WO2006042949A1 - Utilisation de derives de purines pour la fabrication de medicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liees a un defaut d'adressage des proteines dans les cellules - Google Patents
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- WO2006042949A1 WO2006042949A1 PCT/FR2005/002557 FR2005002557W WO2006042949A1 WO 2006042949 A1 WO2006042949 A1 WO 2006042949A1 FR 2005002557 W FR2005002557 W FR 2005002557W WO 2006042949 A1 WO2006042949 A1 WO 2006042949A1
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Definitions
- the invention is directed to the use of purine derivatives for making drugs capable of restoring endoplasmic reticulum protein targeting to plasma membranes. It is particularly aimed at the treatment of cystic fibrosis.
- Cystic fibrosis (CF: Cystic Fibrosis) is the most common recessive genetic disorder, autosomal, lethal, in European and North American populations.
- Le- CF gene (locus 7q31) encodes the transmembrane protein called CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator). Mutations in the CF gene cause abnormal transport of water and electrolytes across cell membranes of various organs such as the lungs, sweat glands, intestine and exocrine pancreas.
- the CFTR protein is a 1480 amino acid glycoprotein belonging to the superfamily of ABC membrane transporters. CFTR is a chloride channel located in the apical plasma membrane of pulmonary epithelial cells in healthy individuals.
- CFTR is responsible for the trans-epithelial transport of .Water and electrolytes 1 and allows in a healthy individual hydration of the pulmonary airways.
- One of the keys to a treatment of this disease therefore consists in a re-addressing of delF508 to the plasma membrane of the cells at which the delF508 transport activity can be stimulated by physiological agonists.
- derivatives known in particular for their anti-proliferative effect were capable of activating wild-type CFTR and mutated forms and causing a re-localization of the delF508-CFTR protein thus restoring its trans-membrane transport capacity.
- these derivatives are capable of restoring protein defect in cells.
- the invention therefore aims to provide a new use of these derivatives to manufacture drugs for the treatment of cystic fibrosis and diseases related to a lack of addressing of proteins in cells.
- the compounds used in accordance with the invention are purine substituted at positions 2, 6 and 9.
- R2 R2, R6 and R9, identical or different from each other, represent a halogen atom, a radical R-NH-
- - R2 may / in addition, represent a heterocycle bearing, where appropriate, a saturated or unsaturated straight or branched chain alkyl radical, an aryl or cycloaryl radical, or a heterocycle, optionally substituted by one or more -OH groups, halogen, amino or alkyl,
- R9 may also represent a saturated or unsaturated straight or branched chain alkyl radical, an aryl or cycloalkyl radical,
- R 2 and R 9 may further represent a hydrogen atom, with the exception of olomoucine.
- the invention aims in particular • • the use of derivatives of formula I above wherein
- R2 is selected from 3-hydroxypropylamino, 1-ethyl-2-hydroxyethylamino, 5-hydroxypentylamino, 1-D, L hydroxymethylpropylamino, aminoethylamino, 2-bis radicals.
- R9 is selected from methyl, isopropyl or cyclopentyl
- R6 is selected from benzylamino, 3-iodo-benzylamino, or isopentenylamino, when R9 represents an isopropyl radical,
- These derivatives correspond to optical isomers and racemic mixtures, where appropriate to geometric isomers. It is more particularly 2- (R, S) (1-ethyl-2-hydroxyethylamino) -6-benzylamino-9-isopropylpurine or 2- (R) - (1-ethyl-2-hydroxyethylamino) 6-benzylamino-9-isopropylpurine, or alternatively 2- (S) - (1-ethyl-2-hydroxyethylamino) -6-benzylamino-9-isopropylpurine.
- Said purine derivatives are capable of restoring the targeting of the CFTR protein to the plasma membranes of the cells and therefore constitute compounds of great interest for the treatment of pathologies related to such problems of addressing defect.
- the active ingredients used in therapeutically effective amounts, are mixed with the pharmaceutically acceptable carriers for the chosen mode of administration.
- These vehicles can be solid or liquid.
- the drugs prepared in the form of capsules, tablets, dragees, capsules, pills, drops, syrups and the like.
- Such drugs may contain from 1 to 100 mg of active ingredient per unit.
- the drugs are in the form of sterile or sterilizable solutions. They can also be in the form of suspensions or emulsions.
- the medicaments of the invention are more particularly administered in the form of aerosols.
- the doses per unit dose may vary from 1 to 50 mg of active ingredient.
- the daily dosage is chosen so as to obtain a final concentration of at most 100 ⁇ M purine derivative in the blood of the treated patient.
- FIGS. 1 to 6 represent: FIG. 1: the effect of roscovitine on addressing D
- FIGS. 4A and 4B activation of delF508 in CF15 cells after treatment with CFTR-T1 (CFTR-T1 designating roscovitine) and response to roscovitine as a function of incubation time; FIGS.
- 5A and 5B the percentage activation as a function of roscovitine concentration and the pharmacological profile of CFTR channels in CF15 cells after incubation with roscovitine; - Figure 6: the competition between CFTR-Tl and the machinery of the chaperone of the ER on the addressing of delF508-CFTR.
- CHO-WT Cells CHO (Chinese Hamster Ovary) cells are fibroblasts that have been transfected with the wild-type CFTR gene (CFTR-WT). These cells will therefore overexpress the CFTR protein.
- Culture medium MEM alpha medium (GIBCO) + 7% fetal calf serum + 0.5% penicillin / streptomycin + 100 ⁇ M methotrexate (amethopterin, Sigma).
- CF15 cells are human nasal epithelial cells that express the ⁇ F508-CFTR gene.
- Calu-3 cells are human lung epithelial cells that express the wild-type CFTR gene.
- Culture medium DMEM / F12 medium with glutamax + 7% fetal calf serum + 1% penicillin / streptomycin.
- Immunolabeling makes it possible to visualize the cellular location of the CFTR protein by means of a primary anti-CFTR antibody (Ac) and then a Cy3 fluorophore-labeled secondary antibody.
- the cells are first seeded on slides in appropriate culture medium. 3 washings with TBS (NaCl: 157 mM, Tris base: 20 ⁇ M, pH 7.4) of 5 min each are carried out. The cells are then fixed by adding TBS-paraformaldehyde (3%) for 20 min. After 3 washes with TBS (5 min), the cells are incubated with 0.1% TBS-triton (10 min) which allows the formation of holes in the cell membrane, then 3 TBS washes are again performed before the setting in the presence of the cells with TBS-BSA 0.5% -saponine 0.05% for 1 h. The cells are then incubated with the primary anti-CTR CFTR antibody (2 ⁇ g / ml) for 1 h.
- TBS NaCl: 157 mM, Tris base: 20 ⁇ M, pH 7.4
- 125 I has the added advantage of having a short life compared with other markers such as 35 Cl (respective half life: 30 days and 300,000 years).
- the cells are cultured on 24-well plates in a suitable medium.
- 2 rinses with efflux medium NaCl: 136.6 mM, KCl: 5.4 ⁇ iM, KH 2 PO 4 : 0.3 mM, NaH 2 PO 4 : 0.3 mM, NaHCO 3 : 4.2 mM
- CaCl 2 1.3 mM, MgCl 2 : 0.5 mM, MgSO 4 : 0.4 mM, HEPES: 10 mM, D-glucose: 5.6 mM
- the cells are incubated with 500 ⁇ l of loading (1 ⁇ Ci / ml of 125 INa) for 30 min for CHO-WT or 1 hour for CF15 and Calu-3. Iodide equilibrates on both sides of the cell membrane.
- the robot (MultiPROBE, Packard) performs the following steps: the charge medium is rinsed with efflux medium to eliminate extracellular radioactivity. The supernatant is collected every minute in hemolysis tubes and the medium is replaced by an equivalent volume (500 ⁇ l). The samples of the first 3 minutes - do not undergo drug addition, they allow to obtain a stable baseline, characterizing the passive output of I ions. The following 7 samples are obtained in the presence of the molecule to be tested.
- the cells are lysed by adding 500 ⁇ l of NaOH (0.1 N) / 0.1% SDS (30 min), thus, the radioactivity remaining inside the cell can be determined.
- the radioactivity present in the hemolysis tubes is counted in counts per minute (cpm) thanks to a gamma counter (Cobra II, Packard).
- the MTT toxicity test is a colorimetric test based on the ability of mitochondrial dehydrogenases to metabolize MTT (yellow tetrazolium salt) to formazan
- the absorbance, proportional to the converted dye concentration, can then be measured spectrophotometrically.
- the cells are incubated on 9-well plates in the presence of the agent to be tested for 2 h. 3 controls are performed: 100% living cells: cells without agents; 0% living cells: cells left in the open air; white: medium without cell.
- the cells are rinsed with RPMI medium without phenol red so that the color of the medium does not interfere with the absorbance measurements. They are then incubated for 4 h with 100 ⁇ l of RPMI solution supplemented with MTT (0.5 mg / ml). The medium is then removed, the addition of 100 .mu.l of DMSO makes it possible to solubilize the converted dye (formazan).
- delF508-CFTR protein addressing study is carried out in the laboratory by combining pharmacology, cell imaging, biochemical and electrophysiological assays on pulmonary human epithelial CF15 cells homozygous for delF508 deletion.
- results were normalized with respect to a reference treatment (treatment of cells with MPB-91 250 ⁇ M for 2 h) for which it is considered that one has 100% CFTR activity.
- the results obtained show that the treatment with the two forms R and S of roscovitine, CF15 cells for 2 h at 37 0 C restores an address of the delF508 protein and allows it to function as an ion carrier ( figure 1) .
- the delF508 protein In the absence of treatment of the cells, the delF508 protein is not membrane-bound and there is no efflux of iodide stimulated by the cocktail (Forskolin 10 ⁇ M, Genistein 30 ⁇ M).
- Cellular imaging shows that the delF508 protein was localized in the plasma membrane compartments after treatment with roscovitine.
- FIGS. 3A to 3C also illustrate the immunolocalization of delF508-CFTR after 2 hours of treatment with roscovitine or in the absence of treatment. This is a confocal visualization of CFTR-delF508 in CF15 cells with a mouse anti-CFTR monoclonal antibody. 'The CF15 cells treated for 24 h at 27 ° C were used as positive control ( Figure 3A).
- Figure 4A illustrates the activation of delF508-CFTR in CF15 cells after treatment with roscovitine.
- CF15 cells treated for 24 h at 27 ° C were used as a positive control and untreated CF15 cells as a negative control (37 ° C.).
- Figure 4B shows that the response to roscovitine depends on the incubation time. 100 ⁇ M roscovitine was used to treat CF15 cells. The cells were stimulated with 10 ⁇ M fsk + 30 ⁇ M gst.
- Figure 5A gives the dose-response results after 2 hours of treatment with roscovitine.
- FIG. 5B the pharmacological profiles of the CFTR channels in the CF15 cells are reported after 2 hours of incubation with 100 ⁇ M of roscovitine.
- FIG. 6A relates to the inhibition of the action of CFTR-Tl by the
- BFA Brefeldin A
- MG132 a proteasome inhibitor, which shows a competition between roscovitine and MG132.
- CFTR-Tl and can modulate the interaction between CFTR-Tl and calnéxine (calcium-dependent mechanism).
- roscovitine has been tested as a potential activator on Calu-3 cells. These results were obtained in efflux iodide on Calu-3 cells.
- CHO-WT cells were incubated for 2 h with different concentrations of inhibitors before undergoing the MTT cell viability test. The results show that the cells are viable for all concentrations of roscovitine. This molecule therefore does not exhibit cellular cytotoxicity.
- roscovitine corrects the defective targeting of the delF508-CFTR protein. Roscovitine treatment of CF cells must then interfere with the ability of the control machinery to interact with and Retain the delF508-CFTR protein in the endoplasmic reticulum via an inhibition of calnexin and chaperone molecules involved in the degradation pathway.
- the solution is formulated in ampoules of 2.5ml. Ampoules containing 5, 10 mg or 20 mg roscovitine are thus prepared.
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Abstract
L'invention a pour objet l'utilisation de dérivés de purines pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules, ces dérivés répondant à la formule (I): dans laquelle, - R2, R6 et R9, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'halogène, un radical R-NH-, R-NH-NH-, NH2-R'-NH- ou R-NH-R'-NH-, dans lequel R représente un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle, ou un hétérocycle, et R' un groupe alcoylène à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, ou un groupe arylène ou cycloalcoylène, R et R' renfermant chacun de 1 à 8 atomes de carbone, et étant substitués, le cas échéant, par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle, - R2 pouvant, en outre, représenter un hétérocycle portant, le cas échéant, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloaryle, ou un hétérocycle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle, - R9 pouvant, en outre, représenter un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle, - R2 et R9 pouvant représenter en outre un atome d'hydrogène, à l'exception de la 2-(2-hydroxyéthylamino)-6-benzylamino-9-méthylpurine.
Description
"UTILISATION DE DERIVES DE PURINES POUR LA FABRICATION DE
MEDICAMENTS POUR LE TRAITEMENT DE LA MUCOVISCIDOSE ET DE
MALADIES LIEES A UN DEFAUT D'ADRESSAGE DES PROTEINES DANS LES
CELLULES "
L'invention vise l'utilisation de dérivés de purines pour fabriquer des médicaments capables de restaurer l'adressage de protéines du réticulum endoplasmique vers les membranes plasmiques . Elle vise tout particulièrement le traitement de la mucoviscidose. La mucoviscidose (CF : Cystic Fibrosis) est la maladie génétique récessive, autosomique, létale., la plus répandue dans les populations européennes et nord américaines. Le- gène CF (locus 7q31) code pour la protéine trans-membranaire nommée CFTR (pour Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator)'. Des mutations du gène CF provoquent un transport anormal d'eau et d' électrolytes à travers les membranes cellulaires de divers organes comme les poumons, les glandes sudoripares, l'intestin et le pancréas exocrine. Bien qu'il existe plus de 1000 mutations de la protéine CFTR, la mutation la plus fréquente (70 % des patients) est la délétion d'une phénylalanine dans le domaine NBFl en position 508 (delF508) . La principale cause de mortalité des patients CF est liée à cette délétion et conduit à des infections ou à une insuffisance pulmonaire provoquées par une augmentation de la viscosité du mucus. Cette viscosité entraîne l'occlusion des voies respiratoires et favorise les infections par les bactéries opportunistes. Une aggravation est de plus constatée au niveau digestif et notamment pancréatique (patient pancréatique-insuffisant) . La protéine CFTR est une glycoprotéine de 1480 acides aminés, appartenant à la superfamille des transporteurs membranaires ABC. CFTR est un canal chlorure localisé dans la membrane plasmique apicale des cellules épithéliales pulmonaires chez les individus sains.
CFTR est responsable du transport trans-épithélial d'.eau et d1 électrolytes et permet chez un individu sain l'hydratation des voies aériennes pulmonaires.
Chez les patients CF, homozygotes pour la mutation
delF508, et plus généralement pour les mutations de classe II
(mutations produisant une protéine absente de la membrane cellulaire) , cette protéine est absente des membranes plasmiques du fait d'un mauvais adressage de la protéine qui est retenue dans le réticulum endoplasmique (RE) .
L'hydratation des voies aériennes pulmonaires n'est plus fonctionnelle dans ce cas. La délétion delF508 perturbe le repliement du domaine NBFl et empêche la maturation complète de la protéine qui est donc dégradée très tôt au cours de sa biosynthèse. Cependant, si la protéine delF508 atteint la membrane, elle fonctionne comme un canal chlorure.
Une des clés d'un traitement de cette maladie consiste donc en un ré-adressage de delF508 vers la membrane plasmique des cellules au niveau de laquelle l'activité de transport de delF508 peut être stimulée par des agonistes physiologiques.
De manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que des dérivés connus notamment pour leur effet anti- prolifératif étaient capables d'activer le CFTR sauvage et des formes mutées et de provoquer une re-localisation membranaire de la protéine delF508-CFTR restaurant ainsi sa capacité de transport trans-membranaire. De manière générale, ces dérivés sont capables de restaurer un défaut d'adressage des protéines dans les cellules.
De plus, ces dérivés présentent l'intérêt d'une innocuité élevée.
L'invention à donc pour but de fournir une nouvelle utilisation de ces dérivés pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d'adressage des protéines dans les cellules. ' Les dérivés, utilisés conformément à l'invention sont des purines substituées en positions 2, 6 et 9.
Des dérivés de ce type ont été décrits en tant qu' inhibiteurs de kinases .
De tels dérivés sont notamment décrits dans le brevet FR 95 14 237 et les brevets et demandes de brevets correspondant au PCT/FR96/01905, ou dans l'article de Vesely et al, 1994, Eur.J.Biochem. , 224,771-786 II, la 2- (2-hydroxyéthylamino) -6- benzylamino-9-méthylpurine, appelée communément olomoucine,
n'entrant pas dans le champ de l'invention.
Il s'agit notamment de dérivés répondant à la formule I
R€
dans laquelle,
- R2, R6 et R9, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'halogène, un radical R-NH-
R-NH-NH-, NH2-R' -NH- ou R-NH-R' -NH-, dans lequel R représente un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle, ou un hétérocycle, et R' un groupe alcoylène à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, ou un groupe arylène ou cycloalcoylène, R et R' renfermant chacun de 1 à 8 atomes de carbone, et étant .substitués, le cas échéant, par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle,
- R2 pouvant/ en outre, représenter un hétérocycle portant, le cas échéant, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloaryle, ou un hétérocycle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle,
- R9 pouvant, en outre, représenter un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle,
- R2 et R9 pouvant représenter en outre un atome d'hydrogène, à l'exception de l' olomoucine.
L'invention vise en ••particulier l'utilisation de dérivés de formule I ci-dessus, dans laquelle
R2 est choisi parmi les radicaux 3-hydroxypropylamino, 1- éthyl-2-hydroxyéthylamino, 5-hydroxypentylamino, 1-D,L hydroxyméthylpropylamino, aminoéthylamino, 2-bis
(hydroxyéthyl) amino, 2- hydroxypropylamino,
2-hydroxyéthylamino, chloro, R-hydroxyméthyl-pyrrolidinyl, benzylaminohydroxyéthyl, R,S-aminohydroxyhexyl, S amino-2- phénylhydroxyéthyl, R ' amino-3-phénylhydroxypropyl, R, S aminohydroxypentyl, R aminohydroxypropyl,
S aminohydroxypropyl, R(-) N-pyrrolidine hydroxyméthyl,
R9 est choisi parmi méthyl, isopropyl ou cyclopentyl, et
R6 est choisi parmi • i benzylamino, 3-iodo-benzylamino, ou isopenténylamino, lorsque R9 représente un radical isopropyle,
. cyclohexylamino, cyclométhylamino, ou 3- hydroxybenzylamino, lorsque R9 représente un radical méthyl, et . benzylamino, lorsque R9 représente un radical cyclopentyl.
Ces dérivés correspondent aux isomères optiques et aux mélanges racémiques, le cas échéant aux isomères géométriques. II s'agit plus particulièrement de la 2- (R, S) (l-éthyl-2- hydroxyéthylamino) -6-benzylamino-9-isopropylpurine ou de la 2- (R) - (l-éthyl-2-hydroxyéthylamino) -6-benzylamino-9- - isopropylpurine, ou encore de la 2-(S) - (l-éthyl-2- hydroxyéthylamino) -6-benzylamino-9-isopropylpurine.
Lesdits dérivés de purines, sont capables de restaurer l'adressage de la protéine CFTR vers les membranes plasmiques des cellules et constituent donc des composés de grand intérêt pour le traitement de pathologies liées à de tels problèmes de défaut d'adressage.
Comme illustré par les exemples, ils sont particulièrement efficaces pour provoquer la re-localisation membranaire de la protéine delF508-CFTR dans la mucoviscidose où cette protéine est retenue dans le réticulum endoplasmique, et de restaurer ainsi sa capacité de transport trans-membranaire.
Lors de l'élaboration des médicaments, les principes actifs, utilisés en quantités thérapeutiquement efficaces, sont mélangés avec les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour le mode d'administration choisi. Ces véhicules peuvent être solides ou liquides.
Ainsi pour une administration par voie orale, les médicaments préparés sous forme de gélules, comprimés, dragées, capsules, pilules, gouttes, sirops et analogues. De tels médicaments peuvent renfermer de 1 à 100 mg de principe actif par unité.
Pour l'administration par voie injectable (intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire) , les médicaments se présentent sous forme de solutions stériles ou stérilisables . Ils peuvent être également sous forme de suspensions ou d'émulsions.
Les médicaments de l'invention sont plus particulièrement administrés sous forme d'aérosols.
Les doses par unité de prise peuvent varier de 1 à 50 mg de principe actif. La posologie quotidienne est choisie de manière à obtenir une concentration finale d'au plus 100 μM en dérivé de purines dans le sang du patient traité.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront donnés dans les résultats rapportés ci-après afin d'illustrer l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 6, qui représentent : la figure 1 : l'effet de la roscovitine sur l'adressage
D
de delF508 dans les cellules CF15 (IA) ; sur l'activité de CFTR dans les cellules calu-3 (IB) ; sur l'adressage de CFTR dans les cellules Calu-3 (IC) ; la figure 2 : les résultats d'immunoprécipitation et d'analyse Western-Blot ; les figures 3A à 3C : l' immunolocalisation • de delF508- CFTR après 2 h de traitement ou sans traitement ; les figures 4A et 4B : l'activation de delF508 dans les cellules CF15 après traitement avec CFTR-Tl (CFTR-Tl désignant la roscovitine) et la réponse à la roscovitine en fonction du temps d' incubation ; les figures 5A et 5B : le pourcentage d'activation en fonction de la concentration en roscovitine et le profil pharmacologique des canaux CFTR dans les cellules CF15 après incubation avec de la roscovitine ; - la figure 6 : la compétition entre CFTR-Tl et la machinerie de la chaperonne du RE sur l'adressage de delF508-CFTR.
MATERIEL ET METHODES
Ml. Culture cellulaire
Cellules CHO-WT : Les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) sont des fibroblastes qui ont été transfectés avec le gène du CFTR sauvage (CFTR-WT) . Ces cellules vont donc surexprimer la protéine CFTR.
Milieu de culture : Milieu MEM alpha (GIBCO) + 7 % de sérum de veau fœtal + 0,5 % de pénicilline/streptomycine + 100 μM de méthotrexate (améthoptérine, Sigma) .
Cellules CF15 : Les cellules CF15 sont des cellules épithéliales humaines d'origine nasale qui expriment le gène ΔF508-CFTR.
Milieu de culture : Milieu DMEM + HAM F12 + 10 % de FCS +
0,6 % de pénicilline/streptomycine + facteurs de croissance
(insuline 5 μg/ml, transferrine 5 μg/ml, épinéphririe 5,5 μM, adénine 0,18 mM, EGF 10 ng/ml, T3 2 nM, hydrocortisone
1,1 μM) .
Cellules Calu-3 : Les cellules Calu-3 sont des cellules épithéliales humaines d'origine pulmonaire qui expriment le
gène du CFTR sauvage.
Milieu de culture : Milieu DMEM/F12 avec glutamax + 7 % de sérum de veau fœtal + 1 % de pénicilline/streptomycine.
M2. Iwmunomarquage L' immunomarquage permet de visualiser la localisation cellulaire de la protéine CFTR grâce à un anticorps (Ac) primaire anti-CFTR, puis un anticorps secondaire anti¬ anticorps primaire marqué au fluorophore Cy3.
Les cellules sont préalablement ensemencées sur des lamelles dans du milieu de culture approprié. 3 lavages au TBS (NaCl : 157 mM, Tris base : 20 μM, pH 7,4) de 5 min chacun sont effectués. Les cellules sont alors fixées par ajout de TBS-paraformaldéhyde (3 %) pendant 20 min. Après 3 lavages au TBS (5 min), les cellules sont incubées avec du TBS-triton 0,1 % (10 min) qui permet la formation de trous dans la membrane cellulaire, puis 3 lavages au TBS sont à nouveau effectués avant la mise en présence des cellules avec le TBS- BSA 0,5 %-saponine 0,05 % pendant 1 h. Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire anti-C terminal CFTR (2 μg/ml) pendant I h. 3 lavages au TBS-BSA-saponine de 5 min chacun sont réalisés avant l'incubation avec l'anticorps secondaire GAM-cy3 (1/400) pendant 1 h. Suite à 2 lavages au TBS de 5 min, les noyaux sont marqués par incubation au Topro3 (1/1000) pendant 5 min. Enfin, les lamelles peuvent être montées sur lame après 3 derniers lavages au TBS de 5 min. Les lames sont observées au microscope confocal (Bio-Rad) grâce à une excitation au laser aux longueurs d'onde appropriées. Afin de différencier le marquage entre Cy3 et Topro3 la couleur de fluorescence de Topro3 a été changée en bleu (couleur des noyaux) .
M3. Efflux de radiotraceurs
Les mesures de transport d'ions chlorure dans les cellules ont été réalisées à l'aide de la technique des efflux d'iodure radioactif (Becq et al., 1999 ; Dormer et al., 2001) . Le traceur (125I) est incorporé dans le milieu intracellulaire. Puis, la quantité de radiotraceur qui sort de la cellule est comptée après l'ajout de différents agents pharmacologiques. L' iodure ' est utilisé comme un traceur du transport d'ions
o
chlorure. 125I a de plus l'avantage d'avoir une courte durée de vie comparée à celle d'autres marqueurs comme 35Cl (1/2 vie respective : 30 jours et 300 000 ans) .
Les cellules sont mises en culture sur des plaques 24 puits dans un milieu adéquat. 2 rinçages avec du milieu d'efflux (NaCl : 136,6 mM, KCl : 5,4 πiM, KH2PO4 : 0,3 mM, NaH2PO4 : 0,3 mM, NaHCO3 : 4,2 mM, CaCl2 : 1,3 mM, MgCl2 : 0,5 mM, MgSO4 : 0,4 mM, HEPES : 10 mM, D-glucose : 5,6 mM) sont effectués afin d'éliminer les cellules mortes qui relarguent la radioactivité de façon anarchique. Puis, les cellules sont mises à incuber avec 500 μl de charge (1 μCi/ml de 125INa) pendant 30 min pour les CHO-WT ou 1 h pour les CF15 et Calu-3. L' iodure s'équilibre de part et d'autre de la membrane cellulaire. Le robot (MultiPROBE, Packard) réalise les étapes suivantes : le milieu de charge est rincé avec du milieu d'efflux pour éliminer la radioactivité extracellulaire. Le surnageant est collecté toutes les minutes dans des tubes à hémolyse et le milieu est remplacé par un volume équivalent (500 μl) . Les prélèvements des 3 premières minutes - ne subissent pas l'addition de drogue, ils permettent d'obtenir une ligne de base stable, caractérisant la sortie passive des ions I . Les 7 prélèvements suivants sont obtenus en présence de la molécule à tester. A la fin de l'expérience, les cellules sont lysées par ajout de 500 μl de NaOH (0,1 N) /0,1 % SDS (30 min), ainsi, la radioactivité restée à l'intérieur de la cellule peut être déterminée. La radioactivité présente dans les tubes à hémolyse est comptée en coups par minute (cpm) grâce à un compteur gamma (Cobra II, Packard) . Les résultats. en cpm sont exprimés sous forme de vitesse de sortie d'iodure radioactif' (R) d'après la formule suivante : R (min"1)=[In (125I ti) -In (125I t2) ] / (tχ-t2) avec 125I tx : cpm au temps ti ; 125I t2 :• cpm au temps t2. Ce flux d'iodure est représenté sous forme de courbe. Afin de quantifier la sortie d'iodure due à l'administration de la molécule testée, on calcule le flux relatif suivant qui permet de s'affranchir du flux de base : Vitesse relative (min"1) =Rpic-Rbasal. Enfin, ces résultats sont normalisés pour pouvoir comparer l'effet des différentes drogues entre elles. Les résultats sont présentés
sous la forme de moyenne +/- SEM. Le test statistique de Student est utilisé pour comparer l'effet des drogues aux contrôles (les valeurs correspondantes à P<0,01 sont considérées comme statistiquement significatives) . M4. Test de cytotox±c±té
Le test de toxicité au MTT est un test colorimétrique qui repose sur la capacité des déshydrogénases mitochondriales à métaboliser le MTT (sel de tétrazolium jaune) en formazan
(pourpre) . L'absorbance, proportionnelle à la concentration de colorant converti, peut être alors mesurée par spectrophotométrie. Les cellules sont mises à incuber sur des plaques 9β puits en présence de l'agent à tester pendant 2 h. 3 contrôles sont réalisés : 100 % cellules vivantes : cellules sans agent ; 0 % cellules vivantes : cellules laissées à l'air libre ; blanc : milieu sans cellule. Les cellules sont rincées avec du milieu RPMI sans rouge de phénol pour que la couleur du milieu n'interfère pas dans les mesures de 1 'absorbance. Puis, elles sont incubées pendant 4 h avec 100 μl de solution de RPMI supplémentée en MTT (0,5 mg/ml) . Le milieu est alors éliminé, l'ajout de 100 μl de DMSO permet de solubiliser le colorant converti (formazan) . L'absorbance est mesurée par spectrophotométrie à 570 nm (pourpre) ; 630 nm (bruit de fond) . Afin de s'affranchir du bruit de fond, le calcul suivant est effectué : DOréeiie=Dθ57onm-Dθ63θnm- Puis, les résultats sont normalisés par rapport aux contrôles (100 % et 0 % de cellules vivantes) et sont présentés sous forme de moyenne +/- SEM.
RESULTATS
Rl. Effet de la roscovit±ne sur l'adressage de delF508 dans les cellules CF15
L'étude de l'adressage de la protéine delF508-CFTR est réalisée au laboratoire en combinant des approches de pharmacologie, d'imagerie cellulaire, des tests biochimiques et électrophysiologiques sur des cellules CF15 épithéliales humaines pulmonaires homozygotes pour la délétion delF508.
Les résultats d' immunoprécipitation et d'analyse Western-Blot de CFTR non muté de cellules CHO de type sauvage et de cellules delF508 traitées 2 h avec 100 μM de composé
testé (figure 3C) ou de cellules non traitées (contrôle) . Les cellules CF15 traitées 24 h à 27° C (figure 3B) ou 2 h avec 10 μM de thapsigargin (TG) on été utilisées comme contrôle positif. - Pour chaque expérience, l'addition d'un cocktail (Forskoline 10 μM + Génistéine 30 μM) permet l'activation du CFTR quand celui-ci est localisé à la membrane. Ainsi, un efflux d'iodure pourra être observé si l'adressage de delF508 a été restauré. Les résultats, présentés sous forme d'histogramme ont été normalisés par rapport à un traitement de référence (traitement des cellules au MPB-91 250 μM pendant 2 h) pour lequel on considère qu'on a 100 % d'activité CFTR. Les résultats obtenus montrent que le traitement par les deux formes R et S de la roscovitine, des cellules CF15 pendant 2 h à 370C restaure un adressage de Ia^ protéine delF508 et permet à celui-ci de fonctionner en tant que transporteur ionique (figure 1) .
En l'absence de traitement des cellules, la protéine delF508 n'est pas membranaire et il n'y a pas d' efflux d'iodure stimulé par le cocktail (Forskoline 10 μM, Génistéine 30 μM) . L'EC50 (concentration de la molécule qui donne 50 % de l'efficacité maximale) de la roscovitine a été déterminé à 34 + 1,9 μM (R-Roscovitine, figure IA, C) et 32 ± 1,4 (S- Roscovitine, figure IB, C) (n=4, pour chaque condition) . L' imagerie cellulaire permet de montrer que la protéine delF508 a été localisée dans les compartiments membranaires plasmatiques après traitement par la roscovitine.
Les figures 3A à 3C illustrent également 1' immunolocalisation de delF508-CFTR après 2 h de traitement par la roscovitine ou en l'absence de traitement. Il s'agit d'une visualisation confocale de CFTR-delF508 dans des cellules CF15 avec un anticorps monoclonal anti-CFTR de souris.' Les cellules CF15 traitées 24 h à 27°C ont été utilisées comme témoin positif (figure 3A) . La figure 4A illustre l'activation de delF508-CFTR dans des cellules CF15 après traitement par la roscovitine.
Les efflux d' iodure ont été observés après 2 h d'incubation avec 100 μM de composé testé ou en l'absence de
traitement.
Les cellules CF15 traitées 24 h à 27°C ont été utilisées comme contrôle positif et les cellules CF15 non traitées comme contrôle négatif (370C) . La figure 4B montre que la réponse à la roscovitine dépend du temps d'incubation. 100 μM de roscovitine ont été utilisés pour traiter les cellules CF15. Les cellules ont été stimulées avec 10 μM fsk + 30 μM gst.
La figure 5A donne les résultats dose-réponse après 2 h de traitement avec la roscovitine. Dans la figure 5B, on rapporte les profils pharmacologique des canaux CFTR dans- les cellules CF15 après 2 h d'incubation avec 100 μM de roscovitine.
Ces résultats montrent qu' après traitement par la roscovitine, on observe : une maturation de delF508-CFTR (voir bande C qui apparaît dans le Western-Blot) après traitement par CFTR-Tl, une correction de la localisation de delF508-CFTR au niveau de la membrane plasmique, et une correction maximale de la fonction de canal chlorure de delF508-CFTR après 2 h de traitement.
La compétition entre CFTR-Tl et la machinerie de la chaperonne du RE est illustrée par les figures 6A et 6B. La figure 6A porte sur l'inhibition de l'action de CFTR-Tl par la
Brefeldine A (BFA) , inhibiteur du trafic vésiculaire ERGIC, ce qui montre que la roscovitine induit un réadressage de la protéine delF508-CFTR. La figure 6B montre qu'aucune modulation n'est observée en présence de MG132, un inhibiteur de protéasome, ce qui montre une compétition entre la roscovitine et MG132.
Le tableau ci-dessous donne un résumé d' expériences de compétition réalisées par la technique d' efflux d' iodure entre la roscovitine et la machinerie de la chaperone du RE.
- inhibition,**- P < 0.01, * P <0.1, ns P > 0.1 (Student's t- test
Ces résultats montrent que la roscovitine induit un réadressage de delF508-CFTR, inhibe la voie de dégradation de
CFTR-Tl et peut moduler l'interaction entre CFTR-Tl et la calnéxine (mécanisme calcium-dépendant) .
R2. Effet de la roscovitine sur l'activité de CFTR dans les cellules Calu-3
Afin de montrer que l'effet de la roscovitine est spécifique de l'adressage- du delF508 et n'altère pas les autres canaux chlorure, la roscovitine a été testée en tant qu' activateur potentiel sur des cellules Calu-3. Ces résultats ont été obtenus en efflux iodure sur cellules Calu-3. Les contrôles utilisés sont la forskoline (5 μM, n=8) et le MPB-91 (250 μM, n=8) la roscovitine (n=8) n'est pas un activateur du CFTR sauvage ni d'autres transports anioniques de ces cellules (pas de différence significative) .
R3. Effet de roscovitine sur l'adressage de CFTR dans les cellules Calu-3
Afin de montrer que l'effet de la roscovitine est spécifique de l'adressage du delF508, la roscovitine a été testée en tant que modulateur de l'adressage du CFTR sauvage sur des cellules Calu-3. Ces résultats ont été obtenus en efflux iodure sur cellules Calu-3 traitées 2 h par la roscovitine (100 μM) . L'activité CFTR dans cette condition expérimentale n'est pas significativement différente par rapport aux contrôles. Ces résultats démontrent que la roscovitine n'affecte pas la voie d'adressage du CFTR sauvage ou d'autres canaux chlorure, ni n'altère l'activité de CFTR dans les cellules épithéliales humaines pulmonaires non-CF.
R4. Cytotox±c±té de la roscovit±ne
Dans le but de tester la cytotoxicité de la roscovitine, des cellules CHO-WT ont été incubées 2 h avec différentes concentrations en inhibiteurs avant de subir le test de viabilité cellulaire au MTT. Les résultats montrent que les cellules sont viables pour toutes les concentrations de la roscovitine. Cette molécule ne présente donc pas de cytotoxicité cellulaire.
Les tests d'efflux ont révélé que la roscovitine permet une relocalisation membranaire de la protéine delF508-CFTR et représente donc t μn moyen pharmacologique de ré-adressage du delF508 dans une cellule épithéliale humaine pulmonaire.
Un traitement de 2 h par 100 μM de roscovitine entraîne l'apparition de la bande mature du CFTR (comme le montrent les techniques d' immunoprécipitation et de western-blot) indiquant que la roscovitine a permis la libération du RE, puis la maturation dans le Golgi de la protéine delF508-CFTR. Des expériences d' immunofluorescence ont confirmé qu'un traitement de 2h à 100 μM de roscovitine permettait la relocalisation membranaire de la protéine delF508-CFTR. Enfin, des expériences d'efflux d' iodure et de patch-clamp sur cellule entière ont mis en évidence la fonctionnalité de la protéine réadressée. Le traitement par la roscovitine présente une EC50 de 56 μM pour 2 h de traitement et permet un réadressage maximal après 2 h.
D'autre part, des expériences de compétition visant à déterminer le mécanisme d' action de la roscovitine ont permis de démontrer que la roscovitine entrait en compétition avec les inhibiteurs de la liaison calnexine/ delF508-CFTR ainsi qu' avec les inhibiteurs de la voie de dégradation
Ces différents résultats permettent de mettre en évidence que la roscovitine corrige le défaut d' adressage de la protéine delF508-CFTR. Un traitement par la roscovitine de cellules CF doit alors permettre d' interférer avec la capacité que possède la machinerie de contrôle d' interagir- et de
retenir la protéine delF508-CFTR dans le réticulum endoplasmique, ceci par l'intermédiaire d'une inhibition de la calnéxine et des molécules chaperonnes qui interviennent dans la voie de dégradation.
Exemple de formulation
On prépare une ' solution pour inhalation - avec un nébuliseur ampoule à partir de chlorure de sodium, de chlorure de calcium déshydraté et d'eau pour préparations injectables. La roscovitine est ajoutée comme ingrédient actif.
La solution est formulée dans des ampoules de 2,5ml. Des ampoules renfermant 5, 10 mg ou 20 mg roscovitine sont ainsi préparées.
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Claims
REVENDICATIONS
1/ Utilisation de dérivés de purines pour fabriquer des médicaments pour le traitement de la mucoviscidose et de maladies liées à un défaut d' adressage des protéines dans les cellules, ces dérivés répondant à la formule (I) :
dans laquelle,
- R2, Rβ et R9, identiques ou différents les uns des autres, représentent un atome d'halogène, un radical R-NH- , R-NH-NH-, NH2-R'-NH- ou R-NH-R' -NH-, dans lequel R représente un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle, ou un hétérocycle, et R' un groupe alcoylène à chaîne droite ou ramifiée., saturé ou insaturé, ou un groupe arylène ou cycloalcoylène, R et R' renfermant chacun de 1 à 8 atomes de carbone, et étant substitués, le cas échéant, par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle,
- R2 pouvant, en outre, représenter un hétérocycle portant, le cas échéant, un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloaryle,
ou un hétérocycle, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupes -OH, halogène, amino ou alkyle,
- R9 pouvant, en outre, représenter un radical alkyle à chaîne droite ou ramifiée, saturé ou insaturé, un radical aryle ou cycloalkyle,
- R2 et R9 pouvant représenter en outre un atome d'hydrogène, à l'exception de la 2- (2-hydroxyéthylamino) -6- benzylamino-9-méthylpurine.
2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits dérivés répondent à la formule (I) dans laquelle R2 est choisi parmi les radicaux 3-hydroxypropylamino, 1- éthyl-2-hydroxyéthylamino, 5-hydroxypentylamino-, 1-D,L hydroxyméthylpropylamino, aminoéthylamino, 2-bis (hydroxyéthyl) amino, 2- hydroxypropylamino, 2- hydroxyéthylamino, chloro, R-hydroxyméthyl-pyrrolidinyl, benzylarαinohydroxyéthyl, R, S-aminohydroxyhexyl, S amino-2- phénylhydroxyéthyl, R amino-3-phénylhydroxypropyl, R, S aminohydroxypentyl, R aminohydroxypropyl, S aminohydroxypropyl, R(-) N-pyrrolidine hydroxyméthyl,
R9 est choisi parmi méthyl, isopropyl ou cyclopentyl, et
R6 est choisi parmi benzylamino, 3-iodo-benzylamino, ou isopenténylamino, lorsque R9 représente un radical isopropyle,
. cyclohexylamino, cyclométhylamino, ou 3- hydroxybenzylamino, lorsque R9 représente un radical méthyl, et
. benzylamino, lorsque R9 représente un radical cyclopentyl.
3/ Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits dérivés correspondent aux isomères optiques et aux mélanges racémiques, le cas échéant aux isomères géométriques.
4/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lesdits dérivés sont choisis parmi
o
la 2- (R, S) (l-éthyl-2-hydroxyéthylamino) -β-benzylamino-9- isopropylpurine ou de la 2- (R) - (l-éthyl-2-hydroxyéthylamino) - β-benzylamino-9-isopropylpurine, ou encore de la 2-(S) (1- éthyl-2-hydroxyéthylamino) -6-benzylainino-9-isopropylpurine. 5/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications
1 à 4, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous formes de gélules', comprimés, dragées, capsules, gouttes ou sirops.
6/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration par voie injectable, sous forme de solution.
7/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications l à 4, caractérisée en ce que les médicaments sont préparés pour une administration sous forme d'aérosol.
8/ Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, pour le traitement de la mucoviscidose.
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