WO2006045939A1 - Modulation de la transmission synaptique par les semaphorines et ses applications - Google Patents

Modulation de la transmission synaptique par les semaphorines et ses applications Download PDF

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Geneviève Rougon
Valérie Castellani
Dominique Debanne
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Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Definitions

  • the present invention relates to the use of semaphorins to modulate synaptic transmission and its applications, for the treatment of pathologies related to a disruption of neuronal activity, as well as for the screening of drugs active on these pathologies.
  • the pathologies linked to a disruption of neuronal activity, particularly affecting neurotransmission encompass numerous genetic and acquired diseases characterized by a disruption of the electrical activity of neural networks (decreased activity or hyperactivity) such as for example: epilepsy, autism, anxiety, anxiety, depression and bipolar disorder, stress, hyperactivity, schizophrenia, sleep disorders, mental health disorders, cognitive disorders, Particularly related to age, ataxias, and pathologies affecting neurotransmission, especially genetic diseases affecting a neurotransmitter receptor.
  • Epilepsies are an example of deregulation of cerebral electrical activity leading to neuronal hyperactivity.
  • Anxieties are also characterized by the fact that certain regions of the brain are hyperactive.
  • cognitive disorders, particularly related to age are examples of pathologies characterized by a decrease in the activity of neural networks.
  • anxiolytics such as benzodiazepines can lower the level of neuronal activity by promoting mechanisms of inhibition.
  • GABA the molecular target of this treatment, GABA, is widespread in the nervous system. As a result, this type of treatment induces side effects such as drowsiness and reduced reflexes.
  • the semaphorin family includes signaling proteins intercellular, membrane or secreted, some of which have a function of guiding axons and one of which participates in the signaling of the immune system.
  • Semaphorins are characterized by the presence, at their NH 2 end, of a domain of about 500 amino acids comprising 17 conserved cysteines (domain "semaphorin” or “sema”, for a review on semaphorins see in particular Râper, JA, Curr Opin Neurobiol., 2000, 10, 88-). Semaphorins were divided into 8 classes according to the organization of additional domains; classes 1 and 2 are present in invertebrates, classes 3 to 7 in vertebrates, while the last class (class V) is encoded by viruses.
  • the semaphorins of classes 2, 3 and V are secreted and the others are anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol type bond or a transmembrane domain.
  • the semaphorin domain is a key element of signaling; it has been shown in particular for class III semaphorins that truncated semaphorins comprising only the semaphorin domain are biologically active when they are produced in the form of dimer; the carboxy-terminal domain containing basic amino acids and an immunoglobulin domain facilitates the binding of class 3 semaphorins to their receptor.
  • the semaphorin receptors are multimolecular complexes comprising neuropilins (NP-I or NP-2), plexins and cell adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily (Ll, Râper et al., Cited above, Castellani et al. Neuron, 2000, 27, 237-249); neuropilins alone are capable of binding semaphorins but signal transduction involves the presence of plexin and adhesion molecule of the immunoglobulin superfamily which act as co-receptors.
  • SemaA and SemaE are antagonists of the NP-I receptor and NP-2 receptor agonists (Takahashi et al., Nature Neuroscience, 1998, 1, 487-493).
  • semaphorins of vertebrates, secreted semaphorins (class 3) have been particularly studied. At least six members who play an important role in the development of nerve tissue have been identified (Sema3A to 3F). These molecules represent a major repulsion signal for the guidance of axons, thus preventing axons from innervating inappropriate territories of developing nervous tissue (Râper, supra). Thus, semaphorins bring structural constraints to the budding associated with the physiological cabling of the nervous system (Giger et al., J. Neurosci Res., 1998, 52, 27-).
  • semaphorins may also limit axonal regeneration in adults (Giger et al., Cited above, Pasterkamp et al., Brain, Res Dev, 2001, 35, 36-; Niclou et al., Mol., Neurosci., 2003, 24, 902-).
  • the effect of semaphorins on developing nerve tissue is related to their ability to model the morphology of axonal endings; they cause dynamic rearrangements of the cytoskeleton actin which induce the retraction or extension of the filopod or lamellipod components of the growth cones (Liu and Slingermatter, Curr Opini, Cell BioL 2001, 13, 619-).
  • a soluble form of the L1 receptor or an L1 mimicking peptide are capable of inhibiting the Sema3A-induced repulsion signal and are therefore useful as a medicament for promoting neuronal regeneration.
  • axonal and treating neurodegenerative diseases International Application WO 03/089470.
  • the subject of the present invention is the use of a molecule selected from the group consisting of a semaphorin and a semaphorin modulator, for the preparation of a medicament intended for the treatment of pathologies related to a disorder of activity. neuronal. Definitions
  • Semaphorin means a protein of the semaphorin family as defined above, a functional derivative, in particular a functional variant of said semaphorin, or a polynucleotide (DNA or RNA) encoding said semaphorin or said derivative, preferably included in an active expression vector in mammalian cells.
  • - Modulator means an activator or an inhibitor.
  • a semaphorin modulator is a modulator of the expression and / or function of a semaphorin.
  • the function of a semaphorin is understood to mean the modulatory function (activating or inhibiting) of the synaptic transmission of said semaphorin; this function results from the binding of said semaphorin to a synaptic receptor and the transduction of a signal mediated by said receptor.
  • Semaphorin receptor is understood to mean both a receptor and a co-receptor of said semaphorin, namely: any molecule of the plasma membrane of a mammalian cell which is: (i) expressed in the synaptic region of neurons, (ii) capable of binding a semaphorin and transducing the signal resulting from this binding (receptor in the strict sense) or of transducing the signal resulting from this binding (co-receptor), and of inducing a modulation of the synaptic transmission, the made of this connection.
  • the effect of said semaphorin or semaphorin modulator on synaptic transmission can be measured by conventional electrophysiology techniques known to those skilled in the art, for example: patch-clamp, extracellular recording or use of potential sensitive probes.
  • - Pathology related to a disruption of neuronal activity, particularly affecting neurotransmission, any genetic or acquired disease characterized by a disruption of the electrical activity of neural networks (loss of activity or hyperactivity) such as for example one of the aforementioned pathologies.
  • the invention encompasses the use of semaphorins of any species (vertebrate or invertebrate).
  • the semaphorin sequences of certain species are available in the sequence databases, notably in GENBANK and in the NCBI database.
  • the semaphorin sequences of other species can be determined by cloning the corresponding cDNA, using primers chosen from known sequences, according to standard molecular biology techniques, known to those skilled in the art.
  • the invention also encompasses the use of semaphorin derivatives (modified semaphorins), especially semaphorin variants corresponding to a functional protein as defined above.
  • modifications which are introduced into said protein by the standard techniques known to those skilled in the art include in a nonlimiting manner: mutation (insertion, deletion, substitution) of at least one amino acid in the sequence of said semaphorin (obtaining semaphorin variants), addition of a fusion sequence (obtaining a fusion protein or chimeric protein), substitution of amino acid residues by non-natural amino acid residues (D-amino acids or the like) amino acids), modification of the peptide bond, cyclization, addition of chemical groups at the side chains of the amino acids, coupling to a molecule of interest, in particular a molecule allowing the passage of the hemato-meningeal barrier; said coupling is carried out via a non-covalent or covalent bond such as a peptide bond (obtaining a chimeric semaphorin).
  • semaphorin when said semaphorin corresponds to a membrane protein, it may advantageously be truncated, in particular by deletion of the transmembrane domain, so as to obtain a secreted protein.
  • modifications are intended in particular to modulate (increase or decrease) the affinity or specificity of semaphorins for one of their receptors, to increase the stability, penetration and diffusion in the nervous tissue, or to facilitate the purification of said proteins.
  • Vectors in which a sequence of interest can be inserted into an expression cassette containing the appropriate transcriptional and translational regulatory elements are known to those skilled in the art; the choice of an appropriate vector depends on the use envisaged for this vector (for example replication of the sequence of interest, expression of this sequence, maintenance of the sequence in extrachromosomal form or integration into the chromosomal material of the host ).
  • naked nucleic acids DNA, RNA, linear or circular
  • viral vectors such as adenoviruses, in particular canine adenoviruses, retroviruses, lentiviruses, herpesviruses, AAVs (Adeno -Associated- Virus), poxviruses, and in particular canarypox, rhabdovirus and Venezuelan encephalitis virus.
  • vectors possessing a natural tropism for nervous tissue (herpesvirus, rhabdovirus, Venezuelan encephalitis virus) or induced by the formation of viral pseudo-particles comprising an envelope protein of a neurotropic virus such as in particular are used.
  • rabies virus glycoprotein pseudotyped lentivirus, for example).
  • said semaphorin is secreted; preferably it is a class 3 semaphorin, such as for example Sema3A.
  • Semaphorin modulators include substances that modulate the response of semaphorins in axon guidance, as well as semaphorin receptor agonists and antagonists.
  • said modulator is selected from the group consisting of cyclic nucleotides and nitric oxide.
  • said modulator is an agonist or antagonist of a semaphorin receptor, which receptor is selected from the group consisting of: neuropilins, plexins and adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily (IgCAM).
  • a semaphorin receptor which receptor is selected from the group consisting of: neuropilins, plexins and adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily (IgCAM).
  • said modulator is an agonist or antagonist of a semaphorin receptor, which receptor is expressed in the synaptic region of the neurons.
  • said receptor is neuropilin NP-1.
  • a semaphorin receptor agonist is defined in the present invention by any molecule capable of mimicking the effect of said semaphorin on a synaptic receptor, i.e., a molecule capable of mimicking the binding of semaphorin to said synaptic receptor and / or to induce transduction of the signal mediated by said receptor or one of its co-receptors.
  • a semaphorin receptor antagonist is defined in the present invention as any molecule capable of inhibiting / blocking the effect of said semaphorin on a synaptic receptor, i.e., a molecule capable of inhibiting the binding of the semaphorin to said synaptic receptor and / or to inhibit signal transduction mediated by said receptor or one of its co-receptors; furthermore, the inhibition of this binding may be competitive (receptor binding antagonist) or non-competitive (semaphorin binding antagonist).
  • This definition includes semaphorins insofar as the different semaphorins act as agonists or antagonists, vis-à-vis the NP-I and NP-2 receptors; for example, SemaA and SemaE are antagonists of the NP-I receptor and NP-2 receptor agonists (Takahashi et al., Nature Neuroscience, 1998, 1, 487-493).
  • Molecules capable of mimicking the binding of a semaphorin to a synaptic receptor include semaphorin fragments including the binding site to said receptor or other molecules, in particular peptides mimicking the receptor binding site of said semaphorin (mimotope of semaphorin).
  • Molecules capable of inhibiting the binding of a semaphorin to a synaptic receptor include fragments of said semaphorin including the receptor binding site or receptor fragments including the binding site. said semaphorin, or other molecules, especially mimicking peptides, either the receptor binding site of said semaphorin (mimotope of semaphorin), or the semaphorin binding site of said receptor (receptor mimotope).
  • mimotopes may in particular be isolated, by screening a library of molecules, by an antibody binding test directed against said semaphorin binding site (semaphorin mimotope) or the semaphorin receptor (receptor mimotope). ).
  • semaphorin mimotope semaphorin binding site
  • receptor mimotope semaphorin receptor
  • other agonists or semaphorin receptor antagonists may also be identified by a functional test for measuring synaptic transmission, using a method known to those skilled in the art, as specified above. .
  • said molecule is associated with at least one substance allowing the crossing of the hemato-meningeal barrier.
  • these substances mention may in particular be made of membrane peptides, such as peptides Pep: Trans TM (http://www.svntem.com/english/techpeptrans.html ' ).
  • said pathology is characterized by a disturbance of the electrical activity of the neural networks (decreased activity or hyperactivity) and is selected from the group consisting of: epilepsy, autism , anxiety, anxiety, depression and bipolar disorder, stress, hyperactivity, schizophrenia, sleep disorders, mental health disorders, cognitive disorders, particularly related to age, ataxias, and pathologies affecting neurotransmission, particularly genetic diseases affecting a neurotransmitter receptor.
  • said molecule is in the form of a composition
  • a pharmaceutically acceptable vehicle and / or a carrier substance.
  • the pharmaceutically acceptable vehicles, the carrier substances and the adjuvants are those conventionally used.
  • the carrier substances are advantageously selected from the group consisting of: unilamellar or multilamellar liposomes, ISCOMS, virosomes, viral pseudoparticles, saponin micelles, solid microspheres of saccharide nature (poly (lactide-co-glycolide)) or gold, and nanoparticles.
  • Said composition is in a galenic form suitable for parenteral (subcutaneous, intramuscular, intravenous, intraperitoneal, intraspinal), enteral (oral, sublingual), or local (intracerebral: intrathecal or intraventricular) administration. ) or by any other means, and possibly by multiple channels.
  • It may be administered once or several times or in continuous release (infusion), in particular by means of osmotic micropumps or associated with any physical or chemical means, in particular with encapsulating agents such as colloidal dispersion systems and polymers, in order to have a therapeutically effective dose at the site of action (nerve tissue).
  • said molecule can be in the form of tablets, single or coated tablets, capsules, granules, syrup, suppositories, injectables, ointments, creams, gels, aerosol, which are prepared according to the usual methods .
  • said molecule is incorporated in excipients usually employed in pharmaceutical compositions, such as talc, gum arabic, lactose, starch, magnesium stearate, cocoa butter, aqueous or non aqueous vehicles. fatty substances of animal or vegetable origin, paraffinic derivatives, glycols, various wetting agents, dispersants or emulsifiers, preservatives.
  • the said molecule is intended to be introduced in vivo into the target cells (neurons), either by passive diffusion, or by using physical methods such as microinjection, or by associating it with any substance (s) allowing the passage of the blood-brain barrier.
  • It can especially be administered directly at its site of action (brain, spinal cord). Alternatively, it can be administered parenterally, after having been previously integrated into a liposome or a nanoparticle which advantageously contains a peptide allowing the crossing. of the blood-brain barrier.
  • the dosage varies depending on the condition to be treated, the route and rate of administration, and the nature and weight of the species to be treated (human or animal).
  • the present invention also relates to a method for screening molecules capable of modulating synaptic transmission, characterized in that it comprises at least the following steps: a) contacting a bank of molecules to be tested with at least a semaphorin receptor, and b) the selection of molecules capable of modulating synaptic transmission.
  • said receptor is selected from the group consisting of neuropilins, plexins and adhesion molecules of the immunoglobulin superfamily (IgCAM). According to another advantageous embodiment of said method, said receptor is expressed in the synaptic region of the neurons.
  • said receptor is neuropiline NP-I.
  • said method comprises, a step of pre-selection of molecules capable of binding to said receptor (s), prior to step b) of selection .
  • step b) is performed in competition with a secreted semaphorin, preferably of class 3, preferably of type 3A (Séma3A).
  • the bank of molecules is a set of molecules related by their structure, origin or function, including a combinatorial library including molecules that differ from each other by the systematic or random replacement of their elementary constituents. It is for example a library of oligomers such as peptides, oligonucleotides (aptamers) and oligosaccharides, an antibody or antibody fragment library, or a library of organic molecules.
  • cyclic or non-cyclic especially small organic molecules, that is to say mass molecular weight less than 2500 Da, preferably less than 2000 Da, preferably less than 1500 Da, more preferably less than 1000 Da, even more preferably less than 750 Da.
  • the screening of the molecule bank and the identification of the molecules capable of binding to the target are carried out by any method known to those skilled in the art for measuring the interaction between two partners ( ELISA, resonance energy transfer (FRET), fluorescence polarization, surface plasmon resonance).
  • the screening is carried out using a target or a target derivative such as a fragment comprising at least the site of interest, a mimotope or an anti-idiotypic antibody representing the internal image. said target site of interest.
  • Said target and its derivatives or the antibody or the antibody fragment are optionally immobilized on a suitable support and / or labeled by any means making it possible to obtain a measurable signal, known to a person skilled in the art .
  • the specificity of the binding can be demonstrated by a competitive binding assay with a labeled ligand (semaphorin / receptor).
  • the identification of molecules capable of modulating synaptic transmission is performed by a functional test, using a method known to those skilled in the art, as specified above; this involves, in particular an in vitro or ex vivo test, in a suitable cellular system (cell line or nerve tissue sample cultured (slice culture or organotypic culture), or in vivo, in a suitable organism
  • a suitable cellular system cell line or nerve tissue sample cultured (slice culture or organotypic culture), or in vivo, in a suitable organism
  • the cells in culture can be immortalized or in primary culture, adherent or in suspension
  • the living organism can be any organism of laboratory or study (rodents, pigs, cattle, sheep ...) transgenic or not -transgénique.
  • polynucleotides as defined in the invention are obtained by conventional methods, known per se, following the standard protocols such as those described in Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and his Inc, Library of Congress, USA). For example, they can be obtained by amplification of a nucleic sequence by PCR or RT-PCR, by screening genomic DNA libraries by hybridization with a homologous probe, or by total or partial chemical synthesis.
  • Recombinant vectors are constructed and introduced into host cells by conventional methods of recombinant DNA and genetic engineering, which are known per se.
  • proteins and derivatives are produced from the corresponding cDNAs, obtained by any means known to those skilled in the art; the cDNA is cloned into a eukaryotic or prokaryotic expression vector and the protein or fragment produced in the cells modified with the recombinant vector are purified by any appropriate means, in particular by affinity chromatography.
  • the peptides can be synthesized in solid phase, according to the Fmoc technique, originally described by Merrifield et al. (J. Am Chem Soc., 1964, 85: 2149-) and purified by reverse phase high performance liquid chromatography.
  • FIG. 1 illustrates the decrease in the transmission of synaptic excitation, induced by Séma3A.
  • A Kinetics of post-synaptic excitation potential (EPSP) slope variation after application of Sema3A in the artificial cerebrospinal fluid bath.
  • the upper graph represents the superposition of two post-synaptic excitation potential curves corresponding to the hippocampal slices incubated in the presence of control supernatant (thin line, empty star), or 15 minutes after incubation in the presence of supernatant containing Sema3A (trait thick, full star).
  • C Repeated stimulation (upper panel) or prolonged (lower panel) by Sema3A, induces a decrease in repeated synaptic transmission (upper panel) or prolonged (lower panel).
  • FIG. 3 illustrates the expression of NP-I in the hippocampus of the adult and its pre-synaptic localization.
  • Aa In situ hybridization showing that the NP-I transcript is detected in the dentate gyrus, and the CA1 and CA3 regions.
  • FIG. 4 illustrates the expression of NP-I in cultures of differentiated neurons of the hippocampus.
  • a to C Co-labeling of NP-I with NeuN (A), parvalbumin (B) and quantification of doubly labeled neurons (C) showing that a high proportion of neurons including parvalbumin-positive neurons, express NP- I.
  • DE Double labeling of NP-I with the somatodendritic marker MAP2 (D) and the axonal marker Tau (E), illustrating the distribution of NP-I in both types of neuritic compartments.
  • the arrow in (D) illustrates a MAP2- / NP1 + neurite, in (E) a Tau- / NP-1 + neurite.
  • F NP-I is expressed in some but not all extensions of primary neurites. Scale bar (AF) 10 ⁇ m.
  • FIG. 5 illustrates the presence of NP-I at the synapses of neurons of the hippocampus in culture.
  • A-B Co-labeling of NP-I with synaptic markers in in vitro differentiated hippocampal neuron (DIV) cultures.
  • the labeling of synaptophysin (A) and the marker of the PSD-95 family (B) shows that synaptogenesis occurs in NP-I-expressing neurites and that NP-I is localized at synapses.
  • the arrow in B shows the affixation of the fluorescences of the marker of the PSD-95 family and NP-I. Scale bar: 10 ⁇ m.
  • FIG. 6 illustrates the induction of Erk phosphorylation, by
  • Sema3A in the differentiated neurons of the hippocampus.
  • A-B Immunolabeling of pERk1 / 2 showing an increase in pErk fluorescence in the cell body and neurites of Sema3A-treated neuronal cultures, compared with control (A) and quantitative labeling analysis (B). * p> 0.01 (Student's test). Scale bars: 10 ⁇ m.
  • FIG. 7 illustrates the effect of treatment with Sema3A on the synaptic synapticin marker labeling.
  • A Neurofilament microphotogaphy and synaptophysin labeling in DIV1 5 hippocampal neurons treated with Sema3A or untreated, illustrating the decrease in Sema3A-induced synaptophysin fluorescence. The total fluorescence and the average area of each dot are reduced, as determined by quantitative fluorescence analysis (B). * p> 0.01 (Student's test). Scale bars: 5 ⁇ m.
  • FIG. 8 represents a model of the mechanism of reduction of synaptic transmission induced by Sema3A.
  • A Séma3A acts on the developing axons and induces a retraction of the filopodia and lamellipods forming the growth cone. This retraction, which is initiated by the binding of Sema3A with NP-1, leads to a collapse of the growth cone.
  • B In the CAl region of the hippocampus, in adults, the Sema3A NP-I receptor is expressed at the level of the pre-synaptic membrane.
  • Sema3A which could be secreted by entorhinal afferents, binds to the NP-I protein of the molecular complex forming the receptor and activates the receptor. This activation induces a morphological retraction response of the synapse, similar to that of the retraction of the growth cone occurring during axonal guidance. This collapse decreases synaptic transmission by increasing the size of the intersynaptic space.
  • Hippocampal sections 400 ⁇ m were prepared from mice six to eight weeks old. The sections were made in a solution (280 mM sucrose, 26 mM NaHCO 3 , 10 mM D-glucose, 1.3 mM KCl, 1 mM CaCl 2 , 10 mM MgCl 2 ) and held for one hour at room temperature in a liquid. Artificial cephalo-rachidian (ACSF) oxygenated (95% O 2 /5% CO 2 , ACSF: 125 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 0.8 mM NaH 2 PO 4 , 26 mM NaHCO 3 , 3 mM CaCl 2 , X mM D-glucose).
  • ASF Artificial cephalo-rachidian
  • Each cup was transferred to a recording chamber containing oxygenated artificial cerebrospinal fluid as above and maintained at 34 ° C.
  • the neurons were visualized by infrared video microscopy (DIC for Differential Interference Contrast). All experiments were performed in the presence of picrotoxin (100 ⁇ M SIGMA), a type A GABA receptor antagonist.
  • the CA1 region was separated from the CA3 region by knife section of the hippocampal section before measurement, so as to avoid epileptiform activity.
  • the post-synaptic excitation (EPSP) potentials of the extracellular fields were recorded in the stratum radiatum, using glass measuring microelectrodes filled with 3M NaCl.
  • the glass stimulation electrodes filled with extracellular saline buffer, were placed in the stratum radiatum.
  • the stimuli (0.1 to 0.15 mS duration) of 0.1 to 3mA were delivered at a frequency of 0.3 Hz for measurements of basal synaptic transmission. All drugs were applied in the artificial cerebrospinal fluid bath.
  • the analog signals were filtered at 3 kHz and the acquisition of the 400 ms sequences was performed at a rate of 12 kHz using the software (ACQUISI TM, BIO-LOGIC). The results expressed by the mean + standard deviation were analyzed using the Mann-Whitney test.
  • COS7 cells were transiently transfected with a recombinant expression vector of Sema3A fused to a myc tag, using lifofectamine TM, as described in Castellani et al., Neuron, 2000, 27, 237-. Three days later, the cell supernatant was harvested and dialyzed for 3 days against artificial cerebrospinal fluid. The LlFc-containing supernatant was similarly obtained from stably transfected LlFc secreting cells (Castellani et al., Supra). The control supernatant consists of supernatant of non-transfected cells, dialyzed with artificial cerebrospinal fluid. 2) Results
  • the decrease in synaptic transmission is closely related to the presence of Sema3A in the brain.
  • the repetitive or prolonged application of Sema3A induces a decrease in repetitive or prolonged synaptic transmission (FIG. 1C).
  • Example 1 Materials and Methods The supernatants of the transfected or non-transfected cells of Example 1 were used to locate the Semaphorin 3A binding sites of the adult hippocampus by immunostaining. More precisely, sagittal sections of mouse brain (30 ⁇ m) were prepared using a vibratome. The Sema3A-myc molecules were pre-aggregated with anti-c myc immunoglobulins (50 ⁇ g / ml, 9E10 hybridoma, SIGMA) for 1 hour and then incubated for 1 hour with slices in suspension. Immunodetection was performed using a secondary antibody labeled with Texas red. After washing with PBS, the sections were counter-stained with bisbenzimide (1: 10,000) for 5 minutes and then mounted prior to observation. 2) Results
  • Semaphorin 3A binding sites of the adult hippocampus was analyzed by incubation of sagittal brain sections with a recombinant Sema3A protein labeled with a myc epitope. Sema3A molecules were pre-aggregated with anti-myc antibodies prior to incubation with brain sections. Under these conditions, the binding of Sema3A is visualized by a labeling in the CAl and C A3 regions of the hippocampus, as well as in the stratum granulosum and the dentate gyrus. In the CAl region, the marking is distributed in the layer of pyramidal cells and in the apical region of the dendrites, where collaterals of Schaffer end ( Figure 2).
  • Sema3A binding sites exist at a convenient time and location to mediate changes in synaptic transmission that are induced by the application of Sema3A.
  • RNA probe complementary to the NP-1 transcript was labeled at one of its ends, using the in vitro transcription system for RNA probe (Riboprobe In vitro Transcription Systems; PROMEGA) and the mixture for labeling of RNA with Digoxygenin (DIG-RNA Labeling Mix, ROCHE). The photos were taken with a camera (DX 30 CCD, KAPPA), using the software provided by the manufacturer (KAPPA). K) Immunohistochemistry The fixed tissues were cut (30 ⁇ m thick) using a vibratome. The sections were incubated in 0.1 M PBS, pH 7.4, supplemented with 20% fetal calf serum, and incubated overnight with the primary antibody: polyclonal anti-NP rabbit antibody.
  • mouse monoclonal anti-synaptophysin antibody (1: 100, ROCHE); mouse anti-L1 (1: 100; R & D SYSTEMS) mouse monoclonal antibody (IgG), anti-PSD-95 mouse monoclonal antibody (IgG) (1: 100, ABR).
  • mouse monoclonal anti-synaptophysin antibody (1: 100, ROCHE); mouse anti-L1 (1: 100; R & D SYSTEMS) mouse monoclonal antibody (IgG), anti-PSD-95 mouse monoclonal antibody (IgG) (1: 100, ABR).
  • NP-I fluorescein-coupled rabbit anti-rabies immunoglobulin goat antibody
  • NP-I Texas red-coupled mouse anti-mouse IgG donkey antibody
  • anti-rat IgG coupled to Texas Red (Ll) diluted 1: 400 (JACKSON IMMUNORESEARCH).
  • the confocal images were obtained using a microscope (Axiovert 135M, ZEISS) equipped with an immersion objective (63x) and a confocal imaging system with laser recording (LSM 410, ZEISS).
  • a microscope Alignishaw 135M, ZEISS
  • 63x immersion objective
  • LSM 410 confocal imaging system with laser recording
  • Postsynaptic density (Post-Synaptic Density PSD) fractions from the mouse hippocampus were prepared as described in Cho et al., Neuron, 1992, 9, 929. Briefly, mouse hippocampal extracts were centrifuged to remove nuclei and tissue debris, the supernatant was then centrifuged at 10,000 g, to obtain a crude pellet of membranes (P2). A synaptosome enriched fraction was prepared by batchwise sucrose gradient centrifugation of resuspended pellet P2. To extract the PSDI fraction, the synaptosomes were diluted in 0.5% Triton X-100.
  • PSD II and III fractions were resuspended and centrifuged in Triton X-100 (0.5%) or Sarcosyl (6%), respectively.
  • the samples were mixed in SDS-containing migration buffer and equal amounts of proteins were separated by SDS-containing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and then transferred to a polyacrylamide gel (SDS-PAGE). nitrocellulose membrane. Immunoreactivity was revealed with a chemiluminescent system.
  • mice monoclonal antibody (IgG) anti-GluR2 (1: 100, CHEMICON INC.
  • Mouse monoclonal antibody (IgG) anti-synaptophysin (1: 1000, ROCHE PRODUCTS)
  • mouse monoclonal antibody (IgG) anti-PSD95 (1: 1000, AFFINITY BIO REAGENTS)
  • anti-NP-1 rabbit polyclonal antibody (1: 1000).
  • the cellular localization of the Sema3A binding sites was analyzed by focusing on NP-I.
  • NP-I The cellular localization of the Sema3A binding sites was analyzed by focusing on NP-I.
  • the expression of NP-I and Séma3A in the adult mouse hippocampus was studied by in situ hybridization.
  • the NP-I transcript is detected in the CAl and CA3 regions and in the dentate gyrus of the adult brain ( Figure 3).
  • the Sema3A transcript is abundantly produced in the dentate gyrus but is absent in the CAl and C A3 regions.
  • the immunocytochemical detection of NP-I reveals an expression pattern resembling that of semaphorin 3A binding sites, such as the pyramidal stratum and the stratum radiatum of the CA1 region.
  • NP-I protein was analyzed at the same time as that of the synaptic synaptophysin marker in an immunofluorescence double-labeling experiment. Confocal analyzes show that the expression of NP-I is in dot form and co-localizes with the labeling of synaptophysin in the CAl region. These observations indicate that NP-I is a component of synapses in the hippocampus ( Figure 3). The subcellular localization of NP-I in synaptic compartments was examined in more detail by double labeling of NP-I and post-synaptic marker PSD-95.
  • Example 4 Expression and localization of neuropilin 1 (NP-I) during the differentiation of hippocampal neurons. 1) Materials and methods
  • the neurons were then fixed with a solution of paraformaldehyde (4% PFA).
  • the fixation with PFA was preceded by a treatment lasting 20 minutes with supernatant containing Sema3A (InM), prepared as described in Example 1.
  • the detection of the various markers was carried out by immunocytochemistry with the following specific antibodies: anti-MAP2 (CHEMICON, 1/200), anti-NeuN (CHEMICON, 1/200), anti-synaptophysin (SIGMA, 1/100), anti-family PSD (clone K28 / 86.2, 1/150), anti parvalbumin (SIGMA, 1/400), anti-NF200Kd (SIGMA, 1/400), anti-Tau (SIGMA, 1/100).
  • anti-MAP2 CHEMICON, 1/200
  • anti-NeuN CHEMICON, 1/200
  • anti-synaptophysin SIGMA, 1/100
  • anti-family PSD clone K28 / 86.2, 1/150
  • Two anti-NP1 antibodies were used: a polyclonal rabbit antibody ( ⁇ 36, 1/1000) and a goat monoclonal antibody (RaD, 1/100). The specificity of the labeling was checked for each antibody, by incubation in the presence of the secondary antibody but in the absence of the primary antibody.
  • the cells were permeabilized with Triton X-100 (0.3%) for 15 minutes.
  • the cells were prepared for immunocytochemical detection of synaptophysin and visualized under a microscope (Axiovert 200M, ZEISS). The images were recorded under identical exposure conditions and exported to Adobe Photoshop® (Adobe Systems Inc.) and NIH image software. For the analysis of the surface and length of the synaptophysin points, the images were processed at a threshold of 48. 2) Results
  • NPL is expressed in hippocampal neurons, from the early stages to the stages highly differentiated, as shown by immunostaining of PN-I protein to the 21 th day of differentiation in vitro (DIV 21, 4A, 4E ).
  • the double labeling of NP-I and the pan-neuronal nuclear marker NeuN indicates that 83% of the neurons of the hippocampus express NP-I.
  • 80% of neurons expressing parvalbumin also express NP-I at a high level ( Figure 4A, 4C).
  • the labeling of NP-I has also been detected in neurons not expressing parvalbumin, indicating that the expression of NP-I is not restricted to this interneuron population.
  • the NP-I protein is distributed both along the axons and dendrites, as visualized by co-labeling with the axonal and somatodendritic markers Tau and MAP2 ( Figures 4D, 4E).
  • NP-I is directed towards the majority but not all of the neuritic compartments of the hippocampal neurons.
  • NP-I is often absent in complex extensions of dendritic trees or axons.
  • NP-I is also present in many but not all synapses visualized with a marker of the PSD-95 family. Apposition zones are observed between the fluorescence of NP-I and PSD-95 (FIG. 5B). These results indicate that NP-I is present at synapses formed by differentiated neurons in culture.
  • Example 5 Sema3A induces the activation of MAPK Erk in differentiated neurons of the hippocampus 1) Materials and methods
  • Immunocytochemical detection of the markers is performed as described in Example 4.
  • the pErk is detected using a specific antibody (anti-phospho Erk 1 A, Santacruz, 1/100).
  • a field was randomly selected in the control (untreated neurons) and a threshold was set to extinguish the fluorescence of the cell bodies or neurites. Cell bodies and neurons with neurites that remain fluorescent in control, were then counted in randomly selected fields. Quantification of the fluorescence of the cells treated with Sema3A was quantified under similar conditions, after application of the threshold. 2) Results
  • the response of adult neurons to Sema3A was investigated by analyzing the effect of Sema3A on the activation of MAPK Erk in differentiated neurons.
  • treatment with Sema3A induces phosphorylation of Erk1 / 2; labeling is not limited to cell bodies but is also detected in neuritic compartments ( Figure 6A).
  • the quantitative fluorescence analysis indicates that the treatment with Sema3A induces a 2.7-fold increase in the pErk positive neuron population compared to the control (FIG. 6B, 141 neurons of two independent cultures per condition). p ⁇ 0.005).

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Abstract

La présente invention est relative à l'utilisation des sémaphorines pour moduler la transmission synaptique et à ses applications, pour le traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale, et pour le criblage de médicaments actifs sur ces pathologies.

Description

MODULATION DE LA TRANSMISSION SYNAPTIQUE PAR LES SEMAPHORINES ET SES APPLICATIONS
La présente Invention est relative à l'utilisation des sémaphorines pour moduler la transmission synaptique et à ses applications, pour le traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale, ainsi que pour le criblage de médicaments actifs sur ces pathologies.
Les pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale, affectant notamment la neurotransmission, englobent de nombreuses maladies génétiques et acquises caractérisées par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones (baisse d'activité ou hyperactivité) telles que par exemple : l'épilepsie, l'autisme, l'anxiété, l'angoisse, la dépression et les troubles bipolaires, le stress, l'hyperactivité, la schizophrénie, les troubles du sommeil, les troubles de la santé mentale, les troubles cognitifs, en particulier liés à l'âge, les ataxies, et les pathologies affectant la neurotransmission, en particulier les maladies génétiques affectant un récepteur de neurotransmetteur. Les épilepsies sont un exemple de dérégulation de l'activité électrique cérébrale conduisant à une hyperactivité neuronale. Les anxiétés se caractérisent également par le fait que certaines régions du cerveau sont hyperactives. A l'opposé, les troubles cognitifs, notamment liés à l'âge, sont des exemples de pathologies caractérisées par une diminution de l'activité des réseaux neuronaux.
Les traitements de ces pathologies, lorsqu'ils existent posent des problèmes liés notamment à des effets secondaires indésirables des molécules utilisées. Par exemple, les anxiolytiques comme les benzodiazépines permettent d'abaisser le niveau d'activité neuronale en favorisant les mécanismes d'inhibition. Toutefois, la cible moléculaire de ce traitement, le GABA, est très répandue dans le système nerveux. En conséquence, ce type de traitement induit des effets secondaires comme la somnolence et la réduction des réflexes.
Une meilleure compréhension du fonctionnement des réseaux neuronaux et notamment des molécules impliquées dans la régulation de l'activité de ces réseaux, permettrait de mettre au point des médicaments mieux adaptés au traitement des pathologies liées à leur dysfonctionnement.
La famille des sémaphorines regroupe des protéines de signalisation intercellulaire, membranaires ou sécrétées, dont certaines ont une fonction de guidage des axones et l'une d'entre elle participe à la signalisation du système immunitaire.
Les sémaphorines sont caractérisées par la présence, à leur extrémité NH2, d'un domaine d'environ 500 acides aminés comprenant 17 cystéines conservées (domaine « sémaphorine » ou « sema » ; pour une revue sur les sémaphorines voir notamment Râper, J. A., Curr. Opin Neurobiol., 2000, 10, 88-). Les sémaphorines ont été divisées en 8 classes en fonction de l'organisation de domaines additionnels ; les classes 1 et 2 sont présentes chez les invertébrés, les classes 3 à 7 chez les vertébrés, alors que la dernière classe (classe V) est codée par des virus. Les sémaphorines de classes 2, 3 et V sont sécrétées et les autres sont ancrées à la membrane cellulaire par une liaison de type phosphatidylinositol ou un domaine transmembranaire. Le domaine sémaphorine est un élément clé de la signalisation ; il a notamment été montré pour les sémaphorines de classe 3, que des sémaphorines tronquées comprenant uniquement le domaine sémaphorine sont biologiquement actives lorsqu'elles sont produites sous la forme de dimère ; le domaine carboxy-terminal contenant des acides aminés basiques et un domaine immunoglobuline facilite la liaison des sémaphorines de classe 3 à leur récepteur.
Les récepteurs des sémaphorines sont des complexes multimoléculaires comprenant des neuropilines (NP-I ou NP -2), des plexines et des molécules d'adhésion cellulaire de la superfamille des immunoglobulines (Ll ; Râper et al., précité ; Castellani et al., Neuron, 2000, 27, 237-249) ; les neuropilines à elles seules sont capables de lier les sémaphorines mais la transduction du signal implique la présence de plexine et de molécule d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines qui jouent le rôle de co-récepteurs. En outre, il a été montré que les différentes sémaphorines jouent le rôle d'agonistes ou d'antagonistes vis-à-vis des récepteurs NP-I et NP -2 ; par exemple SémaA et SémaE sont des antagonistes du récepteur NP-I et des agonistes du récepteur NP-2 (Takahashi et al, Nature Neuroscience, 1998, 1, 487-493).
Parmi les sémaphorines de vertébrés, les sémaphorines sécrétées (classe 3) ont été particulièrement étudiées. Au moins six membres qui jouent un rôle important dans le développement du tissu nerveux, ont été identifiés (Séma3A à 3F). Ces molécules représentent un signal majeur de répulsion pour le guidage des axones, empêchant ainsi les axones d'innerver des territoires inappropriés du tissu nerveux en développement (Râper, précité). Ainsi, les sémaphorines apportent des contraintes structurales au bourgeonnement associé au câblage physiologique du système nerveux (Giger et al., J. Neurosci. Res., 1998, 52, 27-). La régulation positive de leur expression après une lésion suggère que les sémaphorines pourraient également limiter la régénération axonale chez l'adulte (Giger et al., précité ; Pasterkamp et al., Brain. Res. Dev., 2001, 35, 36- ; Niclou et al., Mol. CeIl. Neurosci., 2003, 24, 902-). L'effet des sémaphorines sur le tissu nerveux en développement est lié à leur capacité à modeler la morphologie des terminaisons axonales ; elles provoquent des réarrangements dynamiques de l'actine du cytosquelette qui induisent la rétraction ou l'extension des composants filopodes ou lamellipodes des cônes de croissance (Liu et Strittmatter, Curr. Opini., CeIl. BioL, 2001, 13, 619-).
Il a notamment été montré qu'une forme soluble du récepteur Ll ou un peptide mimant Ll (ASNKL, FASNKL, FASNKLGTAM) sont capables d'inhiber le signal de répulsion induit par Séma3 A et sont donc utiles comme médicament pour favoriser la régénération neuronale/axonale et traiter les maladies neurodégénératives (Demande Internationale WO 03/089470).
En outre, le brevet US 5 639 856 et les Demandes US 2003/0032070 et US 2004/0121948 suggèrent d'utiliser des fragments peptidiques de sémaphorines représentant des antagonistes de récepteurs de sémaphorines ou bien des inhibiteurs de sémaphorine (anticorps ou antisens spécifiques), pour bloquer le signal de répulsion induit par le sémaphorines au niveau du cône de croissance des neurones, de façon à favoriser la régénération neuronale/axonale post-traumatique et traiter les maladies neurodégénératives . Les inventeurs ont montré que les sémaphorines qui jouent un rôle dans le développement des réseaux neuronaux au cours du développement embryonnaire sont également capables de moduler la transmission synaptique chez l'adulte.
La mise en évidence de cette nouvelle propriété des sémaphorines, liée à la liaison des sémaphorines à un récepteur synaptique, ouvre des perspectives très intéressantes pour le traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale. En conséquence, la présente invention a pour objet l'utilisation d'une molécule sélectionnée dans le groupe constitué par une sémaphorine et un modulateur de sémaphorine, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité neuronale. Définitions
- On entend par sémaphorine, une protéine de la famille des sémaphorines telle que définie ci-dessus, un dérivé fonctionnel, notamment un variant fonctionnel de ladite sémaphorine, ou bien un polynucléotide (ADN ou ARN) codant ladite sémaphorine ou ledit dérivé, de préférence inclus dans un vecteur d'expression actif dans les cellules de mammifères.
- On entend par modulateur un activateur ou un inhibiteur.
- On entend par modulateur de sémaphorine un modulateur de l'expression et/ou de la fonction d'une sémaphorine.
- On entend par fonction d'une sémaphorine, la fonction modulatrice (activatrice ou inhibitrice) de la transmission synaptique de ladite sémaphorine ; cette fonction résulte de la liaison de ladite sémaphorine à un récepteur synaptique et de Ia transduction d'un signal médié par ledit récepteur.
- On entend par dérivé fonctionnel de sémaphorine, une sémaphorine modifiée possédant la fonction modulatrice de la transmission synaptique telle que définie ci-dessus.
- On entend par récepteur de sémaphorine aussi bien un récepteur qu'un co-récepteur de ladite sémaphorine, à savoir : toute molécule de la membrane plasmique d'une cellule de mammifère qui est : (i) exprimée dans la région synaptique des neurones, (ii) capable de lier une sémaphorine et de transduire le signal résultant de cette liaison (récepteur au sens strict) ou de transduire le signal résultant de cette liaison (co-récepteur), et d'induire une modulation de la transmission synaptique, du fait de cette liaison.
L'effet de ladite sémaphorine ou dudit modulateur de sémaphorine sur la transmission synaptique peut être mesuré par les techniques classiques d' électrophysiologie connues de l'Homme du métier comme par exemple : le patch- clamp, l'enregistrement extra-cellulaire ou l'utilisation de sondes sensibles au potentiel. - On entend par pathologie liée à un dérèglement de l'activité neuronale, affectant notamment la neurotransmission, toute maladie génétique ou acquise caractérisée par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones (baisse d'activité ou hyperactivité) telle que par exemple l'une des pathologies précitées.
L'invention englobe l'utilisation de sémaphorines de n'importe quelle espèce (vertébré ou invertébré). Les séquences de sémaphorines de certaines espèces (séquences d'ADNc et séquences en acides aminés correspondantes) sont disponibles dans les bases de données de séquences, notamment dans GENBANK et dans la base de données du NCBI.
Les séquences de sémaphorines d'autres espèces peuvent être déterminées par clonage de l'ADNc correspondant, à l'aide d'amorces choisies à partir des séquences connues, selon les techniques classiques de biologie moléculaire, connues de l'Homme du métier. L'invention englobe également l'utilisation de dérivés de sémaphorine (sémaphorines modifiées), notamment de variants de sémaphorine correspondant à une protéine fonctionnelle telle que définie ci-dessus. Les modifications qui sont introduites dans ladite protéine par les techniques classiques connues de l'Homme du métier, incluent de façon non-limitative : mutation (insertion, délétion, substitution) d'au moins un acide aminé dans la séquence de ladite sémaphorine (obtention de variants de sémaphorine), addition d'une séquence de fusion (obtention d'une protéine de fusion ou protéine chimérique), substitution de résidus d'acides aminés par des résidus d'acides aminés non-naturels (acides aminés D ou analogues d'acides aminés), modification de la liaison peptidique, cyclisation, addition de groupements chimiques au niveau des chaînes latérales des acides aminés, couplage à une molécule d'intérêt, notamment une molécule permettant le passage de la barrrière hémato-méningée ; ledit couplage est réalisé par l'intermédiaire d'une liaison non-covalente ou covalente telle qu'une liaison peptidique (obtention d'une sémaphorine chimérique). En outre, lorsque ladite sémaphorine correspond à une protéine membranaire, elle peut avantageusement être tronquée, notamment par délétion du domaine transmembranaire, de façon à obtenir une protéine sécrétée. Ces modifications sont destinées en particulier à moduler (augmenter ou diminuer) l'affinité ou la spécificité des sémaphorines pour un de leur récepteur, à augmenter la stabilité, la pénétration et la diffusion dans le tissu nerveux, ou à faciliter la purification desdites protéines.
Les vecteurs dans lesquels on peut insérer une séquence d'intérêt dans une cassette d'expression contenant les éléments régulateurs de transcription et de traduction appropriés (promoteur, activateur, intron, codon d'initiation (ATG), codon stop, signal de polyadénylation), afin de l'introduire et de la maintenir dans une cellule hôte eucaryote, sont connus de l'Homme du métier ; le choix d'un vecteur approprié dépend de l'utilisation envisagée pour ce vecteur (par exemple réplication de la séquence d'intérêt, expression de cette séquence, maintien de la séquence sous forme extrachromosomique ou bien intégration dans le matériel chromosomique de l'hôte). On peut utiliser entre autres les acides nucléiques nus (ADN, ARN, linéaire ou circulaire), notamment les plasmides, et les vecteurs viraux tels que les adénovirus, notamment les adénovirus canins, les rétrovirus, les lentivirus, les herpesvirus, les AAV (Adeno-Associated- Virus), les poxvirus, et en particulier les canarypox, les rhabdovirus et le virus de l'encéphalite vénézuélienne. De préférence, on utilise des vecteurs possédant un tropisme naturel pour le tissu nerveux (herpesvirus, rhabdovirus, virus de l'encéphalite vénézuélienne) ou induit par la formation de pseudo-particules virales comprenant une protéine d'enveloppe d'un virus neurotrope comme notamment la glycoprotéine du virus de la rage (lentivirus pseudotypé, par exemple).
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite sémaphorine est sécrétée ; de préférence il s'agit d'une sémaphorine de classe 3, comme par exemple Séma3A. Parmi les modulateurs de sémaphorine, on peut citer les substances qui modulent la réponse des sémaphorines dans le guidage axonal, ainsi que les agonistes et les antagonistes de récepteur de sémaphorine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit modulateur est sélectionné dans le groupe constitué par les nucléotides cycliques et le monoxyde d'azote.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant sélectionné dans le groupe constitué par : les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines (IgCAM).
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant exprimé dans la région synaptique des neurones.
Selon une disposition avantageuse de ces modes de réalisation, ledit récepteur est la neuropiline NP-1.
Un agoniste de récepteur de sémaphorine est défini dans la présente invention, par toute molécule capable de mimer l'effet de ladite sémaphorine sur un récepteur synaptique, c'est-à-dire une molécule capable de mimer la liaison de la sémaphorine audit récepteur synaptique et/ou d'induire la transduction du signal médié par ledit récepteur ou l'un de ses co-récepteurs.
Un antagoniste de récepteur de sémaphorine est défini dans la présente invention par, toute molécule capable d'inhiber/bloquer l'effet de ladite sémaphorine sur un récepteur synaptique, c'est-à-dire une molécule capable d'inhiber la liaison de la sémaphorine audit récepteur synaptique et/ou d'inhiber la transduction du signal médié par ledit récepteur ou l'un de ses co-récepteurs ; en outre l'inhibition de cette liaison peut être de nature compétitive (antagoniste se liant au récepteur) ou non-compétitive (antagoniste se liant à la sémaphorine).
Cette définition englobe les sémaphorines dans la mesure où les différentes sémaphorines jouent le rôle d'agonistes ou d'antagonistes, vis-à-vis des récepteurs NP-I et NP -2 ; par exemple SémaA et SémaE sont des antagonistes du récepteur NP-I et des agonistes du récepteur NP-2 (Takahashi et al., Nature Neuroscience, 1998, 1, 487-493).
Des molécules capables de mimer la liaison d'une sémaphorine à un récepteur synaptique sont notamment des fragments de sémaphorine incluant le site de liaison audit récepteur ou d'autres molécules, notamment des peptides mimant le site de liaison au récepteur de ladite sémaphorine (mimotope de sémaphorine). Des molécules capables d'inhiber la liaison d'une sémaphorine à un récepteur synaptique sont notamment des fragments de ladite sémaphorine incluant le site de liaison audit récepteur ou des fragments de récepteur incluant le site de liaison à ladite sémaphorine, ou bien d'autres molécules, notamment des peptides mimant, soit le site de liaison au récepteur de ladite sémaphorine (mimotope de la sémaphorine), soit le site de liaison à la sémaphorine du dit récepteur (mimotope du récepteur).
Parmi ces fragments, on peut citer notamment les peptides décrits dans le Brevet US 5639856 et dans la Demande Internationale WO 03/089470.
D'autres mimotopes peuvent notamment être isolés, par criblage d'une banque de molécules, par un test de liaison à un anticorps dirigé contre ledit site de liaison de la sémaphorine (mimotope de sémaphorine) ou du récepteur de la sémaphorine (mimotope de récepteur). En outre, d'autres agoni stes ou antagonistes de récepteur de sémaphorine peuvent également être identifiés par un test fonctionnel permettant de mesurer la transmission synaptique, à l'aide d'une méthode connue de l'Homme du métier, comme précisé ci-dessus.
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite molécule est associée à au moins une substance permettant le franchissement de la barrière hémato-méningée. Parmi ces substances, on peut citer notamment des peptides membranaires, tels que les peptides Pep:Trans™ (http://www.svntem.com/english/techpeptrans.html').
Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de ladite utilisation, ladite pathologie est caractérisée par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones (baisse d'activité ou hyperactivité) et est sélectionnée dans le groupe constitué par : Pépilepsie, l'autisme, l'anxiété, l'angoisse, la dépression et les troubles bipolaires, le stress, l'hyperactivité, la schizophrénie, les troubles du sommeil, les troubles de la santé mentale, les troubles cognitifs, en particulier liés à l'âge, les ataxies, et les pathologies affectant la neurotransmission, en particulier les maladies génétiques affectant un récepteur de neurotransmetteur.
Conformément à l'invention, ladite molécule (sémaphorine ou modulateur de sémaphorine) est sous la forme d'une composition comprenant un véhicule pharmaceutiquement acceptable, et/ou une substance porteuse. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables, les substances porteuses et les adjuvants sont ceux classiquement utilisés. Les substances porteuses sont avantageusement sélectionnées dans le groupe constitué par : les liposomes unilamellaires ou multilamellaires, les ISCOMS, les virosomes, les pseudoparticules virales, les micelles de saponine, les microsphères solides de nature saccharidique (poly(lactide-co-glycolide)) ou aurifère, et les nanoparticules.
Ladite composition se présente sous une forme galénique adaptée à une administration par voie parentérale (sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-péritonéale,intra-rachidienne), entérale (orale, sublinguale), ou locale (intracérébrale : intra-thécale ou intraventriculaire) ou par toute autre voie, et éventuellement par voies multiples.
Elle peut être administrée en une ou plusieurs fois ou en libération continue (perfusion), notamment au moyen de micropompes osmotiques ou associés à tout moyen physique ou chimique, notamment à des agents encapsulants comme les systèmes de dispersion colloïdaux et les polymères, afin d'avoir une dose thérapeutiquement efficace au site d'action (tissu nerveux).
Elle peut se présenter sous la forme de comprimés, simples ou dragéifiés, de gélules, de granules, de sirop, de suppositoires, de préparations injectables, de pommades, de crèmes, de gels, d'aérosol, lesquels sont préparés selon les méthodes usuelles. Dans ces formes galéniques, ladite molécule est incorporée à des excipients habituellement employés dans des compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, disper¬ sants ou émulsifiants, les conservateurs. Ladite molécule est destinée à être introduite in vivo dans les cellules-cibles (neurones), soit par diffusion passive, soit en utilisant des méthodes physiques telles que la microinjection, soit en l'associant à toute(s) substance(s) permettant le passage de la barrière hémato-méningée.
Elle peut notamment être administrée directement au niveau de son site d'action (cerveau, moelle épinière). Alternativement, elle peut être administrée par voie parentérale, après avoir été préalablement intégrée dans un liposome ou une nanoparticule qui contient avantageusement un peptide permettant le franchissement de la barrière hémato-méningée.
La posologie utile varie en fonction de l'affection à traiter, de la voie et du rythme d'administration, ainsi que de la nature et du poids de l'espèce à traiter (humaine ou animale). La présente invention a également pour objet un procédé de criblage de molécules capables de moduler la transmission synaptique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une banque de molécules à tester avec au moins un récepteur de sémaphorine, et b) la sélection des molécules capables de moduler la transmission synaptique.
Selon un mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ledit récepteur est sélectionné dans le groupe constitué par les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines (IgCAM). Selon un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, ledit récepteur est exprimé dans la région synaptique des neurones.
Selon une disposition avantageuse des modes de mise en œuvre précédents dudit procédé, ledit récepteur est la neuropiline NP-I .
Selon encore un autre mode de mise en œuvre avantageux dudit procédé, il comprend, une étape de pré-sélection des molécules capables de se lier au(x)dit(s) récepteur(s), préalablement à l'étape b) de sélection.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre dudit procédé, l'étape b) est réalisée en compétition avec une sémaphorine sécrétée, de préférence de classe 3, de manière préférée de type 3A (Séma3A). La banque de molécules est un ensemble de molécules apparentées par leur structure, leur origine ou leur fonction, notamment une banque combinatoire incluant des molécules qui diffèrent entre elles par le remplacement systématique ou aléatoire de leurs constituants élémentaires. Il s'agit par exemple d'une banque d'oligomères tels que des peptides, des oligonucléotides (aptamères) et des oligosaccharides, d'une banque d'anticorps ou de fragments d'anticorps, ou bien d'une banque de molécules organiques autres que des oligomères, cycliques ou non- cycliques, notamment des petites molécules organiques, c'est-à-dire de masse moléculaire inférieure à 2500 Da, de préférence inférieure à 2000 Da, de manière préférée inférieure à 1500 Da, de manière plus préférée inférieure à 1000 Da, de manière encore plus préférée inférieure à 750 Da.
Le criblage de la banque de molécules et l'identification des molécules capables de se lier à la cible (sémaphorine ou récepteur de sémaphorine) sont réalisées par toute méthode connue de l'Homme du métier permettant la mesure de l'interaction entre deux partenaires (ELISA, transfert d'énergie par résonance (FRET), polarisation de fluorescence, résonance plasmonique de surface). Le criblage est réalisé à l'aide d'une cible ou d'un dérivé de la cible tel qu'un fragment comprenant au moins le site d'intérêt, un mimotope, ou bien encore un anticorps anti- idiotypique représentant l'image interne dudit site d'intérêt de la cible. La dite cible et ses dérivés ou bien l'anticorps ou le fragment d'anticorps sont éventuellement, immobilisés sur un support approprié, et/ou marqués par tout moyen permettant l'obtention d'un signal mesurable, connus de l'Homme du métier. En outre, Ia spécificité de la liaison peut être démontrée par un test de liaison en compétition, avec un ligand (sémaphorine/récepteur) marqué.
L'identification des molécules capables de moduler la transmission synaptique est réalisée par un test fonctionnel, à l'aide d'une méthode connue de l'Homme du métier, comme précisé ci-dessus ; il s'agit, notamment d'un test in vitro ou ex vivo, dans un système cellulaire approprié (lignée cellulaire ou échantillon de tissu nerveux mis en culture (culture en tranche ou culture organotypique), ou bien in vivo, chez un organisme approprié. Les cellules en culture peuvent être immortalisées ou en culture primaire, adhérentes ou en suspension. L'organisme vivant peut être n'importe quel organisme de laboratoire ou d'étude (rongeurs, porcs, bovins, ovins...) transgénique ou non-transgénique.
Parmi les systèmes cellulaires et les organismes appropriés, on peut citer notamment ceux qui sont des modèles d'un processus pathologique caractérisé par un dysfonctionnement de l'activité des réseaux neuronaux ou une anomalie de décharge des neurones. Les polynucléotides tels que définis dans l'invention sont obtenus par les méthodes classiques, connues en elles-mêmes, en suivant les protocoles standards tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). Par exemple, ils peuvent être obtenus par amplification d'une séquence nucléique par PCR ou RT-PCR, par criblage de banques d'ADN génomique par hybridation avec une sonde homologue, ou bien par synthèse chimique totale ou partielle. Les vecteurs recombinants sont construits et introduits dans des cellules hôtes par les méthodes classiques d'ADN recombinant et de génie génétique, qui sont connues en elles-mêmes.
Les protéines et dérivées (protéines de fusion ou protéine chimérique) sont produites à partir des ADNc correspondants, obtenus par tout moyen connu de l'homme du métier ; l'ADNc est clone dans un vecteur d'expression eucaryote ou procaryote et la protéine ou le fragment produits dans les cellules modifiées par le vecteur recombinant sont purifiés par tout moyen approprié, notamment par chromatographie d'affinité.
Les peptides peuvent être synthétisés en phase solide, selon la technique Fmoc, originellement décrite par Merrifield et al. (J. Am. Chem. Soc., 1964, 85: 2149-) et purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés dans lesquels :
- la figure 1 illustre la diminution de la transmission de l'excitation synaptique, induite par Séma3A. (A) Cinétique de variation de la pente du potentiel d'excitation post-synaptique (EPSP) après application de Séma3A dans le bain de liquide céphalo-rachidien artificiel. Le graphique supérieur représente la superposition de deux courbes de potentiel d'excitation post-synaptique correspondant aux coupes d'hippocampe incubées en présence de surnageant contrôle (trait fin, étoile vide), ou 15 minutes après incubation en présence de surnageant contenant Séma3A (trait épais, étoile pleine). (B) Résumé des modifications normalisées de la pente d'EPSP, après application de surnageant contrôle (CS), de surnageant Séma3A dilué 10 fois (Séma3A/10), de surnageant Séma3A dilué 5 fois (Séma3A/5), et de surnageant Séma3A ou LIFc, non-dilués. (C) La stimulation répétée (panneau supérieur) ou prolongée (panneau inférieur) par Séma3A, induit une diminution de la transmission synaptique répétée (panneau supérieur) ou prolongée (panneau inférieur).
- la figure 2 illustre la mise en évidence de sites de liaison à la sémaphorine 3 A, dans la région CAl de l'hippocampe de l'adulte. Séma3A a été incubée avec des coupes de cerveau et détectée dans la couche correspondant aux corps cellulaires et dans les régions correspondant aux dendrites apicales et distales des cellules pyramidales. L'organisation cellulaire du tissu a été visualisée par coloration au bisbenzimide. Echelle = panneaux de gauche (a, b, c, e, f, h, i) : 250 μm ; panneaux de droite (d, g, j) : 25 μm. - la figure 3 illustre l'expression de NP-I dans l'hippocampe de l'adulte et sa localisation pré-synaptique. (A-a) Hybridation in situ montrant que le transcrit NP-I est détecté dans le gyrus dentate, et les régions CAl et CA3. (A, b-d) Observations confocales d'expériences d'immunocytochimie sur des coupes de cerveau adulte, pour la détection, dans la région CAl, de la protéine NP-I (b) et d'un marqueur synaptique (synaptophysine (SYN) ; c et d (agrandissement d'un région de c)). Echelle = 10 μm. La colocalisation avec la synaptophysine indique que NP-I est distribué dans le compartiment pré-synaptique. (B) Analyse du contenu en synaptophysine, PSD-95 et NP-I d'extraits d'hippocampe adulte, de synaptosomes, de la fraction de densité non-post-synaptique (non-PSD pour non-Post-Synaptic Density) et de plusieurs fractions de densité post-synaptique (PSDI, PSDII, PSDIII). Les immunoblots indiquent que le compartiment pré-synaptique est enrichi en NP-I comme en synaptophysine. En revanche, NP-I n'est pas présente dans les fractions PSD, contrairement au marqueur post-synaptique PSD-95 qui est présent en grande quantité dans ces fractions PSD. - la figure 4 illustre l'expression de NP-I dans des cultures de neurones différenciés de l'hippocampe. (A à C) Co-marquage de NP-I avec NeuN (A), parvalbumine (B) et quantification des neurones doublement marqués (C) montrant qu'une proportion élevée de neurones incluant des neurones positifs pour la parvalbumine, expriment NP-I. (D-E) Double marquage de NP-I avec le marqueur somatodendritique MAP2 (D) et le marqueur axonal Tau (E), illustrant la distribution de NP-I dans les deux types de compartiments neuritiques. La flèche en (D) illustre un neurite MAP2-/NP1+, en (E) un neurite Tau-/NP-l+. (F) NP-I est exprimé dans certains mais pas tous les prolongements des neurites primaires. Barre d'échelle (A-F) 10 μm.
- la figure 5 illustre la présence de NP-I au niveau des synapses de neurones de l'hippocampe en culture. (A-B) Co-marquage de NP-I avec les marqueurs synaptiques dans des cultures de neurones de l'hippocampe différenciés in vitro (DIV). Le marquage de la synaptophysine (A) et du marqueur de la famille PSD- 95 (B) montre que la synaptogénèse se produit dans des neurites exprimant NP-I et que NP-I est localisée au niveau des synapses. La flèche en B montre l'apposition des fluorescences du marqueur de la famille PSD-95 et de NP-I . Barre d'échelle : 10 μm. - la figure 6 illustre l'induction de la phosphorylation de Erk, par
Séma3A, dans les neurones différenciés de l'hippocampe. (A-B) Immunomarquage de pERkl/2 montrant une augmentation de la fluorescence de pErk dans le corps cellulaire et les neurites de cultures de neurones traitées par Séma3A,par comparaison avec le contrôle (A) et l'analyse quantitative du marquage (B). * p> 0,01 (test de Student). Barres d'échelle : 10 μm.
- la figure 7 illustre l'effet du traitement par Séma3A sur le marquage du marqueur synaptique synaptophysine. (A) Microphotogaphies de neurofilaments et marquage de la synaptophysine dans des neurones de l'hippocampe à DIVl 5, traités par Séma3A ou non-traités, illustrant la diminution de la fluorescence de la synaptophysine induite par Séma3A. La fluorescence totale et la surface moyenne de chaque point sont réduits, comme déterminé par l'analyse quantitative de la fluorescence (B). * p> 0,01 (test de Student). Barres d'échelle : 5 μm.
- la figure 8 représente un modèle du mécanisme de diminution de la transmission synaptique induit par Séma3A. A : Séma3A agit sur les axones en développement et induit une rétraction des filopodes et des lamellipodes formant le cône de croissance. Cette rétraction qui est initiée par la liaison de Séma3A avec NP- 1, conduit à un effondrement du cône de croissance. B : Dans la région CAl de l'hippocampe, chez l'adulte, le récepteur NP-I de Séma3A est exprimé au niveau de la membrane pré-synaptique. Séma3A qui pourrait être sécrétée par les afférences entorhinales, se lie à la protéine NP-I du complexe moléculaire formant le récepteur et active le récepteur. Cette activation induit une réponse de rétraction morphologique de la synapse, semblable à celle de la rétraction du cône de croissance se produisant lors du guidage axonal. Cet effondrement diminue la transmission synaptique en augmentant la taille de l'espace intersynaptique.
Exemple 1 : L'application de sémaphorine exogène diminue la transmission synaptique 1) Matériels et méthodes a) Electrophysiologie
Des coupes d'hippocampe (400 μm) ont été préparées à partir de souris âgées de six à huit semaines. Les coupes ont été réalisées dans une solution (280 mM sucrose, 26mM NaHCO3, 10 mM D-glucose, 1,3 mM KCl, ImM CaCl2, 1O mM MgCl2) et maintenues pendant une heure à température ambiante, dans un liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) oxygéné (95 % O2 / 5 % CO2 ; ACSF : 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 0,8 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 3mM CaCl2, X mM D-glucose).
Chaque coupe a été transférée dans une chambre d'enregistrement contenant du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné comme ci-dessus et maintenue à 34°C. Les neurones ont été visualisés par vidéomicroscopie infrarouge (DIC pour Differential Interférence Contrast). Toutes les expériences ont été réalisées en présence de picrotoxine (100 μM SIGMA), un antagoniste du récepteur au GABA de type A. La région CAl a été séparée de la région CA3 par section au couteau de la coupe d'hippocampe avant la mesure, de façon à éviter une activité épilepti forme. Les potentiels d'excitation post-synaptique (EPSP) des champs extracellulaires ont été enregistrés dans le stratum radiatum, à l'aide de microélectrodes de mesure en verre, remplies de NaCl 3M. Les électrodes de stimulation en verre, remplies de tampon salin extracellulaire, ont été placées dans le stratum radiatum. Les stimuli (durée de 0,1 à 0,15 mS) de 0,1 à 3mA ont été délivrés à une fréquence de 0,3 Hz pour les mesures de la transmission synaptique basale. Toutes les drogues ont été appliquées dans le bain de liquide céphalo-rachidien artificiel. Les signaux analogues ont été filtrés à 3 kHz et l'acquisition des séquences de 400 ms a été réalisée à un rythme de 12 kHz à l'aide du logiciel (ACQUISI™, BIO-LOGIC). Les résultats exprimés par la moyenne + écart type, ont été analysés à l'aide du test de Mann-Whitney. b) Production de sémaphorine et de LlFc
Des cellules COS7 ont été transfectées de façon transitoire par un vecteur recombinant d'expression de la Séma3A fusionnée à une étiquette myc, à l'aide de lifofectamine™, comme décrit dans Castellani et al., Neuron, 2000, 27, 237-. Trois jours plus tard, le surnageant cellulaire a été récolté et dialyse pendant 3 jours, contre du liquide céphalo-rachidien artificiel. Le surnageant contenant LlFc a été obtenu de façon similaire, à partir de cellules sécrétant LlFc, transfectées de façon stable (Castellani et al., précité). Le surnageant contrôle est constitué par du surnageant de cellules non-transfectées, dialyse avec du liquide céphalo-rachidien artificiel. 2) Résultats
L'effet des sémaphorines sur la transmission synaptique a été étudié dans l'hippocampe avec la sémaphorine 3A (Séma3A). Les potentiels d'excitation post-synaptiques des champs extracellulaires (EPSP) évoqués par la stimulation des collatérales de Schaffer ont été enregistrés dans la région CAl de fines coupes d'hippocampe de souris âgées de 6 à 8 semaines. L'application de Séma3A exogène dans le bain, diminue de façon significative la pente de la courbe d'EPSP à 80 % ± 9 % de celle du groupe contrôle (n = 5 coupes, test de Mann-Whitney, p<0,001, figure IA). La diminution de la transmission synaptique est dose dépendante, étant donné que l'application de Séma3A diluée d'un facteur 5 induit une réduction plus faible mains néanmoins significative, de la transmission synaptique (91 % ± 7 %, n = 3 coupes, p<0,05 ; figure IB). Aucun abaissement du niveau de transmission n'est induit par l'application de Séma3A diluée d'un facteur 10 (103 + 6 %, n = 3 coupes, p>0,l, figure IB).
De plus, l'application de surnageant contrôle, obtenu dans des conditions similaires, mais dépourvu de Séma3A, n'a aucun effet significatif sur la pente de la courbe d'EPSP (97 % ± 5 %, n = 5 coupes, p>0,l, figure IB). Cette diminution de la transmission synaptique, induite par Séma3A n'est pas associée aune réduction de la voilée pré-synaptique (100 ± 1 %, n = 3, p>0,l), indiquant que Séma3A n'a pas d'effet sur l'excitabilité des axones pré-synaptiques. De plus, l'abaissement du niveau de transmission synaptique induit par Séma3A n'est pas associé à une augmentation significative du rapport de l'amplitude des réponses à une stimulation couplée (104 ± 7 %, n = 5, p>0,l), suggérant que Séma3A n'agit pas en réduisant la probabilité de libération du neurotransmetteur.
La diminution de la transmission synaptique est liée de façon étroite à la présence de Séma3A dans le cerveau. Ainsi, l'application répétitive ou prolongée de Séma3A, induit une diminution de la transmission synaptique répétitive ou prolongée (figure 1 C).
En revanche, l'application dans le bain des coupes d'hippocampe, d'une forme soluble de la molécule d'adhésion cellulaire de la superfamille des immunoglobulines Ll (LlFc) qui stimule efficacement la pousse des neurites, n'a pas d'effet sur la transmission synaptique (107 ± 11 %, n = 3 coupes, p>0,5, figure IB) dans un intervalle de temps comparable à celui de Séma3A.
Exemple 2 : Analyse des sites de liaison à la Séma3A de l'hippocampe adulte
1) Matériels et méthodes Les surnageants des cellules transfectées ou non de l'exemple 1 ont été utilisés pour localiser les sites de liaison à la Sémaphorine 3 A de l'hippocampe adulte, par immunomarquage. De manière plus précise, des coupes sagittales de cerveau de souris (30 μm) ont été préparées à l'aide d'un vibratome. Les molécules de Séma3A-myc ont été pré-agrégées avec des immunoglobulines anti-c myc (50 μg/ml, hybridome 9E10, SIGMA), pendant 1 heure, puis incubées pendant 1 heure avec des coupes en suspension. L'immunodétection a été réalisée à l'aide d'un anticorps secondaire marqué au rouge Texas. Après des lavages en PBS, les coupes ont été contre-colorées avec du bisbenzimide (1 : 10000), pendant 5 minutes, puis montées avant l'observation. 2) Résultats
La distribution des sites de liaison à la Sémaphorine 3A de l'hippocampe adulte, a été analysée par incubation de coupes sagittales de cerveau avec une protéine Séma3A recombinante marquée par un épitope myc. Les molécules de Séma3A ont été pré-agrégées avec des anticorps anti-myc avant l'incubation avec les coupes de cerveau. Dans ces conditions, la liaison de Séma3A est visualisée par un marquage dans les régions CAl et C A3 de l'hippocampe, ainsi que dans le stratum granulosum et le dentate gyrus. Dans la région CAl, le marquage est distribué dans la couche de cellules pyramidales et dans la région apicale des dendrites, où les collatérales de Schaffer se terminent (Figure 2). Ainsi, des sites de liaison de Séma3A existent à un moment et à une localisation appropriée pour médier les changements dans la transmission synaptique, qui sont induits par l'application de Séma3A. Exemple 3 : NP-I est localisé dans le compartiment pré-synaptique 1) Matériels et méthodes a) Hybridation in situ
La sonde d'ARN antisens complémentaire du transcrit NP-I a été marquée à l'une de ses extrémités, à l'aide du système de transcription in vitro pour sonde à ARN (Riboprobe In vitro Transcription Systems ; PROMEGA) et du mélange pour marquage de l'ARN à la Digoxygénine (DIG-RNA Labelling Mix ; ROCHE). Les photos ont été prises avec un appareil photographique (DX 30 CCD ; KAPPA), à l'aide du logiciel fourni par le fabricant (KAPPA). K) Immυnohistochirnie Les tissus fixés ont été coupés (30 μm d'épaisseur) à l'aide d'un vibratome. Les coupes ont été incubées dans du PBS 0,1 M, pH 7,4, additionné de 20 % de sérum de veau fœtal, puis elles ont été incubées toute la nuit avec l'anticorps primaire : anticorps polyclonal de lapin anti-NP-1 (1 : 1000) ; anticorps monoclonal de souris anti-synaptophysine (1 : 100, ROCHE) ; anticorps monoclonal de rat (IgG) anti-Ll de souris (1 : 100 ; R&D SYSTEMS), anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-PSD-95 (1 : 100, ABR). Après des lavages, les coupes ont été incubées avec un anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de lapin, couplé à la fluorescéine (NP-I) ou un anticorps d'âne anti-IgG de souris couplé au rouge Texas (synaptophysine ou PSD- 95) ou anti-IgG de rat couplé au rouge Texas (Ll), dilué au 1 : 400 (JACKSON IMMUNORESEARCH). Les images confocales ont été obtenues à l'aide d'un microscope (Axiovert 135M, ZEISS) muni d'un objectif à immersion (63x) et d'un système d'imagerie pour confocale à enregistrement laser (LSM 410, ZEISS). c) Fractionnement post-svnaptique de densité et immuno-empreintes fimmunoblots)
Les fractions de densité post-synaptique (PSD pour Post-Synaptic Density) de l'hippocampe de souris ont été préparées comme décrit dans Cho et al., Neuron, 1992, 9, 929. Brièvement, des extraits d'hippocampe de souris ont été centrifugés pour éliminer les noyaux et les débris tissulaires, le surnageant a ensuite été centrifugé à 10 000 g, de façon à obtenir un culot brut de membranes (P2). Une fraction enrichie en synaptosomes a été préparée par centrifugation en gradient discontinu de saccharose du culot P2 remis en suspension. Pour extraire la fraction PSDI, les synaptosomes ont été dilués dans 0,5 % de Triton X-100. Les fractions PSD II et III ont été remises en suspension et centrifugées respectivement dans du Triton X-100 (0,5 %) ou du Sarcosyle (6 %). Les échantillons ont été mélangés dans du tampon de migration contenant du SDS et des quantités égales de protéines ont été séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide (7,5 %) contenant du SDS (SDS-PAGE), puis elles ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. L'immunoréactivité a été révélée avec un système de chimioluminescence. Les anticorps suivants ont été utilisés : anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-GluR2 (1 :100, CHEMICON INC.), anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-synaptophysine (1 : 1000, ROCHE PRODUCTS), anticorps monoclonal de souris (IgG) anti-PSD95 (1 : 1000, AFFINITY BIO REAGENTS) et anticorps polyclonal de lapin anti-NP-1 (1 : 1000). 2) Résultats
La localisation cellulaire des sites de liaison à Séma3A a été analysée en se concentrant sur NP-I . Dans un premier temps, l'expression de NP-I et de Séma3A dans l'hippocampe de souris adulte, a été étudiée par hybridation in situ. Le transcrit NP-I est détecté dans les régions CAl et CA3 et dans le gyrus dentate du cerveau adulte (figure 3). Le transcrit Séma3A est produit de façon abondante dans le gyrus dentate mais est absent dans les régions CAl et C A3. La détection immunocytochimique de NP-I révèle un profil d'expression ressemblant à celui des sites de liaison à la sémaphorine 3A, comme le stratum pyramidale et le stratum radiatum de la région CAl. La distribution de la protéine NP-I a été analysée en même temps que celle du marqueur synaptique synaptophysine dans une expérience de double-marquage en immunofluorescence. Les analyses confocales montrent que l'expression de NP-I est sous la forme de points et co-localise avec le marquage de la synaptophysine dans la région CAl. Ces observations indiquent que NP-I est un constituant des synapses de l'hippocampe (Figure 3). La localisation sub-cellulaire de NP-I dans les compartiments synaptiques a été examinée plus en détail, par double marquage de NP-I et du marqueur post-synaptique PSD-95. L'imagerie confocale montre que les marquages de NP-I et de PSD-95 ne co-localisent pas mais sont étroitement apposées, indiquant que NP-I possède une localisation pré-synaptique. L'expression synaptique de NP-I et sa localisation pré-synaptique ont été confirmées à partir des fractions synaptosomales et PSD (Post-Synaptic Density), séparées par centrifugation en gradient de saccharose et extraction par le triton/sarcosyle. Les préparations ont été contrôlées par détection de marqueurs pré- et post-synaptiques, en immunoblot. Le marqueur pré-synaptique synaptophysine est détecté uniquement dans la fraction synaptosomale mais pas dans la fraction PSD. En revanche, le marqueur post-synaptique sous-unité Glu R2 du récepteur au glutamate de type AMPA, est détecté uniquement dans la fraction PSD (figure 3). Les résultats confirment ceux du double-marquage avec la synaptophysine, et démontrent la présence de NP-I dans la fraction synaptosomale mais pas dans la fraction PSD, indiquant que NP-I possède une localisation pré-synaptique (Figure 3). Ces profils d'expression sont compatibles avec un rôle de NPl/Séma3A au niveau des synapses, ayant des répercussions sur les neurones de la région CAl (Figureδ).
Exemple 4 : Expression et localisation de la neuropiline 1 (NP-I) au cours de la différenciation des neurones de l'hippocampe. 1) Matériels et méthodes
Les hippocampes de souris nouveaux-nés ont été prélevés et dissociés. Les neurones ont été cultivés in vitro sur des supports recouverts de poly-lysine, dans du milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10 % de sérum de veau fetal et du B27, pendant 1 à 21 jours (DIV).
Les neurones ont ensuite été fixés avec une solution de paraformaldéhyde (PFA 4%). Dans certaines expériences, la fixation à la PFA a été précédée d'un traitement d'une durée de 20 minutes avec du surnageant contenant Sema3A (InM), préparé comme décrit à l'exemple 1. La détection des différents marqueurs a été réalisée par immunocytochimie avec les anticorps spécifiques suivants : anti-MAP2 (CHEMICON, 1/200), anti-NeuN (CHEMICON, 1/200), anti-synaptophysine (SIGMA, 1/100), anti-famille PSD (clone K28/86.2, 1/150), anti parvalbumine (SIGMA, 1/400), anti-NF200Kd (SIGMA, 1/400), anti-Tau (SIGMA, 1/100). Deux anticorps anti-NPl ont été utilisés : un anticorps polyclonal de lapin (α36, 1/1000) et un anticorps monoclonal de chèvre (RaD, 1/100). La spécificité du marquage a été contrôlée pour chaque anticorps, par incubation en présence de l'anticorps secondaire mais en l'absence de l'anticorps primaire. Les cellules ont été perméabilisées avec du Triton X-100 (0,3 %), pendant 15 minutes. Pour l'analyse quantitative, les cellules ont été préparées pour la détection immunocytochimique de la synaptophysine et visualisées au microscope (Axiovert 200 M, ZEISS). Les images ont été enregistrées dans des conditions d'exposition identiques et exportées dans les logiciels Adobe photoshop™ (Adobe Systems Inc) et NIH image . Pour l'analyse de la surface et de la longueur des points de synaptophysine, les images ont été traitées à un seuil de 48. 2) Résultats
NPl est exprimée dans les neurones de l'hippocampe, depuis les stades précoces jusqu'aux stades très différenciés, comme illustré par l'immunomarquage de la protéine NP-I au 21eme jour de différenciation in vitro (DIV 21, figure 4A, 4E). Le double marquage de NP-I et du marqueur nucléaire pan-neuronal NeuN, indique que 83 % des neurones de l'hippocampe expriment NP-I. En outre, 80 % de neurones exprimant la parvalbumine expriment également NP-I à un niveau élevé (Figure 4A, 4C). Toutefois, le marquage de NP-I a aussi été détecté dans des neurones n'exprimant pas la parvalbumine, indiquant que l'expression de NP-I n'est pas restreinte à cette population d'interneurones. Au niveau subcellulaire, la protéine NP-I est répartie à la fois le long des axones et des dendrites, comme visualisé par le co-marquage avec les marqueurs axonaux et somatodendritiques Tau et MAP2 (Figures 4D, 4E). Toutefois, quelques dendrites et prolongements axonaux négatifs ont été observés, indiquant que NP-I est adressée vers la majorité mais non la totalité des compartiments neuritiques des neurones de l'hippocampe. En particulier, NP-I est souvent absente dans des prolongements complexes des arborescences dendritiques ou des axones. La présence de NP-I au niveau des synapses a été examinée dans des cultures de neurones d'hippocampe à DIVl 5, par double-immunomarquage de NPl et des marqueurs pré-et post-synaptiques, synaptophysine (Syn) et famille PSD-95. De façon intéressante, un niveau d'expression élevé de NPl est observé dans les neurites qui forment des synapses et le marquage est renforcé au niveau des points de synaptophysine, indiquant que NP-I, même s'il n'est pas exclusivement adressé vers les synapses, est certainement présent dans ce compartiment (Figure 5A). Des expériences d'immunomarquage avec un second marqueur des vésicules synaptiques, SV2 montrent un profil similaire de localisation de NP-I . NP-I est également présente dans de nombreuses mais pas dans la totalité des synapses visualisées avec un marqueur de la famille PSD-95. On observe des zones d'apposition entre les fluorescences de NP-I et de PSD-95 (figure 5B). Ces résultats indiquent que NP-I est présente au niveau des synapses formées par des neurones différenciés en culture.
Exemple 5 : Séma3A induit l'activation de la MAPK Erk dans les neurones différenciés de l'hippocampe 1) Matériels et méthodes
La détection immunocytochimique des marqueurs est réalisée comme décrit à l'exemple 4. La pErk est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique (anti- phospho Erk 1A, SANTACRUZ, 1/100). Pour l'analyse du marquage de la pErk, un champ a été sélectionné au hasard dans le contrôle (neurones non-traités) et un seuil a été fixé pour éteindre la fluorescence des corps cellulaires ou des neurites. Les corps cellulaires et les neurones avec des neurites qui restent fluorescents dans le contrôle, ont ensuite été comptés dans des champs sélectionnés au hasard. La quantification de la fluorescence des cellules traitées par Séma3A a été quantifiée dans des conditions similaires, après application du seuil. 2) Résultats
Des études récentes des cascades de signalisations induites par Séma3A, pendant le guidage des axones, ont mis en évidence le rôle déterminant de la kinase régulée par un signal extracellulaire, Erk, de la sous-famille MAPK, dans l'effondrement du cône de croissance induite par Séma3A (Campbell et HoIt, Neuron, 2003, 37, 939-952 ; Bagnard et al., Mol. CeIl. Neurosci., 2004, 25, 722-731). De façon intéressante, Erk est apparue comme un effecteur majeur du remodelage structural et fonctionnel à la base de la plasticité cellulaire (Goldin et Segal , Eur. J. Neurosci., 2003, 17, 2529-2539). La réponse des neurones adultes à Séma3A a été étudiée par l'analyse de l'effet de Séma3A sur l'activation de la MAPK Erk dans des neurones différenciés. Dans les cultures de neurones de l'hippocampe au stade DFVl 5, le traitement par Séma3A induit la phosphorylation de Erkl/2 ; le marquage n'est pas limité aux corps cellulaires mais est aussi détecté dans les compartiments neuritiques (Figure 6A). L'analyse quantitative de la fluorescence indique que le traitement par Séma3A induit une augmentation d'un facteur 2,7, de la population de neurones positifs pour pErk, par rapport au contrôle (Figure 6B, 141 neurones de deux cultures indépendantes par condition, p < 0,005). De plus, après l'application de Séma3A, la proportion de neurones avec des neurites pErk positifs, passe de 8 % à 72 % (Figure 6B, 113 neurones de deux cultures indépendantes par condition, p < 0,001). L'activation de la MAPK Erk induite par Séma3A suggère que les propriétés fonctionnelles de ce facteur sont conservées dans les neurones en développement et les neurones matures. Du fait de la localisation subcellulaire de NP-I au niveau des synapses de l'hippocampe, il peut être envisagé que la diminution de la transmission synaptique induite par Séma3A serait due à une rétraction morphologique de la membrane pré-synaptique, semblable à l'effondrement du cône de croissance provoqué par ce facteur sur les axones en croissance. Pour vérifier cette hypothèse, une double-immunodétection du marqueur axonal NF200 et de la synaptophysine a été effectuée sur des cultures de neurones de l'hippocampe au stade DIVl 5, traitées ou non par Séma3A, puis la taille des points de synaptophysine a été mesurée. De façon surprenante, cette analyse révèle que Séma3A induit une réduction de 30% de la surface totale couverte par la fluorescence de la synaptophysine (Figure 7A5B). En comparaison, aucune modification du marquage de NF200 n'est observée entre les cellules traitées et non-traitées. Des mesures de la fluorescence de chaque point indique une réduction statistiquement significative de la surface moyenne des points, indiquant une rétractation de l'élément pré-synaptique (Total de 1001 points de deux cultures indépendantes, p<0,01 ).

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation d'un modulateur de sémaphorine, pour la préparation d'un médicament apte à moduler la transmission synaptique, destiné au traitement des pathologies liées à un dérèglement de l'activité électrique des neurones. 2°) Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine.
3°) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit agoniste ou antagoniste est une sémaphorine.
4°) Utilisation selon la revendication 3, caractérisée en ce que ladite sémaphorine est une sémaphorine sécrétée.
5°) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite sémaphorine sécrétée est de classe 3.
6°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite sémaphorine de classe 3 est Séma3A. 7°) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant sélectionné dans le groupe constitué par : les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines (IgCAM).
8°) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit modulateur est un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur de sémaphorine, lequel récepteur étant exprimé dans la région synaptique des neurones.
9°) Utilisation selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisée en ce que ledit récepteur est la neuropiline NP-I .
10°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit modulateur est sélectionné dans le groupe constitué par les nucléotides cycliques et le monoxyde d'azote.
11°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ladite molécule est associée à une substance permettant le franchissement de la barrière hémato-méningée. 12°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite pathologie est caractérisée par un dérèglement de l'activité électrique des réseaux de neurones et est sélectionnée dans le groupe constitué par : l'épilepsie, l'autisme, l'anxiété, l'angoisse, la dépression et les troubles bipolaires, le stress, Phyperactivité, la schizophrénie, les troubles du sommeil, les troubles de la santé mentale, les troubles de la mémoire, les troubles cognitifs, en particulier liés à l'âge, les ataxies, et les pathologies affectant la neurotransmission, en particulier les maladies génétiques affectant un récepteur de neurotransmetteur.
13°) Procédé de criblage de molécules capables de moduler la transmission synaptique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins les étapes suivantes : a) la mise en contact d'une banque de molécules à tester, avec au moins un récepteur de sémaphorine, et b) la sélection des molécules capables de moduler la transmission synaptique.
14°) Procédé de criblage selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit récepteur est sélectionné dans le groupe constitué par les neuropilines, les plexines et les molécules d'adhérence de la superfamille des immunoglobulines.
15°) Procédé de criblage selon la revendication 13, caractérisé en ce que ledit récepteur est exprimé dans la région pré-synaptique des neurones.
16°) Procédé de criblage selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisé en ce que ledit récepteur est la neuropiline NP-I . 17°) Procédé de criblage selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de pré-sélection des molécules capables de se lier au(x)dit(s) récepteur(s), préalablement à l'étape b) de sélection.
18°) Procédé de criblage selon la revendication 17, caractérisé en ce que ladite étape de pré-sélection est réalisée en compétition avec une sémaphorine sécrétée, de préférence de classe 3, de manière préférée Séma3A.
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