WO2006037569A1 - Protein assay of type eaac1 - Google Patents

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WO2006037569A1
WO2006037569A1 PCT/EP2005/010597 EP2005010597W WO2006037569A1 WO 2006037569 A1 WO2006037569 A1 WO 2006037569A1 EP 2005010597 W EP2005010597 W EP 2005010597W WO 2006037569 A1 WO2006037569 A1 WO 2006037569A1
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complex
medium
protein
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active substance
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PCT/EP2005/010597
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Natalie Watzke
Maarten Ruitenberg
Wolfgang Dörner
Renate Gauss
Béla KELETY
Robin Krause
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Iongate Biosciences Gmbh
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9406—Neurotransmitters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the invention relates to a type EAAC l protein assay and in particular to a method for identifying an active substance complex which modifies an enzymatic property of an active site complex which contains a type of an EAAC l protein.
  • the invention further relates to an active ingredient complex which is or has been identified according to the method according to the invention, a method for producing a medicament, a test kit for carrying out the method according to the invention, a screening method and the uses of the method according to the invention, the test kits according to the invention and of the medicament.
  • the murine protein EAAC 1 which is also referred to as excitatory amino acid carrier 1, is a transmembrane protein and the most frequently occurring neuronal glutamate transporter which mediates the reuptake of glutamate into the neurons and thus, together with other glial glutamate transporters, ensures the maintenance of a low extracellular glutamate concentration, which is necessary for the maintenance of the synaptic excitability of the neurons.
  • the glutamate is transported with cotransport of sodium cations and, if necessary, counter transport of potassium cations.
  • the type EAAC 1 protein may be native to homopentamers.
  • type EAAC l proteins and EAAC l are used interchangeably in order to express that all members of the protein family are meant, and in particular also the closely related human EAAT3 protein.
  • EAAC 1 means not only the murine protein, but also the other equivalents, and in particular the human equivalent EAAT3.
  • the EAAC 1 protein is integrated into a higher-level site of action. This can be an arrangement of several EAAC 1 units or protein molecules to form an oligomer. However, there may also be other, possibly enzymatic, components that are present in cooperation with the EAAC l protein. These can also be spatially spaced apart.
  • EAAC 1 protein is also expressed in the intestine and kidney of mice. EAAC 1 knockout mice show an increased aspartate and Urine glutamate levels. This transporter is therefore also generally associated with the amino acid metabolism and the excretion of amino acids. It is also discussed that this transporter may actively absorb pharmacologically active substances from the intestine or primary urine, thereby improving their bioavailability.
  • Type EAAC 1 proteins belong to the glutamate transporter family, which contains five subtypes. The subtypes differ in their location and their relationship between glutamate transport and glutamate-induced anion conductivity, ie. H. the channel function of the glutamate transporter. Apart from retina and cerebellum, where mainly tissue-specific transporters (EAAT5 or GLAST and EAAT4) can be found, in the rest of the brain GLT-I is the most common glial and EAAC I the most common neuronal glutamate transporter. In addition, EAAC 1 is additionally expressed in the kidney and intestine.
  • Glutamate is the most important excitatory neurotransmitter in the human central nervous system. It is stored in the presynaptic nerve endings in vesicles and released into the synaptic cleft when the stimulus is passed on. At the postsynaptic membrane, glutamate binds to receptors which, as ligand-controlled cation channels, lead to a depolarization of the postsynaptic nerve cell and thus to signal transmission. Glutamate transporters mediate the (re) uptake of glutamate in nerve cells and in neighboring glial cells. The rapid removal of the glutamate from the synaptic cleft due to active uptake and diffusion leads to the decay of excitation on the postsynaptic cell. Glutamate transporters are therefore essential for maintaining synaptic excitability.
  • the eukaryotic glutamate transporters are glycosylated proteins with a molecular weight of approx. 65 kDa (approx. 570 amino acids), see also FIG. 1. All topology models have in common the intracellular localization of the N-terminus, followed by the first 6 hydrophobic transmembrane domains presumably a-helical structure and a large extracellular loop between the third and fourth transmembrane domains. In contrast, the hydropathy plot and experiments with the labeling of certain amino acids of the C-terminal end are not clear, so that different structures with different numbers of further trans-membrane domains have been postulated. However, the sequence is around 150 C-terminal amino acids are strictly conserved in all subtypes and this area plays an important role both for the function and the subtypical properties of the glutamate transporters towards inhibitors.
  • Glutamate neurotoxicity in brain regions after ischemia is mainly caused by the reverse transport of neuronal glutamate transporters such as EAACl. Since neurons have a higher glutamate content than glial cells, they are more likely to run in reverse mode and thus contribute to an increase in extracellular glutamate concentration to cytotoxic levels in the synaptic cleft. Selective inhibitors for neuronal glutamate transporters such as EAACl can therefore be of therapeutic interest be to prevent glutamate transporters from “reverse transport mode” without influencing glial glutamate transporters in order to minimize the overall increase in the extracellular glutamate concentration.
  • TBOA DL-rhreo- ⁇ -benzyloxyaspartate. If glutamate uptake is inhibited in the CNS after release, this will probably not be without risks, since inhibitors for glutamate transporters can trigger seizures and convulsions. On the other On the one hand, the glutamate transporters are a complex family with 5 subtypes. It is possible that the selective inhibition of one or more members of the family can produce useful effects, e.g. B. cognitive enhancement can lead to low risks.
  • EAACl A database comparison of EAACl with known protein sequences shows that a family of highly conserved transport molecules occurs in a wide variety of vertebrates, to which EAACl belongs.
  • the corresponding amino acid sequence shows agreement in 383 out of 447 amino acids with the human EAAT3 protein [Arriza.J.L. et al. , "Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex.”, J. Neurosci. 14 (9), 5559-5569 (1994)].
  • Electrophysiological methods are also known, for example the so-called patch-clamp technique or voltage-clamp technique, in which, for example, cells are accessible to an electrophysiological examination in isolation.
  • patch-clamp technique or voltage-clamp technique
  • native cells are exposed to different conditions and certain electrical activities that are mediated across the cell membrane by proteins, protein complexes or the like contained therein are measured.
  • the invention is therefore based on the object of providing a type EAAC 1 protein assay in which rapid testing of the active substance, in particular in mass operation, is possible at a reasonable cost in a particularly simple and yet reliable manner.
  • the present invention furthermore relates to an active ingredient or active ingredient complex according to claim 20, a method for producing a medicament according to claim 21, a test kit for carrying out the method according to the invention according to claim 22, a screening method according to claim 23, and uses of the method, the test kit and the medicament according to claims 24, 25 and 26.
  • Advantageous further developments are the subject of the respective dependent subclaims.
  • the invention is based, inter alia, on the idea of the glutamate-dependent charge shift - that is to say the ion transport of the sodium cations, protons and / or potassium cations - directly by attaching enzyme preparations to a suitable surface which is integrated in a flow system and / or which can be used to measure a substrate jump, to measure as an electrical current or as an electrical potential change and to investigate the influence of various active substances on the electrical measured variables of current or potential.
  • the invention thus relates to a method for identifying an active ingredient complex which modifies an enzymatic property and / or the transport behavior of an active site complex which contains a type of an EAAC 1 protein or a part thereof.
  • the method according to the invention has the following steps: (a) providing a plurality of primary carriers which comprise the site of action complex containing the type EAAC1 protein, in particular in a plurality in the region of a membrane of the respective primary carrier,
  • step (h) Introducing the secondary carrier with the primary carriers into a third or activating measuring medium and detecting an electrical action according to or in the sense of process step (e), wherein the third or activating medium corresponds to the second or non-activating medium, but additionally contains a substrate of the type EAAC 1 protein.
  • Steps (f), (g), (h) according to the invention are carried out, preferably with repetitions, preferably in the specified order.
  • a medium with 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NaOH pH 7.2, mmol / 1 DTT can be used as the non-activating medium.
  • a medium with 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol / 1 DTT and 10 to 1000 ⁇ mol / 1 Na-glutamate can be used as the activating medium.
  • the potential active ingredient can be present in all media.
  • the potential active substance should be present in the activating medium, but not in the resting medium or in the non-activating medium.
  • a monomer or an oligomer of an EAAC1 protein is preferably used as the site of action complex or part thereof.
  • an active site complex or a part thereof will be used, which is based on a type EAAC 1 protein which originates from a tissue of a mammal, e.g. is derived from the brain, the intestine or the kidney, or from this.
  • the type EAAC1 protein comes from mammalian cell lines and is cloned.
  • the site of action complex comes from the organism pig, mouse, sheep or human or is derived genetically from these.
  • the expression “enzymatic property” of the type EAAC 1 protein always also means the transport behavior, for example the amino acid transport mediated by these proteins, and thus always refers to the one discussed at the beginning Influence of the protein on the bioavailability of potential active substances, which means that, wherever there is talk of modifying the enzymatic properties of the protein, tests according to the invention are also included, which are intended to show whether a certain substance of the EAAC type protein is transported.
  • All measuring solutions used contain a pH stabilizing agent known to the person skilled in the art, preferably selected from the list: MOPS, HE-PES, MES, Tris, PIPES and others. as e.g. are published in "Buffers, Calbiochem", but can also easily be found in other publications and textbooks on biochemistry or organic chemistry. According to the invention, these agents known per se should have a stabilizing effect in the range from pH 6-8, preferably about 7 The choice of the suitable pH range and agent can depend on the substrate (active ingredient complex) and can easily be determined by the expert through routine experiments.
  • the active ingredient complex or a part thereof can be transported directly to the location of the active site complex by injecting or admixing it into the measuring medium.
  • the respective measuring medium is simply exchanged, for example in a continuous manner.
  • the active substance is only released by chemical or physical conversion or reaction in the measuring medium. This can also be done, for example, by supplying radiation.
  • the qualitative influence and / or the quantitative influence of the potential active ingredient or active ingredient complex is determined by detecting an electrical action which is mediated by the active site complex or a part thereof and in particular by the type -EAACl protein.
  • this electrical action is determined with and without a potential active substance, and by comparing the two measurement series it is examined whether the potential active substance influences the enzymatic properties of the type EAAC 1 protein.
  • the primary carriers are brought into contact with the active site complexes on a secondary carrier, namely the biosensor electrode, and in particular with the insulation region thereof, and are attached there in particular.
  • biosensor electrode As a secondary carrier.
  • a biosensor electrode is used as the secondary carrier, in which an electrically conductive and solid-electrode region is provided with at least one electrode, which is electrically and mechanically insulated from the measuring medium and from the primary carriers by provision an insulation area in the form of a solid-supported membrane, which is built up in layers from an underlayer of an organic thio compound as the bottom layer and the layer facing the electrode, and from an upper layer of an amphiphilic organic compound.
  • a biosensor electrode is used as the secondary carrier, in which an electrode made of gold is provided in the electrode area with a monolayer of a long-chain alkane thiol as the lower layer thereon and a monolayer of a lipid as the upper layer thereon.
  • the primary carriers which are to contain the site of action complex and in particular the type EAAC 1 proteins in the region of their membrane, there are different possibilities, the respective objective of the method being able to be taken into account.
  • a eukaryotic cell for example, in accordance with a particularly advantageous embodiment of the method according to the invention, it is appropriate that a eukaryotic cell, a prokaryotic cell, in particular an oocyte, a bacterium, a virus, an organelle or components thereof, in particular membrane fragments, are used as primary carriers. or associations thereof in native form and / or in modified form, in particular in purified and / or modified form, is used.
  • a vesicle, a liposome or a micellar structure can be used as the primary carrier.
  • the membrane fragments can also accumulate planar, i.e. as a non-spherical structure.
  • the method according to the invention is particularly advantageous when the measuring medium flows around or against the measuring medium in a measuring space, measuring area or measuring vessel, comprising a biosensor electrode as a secondary carrier and attached primary carriers.
  • a change in concentration with regard to the active ingredient complex or a part thereof, for example, can be easily achieved by changing the measuring medium.
  • the measurement conditions according to the invention can also advantageously be set easily and reliably with high time resolution by such a measurement in the context of a flow system.
  • the method according to the invention can also advantageously be carried out with the aid of an automated pipetting device.
  • the method according to the invention is particularly economical and accessible for statistical evaluation if a plurality of tests are carried out in succession, in particular by successive tests. following exchange of the measuring medium, if necessary with intermediate washing or rinsing of the measuring room.
  • Potential active substances to be tested are particularly preferably monoclonal antibodies, antibody fragments, polyclonal antibodies and peptides. However, other substances which are suspected to have a corresponding effect can also be added. These substances are preferably administered in dissolved form.
  • Particularly preferred substances which can be examined as test substances in the test system according to the invention are low molecular weight compounds. Such compounds often have no or only minor side effects if they are used as an active principle in a pharmaceutical composition. Another advantage of such substances is the possibility of oral administration.
  • cyclic pentapeptides as described by Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 1 18, 7641-7472.
  • small peptides, amino acids and amino acid analogs, steroids, nucleotides and other organic chemical substances with a molecular weight of 5000 5000, preferably 3000 3000 and particularly preferably 2000 2000 are attributed to the low molecular weight substances.
  • the active substance complex can be added to or released in the resting medium, in the non-activating as well as in the activating medium.
  • washing step is carried out between steps (f) and (h) by introducing the secondary carrier with the primary carriers into a fourth and [washing medium, which is preferably identical to the non-activating medium.
  • step (f) it is conceivable for step (f) to be carried out repeatedly directly before step (h) in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention.
  • step (f) before the actual series of measurements i.e. before steps (g) and (h) are carried out for the first time, for at least 5 minutes (min), preferably for at least 10 min, particularly preferably for at least 15 min, even more preferably for at least 20 min and particularly preferably for at least 30 min is carried out.
  • steps (g) and (h) are carried out according to the invention for at least 0.5 seconds (sec), but at most 5 seconds and preferably for about 1-2 seconds.
  • step (f) is carried out for at least 1 sec to at most 120 sec, preferably for at least 30 sec to 90 sec, and particularly preferably for 50 sec to 70 sec.
  • the resting medium comprises potassium ions in concentrations which are preferably approximately as high as the sodium concentration in the non-activating and in the activating medium.
  • this concentration can be between 1 ⁇ mol / 1 and 1 mol / 1, preferably 10-200 mmol / 1, very particularly preferably between 120 mmol / 1 and 160 mmol / 1.
  • the non-activating medium contains sodium ions in concentrations which preferably correspond approximately to the concentrations of the potassium ions in the resting medium used in each case.
  • the activating medium contains sodium ions in concentrations which preferably correspond approximately to the concentrations of the potassium ions in the resting medium used in each case and / or in the non-activating medium.
  • the EAAC1 protein contains a substrate of the EAAC1 protein, preferably glutamate.
  • Other possible substrates are D- and L-aspartate.
  • the concentration can fluctuate depending on the application. Glutamate in the ⁇ mol / 1 range can be used in competition tests, for example 1 - 100 ⁇ mol / 1.
  • a concentration in the mmol / 1 range may also be expedient, that is to say about 0.1 to 10 mmol / 1, preferably about 1 mmol / 1.
  • non-activating and activating media are potassium free.
  • a concentration of up to 20 mmol / 1 potassium is acceptable and cannot be avoided if an automated pipetting device is used, since removal of the resting medium is not possible here.
  • Mg ++ is present in the measurement solutions according to the invention in a concentration of> 0-5 mmol / 1.
  • the present invention provides an active substance or an active substance complex which modifies an enzymatic property of a type, a type of an active site complex containing an EAAC1 protein or a part thereof and which identifies according to the method according to the invention for identifying an active substance complex is, will or has been.
  • the present invention also provides a method for producing a medicament, comprising the steps:
  • test kit for carrying out the method according to the invention for identifying an active ingredient complex.
  • This test kit features:
  • a screening method for identifying is also created, specifically for identifying:
  • the method according to the invention for identifying an active ingredient complex is used to find inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of an enzymatic property of an active site complex which contains a type EAAC 1 protein , and in particular a human EAAT3 protein.
  • test kit according to the invention is used according to the invention to find inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors.
  • the medicament is used according to the invention for the inhibition, partial or temporary inhibition, activation or other modulation of an active ingredient complex containing type EAAC 1 protein or a part thereof and in particular a human EAAT3 protein.
  • a z. B. aqueous measuring medium in which the primary carrier and the secondary carrier are arranged.
  • the electrode area is preferably largely electrically insulated from the measuring medium, the primary carriers and from the biological units.
  • the electrode area has e.g. at least one electrode.
  • this can itself be designed as a mechanically stable material area, in particular as a plate, as a wire and / or the like.
  • the electrode is essentially designed as a material layer deposited on the surface of the carrier. It can be an evaporated or sputtered layer of material.
  • the material layer for forming the electrode preferably has a layer thickness of approximately 10 to 200 nm.
  • the type EAAC 1 protein can each be provided in an essentially native form and / or in a modified, in particular purified, microbiological and / or molecular biological modified form.
  • certain native properties can be tested and pharmacologically examined.
  • molecular biological or genetically initiated changes also lend themselves to analyzing certain aspects, for example the transport or the pharmacological mode of action of an active ingredient. It is particularly advantageous that primary carriers of an essentially uniform type of primary carriers are provided. This is important with regard to the clearest possible statement and analysis of an active ingredient test and relates to the geometric, physical, chemical, biological and molecular biological properties of the primary carriers.
  • site of action complexes and type EAAC 1 proteins of an essentially uniform type are provided, in particular with regard to their geometric, physical, chemical, biological and molecular biological properties.
  • biological units should advantageously be approximately uniform with regard to their orientation and / or with regard to their activability with respect to the respective primary carrier.
  • the invention is based, inter alia, on the object of making the effect of substances on the function of type EAAC 1 proteins accessible for investigation.
  • Substances that modulate the action of this transport protein are of commercial interest as potential neuroprotective agents.
  • substrates of the protein that are transported by it might be important new molecules.
  • the measurement of the enzyme activity according to the method proposed according to the invention does not require any mediators or labeled substrates.
  • An individual measurement only takes a few seconds.
  • the measurement is sensitive to all substrates. If a substance does not irreversibly inhibit the reaction, several measurements can be carried out with a sensor loaded with enzyme. Substrates do not have to be chemically modified, since the current response or potential response of the protein is induced by a quick change of solution.
  • the capacity of the protein-loaded membranes was approx. 1000 nF cm “2
  • the conductivity G 18 was approx. 10 nS cm “ 2 .
  • the flow cell of a SurfE 2 R system (IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) with an integrated protein-loaded sensor chip was first flushed with a resting medium (see above). This was followed by the non-activating medium (140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NaOH pH 7, 2 mmol / 1 DTT) and the activating medium was then applied using an electromechanical 3/2-way valve (140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol / 1 DTT + 10-1000 ⁇ M Na-glutamate).
  • the non-activating medium 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol / 1 DTT
  • Figure 1 shows schematically the topology of one type of EAACl unit.
  • FIG. 2 schematically shows in the form of a graph the transport current I (t) caused by the EAAC 1 protein as an electrical action which can be measured by the biosensor electrode.
  • the ordinate thus designates the measured electrical current I (t) as a function of time t, which is measured via the biosensor electrode.
  • With glutamate transport 12 ions are moved via the primary carrier 10, for example via membrane fragments or vesicles, protons onto the biosensor membrane and its electrode by means of the EAAC 1 protein. This can be seen from the positive electrical measuring current I (t).
  • Fundamental advantages of the present invention are the high mechanical stability of the sensor arrangement provided and, along with this, the great operational readiness, the simple handling and the low susceptibility to malfunction.
  • the use of the sensor arrangement results in a long lifespan, a high degree of reliability, a low susceptibility to faults and, in particular, a significantly increased test throughput compared to conventional methods, as a result of which pharmacological active ingredient tests can be carried out, so that corresponding test methods can be developed and carried out cost-effectively.

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Abstract

The invention relates to a method for identifying an active substance, which modifies an enzymatic characteristic of the EAAC1 protein. According to said method, primary carriers containing the EAAC1 protein in the vicinity of their membranes are provided. The primary carriers are adsorbed on the surface of a biosensor electrode that acts as a secondary carrier. A potential active substance is prepared and is reacted with the EAAC1 protein. The qualitative and/or quantitative influence of the potential active substance is determined by the detection of the electric action of the EAAC1 protein or a modification of said action by means of the biosensor electrode that acts as a secondary carrier, e.g. using an electric current measurement or voltage measurement.

Description

Typ-EAACl-Protein-Assay Type EAACl protein assay
Die Erfindung betrifft einen Typ-EAAC l -Protein -Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzymati- sche Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, der einen Typ eines EAAC l -Proteins enthält.The invention relates to a type EAAC l protein assay and in particular to a method for identifying an active substance complex which modifies an enzymatic property of an active site complex which contains a type of an EAAC l protein.
Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfin¬ dungsgemäßen Verfahren identifiziert ist oder wurde, ein Verfahren zum Her¬ stellen eines Arzneimittels, einen Testkit zum Durchführen des erfindungsge¬ mäßen Verfahrens, ein Screeningverfahren sowie die Verwendungen des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens, des erfindungsgemäßen Testkits sowie des Arz¬ neimittels.The invention further relates to an active ingredient complex which is or has been identified according to the method according to the invention, a method for producing a medicament, a test kit for carrying out the method according to the invention, a screening method and the uses of the method according to the invention, the test kits according to the invention and of the medicament.
Das murine Protein EAAC l , das auch als exzitatorischer Aminosäuretranspor¬ ter 1 (excitatory amino acid carrier 1 ) bezeichnet wird, ist ein Trans¬ membranprotein und der am häufigsten auftretende neuronale Glutamat- transporter, welcher die Wiederaufnahme von Glutamat in die Neuronen ver¬ mittelt und so zusammen mit anderen glialen Glutamattransportern für die Aufrechterhaltung einer geringen extrazellulären Glutamatkonzentration sorgt, die für die Aufrechterhaltung der synaptischen Erregbarkeit der Neuronen notwendig ist. Der Glutamattransport erfolgt unter Cotransport von Natrium¬ kationen und ggf. Gegentransport von Kaliumkationen. Das Typ-EAAC l - Protein liegt möglicherweise nativ als Homopentamer vor. Erfindungsgemäß wird synonym von Typ-EAAC l -Proteinen und vom EAAC l gesprochen, um zum Ausdruck zu bringen, daß alle Mitglieder der Proteinfamilie gemeint sind, und insbesondere auch das nahe verwandte humane EAAT3-Protein. Mit EAAC l ist erfindungsgemäß also nicht nur das murine Protein, sondern auch die ande¬ ren Äquivalente, und insbesondere das humane Äquivalent EAAT3 gemeint.The murine protein EAAC 1, which is also referred to as excitatory amino acid carrier 1, is a transmembrane protein and the most frequently occurring neuronal glutamate transporter which mediates the reuptake of glutamate into the neurons and thus, together with other glial glutamate transporters, ensures the maintenance of a low extracellular glutamate concentration, which is necessary for the maintenance of the synaptic excitability of the neurons. The glutamate is transported with cotransport of sodium cations and, if necessary, counter transport of potassium cations. The type EAAC 1 protein may be native to homopentamers. According to the invention, type EAAC l proteins and EAAC l are used interchangeably in order to express that all members of the protein family are meant, and in particular also the closely related human EAAT3 protein. According to the invention, EAAC 1 means not only the murine protein, but also the other equivalents, and in particular the human equivalent EAAT3.
Gegebenenfalls ist das EAAC l -Protein in einen übergeordneten Wirkortkom¬ plex integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer EAAC l -Einheiten oder - Proteinmoleküle zu einem Oligomer sein. Es können aber auch andere, ggf. enzymatische Komponenten vorhanden sein, die in Kooperation mit dem EAAC l -Protein vorliegen. Diese können auch räumlich beabstandet vorliegen.If appropriate, the EAAC 1 protein is integrated into a higher-level site of action. This can be an arrangement of several EAAC 1 units or protein molecules to form an oligomer. However, there may also be other, possibly enzymatic, components that are present in cooperation with the EAAC l protein. These can also be spatially spaced apart.
Weiterhin wird das Typ-EAAC l -Protein auch im Darm und der Niere von Mäu¬ sen exprimiert. EAAC l -Knockout-Mäuse zeigen einen erhöhten Aspartat- und Glutamat-Spiegel im Urin. Damit ist dieser Transporter auch ganz allgemein verbunden mit dem Aminosäurestoffwechsel und der Ausscheidung von Ami¬ nosäuren. Es wird auch diskutiert, dass dieser Transporter möglicherweise pharmakologisch aktive Wirkstoffe aktiv aus dem Darm oder dem Primärharn resorbiert und damit deren Bioverfügbarkeit verbessert.Furthermore, the type EAAC 1 protein is also expressed in the intestine and kidney of mice. EAAC 1 knockout mice show an increased aspartate and Urine glutamate levels. This transporter is therefore also generally associated with the amino acid metabolism and the excretion of amino acids. It is also discussed that this transporter may actively absorb pharmacologically active substances from the intestine or primary urine, thereby improving their bioavailability.
Typ-EAAC l -Proteine gehören zur Glutamattransporterfamilie, die fünf Subty¬ pen enthält. Die Subtypen unterscheiden sich in ihrer Lokalisation und ihrem Verhältnis zwischen Glutamattransport und glutamatinduzierter Anionenleit- fähigkeit, d. h. der Kanalfunktion der Glutamattransporter. Abgesehen von Re¬ tina und Kleinhirn, wo hauptsächlich gewebespezifische Transporter (EAAT5 bzw. GLAST und EAAT4) zu finden sind, ist im übrigen Gehirn GLT- I der häu¬ figste gliale und EAAC l der häufigste neuronale Glutamattransporter. Außer¬ dem ist EAAC l zusätzlich in Niere und Darm exprimiert.Type EAAC 1 proteins belong to the glutamate transporter family, which contains five subtypes. The subtypes differ in their location and their relationship between glutamate transport and glutamate-induced anion conductivity, ie. H. the channel function of the glutamate transporter. Apart from retina and cerebellum, where mainly tissue-specific transporters (EAAT5 or GLAST and EAAT4) can be found, in the rest of the brain GLT-I is the most common glial and EAAC I the most common neuronal glutamate transporter. In addition, EAAC 1 is additionally expressed in the kidney and intestine.
Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im menschlichen zentralen Nervensystem. Es wird in der präsynaptischen Nervenendigung in Vesikeln gespeichert und bei der Reizweiterleitung in den synaptischen Spalt ausgeschüttet. An der postsynaptischen Membran bindet Glutamat an Rezep¬ toren, die als ligandengesteuerte Kationenkanäle zu einer Depolarisierung der postsynaptischen Nervenzelle und damit zur Signalübertragung führen. Glu¬ tamattransporter vermitteln die (Wieder-) Aufnahme von Glutamat in Nerven¬ zellen sowie in benachbarte Gliazellen. Die rasche Entfernung des Glutamats aus dem synaptischen Spalt aufgrund von aktiver Aufnahme und Diffusion führt zum Abklingen der Erregung an der postsynaptischen Zelle. Glutamat¬ transporter sind daher essentiell für die Aufrechterhaltung synaptischer Er¬ regbarkeit.Glutamate is the most important excitatory neurotransmitter in the human central nervous system. It is stored in the presynaptic nerve endings in vesicles and released into the synaptic cleft when the stimulus is passed on. At the postsynaptic membrane, glutamate binds to receptors which, as ligand-controlled cation channels, lead to a depolarization of the postsynaptic nerve cell and thus to signal transmission. Glutamate transporters mediate the (re) uptake of glutamate in nerve cells and in neighboring glial cells. The rapid removal of the glutamate from the synaptic cleft due to active uptake and diffusion leads to the decay of excitation on the postsynaptic cell. Glutamate transporters are therefore essential for maintaining synaptic excitability.
Bei den eukaryotischen Glutamattransportern handelt es sich um glykosylierte Proteine mit einem Molekulargewicht von ca. 65 kDa (ca. 570 Aminosäuren), siehe auch Fig. 1. Allen Topologiemodellen gemeinsam ist die intrazelluläre Lokalisation des N-Terminus, die anschließenden ersten 6 hydrophoben Transmembrandomänen mit vermutlich a-helikaler Struktur und eine große extrazelluläre Schleife zwischen der dritten und vierten Transmembran¬ domäne. Im Gegensatz dazu ist der Hydropathieplot sowie Versuche mit Mar¬ kierung bestimmter Aminosäuren des C-terminalen Endes nicht eindeutig, so- dass verschiedene Strukturen mit unterschiedlicher Anzahl an weiteren Trans¬ membrandomänen postuliert wurden. Allerdings ist die Sequenz der ca. 150 C-terminalen Aminosäuren in allen Subtypen streng konserviert und dieser Bereich spielt eine wichtige Rolle sowohl für die Funktion als auch die subty¬ pischen Eigenschaften der Glutamattransporter gegenüber Inhibitoren.The eukaryotic glutamate transporters are glycosylated proteins with a molecular weight of approx. 65 kDa (approx. 570 amino acids), see also FIG. 1. All topology models have in common the intracellular localization of the N-terminus, followed by the first 6 hydrophobic transmembrane domains presumably a-helical structure and a large extracellular loop between the third and fourth transmembrane domains. In contrast, the hydropathy plot and experiments with the labeling of certain amino acids of the C-terminal end are not clear, so that different structures with different numbers of further trans-membrane domains have been postulated. However, the sequence is around 150 C-terminal amino acids are strictly conserved in all subtypes and this area plays an important role both for the function and the subtypical properties of the glutamate transporters towards inhibitors.
Als Quartärstruktur von Glutamattransportern wurde für Typ-EAAC l -Proteine mit Hilfe von Elektronenmikroskopie an Gefrierbruchflächen von Xenopus Oo¬ zyten Membranen ein Homopentamer nachgewiesen, das eine pyramidenartige Struktur mit einer zentralen Kanal-artigen Aushöhlung zeigte. Dabei wird vermutet, dass die einzelnen Untereinheiten für den Glutamattransport ver¬ antwortlich sind, während der zentrale Kanal mit der Anionenleitfähigkeit as¬ soziiert ist.As the quaternary structure of glutamate transporters, a homopentamer was found for type EAAC 1 proteins with the aid of electron microscopy on freeze fracture surfaces of Xenopus oocyte membranes, which showed a pyramid-like structure with a central channel-like cavity. It is assumed that the individual subunits are responsible for the glutamate transport, while the central channel is associated with the anion conductivity.
Unter pathophysiologischen Bedingungen wie Ischämie können die extra- und intrazelluläre Protonenkonzentration auf Werte von = 6 μmol/1 ansteigen. Da¬ mit nimmt die Wahrscheinlichkeit zu, dass die Protonenbindungsstelle. auf der zytosolischen Seite von EAACl , die einen pK-Wert von ≤ 6,5 aufweist; proto- niert ist und EAACl den Auswärtstransport von Glutamat katalysiert. Bei ei¬ ner künstlich induzierten Energieunterversorgung konnte bereits nachge¬ wiesen werden, dass ein großer Teil des extrazellulären Glutamats im synapti¬ schen Spalt aus dem Auswärtstransport von Glutamattransportern stammt. D.h. die Inhibition der Glutamattransporter unter ischämischen Bedingungen hätte neuroprotektive Wirkung.Under pathophysiological conditions such as ischemia, the extra- and intracellular proton concentration can rise to values of = 6 μmol / 1. This increases the probability that the proton binding site. on the cytosolic side of EAACl, which has a pK value of ≤ 6.5; is protonated and EAACl catalyzes the outward transport of glutamate. In the case of an artificially induced undersupply of energy, it has already been demonstrated that a large part of the extracellular glutamate in the synaptic gap originates from the external transport of glutamate transporters. I.e. inhibiting the glutamate transporters under ischemic conditions would have a neuroprotective effect.
Glutamatneurotoxizität in Gehirnregionen nach Ischämie wird hauptsächlich durch den reversen Transport von neuronalen Glutamattransportern wie EAACl verursacht. Da Neuronen einen höheren Glutamatgehalt haben als GIi- azellen, können sie mit einer höheren Wahrscheinlichkeit im „reverse mode" laufen und damit zum Anstieg der extrazellulären Glutamatkonzentration zu zytotoxischen Levels im synaptischen Spalt beitragen. Selektive Inhibitoren für neuronale Glutamattransporter wie EAACl können daher von therapeutischen Interesse sein, Glutamattransporter am „reverse transport mode" zu hindern, ohne damit gliale Glutamattransporter zu beeinflussen, um insgesamt den An¬ stieg der extrazellulären Glutamatkonzentration zu minimieren.Glutamate neurotoxicity in brain regions after ischemia is mainly caused by the reverse transport of neuronal glutamate transporters such as EAACl. Since neurons have a higher glutamate content than glial cells, they are more likely to run in reverse mode and thus contribute to an increase in extracellular glutamate concentration to cytotoxic levels in the synaptic cleft. Selective inhibitors for neuronal glutamate transporters such as EAACl can therefore be of therapeutic interest be to prevent glutamate transporters from “reverse transport mode” without influencing glial glutamate transporters in order to minimize the overall increase in the extracellular glutamate concentration.
Für EAACl gibt es einen spezifischen Inhibitor, TBOA = DL-rhreo-α- Benzyloxyaspartat. Wird die Glutamataufnahme nach Freisetzung im ZNS in¬ hibiert, wird dies wahrscheinlich nicht ohne Risiken sein, da Inhibitoren für Glutamattransporter Anfälle und Krämpfe auslösen können. Auf der anderen Seite sind die Glutamattransporter eine komplexe Familie mit 5 Subtypen. Es ist möglich, dass die selektive Inhibition eines oder mehrerer Mitglieder der Familie zu nützlichen Effekten, z. B. kognitive Verstärkung, mit geringen Ri¬ siken führen kann.There is a specific inhibitor for EAACl, TBOA = DL-rhreo-α-benzyloxyaspartate. If glutamate uptake is inhibited in the CNS after release, this will probably not be without risks, since inhibitors for glutamate transporters can trigger seizures and convulsions. On the other On the one hand, the glutamate transporters are a complex family with 5 subtypes. It is possible that the selective inhibition of one or more members of the family can produce useful effects, e.g. B. cognitive enhancement can lead to low risks.
Ein Datenbankabgleich von EAACl mit bekannten Proteinsequenzen zeigt, dass eine Familie hochkonservierter Transportmoleküle in den unterschied¬ lichsten Vertebraten vorkommt, zu der EAACl zählt. Beispielsweise zeigt die entsprechende Aminosäuresequenz eine Übereinstimmung bei 383 von 447 Aminosäuren mit dem humanen EAAT3-Protein [Arriza.J.L. et al. , „Functional comparisons of three glutamate transporter Subtypes cloned from human mo- tor cortex.", J. Neurosci. 14 (9), 5559-5569 ( 1994)].A database comparison of EAACl with known protein sequences shows that a family of highly conserved transport molecules occurs in a wide variety of vertebrates, to which EAACl belongs. For example, the corresponding amino acid sequence shows agreement in 383 out of 447 amino acids with the human EAAT3 protein [Arriza.J.L. et al. , "Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex.", J. Neurosci. 14 (9), 5559-5569 (1994)].
Es sind aus einer großen Vielzahl weiterer Wirbeltiere ähnliche Proteine be¬ kannt, denen ähnliche Funktionen zugeordnet werden.Similar proteins are known from a large number of other vertebrates, to which similar functions are assigned.
Die Kenntnis der Möglichkeiten der Beeinflussung der Funktion und der Akti¬ vität von Typ-EAAC l -Proteinen kann daher bei der Erkennung, Linderung und Heilung pathologischer Zustände und Krankheiten von großem Nutzen sein. Eine genaue Kenntnis der stofflichen und energetischen Bedingungen ist also wünschenswert, um regulierende Maßnahmen für die Steuerung des Gluta- mattransports durch EAACl bzw. den extrem nahe verwandten humanen Transportern wie z.B. EAAT3 auffinden zu können, und es wurden bereits ver¬ schiedene Untersuchungs- und Testmöglichkeiten ersonnen, um das Problem des Auffindens geeigneter Wirkstoffe wie Inhibitoren, Aktivatoren oder weite¬ ren Modulatoren für Typ-EAACl -Proteine und den damit im Zusammenhang stehenden Wirkortkomplex zu lösen.Knowing the possibilities of influencing the function and the activity of type EAAC 1 proteins can therefore be of great use in the detection, relief and healing of pathological conditions and diseases. A precise knowledge of the material and energetic conditions is therefore desirable in order to take regulatory measures for the control of glutamate transport by EAACl or the extremely closely related human transporters such as e.g. To be able to find EAAT3, and various investigation and test options have already been devised in order to solve the problem of finding suitable active substances such as inhibitors, activators or further modulators for type EAAC1 proteins and the associated site complex.
Entsprechend sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Messeinrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirkstoffe quantitativ und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.Accordingly, different methods and measuring devices are known in the prior art with which properties of certain active substances can be analyzed and described quantitatively and qualitatively.
Auch ist es wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirk¬ ortkomplex zu applizieren, z.B. am EAACl -Protein, an einer Zelle, einem Ge¬ webe oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflus¬ sen und/oder zu untersuchen. Übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komplexität der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschränkte Aussagekraft.It is also desirable to apply specified and known active substances to the active site complex, for example to the EAAC1 protein, to a cell, a tissue or the like, in order to influence and / or to investigate the functioning of this active site. Conventional experiments on the whole organism are often questionable due to the complexity of the organisms and, furthermore, due to ethical and moral circumstances, and the results obtained are only of limited significance.
Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Ein¬ heiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise ei¬ ner Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum Beispiel Techniken be¬ kannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbei¬ ten und sich ändernde Transport- und/ oder Bindungsspezifitäten ausnutzen und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfälligkeit zukommen.Consequently, methods and devices were developed with the help of which an isolated view of the mode of action of the active substances to be tested on isolated active centers or an investigation of the active centers themselves is possible. Certain tissues, isolated cells and / or other biological units, for example proteins or the like, are made accessible for viewing in an isolated manner. For example, techniques are known which work using dyes or radioactive substances and which utilize and represent changing transport and / or binding specificities. If this procedure is possible at all, it is disadvantageous in that it often has only a low resolution and a high susceptibility to errors.
Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.Such methods are often relatively insensitive.
Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp-Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektrophysiologischen Untersuchung zu¬ gänglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.Electrophysiological methods are also known, for example the so-called patch-clamp technique or voltage-clamp technique, in which, for example, cells are accessible to an electrophysiological examination in isolation. In this procedure, native cells are exposed to different conditions and certain electrical activities that are mediated across the cell membrane by proteins, protein complexes or the like contained therein are measured.
Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekannten elektro¬ physiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit für einen schnellen, automatisierbaren und/ oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel nativen Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile auf¬ weisen. Darüberhinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.Despite the high accuracy that can be achieved, these known electrophysiological methods are disadvantageous in that they are unsuitable for fast, automatable and / or wide use due to their high metrological complexity and their susceptibility to faults, and because of the generally native environment of the objects to be examined have certain problems in the discrimination of undesired signal components. In addition, these methods are very expensive.
Ein besonders günstiges Verfahren zum Messen von elektrochemischen Vor¬ gängen an beispielsweise Membranfragmenten wird in der WO 02/ 074983 be¬ schrieben, auf die für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung vollinhaltlich Bezug genommen wird. Eine Verwendung des dort offenbarten Verfahrens zur Testung an Typ-EAACl -Proteinen wird nicht offenbart.A particularly favorable method for measuring electrochemical processes on membrane fragments, for example, is described in WO 02/074983, the content of which is complete for the purposes of the present application Reference is made. The use of the method disclosed there for testing on type EAAC1 proteins is not disclosed.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-EAAC l -Protein - Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuver¬ lässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftestung, insbesondere im Massen¬ betrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.The invention is therefore based on the object of providing a type EAAC 1 protein assay in which rapid testing of the active substance, in particular in mass operation, is possible at a reasonable cost in a particularly simple and yet reliable manner.
Gelöst wird diese und weitere Aufgaben, die sich zwanglos aus dem eingangs diskutierten Stand der Technik ergeben, durch ein Verfahren zum Identifizie¬ ren eines Wirkstoffkomplexes mit allen Merkmalen des Anspruchs 1.These and other tasks, which result from the prior art discussed at the outset, are solved by a method for identifying an active substance complex with all the features of claim 1.
Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex gemäß Anspruch 20, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels gemäß Anspruch 21 , ein Testkit zur Durchführung des erfin¬ dungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 22, ein Screeningverfahren gemäß Anspruch 23 , sowie Verwendungen des Verfahrens, des Testkits sowie des Arzneimittels gemäß den Ansprüchen 24, 25 bzw. 26. Vorteilhafte Weiterbil¬ dungen sind Gegenstand der jeweiligen abhängigen Unteransprüche.The present invention furthermore relates to an active ingredient or active ingredient complex according to claim 20, a method for producing a medicament according to claim 21, a test kit for carrying out the method according to the invention according to claim 22, a screening method according to claim 23, and uses of the method, the test kit and the medicament according to claims 24, 25 and 26. Advantageous further developments are the subject of the respective dependent subclaims.
Im Transportzyklus von EAAC l werden Natriumkationen und /oder Protonen zusammen mit Glutamat über die Membran verschoben und gegen ein Kali¬ umkation ausgetauscht. Der Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grun¬ de, die glutamatabhängige Ladungsverschiebung - also den Ionentransport der Natriumkationen, Protonen und/ oder Kaliumkationen - direkt durch Anbin¬ dung von Enzympräparationen auf einer geeigneten Oberfläche, die in ein Durchflusssystem integriert ist und/ oder bei der ein Substratsprung durchge¬ führt werden kann, als elektrischen Strom oder als elektrische Potentialände¬ rung zu messen und den Einfluss verschiedener Wirksubstanzen auf die elekt¬ rischen Messgrößen Strom oder Potenzial zu untersuchen.In the transport cycle of EAAC 1, sodium cations and / or protons together with glutamate are shifted across the membrane and exchanged for a potassium cation. The invention is based, inter alia, on the idea of the glutamate-dependent charge shift - that is to say the ion transport of the sodium cations, protons and / or potassium cations - directly by attaching enzyme preparations to a suitable surface which is integrated in a flow system and / or which can be used to measure a substrate jump, to measure as an electrical current or as an electrical potential change and to investigate the influence of various active substances on the electrical measured variables of current or potential.
Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoff¬ komplexes, welcher eine enzymatische Eigenschaft und/ oder das Transport¬ verhalten eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines EAAC l -Proteins oder eines Teils davon enthält, modifiziert. Das erfindungsgemäße Verfahren weist folgende Schritte auf: (a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-EAACl Protein umfassen, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträgers enthal¬ ten,The invention thus relates to a method for identifying an active ingredient complex which modifies an enzymatic property and / or the transport behavior of an active site complex which contains a type of an EAAC 1 protein or a part thereof. The method according to the invention has the following steps: (a) providing a plurality of primary carriers which comprise the site of action complex containing the type EAAC1 protein, in particular in a plurality in the region of a membrane of the respective primary carrier,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflä¬ chenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger be¬ vorzugt gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,(b) attaching or bringing the primary carriers into contact with or in the surface area of an insulation region of a biosensor electrode serving as secondary carrier in a measuring medium, the secondary carrier preferably being mechanically and electrically insulated from the measuring medium and from the primary carriers by means of the insulation region or will,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,(c) providing at least one potential active ingredient complex,
(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträ¬ ger oder Teilen davon, und(d) bringing the potential active substance complex into contact and in particular interaction with the active substance complex of the primary carriers or parts thereof, and
(e) Bestimmen des qualitativen und/ oder quantitativen Einflusses des po¬ tenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detek- tieren einer elektrischen Aktion des oder am Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder eine Änderung dieser elektrischen Aktion über die Bio¬ sensorelektrode als Sekundärträger,(e) determining the qualitative and / or quantitative influence of the potential active substance complex or a part thereof on the enzymatic properties of the active site complex or a part thereof by detecting an electrical action of or on the action site complex or a part thereof or a change in this electrical action via the bio sensor electrode as a secondary carrier,
wobei in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:wherein one or more of the following substeps are carried out in process steps (c), (d) and / or (e):
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein Ruhemedi¬ um und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),(f) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a resting medium and, if appropriate, detecting an electrical action in accordance with or in the sense of method step (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und gegebenenfalls Detektieren einer elekt¬ rischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),(g) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a second non-activating medium and optionally detecting an electrical action in accordance with or in the sense of method step (e),
(h) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein drittes o- der aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium ent¬ spricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-EAAC l -Proteins enthält.(h) Introducing the secondary carrier with the primary carriers into a third or activating measuring medium and detecting an electrical action according to or in the sense of process step (e), wherein the third or activating medium corresponds to the second or non-activating medium, but additionally contains a substrate of the type EAAC 1 protein.
Die erfindungsgemäßen Schritte (f), (g), (h) werden - ggf. mit Wiederholungen - bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.Steps (f), (g), (h) according to the invention are carried out, preferably with repetitions, preferably in the specified order.
Dabei kann als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes-NaOH pH 7, 2 mmol/1 DTT verwendet wer¬ den.A medium with 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NaOH pH 7.2, mmol / 1 DTT can be used as the non-activating medium.
Ferner kann dabei als aktivierendes Medium ein Medium mit 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol/1 DTT und 10 bis 1000 μmol/1 Na-Glutamat verwendet werden.Furthermore, a medium with 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol / 1 DTT and 10 to 1000 μmol / 1 Na-glutamate can be used as the activating medium.
Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das Typ-EAACl ^Protein aktiviert/ inhibiert, kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.If it is to be checked whether a potential active ingredient activates / inhibits the type EAACl ^ protein, the potential active ingredient can be present in all media.
Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff im aktivierenden Medium vorhanden sein, nicht je¬ doch im Ruhemedium bzw. im nicht-aktivierenden Medium.If it is to be checked whether a potential active substance is being transported, the potential active substance should be present in the activating medium, but not in the resting medium or in the non-activating medium.
Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer oder ein Oli- gomer eines EAACl -Proteins verwendet.A monomer or an oligomer of an EAAC1 protein is preferably used as the site of action complex or part thereof.
Ferner ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwen¬ det wird, welcher auf einem Typ-EAAC l -Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers stammt, z.B. aus dem Hirn, dem Darm oder der Niere, oder hieraus abgeleitet ist.Furthermore, it is envisaged that an active site complex or a part thereof will be used, which is based on a type EAAC 1 protein which originates from a tissue of a mammal, e.g. is derived from the brain, the intestine or the kidney, or from this.
Insbesondere stammt das Typ-EAACl -Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt kloniert vor.In particular, the type EAAC1 protein comes from mammalian cell lines and is cloned.
In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex (enthaltend das Typ-EAAC l -Protein) aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzymati- sche Eigenschaft" des Typ-EAAC l -Proteins gleichzeitig auch immer das Trans- portverhalten, z.B. den durch diese Proteine vermittelten Aminosäuretrans¬ port, und nimmt damit auch immer Bezug auf den eingangs diskutierten Ein- fluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe. Dies bedeu¬ tet, daß wo immer von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, auch Untersuchungen erfindungsgemäß mit umfasst sind, die zeigen sollen, ob ein bestimmter Stoff vom Typ-EAAC l -Protein trans¬ portiert wird.It is advantageously provided that the site of action complex (containing the type EAAC 1 protein) comes from the organism pig, mouse, sheep or human or is derived genetically from these. For the purposes of the present invention, the expression “enzymatic property” of the type EAAC 1 protein always also means the transport behavior, for example the amino acid transport mediated by these proteins, and thus always refers to the one discussed at the beginning Influence of the protein on the bioavailability of potential active substances, which means that, wherever there is talk of modifying the enzymatic properties of the protein, tests according to the invention are also included, which are intended to show whether a certain substance of the EAAC type protein is transported.
Erfindungsgemäß werden wässrige Messlösungen und insbesondere wässrige Elektrolytlösungen als Messlösung (= Messmedium) verwendet, die als Ruhe¬ medium, nicht-aktivierende sowie aktivierende Lösung bezeichnet werden.According to the invention, aqueous measurement solutions and in particular aqueous electrolyte solutions are used as the measurement solution (= measurement medium), which are referred to as resting medium, non-activating and activating solution.
Alle verwendenten Messlösungen enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH- Wert stabilisierendes Mittel bevorzugt ausgewählt aus der Liste: MOPS, HE- PES, MES, Tris, PIPES u.a. , wie sie z.B. in „Buffers, Calbiochem" veröffentlicht sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbüchern der Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Er¬ findungsgemäß sollen diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6 - 8 , bevorzugt etwa 7 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Substrat (Wirkstoffkomplex) abhängen und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.All measuring solutions used contain a pH stabilizing agent known to the person skilled in the art, preferably selected from the list: MOPS, HE-PES, MES, Tris, PIPES and others. as e.g. are published in "Buffers, Calbiochem", but can also easily be found in other publications and textbooks on biochemistry or organic chemistry. According to the invention, these agents known per se should have a stabilizing effect in the range from pH 6-8, preferably about 7 The choice of the suitable pH range and agent can depend on the substrate (active ingredient complex) and can easily be determined by the expert through routine experiments.
Erfindungsgmäß ist es möglich, die Verfahrensschritte (c) und/ oder (d) , gege¬ benenfalls auch (f) bis (h) mittelsAccording to the invention, it is possible to use process steps (c) and / or (d), optionally also (f) to (h)
Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/ oder einer Vorstufe davon,Admixing or injecting the active substance complex, a part and / or a precursor thereof,
Austauschen oder Zumischen des Messmediums oder eines Teils davon und/ oder chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmedi¬ ums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/ oder einer Vorstufe davonExchange or admixing of the measuring medium or a part thereof and / or chemical or physical conversion or reaction of the measuring medium or part of it or the active substance, a part and / or a precursor thereof
durchzuführen. Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann. Besonders einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach das jeweilige Messmedium ausge¬ tauscht wird, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikali¬ sches Umsetzen oder Reagieren im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zuführen von Strahlung erfolgen.perform. This means that on the one hand the active ingredient complex or a part thereof can be transported directly to the location of the active site complex by injecting or admixing it into the measuring medium. However, such a process is particularly simple if the respective measuring medium is simply exchanged, for example in a continuous manner. Furthermore, it is conceivable that the active substance is only released by chemical or physical conversion or reaction in the measuring medium. This can also be done, for example, by supplying radiation.
Der qualitative Einfluss und /oder der quantitative Einfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungsgemäß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ -EAACl -Protein .vermittelt wird.According to the invention, the qualitative influence and / or the quantitative influence of the potential active ingredient or active ingredient complex is determined by detecting an electrical action which is mediated by the active site complex or a part thereof and in particular by the type -EAACl protein.
Insbesondere wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Meßreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des Typ-EAAC 1 -Proteins.In particular, this electrical action is determined with and without a potential active substance, and by comparing the two measurement series it is examined whether the potential active substance influences the enzymatic properties of the type EAAC 1 protein.
Wie in der WO02/ 074983 beschrieben werden die Primärträger mit den Wirk¬ ortkomplexen an einem Sekundärträger, nämlich der Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort insbe¬ sondere angelagert.As described in WO02 / 074983, the primary carriers are brought into contact with the active site complexes on a secondary carrier, namely the biosensor electrode, and in particular with the insulation region thereof, and are attached there in particular.
Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundärträger bestehen vielfältige Möglichkeiten.There are various options for designing the biosensor electrode as a secondary carrier.
Es wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als Sekundär¬ träger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperar¬ tiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, wel¬ cher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörperunterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung. Bei einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit einer Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.However, it is particularly preferred that a biosensor electrode is used as the secondary carrier, in which an electrically conductive and solid-electrode region is provided with at least one electrode, which is electrically and mechanically insulated from the measuring medium and from the primary carriers by provision an insulation area in the form of a solid-supported membrane, which is built up in layers from an underlayer of an organic thio compound as the bottom layer and the layer facing the electrode, and from an upper layer of an amphiphilic organic compound. In a preferred embodiment of the method according to the invention, it is provided that a biosensor electrode is used as the secondary carrier, in which an electrode made of gold is provided in the electrode area with a monolayer of a long-chain alkane thiol as the lower layer thereon and a monolayer of a lipid as the upper layer thereon.
Im Hinblick auf die Primärträger, welche den Wirkortkomplex und insbesonde¬ re die Typ-EAAC l -Proteine im Bereich ihrer Membran enthalten sollen, erge¬ ben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen werden kann.With regard to the primary carriers, which are to contain the site of action complex and in particular the type EAAC 1 proteins in the region of their membrane, there are different possibilities, the respective objective of the method being able to be taken into account.
Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestal¬ tungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens an, dass als Primärträger je¬ weils eine eukariontische Zelle, eine prokariontische Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form und/oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modi¬ fizierter Form, verwendet wird.For example, in accordance with a particularly advantageous embodiment of the method according to the invention, it is appropriate that a eukaryotic cell, a prokaryotic cell, in particular an oocyte, a bacterium, a virus, an organelle or components thereof, in particular membrane fragments, are used as primary carriers. or associations thereof in native form and / or in modified form, in particular in purified and / or modified form, is used.
Es ist auch möglich, dass als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom o- der eine mizelläre Struktur verwendet wird. Die Membranfragmente können sich auch planar anlagern, d.h. als nicht-sphärische Struktur.It is also possible for a vesicle, a liposome or a micellar structure to be used as the primary carrier. The membrane fragments can also accumulate planar, i.e. as a non-spherical structure.
Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird. Auf diese Art und Weise lässt sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Kon¬ zentrationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils da¬ von leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rah¬ men eines Fließsystems vorteilhaft auf leichte Art und Weise und zuverlässig mit hoher Zeitauflösung die erfindungsgemäßen Versuchsbedingungen einstel¬ len. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettiervorrichtung kann das erfin¬ dungsgemäße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden.The method according to the invention is particularly advantageous when the measuring medium flows around or against the measuring medium in a measuring space, measuring area or measuring vessel, comprising a biosensor electrode as a secondary carrier and attached primary carriers. In this way, a change in concentration with regard to the active ingredient complex or a part thereof, for example, can be easily achieved by changing the measuring medium. The measurement conditions according to the invention can also advantageously be set easily and reliably with high time resolution by such a measurement in the context of a flow system. The method according to the invention can also advantageously be carried out with the aid of an automated pipetting device.
Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich ges¬ taltet sich das erfindungsgemäße Verfahren dann, wenn aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinander- folgendes Austauschen des Messmediums, ggf. mit zwischengeschaltetem Wa¬ schen oder Spülen des Messraums.The method according to the invention is particularly economical and accessible for statistical evaluation if a plurality of tests are carried out in succession, in particular by successive tests. following exchange of the measuring medium, if necessary with intermediate washing or rinsing of the measuring room.
Wichtig ist bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren das Verglei¬ chen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen nicht- aktivierendem zu aktivierendem Medium in Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.It is important in the present method according to the invention to compare the action of the active site complex in the present active ingredient complex with a situation in which the potential active ingredient complex is not present. This can be done, for example, by switching between non-activating medium to activating medium in the presence or absence of the potential active ingredient complex and comparing the measured values obtained.
Potentielle zu testende Wirkstoffe sind insbesondere bevorzugt monoklonale Antikörper, Antikörperfragmente, polyklonale Antikörper und Peptide. Es kön¬ nen jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, daß sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht.Potential active substances to be tested are particularly preferably monoclonal antibodies, antibody fragments, polyclonal antibodies and peptides. However, other substances which are suspected to have a corresponding effect can also be added. These substances are preferably administered in dissolved form.
Besonders bevorzugte Substanzen, die als Testsubstanzen in dem erfindungs¬ gemäßen Testsystem untersucht werden können, sind niedermolekulare Ver¬ bindungen. Solche Verbindungen haben oft keine oder nur geringe Nebenwir¬ kungen, wenn sie als aktives Prinzip in einer pharmazeutischen Zusammen¬ setzung eingesetzt werden. Ein weiterer Vorteil solcher Substanzen ist die Möglichkeit der oralen Verabreichung.Particularly preferred substances which can be examined as test substances in the test system according to the invention are low molecular weight compounds. Such compounds often have no or only minor side effects if they are used as an active principle in a pharmaceutical composition. Another advantage of such substances is the possibility of oral administration.
Beispiele hierfür sind cyclische Pentapeptide, wie sie von Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 1 18, 7641-7472, beschrieben wurden. Erfindungsge¬ mäß werden den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosäureanaloga, Steroide, Nukleotide und weitere organisch-chemische Stoffe mit einem Molekulargewicht von ≤ 5000, bevorzugt ≤ 3000 und beson¬ ders bevorzugt ≤ 2000 zugerechnet.Examples of this are cyclic pentapeptides, as described by Haubner et. al., J. Am. Chem. Soc. 1996, 1 18, 7641-7472. According to the invention, small peptides, amino acids and amino acid analogs, steroids, nucleotides and other organic chemical substances with a molecular weight of 5000 5000, preferably 3000 3000 and particularly preferably 2000 2000 are attributed to the low molecular weight substances.
Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Ruhemedium, im nicht-aktivierenden als auch im aktivierenden Medium zugesetzt oder dort freigesetzt werden.The active substance complex can be added to or released in the resting medium, in the non-activating as well as in the activating medium.
Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Primärträger mit dem Wirkstoffkomplex denkbar.Incubation of the active site complexes or the primary carriers carrying them with the active ingredient complex is also conceivable as an intermediate step.
Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (h) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein viertes und [WaschJMedium, welches bevorzugt mit dem nicht-aktivierenden Medium identisch ist.Furthermore, it is conceivable that a washing step is carried out between steps (f) and (h) by introducing the secondary carrier with the primary carriers into a fourth and [washing medium, which is preferably identical to the non-activating medium.
Ferner ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (h) bei einer besonders be¬ vorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.Furthermore, it is conceivable for step (f) to be carried out repeatedly directly before step (h) in a particularly preferred embodiment of the method according to the invention.
Es ist bevorzugt, wenn der Schritt (f) vor Beginn der eigentlichen Messreihe, d.h. bevor zum erstenmal die Schritte (g) und (h) durchgeführt werden, für mindestens 5 Minuten (min), bevorzugt für mindestens 10 min, besonders be¬ vorzugt für mindestens 15 min, noch mehr bevorzugt für mindestens 20 min und insbesondere bevorzugt für mindestens 30 min durchgeführt wird. Die Schritte (g) und (h) werden erfindungsgemäß für mindestens 0,5 Sekunden (sec), höchstens jedoch 5 sec und bevorzugt für etwa 1 -2 sec durchgeführt. Nach der erstmaligen Durchführung der Schritte (g) und (h) wird Schritt (f) für mindestens 1 sec bis höchstens 120 sec durchgeführt, bevorzugt für mindes¬ tens 30 sec bis 90 sec, und besonders bevorzugt für 50 sec bis 70 sec.It is preferred if step (f) before the actual series of measurements, i.e. before steps (g) and (h) are carried out for the first time, for at least 5 minutes (min), preferably for at least 10 min, particularly preferably for at least 15 min, even more preferably for at least 20 min and particularly preferably for at least 30 min is carried out. Steps (g) and (h) are carried out according to the invention for at least 0.5 seconds (sec), but at most 5 seconds and preferably for about 1-2 seconds. After steps (g) and (h) have been carried out for the first time, step (f) is carried out for at least 1 sec to at most 120 sec, preferably for at least 30 sec to 90 sec, and particularly preferably for 50 sec to 70 sec.
Das Ruhemedium umfasst Kaliumionen in Konzentrationen, die bevorzugt in etwa so hoch sind wie die Natrium Konzentration im nicht-aktivierenden und im aktivierenden Medium. Beispielsweise kann diese Konzentration zwischen 1 μmol/1 und 1 mol/1 liegen, bevorzugt 10-200 mmol/1, ganz besonders bevor¬ zugt zwischen 120 mmol/1 und 160 mmol/1.The resting medium comprises potassium ions in concentrations which are preferably approximately as high as the sodium concentration in the non-activating and in the activating medium. For example, this concentration can be between 1 μmol / 1 and 1 mol / 1, preferably 10-200 mmol / 1, very particularly preferably between 120 mmol / 1 and 160 mmol / 1.
Das nicht-aktivierende Medium enthält Natriumionen in Konzentrationen, die bevorzugt in etwa den Konzentrationen der Kaliumionen im jeweils verwende¬ ten Ruhemedium entsprechen.The non-activating medium contains sodium ions in concentrations which preferably correspond approximately to the concentrations of the potassium ions in the resting medium used in each case.
Das aktivierende Medium enthält Natriumionen in Konzentrationen, die bevor¬ zugt in etwa den Konzentrationen der Kaliumionen im jeweils verwendeten Ruhemedium und/ oder im nicht aktivierenden Medium entsprechen.The activating medium contains sodium ions in concentrations which preferably correspond approximately to the concentrations of the potassium ions in the resting medium used in each case and / or in the non-activating medium.
Desweiteren enthält es ein Substrat des EAACl -Proteins, bevorzugt Glutamat. Weitere mögliche Substrate sind D- und L-Aspartat. Die Konzentration kann je nach Anwendung schwanken. Bei Kompetetionsuntersuchungen kann Gluta¬ mat im μmol/1 Bereich eingesetzt werden, z.B. 1 - 100 μmol/1. Bei Wirkstofftes- tungen auf Aktivierung und/ oder Inhibierung des TYP-EAACl -Proteins kann auch eine Konzentration im mmol/1-Bereich sinnvoll sein, also etwa 0, 1 bis 10 mmol/1, bevorzugt etwa 1 mmol/1.Furthermore, it contains a substrate of the EAAC1 protein, preferably glutamate. Other possible substrates are D- and L-aspartate. The concentration can fluctuate depending on the application. Glutamate in the μmol / 1 range can be used in competition tests, for example 1 - 100 μmol / 1. In drug tests for activation and / or inhibition of the TYP-EAACl protein can a concentration in the mmol / 1 range may also be expedient, that is to say about 0.1 to 10 mmol / 1, preferably about 1 mmol / 1.
Die entsprechenden Konzentrationen können vom Fachmann leicht ermittelt werden.The corresponding concentrations can easily be determined by a person skilled in the art.
Generell ist es bevorzugt, wenn nicht-aktivierende und aktivierende Medien Kalium frei sind. Allerdings ist eine Konzentration von bis zu 20 mmol/1 Kali¬ um vertretbar, und bei Verwendung einer automatisierten Pipettiervorrichtung auch gar nicht vermeidbar, da hier eine Entfernung des Ruhemediums nicht möglich ist.It is generally preferred if non-activating and activating media are potassium free. However, a concentration of up to 20 mmol / 1 potassium is acceptable and cannot be avoided if an automated pipetting device is used, since removal of the resting medium is not possible here.
Es ist weiterhin bevorzugt, wenn in den erfindungsgemäßen Messlösungen Mg++ in einer Konzentration von >0 - 5 mmol/1 vorhanden ist.It is further preferred if Mg ++ is present in the measurement solutions according to the invention in a concentration of> 0-5 mmol / 1.
Gemäß eines weiteren Aspekts schafft die vorliegende Erfindung einen Wirk¬ stoff oder einen Wirkstoffkomplex, welcher eine enzymatische Eigenschaft ei¬ nes Typs einen Typ eines EAACl -Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes oder eines Teils davon modifiziert und welcher gemäß dem erfindungsgemäßen Ver¬ fahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes identifiziert ist, wird oder wurde.According to a further aspect, the present invention provides an active substance or an active substance complex which modifies an enzymatic property of a type, a type of an active site complex containing an EAAC1 protein or a part thereof and which identifies according to the method according to the invention for identifying an active substance complex is, will or has been.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:The present invention also provides a method for producing a medicament, comprising the steps:
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/ oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine - ggf. bestimmte - enzymatische Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes, welcher einen Typ eines EAAC l -Proteins enthält, oder eines Teils davon o- der eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, und zwar mit Hil¬ fe des erfindungsgemäßen Verfahrens,- Identifying an active ingredient and / or an active ingredient complex which suitably - optionally determined - enzymatic property of an active ingredient complex which contains a type of an EAAC 1 protein or a part thereof or which modifies a plurality of properties, with Hil ¬ fe of the method according to the invention,
- Herstellen und /oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder eines Derivats davon,Producing and / or isolating the active ingredient, the active ingredient complex, a part and / or a derivative thereof,
- ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Deri¬ vats, - ggf. Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersub¬ stanz.- if necessary, purification of the active ingredient, active ingredient complex, part and / or derivatives, optionally mixing and / or portioning the active ingredient, active ingredient complex, part and / or derivative with a pharmaceutically acceptable carrier.
Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchfüh¬ rung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoff¬ komplexes. Dieser Testkit weist auf:Furthermore, the present invention provides a test kit for carrying out the method according to the invention for identifying an active ingredient complex. This test kit features:
- mindestens einen Primärträger mit dem Typ-EAAC l -Protein,- at least one primary carrier with the type EAAC l protein,
- einen Messbereich,- a measuring range,
- gegebenenfalls das erfindungsgemäße Ruhemedium, das nicht-aktivierende Medium sowie das aktivierendes Medium und- If necessary, the rest medium according to the invention, the non-activating medium and the activating medium and
- weiterhin gegebenenfalls mindestens einen potenziellen Wirkstoffkomplex.- if necessary, at least one potential drug complex.
Erfindungsgemäß wird auch ein Screeningverfahren zum Identifizieren ge¬ schaffen, und zwar zum Identifizieren:According to the invention, a screening method for identifying is also created, specifically for identifying:
- eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder Derivats davon,an unknown active substance, active substance complex, a part and / or derivative thereof,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,- the presence of an unknown active substance, active substance complex, part and / or derivative thereof,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,the presence of a known active ingredient, active ingredient complex, part and / or derivative thereof,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/ oder Derivats davon,the concentration of an unknown active ingredient, active ingredient complex, part and / or derivative thereof,
- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon.- The concentration of a known active ingredient, active ingredient complex, part and / or derivative thereof.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfin¬ dungsgemäße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwen¬ det zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibitoren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkort¬ komplexes, welcher ein Typ-EAAC l -Protein enthält, und insbesondere ein hu¬ manes EAAT3-Protein.According to a further aspect of the present invention, the method according to the invention for identifying an active ingredient complex is used to find inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of an enzymatic property of an active site complex which contains a type EAAC 1 protein , and in particular a human EAAT3 protein.
Des Weiteren wird das erfindungsgemäße Testkit erfindungsgemäß verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibi- toren oder Modulatoren eines einen Typ eines EAACl -Proteins enthaltenden Wirkortkomplexes und insbesondere ein humanes EAAT3-Protein.Furthermore, the test kit according to the invention is used according to the invention to find inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors. tors or modulators of a site complex containing a type of an EAACl protein and in particular a human EAAT3 protein.
Des Weiteren wird das Arzneimittel erfindungsgemäß verwendet zur Inhibition, partiellen oder temporären Inhibition, Aktivierung oder sonstige Modulation eines Typ-EAAC l -Proteins enthaltenden Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon und insbesondere eines humanen EAAT3-Proteins.Furthermore, the medicament is used according to the invention for the inhibition, partial or temporary inhibition, activation or other modulation of an active ingredient complex containing type EAAC 1 protein or a part thereof and in particular a human EAAT3 protein.
Auf der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehen¬ den und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten wei¬ ter erläutert:In other words, the preceding and further aspects of the present invention are explained further on the basis of the following remarks:
Darüber hinaus ist ein z. B. wässriges Messmedium vorgesehen, in welchem die Primärträger und die Sekundärträger angeordnet werden. Der Elektroden¬ bereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primärträgern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend elektrisch isoliert.In addition, a z. B. aqueous measuring medium is provided, in which the primary carrier and the secondary carrier are arranged. The electrode area is preferably largely electrically insulated from the measuring medium, the primary carriers and from the biological units.
Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Materialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/ oder dergleichen.The electrode area has e.g. at least one electrode. On the one hand, this can itself be designed as a mechanically stable material area, in particular as a plate, as a wire and / or the like.
Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberfläche des Trägers abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Materialschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstärke von etwa 10 bis 200 nm.A particularly simple arrangement of the sensor electrode device results if the electrode is essentially designed as a material layer deposited on the surface of the carrier. It can be an evaporated or sputtered layer of material. The material layer for forming the electrode preferably has a layer thickness of approximately 10 to 200 nm.
Das Typ-EAAC l -Protein kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakolo¬ gisch untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Veränderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren. Besonders vorteilhaft ist es, dass Primärträger eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Primärträgern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physikalischen, chemi¬ schen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Primärträ¬ ger.The type EAAC 1 protein can each be provided in an essentially native form and / or in a modified, in particular purified, microbiological and / or molecular biological modified form. On the one hand, certain native properties can be tested and pharmacologically examined. On the other hand, molecular biological or genetically initiated changes also lend themselves to analyzing certain aspects, for example the transport or the pharmacological mode of action of an active ingredient. It is particularly advantageous that primary carriers of an essentially uniform type of primary carriers are provided. This is important with regard to the clearest possible statement and analysis of an active ingredient test and relates to the geometric, physical, chemical, biological and molecular biological properties of the primary carriers.
Das Nämliche gilt auch für die in dem Primärträger vorgesehenen Wirkort¬ komplexe und das Typ-EAACl -Protein. Hier sind Wirkortkomplexe und Typ- EAAC l -Protein eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geometrischen, physikalischen, chemi¬ schen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sol¬ len die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Ori¬ entierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den je¬ weiligen Primärträger in etwa einheitlich sein.The same also applies to the active site complexes and the type EAAC1 protein provided in the primary carrier. Here, site of action complexes and type EAAC 1 proteins of an essentially uniform type are provided, in particular with regard to their geometric, physical, chemical, biological and molecular biological properties. In addition, the biological units should advantageously be approximately uniform with regard to their orientation and / or with regard to their activability with respect to the respective primary carrier.
Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Typ-EAAC l- Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulieren, sind als potentielle neuropro- tektive Wirkstoffe von gewerblichem Interesse. Auch wären Substrate des Pro¬ teins, die von diesem transportiert werden, u.U. wichtige neue Moleküle.As already stated, the invention is based, inter alia, on the object of making the effect of substances on the function of type EAAC 1 proteins accessible for investigation. Substances that modulate the action of this transport protein are of commercial interest as potential neuroprotective agents. Also, substrates of the protein that are transported by it might be important new molecules.
Das erfindungsgemäße Vorgehen bietet folgende Vorteile:The procedure according to the invention offers the following advantages:
Die Messung der Enzymaktivität gemäß dem erfindungsgemäß vorgeschlage¬ nen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine Ein¬ zelmessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv ge¬ genüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort des Proteins durch einen schnellen Lösungswechsel induziert wird.The measurement of the enzyme activity according to the method proposed according to the invention does not require any mediators or labeled substrates. An individual measurement only takes a few seconds. The measurement is sensitive to all substrates. If a substance does not irreversibly inhibit the reaction, several measurements can be carried out with a sensor loaded with enzyme. Substrates do not have to be chemically modified, since the current response or potential response of the protein is induced by a quick change of solution.
Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik ein höherer Durchsatz möglich. BEISPIEL 1 Herstellung des EAAC l -SensorchipsIn addition, in contrast to the patch clamp technology, a higher throughput is possible. EXAMPLE 1 Manufacture of the EAAC 1 sensor chip
l Oμl einer Membransuspension (Proteinkonzentration ca. 2-3 mg ml 1) aus ei¬ ner CHO-Plasmamembranpräparation wurden auf einen vorbehandelten Sen¬ sorchip mit einer runden Goldelektrode (3 mm Durchmesser, erhältlich von IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) aufgetragen und über Nacht im Kühlschrank (bei < 8°C) inkubiert.1 μl of a membrane suspension (protein concentration approx. 2-3 mg ml 1 ) from a CHO plasma membrane preparation was applied to a pretreated sensor chip with a round gold electrode (3 mm diameter, available from IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) and incubated overnight in the refrigerator (at <8 ° C).
Die Kapazität der proteinbeladenen Membranen lag bei ca. 1000 nF cm"2, die Leitfähigkeit G18 bei ca. 10 nS cm'2.The capacity of the protein-loaded membranes was approx. 1000 nF cm "2 , the conductivity G 18 was approx. 10 nS cm " 2 .
BEISPIEL 2 Aktivitätsmessung ohne InhibitorEXAMPLE 2 Activity measurement without inhibitor
Die Durchflusszelle eines SurfE2R-Systems (IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) mit integriertem proteinbeladenen Sensorchip wurde zu¬ nächst mit Ruhemedium (siehe oben) durchspült. Danach folgte das nicht- aktivierende Medium ( 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes- NaOH pH 7, 2 mmol/1 DTT) und mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Medium ( 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol/1 DTT + 10- 1000μM Na-Glutamat) umgestellt.The flow cell of a SurfE 2 R system (IonGate Biosciences GmbH, Frankfurt am Main) with an integrated protein-loaded sensor chip was first flushed with a resting medium (see above). This was followed by the non-activating medium (140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NaOH pH 7, 2 mmol / 1 DTT) and the activating medium was then applied using an electromechanical 3/2-way valve (140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol / 1 DTT + 10-1000μM Na-glutamate).
BEISPIEL 3 Aktivitätsmessung mit CholinchloridEXAMPLE 3 Activity measurement with choline chloride
Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurden bei den bei¬ den Lösungen aktivierende und nicht aktivierende das Co -Substrat Natrium durch Cholin ersetzt.The measurements were carried out as above, but in the two solutions activating and not activating the Co substrate sodium were replaced by choline.
Fig. 1 zeigt schematisch die Topologie eines Typs einer EAACl -Einheit.Figure 1 shows schematically the topology of one type of EAACl unit.
Fig. 2 zeigt in Form eines Graphen schematisch den durch das EAAC l - Protein hervorgerufenen Transportstrom I(t) als durch die Biosen¬ sorelektrode messbare elektrische Aktion.2 schematically shows in the form of a graph the transport current I (t) caused by the EAAC 1 protein as an electrical action which can be measured by the biosensor electrode.
Die Abszisse bezeichnet jeweils die Zeit t, wobei t=0 denjenigen Zeitpunkt an¬ gibt, bei welchem das Medium von einem nicht-aktivierendem zu einem akti¬ vierendem gewechselt wird. D.h. , ab t=0 ist das Substrat Glutamat in Form von Natriumglutamat, welches vor t=0 fehlte, im Messmedium vorhanden. Da- durch wird der elektrische Strom als Strom transportierter Ionen manifest, welcher auf der Ordinate aufgezeichnet ist. Die Ordinate bezeichnet also den gemessenen elektrischen Strom I(t), als Funktion der Zeit t, welcher über die Biosensorelektrode gemessen wird. Die Spur A der Fig. 2 zeigt eine Messung, bei welcher die EAAC l -Protein 12 durch Glutamat-Zugabe zum Zeitpunkt t=0 normal aktiviert wird. Unter Glutamattransport werden mittels des EAAC l - Proteins 12 Ionen über die Primärträger 10, z.B. über Membranfragmente oder Vesikel, Protonen auf die Biosensormembran und deren Elektrode zu bewegt. Dies wird am positiven elektrischen Messstrom I(t) erkennbar.The abscissa denotes the time t, where t = 0 indicates the point in time at which the medium is changed from a non-activating to an activating one. Ie, from t = 0 the substrate glutamate in the form of sodium glutamate, which was missing before t = 0, is present in the measuring medium. There- through the electric current is manifested as the current of transported ions, which is recorded on the ordinate. The ordinate thus designates the measured electrical current I (t) as a function of time t, which is measured via the biosensor electrode. Lane A of FIG. 2 shows a measurement in which the EAAC 1 protein 12 is activated normally by adding glutamate at time t = 0. With glutamate transport, 12 ions are moved via the primary carrier 10, for example via membrane fragments or vesicles, protons onto the biosensor membrane and its electrode by means of the EAAC 1 protein. This can be seen from the positive electrical measuring current I (t).
Die Spur B der Fig. 2 zeigt die gleiche Messung, wobei aber statt Natriumchlo¬ rid in der Messlösung 30 - der nicht aktivierenden wie der aktivierenden - Cholinchlorid zu Grunde liegt. Trotz Aktivierung durch Anwesenheit von Glu¬ tamat ab dem Zeitpunkt t=0 ist kein merklicher Strom I(t) messbar. Dadurch ist gezeigt, dass der gemessene elektrische Strom aus der Spur A den Trans¬ portstrom repräsentiert.Track B of FIG. 2 shows the same measurement, but instead of sodium chloride in the measurement solution 30 - the non-activating as well as the activating - is based on choline chloride. Despite activation by the presence of glutamate from time t = 0, no noticeable current I (t) can be measured. This shows that the measured electrical current from track A represents the transport current.
Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechani¬ sche Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhabbarkeit und geringer Stör¬ anfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zu¬ verlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber herkömmlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können. Fundamental advantages of the present invention are the high mechanical stability of the sensor arrangement provided and, along with this, the great operational readiness, the simple handling and the low susceptibility to malfunction. The use of the sensor arrangement results in a long lifespan, a high degree of reliability, a low susceptibility to faults and, in particular, a significantly increased test throughput compared to conventional methods, as a result of which pharmacological active ingredient tests can be carried out, so that corresponding test methods can be developed and carried out cost-effectively.

Claims

Patentansprüche Claims
1. Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine enzy- matische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, welcher einen Typ eines EAAC l -Proteins enthält, mit den Schritten:1. A method for identifying an active ingredient complex which modifies an enzymatic property of an active site complex which contains a type of an EAAC 1 protein, with the steps:
(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primärträger, welche den das Typ-EAAC l - Protein enthaltenden Wirkortkomplex, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primärträger s enthalten ,(a) providing a plurality of primary carriers which contain the site of action complex containing the type EAAC 1 protein, in particular in a plurality in the region of a membrane of the respective primary carrier,
(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primärträger am oder im Oberflä¬ chenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekundärträger dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundärträger bevorzugt gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärträgern mittels des Isolationsbereichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,(b) attaching or bringing the primary carriers into contact with or in the surface area of an insulation region of a biosensor electrode serving as secondary carrier in a measuring medium, the secondary carrier preferably being or being mechanically and electrically insulated from the measuring medium and from the primary carriers by means of the insulation region ,
(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,(c) providing at least one potential active ingredient complex,
(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primärträ¬ ger oder Teilen davon, und(d) bringing the potential active substance complex into contact and in particular interacting with the active substance complex of the primary carriers or parts thereof, and
(e) Bestimmen des qualitativen und/ oder quantitativen Einflusses des po¬ tenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detek- tieren einer elektrischen Aktion des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon oder Änderung der elektrischen Aktion über die Biosensorelektro¬ de als Sekundärträger,(e) Determining the qualitative and / or quantitative influence of the potential active substance complex or a part thereof on the enzymatic properties of the active site complex or a part thereof by detecting an electrical action of the active site complex or a part thereof or changing the electrical action via the biosensor electro ¬ de as secondary carrier,
wobei in den Verfahrensschritten (c), (d) und/ oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:wherein one or more of the following substeps are carried out in process steps (c), (d) and / or (e):
(f) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein Ruhemedi¬ um und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e),(f) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a resting medium and detecting an electrical action in accordance with or in the sense of method step (e),
(g) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), (h) Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein drittes o- der aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium ent¬ spricht, jedoch zusätzlich ein Substrat des Typ-EAAC l -Proteins enthält,(g) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a second non-activating medium and detecting an electrical action in accordance with or in the sense of method step (e), (h) introducing the secondary carrier with the primary carriers into a third or activating measuring medium and detecting an electrical action in accordance with or in the sense of method step (e), the third or activating medium corresponding to the second or non-activating medium, but additionally contains a substrate of the type EAAC l protein,
wobei als nicht-aktivierendes Medium ein Medium mit 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes-NaOH pH 7, 2 mmol/1 DTT verwendet wird undwherein a medium with 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NaOH pH 7.2, 2 mmol / 1 DTT is used as the non-activating medium and
wobei als aktivierendes Medium ein Medium mit 140 mmol/1 NaCl, 2 mmol/1 MgCl2, 30 mmol/1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol/1 DTT und 10 bis 1000 μmol/1 Na-Glutamat verwendet wird.a medium containing 140 mmol / 1 NaCl, 2 mmol / 1 MgCl 2 , 30 mmol / 1 Hepes-NMG pH 7, 2 mmol / 1 DTT and 10 to 1000 μmol / 1 Na-glutamate being used as the activating medium.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfähiger und festkörperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messme¬ dium und gegenüber den Primärträgern bevorzugt elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkörpe¬ runterstützten Membran, welche schichtartig aufgebaut wird aus einer Unter¬ schicht einer organischen Thio Verbindung als unterster und der Elektrode je¬ weils zugewandten Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen or¬ ganischen Verbindung.2. The method according to claim 1, in which a biosensor electrode is used as the secondary carrier, in which an electrically conductive and solid-like electrode region is provided with at least one electrode, which is preferably electrically and mechanically insulated from the measuring medium and from the primary carriers by providing a Isolation area in the form of a solid-supported membrane which is built up in layers from a lower layer of an organic thio compound as the lowest layer and the layer facing the electrode and from an upper layer of an amphiphilic organic compound.
3. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird mit ei¬ ner Monoschicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.3. The method according to any one of the preceding claims, in which a biosensor electrode is used as a secondary carrier, in which an electrode made of gold is provided in the electrode area with a monolayer of a long-chain alkane thiol as the lower layer thereon and a monolayer of a lipid as the upper layer thereon.
4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Biosensorelektrode als Sekundärträger verwendet wird, bei welcher der eine Elektrode der Biosensorelektrode als Sekundärträger abde¬ ckende Bereich des Isolationsbereichs als Membranstruktur nach Art einer festkörperunterstützten Doppelschichtmembran oder Bilayermembran ausge¬ bildet wird oder ist. 4. The method according to any one of the preceding claims, in which a biosensor electrode is used as a secondary carrier, in which the region of the insulation region covering one electrode of the biosensor electrode as a secondary carrier is or is formed as a membrane structure in the manner of a solid-state-supported double-layer membrane or bilayer membrane.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils eine eukariontische Zelle, eine prokarion- tische Zelle, ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestand¬ teile, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon in nativer Form oder in abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologisch geänderter Form, verwendet wird.5. The method according to any one of the preceding claims, in which the primary carrier is a eukaryotic cell, a prokaryotic cell, an oocyte, a bacterium, a virus, an organelle or components, in particular membrane fragments, or associations thereof in native form or in a modified form, in particular in a purified, microbiologically and / or molecular-biologically modified form, is used.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Primärträger jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizel- läre Struktur verwendet wird.6. The method according to any one of the preceding claims, in which a vesicle, a liposome or a micelle structure is used as the primary carrier.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem ein Typ-EAACl -Protein verwendet wird, welcher auf dem EAACl - Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers, bevorzugt Hirn, Darm oder Niere, stammt oder genetisch aus diesem abgeleitet wird oder ist.7. The method according to any one of the preceding claims, in which a type EAACl protein is used, which is based on the EAACl protein, which is derived from a tissue of a mammal, preferably brain, intestine or kidney, or is genetically derived therefrom or is.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-EAAC l -Protein aus dem Organismus Schwein, Maus, Schaf oder Mensch stammt oder aus diesem genetisch abgeleitet wird.8. The method according to any one of the preceding claims, in which the type EAAC l protein originates from the organism pig, mouse, sheep or human or is genetically derived therefrom.
9. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das Typ-EAAC l -Protein zumindest zum Teil im Primärträger eine Membran durchspannend ausgebildet oder verwendet ist oder wird.9. The method according to any one of the preceding claims, wherein the type EAAC l protein is at least partially formed or used in the primary carrier spanning a membrane.
10. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als elektrische Aktion verwendet wird ein durch den Wirkortkom- plex oder einen Teil davon erzeugter elektrischer Strom oder ein davon erzeug¬ tes elektrisches Potenzial, welches jeweils erzeugt werden durch Ladungs- o- der Stofftransport oder -Verschiebung, Konformationsänderungen, Liganden- bindung, -anlagerung oder -freigäbe, oder einer Kombination davon.10. The method according to any one of the preceding claims, in which the electrical action used is an electrical current generated by the active site complex or a part thereof, or an electrical potential generated by it, which are each generated by charge or mass transfer or -Shift, conformational changes, ligand binding, attachment or release, or a combination thereof.
1 1. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als enzymatische Eigenschaft verwendet wird:1 1. The method according to any one of the preceding claims, in which is used as the enzymatic property:
- die Bindung, Anlagerung oder Freigabe des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,- the binding, attachment or release of the active substance complex or a part thereof or the measuring medium or part thereof,
- der Transport oder die Verschiebung des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon, - die chemische Umsetzung oder Reaktion des Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon oder des Messmediums oder eines Teils davon,- the transport or the transfer of the active substance complex or a part thereof or the measuring medium or part thereof, - the chemical conversion or reaction of the active substance complex or a part thereof or the measuring medium or part thereof,
- eine Konformationsänderung oder Bewegung des Wirkortkomplexes oder ei¬ nes Teils davon odera change in conformation or movement of the site of action or a part thereof or
- eine beliebige Kombination dieser Prozesse.- any combination of these processes.
12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium ein wässriges Messmedium verwendet wird und insbesondere eine wässrige Elektrolytlösung.12. The method according to any one of the preceding claims, in which an aqueous measuring medium is used as the measuring medium and in particular an aqueous electrolyte solution.
13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem die Verfahrensschritte (c) und/ oder (d) durchgeführt werden durch:13. The method according to any one of the preceding claims, in which process steps (c) and / or (d) are carried out by:
- Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon,Admixing or injecting the active ingredient complex, a part or a preform thereof,
- Austauschen des Messmediums oder eines Teils davon und/ oder- Exchange of the measuring medium or a part of it and / or
- chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmedi¬ ums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffkomplexes, eines Teils oder einer Vorform davon.- Chemical or physical conversion or reaction of the measuring medium or a part thereof or the active substance complex, a part or a preform thereof.
14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem eine Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundärträ¬ ger und daran angelagerten Primärträgern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefäß vom Messmedium umströmt oder angeströmt wird.14. The method according to any one of the preceding claims, in which a sensor arrangement comprising a biosensor electrode as a secondary carrier and primary carriers attached thereto is flowed around or flowed by the measuring medium in a measuring space, measuring range or measuring vessel.
15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem aufeinanderfolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmediums, gegebenenfalls mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spülen des Messraums.15. The method according to any one of the preceding claims, in which a plurality of tests are carried out in succession by successively exchanging the measuring medium, optionally with intermediate washing or rinsing of the measuring space.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei welchem zwischen den Schritten (g) und (h) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Sekundärträgers mit den Primärträgern in ein vier¬ tes oder Waschmedium.16. The method according to any one of the preceding claims, in which a washing step is carried out between steps (g) and (h) by introducing the secondary carrier with the primary carriers into a fourth or washing medium.
17. Verfahren nach einem der der vorstehenden Ansprüche, bei welchem direkt vor dem Schritt (h) der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird. 17. The method according to any one of the preceding claims, wherein step (f) is carried out repeatedly directly before step (h).
18. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem das erste oder Ruhemedium18. The method according to any one of the preceding claims, wherein the first or rest medium
- K+,- K +,
- gegebenenfalls Mg++, pH 6-8 , besonders bevorzugt etwa 7 , enthält, das zweite oder nicht-aktivierende Mediumoptionally contains Mg ++ , pH 6-8, particularly preferably about 7, the second or non-activating medium
- Na+,- Well +,
- gegebenenfalls Mg++ , pH 6-8 , besonders bevorzugt etwa 7, enthält, und das dritte oder aktivierende Mediumoptionally contains Mg ++ , pH 6-8, particularly preferably about 7, and the third or activating medium
- Na+ ,- Well +,
- gegebenenfalls Mg++, pH 6-8, besonders bevorzugt etwa 7, enthält, sowie ein Substrat des Typ-EAAC l -Proteins, bevorzugt Glutamat zwischen 1 μmol/ 1 und 10 mmol/1 enthält.optionally contains Mg ++ , pH 6-8, particularly preferably about 7, and also contains a substrate of the type EAAC 1 protein, preferably glutamate, between 1 μmol / 1 and 10 mmol / 1.
19. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, bei welchem als Messmedium und insbesondere als zweites oder nicht- aktivierendes Medium und/ oder besonders bevorzugt als drittes oder aktivierendes Medium Medien mit Glutamat, insbesondere mit Natriumgluta- mat verwendet werden, insbesondere mit einer Konzentration von etwa 1 μmol/1 bis 10 mmol/1.19. The method according to any one of the preceding claims, in which media with glutamate, in particular with sodium glutamate, in particular with a concentration of approximately, are used as the measurement medium and in particular as the second or non-activating medium and / or particularly preferably as the third or activating medium 1 μmol / 1 to 10 mmol / 1.
20. Wirkstoff oder Wirkstoffkomplex,20. active substance or complex of active substances,
- welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, der ein Typ- EAAC l -Protein enthält, oder eines Teils davon modifiziert,which modifies an enzymatic property of an active site complex which contains a type EAAC 1 protein or a part thereof,
- welcher gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 identi¬ fiziert ist, wird oder wurde.- Which is, has been or has been identified according to a method according to one of claims 1 to 22.
21. Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:21. A method of manufacturing a drug comprising the steps of:
- Identifizieren eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomplexes, welcher eine bestimmte enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher ein Typ- EAAC l -Protein enthält, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, mit Hilfe eines Verfahrens nach ei¬ nem der Ansprüche 1 bis 19,- Identification of an active ingredient and / or an active ingredient complex which has a certain enzymatic property of an active site complex which contains a type EAAC 1 protein, or a part thereof or a plurality suitably modified properties, with the aid of a method according to one of claims 1 to 19,
- Herstellen und/ oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/ oder eines Derivats davon,Producing and / or isolating the active substance, the active substance complex, a part and / or a derivative thereof,
- ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats,- if necessary, purification of the active ingredient, active ingredient complex, part or derivative,
- ggf. Mischen und/ oder Portionieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, des Teils oder Derivats mit einer pharmazeutisch verträglichen Trägersub¬ stanz.optionally mixing and / or portioning the active ingredient, the active ingredient complex, the part or derivative with a pharmaceutically acceptable carrier.
22. Testkit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, mit:22. Test kit for carrying out the method according to one of claims 1 to 19, with:
- mindestens einem Primärträger,- at least one primary carrier,
- einem Messbereich,- a measuring range,
- gegebenenfalls einem ersten oder Ruhemedium, einem zweiten oder nicht- aktivierenden Medium, einem dritten oder aktivierenden Medium zur Auf¬ nahme eines potenziellen Wirkstoffkomplexes undoptionally a first or resting medium, a second or non-activating medium, a third or activating medium for taking up a potential active substance complex and
- weiterhin gegebenenfalls mindestens einem potenziellen Wirkstoffkomplex.- if necessary, at least one potential active ingredient complex.
23. Screeningverfahren zum Identifizieren:23. Screening procedure for identification:
- eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats da¬ von,an unknown active ingredient, active ingredient complex, part or derivative thereof,
- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon,- the presence of an unknown active substance, active substance complex, part or derivative thereof,
- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon,- the presence of a known active substance, active substance complex, part or derivative thereof,
- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon,the concentration of an unknown active substance, active substance complex, part or derivative thereof,
- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffes, Wirkstoffkomplexes, Teils oder Derivats davon oder- The concentration of a known active ingredient, active ingredient complex, part or derivative thereof or
- einer beliebigen Kombination der zuvor genannten Größen oder Eigenschaf¬ ten durch Verwenden eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19 und/ oder des Testkits gemäß Anspruch 22, wobei der Wirkstoff, der Wirkstoffkomplex, der Teil oder das Derivat davon ei¬ ne enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines EAACl -Proteins enthält, oder eines Teils davon modifiziert. - Any combination of the aforementioned sizes or properties by using a method according to one of claims 1 to 19 and / or the test kit according to claim 22, wherein the active ingredient, the active ingredient complex, the part or the derivative thereof has an enzymatic property of a site complex, which contains a type of an EAAC1 protein, or a part thereof.
24. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19 , zum Auffinden von Inhibitoren, partiellen oder temporären Inhibitoren, Aktiva¬ toren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkom¬ plexes, welcher einen Typ eines EAACl -Proteins enthält, und insbesondere des humanen EAAC l -Proteins.24. Use of the method according to one of claims 1 to 19, for finding inhibitors, partial or temporary inhibitors, activators or modulators of an enzymatic property of a site of action complex, which contains a type of an EAACl protein, and in particular of human EAAC l proteins.
25. Verwenden des Testkits gemäß Anspruch 22, zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporären Inhibi¬ toren oder Modulatoren einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkom- plexes, welcher einen Typ eines EAACl -Proteins enthält, und insbesondere des humanen EAACl -Proteins.25. Use of the test kit according to claim 22, for finding inhibitors, activators, partial or temporary inhibitors or modulators of an enzymatic property of an active site complex which contains a type of an EAACl protein, and in particular of the human EAACl protein.
26. Verwenden eines Arzneimittels,26. Using a drug
- welches gemäß dem Verfahren nach Anspruch 21 hergestellt wurde,which was produced according to the method of claim 21,
- zur Inhibition, partiellen oder temporären Inhibition oder Modulation einer enzymatischen Eigenschaft eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ ei¬ nes EAACl -Proteins enthält, oder eines Teils davon und insbesondere des humanen EAAC l -Proteins. for the inhibition, partial or temporary inhibition or modulation of an enzymatic property of a site of action complex which contains a type of an EAAC1 protein, or a part thereof, and in particular the human EAAC1 protein.
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