WO2006032713A1 - USO DE PROTEÍNAS CON AFINIDAD POR ARNs CORTOS CON ACTIVIDAD SUPRESORA DEL SILENCIAMIENTO POSTTRANSCRIPCIONAL DE GENES - Google Patents

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silencing
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Ángel CEBOLLA RAMÍREZ
Jozsef Burgyan
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Biomedal S.L.
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    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/38011—Tombusviridae
    • C12N2770/38022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention has, above all, applications in the field of biochemical, biomedical or biotechnological research, since RNAs are under study and the present invention would be one of the tools for obtaining specific short interference RNAs. It can be used to modify eukaryotic organisms so it could also be used in the biotechnology, agri-food or biopharmaceutical industry dedicated to making recombinant organisms. It could also be useful as a therapeutic tool for both the administration of the RNA bound protein or not to exert or suppress the expression of relevant genes to combat a pathological process.
  • RNA silencing also known as RNA or interfering RNA silencing
  • RNA silencing describes a highly specific phenomenon of degradation of target messenger RNAs. This degrading mechanism of gene inactivation is induced by double stranded RNA molecules with total or partial hairpin structure. The accumulation of dsRNAs (“double strand RNAs”) induces RNA silencing, which results in the degradation of these dsRNAs and suppression of homologous gene expression.
  • RNA molecules that can be classified into two groups: micro RNAs (miRNAs) and short interfering RNAs (siRNAs).
  • miRNAs micro RNAs
  • siRNAs short interfering RNAs
  • Mature miRNAs are single stranded RNA molecules (ssRNA) of 21-22 nucleotides.
  • the siRNAs are generated from the longest dsRNAs, and are 21-26 nucleotide long double stranded RNA molecules, and contain 3 'protruding ends of 2 nt (Cerutti, H. (2003) RNA interference: traveling in the cell and gaining functions? Trenas Genet 19, 39-46; Voinnet, O. (2002) RNA silencing: small RNAs as ubiquitous regulators of gene expression. Curr Opin Plant Biol, 5, 444).
  • MiRNAs are related to developmental regulation, while siRNAs are primarily involved in the suppression of molecular parasites (Voinnet, O. (2002) RNA silencing: small RNAs as ubiquitous regulators of gene expression. Curr Opin PlantBiol, 5, 444 ; Carrington, JC and Ambros, V. (2003) Role of microRNAs in plant and animal development. Science 301, 336-338; Baulcombe, D. (2002) Viral suppression of systemic silencing. Trenas Microbio !, 10, 306-308 ) as transposons, transgenes and viruses (Voinnet, O. (2001) RNA silencing as a plant irnmune system against virases.
  • siRNAs could be involved in developmental gene control (Aravin, AA, Naumova, NM, Tulin, AV, Vagin, VV, Rozovsky, YM, Gvozdev, VA (2001) Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr Biol. 11, 1017-1027).
  • RNA induced silencing complex RNA induced silencing complex
  • siRNAs are generally characterized by their short length (21-26 nucleotides), 2 nucleotides that protrude at a 3 'protruding end and 5' phosphate groups. But in addition, siRNAs can interact with the target messenger RNAs by functioning as initiators in a polymerization reaction catalyzed by an RNA-dependent RNA polymerase (RdRp).
  • RdRp RNA-dependent RNA polymerase
  • RNA-dependent RNA is generated that is again recognized by RNase-III and digested in siRNAs, thus amplifying silencing (Sijen, T. et al. (2001) On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing CeIl 107, 465-476; Dalmay, T. et al. (2000) An RNA-dependent RNA
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Ce 101, 543-553; Mourrain, P. et al. (2000) Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Ce 101, 533-542).
  • RNA silencing in plants is an extremely complex system that takes place both at the level of simple cells ("cell-autonomous silencing" or of the plant as a whole (“systemic silencing"). The process of autonomous cell silencing results in the suppression of homologous genes in the cells in which dsRNAs accumulate, so that mobile silencing signals are generated.
  • DICER-LIKE1 protein (DCLl) is required for the production of miRNA but not for the generation of siRNA (Finnegan, EJ. Et al. (2003) Posttranscriptional Gene Silencing Is Not Compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE1) Mutant , a Homolog of Dicer- 1 from Drosophila. Curr Biol 13, 236-240; Boutet, S. et al. (2003) Arabidopsis HENl. A Genetic Link between Endogenous miRNA Controlling Development and siRNA Controlling Transgene Silencing and Virus Resistance. Curr Biol 13, 843-848).
  • siRNAs Two proteins homologous to DICER process long dsRNAs to give rise to different small and long siRNAs (Tang, G. et al. (2003) A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes Dev 17, 49-63).
  • Small siRNAs 21-22 nt
  • longer siRNAs 24-26 nt could be involved in long-distance systemic silencing and methylation of DNA / histone complexes (Zilberman, D. Cao, X.
  • RNA silencing Li, H., Li, WX, and Ding, SW (2002). Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus Science 296, 1319-1321; Li, WX, and Ding, SW (2001). Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechno ⁇ 12, 150-154; Voinnet, O.
  • RNA silencing as a plant immune system against viruses Trends Genet, Yl, 449-459) taking as a target different steps of the silencing process (Li, WX, and Ding, SW (2001).
  • Numerous silencing suppressors have been identified in different types of veins, including those containing ssRNA and ssDNA both positively and negatively (Anandalakshmi, R. et al. (1998) A viral suppressor of gene silencing in plants. Proc Nati Acad Sci USA 95, 13079-13084; Brigneti, G.
  • Viral pathogenicity determinants are suppresors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBOJIl, 6739-6746; Kasschau, KD and Carrington, JC (1998). A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing, CeIl 95, 461-470; Li, WX 5 and Ding, SW (2001). Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechno ⁇ 12, 150-154; Voinnet, O. et al. (1999) Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants.
  • the genome of the tombusvirus (tomato bushy virus group) is linear, and is constituted by ssRNA in a positive sense.
  • This genome encodes a 19 kDa protein, called pl9 (ORF 5), and has been shown to be a suppressor of RNA silencing (Qiu, W., Park, JW and Scholthof, HB (2002) Tombusvirus P19-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity Mol Plant Microbe Interact, 15, 269-280; Qu, F. and Morris, TJ. (2002) Efficient infection of Nicotiana benthamiana by Tomato bushy stunt virus is facilitated by the coat protein and maintained by
  • a viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs EMBO J, 21, 3070-3080; Qiu, W., Park, JW and Scholthof, HB (2002) Tombusvirus P19-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity.
  • suppressor proteins such as thombusvirus pl9 to bind with high affinity and specificity to double stranded RNAs between 19 and 25 nucleotides, preferably 21 nt siRNAs, which contain a 3-terminus. '2 nt protuberant, and phosphate groups at the 5' end.
  • This property can be used in vitro to isolate siRNAs present in cells given by copurification with the polypeptide sequence of the suppressor protein pl9, which in turn is separated by affinity chromatography or other separation method that one skilled in the art can use.
  • said polypeptide sequence can be used to sequester populations of specific RNAs of a given size corresponding to siRNAs, which can thus be differentiated from miRNAs that have a different size or different structure in general.
  • the suppressor protein can be fused to other polypeptide sequences that give it additional properties while maintaining its ability to bind RNAs 5 such as affinity to chromatographic purification supports, affinity for
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) certain biological receptors, transport through biological fluids, translocation through peptide membranes, etc. Specific binding to certain RNAs can be used to copurify siRNAs or to suppress posttranslational silencing caused by siRNAs of less than 26 nucleotides.
  • the specific binding between the pl9 protein and 21 nt siRNAs, in the first place can be demonstrated by previously obtaining the purified protein. This can be done by expressing in E. coli the recombinant pl9 protein fused to a polypeptide that allows its subsequent affinity purification. The recombinant protein obtained is used to perform electrophoretic mobility tests in which it is contacted with oligonucleotides of different lengths (19-26 mer) and with different characteristics, to demonstrate the specificity of the binding between the pl9 protein and siRNAs of 21 nt (see example 2).
  • a possible utility of this characteristic of the protein is to specifically capture the 21 nt siRNA molecules from a mixture of RNA molecules of different lengths and characteristics, thus separating the RNA molecules generated during the post-transcriptional gene silencing process. rest of RNA molecules.
  • recombinantly expressed pl9 protein could be used to separate 21 nt siRNA molecules from the remaining constituent components of an extract from a cell culture or organism.
  • This property of the pl9 protein therefore assumes that it can be used as a tool for the investigation of the post-translational gene silencing process, since with it the siRNAs that have been generated in an organism or cell culture that has been isolated can be isolated. subjected to certain experimental conditions. In this way you can compare the genes that are silenced as a result of the application of certain conditions to a cell culture or an organism under study. In addition, the abundance of some siRNAs is too low, so they are very difficult to detect using the tools currently available.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) It is a very useful tool to solve the problems derived from the low abundance of some siRNAs, since they specifically bind to it, and this makes its enrichment and / or purification possible.
  • the pl9 protein can therefore be used as an affinity probe in which 21 nt siRNAs are retained, expanding the chances of success in the detection and study of these small RNAs 5 from which they could be define a multitude of cell signaling routes whose knowledge is not yet complete.
  • This property of the pl9 type protein can be used on the one hand to obtain short RNAs in vitro, using cellular extracts mixed with the purified sequestration protein that can be specifically immobilized by means of affinity columns with specific antibodies, covalent chemical crosslinking with the support or by means of a translational fusion to an affinity labeling, for example a polyhistidine chain, glutathione-S-transferase, the maltose binding domain (MBP, obtainable from the New England Biolabs company), to choline (C -LYTAG from Biomedal), chitin or cellulose (CBD, from Novagen), etc.
  • affinity labeling for example a polyhistidine chain, glutathione-S-transferase, the maltose binding domain (MBP, obtainable from the New England Biolabs company), to choline (C -LYTAG from Biomedal), chitin or cellulose (CBD, from Novagen), etc.
  • RNAs would bind to the fused pl9 protein whether or not it is another protein with a polypeptide domain that allows it to be purified in one step by affinity chromatography.
  • the RNAs could be subsequently separated once the dsRNA protein complexes were purified, using conditions that specifically denatured the protein (not the RNA) 5 such as temperature, chaotropic compounds, pH, etc.
  • protein-RNA complexes could be purified in vivo if using the fusion of the protein, fused or not to the purification domain, you can engineer how to express it within eukaryotic cells.
  • DNA vectors are constructed encoding said sequences and the cells are transformed or transfected, by means of the usual systems that a person skilled in the art usually knows, the stable or transient expression of the protein fusion with specific promoters can be achieved. If there are short 21nts RNAs in the cells, they will bind to the protein. The cells can subsequently be broken under conditions that do not alter the protein-RNA binding and can be isolated by affinity chromatography, immunoprecipitation with specific antibodies or any other technique that specifically binds the binding to the suppressor protein ( Figure 1). Another utility of the pl9 protein and other PTGS suppressors is to conditionally suppress PTGS in certain cells.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) of a genetically manipulated organism (animals or plants).
  • promoters that can be used are: promoters induced during development, promoters induced by chemical substances such as IPTG (Lac operator / repressor Lacl) or tetracycline (derivatives of the TetR regulator), by temperature, or by any environmental change (osmotic stress, light , etc.) (figure 2).
  • siRNAs have also been suggested as possible therapeutic tools to reprogram the expression of genes in diseased cells
  • the property of binding siRNAs can be exploited so that the suppressor protein binds to other molecules that have affinity for these pathogenic cells and that can intern in the cytoplasm
  • Other degradation signals by intracellular proteases fused to the suppressor protein would specifically degrade it, preferably PEST sequences (Rechsteiner M, Rogers SW (1996) PEST sequences and regulation by proteolysis.
  • This example shows how the PTGS suppressor protein pl9 can be purified.
  • the cDNA of Carnation ringstalian ringspot viras protein (CIRV) is amplified by PCR using an oligonucleotide homologous to the first 22 nucleotides of the sequence and another complementary to the last 21 nucleotides of the coding region, starting from a plasmid containing the Complete cDNA of CIRV (Burgyán, J. et al. (1996).
  • the 5 '-terminal region of a tombusvirus genome determines the origin of multivesicular bodies. J Gen Virol 11, 1967-1974).
  • the amplified fragment is cloned into the expression plasmid pGEX-2T.
  • the cells are resuspended in PBS buffer (137 raM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na 2 HPO 4 JH 2 O, 1.4 mM KH 2 PO 4 , 1 mM TCEP, pH 8.0) and lysed by sonication in an ice bath dry / ethanol
  • the fusion protein is purified from the soluble fraction by incubation with glutathione-agarose for 15 minutes at 4 0 C.
  • the resin is washed with PBS, then with PBS supplemented with 0.5 M NaCl, with rupture buffer (20 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1 mM
  • EXAMPLE 2 This example describes how the sequence of pl9 can be used to specifically bind short double stranded RNAs.
  • the affinity of pl9 for siRNA and its specificity for each of the characteristics of the siRNA can be determined using electrophoretic mobility tests (mobility shi ⁇ assays) and measures of the dissociation constant.
  • RNA oligonucleotides are labeled in amounts of 50 pmol using 0.3 ⁇ M [ ⁇ - 32 P] and 20 U of T4 polynucleotide kinase.
  • the reaction is performed in 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl 2 and 5 mM DTT at 37 0 C for 30 minutes.
  • the kinase is subsequently inactivated at 7O 0 C for 20 minutes.
  • To the reaction was added a synthetic oligonucleotide 5' - phosphorylated, and the oligos are treated to 9O 0 C for 1 min followed by slow cooling of the order of I 0 C every 3 minutes.
  • the siRNA duplexes are purified by electrophoresis in polyacrylamide gels (PAGE) using 20% gels in TBE (Tris-borate ethylenediaminetriacetic).
  • siRNAs are visualized on a film, cut from the gel, and eluted overnight in a solution containing 0.5 M sodium acetate, 1 mM EDTA (pH 6.0).
  • the RNA is precipitated using 70% ethanol, and resuspended in Tris-EDTA buffer.
  • the proteins are diluted in a 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0), 1 mM TCEP and 0.02% (w / v) Tween-20.
  • CIRV pl9 can be tested against less than 2.5 pM of siRNA labeled in 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 mM TCEP, 100 mM NaCl and 0.02% Tween-20.
  • the 5 'synthetic and phosphorylated oligonucleotides hybridize in the same manner as in the labeling procedure to form the competing RNA.
  • the competing siRNAs are tested against less than 2.5 pM of 21 nt labeled siRNAs, containing 2 nt at the 3 'end and 0.7 nM CIRV pl9 at 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 mM TCEP, 100 mM NaCl and 0.02% Tween-20. Binding reactions are incubated at room temperature for 45 minutes-1 hour, and adjusted to 7.5% (w / v) Ficoll 400. A part of the reaction is analyzed by electrophoresis at 100 V for 45 minutes and using a gel of 6% in 0.5X TBE. The gels are
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) They dry, and are exposed for 1-5 days. The bands corresponding to the free and bound labeled oligonucleotides are quantified. Based on these measurements, calculations of the apparent dissociation constant (Kd) for the binding of oligonucleotides to the CIRV p 19 protein are performed. The results obtained (see Table 1) show the great affinity of this protein for 21 nt siRNA ( 19-mer duplex with phosphate groups at the 5 'end and 2 nt at the 3' protruding end): 0.17 + 0.02 nM.
  • Kd apparent dissociation constant
  • Kd is the largest dissociation constant measured directly from electrophoretic mobility tests and is not corrected according to the percentage of active protein.
  • Krel is the affinity of the CIRV pl9 protein for siRNA, relative to the affinity for 21-mer oligonucleotides with 5 'phosphate groups and 3 nt protruding ends at the 3' end, measured by competition and electrophoretic mobility tests.
  • the following example shows how the binding of the suppressor protein and the 21 nt siRNAs can be modified using protein mimics. Mutations are made in the pl9 protein and it can be shown that they interfere with the suppression of RNA silencing.
  • the mototants of the pl9 protein are generated by directed mutagenesis. PCR reactions are performed by amplifying the coding region of the pl9 protein (between nucleotides 3872 and 4390) of the CIRV cDNA (Burgyán, J. et al. (1996).
  • the 5 '-terminal region of a tombusvirus genome determines the origin of multivesicular bodies. J Gen Virol 11, 1967-1974) and using appropriate oligonucleotides in each case, to generate point mutations.
  • Nicotiana benthamiana plants are infiltrated with Agrobacterium tumefaciens carrying a gene construct that expresses 35 S-GFP or co-infiltrated with A. tumefaciens carrying 35 S-GFP and other A tumefaciens expressing the mutant protein of pl9 of interest, (see figure 3).
  • the infiltration in the leaves of JV. Wild benthamiana with a strain of A. tumefaciens carrying 35 S-GFP results in a transient expression but also induces the induction of GFP RNA silencing (Johansen and Carrington, 2001; Silhavy et al, 2002).
  • RNA silencing manifested in the reduction of GFP fluorescence, results in the decrease of GFP mRNA levels and the accumulation of GFP-specific siRNAs at the sites of infiltration.
  • Coexpression of GFP and wild-type pl9 CIRV by agrofiltration suppresses GFP RNA silencing and results in intense fluorescence of GFP, high levels of GFP mRNA, and absence of accumulation of GFP siRNA.
  • the suppression levels of GFP silencing in agroinfiltration trials are correlated with the severity of the symptoms caused by the mutated virus. Imitating pl9 proteins are expressed at levels similar to wild, however, GFP derived siRNAs accumulate at high levels while GFP mRNA levels turn out to be significantly lower than in control infiltration with wild pl9 protein.
  • EXAMPLE 4 This example shows how 21 nucleotide siRNAs can be specifically isolated by using pl9 protein fused to a polypeptide tag for copurification.
  • the fragment of the gene coding for the pl9 protein is isolated by PCR using specific primers having the restriction targets BamHl and HmdlII at their ends. The fragment is digested with said enzymes and isolated.
  • plasmid pALEXb is digested
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (Biomedal SL, Spain), which contains the cascade expression system directing the expression of the C-LYTAG tag that binds to choline analogs (Ortega, S., Garc ⁇ a, JL, Zazo, M., Várela, J. , Mu ⁇ oz-Willery, L, Cuevas, P. and Giménez-Gallego, G. (1992) Bio / Technology 1O 5 795-798), with the same restriction enzymes. Both DNA fragments are ligated to give rise to a plasmid with the pl9 fragment fused to the C-LYTAG sequence under the control of the Pm promoter. With this plasmid the strain E.
  • coli CC1184S2 (Onion, A., Sousa, C. and V. de Lorenzo. (2001) is transformed. Rational design of a bacterial transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity. Nucleic Acids Res. 29: 759 -766) which has the regulator module that activates Pm.
  • the cultures are grown in LB in the presence of 100 mg / 1 ampicillin to ensure the permanence of the plasmid and are induced when it reaches an optical density of 0.6 to 0.8 with 2 mM salicylate for 4-6 hours at 3 0 0 C.
  • the induced cells are they break by sonication and the fusion protein of the extracts is purified by a column of cellulose DEAE, and using 150 mM choline chloride as eluent.
  • A. tumefaciens carrying 35 S-GFP results in a transient expression but also induces the silencing of GFP RNA silencing.
  • Infiltrated leaf cells are taken and extracts are obtained. These extracts are mixed with the purified protein C-LYTAG-pl9 (0.5 mg) and passed through 1 to 5 ml of a C-LYTRAP column (Biomedal SL, Spain).
  • the column is washed with saline (1.5 M NaCl) using at least 10 times the volume of extract added.
  • Protein fusion is eluted with 1 ml of 150 mM choline chloride.
  • the eluted protein has the double stranded RNA of 21 nucleotides. These molecules can be separated by partial denaturation by heat (65-7O 0 C) or with detergents for 15-20 minutes. Subsequently, the bound siRNA can be concentrated by precipitation with 2.5 volumes of ethanol.
  • the siRNA can also be purified using a 6 to 12% polyacrylamide gel and eluting the band corresponding to the siRNA.
  • FIGURES Figure 1 Representative scheme showing the purification process of an RNA-protein pl9 complex, using a fusion protein formed by the pl9 protein and the affinity domain C-LYTAG.
  • the fusion protein is added to a cell extract, or introduced or expressed inside the cells.
  • the fusion protein binds to the 21 nucleotide RNAs of the extract specifically. Then, the extract is passed through a column of
  • FIG. 1 SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) DEAE cellulose, specifically binding to the column the C-LYTAG domain that is fused to the pl9 protein. Elution using the affinity ligand of the column (choline) in excess results in the purification of the C-LYTAG pl9 fusion protein bound to the 21 nucleotide RNAs.
  • Figure 2 Representative scheme of the suppression of the post-transcriptional gene silencing process by the pl9 protein.
  • the pl9 protein can be introduced into the cell by transfection techniques or conditionally expressed using its coding DNA sequence linked to controlled promoters.
  • the pl9 protein binds specifically to the 21 nucleotide RNAs, suppressing the silencing of those genes that are subject to said process.
  • Figure 3 Effects produced by the mutation of the CIRV pl9 protein in RNA silencing.
  • A Wild N. benthamiana leaves infiltrated with 35S-GFP or co-filtered with 35S-GFP and 35 or S-CIRV pl9 protein, wild or mutant. The silencing of the GFP protein results in red fluorescence (autofluorescence of chlorophyll), which appears in the photograph in dark gray. Suppression of silencing results in the appearance of green fluorescence, which is seen in the photograph as a lighter gray color. The photographs were taken 6 days after inoculation from sheets illuminated with UV light.
  • B Western blot of total pl9 protein (top panel) and 21 nt RNA analysis specific to GFP (middle panel) and total GFP mRNA (bottom panel). Protein and RNA extraction was performed 6 days after inoculation.

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Abstract

La presente invención hace referencia al uso de una proteína capaz de unir o capturar específicamente poblaciones de RNA cortos de doble cadena de un tamaño definido. Fusiones a estas proteínas pueden usarse como soporte de afinidad para aislar y purificar RNAs específicos presentes en células eucarióticas como los RNAs cortos interferentes de doble cadena. También pueden usarse para suprimir el silenciamiento posttranscripcional de genes (PTGS) de forma específica y condicional si se controla la presencia de la proteína dentro de células. Se pueden también fusionar a una secuencia polipeptídica específica que dirija la proteína p19 unida o no RNA, hacia células concretas donde se desee dirigir la función transportada. Como proteína preferente, se puede usar la proteína p19 de los tombusvirus (tomato bushy virus group) que une con gran afinidad siRNAs de 21 nt, con 2 nt en el extremo 3´ protuberante y grupos fosfato en el 5´.

Description

TITULO
Uso de proteínas con afinidad por ARNs cortos con actividad supresora del silenciamiento posttranscripcional de genes
DESCRIPCIÓN
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención tiene sobre todo aplicaciones en el campo de la investigación bioquímica, biomédica o biotecnológica, puesto que los RNAs son objeto de estudio y la presente invención sería una de las herramientas para obtener RNAs cortos de interferencia específicos. Puede emplearse para modificar organismos eucarióticos por lo que también podría usarse en industria biotecnológica, bien agroalimentaria o bien biofarmacéutica dedicada a hacer organismos recombinantes. También podría ser útil como herramienta terapéutica tanto para la administración de la proteína unida o no al RNA para ejercer una supresión o activación de la expresión de genes relevantes para combatir un proceso patológico.
ESTADO DE LA TÉCNICA
El término silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS), también conocido como silenciamiento por RNA o RNA interferente, describe un fenómeno altamente específico de degradación de los RNA mensajeros diana. Este mecanismo degradativo de inactivación génica está inducido por moléculas de RNA bicatenario con estructura total o parcial de horquilla. La acumulación de dsRNAs ("double strand RNAs") induce el silenciamiento del RNA, que resulta en la degradación de estos dsRNAs y la supresión de la expresión de genes homólogos. El proceso comienza cuando los dsRNAs son reconocidos por una enzima RNasa de tipo III, denominada Dicer y específica de RNA de doble cadena, que los procesa para dar lugar a moléculas más pequeñas de RNA que pueden clasificarse en dos grupos: micro RNAs (miRNAs) y RNAs interferentes cortos ("short interfering RNAs" o siRNAs). Los miRNAs maduros son moléculas de RNA de cadena simple ("single strand RNA" o ssRNA) de 21-22 nucleótidos. Los siRNAs se generan a partir de los dsRNAs más largos, y son moléculas de RNA de cadena doble de 21-26 nucleótidos de largo, y que contienen extremos 3' protuberantes de 2 nt (Cerutti, H. (2003) RNA interference: traveling in the cell and gaining functions? Trenas Genet 19, 39-46; Voinnet, O. (2002) RNA silencing: small RNAs as ubiquitous regulators of gene expression. Curr Opin Plant Biol, 5, 444).
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Los miRNAs están relacionados con la regulación del desarrollo, mientras que los siRNAs están involucrados principalmente en la supresión de parásitos moleculares (Voinnet, O. (2002) RNA silencing: small RNAs as ubiquitous regulators of gene expression. Curr Opin PlantBiol, 5, 444; Carrington, J.C. y Ambros, V. (2003) Role of microRNAs in plant and animal development. Science 301, 336-338; Baulcombe, D. (2002) Viral suppression of systemic silencing. Trenas Microbio!, 10, 306-308) como transposones, transgenes y virus (Voinnet, O. (2001) RNA silencing as a plant irnmune system against virases. Trenas Genet, 17, 449-459). También se ha demostrado que los siRNAs podrían estar involucrados en el control génico del desarrollo (Aravin, A.A., Naumova, N.M., Tulin, A.V., Vagin, V.V., Rozovsky, Y.M., Gvozdev, V.A. (2001) Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tándem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline. Curr Biol. 11, 1017-1027).
Es importante destacar que las vías en las que participan los miRNAs y los siRNAs comparten algunos componentes. Ambos tipos de RNA se incorporan dentro de un complejo ribonucleoprotéico conocido como RISC ("RNA induced silencing complex") actuando a modo de determinantes de especificidad en el reconocimiento de los RNAs diana mediante complementariedad de bases. Esta interacción desemboca en la degradación e inactivación del mRNA diana con secuencia homologa a la molécula inductora (Doench, J.G. et al. (2003) siRNAs can function as miRNAs. Genes Dev 17, 438- 442; Finnegan, EJ. et al. (2003) Posttranscriptional Gene Silencing Is Not Compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE 1) Mutant, a Homolog of Dicer- 1 from Drosophila. Curr Biol 13, 236-240; Hutvagner, G. y Zamore, P.D. (2002) RNAi: nature abhors a double-strand. Curr Opin Genet Dev 12 , 225-232; Chen, X. (2003) A MicroRNA as a Translational Repressor of APET ALA2 in Arabidopsis Flower Development. Science 11, 1; Aukerman, MJ. y Sakai, H. (2003) Regulation of Flowering Time and Floral Organ Identity by a MicroRNA and Its APETALA2-Like Target Genes. Plant CeIl 10, 10 Baulcombe, D. C. (1999). Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr Opin Plant Biol 2, 109-113). Los siRNAs están caracterizados generalmente por su corta longitud (21-26 nucleótidos), 2 nucleótidos que sobresalen en un extremo protuberante 3' y grupos fosfato en el 5'. Pero además, los siRNAs pueden interaccionar con los RNA mensajeros diana funcionando como iniciadores en una reacción de polimerización catalizada por una RNA polimerasa dependiente de RNA (RdRp). De esta manera, utilizando el RNA diana como molde, se genera un RNA bicatenario que es nuevamente reconocido por la RNasa-III y digerido en siRNAs, amplificando así el silenciamiento (Sijen, T. et al. (2001) On the role of RNA amplification in dsRNA-triggered gene silencing. CeIl 107, 465-476; Dalmay, T. et al. (2000) An RNA-dependent RNA
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) polymerase gene in Arabidopsis is required for posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. CeIl 101, 543-553; Mourrain, P. et al. (2000) Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. CeIl 101, 533-542). El silenciamiento del RNA en plantas es un sistema extremadamente complejo que tiene lugar tanto a nivel de las células simples ("cell-autonomous silencing" o silenciamiento autónomo de la célula) como de la planta en su conjunto ("systemic silencing"). El proceso del silenciamiento autónomo de la célula da lugar a la supresión de genes homólogos en las células en las que se acumulan los dsRNAs, de manera que se generan señales de silenciamiento móviles. Estas señales provocan la supresión de mRNAs homólogos en células vecinas (corta distancia) o en partes más alejadas de la planta (silenciamiento sistémico a larga distancia) (Mlotshwa, S., Voinnet, O., Mette, M.F., Matzke, M., Vaucheret, H., Ding, S.W., Pruss, G. and Vanee, V.B. (2002) RNA silencing and the mobile silencing signal. Plcmt CeIl 14, Suppl, S289-301). En plantas existen diferentes genes similares a DICER que procesan moléculas de RNA cortas (Schauer, S.E. et al. (2002) DICER-LIKE1: blind men and elephants in Arabidopsis development. Trenas Plant Sci 7, 487-491). La proteína DICER-LIKE1 (DCLl) se requiere para la producción de miRNA pero no para la generación de siRNA (Finnegan, EJ. et al. (2003) Posttranscriptional Gene Silencing Is Not Compromised in the Arabidopsis CARPEL FACTORY (DICER-LIKE1) Mutant, a Homolog of Dicer- 1 from Drosophila. Curr Biol 13, 236-240; Boutet, S. et al. (2003) Arabidopsis HENl. A Genetic Link between Endogenous miRNA Controlling Development and siRNA Controlling Transgene Silencing and Virus Resistance. Curr Biol 13, 843-848). Dos proteínas homologas a DICER procesan los dsRNAs largos para dar lugar a diferentes siRNAs pequeños y largos (Tang, G. et al. (2003) A biochemical framework for RNA silencing in plants. Genes Dev 17, 49-63). Los siRNAs pequeños (21-22 nt) parece que actúan como guía para la inactivación del mRNA mediada por el RISC, la amplificación de los dsRNAs mediada por RdRP y el silenciamiento sistémico de corta distancia. Por otro lado, los siRNAs más largos (24-26 nt) podrían estar involucrados en el silenciamiento sistémico de larga distancia y el la metilación de los complejos DNA/histonas (Zilberman, D. Cao, X. and Jacobsen, S.E. (2003) ARGONAUTE4 control of locus-specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299, 716-719; Hamilton, AJ. et al. (2002). Two classes of short interfering RNA in RNA silencing. EMBO J 21,4671-4679; Mette, M.F. et al. (2000) Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA. EMBO J 19, 5194-5201).
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) La mayoría de los virus de las plantas poseen un genoma de RNA de cadena simple (HuIl5 R. (2002) Matthews' Plant Virology, Academic Press) que se replica vía intermediarios ("double strand RNAs" o dsRNAs), que son fuertes inductores del silenciamiento del RNA y se cree que son precursores de los siRNAs virales (Ahlquist, P. (2002) RNA-dependent RNA polymerases, viruses, and RNA silencing. Science 296, 1270-1273). Hasta la incorporación de estos siRNAs derivados de los virus en el RISC, el RNA viral se encuentra específicamente atacado para su degradación (Baulcombe, D. C. (1999). Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr Opin Plant Biol 2, 109-113; Waterhouse, P. M., Smith, N. A., and Wang, M.-B. (1999). Virus resistance and gene silencing: killing the messenger. Trends Plant Sci 4, 452-457) permitiendo a la planta recuperarse de la infección viral. Como un mecanismo de defensa, tanto la planta como los virus de los insectos han desarrollado proteínas que suprimen el silenciamiento del RNA (Li, H., Li, W. X., y Ding, S. W. (2002). Induction and suppression of RNA silencing by an animal virus. Science 296, 1319-1321; Li, W. X., y Ding, S. W. (2001). Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechnoí 12, 150-154; Voinnet, O. (2001) RNA silencing as a plant immune system against viruses. Trends Genet, Yl, 449-459) tomando como diana diferentes pasos del proceso del silenciamiento (Li, W. X., y Ding, S. W. (2001). Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechnoí 12, 150-154). Se han identificado numerosos supresores del silenciamiento en diferentes tipos de viras, incluyendo los que contienen ssRNA y ssDNA tanto en sentido positivo como en negativo (Anandalakshmi, R. et al. (1998) A viral supresor of gene silencing in plants. Proc Nati Acad Sci USA 95, 13079-13084; Brigneti, G. et al (1998) Viral pathogenicity determinants are suppresors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana. EMBOJIl, 6739-6746; Kasschau, K.D. y Carrington, J.C. (1998). A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing. CeIl 95, 461-470; Li, W. X.5 y Ding, S. W. (2001). Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechnoí 12, 150-154; Voinnet, O. et al. (1999) Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants. Proc Nati Acad Sci USA 96, 14147- 14152), pero el mecanismo molecular por el que ocurre la supresión es aun desconocido. El genoma de los tombusvirus (tomato bushy virus group) es lineal, y está constituido por ssRNA en sentido positivo. Dicho genoma codifica una proteína de 19 kDa, denominada pl9 (ORF 5), y se ha demostrado que es un supresor del silenciamiento del RNA (Qiu, W., Park, J.W. and Scholthof, H.B. (2002) Tombusvirus P19-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity. Mol Plant Microbe Interact, 15, 269-280; Qu, F. y Morris, TJ. (2002) Efficient infection of Nicotiana benthamiana by Tomato bushy stunt virus is facilitated by the coat protein and maintained by
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) pl9 through suppression of gene silencing. Mol Plant Microbe Interact, 15, 193-202; Silhavy, D., Molnar, A., Lucioli, A., Szittya, G., Homyik, C, Tavazza, M. and Burgyan, J. (2002) A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21- to 25-nucleotide double- stranded RNAs. EMBO J, 21, 3070-3080; Voinnet, O. et al. (1999) Suppression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA virases of plants. Proc Nati Acad Sci USA 96, 14147-14152). Se ha comprobado que la proteína pl9 se une a los siRNAs y los secuestra, evitando su incorporación al RISC. Se han realizado análisis comparativos de infecciones virales utilizando el virus salvaje y un muíante que no posee la proteína pl9, llegando a la conclusión de que la proteína pl9 es un requerimiento para que tenga lugar la infección vírica (Silhavy, D., Molnar, A., Lucioli, A., Szittya, G., Hornyik, C, Tavazza, M. and Burgyan, J. (2002) A viral protein suppresses RNA silencing and binds silencing-generated, 21- to 25-nucleotide double-stranded RNAs. EMBO J, 21, 3070-3080; Qiu, W., Park, J. W. and Scholthof, H.B. (2002) Tombusvirus P19-mediated suppression of virus-induced gene silencing is controlled by genetic and dosage features that influence pathogenicity. Mol Plant Microbe Interact, 15, 269-280; Qu, F. y Morris, TJ. (2002) Efficient infection oϊNicotiana benthamiana by Tomato bushy stunt virus is facilitated by the coat protein and maintained by pl9 through suppression of gene silencing. Mol Plant Microbe Interact, 15, 193-202). Dicha afinidad parece ser que es preferente por RNAs de doble cadena de 21 nucleótidos con extremos protuberantes de dos nucleótidos (Vargason JM, Szittya G, Burgyan J, Tanaka Hall TM. Size selective recognition of siRNA by an RNA silencing suppressor CeIl (2003)115, 799-811).
OBJETO DE LA INVENCIÓN
En la presente invención, describimos procedimientos para aplicar la propiedad de proteínas supresoras como la pl9 del tombusvirus para unirse con alta afinidad y especificidad a RNAs de doble cadena de entre 19 y 25 nucleótidos, preferentemente a siRNAs de 21 nt, que contienen un extremo 3' protuberante de 2 nt, y grupos fosfato en el extremo 5'. Esta propiedad puede usarse in vitro para aislar siRNAs presentes en unas células dadas mediante copurificación con la secuencia polipeptídica de la proteína supresora pl9, que a su vez es separada por cromatografía de afinidad u otro método de separación que un experto en la materia puede usar. In vivo, dicha secuencia polipeptídica puede usarse para secuestrar poblaciones de RNAs específicos de un tamaño dado correspondientes a siRNAs, que pueden diferenciarse así de los miRNAs que tienen un tamaño distinto o diferente estructura en general. La proteína supresora puede fusionarse a otras secuencias polipeptídicas que le den propiedades adicionales manteniendo su capacidad de unir los RNAs5 tales como afinidad a soportes cromatográficos de purificación, afinidad por
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) determinados receptores biológicos, transporte a través de fluidos biológicos, traslocación a través de membranas peptídicas, etc. La unión específica a determinados RNAs puede usarse para copurificar los siRNAs o bien para suprimir el silenciamiento posttraduccional provocado por los siRNAs de menos de 26 nucleótidos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN.
Por un lado, la unión específica entre la proteína pl9 y siRNAs de 21 nt, en primer lugar, se puede demostrar obteniendo previamente la proteína purificada. Esto se puede hacer mediante la expresión en E. coli de la proteína pl9 recombinante fusionada a un polipéptido que permite su posterior purificación por afinidad. La proteína recombinante obtenida se utiliza para realizar ensayos de movilidad electroforética en los que se pone en contacto con oligonucleótidos de diferentes longitudes (19-26 mer) y con diferentes características, para demostrar la especificidad de la unión entre la proteína pl9 y siRNAs de 21 nt (ver ejemplo 2). A partir de la medida de la cantidad de oligonucleótido retenido por la proteína se realizan cálculos de la constante de disociación aparente (Kd) para la unión entre los oligonucleótidos y la proteína pl9. Los resultados de los experimentos muestran que existe una gran afinidad en la unión de la pl9 recombinante y los oligonucleótidos siRNA de 21 nt con 2 nt en el extremo 3' protuberante y grupos fosfato en el 5'. En concreto, la constante de afinidad aparente en este caso es de 0.17+0.02 nM. Esta propiedad hace a la proteína pl9 recombinante una herramienta apropiada para unir específicamente a los siRNAs de estas características.
Una posible utilidad de esta característica de la proteína es capturar específicamente las moléculas de siRNA de 21 nt a partir de una mezcla de moléculas de RNA de diferentes longitudes y características, consiguiendo así separar las moléculas de RNA generadas durante el proceso de silenciamiento génico postranscripcional del resto de moléculas de RNA. De igual manera, la proteína pl9 expresada de forma recombinante podría ser utilizada para separar las moléculas de siRNA de 21 nt del resto de componentes constituyentes de un extracto procedente de un cultivo celular u organismo. Esta propiedad de la proteína pl9 supone por lo tanto que ésta puede ser utilizada como una herramienta para la investigación del proceso de silenciamiento génico postraduccional, ya que con ella se pueden aislar los siRNAs que se han generado en un organismo o cultivo celular que ha estado sometido a unas determinadas condiciones experimentales. De esta forma se pueden comparar los genes que se silencian como consecuencia de la aplicación de determinadas condiciones a un cultivo celular o a un organismo en estudio. Además, la abundancia de algunos siRNAs es demasiado baja, de manera que son muy difíciles de detectar utilizando las herramientas disponibles actualmente. La proteína pl9
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) constituye un instrumento de gran utilidad para solucionar los problemas derivados de la baja abundancia de algunos siRNAs, ya que éstos se unen específicamente a ella, y esto hace posible su enriquecimiento y/o purificación. La proteína pl9 se puede utilizar, por lo tanto, como una sonda de afinidad en la que quedan retenidos los siRNAs de 21 nt, ampliando las posibilidades de éxito en la detección y el estudio de esos pequeños RNAs5 a partir de los cuales se podrían definir multitud de rutas de señalización celular cuyo conocimiento no es aun completo.
Esta propiedad de proteína del tipo de pl9 se puede aprovechar por un lado para obtener los RNAs cortos in vitro, usando extractos celulares mezclados con la proteína secuestradora purificada que puede inmovilizarse específicamente por medio de columnas de afinidad con anticuerpos específicos, entrecruzamiento químico covalente con el soporte o por medio de una fusión traduccional a un etiquetado de afinidad, por ejemplo una cadena de polihistidinas, la glutation-S-transferasa, el dominio de unión a maltosa (MBP, obtenibles de la empresa New England Biolabs), a colina (C-LYTAG de la empresa Biomedal), al de unión a quitina o a celulosa (CBD, de la empresa Novagen), etc. Los RNAs se unirían a la proteína pl9 fusionada esta o no a otra proteína con un dominio polipeptídico que le permitiera purificarse en un solo paso por cromatografía de afinidad. Los RNAs se podrían separar posteriormente una vez purificados los complejos proteína dsRNA, usando condiciones que desnaturalizaran la proteína específicamente (no el RNA)5 como temperatura, compuestos caotrópicos, pH, etc. Por otro lado, los complejos proteína-RNA podrían purificarse in vivo si usando la fusión de la proteína, fusionada o no al dominio de purificación, puede ingeniar la forma de expresarla dentro de las células eucarióticas. Si se construyen vectores de DNA codificando dichas secuencias y se transforman o transfectan las células, mediante los sistemas habituales que un experto en la materia suele conocer, se puede conseguir la expresión estable o transitoria de la fusión proteica con promotores específicos. Si en las células hay RNAs cortos de 21nts se unirán a la proteína. Las células pueden romperse posteriormente en condiciones que no alteren a la unión proteína- RNA y se pueden aislar por cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación con anticuerpos específicos o cualquier otra técnica que consiga unir específicamente la unión a la proteína supresora (figura 1). Otra utilidad de la proteína pl9 y otros supresores del PTGS, es la de suprimir condicionalmente en determinadas células el PTGS. Si expresamos condicionalmente la proteína supresora usando su secuencia de DNA codificante con promotores controlados en el espacio y en el tiempo, podemos seleccionar células o tejidos donde se suprima el PTGS. Esta técnica puede servir de herramienta de estudio para ver el papel de determinados genes silenciados en un organismo o bien incluso en biotecnología si ese proceso tiene utilidad terapéutica o favorece la propiedades
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de un organismo manipulado genéticamente (animales o plantas). Entre los promotores que pueden usarse son: promotores inducidos durante el desarrollo, promotores inducidos por sustancias químicas como IPTG (operador Lac/represor Lacl) o tetraciclina (derivados del regulador TetR), por temperatura, o por cualquier cambio medioambiental (estrés osmótico, luz, etc) (figura 2).
Puesto que los siRNAs también se han sugerido como posibles herramientas terapéuticas para reprogramar la expresión de genes en células enfermas, la propiedad de unir siRNAs puede aprovecharse para que la proteína supresora se una a otras moléculas que tengan afinidad por dichas células patógenas y que puedan internarse en el citoplasma. Esto se podría hacer fusionando la protema supresora a señales de unión a receptores celulares específicos, tales como CCR5 (Pierson TC, Doms RW. (2003) HIV-I entry and its inhibition. Curr Top Microbiol. ImmunoL 281, 1-27) o bien con secuencias de traslocación de proteínas a través de membranas plasmáticas. Otras señales de degradación por proteasas intracelulares fusionadas a la proteína supresora la degradarían específicamente, preferentemente secuencias PEST (Rechsteiner M, Rogers SW (1996) PEST sequences and regulation by proteolisis. Trenas Biochem ScL 21, 267- 71) o señales de ubiquitinación (Ciechanover A, Schwartz AL. (1994) The ubiquitin-mediated proteolytic pathway: mechanisms of recognition of the proteolytic substrate and involvement in the degradation of native cellular proteins. FASEB J, 8, 182-191). De esta forma liberarían el RNA unido que realizaría su acción biológica.
EJEMPLO 1:
Este ejemplo muestra como se puede purificar la proteína supresora de PTGS pl9. El cDNA de la proteína pl9 de Carnation ϊtalian ringspot viras (CIRV) es amplificado por PCR utilizando un oligonucleótido homólogo a los primeros 22 nucleótidos de la secuencia y otro complementario a los 21 nucleótidos últimos de la región codificante, partiendo de un plásmido que contiene el cDNA completo de CIRV (Burgyán, J. et al. (1996). The 5 '-terminal región of a tombusvirus genome determines the origin of multivesicular bodies. J Gen Virol 11, 1967-1974). El fragmento amplificado es clonado en el plásmido de expresión pGEX-2T. La proteína de fusión con GST se expresa en la cepa de E.coli BL21(DE3) a 220C durante 20 horas. Las células se resuspenden en tampón PBS (137 raM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na2HPO4JH2O, 1.4 mM KH2PO4, 1 mM TCEP, pH 8.0) y se lisan mediante sonicación en un baño de hielo seco/etanol. La proteína de fusión se purifica partir de la fracción soluble mediante la incubación con glutatión-agarosa durante 15 minutos a 40C. La resina se lava con PBS, a continuación con PBS suplementado con 0.5 M de NaCl, con tampón de rotura (20 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 1 mM
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) TCEP, pH 7.4), y finalmente con tampón de rotura suplementado con 2.5 mM CaCl2. La resina se traslada a un tubo de microcentríruga donde se ha añadido previamente 1 U de trombina por cada mi de resina. La reacción de rotura se realiza durante toda la noche a 40C. A continuación la resina se coloca en una columna de 10 mi y la proteína pl9 se recoge mediante 3 lavados con tampón de rotura. La proteína recombinante obtenida constituye una herramienta extremadamente útil para capturar los siRNAs que son producidos durante el proceso del silenciamiento génico postrascripcional, ya que se une específicamente a ellos.
EJEMPLO 2 En el presente ejemplo se describe como puede usarse la secuencia de pl9 para unir específicamente RNAs cortos de doble cadena. Para examinar las características de los siRNAs que son importantes para su reconocimiento por pl9, se puede determinar la afinidad de pl9 por siRNA y su especificidad por cada una de las características del siRNA utilizando ensayos de movilidad electroforética ("mobility shiñ assays") y medidas de la constante de disociación. Los oligonucleótidos de RNA se marcan en cantidades de 50 pmol utilizando 0.3 μM[γ-32P] y 20 U de T4 polinucleótido quinasa. La reacción se realiza en 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 y 5 mM DTT a 370C durante 30 minutos. La quinasa posteriormente se inactiva a 7O0C durante 20 minutos. A la reacción se añade un oligonucleótido sintético fosforilado en 5 ', y los oligos se tratan a 9O0C durante 1 min seguido de un enfriamiento lento del orden de I0C cada 3 minutos. Los dúplex de siRNA se purifican por electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) utilizando geles del 20% en TBE (Tris-borato etilendiaminotriacético). Los siRNA marcados se visualizan en una película, son cortados del gel, y eluidos toda la noche en una disolución conteniendo 0.5 M de acetato sódico, 1 mM EDTA (pH 6.0). El RNA se precipita usando 70% etanol, y se resuspende en tampón Tris-EDTA. Las proteínas se diluyen en un tampón 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM TCEP y 0.02%(p/v) Tween-20. Para los experimentos de unión directa, CIRV pl9 se puede probar frente a menos de 2.5 pM de siRNA marcado en 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 mM TCEP, 100 mM NaCl y 0.02% Tween-20. Para los ensayos de competición, los oligonucleótidos sintéticos y fosforilados en 5 ' se hibridan de igual manera que en el procedimiento de marcado para formar el RNA competidor. Los siRNAs competidores se prueban frente a menos de 2.5 pM de siRNA de 21 nt marcados, conteniendo 2 nt en el extremo 3 ' y 0.7 nM CIRV pl9 en 20 mM Tris-HCl (pH 7.0), 1 mM EDTA, 1 mM TCEP, 100 mM NaCl y 0.02% Tween-20. Las reacciones de unión se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos-1 hora, y se ajustan al 7.5%(p/v) Ficoll 400. Una parte de la reacción se analiza por electroforesis a 100 V durante 45 minutos y usando un gel del 6% en TBE 0.5X. Los geles se
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) secan, y se exponen durante 1-5 días. Las bandas correspondientes a los oligonucleótidos marcados libres y unidos se cuantifican. Partiendo de estas medidas se realizan cálculos de la constante de disociación aparente (Kd) para la unión de los oligonucleótidos a la proteína CIRV p 19. Los resultados obtenidos (ver Tabla 1) muestran la gran afinidad de esta proteína por siRNA de 21 nt (dúplex de 19-mer con grupos fosfato en el extremo 5' y 2 nt en el extremo protuberante 3 '): 0.17+0.02 nM.
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Tabla 1: Unión de la proteína pl9 de CIRV a ssrRNA, dsRNA y siRNA. Kd es la mayor constante de disociación medida directamente de los ensayos de movilidad electroforética y no está corregida según el porcentaje de proteína activa. Krel es la afinidad de la proteína CIRV pl9 por siRNA, relativa a la afinidad por oligonucleótidos de 21-mer con grupos fosfato en 5' y extremos protuberantes de 3 nt en el extremo 3', medida por ensayos de competición y movilidad electroforética.
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) EJEMPLO 3:
El siguiente ejemplo muestra como la unión de la proteína supresora y los siRNAs de 21 nt puede ser modificada usando imitantes de la proteína. Se realizan mutaciones en la proteína pl9 y se puede demostrar que éstas interfieren con la supresión del silenciamiento del RNA. Los motantes de la proteína pl9 son generados mediante mutagénesis dirigida. Se realizan reacciones de PCR amplificando la región codificante de la proteína pl9 (entre los nucleótidos 3872 y 4390) del cDNA de CIRV (Burgyán, J. et al. (1996). The 5 '-terminal región of a tombusvirus genome determines the origin of multivesicular bodies. J Gen Virol 11, 1967-1974) y utilizando oligonucleótidos apropiados en cada caso, para generar mutaciones puntuales. Se infiltran plantas de Nicotiana benthamiana con Agrobacterium tumefaciens portadoras de una construcción génica que expresa 35S-GFP o co-infiltradas con A. tumefaciens portadoras de 35S- GFP y otras A tumefaciens expresando la proteína muíante de pl9 de interés, (ver figura 3). La infiltración en las hojas de JV. benthamiana salvaje con una cepa de A. tumefaciens portando 35S- GFP da lugar a una expresión transitoria pero además produce la inducción del silenciamiento del RNA de GFP (Johansen y Carrington, 2001; Silhavy et al, 2002). El silenciamiento del RNA, manifestado en la reducción de la fluorescencia por GFP, resulta en la disminución de los niveles de mRNA de GFP y la acumulación de siRNAs específicos de GFP en los lugares de la infiltración. La coexpresión de GFP y CIRV pl9 salvaje por agroinfϊltración suprime el silenciamiento del RNA de GFP y resulta en una fluorescencia intensa de la GFP, altos niveles de mRNA de GFP, y ausencia de la acumulación de siRNA de GFP. Los niveles de supresión del silenciamiento de GFP en los ensayos de agroinfiltración están correlacionados con la severidad de los síntomas causados por el virus mutado. Las proteínas imitantes de pl9 se expresan a niveles similares que la salvaje, sin embargo, los siRNAs derivados de GFP se acumulan a altos niveles mientras que los niveles de mRNA de GFP resultan ser significativamente menores que en la infiltración control con la proteína pl9 salvaje. Estos resultados sugieren que las diferencias observadas en los síntomas virales o en los diferentes niveles de supresión del silenciamiento de GFP son la consecuencia de la actividad supresora alterada de los imitantes CIRV pl9.
EJEMPLO 4 En este ejemplo se muestra como se puede aislar específicamente siRNAs de 21 nucleótidos mediante el uso de la proteína pl9 fusionada a una etiqueta polipeptídica para su copurificación. Se aisla el fragmento del gen codificante de la proteína pl9 mediante PCR usando cebadores específicos que tengan en sus extremos las dianas de restricción BamHl y HmdlII. Se digiere el fragmento con dichos enzimas y se aisla. Por otro lado, se digiere el plásmido pALEXb
Il
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) (Biomedal S.L., España), que contiene el sistema de expresión en cascada dirigiendo la expresión de la etiqueta C-LYTAG que se une a análogos de colina (Ortega, S., García, J.L., Zazo, M., Várela, J., Muñoz- Willery, L, Cuevas, P. y Giménez-Gallego, G. (1992) Bio/Technology 1O5 795-798), con las mismas enzimas de restricción. Ambos fragmentos de DNA se ligan para dar lugar a un plásmido con el fragmento de pl9 fusionado a la secuencia de C-LYTAG bajo el control del promotor Pm. Con este plásmido se transforma la cepa E. coli CC1184S2 (Cebolla, A., Sousa, C. and V. de Lorenzo. (2001) Rational design of a bacterial transcriptional cascade for amplifying gene expression capacity. Nucleic Acids Res. 29: 759-766) que tiene el módulo regulador que activa a Pm. Los cultivos se crecen en LB en presencia de ampicilina 100 mg/1 para asegurar la permanencia del plásmido y se inducen cuando alcanza una densidad óptica de 0.6 a 0.8 con salicilato 2 mM durante 4-6 horas a 3O0C. Las células inducidas se rompen por sonicación y se purifica la proteína de fusión de los extractos por una columna de DEAE celulosa, y usando cloruro de colina 150 mM como eluyente.
Extractos de líneas transgénicas de Nicotiana benthamiana que expresan GFP y en el cual se ha inducido el PTGS por infiltración con A. tumefaciens portadoras de una construcción génica que expresa 35S-GFP. La infiltración en las hojas de N. benthamiana salvaje con una cepa de A. tumefaciens portando 35S-GFP da lugar a una expresión transitoria pero además produce la inducción del silenciamiento del RNA de GFP. Se toman células de las hojas infiltradas y se obtienen extractos. Estos extractos se mezclan con la proteína purificada C-LYTAG-pl9 (0.5 mg) y se pasan por entre 1 y 5 mi de una columna de C-LYTRAP (Biomedal S. L., España). Se lava la columna con solución salina (NaCl 1.5 M) utilizando al menos 10 veces el volumen de extracto añadido. Se eluye la fusión proteica con 1 mi de cloruro de colina 150 mM. La proteína eluida tiene unido el RNA doble cadena de 21 nucleótidos. Estas moléculas se pueden separar por desnaturalización parcial mediante calor (65-7O0C) o con detergentes durante 15-20 minutos. Posteriormente el siRNA unido se puede concentrar por precipitación con 2.5 volúmenes de etanol. También se puede purificar el siRNA usando un gel de poliacrilamida del 6 al 12% y eluyendo la banda correspondiente al siRNA.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Esquema representativo que muestra el proceso de purificación de un complejo RNA- proteína pl9, utilizando una proteína de fusión formada por la proteína pl9 y el dominio de afinidad C-LYTAG. La proteína de fusión es añadida a un extracto celular, o bien introducida o expresada en el interior de las células. La proteína de fusión se une a los RNA de 21 nucleótidos del extracto específicamente. A continuación, el extracto es pasado a través de una columna de
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) DEAE celulosa, uniéndose específicamente a la columna el dominio C-LYTAG que está fusionado a la proteina pl9. La elución usando el ligando de afinidad de la columna (colina) en exceso da lugar a la purificación de la proteína de fusión C-LYTAG pl9 unida a los RNAs de 21 nucleótidos. Figura 2: Esquema representativo de la supresión del proceso de silenciamiento génico posttranscripcional por la proteína pl9. La proteína pl9 puede introducirse en la célula mediante técnicas de transfección o bien expresarse condicionalmente usando su secuencia de DNA codificante unida a promotores controlados. La proteína pl9 se une específicamente a los RNAs de 21 nucleótidos, suprimiendo el silenciamiento de aquellos genes que se encuentran sometidos a dicho proceso.
Figura 3: Efectos producidos por la mutación de la proteína CIRV pl9 en el silenciamiento del RNA. (A) Hojas de N. benthamiana salvaje infiltradas con 35S-GFP o coinfiltradas con 35S- GFP y la proteína 35 S-CIRV pl9 salvaje o muíante. El silenciamiento de la proteina GFP da lugar a fluorescencia roja (autofluorescencia de la clorofila), que aparece en la fotografía en color gris oscuro. La supresión del silenciamiento resulta en la aparición de fluorescencia verde, que se observa en la fotografía como un color gris más claro. Las fotografías fueron tomadas 6 días después de la inoculación a partir de hojas luminadas con luz UV. (B) Western Blot de la proteína pl9 total (panel de arriba) y análisis del RNA de 21 nt específico de GFP (panel de en medio) y del mRNA total de GFP (panel de abajo). La extracción de las proteínas y del RNA se realizó 6 días después de la inoculación.
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
L- Procedimiento para unir específicamente RNAs cortos de doble cadena por afinidad a una proteína caracterizado porque: a. El RNA al que tiene más afinidad la proteína es menor de 26 nucleótidos de longitud y mayor de 19. b. Porque el RNA corto doble cadena puede causar silenciamiento postraduccional de genes que tengan similar secuencia nucleotídica. c. Porque expresada dicha proteína en una célula puede suprimir el silenciamiento posttraduccional originado por los RNAs existentes de dicho tamaño en dicha célula.
2.- Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la proteína supresora tiene afinidad preferente por RNAs doble cadena de entre 19 y 25 nucleótidos de largo.
3.- Procedimiento según la reivindicación 2 caracterizado porque la proteína supresora tiene afinidad preferente por RNAs doble cadena de 19 a 25 nucleótidos de largo y que contienen grupos fosfato en el extremo 5' y pueden tener un extremo 3' protuberante de 2 nucleótidos, siendo la afinidad definida por una constante de disociación inferior a 5 nM.
4.- Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la proteína supresora contiene la secuencia de la proteína pl9 del tombusvirus.
5.- Proteínas de fusión o imitantes de la secuencia de la reivindicación 4 usadas para el procedimiento de la reivindicación 1.
6.- Procedimiento de aislamiento de RNAs de las características de las reivindicaciones 1 a 3 usando una proteína supresora de la reivindicación 1, 4 o 5.
7.- Procedimiento de supresión específica de silenciamiento de genes provocados por RNAs descritos en las reivindicaciones 1, 2 y 3 caracterizado- porque la proteína supresora se expresa condicionalmente porque su secuencia de DNA está controlada bajo promotores inducibles.
8.- Procedimientos de purificación de fusiones génicas de la proteína supresora a etiquetas para su purificación por cromatografía de afinidad una vez expresadas en las células donde existen los
RNAs cortos que se quieren aislar.
9.- Procedimiento de supresión específica de silenciamiento de genes provocados por RNAs descritos en las reivindicaciones 1, 2 y 3 caracterizado porque la proteína supresora purificada íntegra o fusionada a una etiqueta de purificación se transfecta directamente en células eucarióticas.
10.- Procedimiento de copurificación de los RNAs cortos de las reivindicaciones 2 y 3 con fusiones de la proteína supresora con etiquetas de purificación por cromatografía de afinidad
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HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) caracterizado porque se realiza la purificación desde extractos de células donde están presentes los RNAs cortos que se pueden copurificar añadiendo la proteína purificada.
11.- Procedimiento de copurificación de los RNAs cortos según la reivindicación 10 caracterizado porque la proteína copurificada con dichos RNAs está expresada en la misma célula que contiene dichos RNAs.
12.- Uso del procedimiento según reivindicaciones 1, 2, 3 o 4, a la supresión específica del silenciamiento posttraduccional de genes silenciados por RNAs cortos doble cadena de entre 19 y 25 nucleótidos; o a la separación específica de dichos RNAs; o al enriquecimiento de dichos RNAs en preparaciones realizadas desde extractos celulares.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009058814A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for detection and enrichment of target small rnas
CN105603104A (zh) * 2016-03-16 2016-05-25 福州大学 一种检测血清中循环microRNA的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LI W ET AL: "Viral supressors of RNA silencing", BIOTECHNOL, vol. 12, 2001, pages 150 - 154 *
QIU W ET AL: "Tombusvirus p19-mediated supression of virus.induced gene silencing is controlled by genetic and dpsage features that influence pathogenicity", MOL PLANT MICROBE INTERACT, vol. 15, 2002, pages 269 - 280 *
QU F ET AL: "Effiction of nicotiana benthamiana by tomato bushy stunt virus", MOL PLANT MICROBE INTERACT, vol. 15, 2002, pages 193 - 202 *
SILHAVY D ET AL: "A viral protein supresses RNA silencing and binds silencing-generated 21 to 25 nucleotide double stranded rna's", EMBO, vol. 21, 2002, pages 3070 - 3080 *
VARGASON J M ET AL: "Size selective recognition of sirna by rna silencing supressor", CELL, vol. 115, 2003, pages 799 - 811, XP002510808, DOI: doi:10.1016/S0092-8674(03)00984-X *
VOINNET O ET AL: "Supression of gene silencing: a general strategy used by diverse DNA and RNA viruses of plants", PNAS, vol. 96, 1999, pages 14147 - 14152, XP002174430, DOI: doi:10.1073/pnas.96.24.14147 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009058814A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for detection and enrichment of target small rnas
US8753809B2 (en) 2007-10-29 2014-06-17 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for detection and enrichment of target small RNAs
CN105603104A (zh) * 2016-03-16 2016-05-25 福州大学 一种检测血清中循环microRNA的方法

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