WO2006035975A1 - ユビキチンリガーゼによるユビキチン化の標的タンパク質をスクリーニングする方法 - Google Patents

ユビキチンリガーゼによるユビキチン化の標的タンパク質をスクリーニングする方法 Download PDF

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Tsutomu Kishi
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/25—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving enzymes not classifiable in groups C12Q1/26 - C12Q1/66
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection

Definitions

  • the present invention relates to a novel screening method for identifying a target protein for ubiquitination of ubiquitin ligase.
  • the ubiquitin / proteasome system is a proteolytic system that exists universally in eukaryotes. This system consists of (1) a step in which ubiquitin ligase recognizes and ubiquitinates the protein to be degraded, and (2) a step in which the proteasome degrades the ubiquitinated protein. Since these two steps occur sequentially, the ubiquitinated protein is rapidly degraded.
  • ubiquitination Degradation of regulatory proteins that depend on ubiquitination is thought to be essential for maintaining normal cell function.
  • one of the ubiquitin ligases, SCF ubiquitin ligase and APC ubiquitin ligase regulate various cell growth processes including cell cycle, development, differentiation, and transcriptional regulation. Abnormalities cause various diseases including cancer.
  • SCF ubiquitin ligase is a ubiquitin ligase composed of Skpl, Cull (Cdc53 in budding yeast), F-box protein with binding motif F-box, and Rbxl. Binds to the N-terminal side of Cull through a bond, Rbxl Is the catalytic site, and Rbxl is bound to the C-terminal side of Cull.
  • the F-box protein with the F-box motif plays the role of recognizing (binding) the target protein for ubiquitination.
  • the F-box protein binds to the core of SCF ubiquitin ligase with the F-box motif. In addition to this F-box motif, it has a target protein binding region where the target protein is bound. As a result of genome analysis, it is clear that there are multiple F-box proteins. In addition, genetic analysis reveals that each F-box protein binds to a different target protein.
  • yeast two-hybrid system a technique for detecting protein-protein interactions, but preferably a technique called a yeast two-hybrid system is generally used.
  • the two-hybrid system is based on the fact that the activity of the transcription factor Ga requires two DNA binding domains (DB) and transcription activation domain (AD) (Non-patent Document 1).
  • DB-A transcription factor GAL4 DNA-binding domain and protein A fusion protein
  • AD-B transcription activation domain and protein B fusion Protein
  • APC / C ubiquitin ligase is a complex composed of multiple subunits, and the target protein binds to the target protein binding subunit of APC / C ubiquitin ligase.
  • Cdc20 and Hctl are known as target protein binding subunits.
  • Patent Document 1 U.S. Pat.No. 5,283,173
  • Non-Patent Document 1 Fields S and Song 0.
  • Non-Patent Document 2 Gyuris J, Golemis EA, Chertkov H, Brent R. Cdi l, a human Gl and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cel l 75: 791-803.
  • the application of the present application is to develop an experimental system for screening proteins ubiquitinated by SCF ubiquitin ligase or APC / C ubiquitin ligase, and to identify the target protein for ubiquitination using this system. .
  • the target protein of SCF ubiquitin ligase binds to the F-box protein
  • the target protein may be identified as a protein that binds to the F-box protein.
  • a technique called To-hybrid system that detects protein-protein interaction is generally used.
  • the target protein of SCF ubiquitin ligase is A
  • F_box protein is used for screening
  • B is the target protein
  • F-box protein and target protein B bind in the two-hybrid system, and the reporter gene Expression is expected to occur.
  • F-box protein binds to the target protein, it immediately ubiquitinates target protein B, leading to degradation. As a result, the target protein B is degraded before the reporter gene expression is induced, so that the reporter gene expression cannot be activated. As a result, it appears to be uncoupled. Therefore, in order to identify the target protein, it is necessary to overcome the problem that the target protein is degraded prior to detection of binding.
  • this experimental system can be applied to the screening of drugs that promote or inhibit ubiquitination.
  • the target protein for ubiquitination can be identified by stabilizing the target protein by the following method.
  • the inventor of the present application added (1) an entire F-box motif, which is considered to be a binding region to Skpl, not a full-length F-box protein, to the yeast two hybrid screening system. Using mutant F-box protein lacking the ability to bind to l as bait, and (2) mutant strains with reduced target protein resolution (eg, temperature sensitive mutants or deletion mutants) It has been found that the target protein can be stabilized and, as a result, can be screened by use, and the present invention has been made.
  • mutant F-box motif lacking the ability to bind to l as bait
  • mutant strains with reduced target protein resolution eg, temperature sensitive mutants or deletion mutants
  • the mutant F-box protein and the target protein can be extended in duration by deleting the F-box protein in yeast or inactivating it in a condition-dependent manner, for example, a temperature-dependent manner.
  • target protein of APC / C ubiquitin ligase can be mixed with the method of the present invention. Can be determined.
  • FIG. 1 is a diagram showing the detectability of a target protein using a conventional two hybrid system when Cdc 4 is used as an F-box protein.
  • FIG. 2 shows the improvement of the 2-hybrid system for searching for SCF ubiquitin ligase target proteins.
  • Figure 3 shows a variant of the two-hybrid system (Cdc4 and Sicl), a temperature-sensitive mutant or a deletion mutant that lacks the F-box motif to search for SCF ubiquitin ligase target proteins.
  • -It is a figure which shows the verification of the possibility of the screening of the target protein which uses a box protein as bait.
  • FIG. 4 is a diagram showing the removal of clones that give non-specific interactions using the binding characteristics of Cdc4.
  • FIG. 5 is a diagram showing the removal of clones that give non-specific interactions using the stabilization of target proteins as an index.
  • FIG. 6 shows the proteins identified in this experimental system.
  • the screening procedure is to screen in a stabilized state and use false positives, and (1) binding specificity and (2) two different characteristics with stabilization as indices. Use and remove. Next, (3) the protein half-life is compared between the wild type and the cdc4 mutant to confirm that it is the target protein.
  • FIG. 7 shows that a proteasome temperature-sensitive mutation (prel-1 strain) can be used as a screening host.
  • Cdc4-dF and Cdc4 can also be used.
  • Figure 7 shows the case of using Cdc4.
  • FIG. 8 shows a methodology for identification of APC / C target proteins. Clb2 It is shown that the binding of Hctl and Clb2 can be detected under the condition that is stabilized. In addition, Hctl-dC is used as bait after removing C-box, which is the binding area with APC / C.
  • FIG. 9 shows the proteins identified in this experimental system.
  • Figure 10 shows a schematic diagram of SCF and APC / C.
  • the ubiquitin ligase target protein screening method of the present invention includes, for example,
  • an improved system based on various two-hybrid systems can be used.
  • a two-hybrid system a system using yeast, prokaryote, or mammalian cell is known.
  • the method for identifying the target protein of the ubiquitin ligase of the present invention includes:
  • (2-b) obtained by transforming with a target protein candidate and a gene encoding the second fusion protein containing the second region
  • examples of the ubiquitin ligase include SCF ubiquitin ligase and APC / C ubiquitin ligase.
  • a known method for detecting whether or not the first fusion protein and the second fusion protein bind in the cell (hereinafter referred to as a known in vivo protein interaction detection method) is used.
  • transcription factor DNA binding region and transcription factor activation region specifically (mouth) transcription factor Gal4 DNA binding region and transcription factor Gal4 activity
  • C Escherichia coli transcription factor LexA DNA binding domain and transcription factor B42 activation domain
  • ii Ga DNA binding region and V16 activation region
  • e transcription factor DNA binding region and transcription factor repression region
  • (f) N-intein and C-intein (g) SOS And (1) a T25 fragment of calmodulin-dependent adenylyl cyclase and a T17 fragment of calmodulin-dependent adenyl cyclase.
  • the method of the present invention activates the expression of the third gene by, for example, the interaction between the first fusion protein and the second fusion protein, in other words, binding or association in the cell.
  • the first fusion protein is a fusion protein comprising a mutant F-box protein A lacking the F-box motif and a DNA binding domain (hereinafter referred to as DB) of a transcription factor
  • DB DNA binding domain
  • the second fusion protein is a fusion protein of F-box target protein B and a transcription factor activation domain (hereinafter referred to as AD), and (c) the cell degrades the target protein.
  • the A region of the first fusion protein and the B region of the second fusion protein are combined to activate or suppress the expression of the third gene.
  • a method for identifying a target protein of SCF ubiquitin ligase using cells is included.
  • Examples of the known in vivo protein interaction detection method include the following methods.
  • the BD region of the first fusion protein gene is the DNA binding region of transcription factor Gal4 and the AD region of the second fusion protein
  • GAL4 ( ⁇ ) which is an activation region of the transcription factor Gal4
  • the third gene is a reporter gene, and lacks the transcription factor.
  • the DNA binding region is a Gal4 DNA binding region
  • the activation region is a Gal4 activation region
  • the mutant cell is a GAL4 ( ⁇ ) budding yeast.
  • the BD region of the first fusion protein gene is the DNA binding region of the Escherichia coli transcription factor LexA
  • the AD region of the second fusion protein is the activation region of the transcription factor B42
  • (C) Mammalian cell two-hybrid method The BD region of the first fusion protein gene is the DNA binding region of Gal4, the AD region of the second fusion protein is the V16 activation region, and the third gene is the reporter. A method wherein the gene is a mammalian cell HeLa. (Clonetech Matchmaker Mammalian Cell 2-Hybrid Assay Kit)
  • Transcription factor suppression A method in which the first region of the first fusion protein gene is the transcription factor DNA binding region and the second region of the second fusion protein is the transcription factor suppression region. (See US Pat. No. 5885779.)
  • CytoTrap (TM) method The region corresponding to the first region of the first fusion protein gene is the SOS protein, the second region of the second fusion protein is Myristylation signal, and the mutant strain The method wherein the cell is a cdc 2 5 H strain.
  • the region corresponding to the BD region of the first fusion protein is the first region (or fragment) of the enzyme, and the second fusion protein
  • the region corresponding to the AD region is the second region (fragment) of the enzyme.
  • the first region of the enzyme is a T25 fragment of calmodulin-dependent adenyl cyclase
  • the second region of the enzyme is a T17 fragment of calmodulin-dependent adenylyl cyclase
  • the mutant is a calmodulin-dependent adenyl cyclase-deficient bacterium.
  • C-box protein is required to bind to APC / C ubiquitin ligase
  • the first fusion protein includes an F-box protein or a mutant F-box protein and a first region.
  • Any F-box protein can be used in the present invention as long as it is an F-box protein constituting SCF ubiquitin ligase.
  • yeasts known to function as subunits of SCF ubiquitin ligase are Cdc4, Met30, Grrl, YJL204C, YJL149W, Y and R097C, YLR224W, YLR368W, Y L088, YDR131C, YDR306C, YNL311C, Y0R080W, and Ctfl3.
  • Mutant F-box is child encoding the mutant F-box protein lacking the F-box motif:
  • F-box motif is an F-box motif represented by a sequence when represented by a single letter of amino acid (Trends in Genetics. 14: 236-243 (1998).
  • the mutant F-box protein lacking the box motif is the mutation of the F-Box protein described above, or the mutation of the F-bo X motif to the extent that it cannot bind to Skpl.
  • a mutant F-Box protein in which one or more amino acids in the amino acid sequence, preferably 1 to several amino acids, are selected from deletion, addition or substitution is mutated (hereinafter referred to as F-Box protein). It is described as a mutant F-box protein lacking the box motif).
  • () means the same position in the amino acid sequence.
  • L means leucine
  • I means isoloicin
  • V means nocrine
  • D means aspartic acid
  • C means cysteine
  • K means lysine
  • R means arginine
  • W means tryptophan.
  • X means any amino acid. However, it is not necessarily the same as the designated amino acid.
  • the mutant F-box protein required here must be unable to bind to Skpl. Therefore, it goes without saying that not only mutant F-box proteins lacking the F-box motif but also mutant F_box proteins that cannot bind to Skpl are effective.
  • the first fusion protein is composed of a mutant F-box protein lacking the F-box protein or F-box motif and the first region.
  • the first fusion protein contains a mutant F-box protein lacking the F-box motif.
  • the cell force S used for screening is a mutation of the F-box protein gene.
  • transcription factor DNA binding region or transcription factor activation region specifically (mouth) transcription factor Gal4 DNA binding region or The activation region of transcription factor Gal4, (c) the DNA binding region of E. coli transcription factor LexA or the activation region of transcription factor B42, and (ii) the DNA binding region of Ga or the activation region of V16.
  • the second fusion protein includes a target protein candidate and a second region.
  • Target protein and target protein candidates are identical to Target protein and target protein candidates.
  • the candidate can be used.
  • a gene encoding a target protein candidate a genomic library or a cDNA library can be used.
  • the second region of the second fusion protein includes the second region described above.
  • transcription factor DNA binding region or transcription factor activation region Specifically, (mouth) transcription factor Gal4 DNA binding region or transcription factor Gal4 activation region, (c) E.
  • the target protein binds to the F_box protein, (1) it is not ubiquitinated or (2) it is mutated so that it will not undergo proteolysis even if it is ubiquitinated.
  • F-box protein genes that are essential genes are CDC4, MET30, and CTF13.
  • Temperature-sensitive mutants of these essential genes can be distributed from isolated researchers or can be produced by Kanemaki et al, Nature 423 (2993) 720-724 .
  • deletion mutants of these genes can be used. This deletion mutant is, for example, Longtine et al,
  • these F-Box mutants can be prepared by the following method.
  • the temperature-sensitive mutant strains of these essential genes can be generated by the method of Kanemaki et al, Nature 423 (2993) 720-724, or can be generated by a separate researcher.
  • deletion mutants of these genes can be used. This deletion mutant is, for example, Longtine et al, It can be adjusted by a conventional method such as the method described in Yeast, 953-961 (1998). Or you can purchase it from OPEN BI0SYSTEM, EUR0SCARF.
  • the gene region corresponding to the F-box motif may be deleted by genetic recombination technology.
  • Cdc4 which is one of the F-box proteins of Saccharomyces cerevisiae
  • a sequence from which 282 amino acid residues to 320 amino acid residues are deleted can be used.
  • this mutant F-box protein can also be used.
  • Saccharomyces cerevisiae genomic libraries and cDNA libraries can be prepared by cloning into expression vectors such as pJG4-5.
  • Recombinant mutant F-box gene into an expression vector incorporating LexA DNA-binding domain prepare a vector that can express a protein fused with LexA DNA-binding domain and mutant F-box.
  • pGilda can be used as the expression vector.
  • Recombining a gene in a yeast gene library into an expression vector incorporating the transcriptional activation domain of B42 Prepare a vector library that can express proteins fused with the transcriptional activation domain of B42 and various proteins to be tested
  • the An expression vector such as pJG4-5 can be used.
  • a well-known method for introducing a vector into yeast can be used. For example, the method described in Gietz RD, SchiestlRH Methods Mol. Cell Biol 5: 255-269 (1995) can be used.
  • the F-box deletion mutant is transformed with the byte and library, and the resulting strain is colonized.
  • the reporter gene LacZ is expressed using a synthetic medium containing X-gal, and as a result, colonies that turn blue are picked up.
  • the F-box protein has a motif that binds to the target protein, such as WD (tryptophan faspartic acid) 40 repeat or LRR (Leucine rich repeat).
  • WD tryptophan faspartic acid
  • LRR Leucine rich repeat
  • Cdc4 has WD40.
  • the additional U F-box protein Met30 also has WD40 similar to Cdc4, but Cdc4 and Met30 are involved in the binding of other target proteins. Therefore, the Cdc4-dF-Met30-WD, which replaces the Cdc4 WD and Met30 WD, is cloned into pGilda.
  • the target protein binding region of the F-box protein is WD40
  • the target protein binding region is an F-box protein other than the F-box protein.
  • WD40 an F-box protein whose WD is WD40, can be used.
  • the target protein binding region of the F-box protein is LRR
  • the LRR of an F-box protein other than the F_box protein and the target protein binding region is LRR
  • the clone that gives a positive signal is identified as the clone that encodes the target protein, and the nucleotide sequence is determined.
  • PCR amplification is performed from the start codon of the gene encoding the determined target protein to immediately before the stop codon.
  • the amplified DNA fragment is fused with the LacZ gene.
  • the resulting plasmid is introduced into the F-box mutant and wild type. If the protein is ubiquitinated / degraded depending on the specific F-box, the fusion protein of the protein and LacZ is also degraded in the wild strain but stabilized in the F-box mutant. . Therefore, the colonies are filtered with a synthetic medium containing X-gal to leave positive (blue) clones.
  • Whether the identified target protein is really degraded by SCF ubiquitin ligase can be examined by comparing half-life at the protein level. The amount of protein is examined by Western blotting.
  • As the antibody to be used if there is already an antibody of a candidate protein of the target protein, The antibody is used to detect the protein. If there is no antibody, recombination
  • epitope tag a short amino acid sequence (epitope tag) is fused with a candidate protein for the target protein, and the fusion protein is detected using an epitope specific antibody.
  • epitope tag a peptide consisting of 9 amino acids derived from the hemagglutinin protein (hereinafter referred to as HA) or 9E10 epitope derived from human C-myc protein is used.
  • HA hemagglutinin protein
  • 9E10 epitope derived from human C-myc protein 9E10 epitope derived from human C-myc protein
  • the target protein and Epitope fusion protein is expressed in a wild strain of Saccharomyces cerevisiae and a mutant of the budding fermentation F-box protein gene.
  • the protein synthesis inhibitor cychloheximide purchased by SIGMA
  • SIGMA protein synthesis inhibitor
  • cells were collected at intervals of 15 minutes, and the protein extract was extracted. Is made.
  • the method described in Yeong FM et al. Mol. Cell 5: 501-511 (2000) is used.
  • Western Blotting is performed, and the amount of the fusion protein is examined using an epitope specific antibody. If the protein being studied is a target protein, it is unstable in the wild strain and has a short half-life, but in the mutant strain it should be stabilized and have a longer half-life. Those that satisfy this condition can be reconfirmed as target proteins.
  • V-2 Identification of target protein of human SCF ubiquitin ligase by budding yeast screening system
  • target proteins of mammalian SCF ubiquitin ligases such as humans can be identified.
  • temperature-sensitive mutants of genes other than the F-box protein gene constituting the SCF ubiquitin ligase can be used as mutant cells with reduced target protein degradation. it can.
  • a proteasome mutant that degrades ubiquitinated proteins e.g. cdc34 strain, cdc53 strain, skpl strain
  • proteasome inhibitors that are proteolytic inhibitors such as MG132 (available from SIGMA) Cells treated with can be used.
  • Proteasome inhibitor MG132 In the case of using (SIGMA), an er g 6 mutant strain (a mutant strain of membrane lipid synthase, which has increased the membrane permeation activity of a drug containing the proteasome inhibitor MG132) can be used. .
  • a human F-box protein or a human F-box protein lacking the F-box motif and a gene encoding a fusion protein comprising the first region are used. be able to.
  • a gene encoding the second fusion protein a gene encoding a fusion protein consisting of a candidate for the human target protein and the second region can be used.
  • the target protein of APC / C ubiquitin ligase can be identified.
  • a temperature-sensitive mutant or a mutant mutant of the subunit gene constituting the APC / C ubiquitin ligase can be used.
  • a proteasome mutant that degrades ubiquitinated proteins eg, a temperature-sensitive prel-1 mutant
  • a cell treated with a proteasome inhibitor such as MG132 (available from SIGMA).
  • Cdc20 or Hctl (or a human homolog thereof) as a C-Box, or a gene encoding a fusion protein composed of a mutant thereof and the first region can be used.
  • a gene lacking the C-box motif for example, a mutant lacking a region containing the Hctl C-box motif can be used.
  • C-box motif is the C-box motif represented by the sequence DR (F / Y) IPXR when expressed in the amino acid single letter code (The EMBO Journal Vol. 20, No. 18, pp. 5165-5175).
  • the mutant F_box protein lacking the C-box motif is the mutation in the C-Box protein described above, in which all of the motifs are deleted, or to the extent that it cannot bind to APC / C.
  • Examples include mutant C-Box proteins in which one or more amino acids, preferably 1 to several amino acids in the amino acid sequence are mutated at least one selected from deletion, addition or substitution (hereinafter referred to as C-). It is described as a mutant C-box protein lacking the box motif).
  • mutant C-box protein required here must not be able to bind to APC / C. Therefore, it goes without saying that not only mutant C-box proteins lacking the C-box motif but also mutant C-box proteins that can no longer bind to APC / C are effective.
  • a gene encoding the second fusion protein a gene encoding a fusion protein consisting of the target protein candidate and the second region can be used.
  • the bait protein is expressed in the cdc25H mutant yeast as a fusion protein with human SOS protein and the target protein as a fusion protein with myristylation signal.
  • the SOS protein activates Ras in the form of a membrane and can survive at 37 degrees.
  • F-box / cdc25H mutant yeast in which the F-box mutant was further mutated by a conventional method, was further prepared from the cdc25H mutant yeast, and the F-box protein lacking the F-box motif was also prepared.
  • the target protein can be screened by transformation with a gene that encodes a fusion protein of a human SOS protein fused with a myristylation signal fused to a library containing the target protein. .
  • Mammals Use the two-hybrid method.
  • the bait protein is expressed in HeLa cells as a fusion protein with the yeast Gal4 DB, and the target protein as a fusion protein with AD of V16.
  • the expression of the reporter gene SEAP is observed.
  • the target protein can be screened by transformation with. In this case, it can be used to identify the target protein of mammalian SCF ubiquitin ligase such as human.
  • SCF ubiquitin ligase such as human.
  • proteasome inhibitors can be used as a means of reducing the resolution of target proteins in cells. It is also possible to use cells with reduced SCF ubiquitin ligase or proteasome activity using siRNA techniques (eg Watanabe N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 4419). —4424 (2004)).
  • This mammalian two-hybrid method uses, for example, the binding of the target protein and human F-box protein revealed in human target protein screening using V-2 yeast to human HeLa cells. It can also be used for verification with.
  • HeLa cells were transformed with the gene encoding the fusion protein gene of the human F-box protein gene and the Gal4 DB, and the fusion protein of the target protein and the V16 cage, and the presence of proteasome inhibitors Upon expression, the expression of the reporter gene SEAP can be examined.
  • a fusion protein gene of human F-box protein gene library and V16 AD and a gene encoding a fusion protein of target protein and Gal4 DB. Nare ,.
  • the target protein for APC / C ubiquitin ligase The protein can be identified.
  • the budding yeast strains used in the following examples and reference examples are as follows. Wild strain W303 strain (ATCC200903 etc.)
  • the cdc4-1 strain can be purchased from ATCC (200625, 208543, 208544). Use with wild strains if necessary.
  • the sicl mutation was introduced by the method of Longtine et al, Yeastl4, 953-961 (1998). In this screening, the sicl mutation need not be introduced at all.
  • the hctl mutation was introduced into the W303 strain by the method of Longtine et al, YeastH, 953-961 (1998).
  • pGilda-Cdc4 The full-length CDC4 was amplified by PCR on commercially available pGilda (OriGene), and then cloned by cutting with BamHISall.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the cocoon type is
  • Primers are ATGGATCCCGATGGGGTCGTTTCCCTTAGC and
  • pGi lda-Cdc4-dF deletion of the F-box motif (amino acid residues 281-320 of CDC4)
  • Cdc4-dF was cloned into pGilda. Specifically, 0 to 4 amino acid residues 1-281 were amplified by PCR and cleaved with BamHI EcoRI. Saccharomyces cerevisiae chromosomes used as cocoon type
  • the primer is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl
  • ATGGATCCCGATGGGGTCGTTTCCCTTAGC and CAGAATTCCAAAGACGTTATTAGGTCCCTC were used.
  • DNA sequence encoding from amino acid residue 321 to the C terminus of CDC 4 was amplified by PCR and then cut with EcoRI Sail.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the saddle type was purchased from Invitrogen.
  • CGGAATTCATATCGGAAAATTTTGTGAGCCC and CGGTCGACCAAAGACGTTATTAGGTCCCT were used as primers.
  • Cdc4-dF- Met30WD prepared by fusing the amino acid residues 1-281 of Cdc4 and 228 to C-terminal of Met30 was cloned into pGi lda .
  • the DNA sequence coding for amino acids 1-281 of Cdc4 was amplified by PCR.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the saddle type was purchased from Invitrogen.
  • ATGGATCCCGATGGGGTCGTTTCCCTTAGC and ACGCGGCCGCTCAAAGACGTTATTAGGTCC were used.
  • the DNA sequence encoding Met30 from position 228 to the C terminus was amplified by PCR.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the saddle type was purchased from Invitrogen.
  • AAGCGGCCGCTGCGAGCAGCACATAGACAG and AGTCGACCTAATCATTGAGATCGAATTTG were used.
  • PJG4-5-ASC-SIC1 The entire budding yeast SIC1 amplified by PCR was cleaved into pJG4-5 with EcoRI Notl.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the cocoon was purchased from Invitrogen. Primers used AAGAATTCGGCGCGCCAATGACTCCTTCCA and TTGCGGCCGCATGCTCTTGATCCCTAGATT.
  • Saccharomyces cerevisiae library The library part of the library (Ito et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 1143— 1147 (2001)) containing the entire 0RF (0pen reading frame) of budding yeast is restricted to the restriction enzyme (Ascl). Notl) and replaced with SIC1 part of pJG4- 5- ASC-SIC1.
  • pURA3-Gal lp-HA Amplification from pYES2 (Invitrogen) GALlpromoter to CYC1 terminator by PCR (primers used were AATCTAGACGGATTAGAAGCCGCCGAG
  • YCplac33 (Gene, 74 (1998) 527-534) Basically, any budding yeast plasmid that has URA3 as a marker can be used.
  • pRS306 that can be purchased from ATCC. Can also be used.
  • Plastic Lee Ma one of the DNA fragments amplified by PCR the region was cloned for (using comprising HA Epitopu as ⁇ is CAAAATGTCTGCGGCCGCCATCTTTTACCCATACGAT and AAGCATGCGGCGCGCCTCAGCACTGAGC). Any budding yeast plasmid for expressing a fusion protein with HA epitopes can be substituted.
  • PURA3- SICl-LacZ First, after amplification of the E. coli LacZ gene by PCR (the primer used was TAGCGGCCGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTG)
  • pGilda-HCTl The full length of HCT1 was amplified by PCR into commercially available pGilda (OriGene), then cloned with BamHISall.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the saddle type was purchased from Invitrogen. CCGGATCCCGATGTCCACAAACCTGAACCC and CCGTCGACCTAACGTATTTGATTAAATG were used as primers.
  • Hctl-dC lacking the N-terminal region containing the C-box motif was cloned into pGi lda. Specifically, amino acid residues 99-566 of HCT1 were amplified by PCR and then cleaved with BamHI EcoRI.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the saddle type was purchased from Invitrogen. CCGAATTCGCACATGAAACTTATAATAC and CCGTCGACCTAACGTATTTGATTAAATG were used as primers.
  • PJG4-5-ASC-CLB2 The entire budding yeast CLB2 amplified by PCR was cleaved into pJG4_5 with Ascl Notl and cloned.
  • the budding yeast chromosomal DNA used as the cocoon type was purchased from Invitrogen.
  • As the primers AAGGCGCGCCGATGTCCAACCCAATAGAAAT and GAGCGGCCGCTCATTCATGCAAGGTCATTA were used.
  • Sicl is a protein known to be the target protein of SCF ubiquitin ligase with Cdc4 as F_box. So, with a two-hybrid system,
  • Two-hybrid system (using the DupLEX-A Yeast 2-Hyprid system kit purchased from OriGene (described in I- (Mouth)): (Activation of the DNA-binding domain of E. coli transcription factor LexA and transcription factor B42) The two-hybrid method using the region) was transformed with pGilda-Cdc4 and PJG4-5-ASC-SIC1 in the usual way (Fig. 1) In this way, the target protein for ubiquitination is identified.
  • Example 1 is not possible with a normal two-hybrid system.
  • Transform TK-505 or a wild strain with the following plasmids and transfer the resulting colonies to a membrane (hybond-N Araersham: 88 mm in diameter). Place it on a synthetic medium (agar medium) containing X-gal and raffinose and galactose as carbon sources and incubate at a permissible temperature of 30 ° C or a non-permissive temperature of 37 ° C for 12 hours (below) Filter).
  • the reporter gene LacZ was expressed, and as a result, it was examined whether the colonies turned blue.
  • Wild strains were transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SIC and pGilda_Cdc4 and cultured at an allowable temperature of 30 for 24 hours.
  • Wild strains were transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SICK and pGilda-Cdc4-dF and cultured at a permissive temperature of 30 for 24 hours.
  • TK-505 is transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SIC1, and pGilda-Cdc4-dF, cultured for 12 hours at permissive temperature, and cultured for 12 hours at non-permissive temperature 37 ° did.
  • TK-505 was transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SIC1, and pGilda_Cdc4-dF, and cultured at an allowable temperature of 30 for 24 hours.
  • TK505 strain is transformed with pGilda-Cdc4-dF and pSH18-34.
  • the budding yeast library was introduced into the obtained strain (TK505 / pGilda-Cdc4-dF + pSH18-34) (in accordance with the conventional method).
  • the reporter gene LacZ is expressed. As a result, colonies that turn blue are cultured, and the plasmid is isolated and transformed into E. coli KC8 strain (purchased from Clonetech) according to a conventional method. Extracted and purified.
  • the obtained clone was again introduced into TK505 I pGilda -Cdc4-dF + pSH18-34, and filter assembly was performed in the same manner. As a result, non-reproducible items were discarded.
  • F-box protein is WD (tryptophan aspartic acid) It has a motif that binds to the target protein, such as 40 repeats or LRR (Leucine rich repeat). In case of Cdc4, it has WD40.
  • Another F-box protein, Met30, also has a WD40 similar to Cdc4, but Cdc4 and Met30 are involved in the binding of other target proteins.
  • a plasmid for use was made.
  • the resulting plasmid was introduced into cdc4 mutant and wild type. If the protein being investigated is ubiquitinated / degraded depending on Cdc4, the fusion protein of LacZ and the protein is unstable in the wild type. On the other hand, in the cdc4 mutant strain (TK505 strain), since the protein is stabilized, the fusion protein should also be stabilized.
  • the colonies are transferred to a filter and placed on a synthetic medium (agar medium) containing X-gal and raffinose and galactose as a carbon source for filter assembly. Leave a clone that turns blue here.
  • Figure 5 shows the results for SIC1.
  • the protein synthesis inhibitor cychloheximide (purchased from SIGMA) was added at a final concentration of 50 g / ml to stop the expression of the fusion protein.
  • cells were collected at 15-minute intervals, and a protein extract was prepared by the method described in Yeong FM et al. Mol. Cel 5: 501-511 (2000).
  • Western Blotting was performed, and the amount of the fusion protein was examined using an anti-HA (12CA5) antibody (purchased from Roche).
  • the target protein was unstable in the wild strain but stabilized in the mutant strain.
  • the new target proteins of SCF ubiquitin ligase that have been clarified in this experiment are Swi5, a transcription factor of cell cycle regulator, and Rcnl, which regulates the activity of calcineurin, a regulator of calcium signaling.
  • Swi5 a transcription factor of cell cycle regulator
  • Rcnl a transcription factor of cell cycle regulator
  • Example 2 One of the target proteins revealed in Example 2 has a homolog in human. Therefore, the F-box protein necessary for ubiquitination of this human homolog can be screened. Humans whose full-length sequences have been known so far
  • the F-box protein cloned in the pGilda prepared above was introduced into the obtained transformant.
  • Example 4 The same filter assembly as in Example 1 was performed. After culturing for 12 hours at an allowable temperature in advance, The cells were cultured at 37 ° C (non-permissible temperature) for 24 hours. As a result, there was one that gave a blue signal. This had a structure similar to that of budding yeast Cdc4 and was thought to be a human homologue of Cdc4.
  • Example 4
  • the prel-1 strain (proteasome temperature-sensitive mutant) or the wild strain is transformed with the following plasmid, and the resulting colonies are transferred to a membrane (hybond-NAmers: diameter: 88 mm). Place it on a synthetic medium (agar medium) containing X-gal and raffinose and galactose as carbon sources and incubate at a permissible temperature of 30 ° C or a non-permissive temperature of 37 for 12 hr (hereinafter referred to as filter assembly). And).
  • the reporter gene LacZ was expressed, and as a result, it was examined whether the colonies turned blue.
  • Wild strains were transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SIC1, and pGilda_Cdc4 and cultured at a permissive temperature of 30 for 24 hours.
  • the prel-1 strain was transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SIC1, and pGilda-Cdc4, cultured at a permissive temperature for 12 hours, and then cultured at a non-permissive temperature of 37 ° C for 12 hours. .
  • the prel-1 strain was transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-SIC1, and pGilda-Cdc4, and cultured at an allowable temperature of 30 for 24 hours.
  • the target protein can be screened using a temperature-sensitive mutant of proteasome.
  • Example 4 Cdc4-dF can be used instead of Cdc4.
  • Clb2 is a target protein of APC / C ubiquitin ligase with Hct l as C-box It is a protein known to be. Therefore, bait was prepared using Hctl as a C-box protein in a two-hybrid system, and it was examined whether binding to Clb2 could be detected.
  • TK-542 or wild type is transformed with the following plasmid, and the resulting colonies are transferred to a membrane (hybond-N Amersham: diameter 88 mm). Place on a synthetic medium (agar medium) containing X-gal and raffinose and galactose as a carbon source and incubate for 12 hours at a permissible temperature of 30 ° C or non-permissive temperature of 37 ° C (below) Filter).
  • the reporter gene LacZ was expressed, and as a result, it was examined whether the colonies turned blue.
  • Wild strains were transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-CLB2, and pGilda-HCT1, and cultured at 30 ° C. for 24 hours.
  • Wild strains were transformed with pSH18-34, pJG4-5-ASC-CLB2, and pGilda-HCTl-dC and cultured at 30 for 24 hours.
  • the TK542 strain is transformed with pGilda-Hctl_dC and pSH18-34.
  • the budding yeast library was introduced into the obtained strain (TK505 / pGilda-Hctl-dC + pSH18-34) (in accordance with the conventional method).
  • the colonies were transferred to a membrane (hybond-N Amersham: 88 mm in diameter) and placed on a synthetic medium (agar medium) containing raffinose and galactose as a carbon source containing X-gal and incubated at 30 ° C for 24 hours (below) It was a filter assembly.)
  • the reporter gene LacZ is expressed, and as a result, the colonies that turn blue are cultured, and the plasmid is isolated and transformed into E. coli KC8 (purchased from Clonetech) according to a conventional method, and the plasmid is extracted from the colonies that emerge. Purified.
  • the candidate plasmids obtained so far were introduced into the wild type strain and the hctl mutant.
  • the transformant was cultured in a medium containing raffinose as a carbon source, and then cultured to about 1-2 ⁇ 10 7 cells.
  • galactose was added to a final concentration of 2%, and a fusion protein encoded by ⁇ RF-HA was produced.
  • the protein synthesis inhibitor cychloheximide purchased from SIGMA
  • the target proteins of APC / C ubiquitin ligase that have been clarified so far in this experiment are cell cycle regulators Clbl and UAH1.
  • the target protein for ubiquitination can be clarified.
  • it can be used for screening and evaluation of therapeutic drugs.
  • the target proteins of SCF ubiquitin ligase and APC / C ubiquitin ligase were screened.
  • a new target protein was clarified.
  • These include transcription factors involved in cell cycle control and regulators of force signaling.
  • the present invention is useful for screening and evaluation of therapeutic agents.
  • the method of the present invention comprises:
  • drugs that promote the binding of F-box protein and target protein and drugs that inhibit the binding of C-Box protein and target protein are candidates for therapeutic agents. It can be. Thus, it is used as an experimental system for screening and evaluating agents that promote or inhibit the binding of F-box protein and target protein and agents that promote or inhibit the binding of C-Box protein and target protein. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

　ユビキチンリガーゼによってユビキチン化されるタンパク質をスクリーニングする実験系を開発し、これを用いてユビキチン化の標的タンパク質を同定することを課題とする。　酵母two hybridスクリーニング系に、（１）完全長のF-boxタンパク質ではなく、Skp1との結合領域であると考えられているF-boxモチーフを、全体あるいはSkp1と結合できなくなる程度を欠失した変異型F-boxタンパク質をbaitとして用い、更に（２）標的タンパク質の分解能が低下した変異株（例えば、温度感受性変異株あるいは欠失変異株）用いることにより、標的タンパク質を安定化でき、結果としてスクリーニングできることを見出した。

Description

ュビキチンリガーゼによるュビキチン化の標的タンパク質をスクリ一二ングする 方法 技術分野
本発明はュビキチンリガーゼのュビキチン化の標的タンパク質を同定するため の新規のスクリーニング方法に関する。
明 背景技術 田
ュビキチン/プロテアソーム系は真核生物に普遍的に存在するタンパク質分解 系である。 この系では、 まず、 （1 ) 分解すべきタンパク質をュビキチンリガーゼ が認識し、 ュビキチン化するステップと、 （2 ) ュビキチン化されたタンパク質を プロテアソームが分解するステップからなっている。 この二つのステップは連続 して起きているので、 ュビキチン化されたタンパク質は急速に分解される。
ュビキチン化に依存した制御タンパク質の分解は、 細胞機能を正常に保っため に必須であると考えられている。 特に、 ュビキチンリガーゼの一つである SCFュ ビキチンリガーゼ及び APCュビキチンリガーゼは、 細胞周期、 発生、 分化、 転写 制御をはじめとした様々な細胞増殖の過程を制御しており、 このュビキチン化の 異常は癌をはじめとした様々な疾患を引き起こす。
SCF ュビキチンリガーゼ及び APC/C ュビキチンリガーゼ（Anaphase promoting complex or cyclosome)の細胞機能制御の全体像を把握するため、 ひいては、 ュビ キチン化の異常に起因する病態の原因解明及び治療法を開発するためには、 ュビ キチン化の標的タンパク質を同定することが不可欠である。 しかし、 SCF ュビキ チンリガーゼはタンパク質分解系の一つであるために、 その標的タンパク質の半 減期が極めて短いため、 標的タンパク質の同定は極めて困難である。
SCFュビキチンリガーゼは、 Skpl、 Cul l (出芽酵母では Cdc53)、 Skpl との結合 モチーフ F-boxを持つ F- boxタンパク質、 及び Rbxlから構成されるュビキチン リガーゼであり、 F-Boxは Skpl との結合を介して Cul lの N末端側に結合し、 Rbxl が触媒部位であり、 Rbxlは Cul lの C末端側に結合している。 この中で、 ュビキ チン化の標的タンパク質の認識 （結合） を行う役割を果たすのが、 F- box モチ一 フを持つ F- boxタンパク質である。
F-boxタンパク質は、 F- boxモチーフで SCFュビキチンリガーゼのコアと結合す る。 この F- boxモチーフ以外に、 標的タンパク質結合領域を持ち、 ここで、 標的 タンパク質を結合する。 ゲノム解析の結果、 複数の F- box タンパク質が存在する ことが明らかになつている。 また、 それぞれの F- boxタンパク質が、 異なる標的 タンパク質と結合することが遺伝的な解析から明らかになつている。
ところで、 タンパク質間相互作用を検出する方法として、 いくつか知られてい るが、 好適には、 酵母 2-ハイブリッ ド （Two- hybrid) システムという手法が一般 的に用いられる。
Two- hybridシステムは、 転写因子 Ga の活性に、 DNA結合ドメイン （DB) と転 写活性化ドメイン（AD) の二つが必要であることを利用した系である（非特許文献 1)。
あるタンパク質 Aとタンパク質 Bとが相互作用をするかどうかを調べるために、 まず、転写因子 GAL4の DNA結合ドメインとタンパク質 Aの融合タンパク質（DB-A) と、 転写活性化ドメインとタンパク質 Bの融合タンパク質 （AD-B) を酵母内で発 現させる。 DB-A及び AD-Bはそれぞれ単独では転写因子としては機能できないが、 もし、 A と Bが結合すれば、 転写活性に必要な DMA結合ドメインと転写活性化ド メインの二つ持つことになるので、 転写因子として機能することができる。 した がって、 レポーター遺伝子の発現を調べることにより、 A と Bが結合するのかを 容易に調べることができる。
この時、 Bとして遺伝子ライブラリーを用いれば、 A と結合する未知のタンパク 質をスクリ一ユングできる。
同様に、 APC/C ュビキチンリガーゼも複数のサブュニッ トから構成される複合 体であり、 標的タンパク質は、 APC/C ュビキチンリガーゼの標的蛋白質結合サブ ユニッ トと結合する。 標的蛋白質結合サブュニッ トとしては、 Cdc20及び Hctlが 知られている。
特許文献 1 米国特許第 5283173号 非特許文献 1 Fields S and Song 0. A novel genetic system to detect protein-protein interact ion. Nature 340 ·' 245-246.
非特許文献 2 Gyuris J, Golemi s EA， Chertkov H, Brent R. Cdi l, a human Gl and S phase protein phosphatase that associates with Cdk2. Cel l 75 : 791-803. 発明の開示
本願出願は、 SCFュビキチンリガーゼ又は APC/Cュビキチンリガーゼによって ュビキチン化されるタンパク質をスクリ一二ングする実験系を開発し、 これを用 いてュビキチン化の標的タンパク質を同定することを課題とする。
SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質は、 F-boxタンパク質と結合するので, F-box タンパク質と結合するタンパク質として標的タンパク質を同定できる可能 性がある。 このような場合に、 タンパク質間相互作用を検出する T o-hybridシス テムという手法が一般的に用いられる。
しかしながら、 ュビキチン経路で分解されるようなタンパク質の場合には、 従 来の方法では、 タンパク質間相互作用を検出することが困難であった。
SCFュビキチンリガーゼの標的タンパグ質を Aとして、 F_boxタンパク質を用い てスクリーニングし、 Bが標的タンパク質であるとすると、 Two-hybridシステム では、 F- boxタンパク質と標的タンパク質 Bが結合し、 レポーター遺伝子の発現 がおこることが期待される。
しかし、 F - box タンパク質は標的タンパク質と結合すると、 直ちに標的タンパ ク質 Bをュビキチン化し分解へと導く。 その結果、 レポーター遺伝子の発現を誘 導するより前に、 標的タンパク質 Bが分解されてしまうので、 レポーター遺伝子 の発現を活性化するには至らない。 その結果、 見かけ上、 結合してないように見 えることになる。 したがって、 標的タンパク質を同定するためには、 結合の検出 前に標的タンパク質が分解されるという問題点を克服する必要がある。
また、 標的タンパク質が同定されたら、 この実験系を、 ュビキチン化を促進あ るいは抑制する薬剤のスクリーユングにも応用することができる。
従来の Two - hybri d systemを用いて、 F- box と結合するタンパク質として、 ュ ビキチン化の標的タンパク質を同定することは困難であり、 成功例は報告されて いない。
しかし、 以下の方法で、 標的タンパク質を安定化することにより、 ュビキチン 化の標的タンパク質を同定することが可能となることを見いだした。
本願発明者は、 酵母 two hybri dスク リーニング系に、 （ 1 ) 完全長の F- box タ ンパク質ではなく、Skplとの結合領域であると考えられている F-boxモチーフを、 全体あるいは Skp l と結合できなくなる程度を欠失した変異型 F-box タンパク質 を ba i t として用い、 更に （2 ) 標的タンパク質の分解能が低下した変異株 （例え ば、 温度感受性変異株あるいは欠失変異株） を用いることにより、 標的タンパク 質を安定化でき、 結果としてスク リーニングできることを見出して、 本願発明を なしたものである。
( 1 ) F-boxモチーフを欠失した変異型 F- box タンパク質を ba i t として用いる ことにより、 標的タンパク質と変異型 F-boxタンパク質が結合しても SCFュビキ チンリガーゼのコアに Skplを介して結合することがないので、ュビキチン化され ず、 酵母内での分解が遅れることとなる。
( 2 ) ただし、 変異型 F-boxタンパク質を酵母に導入したのみでは、 酵母内の 野生型の - F-boxタンパク質と標的タンパク質が結合し分解されることとなる。 そ こで、 酵母内の当該 F- boxタンパク質を欠失させる又は条件依存的、 例えば温度 依存的に不活化することにより、 F-box タンパク質と標的タンパク質の存在時間 を延長できたものである。
これにより、 標的タンパク質をスク リーニングするための実験系を、 従来の手 法である酵母 Two - hybri dシステムを改良することにより開発できたものである。 この実験手法を用いて、 出芽酵母ゲノムライブラリーを用いて、 SCF ュビキチ ンリガーゼ （F- box タンパク質 Cdc4) の新規の標的タンパク質を 2種類同定する ことに成功した。
また、 この手法を用いて、 ヒ トの SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質で、 カルシウム制御因子として機能するタンパク質から、 そのュビキチン化に必要な ヒ ト F - box ンパク質を同定した。
また、 本発明の方法により、 APC/C ュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同 定することができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004-279216号の明細書 および または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 F- boxタンパク質として Cdc 4を用いた場合の従来の two hybri d シ ステムによる標的タンパク質の検出可能性を示す図である。
図 2は、 SCF ュビキチンリガーゼ標的タンパク質の探索のための 2—ハイブリ ッ ドシステムの改良を示す図である。
図 3は、 SCF ュビキチンリガーゼ標的タンパク質の探索のため 2—ハイブリツ ド系の改良 （Cdc4 と Sicl)、 温度感受性変異株あるいは欠失変異株を用いて F- boxモチーフを欠失した変異型 F- box タンパク質を baitとして用いる標的タン パク質のスクリ一エングの可能性の検証を示す図である。
図 4は、 Cdc4の結合特性を利用した非特異的な相互作用を与えるクローンの除 去を示す図である。
図 5は、 標的タンパク質の安定化を指標とした非特異的な相互作用を与えるク ローンの除去を示す図である。
図 6は、 本実験系で同定されたタンパク質を示す図である。
スクリ一二ングの手順としては、 安定化された状態でのスク リ一二ングをし、 False positive を、 （1) 結合特異性及び（2)安定化を指標とする 2つの異なる特 異性を利用して、 除去する。 次に （3 ) 蛋白質の半減期を野生株 と cdc4 変異株 とで比較することにより、 標的タンパク質であることを確認する。
図 7 は、 プロテアソームの温度感受性変異変異（prel-1株）をスクリーニング のホストとして用いることができることを示す図である。 なお、 この場合には、 Cdc4-dF および Cdc4を用いることもできる。 図 7では Cdc4を用いた場合につい て示した。 また、 Cdc 4とは異なる F - boxタンパク質 Grrl とその標的タンパク質 Cln2の結合も、 この方法で検出することに成功した。 言いかえれば、 他の F- box にも適用できる。
図 8は、 APC/Cの標的タンパク質の同定のための方法論を示す図である。 Clb2 が安定化される条件では Hctl と Clb2の結合を検出できることを示している。 なお、 APC/Cとの結合領域である C - boxを除去した Hctl- dCを baitとして用いて いる
図 9は、 本実験系で同定されたタンパク質を示す図である。
図 10は、 SCFおよび APC/Cの模式図を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明のュビキチンリガーゼ標的タンパク質スクリ一二ング方法は、 例えば、
Two-hybrid systemであれば、 種々の Two- hybrid systemを基礎として、 改良し た系を利用することができる。 Two- hybrid system としては、 酵母、 原核生物、 哺乳細胞を用いる系が知られている。
本発明のュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法には、
( 1 ) 標的タンパク質の分解能が低下した細胞を、
( 2 _ a)ュビキチンリガーゼを構成するサブュニッ トのうち標的タンパク質と結 合するサブュニッ ト又は変異型の該結合サブュニット及第 1の領域を含む第 1の 融合タンパク質をコードする遺伝子、 並びに
( 2— b)標的タンパク質候補及び第 2の領域を含む第 2の融合タンパク質をコード する遺伝子、 で形質転換して得られる
( 3 ) 第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が結合すれば第 3の遺伝子 の発現を活性又は抑制することができる形質転換細胞用いて、 ュビキチンリガ一 ゼの標的タンパク質を同定する方法が含まれる。
ここで、 ュビキチンリガーゼとしては、 SCFュビキチンリガーゼ及び APC/Cュ ビキチンリガーゼなどが挙げられる。
また、 第 1の融合タンパク質中の第 1の領域及び第 2の融合タンパク質中の第
2の領域の組み合わせとしては、 第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質 が細胞内で結合するか否かを検出する既知の方法（以下既知の in vivo タンパ ク質相互作用検出方法という） において用いられる組み合わせを用いることがで き、 例えば、 （ィ） 転写因子の DNA結合領域及び転写因子の活性化領域、 具体的に は、 （口） 転写因子 Gal4の DNA結合領域及び転写因子 Gal4の活性化領域、 （ハ） 大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域と転写因子 B42の活性化領域 （二） Ga の DNA結合領域及び V16の活性化領域、 が挙げられ、 更に、 （ホ） 転写因子の DNA結 合領域及ぴ転写因子の抑制化領域、 （へ） N- intein及び C- intein、 （ト） SOSタン パク質及び Myri stylation signal , 並びに （チ） カルモジュリン依存性アデ二 ルシクラーゼの T25フラグメント及ぴカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼ の T17フラグメント、 が挙げられる。
より具体的には、 本発明の方法は、 例えば、 第 1の融合タンパク質と第 2の融 合タンパク質が細胞内で相互作用、 言い換えれば結合又は会合することにより第 3の遺伝子の発現を活性化又は抑制させ、 該第 3の遺伝子の活性化また抑制を検 出することにより、 第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が細胞内で結 合するか否かを検出する既知の方法において、（I-a)前記第 1の融合タンパク質は、 F-boxモチーフを欠失した変異型 F-box タンパク質 A及び転写因子の DNA結合ド メイン （以下 DBと記載） を含む融合タンパク質であり、 及び（1- b)前記第 2の融 合タンパク質は、 F— boxの標的タンパク質 Bと転写因子の活性化ドメイン （以下 ADと記載） との融合タンパク質であり、 （c) 前記細胞は、 標的タンパク質の分解 が低下した細胞であって、 該細胞内で、 第 1の融合タンパク質の A領域と第 2の 融合タンパク質の B領域が結合することにより第 3の遺伝子の発現を活性又は抑 制することができる細胞であり、 該細胞を用いて SCFュビキチンリガーゼの標的 タンパク質同定する方法を包含している。
I.上記の既知 in vivo タンパク質相互作用検出方法としては、例えば以下の方 法が含まれる。
(ィ） 転写因子 Gal4の DNA結合領域と活性化領域を用いる two-hybrid法：第 1 の融合タンパク質遺伝子の BD領域が転写因子 Gal4の DNA結合領域であり、第 2の融合タンパク質の AD領域が転写因子 Gal 4の活性化領域であり、 第 3の遺伝 子がレポーター遺伝子であり、 当該転写因子が欠損した GAL4 ( -）株出芽酵母酵母 を用いる方法。 具体的には、 DNA結合領域が Gal4の DNA結合領域であり、 前記活 性化領域が Gal4の活性化領域であり、 変異株細胞が、 GAL4 (-)株出芽酵母である 方法。 （米国特許第 5283173号、 Fields S and Song 0. Nature 340 : 245-246 参 照。）
(口）大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域と転写因子 B42の活性化領域を用い る two- hybri d法：第 1の融合タンパク質遺伝子の BD領域が大腸菌転写因子 LexA の DNA結合領域であり、第 2の融合タンパク質の AD領域が転写因子 B42の活性化 領域であり、 第 3の遺伝子がレポーター遺伝子であり、 特に転写因子を欠損しな い出芽酵母酵母を用いる方法。 （OriGene社 DupLEX- A Yeast 2-ハイブリ ッ ドシス テムキッ ト）
(ハ）哺乳類細胞 two- hybri d法：第 1の融合タンパク質遺伝子の BD領域が Gal4 の DNA結合領域であり、第 2の融合タンパク質の AD領域が V16の活性化領域、第 3の遺伝子がレポーター遺伝子であり、哺乳動物細胞 HeLaである方法。 (Clonetech 社 Matchmaker哺乳類細胞 2-ハイブリ ッドアッセィキッ ト）
(二） 転写因子抑制：第 1の融合タンパク質遺伝子の第 1の領域が転写因子の DNA結合領域であり、 第 2の融合タンパク質の第 2の領域が転写因子の抑制化領 域である方法。 （米国特許第 5885779号参照。）
(ホ） タンパク質トランスプライシング two hybrid法：第 1の融合タンパク質 遺伝子の第 1の領域に相当する領域が N- inteinであり、第 2の融合タンパク質の 第.2の領域が C- inteinである方法。 （米国特許第 6562576号参照。）
(へ） CytoTrap (TM) 法：前記第 1の融合タンパク質遺伝子の第 1の領域に相 当する領域が SOS タンパク質であり、 第 2 の融合タンパク質の第 2 の領域が Myri stylation signalで、 変異株細胞が、 c d c 2 5 H株である方法。
(ト） 酵素分子の 2領域を用いる方法：第 1の融合タンパク質の BD領域に相当 する領域が酵素の第 1の領域（又はフラグメント）あり、 第 2の融合タンパク質の
AD領域に相当する領域領域が酵素の第 2の領域（フラグメント）である、具体的に は、 前記酵素の第 1の領域がカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼの T25フ ラグメントであり、 前記酵素の第 2の領域がカルモジュリン依存性アデ二ルシク ラーゼの T17フラグメン卜であり、 前記変異株がカルモジュリン依存性アデニル シクラーゼ欠損株細菌である方法。 （PR0NAS 95 ： 5752-5756)
以下、 SCFュビキチンリガーゼの標的蛋白質同定法を中心に説明するが、 APC/C ュビキチンリガーゼの標的蛋白質を同定する方法も、 F- Box 蛋白質に代えて、
C - Box蛋白質 （たとえば、 Hct l，Cdc20) を用いて同様に行うことができる。 （図 1
0,参照。 ）C- boxタンパク質は、 APC/Cュビキチンリガーゼと結合するのに必要な C - box モチーフを持つタンパク質で、 APC/C ュビキチンリガーゼによるュビキチ ン化において、 標的タンパク質を結合するタンパク質である。
II.第 1の融合タンパク質をコードする遺伝子
第 1の融合タンパク質は、 F- box タンパク質又は変異型 F-boxタンパク質及第 1の領域を含んでいる。
II- 1. F-boxタンパク質
F-boxタンパク質としては、 SCFュビキチンリガーゼを構成する F- boxタンパク 質であれば、 いずれのタンパク質であっても本願発明に用いることができる。 具 体的には、 酵母であれば、 SCF ュビキチンリガーゼのサブュニッ トとして機能す ることが知られているものは、 Cdc4、 Met30、 Grrl、 YJL204C、 YJL149W、 Yし R097C、 YLR224W, YLR368W、 Y L088 , YDR131C、 YDR306C、 YNL311C、 Y0R080W、 Ctfl3 である。 (Proteins : Structure, function, and bioinf ormatics 5 4 ： 4 5 5 - 4 6 7 )。 ヒ トであれば、 70種以上知られている。
II-2. F-boxモチーフを欠失した変異型 F- boxタンパク質をコードする変異型 F— box is子 ：
F-box モチーフ と しては、 例えば、 ア ミ ノ酸 1 文字表記で表すと 、 配列で表 される F-box モチーフが挙げられる （ Trends in Genetics. 14 : 236-243 (1998)。 F- boxモチーフを欠失した変異型 F-box タンパク質とは、 上 記 F-Boxタンパク質において、 前記モチーフをすベて欠失させた変異、 又は Skpl と結合できなくなる程度、前記 F - b o Xモチーフのァミノ酸配列において 1以上 アミノ酸が、 好ましくは 1ないし数個のアミノ酸が、 欠失、 付加又は置換から選 ばれる少なく とも 1以上の変異したさせた変異型 F - Boxタンパク質があげられる (以下 F- boxモチーフを欠失した変異型 F - boxタンパク質と記載する）。
なお、 （ ） 内はアミノ酸配列中の同じ位置を意味する。 また、 アミノ酸一文字 表記では、 Lはロイシン、 Iはィソロイシン、 Vはノく リン、 Dはァスパラギン酸、 C はシスティン、 Kはリジン、 Rはアルギニン、 Wはトリプトファンを意味する。 X は任意のアミノ酸を意味する。 ただし、 指定されたアミノ酸と必ずしも同一であ る必要はない。 なお、 ここで必要な変異型 F-boxタンパク質については、 Skpl と結合できない ことが必要である。 したがって、 F- boxモチーフを欠失した変異型 F- boxタンパ ク質だけでなく、 Skpl と結合できなくなった変異型 F_boxタンパク質でも有効で あることはいうまでもない。
Π-3.第 1の融合タンパク質は、 F- boxタンパク質又は F-boxモチーフを欠失した 変異型 F- boxタンパク質及び上記第 1の領域から構成される。
ここで、 第 1の融合タンパク質は F-boxモチーフを欠失した変異型 F- boxタン パク質を含むことが好ましいが、 特に、 スク リーニングに使用する細胞力 S、 F - box タンパク質遺伝子の変異株を用いる場合には、 F_box モチーフを欠失した変異型 F - boxタンパク質を使用することが必須である。
また、 第 1の領域としては、 上記したように、 （ィ） 転写因子の DNA結合領域又 は転写因子の活性化領域、 具体的には、 （口） 転写因子 Gal4の DNA結合領域若 しくは転写因子 Gal4の活性化領域、 （ハ）大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域若 しくは転写因子 B42の活性化領域、 （二） Ga の DNA結合領域若しくは V16の活 性化領域、 が挙げられ、 更に、 （ホ） 転写因子の DNA結合領域若しくは転写因子の 抑制化領域、 （へ） N- intein 若しくは C- intein、 （ト） SOS タンパク質若しくは Myristylation signal, 並びに （チ） カルモジュリン依存性アデエルシクラーゼ の T25フラグメント若しくはカルモジュリン依存性アデ二ルシクラーゼの T17フ ラグメント、 が挙げられる。
III.第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子
第 2の融合タンパク質は、 標的タンパク質候補及び第 2の領域を含む。
111-1.標的タンパク質及び標的タンパク質候補
ある F- boxを構成成分とする SCFュビキチンリガーゼによりュビキチン化され る標的タンパク質としての候補がすでにある場合は、 当該候補を用いることがで さる。
また、 標的タンパク質候補をコードする遺伝子としては、 ゲノムライブラリー あるいは cDNAライブラリーを用いることもできる。
III- 2 .第 2の融合タンパク質の第 2の領域としては、上記した第 2の領域が挙げ られる。 例えば、 （ィ） 転写因子の DNA結合領域又は転写因子の活性化領域、 具体 的には、 （口） 転写因子 Gal4の DNA結合領域若しくは転写因子 Gal4の活性化領 域、 （ハ） 大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域若しくは転写因子 B42の活性化領 域、（二） Gal4の DNA結合領域若しくは V16の活性化領域、が挙げられ、更に、 （ホ） 転写因子の DNA結合領域若しくは転写因子の抑制化領域、 （へ） N-intein若しく は C- intein、 （ト） SOSタンパク質若しくは Myristylation s ignal , 並びに （チ） カルモジュリン依存性アデニルシクラーゼの T25フラグメント若しくはカルモジ ュリン依存性アデニルシクラーゼの T17フラグメント、 で、 それぞれめ場合に第 1 の領域でないものが挙げられる。 それぞれの場合に第 1 の領域とは異なるもの とは、 上記（ィ）についていえば、 第 1の領域として 「転写因子の DNA結合領域」 を採用した場合には、 第 2の領域は 「転写因子の活性化領域」 となり、 逆に、 第 1の領域として 「転写因子の活性化領域」 を採用した場合には、 第 2の領域は 「転 写因子の DNA結合領域」 となる。 （口）から（チ）についても同様である。
IV.標的タンパク質の分解が低下した細胞
標的タンパク質が F_boxタンパク質と結合しても、 （ 1 )ュビキチン化されない 又は （2 ) ュビキチン化されてもタンパク質分解を受けないように変異された細 胞があげられる。
( 1 ) 細胞内の内在性の F_boxタンパク質により標的タンパク質がュビキチン化 されないようにする。
(ィ） F-box タンパク質の中で必須遺伝子でなければ、 細胞から欠失させること により、 若しくは必須の遺伝子であれば、 F- box タンパク質の発現を温度感受性 にする変異を起こさせることにより調製できる。
F- boxタンパク質遺伝子の中で必須遺伝子であるものは CDC4、 MET30、 CTF13の
3種類である。 これらの必須遺伝子の温度感受性変異株は、 分離した研究者より 分与を受けるか、 あるいは、 Kanemaki et al, Nature 423 (2993) 720- 724の方法 で温度感受性株を作製することが可能である。
また、 それ以外の F— boxタンパク質遺伝子の場合には、 これらの遺伝子の欠失 変異株を用いることができる。 この欠失変異株は、 例えば、 Longtine et al,
YeasU4, 953-961 (1998)に記載される方法など、常法で調整することができる。 あ るいは、 OPEN BI0SYSTEM社、 EUR0SCARFから購入することが可能である。 (口） SCFュビキチンリガーゼを構成する F- box タンパク質遺伝子以外の遺伝子 の温度感受性変異株 （例えば、 cdc34株、 cdc53株、 skpl株） を用いることも可 能である。 これらの変異株では標的タンパク質のュビキチン化活性が著しく低下 する。 これらの必須遺伝子の温度感受性変異株は、 上記と同様に、 分離した研究 者より分与を受ける力 あるレヽは、 Kanemaki et al, Nature 423 (2993) 720 - 724 の方法で温度感受性株を作製することが可能である。
( 2 ) ュビキチン化されても、 タンパク質分解を受けないように、 タンパク質分 解能が低下した変異株、 又はタンパク質分解阻害剤を与えられた細胞を用いるこ とができる。 具体的には、 プロテアソームの変異株、 あるいはタンパク質分解阻 害剤 MG132 (SIGMAなどから購入可能）を用いる。
V.以下に Two-hybrid法として、 大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域と転写因子 B42 の活性化領域を用いる two- hybrid法に基づいてまず説明するが、 本発明は、 これに限られるものではない。
V- 1.出芽酵母スクリーニング系による出芽酵母 SCFュビキチンリガーゼの標的タ ンパク質の同定
1 - 1 . F-box変異株酵母の調製
出芽酵母には F-boxタンパク質が 1 7種類存在する事が知られている。 このう ち、 SCF ュビキチンリガーゼのサブュニッ トとして機能することが知られている ものは、 Cdc4、 Met30、 Grrl、 YJL204C、 YJL149W、 YLR097C、 YLR224W、 YLR368W、 YML088W, YDR131 YDR306C、 YNL311C , Y0R080W、 Ctfl3 である。 （Proteins : Structure, function, and bioinformatics 5 4 ： 4 5 5 - 4 6 7 )。
まず、これらの F— Boxの変異株については以下の方法で作製することが可能で ある。
上記 F-boxタンパク質の中で必須遺伝子であるものは Cdc4、 Met30、 Ctfl3の 3 種類である。 これらの必須遺伝子の温度感受性変異株は、 分離した研究者より分 与を受ける力 あるいは、 Kanemaki et al, Nature 423 (2993) 720-724の方法で 温度感受性株を作製することが可能である。
また、それ以外の F— box遺伝子の場合には、 これらの遺伝子の欠失変異株を用 い る こ と ができ る。 こ の欠失変異株は、 例えば、 Longtine et al, Yeast , 953-961 (1998)に記載される方法など、常法で調整することができる。 あ るいは、 OPEN BI0SYSTEM社、 EUR0SCARFから購入することが可能である。
1— 2 . F- boxモチーフに変異を導入した変異型 F_boxタンパク質をコ一ドする遺 伝子
F - boxモチーフに変異を導入した変異型 F- box タンパク質に関しては、例えば、 F-box モチーフに相当する部分の遺伝子領域内を、 遺伝子組み換え技術により欠 失 さ せ れ ば よ い 。 具 体 的 に は 、 F- box モ チ ー フ で あ る 列を欠失させた配列、具体的には、出芽酵母の F- boxタンパク質の一つである Cdc4 の場合では、 配列番号 1の配列において 282アミノ酸残基から 320ァミノ酸残基 までを欠失させた配列を用いることができる。 あるいは、 Skpl と結合できなくな つた変異型 F- boxタンパク質が知られている場合にはこの変異型 F-boxタンパク 質を用いることもできる。
( 1— 1 ) と （ 1— 2 ) を組み合わせてスク リーニングを行えば、 Cdc4の標的 タンパク質の場合と同様に、 それぞれの F- boxが結合する標的タンパク質を同定 することが可能である。
1— 3 . 酵母ライブラリーの調製
出芽酵母のゲノムライブラリー、 cDNAライブラリーを、 pJG4-5等の発現べクタ 一にクローン化して調製することができる。
1 - 4 . 酵母 two hybridハイブリッド系の調製
1—4 - 1 . 第 1の融合蛋白質 · Baitの調製
LexAの DNA結合ドメインを組み込んだ発現ベクターに変異型 F— box遺伝子を 組み替え LexA の DNA結合ドメインと変異型 F— boxを融合させたタンパク質を発 現することができるベクターを調製する。発現ベクターとしては、例えば、 pGi lda などを用いることができる。
1— 4— 2 . 第 2の融合タンパク質 ' ライブラリーの調製
B42 の転写活性化ドメインを組み込んだ発現ベクターに酵母遺伝子ライブラリ 一中の遺伝子を組み替え B42の転写活性化ドメインと種種の試験対象タンパク質 を融合させたタンパク質を発現することができるベクターライブラリーを調製す る。 発現ベクターとしては、 pJG4 - 5などを用いることができる。
1 - 4 - 3 . bait とベクターライブラリーの酵母変異株への導入
F - boxタンパク質遺伝子の変異株に、 baitとベクターライブラリ一及びレポ一 ター遺伝子を導入する。 周知の酵母へのベクター導入方法を利用することができ るが、 例えば、 Gietz RD, SchiestlRH Methods Mol. Cell Biol 5 : 255-269 (1995) に記載の方法を用いることができる。
1— 5 .標的タンパク質の同定
陽性株のスクリーニング工程と false positiveを排除する工程からなる。
1一 5— 1 .スク リ一二ング
F- box欠失変異株をバイ トとライブラリーで形質転換し、得られた菌株 をコロ ニー形成させる。 X-galの含まれる合成培地を用いてレポーター遺伝子 LacZを発 現させ、 その結果、 青くなつたコロニーをピックアップする。
1― 5— 2 .選抜されたプラスミ ドの精製
常法に従って、 プラスミ ドを分離し大腸菌 KC8株を形質転換し、 出てきたコロ ニーからプラスミ ドを抽出精製する。
1 - 5 - 3 .再現性の確認
必要に応じ再現性を確認する。 得られたクローンを再び bait、 レポーター遺伝 子とともに F- box変異株に導入し、 同様の要領でフィルターアツセィを行う。 再 現性のないものは排除する。
1一 5— 4 .擬陽性の排除
更に必要に応じ、 擬陽性を次のように排除することができる。
F-boxタンパク質は F- boxモチーフ以外に WD (ト リプトフアンーァスパラギン 酸） 40 リピートあるいは LRR (Leucine rich repeat) などの、 標的タンパク質を 結合するモチーフを持っている。 例えば、 Cdc4の場合には WD40を持つ。 また、 另' Uの F- boxタンパク質 Met30も Cdc4と類似の WD40を持つが、 Cdc4 と Met30は別 の標的タンパク質の結合に関与する。 そこで、 Cdc4の WDと Met30の WDを置き換 え た キ メ ラ 分 子 Cdc4- dF - Met30-WD を pGi lda に ク ロ ー ン 化す る
(pGi lda- Cdc4- dF-Met30 - WD)。 Cdc4の標的タンパク質をスクリーニングする場合 では、 PGi lda-Cdc4-dF のかわりに pGi lda- Cdc4-dF-Met30-WD を導入した上記 F - box欠失変異株酵母に、 （1 ) で分離したプラスミ ドを導入し、 フィルターアツ セィを行い、 青くならないものを選択する。
Met30以外の F-box タンパク質の標的タンパク質結合領域を用いることが可能 であることはいうまでもない。
Cdc4以外の F-boxタンパク質の場合には、該 F- boxタ ^パク質の標的タンパク 質結合領域が WD40の場合には、該 F-boxタンパク質以外の F-boxタンパク質で標 的タンパク質結合領域が WD40である F- boxタンパク質の WD40を用いることがで きる。 また、 該 F- boxタンパク質の標的タンパク質結合領域が LRRの場合には、 該 F_boxタンパク質以外の F-boxタンパク質で標的タンパク質結合領域が LRRで ある F- boxタンパク質の LRRを用いることができる。
1 - 5— 5 .標的タンパク質の塩基配列
pos itive なシグナルを出すクローンを標的タンパク質をコードするクローン として同定し、 塩基配列を決定する。
1一 6 .ュビキチン化及びタンパク質分解の確認
同定された標的タンパク質が、 実際にュビキチン化され、 分解されているかど うかについても、 必要に応じ検定することができる。
1— 6— 1 .ュビキチン化による標的タンパク質の分解の確認 （ 1 )
決定された標的タンパク質をコードする遺伝子の開始コ ドンから終止コドンの 直前までを PCR法により増幅する。増幅した DNA断片と LacZ遺伝子とを融合する。 できたプラスミ ドを F-box変異株、 及び野生株に導入する。 もし該タンパク質が 特定の F- box に依存してュビキチン化/分解されるのであれば、 該タンパク質と LacZの融合タンパク質も、 野生株では分解されるが、 F-box変異株では安定化さ れる。 そこで、 コロニーを X- gal含有合成培地でフィルターアツセィを行い、 陽 性 （青色） クローンを残す。
1 - 6一 2 .ュビキチン化による標的タンパク質の分解の確認 （2)
同定された標的タンパク質が本当に SCFュビキチンリガ一ゼに依存して分解さ れるのかをタンパク質レベルで半減期を比較することにより調べることができる。 タンパク質量については、 Western blottingを行うことにより調べる。 用いる 抗体としては、 すでに標的タンパク質の候補タンパク質の抗体がある場合には、 その抗体を用いてタンパク質を検出する。 もし、 抗体がない場合には、 組み換え
DNA の技術を用いて、 短いアミノ酸配列 （ェピトープタグ） を標的タンパク質の 候補タンパク質と融合し、 ェピトープ特異的抗体を用いて融合タンパク質を検出 する。 ェピトープタグとしては、 インフルエンザへマグルチニンタンパク質由来 の 9アミノ酸からなるペプチド （以下 HAと記載）、 あるいは、 ヒ ト C- mycタンパ ク質由来の 9E10ェピトープなどを用いる。 ここでは、ェピトープ特異的抗体を用 いる場合を例にして説明する。
標的タンパク質とェピトープの融合タンパク質を、 出芽酵母野生株及び出芽酵 母 F- boxタンパク質遺伝子の変異株で発現させる。 ここで、 タンパク質合成阻害 剤 cychloheximide (SIGMAかち購入） を終濃度 50 μ g/ml加えることにより、 融 合タンパク質の発現を停止させ、 その直後から例えば 15分間隔で細胞を回収し、 タンパク質抽出液を作製する。 タンパク質抽出液の作製は、 例えば、 Yeong FM et al. Mol. Cell 5： 501-511 (2000)に記載の方法などを用いる。次に、 Western Blotting を行い、 ェピトープ特異的抗体を用いて融合タンパク質の量を調べる。 もし、 調 ベているタンパク質が標的タンパク質ならば、 野生株では不安定であり半減期が 短いが、 変異株では安定化され半減期が長くなるはずである。 この条件を満たす ものを標的タンパク質として再確認できる。
V-2. 出芽酵母スクリーニング系によるヒ ト SCFュビキチンリガーゼの標的タン パク質の同定
酵母の場合と同様に、 ヒ トなど哺乳類の SCFュビキチンリガーゼの標的タンパ ク質の同定することができる。
今のところ、 酵母の F- boxタンパク質とヒ トの F- boxタンパク質とで、 機能的 な対応についてわかっていない。 そこで、 標的タンパク質の分解が低下した変異 細胞として、 SCFュビキチンリガーゼを構成する F - boxタンパク質遺伝子以外の 遺伝子の温度感受性変異株 （例えば、 cdc34株、 cdc53株、 skpl株） を用いるこ とができる。 あるいは、 ュビキチン化されたタンパク質の分解を行うプロテアソ ームの変異株 （温度感受性 prel- 1変異株） を用いること、 あるいは、 タンパク質 分解阻害剤であるプロテアソームインヒビター例えば MG132 (SIGMA から購入可 能）などで処理した細胞を用いることができる。 プロテアソームの阻害剤 MG132 (SIGMA) を用いる場合には、 さらに、 erg6変異株 （膜脂質合成酵素の変異株で、 プロテアソームの阻害剤 MG132を含む薬剤の膜透過活性があがった変異株） を用 いることができる。
第 1の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、 ヒ ト F - boxタンパク質あ るいは F- boxモチーフを欠失したヒ ト F- boxタンパク質及び第 1の領域からなる 融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。
第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、 ヒ ト標的タンパク質の候 補及び第 2の領域からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることがで さる。
V- 3 . 出芽酵母スクリーニング系による APC/Cュビキチンリガーゼの標的タンパ ク質の同定
SCFュビキチンリガーゼの場合と同様に、 APC/Cュビキチンリガーゼの標的タン パク質の同定することができる。
標的タンパク質の分解が低下した変異として、 APC/C ュビキチンリガーゼを構 成するサブュニッ トの遺伝子の温度感受性変異株あるいは欠失変異株を用いるこ とができる。 あるいは、 ュビキチン化されたタンパク質の分解を行うプロテアソ ームの変異株 （例えば温度感受性 prel - 1変異株など） を用いること、 あるいは、 プロテアソームインヒビター例えば MG132 (SIGMA から購入可能）などで処理した 細胞を用いることができる。
プロテアソームの阻害剤 MG132 (SIGMA) を用いる場合には、 さらに、 erg6変異 株 （膜脂質合成酵素の変異株で、 プロテアソームの阻害剤 MG132を含む薬剤の膜 透過活性があがった変異株） を用いることができる。
第 1の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、 C - Box として Cdc20又は Hctl (あるいはこれらのヒ トホモログ） 若しくはこれらの変異体及び第 1の領域 からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。 上記変異体 としては、 C- Boxモチーフを欠失した遺伝子、 たとえば、 Hctlの C- boxモチーフ を含む領域を欠損させた変異体を用いることができる。
C- boxモチーフとしては、 例えば、 アミノ酸 1文字表記で表すと、 DR (F/Y) IPXR と言う配列で表される C - boxモチーフが挙げられる （The EMBO Journal Vol. 20, No. 18, pp. 5165- 5175)。C-boxモチーフを欠失した変異型 F_box タンパク質とは、 上記 C- Box タンパク質において、 前記モチーフをすベて欠失させた変異、 又は APC/Cと結合できなくなる程度、 前記 C_ b o Xモチーフのァミノ酸配列において 1 以上アミノ酸が、 好ましくは 1ないし数個のアミノ酸が、 欠失、 付加又は置換 から選ばれる少なく とも 1以上の変異したさせた変異型 C - Boxタンパク質があげ られる （以下 C- boxモチーフを欠失した変異型 C- boxタンパク質と記載する）。 なお、 ここで必要な変異型 C- box タンパク質については、 APC/C と結合できな いことが必要である。 したがって、 C- boxモチーフを欠失した変異型 C-box タン パク質だけでなく、 APC/C と結合できなくなった変異型 C- boxタンパク質でも有 効であることはいうまでもない。 第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子としては、 標的タンパク質候補及び 第 2の領域からなる融合タンパク質をコードする遺伝子を用いることができる。 VI . その他のスクリ一ユング系を利用した SCFュビキチンリガーゼの標的タンパ ク質の同定方法
VI- 1 . SOS/Ras システム
two-hybridシステムにおいて、 bait (餌） タンパク質はヒ ト SOSタンパク質と の融合タンパク質として、 標的タンパク質はミリスチル化シグナルとの融合タン パク質として cdc25H変異株酵母内で発現させるシステムで、 bait タンパク質と 標的タンパク質が結合した場合に、 SOSタンパク質が膜状にある Rasを活性化し、 37度での生存ができるというものである。
本システムにおいても、 cdc25H変異株酵母にさらに、 常法により F - box変異さ せた F- box/cdc25H 変異株酵母を調製し、 これに、 F-box モチーフを欠失させた F-box タンパク質を融合したヒ ト SOS タンパク質と、 標的タンパク質を含むライ ブラリーと融合したミ リスチル化シグナルとの融合タンパク質をコードする遺伝 子で形質転換することにより、 標的タンパク質をスクリ一二ングすることができ る。
VI- 2 . ほ乳類 Two - Hybri d法を利用する方法
ほ乳類 Two-Hybrid法を利用する。 two- hybri dシステムにおいて、 bai t (餌） タンパク質は酵母 Gal4の DBとの融 合タンパク質として、標的タンパク質は V16の ADとの融合タンパク質として HeLa 細胞で発現させるシステムで、 baitタンパク質と標的タンパク質が結合した場合 に、 レポーター遺伝子 SEAPの発現が観察されるというものである。
本システムにおいても、 Gal4の DB と F-boxモチーフを欠失させた F-boxタン パク質を融合したタンパク質と、 標的タンパク質を含むライブラリーと融合した V16の ADとの融合タンパク質をコードする遺伝子で形質転換することにより、標 的タンパク質をスクリーニングすることができる。 この場合、 ヒ トなど哺乳類の SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質の同定に用いることが可能である。 今のところ、 酵母の F - boxタンパク質とヒ トの F-boxタンパク質とで、 機能的 な対応についてわかっていない。 そこで、 細胞の、 標的タンパク質の分解能を低 下させる手段として、 プロテアソームインヒビターを用いることができる。 ある レ、は、 siRNAの手法を用いて、 SCFュビキチンリガーゼあるいはプロテアソームの 活性を低下させた細胞を用いることも可能である（例えば Watanabe N et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 101 : 4419—4424 (2004) )。
このほ乳類 Two-Hybrid法を利用する方法は、例えば V- 2の酵母を用いたヒ ト標 的タンパク質スクリーニングにおいて明らかにした標的タンパク質と、 当該ヒ ト F- boxタンパク質の結合を、 ヒ ト HeLa細胞で検証することにも用いることができ る。
あるいは、 ヒ ト SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質であることがわかつ ているが、 それに対応する F - boxタンパク質が明らかでない場合にも用いること ができる。 この場合、 ヒ ト F-boxタンパク質遺伝子のライブラリーと Gal4の DB との融合タンパク質遺伝子、及び標的タンパク質と V16の ΑΌとの融合タンパク質 をコードする遺伝子で HeLa細胞を形質転換し、プロテアソームインヒビターの存 在化でレポーター遺伝子 SEAPの発現を調べることができる。もちろん、ヒ ト F-box タンパク質遺伝子のライブラリーと V16の ADとの融合タンパク質遺伝子、 及び、 標的タンパク質と Gal4の DBとの融合タンパク質をコードする遺伝子を用いても 同様に実験できることはいうまでもなレ、。
SCFュビキチンリガーゼの場合と同様に、 APC/Cュビキチンリガーゼの標的タン パク質の同定することができる。
以下に実施例を用いて、 より具体的に本願発明を説明するが、 本願発明が実施 例に限定されるものではないことは言うまでもない。
[実施例]
以下の実施例、 参考例で使用した出芽酵母菌株は次のとおりである。 野生株 W303株 （ATCC200903など）
TK-505 (Mat a cdc4 - 1 sicl )
cdc4- 1株は ATCC (200625、 208543、 208544)から購入することが可能である。 ま た必要に応じて野生株と掛け合わせて使用する。
s icl変異は、 Longtine et al, Yeastl4, 953- 961 (1998)の方法で導入した。 なお、 このスクリーニングにおいては、 sicl変異が導入されている必要は全く ない。
TK-542 (Mat a hctl)
hctl変異は、 Longtine et al, YeastH, 953- 961 (1998)の方法で W303株に導 入した。
以下の実施例、 参考例で使用するプラスミ ドは次のとおりである。
pGi lda- Cdc4：市販されている pGi lda (OriGene社）に CDC4全長を PCRで増幅後 に BamHISall で切断後クローン化した。錶型として用いた出芽酵母染色体 DNAは、
Invitrogen より購入した。 プライマーは、 ATGGATCCCGATGGGGTCGTTTCCCTTAGC と
CGGTCGACCAAAGACGTTATTAGGTCCCTCを用いた。
pGi lda-Cdc4-dF： F- boxモチーフ （CDC4のアミノ酸残基 281- 320) を欠失した
Cdc4- dFを、 pGi ldaにクローン化した。 具体的には、 PCRでじ0じ4のァミノ酸残 基 1-281 を増幅後、 BamHI EcoRI で切断した。 銹型として用いた出芽酵母染色体
DNA は 、 Invitrogen よ り 購 入 し た 。 プ ラ イ マ ー は 、
ATGGATCCCGATGGGGTCGTTTCCCTTAGCと CAGAATTCCAAAGACGTTATTAGGTCCCTCを用いた。 また、 CDC 4のアミノ酸残基 321番から C末端までをコードする DNA配列を PCR で增幅した後、 EcoRI Sai lで切断した。铸型として用いた出芽酵母染色体 DNAは、 Invitrogenより購入した。 プライマーは、 CGGAATTCATATCGGAAAATTTTGTGAGCCCと CGGTCGACCAAAGACGTTATTAGGTCCCTを用いた。 これら二つの DNA断片を、 BamHI Sai l で切断した pGi ldaにクローン化した。
pGi lda-Cdc4-dF-Met30WD： Cdc4の 1-281 番のァミノ酸残基までと、 Met30の 228番から C末端までを融合して作製した Cdc4 - dF- Met30WDを pGi ldaにクローン ィ匕した。 Cdc4の 1-281番のアミノ酸残基までをコードする DNA配列を PCRで增幅 した。 錶型として用いた出芽酵母染色体 DNAは、 Invitrogenより購入した。 ブラ ィマーは、 ATGGATCCCGATGGGGTCGTTTCCCTTAGCと ACGCGGCCGCTCAAAGACGTTATTAGGTCC を用いた。 また、 Met30の 228番から C末端までをコードする DNA配列は、 PCR で増幅した。鎵型として用いた出芽酵母染色体 DNAは、 Invitrogenより購入した。 プ ラ イ マ ー は ， AAGCGGCCGCTGCGAGCAGCACATAGACAG と AGTCGACCTAATCATTGAGATCGAATTTGを用いた。
PJG4-5-ASC-SIC1 ： PCRで増幅した出芽酵母 SIC1全長を pJG4- 5に EcoRI Notl で切断後クロ一ン化した。 鎳型として用いた出芽酵母染色体 DNAは、 Invitrogen よ り 購 入 し た 。 プ ラ イ マ ー は ， AAGAATTCGGCGCGCCAATGACTCCTTCCA と TTGCGGCCGCATGCTCTTGATCCCTAGATTを用レヽた。
出芽酵母ライブラリー ： 出芽酵母の全 0RF (0pen reading frame)を含むライ ブラリー（Ito et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 : 1143— 1147 (2001) )のライブラ リー部分を制限酵素 （Ascl Notl) で切断し、 pJG4- 5- ASC-SIC1 の SIC1部分と置 き換えた。
pSH18-34 (レポーター遺伝子 LacZを持つプラスミ ド： OriGene社）
pURA3-Gal lp-HA： pYES2 (Invitrogen) の GALlpromoterから CYC1 terminator までを PCR で増幅 （用いたプライマーは、 AATCTAGACGGATTAGAAGCCGCCGAG と
AATCTAGAGGCCGCAAATTAAAGCCTTCである） し、 YCplac33 (Gene, 74 (1998) 527-534、 なお、出芽酵母のプラスミ ドで URA3をマーカーとして持つものであれば基本的に 代用可能で、 例えば ATCCから購入可能な pRS306等を用いることもできる。） の
PvuI I部位にクローン化し（これを YC33Gとした）、次に、この Notl Sphl部位に、 PFA5a-3HA-kanMX (Longt ine et al， Yeastl4, 953-961 (1998) ) を鋅型として HA ェピトープを含む領域を PCRで増幅した DNA断片をクローン化した （用いたプラ イ マ 一 は 、 CAAAATGTCTGCGGCCGCCATCTTTTACCCATACGAT と AAGCATGCGGCGCGCCTCAGCACTGAGCである）。 なお、 HAェピトープとの融合タンパク 質発現用の出芽酵母プラスミ ドであればどれでも代用可能である。
PURA3- SICl-LacZ： まず、 大腸菌 LacZ遺伝子を PCRで増幅後 （用いたプライマ 一 は 、 TAGCGGCCGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTG と
CCGCATGCTTATTTTTGACACCAGACCAACTGGである）、 Notl Sphl で pURA3- Gal lp- HA の HAをコードする領域と置き換えた。
pGi lda-HCTl ： 市販されている pGi lda (OriGene社）に HCT1全長を PCRで増幅 後に BamHISal l で切断後クローン化した。 錄型として用いた出芽酵母染色体 DNA は、 Invitrogenより購入した。 プライマーは、 CCGGATCCCGATGTCCACAAACCTGAACCC と CCGTCGACCTAACGTATTTGATTAAATGを用いた。
pGi lda-Hctl-dC： C-boxモチーフを含む N末端領域を欠失した Hctl-dCを、 pGi ldaにクローン化した。具体的には、 PCRで HCT1のアミノ酸残基 99- 566を増 幅後、 BamHI EcoRI で切断した。 鎵型として用いた出芽酵母染色体 DNA は、 Invitrogen より購入した。 プライマーは、 CCGAATTCGCACATGAAACTTATAATAC と CCGTCGACCTAACGTATTTGATTAAATGを用いた。
PJG4-5-ASC-CLB2 ； PCRで増幅した出芽酵母 CLB2全長を pJG4_5に Ascl Notl で切断後クローン化した。 铸型として用いた出芽酵母染色体 DNAは、 Invitrogen よ り 購入 し た 。 プ ラ イ マ ー は ， AAGGCGCGCCGATGTCCAACCCAATAGAAAT と GAGCGGCCGCTCATTCATGCAAGGTCATTAを用いた。
参考例 1
Siclは F_boxとして Cdc4を持つ SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質で あることがわかっているタンパク質である。 そこで、 two- hybrid システムで、
F-boxタンパク質として Cdc4をもちいて baitを調製し、 SiCl との結合を検出で きるか検討した。 Two-hybridシステム（OriGene社から購入した DupLEX- A Yeast 2- ハイプリ ッ ドシステムキッ トを使用 （I- (口） に記載） ： （大腸菌転写因子 LexA の DNA 結合領域と転写因子 B42 の活性化領域を用いる two-hybrid 法） を、 pGi lda- Cdc4及び PJG4-5- ASC-SIC1で常法により形質転換した。 （図 1)。 このよう にュビキチン化の標的タンパク質の同定を行う場合には、通常の Two- hybridシス テムでは不可能である。 実施例 1
TK-505あるいは野生株を以下のプラスミ ドで形質転換し、得られたコロニーを メンブレン （hybond- N Araersham：直径 88 mm) に移す。 X- galを含み、 炭素源と してラフィノースとガラク トースを含む合成培地 （寒天培地） の上にのせ、 許容 温度 3 0 °Cあるいは非許容温度 3 7 °Cで 1 2 hr培養した （以下フィルターアツセ ィとする）。
レポーター遺伝子 LacZを発現させ、 その結果、 コロニーが青くなるか調べた。
(i) 野生株を pSH18- 34、 pJG4-5-ASC-SIC 及び pGi lda_Cdc4で形質転換し、 許容温度 3 0でで 24時間培養した。
(i i ) 野生株を pSH18-34、 pJG4-5-ASC-SICK 及び pGi lda-Cdc4-dFで形質転換 し、 許容温度 3 0でで 24時間培養した。
(i i i) TK- 505 を pSH18- 34、 pJG4- 5-ASC- SIC1、 及び pGi lda- Cdc4-dFで形質転換 し、 許容温度で 12時間培養後、 非許容温度 3 7度で 1 2時間培養した。
(iv) TK-505 を pSH18- 34、 pJG4- 5- ASC-SIC1、 及び pGi lda_Cdc4- dFで形質転換 し、 許容温度 3 0でで 24時間培養した。
結果をそれぞれ、 図 3に示す。
(i i i)のみ、 POSITIVEなシグナルが得られた。
したがって、 上記標的タンパク質の分解が低下した変異株を用いてスクリー二 ングを行うこと （温度感受性変異株あるいは欠失変異株）、 及び、 完全長の F- box タンパク質ではなく、 F- boxモチーフを欠失した変異型 F-box タンパク質を bait として用いる （図 2参照） ことという条件を同時に満たすことにより、 標的タン パク質のスクリ一二ングが可能となることが判明した。 実施例 2
SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリ一二ング
出芽酵母ライブラリ一を用いてスクリーニングを行った。
具体的には、
( 1) 開発した実験系を用いたスクリーニングと、 （2) 非特異的な相互作用を与 えるクローンの除去及び標的タンパク質であることの確認からなる。 （2) は、 F- boxタンパク質の結合特異性を利用した方法 （2-1) と、 標的タンパク質の安 定化を利用する方法 （2-2) とタンパク質の半減期を測定して、 SCFュビキチン リガーゼの標的タンパク質であることを証明する （2-3)、 という 3段階を用い た。
(1) 開発した実験系を用いたスク リーニング
予め、 TK505株を pGilda- Cdc4-dFと pSH18- 34 の二つで形質転換しておく。 得 られた菌株 （TK505 / pGilda- Cdc4 - dF + pSH18- 34) に、 出芽酵母ライブラリーを 導入した （常法に従う）。
コロニーをメンブレン (hybond-N Amersham：直径 88 mm) に移し、 X - galを含 み炭素源としてラフィノースとガラク トースを含む合成培地 （寒天培地） 上にの せ、 許容温度 30°C 12時間保温した後に、 非許容温度 37°C 12時間保温 （以下フ ィルターアツセィとする） した。
レポーター遺伝子 LacZを発現し、 その結果、 青くなったコロニーを培養し、 常 法に従って、 プラスミ ドを分離し大腸菌 KC8株 （Clonetech より購入した） を形 質転換し、 出てきたコロニーからプラスミ ドを抽出精製した。
再現性を確認するために、 得られたクローンを再び TK505 I pGilda -Cdc4-dF + pSH18- 34に導入し、 同様の要領でフィルターアツセィを行った。 結果、 再現性の ないものは廃棄した。
(2) 非特異的な相互作用を与えるクローンの除去及び標的タンパク質であるこ との確認
(2-1 ) 結合の特異性を利用する方法
F-boxタンパク質は F- boxモチーフ以外に WD (トリプトフアンーァスパラギン酸） 40 リピートあるいは LRR (Leucine rich repeat) などの、 標的タンパク質を結合 するモチーフを持っている。 Cdc4の場合には WD40を持つ。 また、 別の F- boxタ ンパク質 Met30も Cdc4と類似の WD40を持つが、 Cdc4 と Met30は別の標的タンパ ク質の結合に関与する。 そこで、 Cdc4の WDと Met30の WDを置き換えたキメラ分 子 Cdc4- dF-Met30 - WDを pGi ldaにクローン化した（pLexA- Cdc4-dF- Met30- TO : Cdc4 の 1-281番のアミノ酸残基と Met30の 228番から 640番 （C末端まで） を持つ）。 そこで、 実施例 1の pGi lda-Cdc4 - dF のかわりに pGilda- Cdc4- dF_Met30- WDを 導入した株に、（ 1 )で分離したプラスミ ドを導入し、フィルターアツセィを行い、 青くならないものを選択した。 SIC1 の場合の結果を図 4に示す。 ここまでで posit iveなシグナルを与えるクローンの塩基配列を決定する。
( 2 _ 2 )標的タンパク質の安定化を利用する標的タンパク質であることの確認方 法
標的タンパク質の候補遺伝子の開始コドンから終止コ ドンの直前までを PCR法 により増幅し、 増幅された DNA断片と、 pUra3- SICl-LacZの SIC1の部分とを置き 換え、 LacZとの融合タンパク質遺伝子発現用のプラスミ ドを作製した。 できたプ ラスミ ドを cdc4変異株、 及び野生株に導入した。 調べているタンパク質が Cdc4 に依存してュビキチン化/分解されるのであれば、 LacZ と該タンパク質の融合タ ンパク質は、 野生株では不安定である。 一方、 cdc4変異株（TK505株）においては 該タンパク質が安定化されるため融合タンパク質も安定化されるはずである。 そこで、 コロニーをフィルターに移し、 これを X-galを含み炭素源としてラフ ィノースとガラク トースを含む合成培地 （寒天培地） 上におきフィルターアツセ ィを行う。 ここで青くなるクローンを残す。 図 5に SIC1の場合の結果を示した。
( 2 - 3 ) タンパク質の半減期を測定して、 SCFュビキチンリガーゼの標的タンパ ク質であることの確認
これまでの過程で得た 0RFがコードするタンパク質が本当に Cdc4に依存して分 解されるのかをタンパク質レベルで半減期を比較することにより調べる。 標的タ ンパク質の候補遺伝子の開始コ ドンから終止コドンの直前までを PCRで増幅し、 pURA3- Gal lp- HAにクローン化した。 このプラスミ ドを用いて、 出芽酵母野生株及 び cdc4変異株（TK505株）を形質転換した。 形質転換体をラフイノースを炭素源とする培地で培養後、 細胞数が 1-2 X 107 細胞程度まで培養した。 ここで、 ガラク トースを終濃度 2%となるように加え、 0RF-HAがコードする融合タンパク質を生産させた。 ガラク トースを加えてから 1 時間後に、 タンパク質合成阻害剤 cychloheximide (SIGMAから購入） を終濃度 50 g/ml加え、 融合タンパク質の発現を停止させた。 その直後から 15分間隔で細 胞を回収し、 Yeong FM et al. Mol. Cel l 5 : 501- 511 (2000)に記載の方法で、 タンパ ク質抽出液を作製した。 次に、 Western Blotting を行い、 anti- HA (12CA5)抗体 (Roche より購入） を用いて融合タンパク質の量を調べた。 野生株では不安定で あるが、 変異株では安定化されたものを標的タンパク質とした。
本スクリ一二ングで同定した標的タンパク質の場合の一例を図 6に示す。 これ までに本実験で明らかにした SCFュビキチンリガーゼの新規標的タンパク質は細 胞周期制御因子の転写因子である Swi5と、カルシウムシグナリングの制御因子で あるカルシニューリンの活性を調節する Rcnlである。 実施例 3
実施例 2で明らかにした標的タンパク質の一つは、ヒ トにホモログが存在する。 そこで、 このヒ トホモログをュビキチン化するのに必要な F-boxタンパク質をス ク リ一ユングすることができる。 これまでに完全長配列が知られているヒ ト
F-box タ ン ノヽ0 ク 質 の cDNA の う ち 、 7 種 類 ( FBW1, FBW1B, FBW2, FBW3, FBW5, FBW7, SKP2 ： Watanabe N. et al. PNAS 101 : 4419 - 4424 (2004) ： これらの遺伝子は Invitrogen社から購入することが可能 である） を PCRで増幅し、 Ascl Notlで切断後に、 pGi ldaにクローン化した。 次に、 実施例 2.で明らかにした標的タンパク質のヒ トホモログを PCRで増幅後 に pJG4- 5にクローン化した。 これとレポーター遺伝子 pSH18-34とで、 prel- 1株 を形質転換した。 prel-1株はプロテアソームを構成するプロテアーゼ遺伝子の変 異株である (Heinemeyer et al. EMB0 J. 10： 555-562 (1991)。
得られた形質転換体に、 上記で作製した pGi ldaにクローン化された F-box タ ンパク質を導入した。
実施例 1 と同様なフィルターアツセィを行った。予め許容温度で 12時間培養後、 3 7 °C (非許容温度） で 2 4時間培養した。 その結果、 青いシグナルを出すもの が 1種あった。 これは出芽酵母 Cdc4 とよく似た構造をしており、 Cdc4のヒ トホ モログと考えられているものであった。 実施例 4
prel- 1株 （プロテアソームの温度感受性変異株） あるいは野生株を以下のプラ スミ ドで形質転換し、 得られたコロニーをメンブレン （hybond- N Amersham：直径 88 mm) に移す。 X - galを含み、 炭素源としてラフィノースとガラク トースを含む 合成培地 （寒天培地） の上にのせ、 許容温度 3 0 °Cあるいは非許容温度 3 7でで 1 2 hr培養した （以下フィルターアツセィとする）。
レポーター遺伝子 LacZを発現させ、 その結果、 コロニーが青くなるか調べた。
( i) 野生株を pSH18- 34、 pJG4- 5- ASC- SIC1、 及び pGi lda_Cdc4で形質転換し、 許容温度 3 0でで 24時間培養した。
( i i) prel- 1株を pSH18- 34、 pJG4- 5- ASC- SIC1、 及び pGi lda- Cdc4で形質転換 し、 許容温度で 12時間培養後、 非許容温度 3 7度で 1 2時間培養した。
(i i i) prel- 1株を pSH18- 34、 pJG4- 5- ASC- SIC1、 及び pGi lda- Cdc4で开質転換 し、 許容温度 3 0でで 24時間培養した。
結果をそれぞれ、 （図 7 )に示す。
(i i)のみ、 POSITIVEなシグナルが得られた。
したがって、プロテアソ一ムの温度感受性変異株を用いた標的タンパク質のスク リ一二ングが可能であることが判明した。
なお、 本実施例 4では、 Cdc 4に代えて Cdc4- dFを用いることもできる。
また、 Cdc 4とは異なる F- boxタンパク質 Grrl とその標的タンパク質 Cln2の結合 も、 この方法で検出することに成功したので、 他の F- boxにも （プロテアソーム の温度感受性変異株） を利用する方法を適用できることが分かった。 参考例 2
Clb2は C- box として Hct l を持つ APC/Cュビキチンリガーゼの標的タンパク質 であることがわかっているタンパク質である。 そこで、 two- hybrid システムで、 C-boxタンパク質として Hctlをもちいて baitを調製し、 Clb2 との結合を検出で きるか検討した。 Two- hybridシステム（OriGene社から購入した DupLEX- A Yeast 2 - ハイブリ ッドシステムキッ ト （大腸菌転写因子 LexA め DNA結合領域と転写因子 B42 の活性化領域を用いる two- hybrid 法） を使用 し、 pGi lda- HCT1 及び PJG4-5-ASC-CLB2 で常法により形質転換した。 結果、 レポーターの発現は見られ ず、 このようにュビキチン化の標的タンパク質の同定を行う場合には、 通常の Two-hybridシステムでは不可能であることが分かった。 実施例 5
TK-542あるいは野生株を以下のプラスミ ドで形質転換し、得られたコロニーを メンブレン （hybond-N Amersham：直径 88 mm) に移す。 X- galを含み、 炭素源と してラフィノースとガラク トースを含む合成培地 (寒天培地） の上にのせ、 許容 温度 3 0 °Cあるいは非許容温度 3 7 °Cで 1 2 hr培養した （以下フィルターアツセ ィとする）。
レポーター遺伝子 LacZを発現させ、 その結果、 コロニーが青くなるか調べた。
(i) 野生株を pSH18- 34、 pJG4- 5- ASC- CLB2、 及び pGi lda- HCT1で形質転換し、 3 0 °Cで 24時間培養した。
(i i) 野生株を pSH18- 34、 pJG4-5- ASC- CLB2、 及び pGi lda-HCTl- dCで形質転換 し、 3 0でで 24時間培養した。
(i i i) TK-542 を PSH18-34、 pJG4- 5- ASC- CLB2、 及び pGi lda- HCTl-dCで形質転換 し、 3 0 °Cで 24時間培養した。
結果をそれぞれ、 図 8に示す。
(ii i)のみ、 POSITIVEなシグナルが得られた。
したがって、上記標的タンパク質の分解が低下した変異株を用いてスクリーニン グを行うこと （温度感受性変異株あるいは欠失変異株）、及び、完全長の C-box タ ンパク質ではなく、 C- box モチーフを欠失した変異型 C-box タンパク質を bait として用いる （図 2参照） ことという条件を同時に満たすことにより、 標的タン パク質のスクリ一二ングが可^となることが判明した。 実施例 6
APC/C ュビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリーニング出芽酵母ライブラ リ一を用いてスクリ一二ングを行った。
具体的には、
( 1 ) SCF ュビキチンリガーゼの標的タンパク質のスクリーニングと同様に、 開 発した実験系を用いたスクリ一二ングと、 （2 )非特異的な相互作用を与えるクロ —ンの除去及び標的タンパク質であることの確認からなる。 実際に行った結果、
( 1 ) で得たクローンが比較的少なかったので、 ュビキチンリガーゼの標的タン パク質であることを証明する手順のみ行った。
( 1 ) 開発した実験系を用いたスク リーニング
予め、 TK542株を pGi lda- Hctl_dCと pSH18- 34 の二つで开質転換しておく。 得ら れた菌株 （TK505 / pGilda-Hctl- dC + pSH18- 34) に、 出芽酵母ライブラリーを導 入した （常法に従う）。
コロニーをメンブレン (hybond-N Amersham：直径 88 mm) に移し、 X-galを含 み炭素源としてラフィノースとガラク トースを含む合成培地 （寒天培地） 上にの せ、 30°C 24時間保温 （以下フィルターアツセィとする） した。
レポーター遺伝子 LacZを発現し、 その結果、 青くなったコロニーを培養し、 常法 に従って、 プラスミ ドを分離し大腸菌 KC8株 （Clonetech より購入した） を形質 転換し、 出てきたコロニーからプラスミ ドを抽出精製した。
再現性を確認するために、 得られたクローンを再び TK542 I pGi lda- Hctl- dC + PSH18-34に導入し、 同様の要領でフィルターアツセィを行った。 結果、 再現性の ないものは廃棄した。
( 2 ) 非特異的な相互作用を与えるクローンの除去及び標的タンパク質であるこ との確認
タンパク質の半減期を測定して、 SCF ュビキチンリガーゼの標的タンパク質で あることの確認
野生株および hctl変異株にこれまでの過程で得た候補プラスミ ドを導入した。 形質転換体をラフイノースを炭素源とする培地で培養後、 細胞数が 1-2 X 107 細胞程度まで培養した。 ここで、 ガラク トースを終濃度 2%となるように加え、 ◦RF - HAがコードする融合タンパク質を生産させた。 ガラク トースを加えてから 1 時間後に、 タンパク質合成阻害剤 cychloheximide (SIGMAから購入） を終濃度 50 /z g/ml加え、 融合タンパク質の発現を停止させた。 その直後から 15分間隔で細 胞を回収し、 Yeong FM et al. Mol. Cel l 5 : 501- 511 (2000)に記載の方法で、 タンパ ク質抽出液を作製した。 次に、 Western Blotting を行い、 anti-HA (12CA5)抗体 (Roche より購入） を用いて融合タンパク質の量を調べた。 野生株では不安定で あるが、 変異株では安定化されたものを標的タンパク質とした。 同定された 2種 類の標的蛋白質の半減期を図 9に示す。
これまでに本実験で明らかにした APC/Cュビキチンリガーゼの標的タンパク質 は細胞周期制御因子の Clblおよび UAH1である。
産業上の利用可能性
本発明の実験手法により、 ュビキチン化の標的タンパク質を明らかにすること ができる。 こうした基礎生物学への貢献のみでなく、 治療薬のスクリーニング及 び評価に用いることが可能である。
ュビキチン化の標的タンパク質を明らかにする実験系として有用である。
開発した手法を用いて、 SCFュビキチンリガーゼ及び APC/Cュビキチンリガ一 ゼの標的タンパク質のスクリーニングを行った。 その結果、 すでに明らかにされ ている標的タンパク質に加えて、 新規の標的タンパク質を明らかにした。 これら の中には細胞周期制御に関わる転写因子及び力ルシゥムシグナリングの制御因子 を含む。
本発明は、 治療薬のスクリーニング及び評価に有用である。 本発明の方法は、
F-box タンパク質と標的タンパク質の結合を検出する系を包含する。 この結合量 をレポーター遺伝子の活性で定量することもできる。 したがって、 例えば、 ある 薬剤を作用したときに、 F- box タンパク質と標的タンパク質の結合が促進される か、 あるいは阻害されるかを、 レポーター遺伝子の活性の増減を調べることによ り、 容易に判断できる。 特定の標的タンパク質へのュビキチン化活性が亢進、 あ るレ、は阻害されると、 癌をはじめとした様々な病態の原因となることが知られて いる。 もし、 ュビキチン化活性が亢進することによって病気が引き起こされるの であれば、 F - box タンパク質と標的タンパク質の結合を阻害する薬剤及び C - Box タンパク質と標的タンパク質の結合を阻害する薬剤は治療薬の候補になり うる。 また、ュビキチン化活性が低下することによって病気が引き起こされるであれば、 F-boxタンパク質と標的タンパク質の結合を促進する薬剤及び C-Box タンパク質 と標的タンパク質の結合を阻害する薬剤は治療薬の候補になり うる。このように、 F-box タンパク質と標的タンパク質の結合を促進あるいは阻害する薬剤及び C-Box タンパク質と標的タンパク質の結合を促進あるいは阻害する薬剤のスクリ —ニング及び評価する実験系として用いる。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . ( 1 ) 標的タンパク質の分解能が低下した細胞を、
( 2—a)ュビキチンリガ一ゼを構成するサブュニッ 卜のうち標的タンパク質と結 合するサブュニッ ト又は変異型の該結合サブュニット及び第 1 の領域を含む第 1 の融合タンパク質をコードする遺伝子、 並びに
( 2— b)標的タンパク質候補及び第 2の領域を含む第 2の融合タンパク質をコード する遺伝子で、
( 3 ) 形質転換して得られる形質転換細胞であって、 第 1 の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が相互作用すれば第 3の遺伝子の発現を活性又は抑制するこ とができる形質転換細胞を用いて、 ュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定 する方法。
2 . ( 1 ) 標的タンパク質の分解能が低下した細胞を、
( 2— a) F - box タンパク質又は変異型 F-boxタンパク質及び第 1の領域を含む第 1の融合タンパク質をコードする遺伝子、 及び
( 2— b)標的タンパク質候補及び第 2の領域を含む第 2の融合タンパク質をコード する遺伝子で、
( 3 ) 形質転換して得られる形質転換細胞であって、 第 1 の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が会合することにより第 3の遺伝子の発現を活性又は抑制す ることができる形質転換細胞を用いて、 SCF ュビキチンリガーゼの標的タンパク 質を同定する方法。
3 . 第 1の融合タンパク質中の第 1の領域及び第 2の融合タンパク質中の第
2の領域の組み合わせが、（ィ）転写因子 Gal4の DNA結合領域及び転写因子 Gal4 の活性化領域、 （口） 大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域と転写因子 B42の活性 化領域、 （ハ） Gal4の DNA結合領域及び V16の活性化領域、 （二） 転写因子の DNA 結合領域及び転写因子の抑制化領域、 （ホ） N-inte in及び C- intein、 （へ） SOSタ ンパク質及び Myristylation s ignal , 又は （ト） カルモジュリン依存性アデ二 ルシクラーゼの T25フラグメント及びカルモジュリン依存性アデニルシクラーゼ の T17フラグメント、 のいずれかである請求の範囲第 2項記載の方法。
4 . 第 3の遺伝子がレポータ一遺伝子である請求の範囲第 2項記載の方法。
5 . 標的タンパク質の分解能が低下した細胞は、 F— boxタンパク質が欠失し た変異細胞、 F— boxタンパク質遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞、 プロ テアソームをコードする遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞又はプロテア ソームインヒビターで処理された細胞である請求の範囲第 2項記載の方法。
6 . F— boxが由来する細胞と標的タンパク質の分解能が低下した細胞がとも に出芽酵母である請求の範囲第 2項記載の方法。
7 . ( 1 - a) F-box モチーフを欠失した変異型 F- box タンパク質又は Skpl との結合能が低下した変異型 F - box タンパク質及び転写因子の DNA結合領域（以 下 BD という） を含む第 1の融合タンパク質をコードする遺伝子、 並びに
( 1 _ b)標的タンパク質候補及び転写因子の活性化領域 （以下 ADという） を含む 第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子で、
( 2 ) F— boxタンパク質が欠失した変異細胞、 F— boxタンパク質遺伝子の発現が 温度感受性である変異細胞、 プロテアソームインヒビターで処理された細胞、 及 びプロテアソーム変異細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を低 下させた細胞を形質転換し、
( 3 ) 該形質転換細胞内で第 1 の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が相互 作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性又は抑制させることにより、 SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
8 . 前記 BDが Gal4の DNA結合領域であり、 前記 ADが Gal4の活性化領域で あり、 レポーター遺伝子 LacZである請求の範囲第 7項記載の方法。
9 . 前記 BDが大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域であり、前記 ADが転写因 子 B42の活性化領域であり、レポーター遺伝子が LacZである請求の範囲第 7項記 載の方法。
1 0 . 前記 BDが Gal4の DNA結合領域であり、前記 ADが V16の活性化領域で あり、 変異細胞が、 プロテアソ一ムインヒ ビターで処理された哺乳動物細胞 Hela である請求の範囲第 7項記載の方法。
1 1 . ( 1 _ a) F- boxモチーフを欠失した変異型 F_box タンパク質又は Skpl との結合能が低下した変異型 F-box タンパク質及び転写因子の活性化領域（以下 ADという） を含む第 1の融合タンパク質をコードする遺伝子、 及び
( 1 一 b)標的タンパク質候補及び転写因子の DNA結合領域 （以下 BDという） を含 む第 2の融合タンパク質をコ一ドする遺伝子で、
( 2 ) F— boxタンパク質が欠失した変異細胞、 F— boxタンパク質遺伝子の発現が 温度感受性である変異細胞、 プロテアソ一ムインヒ ビターで処理された細胞、 及 びプロテアソーム変異株細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を 低下させた細胞を形質転換し、
( 3 ) 該形質転換細胞内で第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が相互 作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性又は抑制させることにより、 SCFュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
1 2 . 前記 ADが Gal4の活性化領域であり、 前記 BDが Gal4の DNA結合領域 であり、 レポーター遺伝子 LacZである請求の範囲第 1 1項記載の方法。
1 3 . 前記 ADが転写因子 B42の活性化領域と前記 BDが大腸菌転写因子 LexA の DNA結合領域であり、 レポーター遺伝子が LacZである請求の範囲第 1 1項記載 の方法。
1 4 . 前記 ADが V16の活性化領域であり、前記 BDが Gal4の DNA結合領域で あり、 変異株細胞が、 プロテアソームインヒビター処理された哺乳動物細胞であ る請求の範囲第 1 1項記載の方法。
1 5 . 標的タンパク質候補を含む第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子 が遺伝子ライブラリ一である請求の範囲第 7から 14項いずれか 1項記載の方法。
1 6 . F— boxタンパク質がヒ トの F- boxタンパク質である請求の範匪第 7か ら 15項いずれか 1項記載の方法。
1 7 . プロテアソーム変異株細胞がプロテアソームの温度感受性変異出芽酵 母細胞である請求の範囲第 7又は 11項記載の方法。
1 8 . プロテアソームィンヒビタ一で処理された細胞がプロテアソームィン ヒビターで処理した出芽酵母細胞である請求の範囲第 7又は 1 1項記載の方法。
1 9 . ュビキチンリガーゼが APC/Cュビキチンリガ一ゼであり、 ュビキチン リガーゼを構成するサブュニッ トのうち標的タンパク質と結合するサブュニッ ト が、 Cdc20又は Hctl とこれらのヒ トホモログである請求の範囲第 1項記載の方法。
2 0 . ( 1 ) 標的タンパク質の分解能が低下した細胞を、
( 2 - a) C-box タンパク質又は変異型 C- boxタンパク質及第 1 の領域を含む第 1 の融合タンパク質をコードする遺伝子、 及び
( 2— b)標的タンパク質候補及び第 2の領域を含む第 2の融合タンパク質をコード する遺伝子で、
( 3 ) 形質転換して得られる形質転換細胞であって、 第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が会合することにより第 3の遺伝子の発現を活性又は抑制す ることができる形質転換細胞を用いて、 APC/C ュビキチンリガーゼの標的タンパ ク質を同定する方法。
2 1 . 第 1の融合タンパク質中の第 1の領域及び第 2の融合タンパク質中の 第 2の領域の組み合わせが、 （ィ） 転写因子 Ga l4の DNA結合領域及び転写因子 Gal4の活性化領域、 （口） 大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域と転写因子 B42の 活性化領域、 （ハ） Gal4の DNA結合領域及び V16の活性化領域、 （二） 転写因子の DNA結合領域及び転写因子の抑制化領域、 （ホ） N- intein及び C- intein、 （へ） SOS タンパク質及び Myristylation s ignal , 又は （ト） カルモジュリン依存性アデ 二ルシクラーゼの T25 フラグメン ト及びカルモジュリ ン依存性アデ二ルシクラー ゼの T17フラグメント、 のいずれかである請求の範囲第 2 0項記載の方法。
2 2 . 第 3の遺伝子がレポーター遺伝子である請求の範囲第 2 0項記載の方 法。
2 3 . 標的タンパク質の分解能が低下した細胞は、 C一 boxタンパク質が欠失 した変異細胞、 C一 boxタンパク質遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞、 プ 口テアソームをコードする遺伝子の発現が温度感受性である変異細胞又はプロテ ァソームインヒビターで処理された細胞である請求の範囲第 2 0項記載の方法。
2 4 . C一 boxが由来する細胞と標的タンパク質の分解能が低下した細胞がと もに出芽酵母である請求の範囲第 2 0項記載の方法。
2 5 . ( 1 - a) C- boxモチーフを欠失した変異型 C- box タンパク質及び転写 因子の DNA結合領域（以下 BDという） を含む第 1の融合タンパク質をコードする 遺伝子、 並びに
( 1一 b)標的タンパク質候補及び転写因子の活性化領域 （以下 ADという） を含む 第 2の融合タンパク質をコ一ドする遺伝子で、
( 2 ) C— boxタンパク質が欠失した変異細胞、 C一 boxタンパク質遺伝子の発現が 温度感受性である変異細胞、 プロテアソームインヒ ビターで処理された細胞、 及 びプロテアソーム変異細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を低 下させた細胞を形質転換し、
( 3 ) 該形質転換細胞内で第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が相互 作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性又は抑制させることにより、 APC/Cュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
2 6 . 前記 BDが Gal4の DNA結合領域であり、 前記 ADが Ga l4の活性化領域 であり、 レポーター遺伝子 LacZである請求の範囲第 2 5項記載の方法。
2 7 . 前記 BDが大腸菌転写因子 LexAの DNA結合領域であり、前記 ADが転写 因子 B42の活性化領域であり、レポーター遺伝子が LacZである請求の範囲第 2 5 項記載の方法。
2 8 . 前記 BDが Gal 4の DNA結合領域であり、前記 ADが V 16の活性化領域で あり、 変異細胞が、 プロテアソームインヒ ビターで処理された哺乳動物細胞であ る請求の範囲第 2 5項記載の方法。
2 9 . ( 1—a) C- boxモチーフを欠失した変異型 C- box タンパク質又は APC/C ュビキチンリガーゼとの結合能が低下した C- boxタンパク質及び転写因子の活性 化領域 （以下 ADという） を含む第 1の融合タンパク質をコ一ドする遺伝子、 及び ( 1—b)標的タンパク質候補及び転写因子の DNA結合領域 （以下 BDという） を含 む第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子で、
( 2 ) C— boxタンパク質が欠失した変異細胞、 C— boxタンパク質遺伝子の発現が 温度感受性である変異細胞、 プロテアソームインヒ ビターで処理された細胞、 及 びプロテアソーム変異株細胞からなる群から選ばれる標的タンパク質の分解能を 低下させた細胞を形質転換し、
( 3 ) 該形質転換細胞内で第 1の融合タンパク質と第 2の融合タンパク質が相互 作用又は結合すればレポーター遺伝子の発現を活性又は抑制させることにより、 APC/Cュビキチンリガーゼの標的タンパク質を同定する方法。
3 0 . 前記 ADが Ga の活性化領域であり、 前記 BDが Ga の DNA結合領域 であり、 レポーター遺伝子 LacZである請求の範囲第 2 9項記載の方法。
3 1 . 前記 ADが転写因子 B42の活性化領域と前記 BDが大腸菌転写因子 LexA の DNA結合領域であり、レポーター遺伝子が LacZである請求の範囲第 2 9項記載 の方法。
3 2 . 前記 ADが V16の活性化領域であり、前記 BDが Gal4の DNA結合領域で あり、 変異株細胞が、 プロテアソームインヒ ビターで処理された哺乳動物細胞 Helaである請求の範囲第 2 9項記載の方法。
3 3 . 標的タンパク質候補を含む第 2の融合タンパク質をコードする遺伝子 が遺伝子ライブラリ一である請求の範囲第 2 5から 3 2項いずれか 1項記載の方 法。
3 4 . C— boxタンパク質がヒ 卜の C- boxタンパク質である請求の範囲第 2 5 から 3 0項いずれか 1項記載の方法。
3 5 . プロテアソーム変異株細胞がプロテアソームの温度感受性変異出芽酵 母細胞である請求の範囲第 2 5又は 2 9項記載の方法。
3 6 . プロテアソームィンヒ ビターで処理された細胞がプロテアソームィン ヒビターで処理した出芽酵母細胞である請求の範囲第 2 5又は 2 9項記載の方法。
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