましい。哺乳類としては、例え ば、ヒト、サル、ゥシ、ヒッジ、ャギ、ゥマ、ブタ、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、モル モット等が挙げられる。微生物は、原核微生物及び真核微生物のいずれであっても よぐ原核微生物としては、例えば、グラム陽性菌（例えば、 Micrococcus属、 Staphylo coccus j¾、 Bacillus属、 Clostridium属、 Lactobacillus晨、し orynebactermmj¾、 Strepto mycesノ禺等)、グフム陰性囷 (例 ば、 Rhodopseudomonas晨、 Pseudomonasノ禺、 Esheri chia属、 Salmonella属、 Nitrobacter属、 Thiobacillus属、 Neisseria属等）等の細菌類力 S 挙げられ、真核微生物としては、例えば、糸状菌 (カビ類）、酵母等の真菌類が挙げ られる。
[0065] 細胞の種類は特に限定されるものではなぐ例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞、 又はこれらの培養細胞等が挙げられる。体細胞の具体例としては、脳、脊髄等の神 経系組織;網膜細胞、嗅細胞等の感覚器;食道、胃、小腸、大腸等の消化器;肺、気 管支等の呼吸器;精巣、卵巣、子宮、胎盤等の生殖器;腎臓、膀胱等の泌尿器;骨 髄細胞、血球細胞等の造血器;骨格筋、平滑筋、心筋等の筋組織;骨芽細胞、破骨 細胞等の骨組織;皮膚、毛根細胞等の皮膚組織等の各種組織'器官から分離された 生細胞又はその培養細胞等が挙げられ、生殖細胞の具体例としては、卵、精子又は その培養細胞等が挙げられ、幹細胞の具体例としては、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性 生殖細胞（EG細胞）、栄養膜幹細胞 (TS細胞）、骨髄幹細胞、神経幹細胞等が挙げ られる。
[0066] 本発明の核酸構築物の細胞内への導入方法としては、例えば、エレクト口ポレーシ ヨン法、リン酸カルシウム法、リポフエクシヨン法、マイクロインジェクション法等を使用 すること力 Sできる。
[0067] 細胞内に本発明の核酸構築物が導入されると、細胞内の二本鎖 DNAに存在する 標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域が本発明の核酸構築物 に含まれる一本鎖 DNAで相同置換されたのと同様の変異（1又は複数個の塩基の欠 失、置換、揷入又は付加）が、センス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領域のうち一方 の領域に導入され、他方の領域も一方の領域と相補的となるように修正され、その結 果、センス鎖側領域及びアンチセンス鎖側領域の両方に変異が導入される。
[0068] 標的領域に疾患に原因となる異常塩基配列が含まれる場合、異常塩基配列に変 異を導入し、正常塩基配列に変換することにより、異常塩基配列が原因となる疾患を 治療することができる。
[0069] 標的領域に変異が導入された細胞及び該細胞を保有する生物個体は、特定の化 合物等に対する感受性が正常型とは異なるスクリーニング系、疾患モデル等として有 用である。
[0070] 本発明の核酸構築物を保有する生物個体は、生物個体を構成する細胞内に本発 明の核酸構築物が導入された生物個体であってもよいし、本発明の核酸構築物が導 入された細胞を移植された生物個体であってもよい。
実施例
[0071] 1.方法
(1)プラスミドの作製
pHygEGFP (CLONTECH Laboratories社製）の Kpnl-Sall断片を、 pALTER-1 (Prom ega社製）の同じ制限酵素部位へ導入した pALHEに対し、 Altered Sites II in vitro Mu tagenesis System (Promega社製）を用いて部位特異的変異導入反応を行った。なお 、 HygEGFPはハイグロマイシン耐性遺伝子 (Hyg)と緑色蛍光タンパク質 (EGFP)遺伝 子との融合遺伝子である。
[0072] 一回目の反応では、オリゴヌクレオチド Xho (5し cggcacctcgagcacgcggat：配列番号
1)を用いて Xhol部位を導入し、 pALHEXを作製した。このとき、正常 HygEGFP遺伝 子のコドン 195は Valから Gluへ変化する力 S、遺伝子修復反応の定量には影響しなか つた。
[0073] 二回目の反応では、オリゴヌクレオチド Silent (5'-gcgaagaatcacgtgctttca-3'：配列番 号 2)を用いて正常 HygEGFP遺伝子のコドン 34に遺伝子マーカーとなる PmaCI部位 を導入し、 pALHEXPを作製した。さらに、 pALHEXPに対し、オリゴヌクレオチド Opal (5 '-ggcgaagaatgacgtgctttc-3'：配列番号 3)を用いて、正常 HygEGFP遺伝子のコドン 34 に opal変異を導入し、 pALHEXBを作製した。最後の反応では、 opal変異と同時に、 先ほど導入された PmaCI部位が除去され、代わりに変異型 HygEGFP遺伝子のマーカ 一として BmgBI部位が導入される。
それぞれのプラスミドに含まれる HygEGFP遺伝子の配列はシークェンス反応によつ て確認した。
[0074] pALHEXP及び pALHEXBから精製した BamHI-Sall断片を、 NXBリンカ一 (Upper: 5' —catggcgatcctcga— ：酉己歹 IJ番 4, Lower:り -gatctcgaggatcgc-3：自己歹 IJ番号 5)を用レヽ て、 pTriEx-3Neo (Novagen社製）の CMVプロモーター及び T7プロモーターの下流に 存在する Ncol-Xhol部位へ導入し、 pTENHES及び pTENHEXを作製した。 pTENHES 及び pTENHEXは、大腸菌及び哺乳動物の細胞内でそれぞれ正常型及び変異型 Hy gEGFP遺伝子を発現することができることが確認された。これらのプラスミドを大腸菌 DH- 5ひ株に導入し、 Endofree Mega Kit (QIAGEN社製）を用いて精製した。
[0075] (¾ファージミドの作製
pTENHESの Xhol断片を pBluescript II SK+ (Stratagene社製）の Xhol部位に導入す ることにより、ファージミド pBSHES/AntiSense及び pBSHES/Senseを作製した。 pBSHE S/AntiSense及び pBSHES/Senseにおいて、 Xhol断片は、 pBluescript II SK+の fl ori に対して逆の向きに挿入され、 pBSHES/AntiSense及び pBSHES/Senseから得られる 一本鎖環状 DNAは、それぞれ正常型 HygEGFP遺伝子のアンチセンス鎖及びセンス 鎖を含んでいる。それぞれの挿入方向は制限酵素 Nael及び PmaCIによって確認した 。ファージミドを大腸菌 JM105株に導入し、 2 X YT培地（50 i g/mLアンピシリン (Amp) 含有）でー晚培養した後、 5mLを 500mLの 2 X YT培地（50 μ g/mL Amp含有）に移し、 激しく攪拌しながら 37°Cで培養した。 1時間後に 25 μ g/mLとなるようにカナマイシンを 加え、再び培養を続け、 23時間後、遠心分離 (2.15 X 103g, 15分）によってファージミ ドを大腸菌と分離した。上清に含まれるファージミドに、 75mLの 20%PEG6000/2.5M NaCl溶液をカ卩え、 4°Cでー晚静置した。遠心分離（18.8 X 103g, 20分）により、ファー ジミドを沈殿させた後、 20mLの 0.3M AcONa/lmM EDTAに懸濁し、フエノール、フエ ノール/クロロフオルム（1/1)、クロロフオルムを用いて、環状一本鎖 DNAを回収した。
DNA溶液に 25mL EtOHをカ卩え、室温で 15分間静置した後、遠心分離によって沈殿さ せ、 500 μ Lの水に溶解した。
[0076] (3)フラグメント 1の調製
pBSHES/Senseから得られた環状一本鎖 DNA lpmol (l. l μ g)を、 5Uの Xholで消化 し、 606^の断片を3.5%低融点ァガロースゲルで分離した後、フエノール'クロロフォ ルム抽出によって回収した。環状一本鎖 DNAの制限酵素処理において、 Xhol部位 周辺を二本鎖とするため、 pBSHES/Senseの 5'及び 3'側の Xhol部位に相補的なオリゴ ヌクレ テド S5 { — cccccctcgaggtgccg— 3：酉己歹 [|番号り)及び ¾3' (。 -ggggctctcgaggtc gac_3'：配列番号 7)を、環状一本鎖 DNAに対して 5モル当量加えた。
[0077] 回収した断片は、ゲルろ過（NAP5カラム， Amersham Biosciences社製）で精製し、 A
/A 力 Si.8以上であることを確認した。 DNA量は、 OD 1.0あたり一本鎖 DNA 40 μ g として算出した。
こうして調製されたセンス配列からなる一本鎖 DNA (フラグメント 1 )の塩基配列を配 列番号 8に示す。なお、フラグメント 1のうち、標的領域へ変異を導入するための塩基 (以下「変異導入塩基」という。）は、配列番号 8のうち 126 128番目の塩基 (tea)であ る。
[0078] (4)フラグメント 2 6の調製
フラグメント 1の 5'末端部分と相補的な塩基配列からなるフラグメント 2 (配列番号 9) 、フラグメント 1の 3'末端部分と相補的な塩基配列からなるフラグメント 3 (配列番号 10) 、及びフラグメント 1のうち変異導入塩基よりも 3 '側に位置する部分 (配列番号 8のうち 286 320番目の塩基からなる塩基配列部分）と相補的な塩基配列からなるフラグメン ト 6 (配列番号 16)を化学合成により作製した。化学合成は Sigma Genosys Japanに委 託した。
[0079] フラグメント 1の 5'末端部分と相補的な塩基配列を含むフラグメント 4 (配列番号 11) 、及びフラグメント 1の 3'末端部分と相補的な塩基配列を含むフラグメント 5 (配列番号 12)を化学合成により作製した。化学合成は北海道システムサイエンスに委託した。
[0080] なお、フラグメント 4は、次式：
5 FD -FC -FB - FA _ 3
[式中、 FDは ggcggctccggggatctcga (フラグメント 1の 5'末端側部分の塩基配列と相補 的な塩基配列）であり、 FCは gcであり、 FBは gaaaであり、 FAは gcである。 ] で表される塩基配列からなり、 FA部分が FC部分にアニーリングし、ヘアピン構造を 形成すること力できる。
[0081] フラグメント 5は、次式： 5' -FA FB— FC— FD— 3'
1 1 1 1
[式中、 FAは gcであり、 FBは gaaaであり、 FCは gcであり、 FDは ggtgccggacttcggggca
1 1 1 1
g (フラグメント 1の 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配歹 IJ)である。 ] で表される塩基配列からなり、 FA部分が FC部分にアニーリングし、ヘアピン構造を
1 1
形成すること力 sできる。
[0082] (5)核酸構築物の作製
lOpmolのフラグメント 1に対し、アニーリング効率を考慮して 10倍量（lOOpmol)の各 フラグメントを、 20 μ Lの TE緩衝液中で混合した。 95°Cで 5分間加熱して DNAを変性さ せた後、氷中で 5分間急冷した。さらに 80°Cで 5分間加熱した後、徐冷することによつ
[0083] (6)核酸構築物の導入
核酸構築物の導入反応の前日に、 4mLの 10% FBSを含む D'MEM/F12 (Invitrogen 社製）中に懸濁した 3 X 105個の CHO-K1細胞を 6cmディッシュに播き、 37°C、 5% CO 雰囲気下において培養した。フラグメント 1又は各核酸構築物（それぞれ lOpmolのフ
2
ラグメント 1を含む）を pTENHEX (25 fmol, 125 ng)とともに、リポフエクトァミン試薬（Inv itrogen)を用いて、 CHO-K1細胞へ導入した。各核酸構築物を細胞へ導入するにあ たり、フラグメント 1には 1 β gの pALHEX- Ex2 (Promega社製）を加え、すべてのサンプ ノレの DNA量力 μ gとなるように調整した。
[0084] 導入反応後、 48時間培養した細胞をトリプシン処理し、 lmL PBSで洗浄した後、遠 心分離により細胞を集めた。これを 100 /i Lの TEG (25mM Tris-HCl, lOmM EDTA, 5 OmM Glc, pH8.0)に懸濁し、 200 μ Lの 0.2N NaOH/1% SDSをカロえ、穏やかに攪拌し た後、室温で 5分間放置した。さらに 150 μ Lの 8M AcONHを加え、 4°Cで 15分間冷却
4
した。遠心分離後、 isoPrOH沈殿によって、上清からプラスミド DNAを回収した。プラ スミド DNAは 20 μ Lの水に溶解し、使用するまで- 20°Cで保存した。
[0085] (7)遺伝子修復効率の定量
回収したプラスミド DNAを、エレクト口ポレーシヨン法を用いて大腸菌 DH-5ひ株に導 入した。エレクト口ポレーシヨン法は、 Gene Pulser II (Bio-Rad laboratories社製）を用 いて、 4。C、 1.8kV、 25 μ F、 200 Ωの条件で行った。プラスミド DNAを導入した大腸菌 DH-5 a株は、 ImLの SOC培地で 1時間培養した後、 50 μ g/mL Amp添加 LB培地で 希釈し、一晩培養した。このとき大腸菌 DH_5 ct株の一部をとり、 LB寒天培地に播き、 コロニー数によってエレクト口ポレーシヨン効率を測定した力 S、大きな違いは観察され なかった。翌日、大腸菌 DH- 5 α株を遠心分離によって回収し、 100 μ Lの TEGに際 懸濁した。これに 200 x Lの 0.2N NaOH/1 % SDSを加え、穏やかに攪拌した後、さら ίこ 150 μし Sol III (3M酢酸カリウム、 11.5%酢酸）を加え、氷上に 5分間放置した。遠 心分離した上清をフエノール/クロロフオルム（1/1)で処理し、エタノール沈殿によりプ ラスミド DNAを回収した。これを 20 μ Lの水に溶解し、このうち 1〜2 μ Lを大腸菌 BL21 (DE3)株へエレクト口ポレーシヨン法を用いて導入した。このとき、大腸菌 DH-5ひ株と 同様の操作によって、大腸菌 BL21(DE)株への形質転換を行った。形質転換後、 ImL の SOC培地を加え、 37°Cで 1時間培養した後、 50 μ Lをとり 50 μ g/mL Amp及び 10 μ M IPTGを含む ImLの LB培地を用いて、 37°Cで 3時間培養した。培養後、培地の一部 を 10-100倍希釈したものを 75 μ g/mLハイグロマイシン B添加 LB寒天培地（Hyg75： 5 0 μ g/mL Amp, 10 μ M IPTG)へ、 100-1000希釈したものをハイグロマイシン Bを含ま なレヽ LB寒天培地（HygO : 50 i g/mL Amp, 10 /i M IPTG)へ、それぞれ等量ずっ播き 、 37°Cでインキュベートした。 12-24時間後、 HygOに生えたコロニー数をカウントした。 また、 36-48時間後に Hyg75に生えたコロニーを、 FLA2000G (FUJI PHOTO FILM社 製）を用いて解析し、 EGFPの蛍光（Ex. 473nm, Em. 520nm)を発するコロニー数を力 ゥントした。 HygOのコロニー数を分母に、 Hyg75の EGFP蛍光陽性コロニー数を分子と して、遺伝子修復効率を算出した。
なお、 pTENHEXの構成を図 2に示し、 pTENHEXに含まれる変異型 HygEGFP遺伝 子の塩基配列及びそれにコードされるアミノ酸配列を配列番号 13に示す。配列番号 13に示す塩基配列のうち 1〜36番目の塩基からなる塩基配列は、 pTENHEXに変異 型 HygEGFP遺伝子を導入する際に付加された塩基配列であり、変異型 HygEGFP遺 伝子の塩基配列は実際には 37番目の塩基から始まる。正常型 HygEGFP遺伝子のコ ドン 34は teaであり Serをコードしている力 変異型 HygEGFP遺伝子のコドン 34には終 止変異 (TGA)が導入されているため、 HygEGFP遺伝子を正常に発現することができ なレ、。本実験においては、 pTENHEXに含まれる変異型 HygEGFP遺伝子のコドン 34 が正常型 (tea)に修復されたことを、ハイグロマイシン耐性及び EGFPの蛍光発色とい う 2種類の表現型によって確認した。
[0087] 2.結果
図 3は、フラグメント 1単独（図中「Tailed_Duplex 1」）、フラグメント 1とフラグメント 1に アニーリングしたフラグメント 2からなる核酸構築物 S1 (図中「Tailed-Duplex 2」）、フラ グメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 3からなる核酸構築物 S2 (図中 rTailed-Duplex 3」）、及びフラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 6力、らなる核酸構築物 S5 (図中「Tailed-Duplex 6」）を用いた場合の、 pTENHEXに含 まれる変異型 HygEGFP遺伝子の修復効率を示す。
[0088] 図 3に示すように、核酸構築物 Sl、 S2及び S5は、フラグメント 1単独に対し、それ ぞれ 1.3倍、 1.8倍及び 1.8倍高い修復効率を示した (核酸構築物 S1の修復効率 2.6 %,核酸構築物 S2の修復効率 3.7%,核酸構築物 S5の修復効率 3.7%)。また、核 酸構築物 S1の修復効率に対し、核酸構築物 S2及び S5の修復効率は有意に高かつ た。
[0089] 図 4は、フラグメント 1単独（図中「Looped-Duplex 1」）、フラグメント 1とフラグメント 1 にアニーリングしたフラグメント 4からなる核酸構築物 S3 (図中「Looped_Duplex 4」）、 及びフラグメント 1とフラグメント 1にアニーリングしたフラグメント 5からなる核酸構築物 S4 (図中「Looped_Duplex 5」 )を用いた場合の、 pTENHEXに含まれる変異型 HygEG FP遺伝子の修復効率を示す。
[0090] 図 4に示すように、核酸構築物 S3及び S4は、フラグメント 1単独に対し、それぞれ 1· 4倍及び 1.9倍高い修復効率を示した (核酸構築物 S3の修復効率 2.7%,核酸構築 物 S4の修復効率 3.7%)。また、核酸構築物 S3の修復効率に対し、核酸構築物 S4 は有意ではないものの高い修復効率を示した。フラグメント 4及び 5がヘアピン構造を 形成する核酸構築物 S3及び S4が、より安定な 35塩基対の二本鎖を形成する核酸構 築物 S1及び S2と同等の遺伝子修復効率を示したことから、末端のループ化による D NA断片のェキソヌクレアーゼからの保護は非常に重要な意味を持つことが推測され る。したがって、フラグメント 2〜5の代わりに、細胞内のヌクレアーゼに抵抗性を持ち 、なおかつ DNAと効率よくアニーリングできる 2'-0_Me-RNA、 PNA等の核酸アナログ を用いることによって、遺伝子修復効率がさらに向上することが期待できる。
なお、 pTENHEXに対して、 PCR産物を用いた従来の SFHR法により、変異型 HygEG FP遺伝子を修復した結果、変換効率は 0.16%であった。 PCR産物は、プライマー 1 (5 - gagatccccggagccg -3 ：目歹 K番号丄 4)及びフフイマ一 2 (o - gaggtgccggacttcgg ~ό'： 配列番号 15)と Taqポリメラーゼ（Tokyobo社製）を用いて増幅し、 3'末端を Blunting Hi gh Kit (Tokyobo社製）により平滑末端化し、 3.5%低融点ァガロース電気泳動により 精製した。

Claims

請求の範囲
細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス 鎖側領域の塩基配列において、 1又は複数個の塩基が欠失、置換、揷入又は付加さ れた塩基配列からなり、前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域の塩基 配列との相同性が 90%以上である一本鎖 DNAと、
前記一本鎖 DNAの一部の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖 DNA にアニーリングした一本鎖核酸とを有する核酸構築物。
前記一本鎖 DNAの塩基数が 300 3000であり、前記一本鎖核酸の塩基数が 15 1 00である請求項 1記載の核酸構築物。
前記一本鎖核酸が、前記一本鎖 DNAのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチ センス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加された前記塩基のいずれをも含 まない部分の塩基配列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖 DNAのうち、前記セ ンス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又は付加さ れた前記塩基のいずれをも含まない部分にアニーリングした請求項 1又は 2記載の 核酸構築物。
前記一本鎖核酸が、前記一本鎖 DNAのうち、前記センス鎖側領域又は前記アンチ センス鎖側領域に対して欠失、置換、揷入又は付加された前記塩基のいずれよりも 5 '側又は 3'側に位置する部分にアニーリングした請求項 3記載の核酸構築物。
前記一本鎖核酸が、前記一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分の塩基配 列と相補的な塩基配列を含み、前記一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端側部分 にアニーリングした請求項 1 4のいずれかに記載の核酸構築物。
前記一本鎖核酸が、次式 (I) :
5 D - C - B -A _ 3
1 1 1 1
[式中、 Aは、 2個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、 Bは、 Aで表される塩
1 1 1
基配列と相補的な塩基配列を含まない、 3個以上の任意の塩基からなる塩基配列を 表し、 Cは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、 Dは、前記一本鎖 D
1 1 1
NAの 5'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配歹 IJを表す。]
で表される塩基配列からなり、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される 塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している請求項 5記載 の核酸構築物。
前記一本鎖核酸が、次式 (II) :
5 A -B -C -D _3
[式中、 Aは、 2個以上の任意の塩基からなる塩基配列を表し、 Bは、 Aで表される塩 基配列と相補的な塩基配列を含まない、 3個以上の任意の塩基からなる塩基配列を 表し、 Cは、 Aで表される塩基配列と相補的な塩基配列を表し、 Dは、前記一本鎖 D
NAの 3'末端側部分の塩基配列と相補的な塩基配歹 1Jを表す。]
で表される塩基配列からなり、 Aで表される塩基配列からなる部分力 Cで表される 塩基配列からなる部分にアニーリングし、ヘアピン構造を形成している請求項 5記載 の核酸構築物。
前記センス鎖側領域又は前記アンチセンス鎖側領域に対して欠失、置換、挿入又 は付加された前記塩基のいずれも力 前記一本鎖 DNAの 5'末端側部分又は 3'末端 側部分に存在しない請求項 5 7のいずれかに記載の核酸構築物。
前記一本鎖 DNAにアニーリングした複数の一本鎖核酸を有し、
前記複数の一本鎖核酸がそれぞれ前記一本鎖 DNAの異なる部分の塩基配列と相 補的な塩基配列を含む請求項：!〜 8のいずれかに記載の核酸構築物。
前記標的領域に疾患の原因となる異常塩基配列が含まれており、
前記一本鎖 DNAが、前記標的領域のうちセンス鎖側領域又はアンチセンス鎖側領 域の塩基配列において、前記異常塩基配列が正常塩基配列となるように、 1又は複 数個の塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる請求項 1 9のい ずれかに記載の核酸構築物。
細胞内の二本鎖 DNAに存在する標的領域に含まれる異常塩基配列が原因となる 疾患の治療剤であって、
請求項 10記載の核酸構築物を含む治療剤。
生物個体を構成していない細胞内又はヒト以外の生物個体を構成している細胞内 の二本鎖 DNAに存在する標的領域の塩基配列に変異を導入する方法であって、 前記細胞内に請求項:!〜 10のいずれかに記載の核酸構築物を導入する工程を含 む方法。
請求項 1〜： 10のいずれかに記載の核酸構築物が導入された細胞。 請求項 13記載の細胞を保有するヒト以外の生物個体。
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