WO2006027463A2 - Biochip for determining sensitivity to an anticancer drug - Google Patents

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WO2006027463A2 PCT/FR2005/002142 FR2005002142W WO2006027463A2 WO 2006027463 A2 WO2006027463 A2 WO 2006027463A2 FR 2005002142 W FR2005002142 W FR 2005002142W WO 2006027463 A2 WO2006027463 A2 WO 2006027463A2
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Chantal D'incan
Valérie SYLVAIN-VIDAL
Véronique VIDAL
Marie Agier
Yves-Jean Bignon
Christian Pradeyrol
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    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism

Abstract

The invention relates to a solid substrate coated with a set of fragments representative of genes whereof the expression profile in a patient with cancer enables the chemosensitivity or chemoresistance to at least one given anticancer drug to be predicted. The invention also relates to a kit comprising one such substrate, and to a method for the in vitro prediction of the therapeutic response from a tumorous specimen of one such patient, said method using the inventive solid substrate.

Description

BIOPUCE DE DETERMINATION D'UNE SENSIBILITE A UN BIOPUCE DETERMINING A SENSITIVITY TO A
MEDICAMENT ANTICANCEREUX ET SON PROCEDEANTICANCER DRUG AND METHOD THEREOF
D'UTILISATIONUSE
La présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet atteint d'un cancer permet de prédire une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins un médicament anticancéreux donné, ainsi qu'un kit comprenant un tel support ; l'invention a également pour objet un procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à partir d'un prélèvement tumoral chez un tel sujet, ledit procédé mettant en œuvre l'utilisation du support solide.The subject of the present invention is a solid support coated with a set of representative gene fragments whose expression profile for all of these genes in a subject suffering from a cancer makes it possible to predict chemosensitivity or chemoresistance to minus a given anti-cancer drug, as well as a kit comprising such a carrier; the invention also relates to a method for in vitro prediction of the therapeutic response from a tumor sample in such a subject, said method implementing the use of the solid support.
Le cancer peut être défini de façon très large comme une maladie liée à la prolifération et la diffusion incontrôlée de cellules de l'organisme devenues anormales : ces cellules anormales, dites « malignes », prolifèrent de manière anarchique à partir d'un foyer primitif, qui peut récidiver localement après son ablation, s'étendre aux tissus voisins et essaimer à distance (métastases).Cancer can be defined very broadly as a disease linked to the proliferation and uncontrolled spread of abnormal cells of the body: these abnormal cells, called "malignant", proliferate anarchically from a primitive home, who can relapse locally after removal, extend to adjacent tissues and spread at a distance (metastases).
Le cancer touche environ 10 millions de personnes dans le monde. Plus de 4,4 millions des cas proviennent d'Asie. L'Europe compte 2,8 millions de cas, l'Amérique du Nord 1,4 millions et l'Afrique 627 000 cas. Le cancer est l'une des premières causes de mortalité dans les pays développés ; en Europe et aux Etats- Unis, on estime qu'une personne sur cinq décédera d'un cancer. L'incidence des cancers sur les 100 dernières années paraît être en progression, mais cette observation doit être pondérée par le fait que la probabilité de développer un cancer augmente avec l'âge, et que globalement la proportion de la population âgée est aussi en augmentation.Cancer affects about 10 million people worldwide. More than 4.4 million cases come from Asia. Europe has 2.8 million cases, North America 1.4 million and Africa 627 000 cases. Cancer is one of the leading causes of death in developed countries; in Europe and the United States, it is estimated that one in five people will die of cancer. The incidence of cancer over the last 100 years seems to be increasing, but this observation must be balanced by the fact that the probability of developing cancer increases with age, and that overall the proportion of the elderly population is also increasing .
En France, les cancers représentent la première cause de mortalité chez les hommes et la deuxième chez les femmes après . les maladies cardiovasculaires. Quatre cancers sont responsables de près de la moitié de tous les décès par cancer en France, à savoir le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du poumon et le cancer du côlon-rectum. Parmi les autres cancers, on compte par exemple le cancer de la lèvre-bouche-pharynx, de la vessie, des reins, le mélanome de la peau, le cancer de l'estomac, la leucémie, le cancer du foie, du système nerveux central, du col de l'utérus, de l'œsophage, du pancréas, des ovaires, du larynx, de la thyroïde, etc...In France, cancers are the leading cause of death for men and the second for women afterwards. cardiovascular illnesses. Four cancers account for nearly half of all cancer deaths in France, namely breast cancer, prostate cancer, lung cancer and colorectal cancer. Other cancers include, but are not limited to, cancer of the lip-mouth-pharynx, bladder, kidneys, skin melanoma, stomach cancer, leukemia, liver cancer, nervous system central, cervix, esophagus, pancreas, ovaries, larynx, thyroid, etc.
En général, la plupart des cancers sont traités par quatre moyens thérapeutiques : la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'hoπnonothérapie. Lorsque la tumeur est localisée et ne possède pas les caractéristiques d'invasivité ou de métastase, elle est dite bénigne ; dans le cas contraire on parle de tumeur maligne ou de cancer ; la chimiothérapie cytotoxique ne s'adresse qu'à ce dernier cas. Les médicaments chimiothérapeutiques sont des médicaments interférant dans le métabolisme et la vie cellulaire et qui, de ce fait, sont cytotoxiques : c'est par ce mécanisme que la chimiothérapie permet d'inhiber la croissance tumorale. Le plus souvent, la chimiothérapie est administrée par voie systémique, ce qui explique que la toxicité qu'elle induit soit générale.In general, most cancers are treated by four therapeutic means: surgery, chemotherapy, radiotherapy and hohnotherapy. When the tumor is localized and does not have the characteristics of invasiveness or metastasis, it is called benign; in the opposite case we speak of malignant tumor or cancer; cytotoxic chemotherapy is only for the latter case. Chemotherapy drugs are drugs interfering in metabolism and cell life and, as such, are cytotoxic: it is through this mechanism that chemotherapy can inhibit tumor growth. Most often, chemotherapy is administered systemically, which explains why the toxicity it induces is general.
Une conséquence importante, liée à la propriété principale de ces produits sur la division cellulaire, est d'affecter de la même façon les cellules normales et plus particulièrement les tissus présentant un taux de renouvellement important. La majorité des effets toxiques observés, à savoir une myélosuppression, des troubles de la cicatrisation, un retard de croissance (enfants), la stérilité, la tératogénicité (malformations), l'alopécie et l'atteinte des muqueuses des voies digestives, découlent de cette propriété. Ces substances peuvent en elles-mêmes êtres carcinogéniques. De plus, une destruction cellulaire massive entraînant un catabolisme des purines important, la précipitation tabulaire des urates, peut conduire à une défaillance rénale. Enfin, ces produits provoquent très souvent des nausées et vomissements sévères qui diminuent la compliance (mesure de la souplesse et des possibilités de distension d'un réservoir élastique tels que la vessie ou les poumons) des patients. En outre, d'autres effets toxiques sont observables de façon spécifique suivant les produits. Comme exemple de médicaments majeurs en chimiothérapie on peut citer les agents alkylants (oxazaphosphorines, nitroso-urées,...), les antibiotiques (anthracyclines, anthracènediones, actinomycine D, bléomycine sulfate, ....), les vinca-alcaloïdes (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine,...), les dérivés du platine (cisplatine, carboplatine, oxaliplatine,...), les antimétabolites (5-fluoro- uracile, méthotrexate, 6-mercaptopurine...), les taxanes (paclitaxel, docétaxel), les dérivés de la camptothécine (irinotécan, topotécan,...) et les epipadophyllotoxines (etoposide, teniposide).An important consequence, related to the main property of these products on the cell division, is to affect in the same way the normal cells and more particularly the tissues having a significant turnover rate. The majority of toxic effects observed, namely myelosuppression, healing disorders, growth retardation (children), sterility, teratogenicity (malformations), alopecia and damage to the mucous membranes of the digestive tract, result from this property. These substances can in themselves be carcinogenic. In addition, massive cell destruction resulting in significant catabolism of purines, the tabular precipitation of urates, can lead to renal failure. Finally, these products very often cause severe nausea and vomiting that decrease the compliance (measurement of the flexibility and possibilities of stretching of an elastic reservoir such as the bladder or lungs) patients. In addition, other toxic effects are observable specifically depending on the products. Examples of major drugs in chemotherapy include alkylating agents (oxazaphosphorines, nitrosoureas, ...), antibiotics (anthracyclines, anthracenediones, actinomycin D, bleomycin sulfate, ....), vinca-alkaloids (vincristine , vinblastine, vindesine, vinorelbine, ...), platinum derivatives (cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, ...), antimetabolites (5-fluorouracil, methotrexate, 6-mercaptopurine ...), taxanes ( paclitaxel, docetaxel), camptothecin derivatives (irinotecan, topotecan, etc.) and epipadophyllotoxins (etoposide, teniposide).
Plus particulièrement, les taxanes sont des dérivés de plantes (if du Pacifique et if européen) très actifs sur les tumeurs du sein et de l'ovaire mais relativement toxiques : neuropathies, aplasies (arrêt du développement ou développement parfois insuffisant d'un tissu) parfois profondes et risque de survenue d'oedèmes des membres voire des séreuses (épanchements pleuraux et péricardiques). Les taxanes inhibent la formation des microtubules et entravent donc les transports intracellulaires ainsi que la mitose. Les taxanes comprennent le docétaxel, qui a d'abord été indiqué dans le traitement des stades localement avancés ou métastatiques de cancers du sein en monothérapie, puis en association avec les anthracyclines.More particularly, taxanes are derivatives of plants (Pacific yew and European yew) very active on breast and ovarian tumors but relatively toxic: neuropathies, aplasia (developmental arrest or sometimes insufficient development of a tissue) sometimes deep and risk of edema of limbs or even serous (pleural and pericardial effusions). Taxanes inhibit the formation of microtubules and thus hinder intracellular transport as well as mitosis. Taxanes include docetaxel, which was first indicated in the treatment of locally advanced or metastatic stages of breast cancer monotherapy, and then in combination with anthracyclines.
Chez la femme, le cancer du sein et le plus fréquent : on note ainsi 43 000 nouveaux cas et 11 000 décès par an en France. Il est la première cause de décès par cancer chez la femme. Les échecs thérapeutiques sont dus aux mécanismes de chimiorésistance développés chez certaines patientes. Un effort est donc fait pour développer de nouvelles molécules thérapeutiques afin d'augmenter le taux de survie.In women, breast cancer and the most common: there are thus 43,000 new cases and 11,000 deaths per year in France. It is the leading cause of cancer death in women. The therapeutic failures are due to the mechanisms of chemoresistance developed in some patients. An effort is therefore made to develop new therapeutic molecules to increase the survival rate.
Son efficacité démontrée, le docétaxel a été ensuite incorporé dans le traitement des stades précoces en adjuvant (chimiothérapie réalisée après chirurgie) et en néoadjuvant (chimiothérapie « d'induction », ou « première », c'est-à-dire avant chirurgie). Il a ainsi été montré une amélioration de 30 % de la survie et une diminution de 28 % du risque de rechute en faveur de l'association de docétaxel chez les femmes atteintes de cancers du sein à un stade précoce avec atteinte ganglionnaire, par rapport au traitement de référence en situation adjuvante (étude BIRG 001, « San Antonio Breast Cancer Symposium », décembre 2003). Le docétaxel semble être le seul taxane à démontrer un bénéfice en termes de survie sans rechute, quel que soit le statut hormonal de la patiente.Its proven efficacy, docetaxel was then incorporated in the treatment of early stages of adjuvant (chemotherapy performed after surgery) and neoadjuvant (chemotherapy "induction" or "first", that is to say before surgery) . It has thus been shown a 30% improvement in survival and a A 28% decrease in the risk of relapse for the combination of docetaxel in women with early-stage node-positive breast cancer, compared to adjuvant standard therapy (BIRG 001, "San Antonio Breast Cancer Symposium, December 2003). Docetaxel appears to be the only taxane to demonstrate a benefit in terms of relapse-free survival, regardless of the patient's hormonal status.
Dans les protocoles de chimiothérapie néoadjuvante, l'administration de docétaxel après des anthracyclines permet une amélioration de la survie, une meilleure réponse clinique entraînant un plus grand nombre de traitements conservateurs et une augmentation du taux de réponse complète histologique. L'efficacité du docétaxel est donc démontrée dans les formes avancées et précoces du cancer du sein.In neoadjuvant chemotherapy regimens, the administration of docetaxel after anthracyclines results in improved survival, a better clinical response resulting in more conservative treatments and an increase in the rate of complete histological response. The efficacy of docetaxel is therefore demonstrated in advanced and early forms of breast cancer.
Toutefois, la cytotoxicité liée à l'utilisation d'un anticancéreux tel que le docétaxel implique la nécessité d'identifier les patientes qui peuvent bénéficier de ce type de traitement ; en effet, les cellules tumorales peuvent être résistantes à un traitement de chimiothérapie, lequel traitement s'avère alors inutile et toxique pour le patient. Comme moyen de prédiction, on peut citer par exemple l'étude in vitro des modifications cellulaires causées par un agent anticancéreux, qui se fait sur des cellules isolées qui, après incubation, peuvent être altérées par la présence d'un anticancéreux, ou bien au contraire résistantes à cet anticancéreux. La lecture de ces modifications métaboliques peut se faire par l'étude des variations dans l'incorporation d'un nucléotide marqué tel que la thymidine traitée. Cette étude in vitro peut se faire également à partir de cultures de cellules. Après dissociation cellulaire d'un fragment tumoral, on ensemence des boîtes de Pétri contenant un milieu nutritif. La pousse des cultures est plus ou moins inhibée par l'agent anticancéreux qui peut être mis en contact à des concentrations variables. Toutefois, ces conditions sont loin de celles des traitements in vivo.However, the cytotoxicity linked to the use of an anticancer drug such as docetaxel implies the need to identify the patients who can benefit from this type of treatment; indeed, the tumor cells can be resistant to a chemotherapy treatment, which treatment is then unnecessary and toxic for the patient. As a means of prediction, there may be mentioned, for example, the in vitro study of the cellular modifications caused by an anti-cancer agent, which is carried out on isolated cells which, after incubation, may be altered by the presence of an anti-cancer agent, or otherwise resistant to this anticancer. The reading of these metabolic changes can be done by studying variations in the incorporation of a labeled nucleotide such as treated thymidine. This in vitro study can also be done from cell cultures. After cellular dissociation of a tumor fragment, Petri dishes containing a nutrient medium are inoculated. Crop growth is more or less inhibited by the anticancer agent which can be contacted at varying concentrations. However, these conditions are far from those of in vivo treatments.
Ainsi, il existe un réel besoin de pouvoir disposer d'une nouvelle technique qui permette de déterminer au préalable si un patient atteint d'un cancer sera sensible ou bien au contraire résistant à un médicament chimiothérapeutique, tel que notamment le docétaxel, en particulier pour des patientes atteintes d'un cancer du sein. Les inventeurs ont pu apporter une solution à ce problème, et ont mis au point l'invention telle que présentée ci-après.Thus, there is a real need to have a new technique that allows to determine beforehand if a patient with cancer will be sensitive or else resistant to a chemotherapeutic drug, such as in particular docetaxel, especially for patients with breast cancer. The inventors have been able to provide a solution to this problem, and have developed the invention as presented hereinafter.
La présente invention a pour objet un support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet atteint d'un cancer permet de prédire une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins le médicament anticancéreux de formule (I) suivante :The subject of the present invention is a solid support coated with a set of representative gene fragments whose expression profile for all of these genes in a subject suffering from a cancer makes it possible to predict chemosensitivity or chemoresistance to the anticancer drug of the following formula (I):
Figure imgf000006_0001
caractérisé en ce que ledit jeu :
Figure imgf000006_0001
characterized in that said game:
- comprend au moins 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A, etcomprises at least 23 fragments, each of the 23 fragments being representative of a distinct gene chosen from the genes of Table A, and
- est en outre constitué au maximum par 366 fragments, chacun des 366 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.is further constituted by a maximum of 366 fragments, each of the 366 fragments being representative of a gene chosen from the genes of Table B.
Le composé de formule générale (I) est le docétaxel (ou taxotere).The compound of general formula (I) is docetaxel (or taxotere).
Un tel support solide selon l'invention permet de déterminer quelles patientes peuvent bénéficier au moins du traitement anticancéreux au docétaxel, et le cas échéant, de tester leur chimiosensibilité ou leur chimiorésistance à d'autres traitements anti cancéreux, en fonction du profil biologique des tumeurs. L'étude du profil biologique d'une tumeur passe par l'analyse de son profil génétique. En effet, les tumeurs sont hétérogènes car elles résultent de l'accumulation de combinaisons de multiples altérations moléculaires. Les indications thérapeutiques et diagnostiques sont fondées sur des facteurs pronostics classiques (histologiques et cliniques) qui ne révèlent pas cette hétérogénicité. Une caractérisation moléculaire globale et détaillée permet donc d'affiner le diagnostic, les indications thérapeutiques et donc la survie du patient.Such a solid support according to the invention makes it possible to determine which patients can benefit at least from anticancer treatment with docetaxel, and if necessary to test their chemosensitivity or their chemoresistance to other anti-cancer treatments, according to the biological profile of the tumors. . The study of the biological profile of a tumor requires the analysis of its genetic profile. Indeed, tumors are heterogeneous because they result from the accumulation of combinations of multiple molecular alterations. Therapeutic indications and diagnostics are based on classical prognostic factors (histological and clinical) that do not reveal this heterogeneity. Comprehensive and detailed molecular characterization thus makes it possible to refine the diagnosis, the therapeutic indications and therefore the survival of the patient.
Ce jeu, qui comprend au moins lesdits 23 fragments, est en outre constitué au maximum par 366 fragments, chacun des 366 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B. L'expression « en outre constitué au maximum par » signifie que le jeu, comprenant au moins les 23 fragments, peut en outre contenir de 1 à 366 autres fragments représentatifs de gènes tels que définis dans le Tableau B. De préférence, le jeu est en outre constitué par 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 358, 360, 365 fragments représentatifs de gènes tels que définis dans le Tableau B.This set, which comprises at least the said 23 fragments, is further constituted by a maximum of 366 fragments, each of the 366 fragments being representative of a gene chosen from the genes of Table B. The expression "furthermore constituted at most by means that the set, comprising at least the 23 fragments, may further contain from 1 to 366 other representative gene fragments as defined in Table B. Preferably, the clearance is further constituted by 2, 3, 4, 5 , 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 , 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55 , 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220 , 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 358, 360, 365 representative gene fragments as defined in Table B.
De préférence, le support solide selon la présente invention est revêtu d'un jeu qui : comprend lesdits au moins 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A, etPreferably, the solid support according to the present invention is coated with a set which comprises: said at least 23 fragments, each of the 23 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Table A, and
- est en outre constitué au maximum par 100 fragments, chacun des 100 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.is moreover constituted at the most by 100 fragments, each of the 100 fragments being representative of a gene chosen from the genes of Table B.
Ainsi, le support solide selon la présente invention permet de prédire chez un sujet une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins un autre médicament anticancéreux.Thus, the solid support according to the present invention makes it possible to predict in a subject chemosensitivity or chemoresistance to at least one other anticancer drug.
Par l'expression « médicament anticancéreux » on entend désigner dans la présente demande un composé de chimiothérapie, ou une association d'au moins deux composés de chimiothérapie, utilisé pour traiter ou prévenir un cancer. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter, un agent alkylant (oxazaphosphorines, nitroso-urées,...), un antibiotique (anthracyclines, anthracènediones, actinomycine D, bléomycine sulfate, ....), un vinca-alcaloïde (vincristine, vinblastine, vindésine, vinorelbine,...), un dérivé du platine (cisplatine, carboplatine, oxaliplatine,...), un antimétabolite (5-fhioro-uracile, méthotrexate, 6-mercaptopurine...), un taxane (paclitaxel, docétaxel), les dérivés de la camptothécine (irinotécan, topotécan,...) ou une epipadophyllotoxine (etoposide, teniposide).By the term "anticancer drug" is meant in the present application a chemotherapy compound, or a combination of at least two compounds of chemotherapy, used to treat or prevent cancer. We may include, for example, but not limited to, an alkylating agent (oxazaphosphorines, nitrosoureas, ...), an antibiotic (anthracyclines, anthracenediones, actinomycin D, bleomycin sulfate, ....), a vinca-alkaloid (vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, ...), a platinum derivative (cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, ...), an antimetabolite (5-fiorioruracil, methotrexate, 6-mercaptopurine ...), a taxane (paclitaxel, docetaxel), camptothecin derivatives (irinotecan, topotecan, ...) or epipadophyllotoxin (etoposide, teniposide).
De préférence, le support solide selon la présente invention permet en outre de prédire chez un sujet une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins la composition FEC, qui est une association comprenant les composés F, E et C, de formules respectives (II), (III) et (FV) suivantes :Preferably, the solid support according to the present invention further makes it possible to predict in a subject a chemosensitivity or a chemoresistance to at least the composition FEC, which is an association comprising the compounds F, E and C, of respective formulas (II), (III) and (FV):
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(IV). Les composés F (II), E (III) et C (W) correspondent respectivement au 5- fluorouracile, à Pépirubicine, et au cyclophosphamide.
Figure imgf000008_0003
(IV). Compounds F (II), E (III) and C (W) correspond to 5-fluorouracil, epirubicin and cyclophosphamide, respectively.
De manière encore préférée, le support solide selon la présente invention permet en outre de prédire chez un sujet une chirniosensibilité ou une cliimiorésistance à la composition FEC.More preferably, the solid support according to the present invention also makes it possible to predict in a subject a chirniosensitivity or a resistance to the FEC composition.
Les phénomènes de chirniosensibilité ou de chimiorésistance résultent de mécanismes complexes liés en partie à des variations au niveau de l'expression de plusieurs gènes. Si la surexpression de gènes impliqués dans le transport des drogues ainsi qu'une augmentation des processus de réparation de l'ADN sont identifiés comme intervenant dans la sensibilité des cellules aux drogues, de nombreux autres gènes peuvent influencer cette sensibilité. Les facteurs de transcription, les gènes régulant le cycle celullaire, les facteurs de croissance et leur récepteur sont autant d'acteurs potentiels impliqués dans les phénomènes de chimiosensibilité ou de cliimiorésistance.Chirnosensitivity or chemoresistance phenomena result from complex mechanisms linked in part to variations in the expression of several genes. While the overexpression of genes involved in drug trafficking and an increase in DNA repair processes are identified as factors in the cells' sensitivity to drugs, many other genes can influence this sensitivity. Transcription factors, genes regulating the cell cycle, growth factors and their receptor are all potential actors involved in the phenomena of chemosensitivity or resistance.
Sept grands groupes fonctionnels de gènes sont identifiés dans les tableaux A et B : les gènes impliqués dans le métabolisme, le cycle cellulaire, l'apoptose, la transcription, l'adhésion cellulaire, la transduction du signal, et les gènes impliqués dans la réparation. D'autres gènes sont caractéristiques de cibles potentielles de drogues.Seven major functional groups of genes are identified in Tables A and B: genes involved in metabolism, cell cycle, apoptosis, transcription, cell adhesion, signal transduction, and genes involved in repair . Other genes are characteristic of potential drug targets.
Le profil d'expression, qui est obtenu en utilisant le support solide selon la présente invention, contient les informations relatives à l'expression de l'ensemble des gènes dont un fragment représentatif a été déposé sur ledit support solide.The expression profile, which is obtained using the solid support according to the present invention, contains the information relating to the expression of all the genes of which a representative fragment has been deposited on said solid support.
Par l'expression « fragment représentatif » d'un gène du Tableau A ou du Tableau B on entend désigner dans la présente demande tout fragment d'un de ces gènes qui est suffisamment long pour s'hybrider spécifiquement, dans des conditions appropriées pour l'hybridation, avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test ou avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, et permet ainsi d'identifier ledit fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test ou de référence comme étant un fragment constitutif dudit gène donné, ledit gène étant donc présent dans l' échantillon d'acide nucléique test ou dans l'échantillon d'acide nucléique de référence ; lorsqu'un tel fragment représentatif d'un gène du Tableau A ou B est séquence, la séquence identifiée permet de conclure sans ambiguïté que ledit fragment appartient audit gène donné du Tableau A ou B. De préférence, ledit fragment représentatif est un fragment représentatif de l'ARNm dudit gène. La séquence dudit ARNm peut notamment être celle décrite dans la banque de données Unigene accessible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/, pour la référence Unigene telle que donnée dans la colonne Unigene des Tableaux A et B.By the term "representative fragment" of a gene of Table A or Table B is meant in the present application any fragment of one of these genes that is long enough to hybridize specifically, under appropriate conditions for the first time. hybridization, with a fragment present in the test nucleic acid sample or with a fragment present in the acid sample reference nuclei, and thus makes it possible to identify said fragment present in the test or reference nucleic acid sample as being a constitutive fragment of said given gene, said gene therefore being present in the test nucleic acid sample or in the reference nucleic acid sample; when such a representative fragment of a gene of Table A or B is sequenced, the identified sequence allows to unambiguously conclude that said fragment belongs to said gene given in Table A or B. Preferably, said representative fragment is a representative fragment of the mRNA of said gene. The sequence of said mRNA can notably be that described in the Unigene database accessible on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene/, for the Unigene reference as given in the Unigene column of Tables A and B.
De préférence, le fragment représentatif d'un gène selon l'invention contient au moins 15, de préférence 20, 25, 30, 35, 40, 45, 47, 48, 49 et de manière particulièrement préférée 50 nucléotides identiques à ceux du fragment de l'acide nucléique test ou de référence constitutif dudit gène donné, ledit gène étant donc présent dans l'acide nucléique test et dans l'acide nucléique de référence. Le terme « sonde » est également utilisé dans la présente demande pour désigner un fragment représentatif.Preferably, the fragment representative of a gene according to the invention contains at least 15, preferably 20, 25, 30, 35, 40, 45, 47, 48, 49 and particularly preferably 50 nucleotides identical to those of the fragment. test nucleic acid or constitutive reference of said gene, said gene being present in the test nucleic acid and in the reference nucleic acid. The term "probe" is also used in this application to refer to a representative fragment.
L'expression "conditions appropriées pour l'hybridation" dans la présente invention désigne des conditions de forte stringence qui permettent l'hybridation lorsque des séquences complémentaires à au moins 80, 82, 85, 87, 89, 90, 92, 95, 97 or 99 % sont capables de s'hybrider spécifiquement. Les conditions de forte stringence sont largement décrites dans la littérature, par exemple dans Sambrook et al., (1989, « Molecular cloning, A laboratory Manual », CoId Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (« Molecular cloning, A laboratory Manual », CoId Spring Harbor Lab. CSH, N.Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) "Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2" (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N. Y.), et ces conditions peuvent être adaptées par l'homme du métier en fonction de la taille des fragments nucléotidiques, selon les enseignements appropriés connus. On utilisera par exemple des tampons d'hybridation ou de lavage appropriés (Corning), ou encore les conditions d'hybridation suivantes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (2OmM, pH 7,5) contenant 5X SSC (IX SSC correspond à une solution 0.15M NaCl + 0.015 M de citrate de sodium), 50% de formamide, 7% de sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X de solution de Denhardt's, 5% de dextran sulfate et 1% d'ADN de sperme de saumon ;The term "appropriate conditions for hybridization" in the present invention refers to conditions of high stringency that allow hybridization when sequences complementary to at least 80, 82, 85, 87, 89, 90, 92, 95, 97 99% gold are able to hybridize specifically. Conditions of high stringency are widely described in the literature, for example in Sambrook et al., (1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", CoId Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 ("Molecular cloning, A laboratory Manual, CoId Spring Harbor Lab, CSH, NY USA or one of his recent reissues and in Ausubel et al., Eds. (1995) "Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2" (Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY), and these conditions can be adapted by those skilled in the art depending on the size of the nucleotide fragments, according to the appropriate teachings known. For example, suitable hybridization or washing buffers (Corning) or the following hybridization conditions will be used: (1) prehybridization at 42 ° C. for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5X SSC (IX SSC corresponds to a solution 0.15M NaCl + 0.015M sodium citrate), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10X Denhardt's solution, 5% dextran sulfate and 1% d Salmon sperm DNA;
(2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (par exemple 55°C pour une sonde de taille d'environ 50 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 200C en 2X SSC + 2% SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0.1X SSC + 0.1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0.1X SSC + 0.1% SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille d'environ 50 nucléotides.(2) actual hybridization for 20 hours at a temperature dependent on the size of the probe (for example 55 ° C for a probe of size about 50 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 0 C in 2X SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1X SSC + 0.1% SDS. The last wash is performed in 0.1X SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C for a size probe of about 50 nucleotides.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après leur meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé à l'aide d'algorithmes mathématiques. D'une manière préférée, non limitative, on peut citer différents algorithmes rappelés dans le document Fundamentals of database searching (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics : A trends Guide, 1998 :5 :7-9, notamment les algorithmes de Karlin et Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modifié dans Karlin et Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. On pourra utiliser en particulier les programmes :By "percent identity" between two nucleic acid sequences, it is meant to designate a percentage of identical nucleotides between the two sequences to be compared, obtained after their better alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed. at random and over their entire length. Optimal sequence alignment for comparison can be achieved using mathematical algorithms. In a preferred, nonlimiting manner, mention may be made of the various algorithms mentioned in the document Fundamentals of Database Search (review) Stephen F., Altschul, Bioinformatics: A Trends Guide, 1998: 5: 7-9, in particular Karlin's algorithms and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264, modified in Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877. In particular, the programs can be used:
-BLAST, notamment BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 séquences - a new tool for comparing protein and nucleotide séquences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), gapped BLAST (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402),-BLAST, including BLASTN, BLAST2 (Tatusova et al., 1999, "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett., 174: 247-250), gapped BLAST (Altschul et al. 1997, Nucleic Acids Res 25 (17): 3389-3402),
-FASTA (Altschul S. F. et al, 1990, J. Mol. Biol., 403-410), -Clustal W (Thompson, J. D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22, 4673-SO), -BESTFIT.Fabta (Altschul SF et al., 1990, J. Mol Biol., 403-410), Clustal W (Thompson, JD et al, 1994, Nucleic Acids Res 22, 4673-SO), -BESTFIT.
L'algorithme BLAST est décrit en détail sur le site du NCBIThe BLAST algorithm is described in detail on the NCBI website
(http :ww.ncbi.nih.gov).(http: ww.ncbi.nih.gov).
Les fragments représentatifs selon la présente invention peuvent être de n'importe quel type d'acide nucléique donné, tel que PADN5 l'ADNc, TARN, etc...The representative fragments according to the present invention may be of any given type of nucleic acid, such as DNA 5 cDNA, RNA, etc ...
Le support solide utilisé pour la réalisation de la présente invention peut être de manière générale tout support miniaturisé de verre, de silicium ou de polymère qui peut être revêtu de séquences nucléotidiques de séquence connue, en particulier les fragments représentatifs de gènes selon la présente invention déposés en arrangement ordonné, et dont la fonction est de reconnaître, dans un mélange, leurs séquences nucléotidiques complémentaires. Comme exemple de support solide on peut citer, mais sans s'y limiter, des membranes telles que les membranes de nylon à densité élevée (par exemple Performa, Genetix, New Milton, UK) ; on utilisera de préférence des lames microréseau en amino-silane, disponibles notamment chez Corning (ultraGAP™, NY). La surface du support est traitée pour former un réseau dense et régulier de microsurfaces sur lesquelles les fragments représentatifs sont fixés ; l'emplacement de chacun d'entre eux est précisément connu. De tels supports solides sont bien connus de l'homme de l'art, qui saura choisir le type de support à utiliser et les conditions appropriées pour un test d'hybridation donné.The solid support used for carrying out the present invention may generally be any miniaturized support of glass, silicon or polymer which may be coated with nucleotide sequences of known sequence, in particular the representative fragments of genes according to the present invention deposited in an ordered arrangement, and whose function is to recognize, in a mixture, their complementary nucleotide sequences. As an example of a solid support, there may be mentioned, but not limited to, membranes such as high density nylon membranes (eg Performa, Genetix, New Milton, UK); micro-amino-silane microarrays are preferably used, especially from Corning (ultraGAP ™, NY). The surface of the support is treated to form a dense and regular network of microsurfaces on which the representative fragments are fixed; the location of each of them is precisely known. Such solid supports are well known to those skilled in the art, who will be able to choose the type of support to be used and the appropriate conditions for a given hybridization test.
Le sujet atteint d'un cancer est de préférence un mammifère, et de manière particulièrement préférée l'homme. Le cancer dont est atteint le sujet peut être de n'importe quel type tel que par exemple, mais sans s'y limiter, le cancer du sein, le cancer de la prostate, le cancer du poumon, le cancer du côlon-rectum, le cancer de la lèvre-bouche-pharynx, de la vessie, des reins, le mélanome de la peau, le cancer de l'estomac, la leucémie, le cancer du foie, du système nerveux central, du col de l'utérus, de l'œsophage, du pancréas, des ovaires, du larynx ou de la thyroïde. De manière préférée, le support solide selon l'invention est caractérisé en ce que le sujet est atteint d'un cancer du sein, d'un cancer de la prostate, d'un cancer du poumon ou d'un cancer du côlon-rectum, De manière particulièrement préférée, le sujet est atteint d'un cancer du sein.The subject suffering from cancer is preferably a mammal, and particularly preferably man. The cancer of which the subject is afflicted may be of any type such as for example, but not limited to, breast cancer, prostate cancer, lung cancer, colon cancer, rectal cancer, cancer of the lip-mouth-pharynx, bladder, kidneys, melanoma of the skin, cancer of the stomach, leukemia, cancer of the liver, central nervous system, cervix, esophagus, pancreas, ovaries, larynx or thyroid. Preferably, the solid support according to the invention is characterized in that the subject is suffering from breast cancer, prostate cancer, lung cancer or cancer of the colon-rectum. In a particularly preferred manner, the subject is suffering from breast cancer.
Selon une autre préférence, l'un au moins des fragments représentatifs des gènes du Tableau A ou du Tableau B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ E) N0 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N0 4, SEQ ID N0 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N0 107, SEQ ID N0 114, SEQ ID N0 136, -SEQ ID N° 211, SEQ BD N0 214, SEQ ID N° 219, SEQ ID N° 246, SEQ ID N0 250, SEQ ID N0 298, SEQ ID N° 338 et SEQ ID N0 382 à 389 pour le Tableau A et SEQ ID N0 3, SEQ ID N0 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N0 10 à 106, SEQ ID N0 108 à 113, SEQ ID N0 1 15 à 135, SEQ ID N° 137 à 210, SEQ ID N0 212, SEQ ID N° 213, SEQ ID N° 215 à 218, SEQ ID N0 220 à 245, SEQ ID N0 247 à 249, SEQ ID N0 251 à 297, SEQ ID N° 299 à 337 et SEQ ID N° 339 à 3Sl pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).According to another preference, at least one representative fragment of the genes of Table A or Table B is chosen from the following fragments: a) fragments of sequence SEQ E) N 0 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID N 0 4, SEQ ID N 0 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 0107, SEQ ID NO 0114, SEQ ID NO 0136, -SEQ ID NO: 211, SEQ BD NO 0214, SEQ ID 219, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO : 250, SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO: 338 and SEQ ID NO : 382-389 for Table A and SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5. , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 10 to 106, SEQ ID NO : 108 to 113, SEQ ID NO : 15 to 135, SEQ ID NO: 137 to 210, SEQ ID NO: 0 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215 to 218, SEQ ID NO : 220 to 245, SEQ ID NO : 247 to 249, SEQ ID NO : 251 to 297, SEQ ID NO: 299 to 337 and SEQ ID No. 339 to 3S1 for Table B, or b) fragments having at least 70% identity with fragments as defined in a), or c) fragments comprising fragments as defined in a) or b). ), or d) fragments of which the sequences are complementary to the sequences of the fragments as defined in a), b) or c).
Les fragments tels que définis au point b), qui restent représentatifs des gènes donnés, résultent par exemple d'un polymorphisme nucléotidique ou d'une mutation (délétion, insertion, substitution...).The fragments as defined in point b), which remain representative of the given genes, result for example from a nucleotide polymorphism or from a mutation (deletion, insertion, substitution ...).
De manière encore préférée, chaque fragment représentatif des gènes du Tableau A ou du Tableau B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N0 1, SEQ ID N0 2, SEQ DD N0 4,More preferably, each representative fragment of the genes of Table A or Table B is chosen from the following fragments: a) fragments of sequence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4,
SEQ ID N0 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N0 107, SEQ ID N0 114, SEQ ID N° 136, SEQ ID N° 211, SEQ ID N° 214, SEQ ID N0 219, SEQ ID N0 246, SEQ ID N° 250, SEQ ID N° 298, SEQ ID N0 33S et SEQ ID N0 3S2 à 389 pour le Tableau A et SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° S5 SEQ ID N° 10 à 106, SEQ ID N° 108 à 113, SEQ ID N° 115 à 135, SEQ ID N0 137 à 210, SEQ ID N° 212, SEQ ID N° 213, SEQ ID N° 215 à 218, SEQ ID N° 220 à 245, SEQ ID N° 247 à 249, SEQ ID N° 251 à 297, SEQ ID N° 299 à 337 et SEQ ID N° 339 à 381 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO : 107, SEQ ID NO : 114, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO : 219, SEQ ID. N 0 246, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 298, SEQ ID NO : 33S, and SEQ ID NO : 3S2 through 389 for Table A and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 10-106, SEQ ID NO: 108-113, SEQ ID NO: 115-135, SEQ ID NO. ID N 0 137 to 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215 to 218, SEQ ID NO: 220 to 245, SEQ ID NO: 247 to 249, SEQ ID NO: 251 to 297 , SEQ ID No. 299 to 337 and SEQ ID No. 339 to 381 for Table B, or b) fragments having at least 70% identity with fragments as defined in a), or c) fragments comprising fragments as defined in a) or b), or d) fragments whose sequences are complementary to the sequences of fragments as defined in a), b) or c).
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le jeu est constitué par 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A.According to a particularly preferred embodiment, the set consists of 23 fragments, each of the 23 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Table A.
Un deuxième aspect de la présente invention concerne un procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à au moins un médicament anticancéreux chez un sujet atteint d'un cancer à partir d'un prélèvement tumoral chez ledit sujet, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape dans laquelle on dépose un échantillon d'un extrait d'acide nucléique, le cas échéant après rétro-transcription, issu dudit prélèvement tumoral, sur un support solide selon la présente invention, et en ce qu'on analyse la quantité d'acide nucléique ayant hybride avec le jeu de fragments représentatifs déposé sur ledit support.A second aspect of the present invention relates to a method for in vitro prediction of the therapeutic response to at least one anticancer drug in a subject suffering from cancer from a tumor sample in said subject, characterized in that said method comprises a step in which a sample of a nucleic acid extract, where appropriate after retro-transcription, is deposited from said tumor sample on a solid support according to the present invention, and in which the amount of nucleic acid having hybridized with the set of representative fragments deposited on said support.
De préférence, le procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à un médicament anticancéreux chez un sujet atteint d'un cancer à partir d'un prélèvement tumoral chez ledit sujet est caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral, b) le marquage de l'acide nucléique test de l'échantillon obtenu à l'étape a) à l'aide d'un premier marqueur, c) en parallèle, le marquage d'un échantillon d'acide nucléique de référence à l'aide d'un deuxième marqueur différent du premier marqueur de l'étape b), d) la mise en contact de l'échantillon d'acide nucléique test marqué obtenu à l'étape b) et de l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué obtenu à l'étape c) avec le support selon l'invention dans des conditions appropriées pour l'hybridation, chaque fragment représentatif d'un gène du support solide étant capable de s'hybrider avec un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique test marqué et un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, e) la normalisation, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, f) la comparaison, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, de sorte à obtenir un profil d'expression des gènes dont les fragments représentatifs ont été déposés sur le support solide, g) le classement de la réponse thérapeutique du sujet au médicament anticancéreux dans la classe cliimiosensibilité ou dans la classe cbimiorésistance par analyse en fonction du profil d'expression obtenu à l'étape f).Preferably, the method for in vitro prediction of the therapeutic response to an anticancer drug in a subject suffering from cancer from a tumor sample in said subject is characterized in that said method comprises the following steps: a) extracting a test nucleic acid sample from the tumor sample, b) labeling the test nucleic acid of the sample obtained in step a) with a first marker, c) in parallel, labeling a reference nucleic acid sample with a second marker different from the first marker of step b), d) contacting the acid sample nucleic acid labeled test obtained in step b) and the labeled reference nucleic acid sample obtained in step c) with the support according to the invention under appropriate conditions for hybridization, each representative fragment of a solid support gene being capable of hybridizing with a fragment of the gene present in the labeled test nucleic acid sample and a fragment of the gene present in the reference nucleic acid sample, e) normalization, for each representative fragment of gene deposited on the support, the hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample and that obtained for the labeled reference nucleic acid sample, f) the comparison, for each fragment represented the standardized hybridization intensity obtained for the test nucleic acid sample labeled with that obtained for the labeled reference nucleic acid sample, so as to obtain a profile of expression of the genes whose representative fragments have been deposited on the solid support; g) the classification of the subject's therapeutic response to the anticancer drug in the immunosensitivity class or in the resistance class by analysis as a function of the expression profile obtained at the step f).
L'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral telle que définie à l'étape a) du procédé de prédiction selon la présente invention est une technique couramment employée en biologie moléculaire. De manière générale, les techniques de biologie moléculaire employées pour la réalisation de la présente invention sont bien connues de l'homme de l'art, et sont largement décrites dans la littérature (voir par exemple Sambrook, Russell et al, "Molecular cloning: A lάboratoiy mannal", Vol.3, January 15, 2001, CoId Spring Harbor Laboratory ; « Nucleic acid hybridization », BD Haines, SJ Higgins (Eds), 1985, IRL Press). Ainsi, l'homme du métier saura appliquer la procédure nécessaire pour l'extraction d'un échantillon de l'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral.The extraction of a test nucleic acid sample from the tumor sample as defined in step a) of the prediction method according to the present invention is a technique commonly used in molecular biology. In general, the molecular biology techniques employed for carrying out the present invention are well known to those skilled in the art, and are widely described in the literature (see, for example, Sambrook, Russell et al, "Molecular cloning: In the literature, Vol.3, January 15, 2001, CoId Spring Harbor Laboratory, Nucleic Acid Hybridization, BD Haines, SJ Higgins (Eds), 1985, IRL Press. Thus, those skilled in the art will be able to apply the procedure necessary for the extraction of a sample of the test nucleic acid from the tumor sample.
Les expressions « acide nucléique », « séquence nucléique » ou « d'acide nucléique », « polynucléotide », « oligonucléotide », « séquence de polynucléotide », « séquence nucléotidique », pourront être employés de manière indifférente dans la présente demande pour désigner un enchaînement précis de nucléotides pouvant correspondre aussi bien à de PADN qu'à ses produits de transcription (ARN). Ces acides nucléiques sont isolés de leur environnement naturel.The terms "nucleic acid", "nucleic sequence" or "nucleic acid", "polynucleotide", "oligonucleotide", "polynucleotide sequence", "nucleotide sequence", may be used indifferently in the present application to designate a precise sequence of nucleotides that can correspond to both DNA and its transcription products (RNA). These nucleic acids are isolated from their natural environment.
Le marquage de l'échantillon d'acide nucléique test à l'étape b) et celui de l'échantillon d'acide nucléique de référence à l'étape c) permet l'émission d'un signal détectable et quantifiable, caractéristique de l'intensité d'hybridation obtenue lorsqu'un fragment représentatif d'un gène donné s'hybride d'une part avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique test, d'autre part avec un fragment présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence. L'intensité d'hybridation obtenue est proportionnelle au niveau d'expression du gène représenté par le fragment déposé sur le support solide.The labeling of the test nucleic acid sample in step b) and that of the reference nucleic acid sample in step c) allows the emission of a detectable and quantifiable signal characteristic of the hybridization intensity obtained when a representative fragment of a given gene hybridizes on the one hand with a fragment present in the test nucleic acid sample, on the other hand with a fragment present in the sample of nucleic acid reference. The intensity of hybridization obtained is proportional to the level of expression of the gene represented by the fragment deposited on the solid support.
Le marquage peut consister en un radio-marquage (tel que 32P, 33P ,35S, qui peut être détecté en utilisant par exemple un compteur gamma ou un scintillateur, autoradiographie,...), un marquage enzymatique (biotine, digoxigénine,...), un marquage chimioluminescent (luminol, dioxétane, luciférase, luciférine) ou un marquage fluorescent. Lorsqu'on utilise le marquage radioactif, le support solide ne doit pas être en verre.The labeling may consist of a radio-labeling (such as 32 P, 33 P, 35 S, which can be detected using for example a gamma counter or a scintillator, autoradiography, ...), an enzymatic labeling (biotin, digoxigenin , ...), chemiluminescent labeling (luminol, dioxetane, luciferase, luciferin) or fluorescent labeling. When radioactive labeling is used, the solid support must not be glass.
Le marquage fluorescent est particulièrement préféré pour la réalisation de la présente invention. Comme exemple de marqueurs fluorescents on peut citer, mais sans s'y limiter, la fluorescéine et ses dérivés, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC), les coumarines, les cyanines 2, 3 et 5, les dérivés de la phycocyanine, Pallophycocyanine (APC)5 la phycoérythrine-cyanine 5 (PC5) et la phycoérythrine (PE), la calcéine (AM), la tetraméthyl-rhodamine de fluorescence rouge ou la rhodamine et ses dérivés, la protéine de fluorescence verte ou GFP (« Green Fluorescent Protein »), le chlorure de dansyl, l'umbelliferone etc.. (voir également W. T. Mason (1999), « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Académie Press, Londres, 2è édition).The fluorescent marking is particularly preferred for carrying out the present invention. As an example of fluorescent markers, mention may be made of, but not limited to, fluorescein and its derivatives, such as fluorescein isothiocyanate (FITC), coumarins, cyanines 2, 3 and 5, derivatives of phycocyanin, Pallophycocyanine (APC) 5 phycoerythrin-cyanine 5 (PC5) and phycoerythrin (PE), the calcein (AM), tetramethyl-rhodamine red fluorescence and rhodamine and derivatives thereof, green fluorescent protein or GFP ( "Green Fluorescent Protein"), dansyl chloride, umbelliferone etc. (see also WT Mason (1999), "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity", Academy Press, London, 2nd edition).
On choisira les deux marqueurs pour l'échantillon d'acide nucléique test et pour l'échantillon d'acide nucléique de référence de sorte à obtenir deux signaux caractéristiques de l'intensité d'hybridation comparables entre eux. Les méthodes de marquage sont bien connues de l'homme de l'art et sont largement décrites dans la littérature (voir par exemple "Pratique de l'utilisation des sondes nucléiques et de l'hybridation moléculaire", Gérard Lacotte, May 1992, Ed. Lavoisier, Paris, et W. T. Mason (1999), « Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity », Académie Press, Londres, 2è édition) ; les kits et les marqueurs sont disponibles dans le commerce (voir par exemple le kit « Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit », disponible chez Agilent Technologies, ou d'autres kits/marqueurs disponibles par exemple chez Molecular Probes, Leiden, NL, Clontech, PaIo Alto, CA, Stratagene, La Jolla, CA, etc .).The two markers for the test nucleic acid sample and for the reference nucleic acid sample will be chosen so as to obtain two signals characteristic of the hybridization intensity that are comparable to one another. Labeling methods are well known to those skilled in the art and are widely described in the literature (see for example "Practice in the use of nucleic probes and molecular hybridization", Gérard Lacotte, May 1992, Ed Lavoisier, Paris, and WT Mason (1999), "Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity", Academy Press, London, 2nd edition); kits and markers are commercially available (see, for example, the Low RNA Input Fluorescent Linear Amplification Kit, available from Agilent Technologies, or other kits / markers available from, for example, Molecular Probes, Leiden, NL, Clontech , PaIo Alto, CA, Stratagene, La Jolla, CA, etc.).
On entend désigner par « échantillon d'acide nucléique de référence » dans la présente demande un pool d'acide nucléique obtenu à partir de différentes lignées cellulaires normales et tumorales. Ces lignées cellulaires sont de manière générale mises en culture à l'échelle industrielle afin de produire des lots de taille importante, qui subissent des procédures de contrôle qualité stringentes. Un tel échantillon d'acide nucléique de référence sert de contrôle pour obtenir les informations relatives à l'expression des gènes présents dans l'échantillon d'acide nucléique test après hybridation avec les fragments représentatifs déposés sur le support solide.The term "reference nucleic acid sample" in this application is intended to denote a pool of nucleic acid obtained from different normal and tumor cell lines. These cell lines are generally cultured on an industrial scale to produce large batches that undergo stringent quality control procedures. Such a reference nucleic acid sample serves as a control to obtain the information relating to the expression of the genes present in the test nucleic acid sample after hybridization with the representative fragments deposited on the solid support.
Comme exemple d'échantillon d'acide nucléique de référence on peut citer, mais sans s'y limiter, le pool d'ARN « Universal human référence RNA », commercialisé par Stratagene. La normalisation à l'étape e) permet de s'affranchir des différences causées par le bruit de fond, la durée de l'hybridation, le marquage plus ou moins important des échantillons d'acides nucléiques test et de référence, les quantités variables des échantillons d'acides nucléiques test et de référence déposés sur le support solide, etc... La normalisation des résultats est couramment utilisée dans les expériences de biologie moléculaire et est bien connue de l'homme de l'art. Tous types de méthodes peuvent être utilisés pour la réalisation de la présente invention, tels que notamment la méthode « Lowess Global » (Yang IV et al. Within the fold: assessing differential expression measures and reproducibility in microarray assays. Génome Biol. 3, research 0062.1-0062.12, 2002).As an example of a reference nucleic acid sample, mention may be made of, but not limited to, the "Universal human reference RNA" RNA pool, marketed by Stratagene. The normalization in step e) makes it possible to overcome the differences caused by the background noise, the duration of the hybridization, the more or less important labeling of the test and reference nucleic acid samples, the variable amounts of the test and reference nucleic acid samples deposited on the solid support, etc. Normalization of the results is commonly used in molecular biology experiments and is well known to those skilled in the art. All types of methods can be used for carrying out the present invention, such as, in particular, the "Lowess Global" method (Yang IV et al., Genome Biol.3, research and propagation of microarray assays. 0062.1-0062.12, 2002).
L'analyse à l'étape g) en fonction du profil d'expression obtenu à l'étape f) est réalisée à l'aide de la méthode d'Analyse en Composantes Principales développée par le laboratoire Génome et Informatique d'Evry (logiciel GeneAnova, voir point 5 « analyse des données » de l'exemple). D'autres méthodes d'analyse à plusieurs variables appropriées pourront être utilisées pour classer la réponse thérapeutique du sujet dans la classe chimiosensibilité ou dans la classe chimiorésistance.The analysis in step g) as a function of the expression profile obtained in step f) is carried out using the Principal Component Analysis method developed by Evry's Génome et Informatique laboratory (software GeneAnova, see point 5 "data analysis" of the example). Other appropriate multivariate analysis methods may be used to classify the subject's therapeutic response into the chemosensitivity or chemoresistance class.
De préférence, le procédé selon la présente invention permet de prédire la réponse thérapeutique à au moins un médicament anticancéreux tel que défini précédemment, de préférence au moins le composé de formule (I) suivante :Preferably, the method according to the present invention makes it possible to predict the therapeutic response to at least one anti-cancer drug as defined above, preferably at least the compound of formula (I) below:
Figure imgf000018_0001
la composition FEC, qui est une association comprenant les composés F, E et C, de formules respectives (II), (III) et (FV) suivantes :
Figure imgf000018_0001
the composition FEC, which is an association comprising the compounds F, E and C, of the following formulas (II), (III) and (FV):
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000019_0002
De manière encore préférée, le classement à l'étape g) de la réponse thérapeutique est déterminé par comparaison du profil d'expression obtenu à l'étape f) avec le profil d'expression tel que défini dans le Tableau A5 à savoir que la surexpression des gènes ACP5, BAD, BARDl, BIRC3, COL4A2, CYP19, DHFR, ERCC5, ERCC6, FEN, GSTA3, LUC7A, MAP2K2, MCM6, NK4, PIP5 PSMD12, STK4 et TSN est caractéristique d'une chimiosensibilité et la surexpression des gènes CX3CL1, MAPKl 3, MYLK et XBPl est caractéristique d'une chimiorésistance.More preferably, the classification in step g) of the therapeutic response is determined by comparing the expression profile obtained in step f) with the profile of expression as defined in Table A 5 namely that overexpression of genes ACP5, ADB, BARDl, BIRC3, COL4A2, CYP19, DHFR, ERCC5, ERCC6, FEN, GSTA3, LUC7A, MAP2K2, MCM6, NK4, PIP 5 PSMD12, STK4 and TSN is characteristic of chemosensitivity and overexpression CX3CL1, MAPK1, MYLK and XBPl genes are characteristic of chemoresistance.
Selon encore une autre préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que la comparaison à l'étape f) de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué comprend les étapes suivantes : a) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du rapport entre l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, b) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du log2 de chaque rapport obtenu à l'étape a).According to yet another preference, the method according to the present invention is characterized in that the comparison in step f) of the intensity of hybridization obtained standard for the labeled nucleic acid sample labeled with that obtained for the labeled reference nucleic acid sample comprises the following steps: a) calculating, for each representative fragment of a gene deposited on the support, the ratio between the normalized hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample and that obtained for the labeled reference nucleic acid sample; b) the calculation, for each representative fragment of a gene deposited on the support, log 2 of each report obtained in step a).
Chaque fragment représentatif du jeu est déposé de manière générale une fois, de préférence deux fois, manière encore préférée trois fois, voire quatre fois sur le support solide. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que, lorsque chaque fragment du jeu est déposé trois fois sur le support, la moyenne des log2 des trois réplicats est calculée pour chacun de ces fragments.Each representative fragment of the set is generally deposited once, preferably twice, more preferably three times or even four times on the solid support. Thus, according to a particular embodiment, the method according to the present invention is characterized in that, when each fragment of the game is deposited three times on the support, the average log 2 of the three replicates is calculated for each of these fragments.
Selon un autre mode de réalisation, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que les échantillons d'acides nucléiques test et de référence sont de l'ARN.According to another embodiment, the method according to the present invention is characterized in that the test and reference nucleic acid samples are RNA.
De préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que l'étape b) de marquage de l'ARN test de l'échantillon à l'aide du premier marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN test de l'échantillon obtenu à l'étape a), ii) l'incorporation du premier marqueur lors de la transcription in vitro dePreferably, the method according to the present invention is characterized in that step b) of labeling the test RNA of the sample with the aid of the first marker comprises the following steps: i) reverse transcription of the RNA test of the sample obtained in step a), ii) the incorporation of the first marker during the in vitro transcription of
PADN test obtenu à l'étape i).DNA test obtained in step i).
Selon une autre préférence, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que l'étape c) de marquage de l'échantillon d'ARN de référence à l'aide du deuxième marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN de référence de l'étape c), ii) l'incorporation du deuxième marqueur lors de la transcription in vitro deAccording to another preference, the method according to the present invention is characterized in that step c) of marking the reference RNA sample with the aid of the second marker comprises the following steps: i) reverse transcription of the Reference RNA of step c), ii) incorporation of the second marker during in vitro transcription of
PADN test obtenu à l'étape i).DNA test obtained in step i).
De manière encore préférée, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que les premier et deuxième marqueurs sont choisis parmi la cyanine 3 et la cyanine 5.More preferably, the process according to the present invention is characterized in that the first and second markers are chosen from cyanine 3 and cyanine 5.
Selon un autre mode de réalisation préféré, le procédé selon la présente invention est caractérisé en ce que le sujet est atteint d'un cancer du sein, d'un cancer de la prostate ou d'un cancer du colon.According to another preferred embodiment, the method according to the present invention is characterized in that the subject is suffering from breast cancer, prostate cancer or colon cancer.
Un dernier aspect de la présente invention concerne un kit comprenant le support solide selon la présente invention. Les kits comprenant un support solide d'hybridation sont suffisamment décrits dans la littérature, et comprennent de manière générale, outre le support solide, des réactifs nécessaires pour l'hybridation tels que notamment des marqueurs ou des tampons d'hybridation et de lavage.A final aspect of the present invention is a kit comprising the solid support of the present invention. Kits comprising a solid hybridization support are sufficiently described in the literature, and generally comprise, in addition to the solid support, reagents necessary for hybridization, such as, in particular, markers or hybridization and washing buffers.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinées à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.The legends of the figures and examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope.
FIGURESFIGURES
Figure 1 : Classification des tumeurs étudiées (ACP, logiciel GeneAnova)Figure 1: Classification of tumors studied (PCR, GeneAnova software)
EXEMPLESEXAMPLES
1. Patientes1. Patients
Les patientes (17) ont été vues en consultation en sénologie et plusieurs biopsies sont réalisées. Après examen anatomopathologique permettant de caractériser la tumeur au niveau histologique, la patiente reçoit une chimiothérapie néo-adjuvante composée de 6 cures de Taxotere (Docétaxel). La réponse thérapeutique est évaluée après l'intervention chirurgicale selon la classification de Sataloff qui prend en compte la régression tumorale au site primaire ainsi que la réponse ganglionnaire (Cf. Tableau 1, ci-dessous).The patients (17) were seen in consultation in senology and several biopsies are performed. After anatomopathological examination to characterize the tumor histologically, the patient receives neo-adjuvant chemotherapy consisting of 6 courses of Taxotere (Docetaxel). The therapeutic response is evaluated after the surgical procedure according to the Sataloff classification which takes into account the tumor regression at the primary site as well as the ganglionic response (see Table 1, below).
CLASSIFICATION DE SATALOFFCLASSIFICATION OF SATALOFF
Sataloff, JAm CoIl Surg 1995, 180 : 297-304Sataloff, JAm CoIl Surg 1995, 180: 297-304
Réponse au site primaire :Response to the primary site:
TA : effet thérapeutique total ou pratiquement complet, TB : effet thérapeutique supérieur objectivement à 50%. TC : moins de 50% d'effet thérapeutique mais effet évident, TD : pas d'effet thérapeutique.TA: total or almost complete therapeutic effect, TB: therapeutic effect objectively higher than 50%. TC: less than 50% of therapeutic effect but obvious effect, TD: no therapeutic effect.
Réponse ganglionnaire :Lymph node response:
NA : effet thérapeutique présent, pas de métastase. NB : pas de métastase, pas d'effet thérapeutique. NC : aspect d'effet thérapeutique mais métastase. ND : métastases viables, pas d'effet thérapeutique.NA: therapeutic effect present, no metastasis. NB: no metastasis, no therapeutic effect. NC: aspect of therapeutic effect but metastasis. ND: viable metastases, no therapeutic effect.
TABLEAU 1TABLE 1
2. Echantillons biologiques2. Biological samples
Les ARN sont extraits à partir des biopsies congelées dans l'azote liquide avec le protocole Trizol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). Après vérification de la qualité des ARN obtenus par microélectrophorèse sur le bioanalyseur (Agilent technologies, Massy, France).RNAs are extracted from frozen biopsies in liquid nitrogen with the Trizol protocol (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France). After checking the quality of RNA obtained by microelectrophoresis on the bioanalyzer (Agilent technologies, Massy, France).
Un pool d'ARN de lignées cellulaires est utilisé comme ARN référence (Universal human référence RNA, Stratagene, La Jolla, CA).An RNA pool of cell lines is used as the reference RNA (Universal human reference RNA, Stratagene, La Jolla, CA).
Ce pool d'ARN de référence, disponible dans le commerce, comprend une collection d'ARN obtenus à partir d'un certain nombre de lignées cellulaires pour couvrir une gamme optimale de gènes.This reference pool of reference RNA is commercially available and includes a collection of RNAs obtained from a number of cell lines to cover an optimal range of genes.
3. Préparation des biopuces (ou « support solides >>)3. Preparation of biochips (or "solid supports")
Les sondes moléculaires (ou « fragments représentatifs ») sont des oligonucléotides de 50 bases synthétisés par la société MWG. La séquence de certains oligonucléotides sont disponibles dans les banques MWG, d'autres ont été recherchées à la demande des inventeurs. Ces oligonucléotides sont dilués à une concentration de 25 μM dans une solution de DMSO 50% (diméthylsulfoxide) puis déposés sur des lames Ultragaps (Corning, New York, US) grâce à un robot (Microgrid II, Biorobotics, Genomic Solutions, Cambridge, UK). Chaque sonde moléculaire est déposée en triplicat sur la lame. Après dépôt, les molécules d'ADN sont fixées par incubation des lames à 8O0C, pendant 2 heures. Un traitement chimique tel que défini par la société Corning est réalisé. Les lames sont alors conservées à température ambiante, à l'obscurité.Molecular probes (or "representative fragments") are oligonucleotides of 50 bases synthesized by MWG. The sequence of some oligonucleotides are available in the MWG banks, others were searched at the request of the inventors. These oligonucleotides are diluted to a concentration of 25 μM in a 50% DMSO solution (dimethylsulfoxide) and then deposited on Ultragaps slides (Corning, New York, US) using a robot (Microgrid II, Biorobotics, Genomic Solutions, Cambridge, UK). ). Each molecular probe is deposited in triplicate on the slide. After deposition, the DNA molecules are fixed by incubation of the slides at 80 ° C. for 2 hours. A chemical treatment as defined by the company Corning is carried out. The slides are then stored at room temperature in the dark.
4. Marquage et hybridation4. Marking and hybridization
Pour chaque échantillon, 1,5 μg d'ARN totaux sont rétrotranscrits puis, une transcription in vitro est réalisée avec incubation de cyanine 5 pour les ARN de la tumeur, de cyanine 3 pour les ARN référence (Low RNA Input Fluorescent LinearFor each sample, 1.5 μg of total RNA are retrotranscribed then, an in vitro transcription is carried out with cyanine incubation for tumor RNA, cyanine 3 for reference RNA (Low RNA Input Fluorescent Linear
Amplification Kit, Agilent Technologies). Les ARN antisens obtenus sont purifiés et séchés sous vide. Le culot est repris dans 16 μl de tampon d'hybridationAmplification Kit, Agilent Technologies). The antisense RNAs obtained are purified and dried under vacuum. The pellet is taken up in 16 μl of hybridization buffer
(Corning) puis dénaturés à 1000C. L'hybridation se fait avec un coverslip qui permet de maintenir le contact entre la cible et la surface de la lame, à 370C et(Corning) and then denatured at 100 ° C. The hybridization is done with a coverslip which makes it possible to maintain the contact between the target and the surface of the slide, at 37 ° C. and
50% d'humidité, pendant la nuit.50% humidity, during the night.
Les lames sont ensuite lavées dans des solutions de SDS (dodécylsulfate de sodium) et SSC (citrate de sodium salin) à différentes concentrations. La fluorescence est détectée par le passage de la puce dans le scanner (GMS 418, Affymetrix).The slides are then washed in solutions of SDS (sodium dodecyl sulphate) and SSC (saline sodium citrate) at different concentrations. Fluorescence is detected by the passage of the chip in the scanner (GMS 418, Affymetrix).
5. Analyses des données5. Data analysis
Les images obtenues sont analysées avec un logiciel d'analyse d'image (Jaguar, Afrymetrix, UK). La normalisation des données est effectuée selon la méthode lowess global car il y a une dépendance systématique entre la valeur du Iog2(ratio) et l'intensité, qui apparaît généralement par des valeurs du Iog2(ratio) élevées pour des valeurs d'intensité faibles. Cette méthode permet d'enlever de tels effets. Ensuite, le ratio des intensités tumeur/référence est calculé, puis le log2 des ratios. Pour chaque gène, la moyenne des Iog2(ratio) des trois réplicats est calculée, chaque sonde moléculaire étant déposée trois fois sur la puce. Le test de Student est alors utilisé. Il s'agit d'un test de significativité qui peut être employé lors de la comparaison de deux moyennes. Le test t est calculé en effectuant le rapport de la différence des moyennes sur l'erreur standard. Une valeur p < 0,05 est considérée comme significative. Ce test est impliqué pour évaluer le niveau de significativité entre les moyennes d'expression des différents gènes entre le groupe des échantillons « sensibles » et le groupe des échantillons « résistantes ». Les profils d'expression des gènes discriminants (p<0,05) sont alors étudiés par une analyse en composantes principales (ACP). L'Analyse en Composantes Principales (logiciel GeneAnova, Laboratoire Génome et Informatique d'Evry, FR) est une méthode dite descriptive, elle vise à structurer et simplifier des données issues de plusieurs variables, sans privilégier l'une d'entre elles. L' ACP permet de visualiser la géométrie du nuage des observations quand l'espace à plus de 3 dimensions. Elle procède en 2 étapes, le détermination des axes d'inertie du nuage puis sa projection sur les plans déterminés par les axes d'inertie pris 2 à 2. L'analyse de la sphère des corrélations permet de visualiser les similitudes entre différents profils d'expression. La corrélation linéaire entre 2 profils est égale au cosinus de l'angle entre les vecteurs correspondants à ces conditions expérimentales (un angle de 90° montre une absence totale de corrélation). 6. Résultats et discussionThe resulting images are analyzed with image analysis software (Jaguar, Afrymetrix, UK). The normalization of the data is done according to the global lowess method because there is a systematic dependence between the value of the Iog 2 (ratio) and the intensity, which generally appears by high values of the Iog 2 (ratio) for values of low intensity. This method makes it possible to remove such effects. Then, the ratio of tumor / reference intensities is calculated, then the log 2 ratios. For each gene, the average of the Iog 2 (ratio) of the three replicates is calculated, each molecular probe being deposited three times on the chip. The Student test is then used. This is a significance test that can be used when comparing two averages. The t-test is calculated by performing the ratio of the difference of the averages over the standard error. A value p <0.05 is considered significant. This test is involved to evaluate the level of significance between the means of expression of the different genes between the group of "sensitive" samples and the group of "resistant" samples. The expression profiles of the discriminant genes (p <0.05) are then studied by a principal component analysis (PCA). Principal Component Analysis (GeneAnova software, Genome and Computer Science Laboratory of Evry, FR) is a so-called descriptive method, it aims at structuring and simplifying data from several variables, without favoring one of them. The PCA allows to visualize the geometry of the cloud of observations when the space has more than 3 dimensions. It proceeds in 2 steps, the determination of the axes of inertia of the cloud then its projection on the planes determined by the axes of inertia taken 2 to 2. The analysis of the sphere of the correlations makes it possible to visualize the similarities between different profiles of 'expression. The linear correlation between 2 profiles is equal to the cosine of the angle between the vectors corresponding to these experimental conditions (an angle of 90 ° shows a total absence of correlation). 6. Results and discussion
Les 17 patientes avec lesquelles le test a été effectué sont réparties en 3 groupesThe 17 patients with whom the test was performed are divided into 3 groups
Groupe 1 : bonne réponse thérapeutique.Group 1: good therapeutic response.
Groupe 2 : mauvaise réponse thérapeutique.Group 2: poor therapeutic response.
Groupe 3 : réponse non déterminée.Group 3: Undetermined response.
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Figure imgf000025_0001
TABLEAU 2TABLE 2
Résultats obtenus:Results obtained:
Les données ont été analysées comme décrit précédemment. Le mode de représentation de la classification est une analyse en composante multiple réalisée à l'aide du logiciel GeneAnova (voir Figure 1). On observe 2 groupes correspondant au groupe 1 et au groupe 2 définis dans le tableau.The data was analyzed as described previously. The representation mode of the classification is a multiple component analysis performed using the GeneAnova software (see Figure 1). There are 2 groups corresponding to group 1 and group 2 defined in the table.
Les patientes pour lesquelles la réponse thérapeutique n'est pas connue se répartissent dans les deux groupes.Patients for whom the therapeutic response is unknown are distributed in both groups.
Il faut noter que d'après les données cliniques, la patiente 11 a bien répondu au traitement. Ceci justifie son classement dans le groupe 2.It should be noted that according to clinical data, patient 11 responded well to treatment. This justifies its classification in group 2.
Vingt-trois gènes (cf. Tableau A - Le symbole « X » dans le Tableau A indique la surexpression d'un gène) sont sélectionnés pour la classification (p < 0,05). La puce utilisée ici permet de mettre en évidence un profil d'expression caractéristique de la réponse thérapeutique au taxotere (docétaxel). Twenty-three genes (see Table A - The symbol "X" in Table A indicates overexpression of a gene) are selected for classification (p <0.05). The chip used here makes it possible to highlight a characteristic expression profile of the therapeutic response to taxotere (docetaxel).
TABLEAUATABLEA
κ>κ>
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N)NOT)
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TABLEAU BTABLE B
κ>κ>
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κ>κ>
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κ>κ>
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VCVC
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Claims

38Revendications 38Revendications
1. Support solide revêtu d'un jeu de fragments représentatifs de gènes dont le profil d'expression pour l'ensemble de ces gènes chez un sujet atteint d'un cancer permet de prédire une chimiosensibilité ou une chimiorésistance à au moins le médicament anticancéreux de formule (I) suivante :1. Solid support coated with a set of representative gene fragments whose expression profile for all of these genes in a subject suffering from cancer makes it possible to predict chemosensitivity or chemoresistance to at least the anticancer drug of following formula (I):
Figure imgf000041_0001
caractérisé en ce que ledit jeu :
Figure imgf000041_0001
characterized in that said game:
- comprend au moins 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A, etcomprises at least 23 fragments, each of the 23 fragments being representative of a distinct gene chosen from the genes of Table A, and
- est en outre constitué au maximum par 366 fragments, chacun des 366 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.is further constituted by a maximum of 366 fragments, each of the 366 fragments being representative of a gene chosen from the genes of Table B.
2. Support solide selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le jeu :2. Solid support according to claim 1, characterized in that the game:
- comprend lesdits au moins 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A, etcomprises said at least 23 fragments, each of the 23 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Table A, and
- est en outre constitué au maximum par 100 fragments, chacun des 100 fragments étant représentatif d'un gène choisi parmi les gènes du Tableau B.is moreover constituted at the most by 100 fragments, each of the 100 fragments being representative of a gene chosen from the genes of Table B.
3. Support solide selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'un au moins des fragments représentatifs des gènes du Tableau A ou du Tableau B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N0 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4,3. Solid support according to claim 1 or 2, characterized in that at least one representative fragment of the genes of Table A or Table B is chosen from the following fragments: a) fragments of sequence SEQ ID N 0 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4,
SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 107, SEQ ED N0 114, SEQ ID N° 136, 39SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO 107, SEQ ID 0114, SEQ ID N ° 136, 39
SEQ ID N0 211, SEQ ID N° 214, SEQ ID N° 219, SEQ ID N0 246, SEQ ID N° 250, SEQ ID N0 298, SEQ ID N0 338 et SEQ ED N0 382 à 389 pour le Tableau A et SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N0 10 à 106, SEQ ID N° 108 à 113, SEQ ID N0 115 à 135, SEQ ID N° 137 à 210, SEQ ID N° 212, SEQ ID N° 213, SEQ ID N° 215 à 218, SEQ ID N° 220 à 245, SEQ ID N° 247 à 249, SEQ ID N° 251 à 297, SEQ ID N° 299 à 337 et SEQ ID N° 339 à 381 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c).SEQ ID NO : 211, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 219, SEQ ID NO : 246, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO : 298, SEQ ID NO : 338, and SEQ ID NO : 382 through 389 for Table A and SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO : 10 to 106, SEQ ID NO: 108 to 113, SEQ ID NO : 115 at 135, SEQ ID NO: 137-210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 215-218, SEQ ID NO: 220-245, SEQ ID NO: 247-249, SEQ ID NO: 251 to 297, SEQ ID NO: 299 to 337 and SEQ ID NO: 339 to 381 for Table B, or b) fragments having at least 70% identity with fragments as defined in a), or c) fragments comprising the fragments as defined in a) or b), or d) fragments whose sequences are complementary to the sequences of the fragments as defined in a), b) or c).
4. Support solide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que chaque fragment représentatif des gènes du Tableau A ou du Tableau B est choisi parmi les fragments suivants : a) les fragments de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 107, SEQ ID N° 114, SEQ ID N0 136, SEQ ID N0 211, SEQ ID N0 214, SEQ ID N° 219, SEQ ID N° 246, SEQ ID N0 250, SEQ ED N° 298, SEQ ID N° 338 et SEQ ID N° 382 à 389 pour le Tableau A et SEQ ID N° 3, SEQ ID N0 5, SEQ ID N0 6, SEQ ID N0 8, SEQ ID N° 10 à 106, SEQ ID N0 108 à 113, SEQ ID N0 115 à 135, SEQ ID N° 137 à 210, SEQ ID N0 212, SEQ ED N0 213, SEQ ID N0 215 à 218, SEQ ID N0 220 à 245, SEQ ID. N0 247 à 249, SEQ ID N° 251 à 297, SEQ ID N° 299 à 337 et SEQ ID N0 339 à 381 pour le Tableau B, ou b) les fragments ayant au moins 70 % d'identité avec les fragments tels que définis en a), ou c) les fragments comprenant les fragments tels que définis en a) ou en b), ou d) les fragments dont les séquences sont complémentaires des séquences des fragments tels que définis en a), b) ou c). 404. Solid support according to one of claims 1 to 3, characterized in that each representative fragment of the genes of Table A or Table B is chosen from the following fragments: a) fragments of sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 0 , SEQ ID NO : 211, SEQ ID NO. 0214, SEQ ID NO 219, SEQ ID NO 246, SEQ ID NO 0250, SEQ ID NO 298, SEQ ID NO 338 and SEQ ID NO: 382-389 for Table A and SEQ ID NO: 3 , SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO: 10 to 106, SEQ ID NO : 108 to 113, SEQ ID NO : 115 to 135, SEQ ID NO: 137 to 210 , SEQ ID NO 0212, SEQ ID 0213, SEQ ID NO 0215 to 218, SEQ ID NA 0 220-245, SEQ ID. NA 0 247 to 249, SEQ ID NO: 251-297, SEQ ID NO: 299-337 and SEQ ID NA 0 339-381 to Table B, or b) fragments having at least 70% identity with fragments as defined in a), or c) fragments comprising the fragments as defined in a) or b), or d) fragments whose sequences are complementary to the sequences of the fragments as defined in a), b) or vs). 40
5. Support solide selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le jeu est constitué par 23 fragments, chacun des 23 fragments étant représentatif d'un gène distinct choisi parmi les gènes du Tableau A.5. solid support according to one of claims 1 to 4, characterized in that the game consists of 23 fragments, each of the 23 fragments being representative of a distinct gene selected from the genes of Table A.
6. Procédé de prédiction in vitro de la réponse thérapeutique à au moins un médicament anticancéreux chez un sujet atteint d'un cancer à partir d'un prélèvement tumoral chez ledit sujet, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape dans laquelle on dépose un échantillon d'un extrait d'acide nucléique, le cas échéant après rétro-transcription, issu dudit prélèvement tumoral, sur un support solide selon l'une des revendications 1 à 5, et en ce qu'on analyse la quantité d'acide nucléique ayant hybride avec le jeu de fragments représentatifs déposé sur ledit support.6. A method for in vitro prediction of the therapeutic response to at least one anticancer drug in a subject suffering from cancer from a tumor sample in said subject, characterized in that said method comprises a step in which a sample of a nucleic acid extract, optionally after retro-transcription, from said tumor sample, on a solid support according to one of claims 1 to 5, and in that the amount of nucleic acid is analyzed; having hybridized with the set of representative fragments deposited on said support.
7. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) l'extraction d'un échantillon d'acide nucléique test à partir du prélèvement tumoral, b) le marquage de l'acide nucléique test de l'échantillon obtenu à l'étape a) à l'aide d'un premier marqueur, c) en parallèle, le marquage d'un échantillon d'acide nucléique de référence à l'aide d'un deuxième marqueur différent du premier marqueur de l'étape b), d) la mise en contact de l'échantillon d'acide nucléique test marqué obtenu à l'étape b) et de l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué obtenu à l'étape c) avec le support selon l'une les revendications 1 à 5 dans des conditions appropriées pour l'hybridation, chaque fragment représentatif d'un gène du support solide étant capable de s'hybrider avec un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique test marqué et un fragment du gène présent dans l'échantillon d'acide nucléique de référence, e) la normalisation, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, 417. Method according to claim 5, characterized in that said method comprises the following steps: a) the extraction of a test nucleic acid sample from the tumor sample, b) the labeling of the nucleic acid test of the sample obtained in step a) using a first marker, c) in parallel, the marking of a reference nucleic acid sample with a second marker different from the first marker of step b), d) contacting the labeled test nucleic acid sample obtained in step b) and the labeled reference nucleic acid sample obtained in step c) with the carrier according to any of claims 1 to 5 under conditions suitable for hybridization, each representative fragment of a solid support gene being capable of hybridizing with a fragment of the gene present in the nucleic acid sample labeled test and a fragment of the gene present in the sample of reference nucleic acid, e) normalization, for each representative fragment of gene deposited on the support, of the hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample and that obtained for the acid sample marked reference nucleic, 41
f) la comparaison, pour chaque fragment représentatif de gène déposé sur le support, de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, de sorte à obtenir un profil d'expression des gènes dont les fragments représentatifs ont été déposés sur le support solide, g) le classement de la réponse thérapeutique du sujet au médicament anticancéreux dans la classe chimiosensibilité ou dans la classe chimiorésistance par analyse en fonction du profil d'expression obtenu à l'étape f).f) comparing, for each representative fragment of gene deposited on the support, the standardized hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample with that obtained for the labeled reference nucleic acid sample, so as to obtain an expression profile of the genes whose representative fragments have been deposited on the solid support, g) the classification of the subject's therapeutic response to the anticancer drug in the chemosensitivity class or in the chemoresistance class by analysis according to the expression profile obtained in step f).
8. Procédé selon la revendication 6 ou 7 ', caractérisé en ce que ledit au moins un médicament anticancéreux est le composé de formule (I) suivante :8. Method according to claim 6 or 7 ' , characterized in that said at least one anticancer drug is the compound of formula (I) below:
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0001
9. Procédé selon la revendication S, caractérisé en ce que le classement à l'étape g) de la réponse thérapeutique est déterminé par comparaison du profil d'expression obtenu à l'étape f) avec le profil d'expression tel que défini dans le Tableau A, à savoir que la surexpression des gènes ACP5, BAD, BARDl, BIRC3, COL4A2, CYP 19, DHFR, ERCC5, ERCC6, FEN, GSTA3, LUC7A, MAP2K2, MCM6, NK4, PIP, PSMD12, STK4 et TSN est caractéristique d'une chimiosensibilité et la surexpression des gènes CX3CL1, MAPKl 3, MYLK et XBPl est caractéristique d'une chimiorésistance.9. Method according to claim 5, characterized in that the classification in step g) of the therapeutic response is determined by comparing the expression profile obtained in step f) with the expression profile as defined in Table A, that the overexpression of the genes ACP5, BAD, BARD1, BIRC3, COL4A2, CYP19, DHFR, ERCC5, ERCC6, FEN, GSTA3, LUC7A, MAP2K2, MCM6, NK4, PIP, PSMD12, STK4 and TSN is characteristic of chemosensitivity and overexpression of CX3CL1, MAPKl3, MYLK and XBPl genes is characteristic of chemoresistance.
10. Procédé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce que la comparaison à l'étape f) de l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour 4210. Method according to one of claims 6 to 9, characterized in that the comparison in step f) of the standardized hybridization intensity obtained for 42
l'échantillon d'acide nucléique test marqué avec celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué comprend les étapes suivantes : a) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du rapport entre l'intensité d'hybridation normalisée obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique test marqué et celle obtenue pour l'échantillon d'acide nucléique de référence marqué, b) le calcul, pour chaque fragment représentatif d'un gène déposé sur le support, du 1Og2 de chaque rapport obtenu à l'étape a).the test nucleic acid sample labeled with that obtained for the labeled reference nucleic acid sample comprises the following steps: a) calculating, for each representative fragment of a gene deposited on the support, the ratio between standardized hybridization intensity obtained for the labeled test nucleic acid sample and that obtained for the labeled reference nucleic acid sample, b) the calculation, for each representative fragment of a gene deposited on the support, 1Og 2 of each report obtained in step a).
11. Procédé selon l'une des revendications 6 à 10 caractérisé en ce que, lorsque chaque fragment du jeu est déposé trois fois sur le support, la moyenne des log2 des trois réplicats est calculée pour chacun de ces fragments.11. Method according to one of claims 6 to 10 characterized in that, when each fragment of the game is deposited three times on the support, the average log 2 of the three replicates is calculated for each of these fragments.
12. Procédé selon l'une des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que les échantillons d'acides nucléiques test et de référence sont de TARN.12. Method according to one of claims 6 to 11, characterized in that the test and reference nucleic acid samples are of RNA.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape b) de marquage de l'ARN test de l'échantillon à l'aide du premier marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN test de l'échantillon obtenu à l'étape a), ii) l'incorporation du premier marqueur lors de la transcription in vitro de l'ADN test obtenu à l'étape i).13. The method according to claim 12, characterized in that step b) of marking the test RNA of the sample with the aid of the first marker comprises the following steps: i) the retrotranscription of the RNA test of the sample obtained in step a), ii) the incorporation of the first marker during the in vitro transcription of the test DNA obtained in step i).
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape c) de marquage de l'échantillon d'ARN de référence à l'aide du deuxième marqueur comprend les étapes suivantes : i) la rétrotranscription de l'ARN de référence de l'étape c), ii) l'incorporation du deuxième marqueur lors de la transcription in vitro de l'ADN test obtenu à l'étape i).14. The method according to claim 12, characterized in that step c) of marking the reference RNA sample with the aid of the second marker comprises the following steps: i) the retrotranscription of the reference RNA of step c), ii) the incorporation of the second marker during the in vitro transcription of the test DNA obtained in step i).
15. Procédé selon l'une des revendications 6 à 14, caractérisé en ce que les premier et deuxième marqueurs sont choisis parmi la cyanine 3 et la cyanine 5. 4315. Method according to one of claims 6 to 14, characterized in that the first and second markers are chosen from cyanine 3 and cyanine 5. 43
16. Procédé selon l'une des revendications 6 à 15, caractérisé en ce que le sujet est atteint d'un cancer du sein, d'un cancer de la prostate, d'un cancer du poumon ou d'un cancer du côlon-rectum.16. Method according to one of claims 6 to 15, characterized in that the subject is suffering from breast cancer, prostate cancer, lung cancer or cancer of the colon. rectum.
17. Kit comprenant le support solide selon l'une des revendications 1 à 5. 17. Kit comprising the solid support according to one of claims 1 to 5.
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