WO2006030872A1 - Method and apparatus for measuring mutation ratio - Google Patents

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WO2006030872A1
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Abstract

[PROBLEMS] To provide a method and an apparatus for measuring a mutation ratio whereby a mutation ratio of a gene can be measured at a high sensitivity even in the case where the base sequence of a probe fitting for a normal gene only slightly differs from the base sequence of a probe fitting for an abnormal gene. [MEANS FOR SOLVING PROBLEMS] In amplifying a specific base sequence part in a target DNA sample by the PCR method, the amplification is carried out in the state of using a probe fitting for a normal gene together with a probe fitting for an abnormal gene for a single DNA sample.

Description

明 細 書  Specification
突然変異率計測方法及び装置  Mutation rate measuring method and apparatus
技術分野  Technical field
[0001] この発明は、突然変異率計測方法及び装置に係り、特に、正常遺伝子適合型プロ ーブと異常遺伝子適合型プローブとを使用して、遺伝子の突然変異率を高感度に 計測する突然変異率計測方法及び装置に関する。  [0001] The present invention relates to a mutation rate measuring method and apparatus, and more particularly, to suddenly measure the mutation rate of a gene with high sensitivity using a normal gene compatible probe and an abnormal gene compatible probe. The present invention relates to a mutation rate measuring method and apparatus.
背景技術  Background art
[0002] 遺伝子鎖の特定長さ領域のみを選択的に複製増殖させる方法としては、 PCR法が 従来より知られている（例えば、特許文献 1参照)。この PCR法 (以下、「基本 PCR法」 と称する）は、二種類のプライマ（以下、「フォワードプライマ」、「リバースプライマ」と称 する）を使用して、選択的に複製増殖させたい遺伝子鎖領域を限定する。フォワード プライマは、選択的に複製増殖させたい遺伝子鎖領域の第 1の端部所定長さの塩基 配列のみに適合する塩基配列を有する。同様に、リバースプライマは、複製増殖させ たい遺伝子鎖領域の第 2の端部所定長さの塩基配列のみに適合する塩基配列を有 する。この PCR法にあっては、遺伝子を構成する二重鎖は対をなす 2つの単鎖に解 離され、しかるのち、各単鎖のそれぞれにフォワード及びリバースプライマが作用する ことにより、新たに対となる単鎖が再生されて、元の二重鎖が 2個生成される。これを 1 サイクルとして、以上の処理を繰り返すことにより、遺伝子鎖の特定長さ領域のみを選 択的に複製増殖 (2個、 4個、 8個、 16個 · · させることができる。  [0002] As a method for selectively replicating and propagating only a specific length region of a gene chain, a PCR method has been conventionally known (see, for example, Patent Document 1). This PCR method (hereinafter referred to as “basic PCR method”) uses two types of primers (hereinafter referred to as “forward primer” and “reverse primer”) to select gene chains to be selectively replicated. Limit the area. The forward primer has a base sequence that matches only the base sequence of a predetermined length at the first end of the gene chain region to be selectively replicated. Similarly, the reverse primer has a base sequence that matches only the base sequence of a predetermined length at the second end of the gene chain region to be replicated and propagated. In this PCR method, the double strands constituting a gene are separated into two single strands that make a pair, and then a new pair is created by the forward and reverse primers acting on each single strand. Is regenerated to produce two original double strands. By repeating this process as one cycle, only a specific length region of the gene chain can be selectively replicated (2, 4, 8, or 16).
[0003] PCR法における領域限定能力を高めたものとしては、タックマン (TaqMan) PCR法 が知られている。このタックマン PCR法にあっては、上述のフォワードプライマ及びリ バースプライマに加えて、選択的に複製増殖させたい遺伝子鎖領域の中間部所定 長さの塩基配列のみに適合する塩基配列を有するプローブ (以下、タックマンプロ一 ブと称する）が使用される。このタックマンプローブには識別子として、蛍光色素が含 まれる。フォワードプライマ、リバースプライマ、及びタックマンプローブの三者がすべ て適合した塩基列の場合に限り、タックマンプローブは遺伝子単鎖の再生に寄与す ると共に、そのときに限り蛍光色素はその遺伝子に残存される。この蛍光色素を頼りと して、目的とする遺伝子鎖領域の存在を検出することができる。このタックマン PCR法 によれば、フォワードプライマ、リバースプライマ、及びタックマンプローブからなる 3個 の識別子を使用して領域限定を行うため、領域限定能力が向上する。 [0003] The TaqMan PCR method is known as an enhanced region-limiting ability in the PCR method. In this Tackman PCR method, in addition to the above-mentioned forward primer and reverse primer, a probe having a base sequence that matches only the base sequence of a predetermined length in the middle part of the gene chain region to be selectively replicated and proliferated ( Hereinafter, it is referred to as a Tuckman probe). This Taqman probe includes a fluorescent dye as an identifier. Only in the case of a base sequence in which all three of the forward primer, reverse primer, and Taqman probe are compatible, the Taqman probe contributes to the regeneration of the gene single chain, and only when that happens, the fluorescent dye remains in the gene. The Relying on this fluorescent dye Thus, the presence of the target gene chain region can be detected. According to this Taqman PCR method, the region limiting capability is improved because the region limiting is performed using the three identifiers consisting of the forward primer, the reverse primer, and the Taqman probe.
[0004] ところで、従来の遺伝子の突然変異率計測方法としては、上述の基本 PCR法を利 用したものが知られている (非特許文献 1参照)。この突然変異率計測方法にあって も、フォワードプライマとリバースプライマとからなる 2種類のプライマが使用される。た だし、フォワードプライマとリバースプライマとのうちのいずれか一方は、塩基配列が 僅か〖こ異なる 2種類のプライマ（以下、正常 (Wild)適合型プライマ、異常 (Mutation) 適合型プライマと称する）とされる。遺伝子の点変異 (Point Mutation)を検出しようと する場合、正常適合型プライマと異常適合型プライマとは、塩基を 20個程度連ねて なる塩基列の中で特定番目の 1個の塩基のみが異なる関係にある。この特定番目の 塩基の相異が、突然変異を起こした異常遺伝子と突然変異を起こして!/、な!、正常遺 伝子との選別に寄与する。  [0004] Incidentally, as a conventional method for measuring the mutation rate of a gene, a method using the above-mentioned basic PCR method is known (see Non-Patent Document 1). Even in this mutation rate measurement method, two types of primers consisting of a forward primer and a reverse primer are used. However, either one of the forward primer and the reverse primer is two types of primers (hereinafter referred to as a normal compatible primer and an abnormal compatible primer) that are slightly different in nucleotide sequence. Is done. When trying to detect a point mutation of a gene, a normal matching primer and an abnormal matching primer differ only in a specific base in a base sequence consisting of about 20 bases. There is a relationship. This particular base difference contributes to the selection of normal genes by mutating abnormal genes that have been mutated!
[0005] この基本 PCR法を利用した突然変異率計測方法にあっては、計測対象となる遺伝 子試料は、同一成分を有する二つの試料 (以下、「正常遺伝子計測用」、「異常遺伝 子計測用」と称する）に分けられる。それらの試料のそれぞれには、フォワードプライ マとリバースプライマとが適用される。ただし、正常遺伝子計測用の試料の場合、フォ ワードプライマとリバースプライマとのうちで、いずれか一方（例えば、フォワードプライ マ）は正常遺伝子適合型プライマとされる。これに対して、異常遺伝子計測用の試料 の場合、フォワードプライマとリバースプライマとのうちで、いずれか一方（例えば、フ ォワードプライマ）は異常遺伝子適合型プライマとされる。これにより、正常遺伝子計 測用の試料においては、正常な塩基配列を有する塩基列のみが選択的に複製増殖 されるのに対して、異常遺伝子計測用の試料においては、突然変異による塩基配列 を有する塩基列のみが選択的に複製増殖されるから、それらの別々に複製増殖され た塩基列の量の比に基づ!/、て、元の試料中における遺伝子の突然変異率 (Mutatio n Rate)を同定することができる。  [0005] In this mutation rate measurement method using the basic PCR method, the gene samples to be measured are two samples having the same component (hereinafter referred to as “normal gene measurement”, “abnormal gene”). Called “for measurement”). A forward primer and a reverse primer are applied to each of these samples. However, in the case of a normal gene measurement sample, either the forward primer or the reverse primer (for example, the forward primer) is a normal gene compatible primer. On the other hand, in the case of a sample for measuring an abnormal gene, either a forward primer or a reverse primer (for example, a forward primer) is an abnormal gene-matching primer. As a result, in the normal gene measurement sample, only the base sequence having the normal base sequence is selectively replicated and proliferated, whereas in the abnormal gene measurement sample, the base sequence due to mutation is changed. Since only the base sequences that are possessed are selectively replicated, the mutation rate of the gene in the original sample (Mutatio n Rate) is based on the ratio of the amount of the base sequences that are replicated separately. ) Can be identified.
特許文献 1： W096Z17932国際公開パンフレット  Patent Document 1: W096Z17932 International Publication Pamphlet
非特許文献 1 : AMERICAN JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY 1997;124;217-221 発明の開示 Non-Patent Document 1: AMERICAN JOURNAL OF OPHTHALMOLOGY 1997; 124; 217-221 Disclosure of the invention
発明が解決しょうとする課題  Problems to be solved by the invention
[0006] しかしながら、基本 PCR法を利用した従来の突然変異率計測方法にあっては、正 常遺伝子適合型プライマと異常遺伝子適合型プライマとの塩基配列上の相異は僅 力 1塩基程度に過ぎないことから、塩基列選別性能は必ずしも充分なものとは言い難 ぐそのため正常遺伝子計測用の試料においては、正常な塩基配列を有する塩基 列のみならず、突然変異による塩基配列を有する塩基列までもが僅かに複製増殖さ れてしまったり、あるいは、異常遺伝子計測用の試料においても、突然変異による塩 基配列を有する塩基列のみならず、正常な塩基配列を有する塩基列までもが僅かに 複製増殖されたりして、計測可能な突然変異率 (Mutation Rate)の下限は精々 10% 程度にしかならないと言う不具合があった。  [0006] However, in the conventional mutation rate measurement method using the basic PCR method, the difference in the base sequence between the normal gene-matching primer and the abnormal gene-matching primer is as little as 1 base. Therefore, it is difficult to say that the base sequence selection performance is sufficient. Therefore, in normal gene measurement samples, not only base sequences with normal base sequences but also base sequences with mutation base sequences. In the sample for abnormal gene measurement, not only the base sequence having the base sequence due to the mutation but also the base sequence having the normal base sequence is slight. In other words, the lower limit of the measurable mutation rate was only about 10%.
[0007] この種の突然変異率計測方法は、遺伝子の突然変異に基づく病気や老化等の早 期発見への応用が期待されるものである力 そのためには、好ましくは 1. 0%程度の 突然変異率 (Mutation Rate)が生じた段階での検出が要求されるため、上述の遺伝 子検出方法にては充分なる実用には供し得ないと言う問題点がある。  [0007] This type of mutation rate measurement method is expected to be applied to early detection of diseases and aging based on gene mutations. Since detection at the stage where the mutation rate has occurred is required, there is a problem that the gene detection method described above cannot be put to practical use.
[0008] この発明は、上述の問題点に着目してなされたものであり、その目的とするところは 、正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブとの塩基配列上の相異 が僅かなものであっても、遺伝子の突然変異率を高感度に計測することが可能な突 然変異率計測方法及び装置を提供することにある。  [0008] The present invention has been made by paying attention to the above-mentioned problems, and the object of the present invention is to have a slight difference in base sequence between a normal gene-matching probe and an abnormal gene-matching probe. It is an object of the present invention to provide a method and apparatus for sudden mutation rate measurement that can measure the mutation rate of a gene with high sensitivity.
[0009] また、この発明の他の目的とするところは、計測結果がばらつくことなく再現性に優 れた突然変異計測方法及び装置を提供することにある。  Another object of the present invention is to provide a mutation measurement method and apparatus excellent in reproducibility without variation in measurement results.
[0010] この発明の更に他の目的並びに作用効果については、本願明細書の以下の記載 により当業者であれば容易に理解されるであろう。  [0010] Still other objects and operational effects of the present invention will be easily understood by those skilled in the art from the following description of the present specification.
課題を解決するための手段  Means for solving the problem
[0011] 上記の目的を達成するために、本発明の突然変異率計測方法は、検査対象となる DNA試料中の特定塩基配列部分を、正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適 合型プローブとを使用して複製増殖させる第 1のステップと、複製増殖後における正 常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分を定量化する第 2のステップと、定量 化された正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分に基づいて当初の DNA 試料中における特定遺伝子に関する突然変異率を同定する第 3のステップと、を有 する突然変異率計測方法であって、第 1のステップにおける複製増殖は、同一の DN A試料に対して、正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブとの双方 を混入した状態にて行われる、ことを特徴とする。 [0011] In order to achieve the above object, the mutation rate measuring method of the present invention comprises a specific base sequence portion in a DNA sample to be examined, a normal gene-compatible probe and an abnormal gene-compatible probe. A first step to replicate and propagate, a second step to quantify normal and Z or abnormal gene components after replication and quantification A third step of identifying a mutation rate for a specific gene in the original DNA sample based on the normalized normal gene component and the Z or abnormal gene component, comprising: The replication growth in this step is characterized in that the same DNA sample is carried out in a state where both a normal gene compatible probe and an abnormal gene compatible probe are mixed.
[0012] なお、「正常遺伝子適合型プローブ」又は「異常遺伝子適合型プローブ」に言う「正 常遺伝子」又は「異常遺伝子」とは、必ずしも、それが特定の疾病に繋がる遺伝子か 否かを基準として定義されるものではない。すなわち、ここで言う「正常遺伝子」と「異 常遺伝子」とは、「基準となる遺伝子」と「それと僅かに塩基配列の異なる他の遺伝子 」と言い換えることもできる。ここで、「それと僅かに塩基配列の異なる」には、（1)基準 となる遺伝子の特定塩基が他の塩基と置換されて!ヽる場合、 (2)基準となる遺伝子 の特定塩基が欠落している場合、（3)基準となる遺伝子の特定塩基間に他の塩基が 余分に付加されている場合、が含まれる。  [0012] Note that "normal gene" or "abnormal gene" referred to as "normal gene compatible probe" or "abnormal gene compatible probe" does not necessarily refer to whether or not it is a gene that leads to a specific disease. Is not defined as That is, the “normal gene” and “abnormal gene” referred to here can be rephrased as “reference gene” and “other gene slightly different in nucleotide sequence”. Here, “Slightly different base sequence” includes (1) When a specific base of a reference gene is replaced with another base! (2) A specific base of a reference gene is missing (3) When other bases are added between specific bases of the reference gene.
[0013] 好ましい実施の形態においては、第 1のステップにおける特定塩基配列部分の複 製増殖は PCR法を使用して行われる。このとき、第 1のステップにおける特定塩基配 列部分の複製増殖に使用される PCR法がタックマン PCR法であり、かつ正常遺伝子 適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブとが、タックマンプローブと置換された もの（すなわち、「正常遺伝子適合型タックマンプローブ」と「異常遺伝子適合型タック マンプローブ」）であってもよい。また、第 1のステップにおける特定塩基配列部分の 複製増殖に使用される PCR法が基本 PCR法であり、かつ正常遺伝子適合型プロ一 ブと異常遺伝子適合型プローブとが、フォワードプライマ又はリバースプライマと置換 されたもの (すなわち、「正常遺伝子適合型フォワードプライマ」と「異常遺伝子適合 型フォワードプライマ」、又は「正常遺伝子適合型リバースプライマ」と「異常遺伝子適 合型リバースプライマ」）であってもよ ヽ。  [0013] In a preferred embodiment, the replication of the specific nucleotide sequence portion in the first step is performed using a PCR method. At this time, the PCR method used for replication growth of the specific nucleotide sequence in the first step is the Taqman PCR method, and the normal gene-compatible probe and the abnormal gene-compatible probe are replaced with the Taqman probe. (Ie, a “normal gene-matching tackman probe” and an “abnormal gene-matching tackman probe”). In addition, the PCR method used for the replication propagation of the specific nucleotide sequence portion in the first step is a basic PCR method, and a normal gene compatible probe and an abnormal gene compatible probe are combined with a forward primer or a reverse primer. May be replaced (ie, “normal gene compatible forward primer” and “abnormal gene compatible forward primer”, or “normal gene compatible reverse primer” and “abnormal gene compatible reverse primer”).ヽ.
[0014] 好ましい実施の形態においては、第 1のステップにて使用される正常遺伝子適合型 プローブおよび Zまたは異常遺伝子適合型プローブには固有の識別子が付与され ており、かつ第 2のステップにおける正常遺伝子成分および/または異常遺伝子成 分の定量ィ匕は識別子に基づいて行われるものであってもよい。このとき、識別子が蛍 光色素、化学発光色素、又は放射性同位元素であってもよい。識別子として蛍光色 素を使用する場合、正常遺伝子に相当する塩基配列部分と異常遺伝子に相当する 塩基配列部分とのうちで、双方の塩基配列部分を別々に定量ィヒしたいのであれば、 2種類のプローブのそれぞれに異なる蛍光色素（例えば、後述する VICと FAM)を 付加する必要があるのは当然である。しかし、そのうちの一方 (例えば、異常遺伝子 に相当する塩基配列部分)のみを定量ィ匕したいのであれば、理論的には、一方のプ ローブ (異常遺伝子適合型プローブ）のみに、蛍光色素を付加するだけでよ！ヽように も思われる。ところが、本発明者の鋭意研究によれば、正常遺伝子に相当する塩基 配列部分と異常遺伝子に相当する塩基配列部分とのうちで、いずれか一方のみを定 量化させたい場合であっても、双方のプローブに識別用の蛍光色素を付加させた方 力 再現性に優れると言う実験結果が得られている。これは、プローブが目的とする 塩基配列部分と結合する過程にお!、て、蛍光色素も結合作用に何らかの機能を果 たすためであると推定される。 [0014] In a preferred embodiment, the normal gene-matching probe and the Z or abnormal gene-matching probe used in the first step are given unique identifiers, and the normal gene in the second step is normal. Quantification of gene components and / or abnormal gene components may be performed based on the identifier. At this time, the identifier is firefly It may be a photo dye, a chemiluminescent dye, or a radioisotope. When using fluorescent dye as an identifier, if you want to quantify both of the base sequence part corresponding to the normal gene and the base sequence part corresponding to the abnormal gene separately, Naturally, it is necessary to add different fluorescent dyes (for example, VIC and FAM described later) to each of the probes. However, if you want to quantify only one of them (for example, the base sequence corresponding to the abnormal gene), theoretically, add fluorescent dye to only one probe (abnormal gene-compatible probe). Just do it! It seems like ヽ. However, according to the earnest study of the present inventor, even when it is desired to quantify only one of the base sequence portion corresponding to the normal gene and the base sequence portion corresponding to the abnormal gene, both The result of the experiment in which the reproducibility is excellent when the fluorescent dye for identification is added to this probe. This is presumed to be because the fluorescent dye also performs some function in the binding action during the process of binding of the probe to the target nucleotide sequence.
[0015] 好ましい実施の形態においては、第 3のステップにおける突然変異率の同定は、第 2のステップにて定量ィヒされた正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分に基 づいて生成された所定の特徴量と既知の突然変異率を有する複数の基準試料のそ れぞれに関して予め生成された対応する所定の特徴量とを関係付けしてなる参照テ 一ブルとの照合により行われるようにしてもよい。このとき、所定の特徴量が、サイクル 回数に対する正常遺伝子成分又は異常遺伝子成分の変化率が既定値を超えかつ その値が安定している領域における成分対サイクル回数の近似直線の傾きであって もよい。また、所定の特徴量が、サイクル回数に対する正常遺伝子成分又は異常遺 伝子成分の変化率が規定値を超えかつその値が安定している領域における成分対 サイクル回数の近似直線の切片であってもよ!/、。  [0015] In a preferred embodiment, the identification of the mutation rate in the third step is a predetermined gene generated based on the normal gene component and the Z or abnormal gene component quantified in the second step. And a reference table obtained by associating a predetermined predetermined feature value generated in advance with respect to each of a plurality of reference samples having a known mutation rate. May be. At this time, the predetermined feature amount may be the slope of the approximate line of the component vs. cycle number in a region where the change rate of the normal gene component or abnormal gene component with respect to the cycle number exceeds a predetermined value and the value is stable. Good. Further, the predetermined feature amount is an intercept of an approximate straight line of the component versus the cycle number in a region where the change rate of the normal gene component or the abnormal gene component with respect to the cycle number exceeds a specified value and the value is stable. Moyo! /
[0016] 好ま 、実施の形態にお!、ては、本発明の突然変異率計測方法は、ヒトの DNA又 はヒトのミトコンドリア DNAの突然変異率の計測に応用されるものであってもよい。  [0016] Preferably, in the embodiment, the mutation rate measurement method of the present invention may be applied to the measurement of the mutation rate of human DNA or human mitochondrial DNA. .
[0017] 別の一面力も見た本発明は、突然変異率計測装置としても実現することができる。  [0017] The present invention, which also has another aspect, can be realized as a mutation rate measuring apparatus.
この突然変異率計測装置は、それぞれ識別子として固有の蛍光色素が付与された 正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブとの双方がタックマンプロ ーブとして混入された DNA試料に対して、タックマン PCR法に相当する処理を施し て、複数サイクルに亘り、 DNA試料を複製増殖させ、同時に、各増殖サイクル毎の 少なくとも異常遺伝子適合型プローブに関する蛍光強度を計測する DNA増殖計測 器と、 DNA増殖計測器における各サイクル毎の少なくとも異常遺伝子適合型プロ一 ブに関する蛍光強度データ計測値をサンプリングするサンプリング手段と、サンプリン グされた一連の蛍光強度データ計測値を時間軸方向へと微分処理する微分処理手 段と、微分処理手段にて生成される一連の微分値データを所定のしきい値を基準と してニ値ィ匕することにより、計測信頼性の高いサイクル領域を弁別する弁別処理手 段と、弁別されたサイクル領域に存在する一連の蛍光強度データ計測値列のなす曲 線を直線近似する直線近似化手段と、直線近似化手段にて得られる近似直線の傾 きを求める傾き取得手段と、傾き取得手段にて取得された近似直線の傾きを、突然 変異率の異なる複数の基準試料のそれぞれについて予め求めておいた近似直線の 傾きと照合することにより、当該検査対象試料の突然変異率を同定する同定手段と、 を具備する。 This mutation rate measurement device uses both a normal gene-matched probe and an abnormal gene-matched probe each with a unique fluorescent dye as an identifier. The DNA sample mixed as a probe is subjected to a treatment equivalent to the Taqman PCR method, and the DNA sample is replicated and propagated over multiple cycles. At the same time, at least the fluorescence associated with the abnormal gene-compatible probe in each growth cycle DNA proliferation measuring instrument that measures intensity, sampling means for sampling fluorescence intensity data measurement values for at least abnormal gene-matched probes for each cycle in the DNA proliferation measuring instrument, and a series of sampled fluorescence intensity data measurements The measurement processing reliability is obtained by differentiating the value with respect to a predetermined threshold value with a differential processing means for differentially processing the value in the time axis direction and a series of differential value data generated by the differential processing means. A discriminating process that discriminates highly reliable cycle areas and a series of fluorescence intensity data measurement values that exist in the discriminated cycle areas The straight line approximation means for linearly approximating a line, the slope acquisition means for obtaining the slope of the approximate straight line obtained by the straight line approximation means, and the slope of the approximate straight line obtained by the slope acquisition means are suddenly different in mutation rate. Identification means for identifying the mutation rate of the sample to be examined by comparing with the slope of the approximate straight line obtained in advance for each of the plurality of reference samples.
発明の効果  The invention's effect
[0018] 本発明によれば、正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブとの塩 基配列上の相異が僅かなものであっても、高感度に遺伝子の突然変異率を計測す ることが可能となり、 DNA試料中に突然変異を有する DNAがごく微量にしか含まれ ていない場合であっても、突然変異率 (mutaion rate)の計測が可能となる。それによ り、 DNA試料としてミトコンドリア DNAを選択すれば、ミトコンドリア DNAの突然変異 と、老化やミトコンドリア病等の疾病との関連性を調べることが可能となる他、 DNA試 料としてヒトの DNAを選択することにより、ヒトの DNA中のごく少量の突然変異も発 見可能となり、癌等の病気の早期発見も可能となる。  [0018] According to the present invention, the mutation rate of a gene is measured with high sensitivity even if there is a slight difference in the base sequence between a normal gene-compatible probe and an abnormal gene-compatible probe. Therefore, even when the DNA sample contains only a very small amount of DNA having mutation, the mutation rate can be measured. As a result, if mitochondrial DNA is selected as a DNA sample, it is possible to investigate the relationship between mitochondrial DNA mutations and diseases such as aging and mitochondrial diseases, and human DNA is selected as a DNA sample. By doing so, it is possible to detect very small amounts of mutations in human DNA, and early detection of diseases such as cancer is also possible.
[0019] また、本発明の突然変異率計測方法によれば、計測結果がばらつくことなぐ再現 性に優れている。  [0019] In addition, according to the mutation rate measuring method of the present invention, the reproducibility without variation in the measurement results is excellent.
発明を実施するための最良の形態  BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
[0020] 以下に、本発明の好適な実施の一形態を添付図面を参照しながら詳細に説明する 。尚、言うまでもないが、本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載により特定さ れるものであって、以下の実施形態にのみ限定されるものではない。 [0020] Hereinafter, a preferred embodiment of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Needless to say, the technical scope of the present invention is specified by the description of the scope of claims. However, the present invention is not limited to the following embodiments.
[0021] 先に述べたように、本発明の突然変異率 (Mutation rate)計測方法は、第 1のステツ プ〜第 3のステップからなる 3つのステップを含んでいる。 [0021] As described above, the mutation rate measurement method of the present invention includes three steps including a first step to a third step.
[0022] 第 1のステップは、検査対象となる DNA試料中の特定塩基配列部分を、正常遺伝 子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブとを使用して、複製増殖させる。この とき、従前のものとの最大の相違点は、同一の DNA試料に対して、正常遺伝子適合 型プローブと異常遺伝子適合型プローブとの双方が混入される点である。複製増殖 方法としては、基本 PCR法やタックマン PCR法等を採用することができる。基本 PCR 法が採用される場合にはフォワード又はリバースプライマ力 またタックマン PCR法が 採用される場合にはタックマンプローブが、正常遺伝子適合型プローブ又は異常遺 伝子適合型プローブと置換される。 [0022] In the first step, a specific base sequence portion in a DNA sample to be examined is replicated and propagated using a normal gene compatible probe and an abnormal gene compatible probe. At this time, the biggest difference from the previous one is that both the normal gene-matching probe and the abnormal gene-matching probe are mixed into the same DNA sample. As a replication propagation method, a basic PCR method, a Taqman PCR method, or the like can be employed. When the basic PCR method is adopted, the forward or reverse primer force is used. When the Taqman PCR method is adopted, the Taqman probe is replaced with a normal gene compatible probe or an abnormal gene compatible probe.
[0023] 第 2のステップは、複製増殖後における正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝 子成分を定量化する。正常遺伝子適合型プローブおよび異常遺伝子適合型プロ一 ブに対して、固有の蛍光色を有する蛍光色素が識別子として付与されている場合に は、正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分の定量化は蛍光強度に基づ 、 て行うことができる。 [0023] The second step quantifies normal gene components and Z or abnormal gene components after replication growth. Quantification of normal gene component and Z or abnormal gene component is fluorescent when a fluorescent dye having a unique fluorescent color is assigned as an identifier to normal gene compatible probe and abnormal gene compatible probe. This can be done based on strength.
[0024] 第 3のステップは、定量化された正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分 に基づいて当初の DNA試料中における特定遺伝子に関する突然変異発生割合を 同定する。突然変異発生割合の同定は、第 2のステップにて定量化された正常遺伝 子成分および Zまたは異常遺伝子成分に基づいて生成された所定の特徴量と複数 の基準試料のそれぞれに関して予め生成された対応する所定の特徴量とを関係付 けしてなる参照テーブルとの照合により行なうことができる。このとき、所定の特徴量 力 サイクル回数に対する正常遺伝子成分又は異常遺伝子成分の変化率が規定値 を超えかつその値が安定している領域における成分対サイクル回数の近似直線の傾 きであってもよい。また、所定の特徴量が、サイクル回数に対する正常遺伝子成分又 は異常遺伝子成分の変化率が規定値を超えかつその値が安定している領域におけ る成分対サイクル回数の近似直線の切片であってもよ 、。  [0024] The third step identifies the mutation rate for a particular gene in the original DNA sample based on the quantified normal and Z or abnormal gene components. The identification of the mutation rate was previously generated for each of the predetermined feature quantity and the plurality of reference samples generated based on the normal gene component and the Z or abnormal gene component quantified in the second step. This can be done by collating with a reference table that associates the corresponding predetermined feature quantity. At this time, even if the rate of change of the normal gene component or abnormal gene component with respect to the predetermined feature quantity force cycle number exceeds the specified value and the value is stable, the inclination of the approximate line of the component versus cycle number Good. In addition, the predetermined feature amount is an intercept of an approximate straight line of the component number versus the cycle number in a region where the change rate of the normal gene component or the abnormal gene component with respect to the cycle number exceeds the specified value and the value is stable. Anyway.
[0025] 以上説明した第 1のステップ〜第 3のステップは、この実施形態においては、 DNA 自動増殖定量化装置とデータ処理用コンピュータとを含む突然変異率計測装置とし て実施される。従来装置と本発明装置とを比較して示す概念図が図 1に示されている [0025] The first to third steps described above are DNA in this embodiment. It is implemented as a mutation rate measuring device including an automatic growth quantification device and a data processing computer. A conceptual diagram showing a comparison between the conventional apparatus and the present invention apparatus is shown in FIG.
[0026] 図 1 (a)に示す従来装置の場合、検査対象となる DNA試料は反応液 (DNAポリメ ラーゼと dNTP (デォキシリボヌクレオチド）とが含まれて 、る）が入った 2個の容器 la , lbに分けて収容され、一方の容器 la内の DNA試料中には異常遺伝子適合型プ ローブ（PR1)が例えば基本 PCR法のフォワードプライマ（又は、リバースプライマ）の 代わりに添加されるのに対して、他方の容器 lb内の DNA試料中には正常遺伝子適 合型プローブ（PR2)が例えば基本 PCR法のフォワードプライマ（又は、リバースプラ イマ）の代わりに添加される。正常遺伝子適合型プローブ及び異常遺伝子適合型プ ローブにはそれぞれ固有の蛍光色を有する蛍光色素 (VIC)が識別子として付加さ れている。 [0026] In the case of the conventional apparatus shown in Fig. 1 (a), the DNA samples to be tested are two samples containing the reaction solution (containing DNA polymerase and dNTP (deoxyribonucleotide)). In this case, an abnormal gene-matching probe (PR1) is added to the DNA sample in one container la instead of the forward primer (or reverse primer) of the basic PCR method, for example. In contrast, a normal gene-matching probe (PR2) is added to the DNA sample in the other container lb instead of the forward primer (or reverse primer) of the basic PCR method, for example. A fluorescent dye (VIC) having a unique fluorescent color is added to each of the normal gene-compatible probe and the abnormal gene-compatible probe as an identifier.
[0027] DNA自動増殖定量化装置 2aは、容器 la内の試料及び容器 lb内の試料に対して 、基本 PCR法の温度プロファイルに従った熱処理を施すことにより、複数サイクルに 亘り DNA試料を複製増殖させ、同時に、各増殖サイクル毎の蛍光強度計測値に基 づいて、容器 la内試料の異常遺伝子成分及び容器 lb内試料の正常遺伝子成分を 別々に定量化する。  [0027] The automatic DNA quantification apparatus 2a replicates a DNA sample over a plurality of cycles by subjecting the sample in the container la and the sample in the container lb to heat treatment according to the temperature profile of the basic PCR method. At the same time, the abnormal gene component of the sample in the container la and the normal gene component of the sample in the container lb are separately quantified based on the fluorescence intensity measurement value for each growth cycle.
[0028] データ処理用のコンピュータ (例えば、パソコン等） 3aでは、例えば所定の増殖サイ クル回数において定量化された異常遺伝子成分と正常遺伝子成分とに基づいて、 検査対象試料の遺伝子の突然変異率を同定する。  [0028] In a data processing computer (for example, a personal computer or the like) 3a, for example, based on the abnormal gene component and the normal gene component quantified in a predetermined number of propagation cycles, the mutation rate of the gene in the sample to be examined Is identified.
[0029] 上述の従来装置にあっては、先に説明したように、正常遺伝子適合型プローブ (P R2)と異常遺伝子適合型プローブ (PR1)との塩基配列上の相異は僅か 1塩基程度 に過ぎないことから、塩基列選別性能は必ずしも充分なものとは言い難ぐそのため 容器 la内の正常遺伝子計測用の試料においては、正常な塩基配列を有する塩基 列のみならず、突然変異による塩基配列を有する塩基列までもが僅かに複製増殖さ れてしまったり、あるいは、容器 lb内の異常遺伝子計測用の試料においても、突然 変異による塩基配列を有する塩基列のみならず、正常な塩基配列を有する塩基列ま でもが僅かに複製増殖されたりして、計測可能な突然変異率 (Mutation Rate)の下限 は精々 10%程度にしかならない。 [0029] In the above-described conventional apparatus, as described above, the difference in base sequence between the normal gene compatible probe (PR2) and the abnormal gene compatible probe (PR1) is only about 1 base. Therefore, in the sample for normal gene measurement in the container la, not only a base sequence having a normal base sequence but also a base by mutation is not necessarily sufficient. Even a base sequence having a sequence may be slightly replicated or propagated, or even in a sample for measuring abnormal genes in a container lb, not only a base sequence having a base sequence due to a sudden mutation but also a normal base sequence The lower limit of the mutation rate that can be measured because the base sequence having Is only about 10%.
[0030] これに対して、図 1 (b)に示す本発明装置の場合、検査対象となる DNA試料は共 通の容器 1に収容され、この共通の容器 1内の DNA試料中には、異常遺伝子適合 型プローブ (PR1)と正常遺伝子適合型プローブ (PR2)との双方が混入される。この とき、異常遺伝子適合型プローブ (PR1)及び正常遺伝子適合型プローブ (PR2)は 例えばタックマン PCR法のタックマンプローブの代わりに添加される。なお、異常遺 伝子適合型プローブ (PR1)及び正常遺伝子適合型プローブ (PR2)は例えば基本 P CR法のフォワードプライマ（又はリバースプライマ）の代わりに添加されるようにしても よい。異常遺伝子適合型プローブ (PR1)には固有の蛍光色を有する蛍光色素 (FA M)が、また正常遺伝子適合型プローブ (PR2)には、固有の蛍光色を有する蛍光色 素 (VIC)が識別子としてそれぞれ付加されている。尚、 FAMの化学構造式は図 45 に示されている。 [0030] On the other hand, in the case of the apparatus of the present invention shown in FIG. 1 (b), the DNA sample to be tested is accommodated in the common container 1, and the DNA sample in the common container 1 contains Both an abnormal gene compatible probe (PR1) and a normal gene compatible probe (PR2) are mixed. At this time, the abnormal gene compatible probe (PR1) and the normal gene compatible probe (PR2) are added in place of, for example, the Taqman probe in the Taqman PCR method. The abnormal gene compatible probe (PR1) and the normal gene compatible probe (PR2) may be added instead of the forward primer (or reverse primer) of the basic PCR method, for example. The abnormal gene compatible probe (PR1) is identified with a fluorescent dye (FAM) having a unique fluorescent color, and the normal genetic matched probe (PR2) is identified with a fluorescent dye (VIC) having a unique fluorescent color. Are added respectively. The chemical structural formula of FAM is shown in Fig. 45.
[0031] DNA自動増殖定量化装置 2bは、異常遺伝子適合型プローブ及び正常遺伝子適 合型プローブ及び反応液（DNAポリメラーゼと dNTP (デォキシリボヌクレオチド）とが 含まれている）が混入された容器 1内の試料に対して、タックマン PCR法 (又は基本 P CR法）の温度プロファイルに従った熱処理を施すことにより、複数サイクルに亘り DN A試料を複製増殖させ、同時に、各増殖サイクル毎の蛍光強度計測値に基づいて、 容器 la内試料の異常遺伝子成分及び容器 lb内試料の正常遺伝子成分を別々に 定量化する。  [0031] The DNA automatic growth quantification apparatus 2b is mixed with an abnormal gene compatible probe, a normal gene compatible probe, and a reaction solution (containing DNA polymerase and dNTP (deoxyribonucleotide)). By subjecting the sample in container 1 to heat treatment according to the temperature profile of the Taqman PCR method (or the basic PCR method), the DNA sample is replicated and propagated over multiple cycles. Based on the measured fluorescence intensity, the abnormal gene component of the sample in the container la and the normal gene component of the sample in the container lb are separately quantified.
[0032] ここで、基本 PCR法及びタックマン PCR法による遺伝子操作にっ 、て、簡単に解 説する。基本 PCR法の概念図が図 6に示されている。基本 PCR法は、フォワードプラ イマ 6とリバースプライマ 7とからなる二種類のプローブを使用して、選択的に複製増 殖させたい遺伝子鎖領域を限定する（図 6 (c)参照)。フォワードプライマ 6は、選択的 に複製増殖させたい遺伝子鎖領域の第 1の端部所定長さの塩基配列のみに適合す る塩基配列を有する。同様に、リバースプライマ 7は、複製増殖させたい遺伝子鎖領 域の第 2の端部所定長さの塩基配列のみに適合する塩基配列を有する。この PCR 法にあっては、遺伝子を構成する二重鎖 4 (図 6 (a)参照）は対をなす 2つの単鎖 5a, 5bに解離され（図 6 (b)参照）、しかるのち、反応液中の DNAポリメラーゼと dNTPが 作用することにより、各単鎖のそれぞれ 5a, 5bにフォワード及びリバースプライマ 6, 7 を基点とした相補鎖が合成されて、新たに対となる単鎖が再生されて、元の二重鎖 4 力^個生成される（図 6 (d)参照)。これを 1サイクルとして、以上の処理を繰り返すこと により、遺伝子鎖の特定長さ領域のみを選択的に複製増殖 (2個、 4個、 8個、 16個 · • させることができる。なお、符号 8は識別子として機能する蛍光色素である。 [0032] Here, the gene manipulation by the basic PCR method and the Taqman PCR method will be briefly explained. A conceptual diagram of the basic PCR method is shown in Figure 6. The basic PCR method uses two types of probes consisting of a forward primer 6 and a reverse primer 7 to limit the gene chain region that is to be selectively replicated (see Fig. 6 (c)). The forward primer 6 has a base sequence that matches only the base sequence of a predetermined length at the first end of the gene chain region to be selectively replicated. Similarly, reverse primer 7 has a base sequence that matches only the base sequence of a predetermined length at the second end of the gene chain region to be replicated and propagated. In this PCR method, the double strand 4 constituting the gene (see Fig. 6 (a)) is dissociated into two single strands 5a and 5b that make a pair (see Fig. 6 (b)). DNA polymerase and dNTP in the reaction solution As a result, complementary strands based on the forward and reverse primers 6, 7 are synthesized in 5a and 5b of each single strand, and a new pair of single strands is regenerated, and the original double strand 4 Forces are generated (see Fig. 6 (d)). By repeating this process as a cycle, only the specific length region of the gene chain can be selectively replicated (2, 4, 8, 16, etc.). A fluorescent dye 8 functions as an identifier.
[0033] PCR法における領域限定能力を高めたタックマン PCR法の概念図が図 7に示され ている。このタックマン PCR法にあっては、上述のフォワードプライマ 6及びリバースプ ライマ 7に加えて、選択的に複製増殖させたい遺伝子鎖領域の中間部所定長さの塩 基配列のみに適合する塩基配列を有するタックマンプローブ 9が使用される。このタ ックマンプローブ 9には識別子として、蛍光色素 8が含まれる。フォワードプライマ 6、リ バースプライマ 7、及びタックマンプローブ 9の三者がすべて適合した塩基列の場合 に限り、タックマンプローブは遺伝子単鎖 5a, 5bの再生に寄与すると共に、そのとき に限り蛍光色素 8はその遺伝子に残存される。この蛍光色素 8を頼りとして、目的とす る遺伝子鎖領域の存在を検出することができる。このタックマン PCR法によれば、フォ ワードプライマ 6、リバースプライマ 7、及びタックマンプローブ 9からなる 3個の識別子 を使用して領域限定を行うため、領域限定能力が向上する。なお、図 7において、図 6と同一構成部分については同符号を付して説明は省略する。  [0033] FIG. 7 shows a conceptual diagram of the Tachman PCR method with enhanced region limiting ability in the PCR method. In this Taqman PCR method, in addition to the above forward primer 6 and reverse primer 7, it has a base sequence that matches only the base sequence of a predetermined length in the middle part of the gene chain region to be selectively replicated. Tackman probe 9 is used. The tackman probe 9 includes a fluorescent dye 8 as an identifier. Only when all three of the forward primer 6, the reverse primer 7, and the Taqman probe 9 are compatible base sequences, the Taqman probe contributes to the regeneration of the gene single strands 5a and 5b, and only in that case the fluorescent dye 8 Remains in the gene. By using this fluorescent dye 8, it is possible to detect the presence of the target gene chain region. According to this Taqman PCR method, the area limiting capability is improved because the area limiting is performed using the three identifiers consisting of the forward primer 6, the reverse primer 7, and the Taqman probe 9. In FIG. 7, the same components as those in FIG.
[0034] パソコン 3bは、自動増殖定量化装置 2bにて定量化された正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分に基づいて当所の DNA試料中における特定遺伝子に関 する突然変異率を同定する。  [0034] The personal computer 3b identifies the mutation rate related to a specific gene in the DNA sample of this site based on the normal gene component and the Z or abnormal gene component quantified by the automatic growth quantification apparatus 2b.
[0035] 本発明に係る突然変異率計測装置の動作を示すゼネラルフローチャートが図 2〖こ 示されて!/ヽる。本発明装置は自動増殖定量化装置 2bとパソコン (PC) 3bとを含んで 構成される。同図において、処理が開始されると、先ず、自動増殖定量化装置 2bが 運転される (ステップ 201)。すると、先に説明したように、 DNA自動増殖計測装置 2b は、異常遺伝子適合型プローブ及び正常遺伝子適合型プローブが混入された容器 1内の試料に対して、タックマン PCR法（又は基本 PCR法）の温度プロファイルに従 つた熱処理を施すことにより、複数サイクルに亘り DNA試料を複製増殖させ、同時に 、各増殖サイクル毎の蛍光強度計測値に基づいて、容器 la内試料の異常遺伝子成 分及び容器 lb内試料の正常遺伝子成分を別々に定量ィ匕する。 [0035] A general flowchart showing the operation of the mutation rate measuring apparatus according to the present invention is shown in FIG. The apparatus of the present invention comprises an automatic growth quantification apparatus 2b and a personal computer (PC) 3b. In the figure, when processing is started, first, the automatic growth quantification apparatus 2b is operated (step 201). Then, as explained above, the DNA automatic proliferation measuring device 2b uses the Taqman PCR method (or the basic PCR method) for the sample in the container 1 in which the abnormal gene compatible probe and the normal gene compatible probe are mixed. By performing heat treatment according to the temperature profile of the DNA sample, the DNA sample is replicated and propagated over multiple cycles, and at the same time, the abnormal gene formation of the sample in the container la is determined based on the fluorescence intensity measurement value for each growth cycle. Separately quantify the normal gene components of the sample in the aliquot and container lb.
[0036] 続いて、パソコン 3bは、サンプリング処理 (ステップ 202)を実行することにより、増殖 サイクル毎に定量化される異常遺伝子成分及び正常遺伝子成分に相当する蛍光強 度データを自動増殖定量ィ匕装置 2bから取得して所定のメモリ領域に蓄積記憶させる 。予め決められた最大サイクル数に達すると (ステップ 203YES)、サンプリング処理（ ステップ 202)は終了する。  [0036] Subsequently, the personal computer 3b executes a sampling process (step 202) to automatically detect the fluorescence intensity data corresponding to the abnormal gene component and the normal gene component quantified for each proliferation cycle. Acquired from the device 2b and stored in a predetermined memory area. When the predetermined maximum number of cycles is reached (step 203 YES), the sampling process (step 202) ends.
[0037] 続、て、パソコン 3bは特徴量生成処理 (ステップ 204)と特徴量照合処理 (ステップ 205)とを実行することにより、メモリ領域に蓄積記憶された増殖サイクル毎の異常遺 伝子成分及び正常遺伝子成分に相当する蛍光強度データに基づいて、当該 DNA 試料中の特定塩基列に関する突然変異率 (Mutation rate)を同定する。  [0037] Subsequently, the personal computer 3b executes the feature value generation process (step 204) and the feature value verification process (step 205), whereby the abnormal gene component for each multiplication cycle accumulated and stored in the memory area is stored. Based on the fluorescence intensity data corresponding to the normal gene component, the mutation rate for the specific base sequence in the DNA sample is identified.
[0038] パソコン 3bが実行する特徴量生成処理 (ステップ 204)の詳細フローチャートが図 3 に示されている。同図において、処理が開始されると、先ず、微分処理 (ステップ 301 )が実行されて、サンプリングされた一連の蛍光強度データは時間軸方向へと微分処 理される。続いて、領域弁別処理 (ステップ 302)が実行されて、微分処理 (ステップ 3 01)にて生成される一連の微分値データを所定のしき!/、値を基準としてニ値ィ匕する ことにより、計測信頼性の高いサイクル領域が弁別される。続いて、近似直線生成処 理 (ステップ 303)が実行されて、弁別されたサイクル領域に存在する一連の蛍光強 度データ列のなす曲線は直線近似される。続いて、傾き生成処理 (ステップ 304)が 実行されて、近似直線生成処理 (ステップ 303)にて生成された近似直線の傾き（SL OPE)力 当該 DNA試料の突然変異率に相当する特徴量として求められる。  FIG. 3 shows a detailed flowchart of the feature value generation process (step 204) executed by the personal computer 3b. In the figure, when processing is started, differentiation processing (step 301) is first executed, and a series of sampled fluorescence intensity data is subjected to differentiation processing in the time axis direction. Subsequently, the region discrimination processing (step 302) is executed, and the series of differential value data generated in the differentiation processing (step 301) is displayed on the basis of a predetermined threshold! / And the value as a reference. A cycle region with high measurement reliability is discriminated. Subsequently, an approximate straight line generation process (step 303) is executed, and a curve formed by a series of fluorescence intensity data strings existing in the discriminated cycle region is linearly approximated. Subsequently, the slope generation process (step 304) is executed, and the slope (SL OPE) force of the approximate line generated in the approximate line generation process (step 303) is calculated as a feature quantity corresponding to the mutation rate of the DNA sample. Desired.
[0039] ノソコン 3bが実行する特徴量照合処理 (ステップ 205)の詳細フローチャートが図 4 に示されている。この特徴量照合処理 (ステップ 205)では、傾き生成処理 (ステップ 3 04)にて生成された近似直線の傾きを、突然変異率の異なる複数の基準試料のそれ ぞれについて予め求めておいた近似直線の傾きと照合することにより、当該検査試 料の突然変異率を同定する。パソコン 3bのメモリ内には、図 5に示されるように、デー タ No. 1, 2, 3 · · ·に対応させて、傾き（SLOPE)と突然変異率（Mutation rate)との関 係を規定する参照テーブルが格納されて 、る。  FIG. 4 shows a detailed flowchart of the feature amount matching process (step 205) executed by the nosocon 3b. In this feature value matching process (Step 205), the slope of the approximate line generated in the slope generation process (Step 304) is calculated in advance for each of a plurality of reference samples having different mutation rates. By matching the slope of the straight line, the mutation rate of the test sample is identified. In the memory of PC 3b, as shown in Fig. 5, the relationship between slope (SLOPE) and mutation rate (Mutation rate) is associated with data Nos. 1, 2, 3,. The reference table to be specified is stored.
[0040] 図 4において、処理が開始されると、データ No. nの値を 1から順に + 1づっ増加さ せながら (ステップ 406)、傾き生成処理 (ステップ 304)にて生成された傾き（SLOPE) とデータ No. nで指定されるデータの傾き（SLOPE)とを照合する処理 (ステップ 401 〜403)が実行される。そして、いずれかのデータ No. nにおいて、両者の傾き（SLO PE)の一致が確認されると（ステップ 404YES)、そのデータ No. nのデータにおける 突然変異率 (Mutation rate)が参照テーブル力も読み出され (ステップ 404)、こうして 読み出された突然変異率 (Mutation rate)は、その DNA試料の突然変異率 (Mutatio n rate)として同定される (ステップ 405)。なお、両者の比較のために着目する特徴量 としては、近似直線の切片としてもよい。 [0040] In FIG. 4, when the process is started, the value of data No. n is incremented by 1 in order from 1. (Step 406), the process (Steps 401 to 403) for checking the slope (SLOPE) generated in the slope generation process (Step 304) and the slope (SLOPE) of the data specified by data No. n Executed. If any data No. n matches the slope (SLO PE) of the two (step 404 YES), the mutation rate in the data No. n data also reads the reference table power. The mutation rate that has been issued (step 404) and thus read out is identified as the mutation rate of the DNA sample (step 405). Note that the feature amount of interest for comparison between the two may be an intercept of an approximate straight line.
[0041] 以上説明した本発明方法を実施する突然変異率計測装置によれば、図 1 (b)に示 されるように、容器 1に収容された同一の DNA試料に対して、異常遺伝子適合型プ ローブ (PR1)と正常遺伝子適合型プローブ (PR2)との双方を混入してから、自動増 殖定量ィ匕装置 2bにて基本 PCR法又はタックマン PCR法にて増殖定量ィ匕するという 手法を採用したことにより、計測可能な突然変異率の下限を従前のものに比べて大 幅に低下させることが可能となった。  [0041] According to the mutation rate measuring apparatus for carrying out the method of the present invention described above, as shown in Fig. 1 (b), the abnormal DNA match is applied to the same DNA sample stored in the container 1. A method in which both the type probe (PR1) and the normal gene-matched probe (PR2) are mixed, and then the growth quantification is performed by the basic PCR method or the Taqman PCR method using the automatic growth quantification device 2b. By adopting, the lower limit of measurable mutation rate can be greatly reduced compared to the previous one.
[0042] また、以上の突然変異率計測装置によれば、突然変異率の同定にあたっては、異 常遺伝子成分に基づいて生成された所定の特徴量と既知の突然変異率を有する複 数の基準試料のそれぞれに関して予め生成された対応する所定の特徴量とを関係 づけしてなる参照テーブルとの照合により行うと共に、特徴量としては近似直線の傾 きを採用したことにより、計測可能な突然変異率の下限を一層低下させ、同時に分解 能を向上させることが可能となった。  [0042] Further, according to the above mutation rate measuring apparatus, in identifying the mutation rate, a plurality of criteria having a predetermined feature amount generated based on the abnormal gene component and a known mutation rate are used. Mutations that can be measured by using a reference table that correlates the corresponding predetermined feature values generated in advance with respect to each sample and adopting the inclination of the approximate straight line as the feature value It became possible to further lower the lower limit of the rate and at the same time improve the resolution.
[0043] 次に、本発明方法及び装置による計測限界値並びに計測分解能の下限について 検証した結果を説明する。本発明者は、（1)既知の突然変異率 (Mutation rate)を有 する試料を作成し、その試料に正常遺伝子 (Wild)適合型プローブと異常遺伝子 (Mu t)適合型プローブとの双方を混入し、自動増殖定量ィ匕装置にかけてタックマン PCR 法で複製増殖処理を行い、以上を突然変異率の異なる複数通りの試料について繰り 返し行 、、 (2)増殖サイクル毎の蛍光強度データを各試料につ!、て取得 (サンプリン グ)し、 (3)各資料につ!、て取得された蛍光強度データ列から 、くつかの特徴量 (傾 き、切片、特定サイクル回の蛍光強度値)を抽出し、（4)それらの特徴量毎に突然変 異率 (Mutation rate)との相関を確認した。その結果、「傾き」や「切片」と突然変異率 との間には直線的な相関が認められ、殊に、「傾き」と突然変異率との間には突然変 異率の下限に至るまで、極めて正確な相関があることが確認された。以下、検証の過 程を具体的に説明する。 [0043] Next, the results of verifying the measurement limit value and the lower limit of the measurement resolution by the method and apparatus of the present invention will be described. The inventor (1) creates a sample having a known mutation rate, and adds both a normal gene (Wild) compatible probe and an abnormal gene (Mut) compatible probe to the sample. The sample was mixed and subjected to replication growth treatment by the Tackman PCR method using an automatic growth quantification apparatus, and the above was repeated for multiple samples with different mutation rates. (2) Fluorescence intensity data for each growth cycle was measured for each sample. (Sampling), (3) From each fluorescence intensity data row acquired, several features (tilt, intercept, fluorescence intensity value for a specific cycle) (4) suddenly change for each feature A correlation with the Mutation rate was confirmed. As a result, there is a linear correlation between the “slope” and “intercept” and the mutation rate, and in particular, the “slope” and the mutation rate reach the lower limit of the sudden variation rate. Until now, it was confirmed that there was a very accurate correlation. The verification process will be explained in detail below.
[0044] [検証用試料の作成、及び定量 PCR]  [0044] [Preparation of verification sample and quantitative PCR]
(株）キアゲン社製のバクスジーンブラッド DNAキット（PAXgene Blood DNA kit)を 用いて DNAを抽出し、試料 DNAの用意を行う。なお、以下で用いる試薬のうち、 B G1ノ ッファ（BG1 buffer)、： BG2バッファ（BG2 buffer) BG3バッファ（BG3 buffer)、： BG 4バッファ（BG4 buffer)、プロテアーゼ（Protease)については、バクスジーンブラッド D NAキットに含まれる試薬を用 V、た。  Extract the DNA using the PAXgene Blood DNA kit manufactured by Qiagen, and prepare the sample DNA. Among the reagents used below, BG1 buffer, BG2 buffer, BG3 buffer, BG4 buffer, protease, and protease Use the reagents included in the Blood DNA kit.
[0045] 最初に、採血管（同キットに含まれる）に血液を約 8. 5ml採取した（全量 10ml)。次 に、 25mlの BG1バッファの入った 50mlの遠沈管に血液を移動して混和し、 2500G で 5分間遠心した。上清を捨てたのち、 5mlの BG2バッファをカ卩えて混和し、 2500G で 5分間遠心した。上清を捨てた後、 5mlの BG3バッファ及び 50 1のプロテアーゼ を加え、沈殿が溶解するまで激しく懸濁した。 65°Cで 10分間インキュベートしたのち 、 5mlのイソプロバノール (和光純薬工業 (株)製）をカ卩え、糸状の DNAが見えるよう になるまで良く混和した。 2500Gで 3分間遠心後、上清を捨て、 70%エタノール 5ml を加え軽く撹拌し、 2500Gで 3分間遠心した。遠心後、上清を捨て、沈殿を乾燥させ 、 1mlの BG4バッファを加え、恒温槽で 65°C1時間インキュベートした。その後、室温 でー晚インキュベートし DNAを完全に溶解させ DNA試料とした。最後に、吸光によ る DNA濃度測定を行い、 lOngZ w l濃度に調整したサンプル 5 /ζ 1(50η8分)を 1% ァガロースゲルにて電気泳動し、純度を確認した。 [0045] First, about 8.5 ml of blood was collected into a blood collection tube (included in the kit) (total amount 10 ml). The blood was then transferred to a 50 ml centrifuge tube containing 25 ml of BG1 buffer, mixed, and centrifuged at 2500 G for 5 minutes. After discarding the supernatant, 5 ml of BG2 buffer was added and mixed, and centrifuged at 2500 G for 5 minutes. After discarding the supernatant, 5 ml BG3 buffer and 50 1 protease were added and vigorously suspended until the precipitate dissolved. After incubating at 65 ° C for 10 minutes, 5 ml of isopropanol (made by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added and mixed well until the filamentous DNA became visible. After centrifugation at 2500 G for 3 minutes, the supernatant was discarded, 5 ml of 70% ethanol was added, and the mixture was gently stirred, and centrifuged at 2500 G for 3 minutes. After centrifugation, the supernatant was discarded, the precipitate was dried, 1 ml of BG4 buffer was added, and the mixture was incubated at 65 ° C. for 1 hour in a thermostatic bath. Thereafter, the mixture was incubated at room temperature for complete dissolution of the DNA to prepare a DNA sample. Finally, DNA concentration was measured by absorption, and sample 5 / ζ 1 (50η 8 min) adjusted to lOngZ wl concentration was electrophoresed on a 1% agarose gel to confirm purity.
[0046] 上記の方法で抽出した DNAを全量で 10ng用い、アプライドバイオシステムズジャ パン株式会社のタックマンプローブ（TaqMan Probe)を用いた定量 PCRを行った。 自 動増殖定量化装置としては、アプライドバイォシステムズジャパン株式会社の PRIS M7000を用いた。同装置は、異常遺伝子適合型プローブ及び正常遺伝子適合型 プローブが混入された容器内の試料に対して、タックマン PCR法の温度プロファイル に従った熱処理を施すことにより、複数サイクルに亘り DNA試料を複製増殖させ、同 時に、各増殖サイクル毎の蛍光強度計測値に基づいて、容器内試料の異常遺伝子 成分及び正常遺伝子成分を別々に定量化する。 [0046] A total of 10 ng of the DNA extracted by the above method was used, and quantitative PCR was performed using a TaqMan Probe (Applied Biosystems Japan). As an automatic growth quantification apparatus, PRIS M7000 of Applied Systems Japan Co., Ltd. was used. The device replicates DNA samples over multiple cycles by heat-treating the sample in the container containing the abnormal gene-compatible probe and normal gene-compatible probe according to the temperature profile of the Tacman PCR method. Proliferate and the same Sometimes, the abnormal gene component and normal gene component of the sample in the container are quantified separately based on the fluorescence intensity measurement value for each growth cycle.
[0047] DNA試料としては、正常な DNA(WT)とミトコンドリア DNAの 3243番目のアデ- ン (A)がグァニン (G)に変異して 、るもの (A3243G)とを複数通りの割合で混合した ものを用いた。  [0047] As a DNA sample, normal DNA (WT) and mitochondrial DNA 3243rd adene (A) is mutated to guanine (G) and mixed (A3243G) in multiple proportions We used what we did.
フォワードプライマ（Forward Primer)としては、  As a Forward Primer,
5 ' 一 C ACCC AAG AAC AGGGTTTGTTAA - 3 'を、  5 'One C ACCC AAG AAC AGGGTTTGTTAA-3',
リバースプライマ（Reverse Primer)としては、  As a reverse primer (Reverse Primer)
5 ' - GTTGGCCATGGGTATGTTGTTA— 3，を、それぞれ用 V、た。 また、正常な DNA(WT)を検出するためのタックマンプローブ（TaqMan- MGBプロ ーブ）としては、レポーターが VICである  5 '-GTTGGCCATGGGTATGTTGTTA-3, for V, respectively. In addition, as a TaqMan probe (TaqMan-MGB probe) for detecting normal DNA (WT), the reporter is VIC.
5， 一 VIC— ATGGCAGAGCCCGG— MGB— 3，を、  5. One VIC—ATGGCAGAGCCCGG—MGB—3,
異常な DNA(A3243G)を検出するためのタックマンプローブ（TaqMan- MGBプロ ーブ）としては、レポーターが FAMである  As a TaqMan probe (TaqMan-MGB probe) for detecting abnormal DNA (A3243G), the reporter is FAM.
5' FAM— TGGCAGGGCCCGG— MGB— 3，を、それぞれ用いた。  5 ′ FAM— TGGCAGGGCCCGG— MGB-3 were used respectively.
[0048] これらと、 ABI社製のタックマン ·ュ-バーサノレ · PCRマスターミックス（TaqMan Univ ersai PCR Master Mix)を使用して、以下のように反応液を調整し、定量 PCRを行つ た。すなわち、反応液は、以下の物質を混ぜ蒸留水で総量が 25 1になるように調整 する。反応に必要な温度プロファイルは、 50°Cで 2分、 95°Cで 10分の処理を行った 後、 95°Cで 15秒、 60°Cで 1分の増殖サイクルを 40回繰り返した。 [0048] Using these and ABI's TaqMan Univer PCR PCR Mix (TaqMan Univer PCR PCR Mix), the reaction mixture was prepared as follows, and quantitative PCR was performed. In other words, the reaction mixture should be adjusted to a total volume of 25 1 with the following substances mixed with distilled water. The temperature profile required for the reaction was treated at 50 ° C for 2 minutes and at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 growth cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute.
[0049] 反応液の成分 [0049] Components of the reaction solution
• TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5 ^ 1  • TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5 ^ 1
• Forward Primer 0. 4 μ M  • Forward Primer 0.4 μM
• Reverse Primer 0. 4 μ M  • Reverse Primer 0.4 μM
• TaqMan Probe 75nM (正常 DNA適合型、異常 DNA適合型のそれぞれにつ いて）  • TaqMan Probe 75nM (For both normal DNA and abnormal DNA)
• Template DNA 10ng (DNAサンプル）  • Template DNA 10ng (DNA sample)
[0050] [毎サイクルの蛍光強度取得、特徴量抽出、及び相関の確認] 突然変異 DNA(A3243G)の含有率の異なる試料 DNAを 18種類準備し、全て同 じ条件でタックマン PCR法による定量 PCRを行った。この実験に関して、各 DNA試 料ごとに、 PCRサイクルと異常遺伝子検出用の FAMプローブの蛍光強度との相関 関係を測定したグラフが図 8に示されている。図において、横軸は PCRのサイクル数 、縦軸は蛍光強度 (DeltaRn)である。なお、例えば、 0. OlMutとは、突然変異率（ Mutation rate)が 0. 01%の試料に相当することを意味している。 [0050] [Acquisition of fluorescence intensity in each cycle, feature extraction, and confirmation of correlation] Eighteen sample DNAs with different contents of mutant DNA (A3243G) were prepared, and quantitative PCR was performed by the Taqman PCR method under the same conditions. For this experiment, a graph showing the correlation between the PCR cycle and the fluorescence intensity of the FAM probe for detecting abnormal genes is shown in Fig. 8 for each DNA sample. In the figure, the horizontal axis represents the number of PCR cycles, and the vertical axis represents the fluorescence intensity (DeltaRn). For example, 0. OlMut means that it corresponds to a sample having a mutation rate of 0.01%.
[0051] 図から明らかなように、 PCRサイクル数が 0〜約 16ぐらいまでのサイクル数領域にあ つては、いずれの試料に関しても、 PCRサイクル数が増加しても蛍光強度（DeltaRn )の値はほとんど規則的には増加しないことが認められる。これに対して、 PCRサイク ル数が 16を越えた辺りから、いずれの試料においても、蛍光強度の値はサイクル数 に応じて規則的な増加を開始し、特に、 PCRサイクル数が約 21〜約 30のサイクル数 領域においては、サイクル数と蛍光強度との間には直線的な相関関係が認められる 。なお、 PCRサイクル数が約 30を越えると、いずれの試料においても、サイクル数の 増加に対する蛍光強度の増加率は徐々に減少して、曲線はなだらかなものとなる。こ れは PCRの効率低下及び PCRを行うための塩基等の減少などが原因だと思われる [0051] As is clear from the figure, in the cycle number region where the number of PCR cycles is from 0 to about 16, the fluorescence intensity (DeltaRn) value for any sample is increased even if the number of PCR cycles is increased. Is observed to increase almost regularly. On the other hand, the fluorescence intensity value started to increase regularly according to the number of cycles in any sample from the time when the number of PCR cycles exceeded 16, and in particular, the number of PCR cycles was about 21 to In the cycle number region of about 30, there is a linear correlation between the cycle number and the fluorescence intensity. When the PCR cycle number exceeds about 30, the increase rate of the fluorescence intensity with respect to the increase in the cycle number gradually decreases in any sample, and the curve becomes gentle. This seems to be caused by a decrease in the efficiency of PCR and a decrease in bases for PCR.
[0052] 図 8のグラフにおいて、蛍光強度（DeltaRn)がー 0. 1〜0. 5の範囲を拡大して示 すグラフが、図 9に示されている。図から明らかなように、突然変異 DNAの含有率が 0%の試料 DNA (0%Mut)と、突然変異 DNAの含有率が 0. 5%の試料 DNA(0. 5Mut)とでは、それぞれグラフの傾きが明らかに異なることが認められる。このことか ら、本発明の突然変異率計測方法によれば、突然変異率と相関の高い特徴量として 近似直線の傾き（SLOPE)を採用することにより、 0. 5%の濃度 (突然変異率)の違い も容易に判別できる高 、分解能が得られることが理解される。 In the graph of FIG. 8, FIG. 9 shows a graph in which the fluorescence intensity (DeltaRn) is enlarged in the range of −0.1 to 0.5. As is clear from the figure, the sample DNA (0% Mut) with a mutant DNA content of 0% and the sample DNA with a mutant DNA content of 0.5% (0.5Mut) are respectively graphed. It can be seen that the slopes of are clearly different. Therefore, according to the mutation rate measuring method of the present invention, by adopting the slope of the approximate line (SLOPE) as a feature quantity having a high correlation with the mutation rate, a concentration of 0.5% (mutation rate) It is understood that a high resolution can be obtained that can be easily discriminated.
[0053] 突然変異率と相関のある特徴量として近似直線の傾き (SLOPE)を使用した突然変 異率計測装置を実現する場合、検査対象試料から得られる蛍光強度データ列から、 ノイズの影響を排除して、その検査対象試料に固有な近似直線の傾き (SLOPE)を自 動的に抽出せねばならない。以下に、パソコンで実現可能な傾き自動抽出アルゴリ ズムについて説明する。 [0054] 突然変異 DNAの含有率が 0. 1%の試料 DNA (0. l%Mut)について、 PCRサイ クルと各サイクルで取得される蛍光強度データ列との関係を示すグラフが図 10に示 されている。図から明らかなように、このグラフ力 は、サイクル数が 0〜20の領域に つ!、ては、サイクル数が増加しても蛍光強度 (Delta Rn)は規則的には増加しな!ヽ のに対して、サイクル数が 20〜40の領域については、 PCRサイクル数に応じて蛍光 強度は規則的に増加し、 PCRサイクル数と蛍光強度との間には、直線的な相関関係 が存在することが認められる。 [0053] When realizing an abrupt variation rate measurement device that uses the slope of the approximate straight line (SLOPE) as a feature quantity that correlates with the mutation rate, the influence of noise is detected from the fluorescence intensity data string obtained from the sample to be examined. It must be excluded and the approximate straight line slope (SLOPE) specific to the sample to be examined must be extracted automatically. The automatic slope extraction algorithm that can be implemented on a personal computer is described below. [0054] Fig. 10 is a graph showing the relationship between the PCR cycle and the fluorescence intensity data string obtained in each cycle for the sample DNA (0.1% Mut) with a mutant DNA content of 0.1%. It is shown. As can be seen from the graph, this graph force does not increase regularly (Delta Rn) even when the number of cycles increases! On the other hand, in the region where the cycle number is 20 to 40, the fluorescence intensity increases regularly according to the PCR cycle number, and there is a linear correlation between the PCR cycle number and the fluorescence intensity. Is allowed to do.
[0055] 図 10のグラフに示される蛍光強度列をサイクル数について微分して得られた微分 値列が図 11のグラフに示されている。図から明らかなように、微分値列を見ると、サイ クル回数 0〜20の領域につ!、ては微分値列は 0に近!、低!/、値を示すのに対して、サ イタル回数 20〜40の領域につ!、ては微分値列は 0. 05に近 、高!/、値を示すことが 認められる。  A differential value sequence obtained by differentiating the fluorescence intensity sequence shown in the graph of FIG. 10 with respect to the number of cycles is shown in the graph of FIG. As can be seen from the figure, when the differential value sequence is viewed, the differential value sequence is close to 0 !, low! / It is recognized that the differential value sequence is close to 0.05 and high! / In the range of 20 to 40 iterations.
[0056] 図 11のグラフに示される微分値列を閾値（=微分値の最大値 Z2)にて弁別二値 化して、閾値よりも大きい微分値列だけを抽出した結果が図 12のグラフに示されてい る。図から明らかなように、上述の弁別二値化処理の結果、サイクル数 20〜40の領 域に含まれる微分値列のみが残される。  [0056] The differential value sequence shown in the graph of FIG. 11 is binarized with a threshold value (= maximum differential value Z2), and the result of extracting only the differential value sequence larger than the threshold value is shown in the graph of FIG. It is shown. As is clear from the figure, as a result of the above-described discrimination binarization process, only the differential value sequence included in the region of 20 to 40 cycles is left.
[0057] 図 12のグラフに示される微分値列に対応する蛍光強度列を抽出した結果が図 13 のグラフに示されている。図から明らかなように、図 10のグラフに示される蛍光強度デ ータ列の中から、規則的な単純増加傾向にある直線領域に存在する蛍光強度デー タ列のみが抽出されていることが認められる。  The result of extracting the fluorescence intensity sequence corresponding to the differential value sequence shown in the graph of FIG. 12 is shown in the graph of FIG. As is clear from the figure, only the fluorescence intensity data string existing in the linear region that tends to increase regularly is extracted from the fluorescence intensity data string shown in the graph of FIG. Is recognized.
[0058] 図 13のグラフに示される蛍光強度データ列に対して公知の直線近似化処理を適 用することにより得られた近似直線が図 14に示されている。図から明らかなように、こ の直線近似化処理の結果、下記の数式にて表される近似直線が求められている。こ の例では、傾きは 0. 0231であり、 y切片は 0. 4453であり、これらの特徴量と突然変 異率との間には良好な相関関係が存在する。  FIG. 14 shows an approximate line obtained by applying a known linear approximation process to the fluorescence intensity data string shown in the graph of FIG. As is apparent from the figure, as a result of this linear approximation process, an approximate straight line represented by the following mathematical formula is obtained. In this example, the slope is 0.0231 and the y-intercept is 0.4453, and there is a good correlation between these features and the sudden change rate.
y=0. 0231x-0. 4453  y = 0. 0231x-0. 4453
R2 = 0. 9995 R 2 = 0.99995
[0059] 上述のように、微分処理、弁別二値化処理、直線近似化処理を含む所定のァルゴ リズムを利用することにより、各試料毎に近似化直線を生成することができ、こうして 得られた近似化直線に基づ ヽて、各試料の突然変異率と相関のある様々な特徴量（ 傾き、 y切片等)を自動的に生成することができる。 [0059] As described above, a predetermined algorithm including differentiation processing, discrimination binarization processing, and linear approximation processing is performed. By using the rhythm, an approximate line can be generated for each sample. Based on the approximate line thus obtained, various feature quantities (inclinations) correlated with the mutation rate of each sample. , Y intercept, etc.) can be generated automatically.
[0060] こうして生成される特徴量の一例が図 15の表に示されている。なお、図において、 X gradは（近似直線の傾き）、 yinterceptは（y切片）、 yO, yO. 01, yO. 05, yO. 1, y 0. 2は、（サイクル数と蛍光強度との関係を示すグラフにおいて、突然変異率 0, 0. 0 1, 0. 05, 0. 1, 0. 2のそれぞれ対応するサイクル数の値）である。  An example of the feature amount generated in this way is shown in the table of FIG. In the figure, X grad is (slope of approximate line), yintercept is (y intercept), yO, yO. 01, yO. 05, yO. 1, y 0.2 is (cycle number and fluorescence intensity In the graph showing the relationship, the mutation rates are 0, 0. 0 1, 0. 05, 0. 1, 0.2 and the corresponding cycle number values).
[0061] 次に、 2種類のプローブを同一試料に併用した場合の計測結果について説明する 。突然変異 DNA(A3243G)の含有率の異なる試料 DNAを 18種類準備し、同一試 料に対して異常遺伝子検出用の FAMプローブと正常遺伝子検出用の VICプローブ とを併用して、全て同じ条件でタックマン PCR法による定量 PCRを行い、各 DNA試 料ごとに PCRサイクルと異常遺伝子検出用の FAMプローブの蛍光強度との相関関 係を測定した。この実験に関して、 Cycle値と FAMプローブの DeltaRnとの相関関 係を示すグラフが図 16に、 Cycle値と VICプローブの DeltaRnとの相関関係を示す グラフが図 17に、それぞれ示されている。図 16及び図 17において、横軸は PCRの Cycle数、縦軸は蛍光強度（DeltaRn値)である。なお、例えば、 0. OlMutとは、突 然変異率 (Mutation rate)が 0. 01%の試料であることを意味している。  [0061] Next, measurement results when two types of probes are used in combination with the same sample will be described. Prepare 18 types of sample DNA with different content of mutant DNA (A3243G), and use FAM probe for abnormal gene detection and VIC probe for normal gene detection on the same sample, all under the same conditions. Quantitative PCR was performed by the Tackman PCR method, and the correlation between the PCR cycle and the fluorescence intensity of the FAM probe for detecting abnormal genes was measured for each DNA sample. Regarding this experiment, a graph showing the correlation between the Cycle value and DeltaRn of the FAM probe is shown in FIG. 16, and a graph showing the correlation between the Cycle value and DeltaRn of the VIC probe is shown in FIG. 16 and 17, the horizontal axis represents the number of PCR cycles, and the vertical axis represents the fluorescence intensity (DeltaRn value). For example, 0. OlMut means that the sample has a mutation rate of 0.01%.
[0062] 図から明らかなように、 PCRサイクル数が 0〜約 20ぐらいまでのサイクル数領域にあ つては、いずれの試料に関しても、 PCRサイクル数が増加しても蛍光強度（DeltaRn )の値はほとんど規則的には増加しないことが認められる。これに対して、 PCRサイク ル数が 20を越えた辺りから、いずれの試料においても、蛍光強度の値はサイクル数 に応じて規則的な増加を開始し、特に、 PCRサイクル数が約 21〜約 30のサイクル数 領域においては、サイクル数と蛍光強度との間には直線的な相関関係が認められる 。なお、 PCRサイクル数が約 30を越えると、いずれの試料においても、サイクル数の 増加に対する蛍光強度の増加率は徐々に減少して、曲線はなだらかなものとなる。こ れは PCRの効率低下及び PCRを行うための塩基等の減少などが原因だと思われる  [0062] As is apparent from the figure, in the cycle number region where the number of PCR cycles is from 0 to about 20, the value of the fluorescence intensity (DeltaRn) for any sample is increased even if the number of PCR cycles is increased. Is observed to increase almost regularly. On the other hand, the fluorescence intensity value started to increase regularly according to the number of cycles in any sample from the time when the number of PCR cycles exceeded 20, and in particular, the number of PCR cycles was about 21 to In the cycle number region of about 30, there is a linear correlation between the cycle number and the fluorescence intensity. When the PCR cycle number exceeds about 30, the increase rate of the fluorescence intensity with respect to the increase in the cycle number gradually decreases in any sample, and the curve becomes gentle. This seems to be caused by a decrease in the efficiency of PCR and a decrease in bases for PCR.
[0063] 次に、こうして得られた近似直線の傾き（SLOPE)と異常 DNA含有率 (Mut濃度％) との相関をさらに検証する。 [0063] Next, the slope of the approximate straight line thus obtained (SLOPE) and abnormal DNA content (Mut concentration%) The correlation with is further verified.
[0064] 図 16において、先に述べた方法にて試料の Mut濃度毎に近似直線を求め（図 3〜  [0064] In Fig. 16, an approximate straight line is obtained for each Mut concentration of the sample by the method described above (Fig. 3 ~
5,図 10〜15参照）、 FAMプローブの DeltaRn値の近似直線の傾きと Mut濃度と の相関関係を示したグラフが図 18〜図 20に示されて!/、る。図 18は 0〜 100%の範 囲、図 19は 60〜100%の範囲、図 20は 0〜5%の範囲をそれぞれ示したものである  5, see Fig. 10 to 15), the graph showing the correlation between the slope of the approximate line of the DeltaRn value of the FAM probe and the Mut concentration is shown in Figs. Figure 18 shows the 0-100% range, Figure 19 shows the 60-100% range, and Figure 20 shows the 0-5% range.
[0065] 図 18のグラフから明らかなように、 FAMプローブの DeltaRnを検出し特徴量として 近似直線の傾きを採用した場合、 Mut濃度 (0〜60%、特に 0〜20%)の領域にお いて、曲線の傾きは比較的に急峻であるから、この領域においては良好な計測分解 能が得られることが理解される。同様にして、図 20のグラフから明らかなように、 Mut 濃度 (0〜5%)の領域においても、曲線の傾きは比較的に急峻であるから、この領域 においても良好な計測分解能が得られ、 Mut濃度 0. 5%程度まで判別可能であるこ とが理解される。これに対して、図 19のグラフからは、 FAMプローブを用いて検出し た場合には、 Mut濃度（60〜100%)の領域においては、前 2者と比べれば曲線の 傾きは緩やかであり、この領域においては計測分解能があまり良好でないことが理解 される。 [0065] As is apparent from the graph of Fig. 18, when the DeltaRn of the FAM probe is detected and the slope of the approximate straight line is adopted as the feature value, it is in the Mut concentration range (0 to 60%, especially 0 to 20%). Since the slope of the curve is relatively steep, it is understood that good measurement resolution can be obtained in this region. Similarly, as is clear from the graph of FIG. 20, even in the Mut concentration (0 to 5%) region, the slope of the curve is relatively steep, so that a good measurement resolution can be obtained also in this region. It is understood that the Mut concentration can be discriminated up to about 0.5%. On the other hand, from the graph of Fig. 19, when detected using the FAM probe, the slope of the curve is gentler in the Mut concentration (60-100%) region than in the former two. It is understood that the measurement resolution is not very good in this area.
[0066] 以上、図 16,図 18〜図 20より明らかなように、異常遺伝子を検出する FAMプロ一 ブを用いた場合には、 Mut濃度が低 ヽ領域では良好な計測分解能が得られるが、 Mut濃度が 80%以上の領域では計測分解能があまり良好ではないことがわかる。  [0066] As is apparent from FIGS. 16 and 18 to 20, when the FAM probe for detecting an abnormal gene is used, good measurement resolution can be obtained in a region where the Mut concentration is low. It can be seen that the measurement resolution is not very good in the region where the Mut concentration is 80% or more.
[0067] 図 17において、試料の Mut濃度毎に近似直線を求め、 VICプローブの DeltaRn 値の近似直線の傾きと Mut濃度との相関関係を示したグラフが図 21〜図 23に示さ れている。図 21は 0〜： LOO%の範囲、図 22は 60〜： LOO%の範囲、図 23は 0〜5%の 範囲をそれぞれ示したものである。  [0067] In Fig. 17, graphs showing the correlation between the slope of the approximate line of the DeltaRn value of the VIC probe and the Mut concentration are shown in Figs. 21 to 23 for each Mut concentration of the sample. . Fig. 21 shows the range from 0 to: LOO%, Fig. 22 shows the range from 60 to: LOO%, and Fig. 23 shows the range from 0 to 5%.
[0068] 図 21のグラフから明らかなように、 VICプローブの DeltaRnを検出し特徴量として 近似直線の傾きを採用した場合、 Mut濃度 (40〜100%、特に 60〜100%)の領域 において、曲線の傾きは比較的に急峻であるから、この領域においては良好な計測 分解能が得られることが理解される。同様にして、図 22のグラフから明らかなように、 Mut濃度（60〜： LOO%)の領域において、曲線の傾きは比較的に急峻であるから、 VICプローブを用いて検出した場合には、 Mut濃度が高い領域、即ち正常遺伝子 の濃度が低 ヽ領域にぉ 、て良好な計測分解能が得られることが理解される。これに 対して、図 23のグラフからは、 VICプローブを用いて検出した場合には、 Mut濃度（ 0〜5%)の領域においては、前 2者と比べれば曲線の傾きは緩やかであり、この領域 にお!/ヽては計測分解能があまり良好でな ヽことが理解される。 [0068] As is apparent from the graph of FIG. 21, when the DeltaRn of the VIC probe is detected and the slope of the approximate line is adopted as the feature amount, in the region of the Mut concentration (40 to 100%, particularly 60 to 100%), Since the slope of the curve is relatively steep, it is understood that good measurement resolution can be obtained in this region. Similarly, as is apparent from the graph of FIG. 22, the slope of the curve is relatively steep in the region of Mut concentration (60 to: LOO%). It is understood that when the detection is performed using the VIC probe, a good measurement resolution can be obtained in the region where the Mut concentration is high, that is, in the region where the normal gene concentration is low. On the other hand, from the graph of Fig. 23, when detected using the VIC probe, the slope of the curve is gentler in the Mut concentration (0-5%) region than the former two, In this area, it is understood that the measurement resolution is not very good.
[0069] 以上、図 17,図 21〜図 23より明らかなように、正常遺伝子を検出する VICプロ一 ブを用いた場合には、 Mut濃度が高 、領域 (即ち正常遺伝子が少な 、領域)では良 好な計測分解能が得られるが、 Mut濃度が 5%以下の領域では計測分解能があまり 良好ではな!/、ことがわ力る。 [0069] As can be seen from FIGS. 17 and 21 to 23, when the VIC probe for detecting a normal gene is used, the Mut concentration is high and the region (ie, the region having few normal genes). In this case, good measurement resolution can be obtained, but in the region where the Mut concentration is 5% or less, the measurement resolution is not so good!
図 16〜図 23より、 Mut濃度が低い領域では VICプローブよりも FAMプローブの計 測分解能が高ぐ Mut濃度の低 、領域では FAMプローブよりも VICプローブの計 測分解能が高いことがわかる。本発明においては、 Mut濃度の低い領域では FAM プローブの標準曲線を用い、 Mut濃度の高い領域では VICプローブの標準曲線を 用いることにより、どのような Mut濃度においても誤差の少ない結果が得られるもので ある。  16 to 23 show that the measurement resolution of the FAM probe is higher than that of the VIC probe in the region where the Mut concentration is low, and that the measurement resolution of the VIC probe is higher than that of the FAM probe in the region where the Mut concentration is low. In the present invention, the standard curve of the FAM probe is used in the region where the Mut concentration is low, and the standard curve of the VIC probe is used in the region where the Mut concentration is high. It is.
[0070] 次に、特徴量として近似直線の y切片を採用した場合について述べる。図 16にお V、て、 FAMプローブの DeltaRn値の近似直線の y切片と Mut濃度との相関関係を 示したグラフが図 24〜図 26に示されている。図 24は 0〜100%の範囲、図 25は 0〜 5%の範囲、図 26は 60〜100%の範囲をそれぞれ示したものである。  [0070] Next, the case where the y-intercept of the approximate line is adopted as the feature amount will be described. Fig. 24 to Fig. 26 show the correlation between the y-intercept of the approximate straight line of the DeltaRn value of the FAM probe and the Mut concentration in Fig. 16. 24 shows the range of 0-100%, FIG. 25 shows the range of 0-5%, and FIG. 26 shows the range of 60-100%.
[0071] 図 24のグラフから明らかなように、特徴量として y切片 (yinterc印 t)を採用した場合 、 Mut濃度 (0〜60%、特に 0〜20%)の領域において、曲線の傾きは比較的に急 峻であるから、この領域においては良好な計測分解能が得られることが理解される。 同様にして、図 25のグラフから明らかなように、 Mut濃度 (0〜5%)の領域において も、曲線の傾きは比較的に急峻であるから、この領域においても良好な計測分解能 が得られることが理解される。また、図 26のグラフからは、 Mut濃度（60〜100%)の 領域においては、前 2者と比べれば曲線の傾きは緩やかであり、この領域において は計測分解能があまり良好でな ヽことが理解される。  [0071] As is apparent from the graph of FIG. 24, when the y-intercept (yinterc mark t) is adopted as the feature amount, the slope of the curve is in the region of the Mut concentration (0 to 60%, particularly 0 to 20%). It is understood that good measurement resolution can be obtained in this region because it is relatively steep. Similarly, as is apparent from the graph of FIG. 25, the slope of the curve is relatively steep even in the region of Mut concentration (0 to 5%), so that good measurement resolution can be obtained also in this region. It is understood. Also, from the graph in Fig. 26, the slope of the curve is gentler in the Mut concentration (60-100%) region than in the former two, and the measurement resolution may be much better in this region. Understood.
[0072] この結果より、突然変異 DNA含有率毎の直線部 y切片の値をプロットした場合、突 然変異 DNA含有率 0%のサンプルと、突然変異 DNA含有率 1%のサンプルとの間 で有為差が認められた。し力しながら、突然変異 DNA含有率が 1%以下の領域では サンプル間の有為差異認められず、特徴量として y切片を採用した場合は、同じ FA Mプローブを採用しているにも関わらず直線部傾きを用いた図 18〜図 20の場合と 比べて、分解能が低いことが明ら力とされた。 [0072] From this result, when the value of the y-intercept of the straight line portion for each mutant DNA content is plotted, However, there was a significant difference between the sample with 0% mutant DNA content and the sample with 1% mutant DNA content. However, in the region where the mutant DNA content is 1% or less, there is no significant difference between samples, and if the y-intercept is used as a feature, the same FAM probe is used. Compared to the cases of Figs. 18 to 20 using the straight line slope, the lower resolution was the clear power.
[0073] 図 17において、 VICプローブの DeltaRn値の近似直線の y切片と Mut濃度との相 関関係を示したグラフが図 30〜図 32に示されている。図 30は 0〜100%の範囲、図 31は 0〜5%の範囲、図 32は 60〜100%の範囲をそれぞれ示したものである。  [0073] In Fig. 17, graphs showing the correlation between the y-intercept of the approximate straight line of the DeltaRn value of the VIC probe and the Mut concentration are shown in Figs. 30 shows the range of 0-100%, FIG. 31 shows the range of 0-5%, and FIG. 32 shows the range of 60-100%.
[0074] 図 30のグラフから明らかなように、特徴量として y切片 (yinterc印 t)を採用した場合 、 Mut濃度 (40〜100%、特に 60〜100%)の領域において、曲線の傾きは比較的 に急峻であるから、この領域にぉ 、ては良好な計測分解能が得られることが理解され る。同様にして、図 32のグラフから明らかなように、 Mut濃度（60〜100%)の領域に おいても、曲線の傾きは比較的に急峻であるから、この領域においても良好な計測 分解能が得られることが理解される。これに対して、図 31のグラフからは、 Mut濃度（ 0〜5%)の領域においては、前 2者と比べれば曲線の傾きは緩やかであり、この領域 にお!/ヽては計測分解能があまり良好でな ヽことが理解される。  [0074] As is apparent from the graph of FIG. 30, when the y-intercept (yinterc mark t) is adopted as the feature amount, the slope of the curve is in the region of the Mut concentration (40 to 100%, particularly 60 to 100%). Since it is relatively steep, it is understood that a good measurement resolution can be obtained in this region. Similarly, as is clear from the graph of FIG. 32, the slope of the curve is relatively steep even in the region of Mut concentration (60 to 100%), so that a good measurement resolution is also obtained in this region. It is understood that it is obtained. In contrast, the graph in Fig. 31 shows that the slope of the curve in the Mut concentration (0 to 5%) region is more gradual than in the former two. It is understood that it is not so good.
[0075] この結果より、突然変異 DNA含有率毎の直線部 y切片の値をプロットした場合、突 然変異 DNA含有率 95%のサンプルと、突然変異 DNA含有率 100%のサンプルと の間で有為差が認められた。し力しながら、近似直線の傾きを用いた場合と比べて濃 度の僅かな違いは判別しにく!/、ものであった。  [0075] From this result, when the value of the y-intercept of the straight line for each mutant DNA content is plotted, between the sample with a sudden mutation DNA content of 95% and the sample with a mutation DNA content of 100% A significant difference was observed. However, the slight difference in density compared to the case of using the slope of the approximate line was difficult to distinguish! /.
[0076] 次に、特徴量として特定サイクル回数における FAMプローブの蛍光強度（DeltaR n値）を採用した場合について説明する。図 16に関して FAMプローブの Cycle28に おける DeltaRn値と Mut濃度との相関関係を示したグラフが図 27〜図 29に示され ている。図 27は 0〜100%の範囲、図 28は 0〜5%の範囲、図 29は 60〜100%の範 囲をそれぞれ示したものである。  Next, a case where the fluorescence intensity (DeltaR n value) of the FAM probe at a specific number of cycles is adopted as the feature amount will be described. Graphs showing the correlation between the DeltaRn value in Cycle 28 of the FAM probe and the Mut concentration with respect to Fig. 16 are shown in Figs. Figure 27 shows the range of 0-100%, Figure 28 shows the range of 0-5%, and Figure 29 shows the range of 60-100%.
[0077] これらの図から明らかなように、特定サイクル回数の蛍光強度をプロットした場合も y 切片の場合と同様に Mut濃度 1%ではある程度判別可能である力 それ以下の濃度 では各 Mut濃度毎の有為差が認めにくぐ含有量、さらには含有の有無が判別しに くい。 [0077] As is clear from these figures, when the fluorescence intensity at a specific number of cycles is plotted, the force that can be discriminated to some extent at a Mut concentration of 1% is the same as in the case of the y-intercept. It is difficult to recognize the significant difference in Peg.
[0078] 図 17に関して VICプローブの Cycle28における DeltaRn値と Mut濃度との相関関 係を示したグラフが図 33〜図 35に示されている。図 33は 0〜100%の範囲、図 34 は 0〜5%の範囲、図 35は 60〜100%の範囲をそれぞれ示したものである。  [0078] Regarding FIG. 17, graphs showing the correlation between the DeltaRn value in Cycle 28 of the VIC probe and the Mut concentration are shown in FIGS. Fig. 33 shows the range of 0-100%, Fig. 34 shows the range of 0-5%, and Fig. 35 shows the range of 60-100%.
[0079] これらの図から明らかなように、特定サイクル回数の蛍光強度をプロットした場合も y 切片の場合と同様に Mut濃度 80〜100%ではある程度判別可能であるが、近似直 線の傾きを用いた場合と比べて濃度の僅かな違いは判別しにく 、ものであった。  [0079] As is clear from these figures, even when the fluorescence intensity at a specific number of cycles is plotted, it can be distinguished to some extent at a Mut concentration of 80 to 100% as in the case of the y-intercept, but the slope of the approximate straight line is The slight difference in concentration compared to the case of using was difficult to distinguish.
[0080] 次に、比較例として一つの試料に一種のプローブのみを用いた場合について説明 する。突然変異 DNA(A3243G)の含有率の異なる試料 DNAを 18種類準備し、異 常遺伝子検出用の FAMプローブのみを用いて、全て同じ条件でタックマン PCR法 による定量 PCRを行 ヽ、各 DNA試料ごとに PCRサイクルと異常遺伝子検出用の FA Mプローブの蛍光強度との相関関係を測定した。この実験に関して、 Cycle値と FA Mプローブの DeltaRnとの相関関係を示すグラフが図 36に示されている。同図にお いて、横軸は PCRの Cycle数、縦軸は蛍光強度 (DeltaRn値)である。  [0080] Next, a case where only one type of probe is used for one sample will be described as a comparative example. Prepare 18 types of sample DNA with different contents of mutant DNA (A3243G), and perform quantitative PCR using the Taqman PCR method under the same conditions using only the FAM probe for detecting abnormal genes. The correlation between the PCR cycle and the fluorescence intensity of the FAM probe for detecting abnormal genes was measured. A graph showing the correlation between the Cycle value and the DeltaRn of the FAM probe for this experiment is shown in FIG. In the figure, the horizontal axis represents the number of PCR cycles, and the vertical axis represents the fluorescence intensity (DeltaRn value).
[0081] FAMプローブと VICプローブとを併用した場合の図 16と比較すると、 FAMプロ一 ブのみしか用いてない図 36では明らかに分解能が低いことがわかる。これは、 2種類 のプローブを併用した場合には正常遺伝子には正常遺伝子検出用プローブが、異 常遺伝子には異常遺伝子検出用プローブがそれぞれ優先的に適合するのに対して 、 1種類のプローブのみしか用いない場合には、適合性の低い方にもつくことがある ためだと推測される。  [0081] Compared to Fig. 16 when the FAM probe and VIC probe are used in combination, it can be seen that the resolution is clearly lower in Fig. 36 where only the FAM probe is used. This is because, when two types of probes are used in combination, a normal gene detection probe is preferentially matched to a normal gene and an abnormal gene detection probe is preferentially matched to an abnormal gene. This is probably because if it is only used, it may be attached to the less compatible one.
[0082] 図 36において、試料の Mut濃度毎に近似直線を求め、 FAMプローブの DeltaRn 値の近似直線の傾きと Mut濃度との相関関係を示したグラフが図 37〜図 39に示さ れている。図 37は 0〜100%の範囲、図 38は 0〜5%の範囲、図 39は 60〜100%の 範囲をそれぞれ示したものである。  In FIG. 36, graphs showing the correlation between the slope of the approximate straight line of the DeltaRn value of the FAM probe and the Mut concentration are shown in FIGS. 37 to 39 for each Mut concentration of the sample. . Fig. 37 shows the range of 0-100%, Fig. 38 shows the range of 0-5%, and Fig. 39 shows the range of 60-100%.
[0083] FAMプローブのみを用いた図 37〜図 39と、 FAMプローブと VICプローブとを併 用した図 18〜図 20とを比較すると、いずれの範囲においてもプローブを 2種併用し た図 18〜図 20の方が精度が高いことが明らかである。  [0083] Comparing Figures 37 to 39 using only the FAM probe with Figures 18 to 20 using the FAM probe and the VIC probe together, Figure 18 using two types of probes in any range. ~ It is clear that Figure 20 is more accurate.
[0084] 突然変異率を求める方法として、従来は A Ct法などが用いられていた。 1種のプロ ーブのみを用いて PCRを行った際の Cycle値とプローブの DeltaRn値の対数との相 関関係を示すグラフが図 46に示されている。 A Ct法では、先ず各 Mut濃度毎に所 定のしきい値に達した点をプロットし、標準曲線を作成する。 Mut濃度が未知である サンプルの Mut濃度を求める場合には、先に求めた標準曲線に基づき、その差分（ Δ Ct)よりサンプルの Mut濃度を求めるものである。 Δ Ct法は検出感度があまり高く なぐ 5%程度が限界であった。 [0084] As a method for obtaining the mutation rate, the A Ct method or the like has been conventionally used. 1 kind of professional A graph showing the correlation between the Cycle value and the logarithm of the DeltaRn value of the probe when PCR is performed using only the probe is shown in FIG. In the A Ct method, a standard curve is created by first plotting points that have reached a certain threshold value for each Mut concentration. When obtaining the Mut concentration of a sample whose Mut concentration is unknown, the Mut concentration of the sample is obtained from the difference (ΔCt) based on the previously obtained standard curve. The limit of the detection sensitivity of the ΔCt method is about 5%, which is too high.
[0085] その結果、本発明が適用された計測装置によれば、突然変異 DNA含有率 0. 5% の DNA試料でも、突然変異 DNA含有率 0%の DNA試料と有為差が生ずることが 認められ、計測可能な Mut濃度％の下限は 0. 5%を達成することができた。これは、 従来の計測装置の下限が 10%程度であったことを考慮すると、飛躍的な進歩をもた らせたことが理解されるであろう。このような進歩をもたらせた理由としては、現在も鋭 意究明中ではあるが、同一の DNA試料中に正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝 子適合型プローブとの双方を混入して PCR法を実施したことにより、双方のプローブ が互いに影響を及ぼし合って、他方のプローブが予定しない塩基列と結合することを 妨げるためではないかと推測されている。し力も、本発明が適用された計測装置によ れば、計測毎のデータのばらつきが少なぐ誤差が少なく再現性の高いデータが得ら れる。 As a result, according to the measuring device to which the present invention is applied, even a DNA sample with a mutant DNA content of 0.5% may cause a significant difference from a DNA sample with a mutant DNA content of 0%. The lower limit of measurable Mut concentration% was 0.5%. It will be understood that this has made tremendous progress, considering that the lower limit of conventional measuring devices was around 10%. The reason for this advancement is still under intensive investigation, but PCR is performed by mixing both normal and abnormal gene compatible probes in the same DNA sample. It has been speculated that the two probes may affect each other and prevent the other probe from binding to an unintended base sequence. As for the force, according to the measuring device to which the present invention is applied, data having a small variation in data for each measurement and an error can be obtained with high reproducibility.
[0086] [本発明の応用]  [0086] [Application of the present invention]
本発明は、ヒト ·動物'植物の様々な DNAの突然変異を高 、精度で検出するのに 応用することができる。よく知られているように、 DNAは細胞の核とミトコンドリアとに 存在する。細胞とミトコンドリア DNAの構造が図 40に示されている。図において、 10 は細胞、 11は核、 12はミトコンドリア、 13はミトコンドリア DNA("mtDNA"とも表され る）である。また、ミトコンドリア DNAの DNAマップが図 41 (出典： MITOMAP http: //www. gen . emory . edu/mitomap .html)に示されている。検証に際して使用した例は、 ミトコンドリア病の一つである MELASに関与する 3243Gにおいて DNA組み換えが どの程度の割合で起きているかを検査するのに応用できる。  The present invention can be applied to detect various DNA mutations in human / animal plants with high accuracy. As is well known, DNA exists in the cell nucleus and mitochondria. The structure of the cell and mitochondrial DNA is shown in Figure 40. In the figure, 10 is a cell, 11 is a nucleus, 12 is a mitochondria, and 13 is a mitochondrial DNA (also referred to as “mtDNA”). The DNA map of mitochondrial DNA is shown in Figure 41 (Source: MITOMAP http: //www.gen.emory.edu/mitomap.html). The example used for verification can be applied to examine the rate of DNA recombination occurring in 3243G, which is involved in MELAS, a mitochondrial disease.
[0087] 年齢によるミトコンドリア DNAのダメージの増加と、年齢による呼吸活性の減少との 相関関係を予測するグラフが図 42, 43 (出典： Douglas C, Wallace Ann.Rev, Bioche m.， 1992)に示されている。すなわち、図 42は年齢と mtDNAへのダメージとの相関 関係を予測したグラフであり、図 43は年齢と酸ィ匕的リン酸化との相関関係を予測した グラフである。なお、このグラフに示されている値は実測値ではなぐ従前より知られ ている予測に基づくものである。 [0087] Figures 42, 43 (Source: Douglas C, Wallace Ann. Rev, Bioche) predict the correlation between increased mitochondrial DNA damage with age and decreased respiratory activity with age. m., 1992). That is, FIG. 42 is a graph predicting the correlation between age and damage to mtDNA, and FIG. 43 is a graph predicting the correlation between age and acid phosphorylation. Note that the values shown in this graph are based on previously known predictions rather than actual measurements.
[0088] 先に述べたように、本願に係る突然変異率計測方法は癌の早期発見にも応用可能 である。発癌の過程を示す模式図が図 44に示されている。図において、 14は正常細 胞、 15は癌化細胞である。従前の検出方法では検出感度が低ぐ癌細胞が大幅に 増殖した後（図 44 · Βの段階)でないと検出不可能であった。しかし本願によれば従 前の方法では検出できな力つた早期（図 44 · Αの段階）に細胞の癌化を発見すること が可能であると考えられる。 [0088] As described above, the mutation rate measurement method according to the present application can be applied to early detection of cancer. A schematic diagram showing the process of carcinogenesis is shown in FIG. In the figure, 14 is a normal cell and 15 is a cancerous cell. In the conventional detection method, cancer cells with low detection sensitivity could not be detected until after significant proliferation (Fig. 44 · 段 階 stage). However, according to the present application, it is considered possible to detect canceration of cells at an early stage (step 段 階 in Fig. 44) that cannot be detected by the conventional method.
産業上の利用可能性  Industrial applicability
[0089] 以上、本発明の突然変異率計測方法によれば、 2種のプローブを併用することによ り、突然変異率を高い感度で計測することが可能である。また、突然変異検出プロ一 ブと正常遺伝子検出プローブとを併用することにより、突然変異率の高低に関わらず 精度の高 、計測が可能である。 As described above, according to the mutation rate measuring method of the present invention, the mutation rate can be measured with high sensitivity by using two types of probes together. In addition, by using a mutation detection probe and a normal gene detection probe in combination, measurement can be performed with high accuracy regardless of the level of mutation.
図面の簡単な説明  Brief Description of Drawings
[0090] [図 1]従来装置と本発明装置とを比較して示す図である。 FIG. 1 is a diagram showing a comparison between a conventional apparatus and the apparatus of the present invention.
[図 2]本発明の全体の流れを示すゼネラルフローチャートである。  FIG. 2 is a general flowchart showing the overall flow of the present invention.
[図 3]特徴量生成処理の詳細フローチャートである。  FIG. 3 is a detailed flowchart of a feature value generation process.
[図 4]特徴量照合処理の詳細フローチャートである。  FIG. 4 is a detailed flowchart of feature amount matching processing.
[図 5]参照テーブルの構成例を示す図である。  FIG. 5 is a diagram showing a configuration example of a reference table.
[図 6]基本 PCR法の概念図である。  FIG. 6 is a conceptual diagram of the basic PCR method.
[図 7]タックマン PCR法の概念図である。  FIG. 7 is a conceptual diagram of Tackman PCR method.
[図 8]Cycle値と DeltaRn (— 0. 2〜1. 8)との関係を示すグラフである。  FIG. 8 is a graph showing the relationship between Cycle value and DeltaRn (—0.2 to 1.8).
[図 9]Cycle値と DeltaRn (— 0. 1〜0. 5)との関係を示すグラフである。  FIG. 9 is a graph showing the relationship between the Cycle value and DeltaRn (—0.1 to 0.5).
[図 10]Cycle値と DeltaRn値との関係を示すグラフである。  FIG. 10 is a graph showing the relationship between Cycle value and DeltaRn value.
[図 l l]Cycle値と DeltaRn微分値との関係を示すグラフである。  [Fig. L l] A graph showing the relationship between the Cycle value and the DeltaRn differential value.
[図 12]Cycle値と DeltaRn微分値 (弁別領域）との関係を示すグラフである。 [図 13]Cycle値と DeltaRn値 (弁別領域）との関係を示すグラフである。 FIG. 12 is a graph showing the relationship between the Cycle value and the DeltaRn differential value (discrimination area). FIG. 13 is a graph showing the relationship between Cycle value and DeltaRn value (discrimination area).
[図 14]Cycle値と DeltaRn値（直線近似値）との関係を示すグラフである。  FIG. 14 is a graph showing the relationship between Cycle value and DeltaRn value (linear approximation).
圆 15]近似直線と各種特徴量との関係を表にして示す図である。 [15] This is a table showing the relationship between approximate lines and various feature quantities.
[図 16]FAMプローブと VICプローブとを併用し PCRを行った際の Cycle値と FAM プローブの DeltaRnとの相関関係を示すグラフである。  FIG. 16 is a graph showing the correlation between the Cycle value and DeltaRn of the FAM probe when PCR is performed using a FAM probe and a VIC probe in combination.
[図 17]FAMプローブと VICプローブとを併用し PCRを行った際の Cycle値と VICプ ローブの DeltaRnとの相関関係を示すグラフである。  FIG. 17 is a graph showing the correlation between the Cycle value and DeltaRn of the VIC probe when PCR is performed using both the FAM probe and the VIC probe.
[図 18]図 16における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（0〜1 00%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 18 is a graph showing the correlation between the slope of the linear part of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (0 to 100%).
[図 19]図 16における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（60〜 100%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 19 is a graph showing the correlation between the slope of the linear portion of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (60 to 100%).
[図 20]図 16における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（0〜5 %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 20 is a graph showing the correlation between the slope of the linear portion of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (0 to 5%).
[図 21]図 17における VICプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（0〜10 0%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 21 is a graph showing the correlation between the slope of the linear portion of the DeltaRn value of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (0 to 100%).
[図 22]図 17における VICプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（60〜1 00%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 22 is a graph showing the correlation between the slope of the linear portion of the DeltaRn value of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (60 to 100%).
[図 23]図 17における VICプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（0〜5 %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 23 is a graph showing the correlation between the slope of the straight line portion of the DeltaRn value of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (0 to 5%).
[図 24]図 16における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の y切片と Mut濃度（0〜 100%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 24 is a graph showing the correlation between the y-intercept of the linear part of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (0 to 100%).
[図 25]図 16における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の y切片と Mut濃度（0〜 5%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 25 is a graph showing the correlation between the y-intercept of the linear part of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (0 to 5%).
[図 26]図 16における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の y切片と Mut濃度（60 〜100%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 26 is a graph showing the correlation between the y-intercept of the linear part of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (60 to 100%).
[図 27]図 16における FAMプローブの Cycle28の DeltaRn値と Mut濃度（0〜： L00 %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 27 is a graph showing the correlation between the DeltaRn value of Cycle 28 of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (0 to: L00%).
[図 28]図 16における FAMプローブの Cycle28の DeltaRn値と Mut濃度（0〜5%) との相関関係を示すグラフである。 [Fig.28] DeltaRn value and Mut concentration (0-5%) of Cycle28 of FAM probe in Fig.16 It is a graph which shows correlation with.
[図 29]図 16における FAMプローブの Cycle28の DeltaRn値と Mut濃度（60〜： LOO %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 29 is a graph showing the correlation between the DeltaRn value of Cycle 28 of the FAM probe in FIG. 16 and the Mut concentration (60 to: LOO%).
[図 30]図 17における VICプローブの DeltaRn値の直線部の y切片と Mut濃度（0〜1 00%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 30 is a graph showing the correlation between the y-intercept of the linear part of the DeltaRn value of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (0 to 100%).
[図 31]図 17における VICプローブの DeltaRn値の直線部の y切片と Mut濃度（0〜5 %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 31 is a graph showing the correlation between the y-intercept of the linear part of the DeltaRn value of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (0 to 5%).
[図 32]図 17における VICプローブの DeltaRn値の直線部の y切片と Mut濃度（60〜 100%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 32 is a graph showing the correlation between the y-intercept of the linear part of the DeltaRn value of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (60 to 100%).
[図 33]図 17における VICプローブの Cycle28の DeltaRn値と Mut濃度（0〜： LOO% )との相関関係を示すグラフである。  FIG. 33 is a graph showing the correlation between the DeltaRn value of Cycle 28 of the VIC probe in FIG. 17 and the Mut concentration (0 to: LOO%).
[図 34]図 17における VICプローブの Cycle28の DeltaRn値と Mut濃度（0〜5%)と の相関関係を示すグラフである。  FIG. 34 is a graph showing the correlation between the DeltaRn value of Cycle 28 of the VIC probe and the Mut concentration (0 to 5%) in FIG.
[図 35]図 17における VICプローブの Cycle28の DeltaRn値と Mut濃度（60〜： LOO %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 35 is a graph showing the correlation between the DeltaRn value of Cycle 28 of the VIC probe and the Mut concentration (60 to: LOO%) in FIG.
[図 36]FAMプローブのみを用いて PCRを行った際の Cycle値と FAMプローブの D eltaRnとの相関関係を示すグラフである。  FIG. 36 is a graph showing the correlation between the Cycle value and DeltaRn of the FAM probe when PCR is performed using only the FAM probe.
[図 37]図 36における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（0〜1 00%)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 37 is a graph showing the correlation between the slope of the linear part of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 36 and the Mut concentration (0 to 100%).
[図 38]図 36における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（0〜5 %)との相関関係を示すグラフである。  FIG. 38 is a graph showing the correlation between the slope of the linear part of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG. 36 and the Mut concentration (0 to 5%).
[図 39]図 36における FAMプローブの DeltaRn値の直線部の傾きと Mut濃度（60〜 [FIG. 39] The slope of the DeltaRn value of the FAM probe in FIG.
100%)との相関関係を示すグラフである。 100%) is a graph showing the correlation.
[図 40]細胞とミトコンドリア DNAの構造を示す模式図である。  FIG. 40 is a schematic diagram showing the structure of cells and mitochondrial DNA.
[図 41]ヒト mtDNAの DNAマップである。  FIG. 41 is a DNA map of human mtDNA.
[図 42]加齢と損傷 mtDNAとの関係を示すグラフである。  FIG. 42 is a graph showing the relationship between aging and damaged mtDNA.
[図 43]加齢と酸ィ匕的りん酸化との関係を示すグラフである。  FIG. 43 is a graph showing the relationship between aging and acid phosphorylation.
圆 44]発癌の過程を示す模式図である。 [図 45]FAMの化学構造式を示す図である。 圆 44] It is a schematic diagram showing the process of carcinogenesis. FIG. 45 shows a chemical structural formula of FAM.
[図 46] 1種のプローブのみを用いて PCRを行った際の Cycle値とプローブの DeltaR n値の対数との相関関係を示すグラフである（ Δ Ct法)。  FIG. 46 is a graph showing the correlation between the Cycle value and the logarithm of the DeltaR n value of the probe when PCR was performed using only one type of probe (ΔCt method).
符号の説明 Explanation of symbols
1 共通容器  1 Common container
la 異常遺伝子増殖用容器  la Abnormal gene growth container
lb 正常遺伝子増殖用容器  lb Normal gene growth container
2a 従来の自動増殖定量化装置  2a Conventional automatic growth quantification device
2b 本発明の自動増殖定量化装置  2b Automatic growth quantification device of the present invention
3a 従来の処理を行うパソコン  3a PC for conventional processing
3b 本発明の処理を行うパソコン  3b Personal computer performing the processing of the present invention
4 二重鎖  4 duplex
5a, 5b 単鎖  5a, 5b single chain
6 フォワードプライマ  6 Forward primer
7 リバースプライマ  7 Reverse primer
8 蛍光色素  8 Fluorescent dye
9 タックマンプローブ  9 Tackman probe
10 細胞  10 cells
11 核  11 nuclear
12 ミトコンドリア  12 Mitochondria
13 ミトコンドリア DNA  13 Mitochondrial DNA
14 正常細胞  14 Normal cells
15 癌化細胞  15 Cancerous cells

Claims

請求の範囲 The scope of the claims
[1] 検査対象となる DNA試料中の特定塩基配列部分を、正常遺伝子適合型プローブ と異常遺伝子適合型プローブとを使用して複製増殖させる第 1のステップと、 複製増殖後における正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分を定量ィ匕す る第 2のステップと、  [1] A first step of replicating and proliferating a specific nucleotide sequence portion in a DNA sample to be examined using a normal gene-compatible probe and an abnormal gene-compatible probe, and normal gene components and A second step to quantify Z or abnormal gene components;
定量化された正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分に基づいて当初の DNA試料中における特定遺伝子に関する突然変異率を同定する第 3のステップと、 を有する突然変異率計測方法であって、  A third step of identifying a mutation rate for a specific gene in the original DNA sample based on the quantified normal gene component and the Z or abnormal gene component, comprising:
第 1のステップにおける複製増殖は、同一の DNA試料に対して、正常遺伝子適合 型プローブと異常遺伝子適合型プローブとの双方を混入した状態にて行われる、こと を特徴とする突然変異率計測方法。  The method for measuring mutation rate, characterized in that the replication growth in the first step is performed in the same DNA sample in a state in which both a normal gene compatible probe and an abnormal gene compatible probe are mixed. .
[2] 第 1のステップにおける特定塩基配列部分の複製増殖は PCR法を使用して行われ る、ことを特徴とする請求項 1に記載の突然変異率計測方法。 [2] The method for measuring mutation rate according to [1], wherein the replication of the specific nucleotide sequence in the first step is performed using PCR.
[3] 第 1のステップにおける特定塩基配列部分の複製増殖に使用される PCR法がタツ クマン PCR法であり、かつ [3] The PCR method used for replicating the specific nucleotide sequence in the first step is the Taqman PCR method, and
正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブと力 タックマンプローブ と置換されたものである、ことを特徴とする請求項 2に記載の突然変異率計測方法。  3. The mutation rate measuring method according to claim 2, wherein the normal gene compatible probe, the abnormal gene compatible probe, and the force Taqman probe are substituted.
[4] 第 1のステップにおける特定塩基配列部分の複製増殖に使用される PCR法が基本[4] Based on the PCR method used for replication of the specific nucleotide sequence in the first step
PCR法であり、かつ PCR method and
正常遺伝子適合型プローブと異常遺伝子適合型プローブと力 フォワードプライマ 又はリバースプライマと置換されたものである、ことを特徴とする請求項 2に記載の突 然変異率計測方法。  3. The method for measuring a mutation rate according to claim 2, wherein the normal gene-matching probe, the abnormal gene-matching probe, and the force forward primer or reverse primer are substituted.
[5] 第 1のステップにて使用される正常遺伝子適合型プローブおよび Zまたは異常遺 伝子適合型プローブには識別子が付与されており、かつ  [5] The normal gene-compatible probe and the Z or abnormal gene-compatible probe used in the first step have an identifier, and
第 2のステップにおける正常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分の定量化 は識別子に基づいて行われる、ことを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載の突 然変異率計測方法。  The method for measuring a mutation rate according to any one of claims 1 to 4, wherein the normal gene component and the Z or abnormal gene component in the second step are quantified based on the identifier.
[6] 識別子が蛍光色素である、ことを特徴とする請求項 5に記載の突然変異率計測方 法。 [6] The mutation rate measurement method according to claim 5, wherein the identifier is a fluorescent dye. Law.
[7] 第 3のステップにおける突然変異率の同定は、第 2のステップにて定量ィ匕された正 常遺伝子成分および Zまたは異常遺伝子成分に基づいて生成された所定の特徴量 と複数の基準試料のそれぞれに関して予め生成された対応する所定の特徴量とを 関係付けしてなる参照テーブルとの照合により行われる、ことを特徴とする請求項 1〜 6の 、ずれかに記載の突然変異率計測方法。  [7] The mutation rate in the third step is identified by a predetermined feature quantity and multiple criteria generated based on the normal gene component and the Z or abnormal gene component quantified in the second step. The mutation rate according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the mutation rate is performed by collating with a reference table formed by associating a corresponding predetermined feature amount generated in advance for each of the samples. Measurement method.
[8] 所定の特徴量が、サイクル回数に対する正常遺伝子成分又は異常遺伝子成分の 変化率が規定値を超えかつその値が安定している領域における成分対サイクル回 数の近似直線の傾きである、ことを特徴とする請求項 7に記載の突然変異率計測方 法。  [8] The predetermined feature amount is the slope of the approximate line of the component number versus the cycle number in a region where the change rate of the normal gene component or the abnormal gene component with respect to the cycle number exceeds the specified value and the value is stable. The method for measuring a mutation rate according to claim 7, wherein:
[9] 所定の特徴量が、サイクル回数に対する正常遺伝子成分又は異常遺伝子成分の 変化率が規定値を超えかつその値が安定している領域における成分対サイクル回 数の近似直線の切片である、ことを特徴とする請求項 7に記載の突然変異率計測方 法。  [9] The predetermined feature amount is an intercept of an approximate straight line of the component number versus the cycle number in a region where the change rate of the normal gene component or the abnormal gene component with respect to the cycle number exceeds a specified value and the value is stable. The method for measuring a mutation rate according to claim 7, wherein:
[10] 検査対象となる DNA試料が、ヒトの DNA又はヒトのミトコンドリア DNAである、こと を特徴とする請求項 1〜9のいずれかに記載の突然変異率計測方法。  10. The mutation rate measuring method according to any one of claims 1 to 9, wherein the DNA sample to be examined is human DNA or human mitochondrial DNA.
[11] それぞれ識別子として固有の蛍光色素が付与された正常遺伝子適合型プローブと 異常遺伝子適合型プローブとの双方がタックマンプローブとして混入された DNA試 料に対して、タックマン PCR法に相当する処理を施して、複数サイクルに亘り、 DNA 試料を複製増殖させ、同時に、各増殖サイクル毎の少なくとも異常遺伝子適合型プ ローブに関する蛍光強度を計測する DNA増殖計測器と、  [11] A DNA sample in which both a normal gene-matched probe and an abnormal gene-matched probe each having a unique fluorescent dye as an identifier are mixed as tackman probes is subjected to a treatment equivalent to the tackman PCR method. A DNA proliferation measuring instrument that replicates and propagates a DNA sample over a plurality of cycles, and at the same time, measures fluorescence intensity of at least an abnormal gene-compatible probe for each growth cycle;
DNA増殖計測器における各サイクル毎の少なくとも異常遺伝子適合型プローブに 関する蛍光強度データ計測値をサンプリングするサンプリング手段と、  Sampling means for sampling fluorescence intensity data measurement values for at least an abnormal gene compatible probe for each cycle in a DNA proliferation measuring instrument,
サンプリングされた一連の蛍光強度データ計測値を時間軸方向へと微分処理する 微分処理手段と、  Differential processing means for differentially processing a series of sampled fluorescence intensity data measurements in the time axis direction;
微分処理手段にて生成される一連の微分値データを所定のしきい値を基準として 二値ィヒすることにより、計測信頼性の高いサイクル領域を弁別する弁別処理手段と、 弁別されたサイクル領域に存在する一連の蛍光強度データ計測値列のなす曲線を 直線近似する直線近似化手段と、 Discrimination processing means for discriminating cycle areas with high measurement reliability by binarizing a series of differential value data generated by the differential processing means with a predetermined threshold as a reference, and the discriminated cycle areas The curve formed by a series of fluorescence intensity data measurement values existing in Linear approximation means for linear approximation;
直線近似化手段にて得られる近似直線の傾きを求める傾き取得手段と、 傾き取得手段にて取得された近似直線の傾きを、突然変異率の異なる複数の基準 試料のそれぞれについて予め求めておいた近似直線の傾きと照合することにより、 当該検査対象試料の突然変異率を同定する同定手段と、を具備することを特徴とす る突然変異率計測装置。  The slope acquisition means for obtaining the slope of the approximate line obtained by the straight line approximation means, and the slope of the approximate line obtained by the slope acquisition means were previously obtained for each of a plurality of reference samples having different mutation rates. A mutation rate measuring apparatus comprising: an identification unit that identifies a mutation rate of the sample to be examined by checking with an inclination of an approximate straight line.
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