WO2006046766A1

WO2006046766A1 - 心不全治療のための遺伝子治療

Info

Publication number: WO2006046766A1
Application number: PCT/JP2005/020163
Authority: WO
Inventors: Yoshiki Sawa; Yukitoshi Shirakawa; Eisuke Tatsumi; Yoshiyuki Taenaka; Hikaru Matsuda
Original assignee: Anges Mg, Inc.
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-27
Publication date: 2006-05-04
Also published as: US20090012498A1; CA2582143A1; EP1810696A1; EP1810696A4; JPWO2006046766A1

Abstract

本発明は、補助人工心臓(VAD)併用下に投与される、急性心筋梗塞(AMI)、特発性心筋症(ICM)、拡張型心筋症(DCM)または心不全治療のための、血管新生サイトカインをコードする遺伝子からなる医薬である。

Description

心不全治療のための遺伝子治療発明の技術分野

本発明は心不全治療のための遺伝子治療またはその医薬である。背景技術

以下の説明における [番号]は後に記載した文献を示す。

重症慢性心不全 (CHF)患者においては、依然として心移植が究極的な治療方法である。

しかしながら心移植の全般的な適用可能性は、ドナーの極端な不足により限定的である [1]。

重症 CHF患者の多に対する薬物治療は十分ではなく、血管再開通術や他の外科的手法も通常は一時的なものに過ぎず、全体的に最終死亡率を大幅に減じるものではない。

左室補助人工心臓 (LVAD)は、心移植が実施できるまで、血液循環補助のために多頻度に用いられている。

しかし不幸なことに多くの患者は、この装置装着下に数ケ月ないし数年を過ごしている。

LVADの改良は臨床的に有意な生存利益を与え、重症 CHF患者の QOL (quality of life)を改善したが、一層の改善が求められている [2]。

最近、装着に成功した LVADによる心機能の回復が十分だった末期 CHF患者に関し、数件の報告がなされている。 [3 - 5]

しかしながらこのような患者は、 LVADを使用している患者のうちわずかな割合を占めるに過ぎない。

また長期回復成果、回復の機序、どの患者に対し適用可能かなど、依然不明であつ 7こ。重症 CHF患者数は増加しているため、再生医療のような他の選択肢を探す努力も続けられている。

肝細胞増殖因子（HGF)は、筋肉細胞を含む種々の細胞において、その特異的レセプターである c - Metを介し細胞分裂、遊走/移動（motogenic)、形態変化

(morphogenic)を起こさせることによる血管再生作用を有して 1、る [6, 7]。

我々発明者は以前、 HGFが心筋において繊維化抑制作用お tびアポトーシス抑制作用を示すことを示した [8-10]。

繊維化の進行、内皮機能障害の進行、機能する毛細血管の喪失、およびアポト一シスに関違した収縮容量喪失のような、重症心不全の発症上の特徴を考慮すると [11, 12]、 HGFは、心障害におけるリモデリング過程を減じる有用な効果を有するかもしれない [13, 14]。

従って HGF遺伝子導入は、 LVAD補助下における心障害に、 "自己心機能回復への橋渡し（Bridge to Recovery) "を可能とするかもしれない。

この可能性を検証するため、我々は LVADを埋設した心障害ャギに対し、 HGF遺伝子治療を実施した。

W001/026694公報は、心機能修復のため、センダイウィルス（HVJ) -リボソームに封入した HGF 遺伝子を、心筋病変部位に非侵襲的に投与する方法を開示している。しかしながらこの先行技術は、裸の（naked)プラスミドの投与や補助人工心臓 (VAD)との組み合わせに関しては、何ら開示していなかった。発明の開示

本発明は以下それぞれに関する。

(1) 助人工心臓 (VAD)併用下に投与される、急性心筋梗塞 (AMI)、特発性心筋症 (ICM)、拡張型心筋症 (DCM)または心不全治療のための、血管新生サイト力インをコ一ドする遺伝子からなる医薬、

(9) 上記医薬を補助人工心臓 (VAD)併用下の患者に投与することにより、急性心筋梗塞 (AMI)、特発性心筋症（ICM)、拡張型心筋症 (DCM)または、不全を治療する方法、または (10) 補助人工心臓 (VAD)併用下の患者の急性心筋梗塞（AMI)、特発性心筋症（ICM)、拡張型心筋症 (DCM)または心不全を治療する医薬を製造するための血管新生サイト力インをコードする遺伝子の用途。図面の簡単な説明

図 1は、心臓障害の動物モデルおよび実験デザィンを示した写真である。

A, 成体ャギ心臓の左前下行枝（LAD)を結紮して心筋梗塞を作製し、心筋中に直接、 hHGF cDNAまたは ]3 -ガラタシダーゼをコードするプラスミドを投与した。

B, 心障害ャギに両心室補助装置 [Bi- ventricular assist devices (BVAD) ]を装着した状況である。

C, 超音波振動子の装着部位を示した写真である。

手術時、 2個の超音波振動子を図示のように、心内膜中乳頭筋レベルで左室短軸と平行に埋設した。

図 2は、本実験における、 VAD補助率を比較したグラフ（A)、および HGF群（口）と対照群（〇）の原 (native)心拍出量を比較したグラフ（B)である。

データは平均土標準偏差で示した。

*対照群に対し P< 0. 01を示す。

図 3は、音波測微法（sonomicrometry)により算出した、％左室内径短縮率（％FS) で壁収縮能を比較した図である。

HGF群は口で、対照群は〇で示した。

データは平均土標準偏差で示した。

*対照群に対し P<0. 01を示す。

図 4は、 VADを取り除いた後の血行動態変化を示した図である。

心拍数 (ん HR)、全身血圧 (B, 平均 AoP)、混合静脈血酸素飽和度 (C, Sv02)、肺動脈圧（D, mean PAP) , 原 (native)心拍出量 (E, CO)および左室拡張末期径 (F, LVDd) を測定した。

データは平均 ±標準偏差で示した。

*対照群に対し P< 0. 05を示す。図 5は、遺伝子導入 4週後の心組織学的所見を示した写真である。

A, B, 左室短軸面断層部の顕微鏡所見

C, D, 梗塞領域に隣接する心筋 (梗塞部位、正常部位）をァザン -トリクローム染色した結果。（直線 = 100 /_t m、原拡大率 X 100)

E, F, 境界領域心筋をへマトキシリン 'ェォジン染色した結果。（直線 = 100 m、原拡大率 X 200)

G, H, フォンヴイレブランド抗体による免疫組織染色した結果。（直線 = 100 ΙΒ、原拡大率 X 200)

矢印は、フォンヴィレプランド抗体に対し陽性の内皮細胞の例を示す。

A, C, Εおよび Gは HGF群である。

Β, D, Fおよび Ηは対照群である。

図 6は、組織学的所見の評価結果を示したグラフである。

Α, 線維化率

Β, 境界領域における筋細胞直径

データは平均土標準偏差で示した。

C, 血管密度

細動脈密度発明の詳細な説明

本発明は、詳細には以下も含む。

(2) 血管新生サイト力インが、肝細胞増殖因子 (HGF)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、線維芽細胞増殖因子 (FGF)、上皮細胞増殖因子 (EGF)、神経増殖因子 (NGF)、トランスフォーミング成長因子 (TGF)、血小板由来増殖因子 (PDGF)およびィンスリン様增殖因子（IGF)からなる群より選ばれた一種である、（1)記載の医薬、

(3) 血管新生サイト力インが HGFである、（1)または (2)記載の医薬、

(4) 遺伝子がプラスミドの形にある、（1)ないし（3)いずれか記載の医薬、

(5) 血管新生サイト力インが心筋に直接投与される、（1)ないし (4)いずれか記載の医薬、 (6) 血管新生サイト力インが心筋の複数箇所に投与される、（1)ないし（5)いずれか記載の医薬、

(7) 心筋が左心室壁の虚血部位である、（1)ないし（6)いずれか記載の医薬、

(8) VADが、左室補助人工心臓 (LVAD)である、（1)ないし（7)いずれか記載の医薬、重症心不全においては、心移植までの血液循環補助に左室補助人工心臓 (LVAD) がしばしば用いられているが、長期 LVAD使用における死亡率は依然として高い。我々は肝細胞増殖因子 (HGF)が血管新生作用、繊維化抑制作用およびアポトーシス抑制作用を有することを明らかにした。従って HGF - cDNAプラスミドを用いる遺伝子治療は、 "自己心機能回復への橋渡し（Bridge to Recovery) "の可能性を高めるかもしれない。本研究では、我々は心障害ャギにおいて、 LVAD使用下に HGF遺伝子治療を行った。詳しくは、 6匹の成体ャギ（56 - 65kg)に対し、冠動脈結紮により心障害を作製し VADを装着した。 HGF群（n=3)には、ヒト HGF- cDNAプラスミド (2. Omg)を心筋内投与した。対照群 (n=3)には、 ]3 -カラクトシダーゼ 'プラスミドを同様に投与した。遺伝子導入 4週後、すべてのャギから VADを取り外した。 hHGF-cDNAを遺伝子導入した心筋においては、導入 3日後に 1. 0± 0. 3ng/組織（g) レベルでヒト HGFタンパクを含有した。 VADを取り除いた後、 HGF群は良好な血行動態を示したのに対し、対照群では悪化が認められた。％左室内径短縮率は、 HGF 群は対照群と比較し有意に高かった（HGF vs. control, 37. 9± 1. 7% vs.

26. 4± 0. 3°ん p< 0. 01)。対照群においては心筋細胞肥大および繊維化を伴う左室拡張が認められたが、 HGF群では認められなかった。 HGF群においては血管密度が著増していた。これらの結果は、心障害に対する VAD使用下にヒト HGFを用いた遺伝子治療は、 "自己心機能回復への橋渡し（Bridge to Recovery) "の可能性を高めるかもしれないことを示唆している。実施例

以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらには限定されない。

(1) 方法 1) ヒト HGF c DNAをコードしたプラスミドの調製

配列番号 1で示されるヒト HGF (hHGF)を、 [15] に記載されているように、 pUC— SRa発現ベクタープラスミドの No t I部位に挿入した。

このプラスミドにおいて、 hHGF c DNAの発現は、シミアンウィルス 40 ポリアデニル化配列で構成される S Rひプロモータの制御下で調節される。

2000 μ gの hHGF— c DNAを含む精製プラスミドを無菌生理食塩水 2. OmL中で再構成し、 2. 5mLシリンジおよび 3◦ゲージ針を用いて、心筋の 10箇所に直接注射した。

心臓内での hHGF濃度は、抗ヒト HGF抗体（免疫学会、東京、日本）を用いた酵素免疫吸着測定法（EL I SA) によって決定した。

hHGFに対する抗体は、 hHGFだけと反応し、ャギ HGFとは反応しない。血清 hHGFレベルについても、 cDNA注射後、 1、 3、 5、 7、 14、 2 8日目に、同じ EL I S A装置を用いて評価した。

(2) 心臓機能障害の動物モデル

この研究のために、 56〜 65 k gの 10匹のャギ成体を用いた。

すべての動物は、国立医学研究協会作成の「実験動物取扱方針（P 1- i n c i p i e s o f La b o r a t o r y An ima l Ca r e) 」および実験動物資源協会によって作成され、国立衛生研究所（N I H出版番号 86〜23、 1985年改訂）によって出版されている「実験動物の取扱および使用の手引き (Gu i d e I o r t h e Ca r e a n d Us e o f L a b o r a t o r y An i ma l s) ] に準拠するように、人道的に取り扱った。

ィソフルランおよび亜酸化窒素による全身麻酔下において、左第 5肋間開胸術を行った。

ポリエチレンカテーテルは、全身血圧（BP) 測定のためには、左頸動脈を介して胸部大動脈に挿入し、静脈内注射のためには左頸静脈に挿入した。

光ファイバ一肺動脈カテーテル（Ox i me t r i x ; Ab b o t t C r i t i c a 1 Ca r e s y s t ems、イリノィ州ノースシカゴ）は、肺動脈内に配置して、混合静脈酸素消費量（S v02) と肺動脈圧 (PAP) を混合させるようにした。

心拍数（HR) は心電図によって連続的にモニタした。

大動脈血流およびバイパス流量を測定するために、電磁流量計（MF— 210 0 ；日本光電、東京、日本）を上行大動脈内に、 L VADを流出力ニューレ内に配置した。

大動脈血流は、原 (native)心拍質量の指標として用い、 VAD補助率は以下のようにして算出した。

VAD補助率（％) =バイパス流量（LZ分） Z [大動脈流量（L/分） +バイパス流量（LZ分） ]

機能障害心臓は、左冠動脈前下行枝（LAD) をその第 1斜行分枝の遠位側に結紮することにより作成した（図 1、 A) 。

結紮後、すべてのャギは心原性ショックを経験し、心室細動や心室頻脈などの重篤な不整脈を発症した。

全身循環を維持し、左室への負荷を除くために、体外において、左心房と下行大動脈の間に LVAD (東洋紡、大阪、日本）を導入した。

血液の排出のためには、複数の側孔を有する 1/2インチの塩化ビニル流入力ニューレを用い、血液の回収のためには 12 mmの織グラフト（Me a d o x、 '米国オークランド）を有する 1Z 2インチの塩化ビニル流出力ニューレを用いた。全身へパリン化後（300 u/k g、静脈内注射）に、流出力ニューレは下行大動脈に縫合し、流入力ニューレは心肺バイパスを有しない左心房内に挿入した (図 1、 B) 。

RVAD (東洋紡、大阪、日本）は、同様の手順により、体外にて、右心房と肺動脈幹の間に導入した（図 1、 B) 。

ャギをランダムに 2つの群に分けた。

HGF群においては、全量 2. Omgの hHGF— c DNAを含む 2. OmL のプラスミド溶液を、 30G針を用いて、左心室壁の虚血領域の 10力所から心筋に注射した（図 1、 A) 。

hHGF— cDNAプラスミドの注射に'伴う血行動態の変化は見られず、このフ実験全体を通してャギ達にアナフィラキシー反応などの明らかな悪影響は観察されなかった。

対照群において、等体積の 3—ガラクトシダ一ゼ 'プラスミドを同様の手順で注射した。

その後、閉胸して麻酔から回復させた。

処理した心筋内の hHGFタンパク質を検出するために、 c DNA注射の 3日後に各群より 2匹のャギを屠殺した。

各群からの別の 3匹において、 B VAD下で 4週間のあいだ、全身循環を引き続き維持した。

外科手術の 2日後に、抗凝固法を行った。

ヮルフアリン 'ナトリウムを、 2. 5〜3. 5の範囲の国際標準比で標的に投与した。

血小板抗凝集剤は一切投与しなかった。

(3) 心機能の評価

心機能の変化について、三次元デジタル音波測微計（s o n omi c r ome t r y) (ソノメトリック社（S o n ome t r i c s C o r p. ) 、オンタリオ、カナダ）を用いて評価した [16] 。

2つの超音波発振子を、手術時に、乳頭筋の高さにおいて短軸に平行な心内膜内に移植した（図 1、 C) 。

これらの発振子を前壁内とその対向部位に配置して、 LAD冠動脈の分布における心筋収縮能を評価した。

心筋拡張期の最後（LVDd) および心筋収縮期の最後（LVD s) における L V寸法を、同時に測定された L V Pによつて判定した。

LV短縮百分率（％FS) は以下のようにして算出した。

%F S (%) = (LVDd— LVD s) /L VD d X 100

LAD冠動脈の結紮の前後、遺伝子トランスフエクシヨンの 1、 2、 3および 4日目に、 B V ADを短期間の間停止した状態で、％ F Sと心拍出量を測定した。

(4) VAD停止試験遺伝子トランスフエクションの 4週間後、すべてのャギを BVADから引き離す試みを行った。

全身へパリン化（300 uZk g、静脈内注射）の後、 BVADを停止しこ。 BVAD停止から 5、 1 5、および 30分後、 HR、 BP、 S v02、 P AP、心拍出量、および L V D dを測定した。

(5) 組織学的分析

プラスミド投与から 4週間後、および VAD停止試験の後、すべてのャギぺントバルビタールナトリゥムの過剰投与により安楽死させ、心臓を摘出した。

心臓を短軸において 5つの小片に裁断し、 L V心筋標本を 10 %緩衝ホルリン中に固定し、パラフィン中に包埋した。

各標本からのいくつかの連続した切片を 5 mの厚みにスライスし、組織的観察および心筋細胞径の測定のためにへマトキシリンおよびェォシンで、あるレヽは AZAN—トリクロムで染色し、コラーゲン含量を評価した。

. 梗塞に隣接する境界領域における線維症が占める面積の割合を、 10のランダムに選択された視野上で測定し、結果を線維症の百分率として表した。

血管壁を、梗塞に隣接する境界領域において計数できるように血管内皮細 J を標識するために、フォンヴィレブランド因子に関連した抗原の免疫組織学的色を、修正プロトコールに従って実施した。

HRPと連結されたフォンヴィレブランド因子に関連した抗原に対する E P O S共役抗体（DAKO EPOS抗ーヒト ZHRP、 DAKO) を、一次抗ィとして使用した。

染色された血管内皮細胞を、 1切片につき少なくとも 10のランダムに選尺された視野を用いて、 200倍の光学顕微鏡下で、血管密度として計数した。

結果は、 1mm²あたりの血管の数として表した。

病理学（細胞径、線維症の百分率、および血管密度）のコンピュータによる鑑定は、米国国立衛生研究所で開発された公開ドメィン画像プログラムを用いてマッキントッシュコンピュータによって実施した。

(6) 統計学的分析すべてのデータは、平均 ±標準偏差として表した。

ANOVAおよび対応のない検定（un p a i r e d S t u d e n t ' s t - t e s t) を用いて群同士の比較を行った。

すべての分析は、プログラム S t a t V i e w (バージョン 5. 0 ； Ab a c u s Co n c e p t s, I n c. 、カリフォルニァ州バークレー）を用いて行つた。

p < 0. 05となる値が統計学的有意性を示すと考えた。

(1) I n v i v o HGF遺伝子トランスフエクシヨン

心臓に hHGF— c DNAプラスミドをトランスフエタトして 3日後、 c DN Aを注射した領域から得た心筋試料内の hHGFタンパク質含量を、 EL I SA アツセィによって測定した。

hHGF- c DNAでトランスフエクトした心筋は、トランスフエクシヨンの 3日目に、組織 1 gあたりに 1 · 0±0· 3 n gという高い濃度 hHGFタンパク質を含んでいた。

対照的に、対象群の動物の心筋においては、 hHGFは検出さ; ^なかった。血清 hHGFレベルは、この実験全体を通して 2群のいずれにおいても検出されなカつた。

(2) 動物状態と全身血液状態データ

梗塞直後、すべてのャギは、重篤な低拍出症候群および心性ショックを発症した。

原（native)心拍出量は、約 20または 3 OmL/k g/分低下した。

B VADの補助下において、すべての動物を良好な状態に維持し、 VAD補助による無負荷状態における HRおよび B Pは、本実験を通じて 2つの群間で違わなかった（表 1) 。

表 1 プレボス卜 3曰 1週 2週 3週 4週心拍数 (回/分)

HGF群 . 98± 2 59+ 1 145±5 146±4 13は 9 121=hl7 118 + 17 対照群 86±10 62±10 140±7 147±4 134±3 113dz28 90±28 平均大動脈圧（mmHg)

HGF群 100±10 59土 8 82±3 82±5 87+ 5 94 =t 5 91±5 対照群 96 ± 6 60±10 80±7 86±9 97±10 93=tl0 96±3

VAD補助率は、本実験を通じて約 70%に維持し、この比は 2つの群の間で顕著には違わなかった（図 2、 A) 。

しかしながら、遺伝子トランスフエクシヨンから 4週間目には、 HGF群における心拍出力が対象群のものよりも著しく高くなっていた（HG F群における 8 5. 0±1. 4mLZk g/分に対し、対照群における 64. 6± 6. OmL/ k g/分、 p< 0. 01 ;図2、 8) 。

(3) 心機能の評価

梗塞後、％F Sは、いずれの群においてもベースラインと比較して著しく減少し、劣化の程度は 2つの群の間で違いはなかった。

%F Sは、遺伝子トランスフエクション後の 2つの群において:^々に回復したしかしながら、 HGF群における％F Sの改善は、対照群よりもはるかに大きかった。

遺伝子トランスフエクション 4日後の HGF群における⁰ /oF Sは、対照群よりもはるかに回復していた。（？^0?群にぉける 37. 9± 1. 7%に対し、対照群における 26. 4±0. 3%、 p < 0. 01 ；図 3)

(4) VAD停止試験

遺伝子トランスフエクシヨンの 4週後、 VAD 「停止試験 j (図 4) を行った < BVADをオフにした後の負荷状態において、対照群において «;、 HRが定常的に増加し、 B Pが定常的に減少したが、 HGF群においては、これらのパラメ一タは安定なままであり劣化することはなかった。

対照群では S V O 2および PAPも、 HGF群のものとくらベて劣化していた _c VADから引き離して 30分後の心拍出量は、対照群に比べて HGF群においてはるかに増加していた（HGF群における 80. 1 ±6. 2m L/k gZ分に対し、対照群における 6 1. 2±4· 3mL/k g/分、 p< 0. 05 ;囱 4) 。また対照群において、 VADから引き離した 3◦分後の LVD dは、 HGF群のものと比べてはるかに増加していた。（110 群にぉける35- 8±1. 6m mに対し、対照群における 46. 9±0. lmm、 p < 0. 05 ；図 4) 。

(5) 組織学的評価

実験終了後の心臓の巨視的な所見では、動脈壁の壊死変化と瘢痕形成はいずれの群においても認められたものの、 LV拡張は、対照群の場合と上匕べて HGF群において顕著に抑制されていることが分かった（図 5、 Aおよび B) 。

梗塞領域に隣接する心筋をァザン染色したところ、 HGF群においては、対照群の場合と比べて、線維変化も抑制されていることが分かった（図 5、 Cおよび D) 。

線維症の百分率は、対照群に比べて、 HGF群において著しく？咸少していた (HGF群における 13. 9±1. 7%に対し、対照群における 22. 3土 1.

3 %、 p < 0. 01 ；図 6、 A；) 。

境界域の HE染色から、対照群においては心筋細胞が肥大変化しているが、 H

GF群においてはこの変化が見られないことが分かった（図 5、 Eおよび F) 。細胞径は、対照群に比べて HGF群の方がはるかに小さい（H GF群における

39. 6±0. 5 μπιに対し、対照群における 54. 4±0· 6 m、 p < 0.

01 ；図 6、 B) 。'

血管密度は、梗塞領域の境界域において調べた（図 5、 Gおよび H) 。

血管密度は、対照群に比べて HGF群においてはるかに高かった（HGF群においては 1視野あたりに血管 35. 2±2. 1本に対し、対照群においては 1四やあたり血管 24. 5±2. 7本、 pく 0. 05 ;図 6、 C) 。

考察

(1) VAD単独による左心室の除負荷作用では、心筋梗塞後の心リモデリングを十分に抑制することができなかった。 (2) HGF— c DN Aプラスミドによる遺伝子トランスフエクシヨンは、 V ADによる機械的除負荷作用下で損傷した心臓における心リモデリングを減衰させるとともに、 VAD単独による場合よりも、著しく良好に心機能を改善したことから、その「自己心機能回復への橋渡し」としての潜在的用途が示唆される。最近になって、遺伝子治療または細胞移植を用いた再生治療のいくつかの研究において、心筋細胞の保護および損傷心臓における心機能の改善への効果を報告している [ 1 7〜20] 。

しかしながら、そのような治療は実施に時間がかかり、処置後直ちに心不全を制御することができない。

VADは全身循環を補助するだけでなく、心室の除負荷作用とともに心筋回復のための最適環境を与える [2〜 5、 21〜23] 。

したがって、我々は、遺伝子治療と VADとを併用した治療を、重篤な心不全の治療のための新しい戦略として提案する。

V A Dは心筋の再生のために十分な時間と適切な状を提供し、再生的治療は損傷心臓における心筋の回復を促進して、「回復への橋渡し」を増大させる。

HGFは強力な脈管形成因子であり、我々は大阪大学医学部付属病院にて閉塞性動脈硬化の患者に対しその臨床応用を開始している [24] 。

さらに、 HGFは脈管形成因子であるだけでなく、抗線維化および心回帰（c a r d i o t r o p h i c) 活性を含む様々な生理学白勺活性を示す [6〜9、 2 5、 26]

したがって、 HGFは、心筋の再生を促進するのに有利であるに違いない。心筋梗塞の慢性期における心機能の低下を伴う心リモデリングの進行は、心筋細胞のアポトーシスだけでなく、間質性線維症にも関与している。

特に、梗塞領域から遠く離れた線維症は、虚血性心筋症における心室再造形の主たる要因であると考えられる。

本研究においては、梗塞周辺領域において、 HGF遺伝子トランスフエクションにより、血管新生が誘引され、線維化が抑制される。

心リモデリングの間に線維化に寄与する分子のいくつかが同定されている [2 7] ₀

トランスフォーミング成長因子 βおよびアンジォテンシン I I力線維症の病理学に重要な役割を果たすと信じられている [28〜30] 。

これらの分子は様々な細胞型において局所的 H G F生産の負の調節剤である [7-9] 。

本研究においては、局所的な HGF発現の増加が、おそらくは以前に報告されているような分子の生産を阻害することにより [6〜； 10] 、心筋の線維化を防止しているのかもしれない。

HGFの送達に関して、本研究においては遺伝子治療用のベクターを使用しな力つた。

これは、我々がすでに報告しているように、 HGF— cDNAプラスミドは、直接投与でも、梗塞心筋における血管形成および心機能を高めるのに十分な H G Fを局所的かつ持続的に壁内に送達できるからである [6〜8、 24、 25] 。天然の H G Fも心臓保護因子として重要な役割を果たしていると考えられる力天然の HG Fは本実験において心リモデリングを減衰するに ί 不十分である。プラスミドの遺伝子トランスフエクシヨンが、天然の H G Fの心臓保護機能も支援するので、連続的に発現されるタンパク質はより少ない量でも、血管形成を誘導し、これに続く局所的心機能の回復を支持するのに十分である [13、 1 4] 。

さらに、 HGFは、パラクリン成長因子として機能し、心筋中への HGF— c DNAプラスミドの投与による HGFの生産は約 14日間持続する。

したがって、ウィルスベクターを用いない HGFの局所合威が副作用に対して安全であり、遺伝子治療中に血清 HGFレベルは検出されなレ、。

したがって、我々の結果は臨床応用を約束するものであろう。

本発明は、 L V AD下での損傷心臓における再生治療の効力を実証した最初の報告であり、本研究のプロトコールは重篤な心不全に対する新しい治療戦略の 1 つとして用いることができる。

しかしながら、臨床に応用する際には、本研究のいくつかの制限を考慮しなければならなレ、。

まず最初に、実験プロトコールの制限から、慢性期における損傷心筋の瘢痕の菲簿化（scar thinning)や拡大に関して、本方法の効力を明確にすることができない。

拡張型心筋症患者においてなど、収縮量の損失が著しく増加する場合には、 H GF遺伝子トランスフエクシヨンをもってしても、心筋の再生が収縮機能を増加させるのには不十分である。

したがって、治療効果を高めるために細胞心筋形成術などの収縮量を補う方法が必要かもしれない.。

第 2に、ャギ HGFを測定するための技術が無いため、本実験における内在性 HGFの変化および役割が明確でない。

第 3に、 HGF効果の長期の成果についても明確でない。

本実験の設定において、冠状動脈結紮後、心室頻拍症や細動などの重篤な不整脈が頻繁に起こった。

したがって、我々は VAD流と全身循環を維持するために、 RVADSを移植した。

結論として、我々は LVAD下において損傷した心臓中に hHGF遺伝子をトランスフエクシヨンすることにより心リモデリングを抑制する潜在的治療価値を実証したのである。

我々の結果は、心原性ショックを引き起こす急性心筋梗塞の設定において、 H GF遺伝子治療と LVADとを併用した治療が、 LVAD下において、重篤な損傷を受けた心臓における「自己心機能回復への橋渡し」の可能性を高め得る。文献

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Claims

請求の範囲

1 . 補助人工心臓 (VAD)併用下に投与される、急性心筋梗塞 (AMI)、特発性心筋症（ICM)、拡張型心筋症 (DCM)または心不全治療のための、血管新生サイト力インをコードする遺伝子からなる医薬。

2 . 血管新生サイトカインが、肝細胞増殖因子 (HGF)、血管内皮増殖因子 (VEGF)、線維芽細胞増殖因子 (FGF)、上皮細胞増殖因子 (EGF；)、神経増殖因子 (NGF)、トランスフォーミング成長因子 (TGF)、血小板由来増殖因子 (PDGF)およびィンスリン様増殖因子（IGF)からなる群より選ばれた一種である、請求項 1記載の医薬。

3 . 血管新生サイト力インが HGFである、請求項 1または 2記載の医薬。

4 . 遺伝子がプラスミドの形にある、請求項 1ないし 3いずれか記載の医薬。

5 . 血管新生サイト力インが心筋に直接投与される、請求項 1ないし 4いずれか記載の医薬。

6 . 血管新生サイト力インが心筋の複数箇所に投与される、請求項 1ないし 5 いずれか記載の医薬。

7 . 心筋が左心室壁の虚血部位である、請求項 1ないし 6いずれか記載の医薬。

8 . VADが、左室補助人工心臓 (LVAD)である、請求項 1ないし 7いずれか記載の医薬。

9 . 請求項 1に記載の医薬を補助人工心臓 (VAD)併用下の患者に投与することにより、急性心筋梗塞 (AMI)、特発性心筋症 (ICM)、拡張型心筋症 (DCM)または心不全を治療する方法。

1 0 . 補助人工心臓 (VAD)併用下の患者の急性心筋梗塞 (AMI)、特発性心筋症 (ICM)、拡張型心筋症 (DCM)または心不全を治療する医薬を製造するための血管新生サイト力インをコードする遺伝子の用途。