WO2006024476A2 - Homogeneous method for determining an analyte in the presence of an excess of cross-reacting substances - Google Patents

Homogeneous method for determining an analyte in the presence of an excess of cross-reacting substances Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to a homogeneous method for the determination of an analyte in a sample, which additionally contains an excess of a substance which cross-reacts with one of the analyte-specific binding partners.
  • binding tests are available, which allow specific detection and exact quantification by the use of analyte-specific binding partner. Examples of binding tests are immunoassays or methods in which nucleic acids are hybridized.
  • homogeneous processes being characterized in that no washing and separation steps are required. Accordingly, homogeneous methods are particularly preferred for use in automatic analyzers, since the sequence of a test is reduced to a minimum of method steps, which firstly reduces the number of possible error sources and secondly the test duration.
  • a particular category of binding assays are the so-called sandwich assays, characterized in that two analyte-specific binding partners form a "binding partner / analyte / binding partner" complex with the analyte, at least one of the binding partners being associated with a component of a signal-forming system, Heterogeneous sandwich assays are designed in such a way that, prior to the induction or measurement of the signal, a Separation of the free, unbound binding partner or unbound analyte is necessary, such. In ELISA testing.
  • Homogeneous sandwich assays allow the determination of the measurement signal generated by the "binding partner / analyte / binding partner" complex, even in the presence of unbound, free binding partner or analyte molecules Components and the sample containing is measured after or even during the binding reaction without further separation and / or washing step and determines the corresponding measurement signal
  • Examples of homogeneous sandwich assays eg., Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology 7: 401-414] are many turbidimetric or nephelometric methods, wherein the specific for the detection of analyte used binding partners may be linked to latex particles, such as the EMIT ® - Test; CEDIA ® -Teste.
  • a particular embodiment of a homogeneous sandwich assay is based on the use of a signal-generating system in which the analyte-mediated pairing allows interaction between the two signal-forming components which then causes a measurable signal.
  • assays are fluorescence polarization immunoassays or Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay, LOCI TM for short [EP-B1-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Be. 91: 5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42: 1518-1526].
  • numerous analytes see also EP-B1-0 515 194, pages 7-14
  • analyte concentrations in a range from 10 "4 to 10 -16 M can be measured.
  • a prerequisite required for using this sandwich method is the availability of two analyte-specific binding partners. In order for pairing and thus the signal-inducing interaction to take place, it must be ensured that both binding partners can bind together to an analyte molecule. In the case of LOCI TM immunoassays, for example, this is accomplished by the use of two analyte-specific antibodies that bind to two different epitopes of the analyte. While one of the antibodies is associated with a photosensitizer, the other antibody is with one ChemilumineszenzENS associated. Only by the spatial proximity of the two signaling components of the energy transfer from the photosensitizer on the chemiluminescent compound is made possible, so that the amount of luminescence caused by the pairing correlated with the amount of analyte.
  • Monoreactive in the context of the present invention means that the binding partner has no or negligible affinity for other substances in the sample and binds to the analyte with high specificity.
  • An analyte-specific, polyreactive binding partner binds the analyte but also to at least one further substance which is contained in the sample.
  • Prothrombin is the proenzyme of thrombin, the central enzyme in the blood clotting cascade.
  • the prothrombin protein is modular and consists of an N-terminal Fi +2 -AnteiI and a C-terminal thrombin portion.
  • Prothrombin is cleaved by the proteolytic activity of factor Xa, so that a thrombin molecule (30 kD) is formed per prothrombin molecule (70 kD) with the release of a prothrombin fragment F 1 + 2 (35 kD).
  • the autocatalytic cleavage of prothrombin by thrombin can further lead to the cleavage of the fragments F 1 and F 2 .
  • thrombin does not occur in the blood in free form, but is bound to inhibitors and fibrin immediately after its formation, the extent of thrombin formation must be detected indirectly, e.g. B. by the determination of the activation marker F 1 + 2 and / or F 2 .
  • One possibility for the detection or exclusion of increased thrombin formation in vivo is therefore the determination of the F 2 / F 1 + 2 concentration in the plasma.
  • the prothrombin concentration in the plasma of healthy individuals varies between 1 and 2 ⁇ mol / l, while the F 1 + 2 concentration is usually between 60 and 200 pmol / l and values of up to 9.5 nmol in acute venous thromboembolism / l can reach. This means that, compared to the F 1 + 2 concentration, there is a 1,000 to 10,000 fold molar excess of prothrombin in plasma samples.
  • the immunological detection of F 2 / F 1 + 2 in the presence of prothrombin is complicated by the fact that the released prothrombin fragments F 2 / F 1 + 2 to intact, uncleaved prothrombin only a single F 2 / F 1 + 2 -specific, antigenic Epitope and namely the resulting after the cleavage of thrombin carboxy terminus of the F 2 / F 1 + 2 peptide (neoantigen). Only antibodies directed against the carboxy-terminal region of the F 2 / F 1 + 2 peptide are able to specifically bind to the prothrombin fragments F 2 / F 1 + 2 without at the same time having a specificity for intact prothrombin.
  • the F 2 / Fi +2 neoantigen-specific antibodies are coupled to a solid phase and incubated with the sample, so that the F 2 / Fi + 2 peptides can bind to the immobilized antibodies.
  • unbound proteins in particular prothrombin
  • prothrombin-binding antibody is applied by addition of an antibody solution.
  • this second antibody is associated with a signal-forming component that allows quantification of the F 2 / Fi + 2 concentration.
  • the present invention has for its object to provide a sensitive homogeneous method that allows the determination of analytes for which only one monoreactive binding partner is available and which are to be determined in a sample which additionally contains an excess of at least one substance with a second analyte-specific but polyreactive binding partner cross-reacts.
  • the object is achieved in that a sample, which presumably contains the analyte, an analyte-specific, monoreactive binding partner and an analyte-specific, polyrezine binding partner is added, the polyreactive binding partner in terms of the sum of all substances that a reaction enter with him, in 1.5 to 5-fold molar excess, preferably in 2 to 3-fold molar excess, is used.
  • the sum of all substances which undergoes a reaction with the analyte-specific, polyreactive binding partner is composed of the usually expected amount of analyte (mol / l) and the total amount of cross-reacting substances (mol / l), which are usually present in the respective sample material are included, together.
  • the analyte specific binding partner associated with each a signal-forming component which are brought by the formation of a binding partner / analyte / binding partner complex in spatial proximity and consequently in a detectable, quantifiable interaction.
  • binding partner a member of a binding pair, the members of a specific binding pair being two molecules each having at least one structure complementary to a structure of the other molecule, the two molecules being linked by a complementary binding
  • molecule also includes molecular complexes such as enzymes consisting of apo- and coenzyme, proteins consisting of several subunits, lipoproteins consisting of protein and lipids, etc.
  • Specific binding partners may be naturally occurring but also eg be produced by chemical synthesis, microbiological techniques and / or genetic engineering methods, such as antibodies, receptors, enzymes or polynucleotides.
  • the reaction of a monoreactive or polyreactive binding partner with the analyte is a specific binding, e.g. B. mutual recognition of complementary surface structures or an interaction of polar or non-polar groups may be based.
  • specific binding reactions are antibody / antigen, antibody / hapten, receptor / ligand, enzyme / substrate, DNA / DNA, DNA / RNA; Operator / repressor, nuclease / nucleotide, biotin / avidin, lectin / polysaccharide, hormone / hormone receptor and other interactions.
  • the polyreactive binding partner in the sense of the present invention reacts with at least one further substance which is contained in the sample in addition to the analyte.
  • This reaction may also be based on specific binding, e.g. B. if the substance has identical surface structures as the analyte or if the polyreactive binding partner recognizes and binds the analyte and the other cross-reacting substance due to a common feature or a common property.
  • polyreactive binding partners having specificity for more than one analyte are e.g. B. antibodies the are directed against such epitopes of a proenzyme which are retained on the proteolytic spaite products of the precursor molecule.
  • the polyreactive binding partner binds specifically to the analyte and enters into a nonspecific interaction with one or more further substances. Such nonspecific reactions are usually characterized in that they can occur independently of complementary surface structures.
  • the analyte-specific binding partners are monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the term "antibody” means an immunoglobulin, for example an immunoglobulin of the class or subclass IgA, IgD, IgE, IgGi, IgG 2a , IgG 2 b, IgG 3 , IgG 4 , IgM
  • the method according to the invention for the determination of an analyte is further based on the use of analyte-specific binding partners, which are each associated with one component of a signal-forming system, wherein at least one component is a detectable label.
  • a label is any molecule that can itself produce a signal or induce the production of a signal such.
  • a fluorescent substance a radioactive substance, an enzyme or a chemiluminescent substance.
  • the signal may be detected or measured by enzyme activity, luminescence, light absorption, light scattering, radiated electromagnetic or radioactive radiation, or a chemical reaction.
  • a “signal-generating system” comprises components which, when in close proximity to one another, can undergo a detectable interaction with one another, for example in the form of energy donors and energy receivers such as, for example, photosensitizer and chemiluminescent substances (EP-A2-0 515 194), photosensitizer and fluorophores (WO 95/06877), radioactive (or 125 and fluorophores [Udenfriend et al., (1985) Proc. Natl. Acad., 82: 8672-8676] , Fluorophores and Fluorophores [Mathis (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959] or fluorophores and fluorescence quenchers (US 3,996,345).
  • photosensitizer and chemiluminescent substances EP-A2-0 515 194
  • photosensitizer and fluorophores WO 95/06877
  • radioactive or 125 and fluorophores [Udenfriend et al., (1985) Proc. Nat
  • the direct transfer of energy between the components e.g. As by light or electron radiation and short-lived reactive chemical molecules, mitein reminder.
  • processes in which the activity of one component is inhibited or enhanced by one or more others for example, the inhibition or enhancement of enzyme activity, or the inhibition, enhancement, or alteration (eg, wavelength shift, polarization) of the affected one Component emitted electromagnetic radiation.
  • the interaction between the components also includes enzyme cascades.
  • the components are enzymes, at least one of which provides the substrate for another such that a maximum or minimum reaction rate of the coupled substrate reaction results.
  • An effective interaction between the components usually takes place when they are spatially adjacent, so z. B. within a distance range of a few microns, in particular within a distance range of less than 600 nm, preferably below 400 nm, most preferably of less than 200 nm.
  • the monoreactive binding partner is associated with a chemiluminescent compound and the polyreactive binding partner is associated with a photosensitizer or vice versa.
  • chemiluminescent compounds and of substances which are suitable as photosensitizers are described in EP-B1-0 515 194 (chemiluminescent compounds see page 22, line 42 to page 34, line 15, photosensitizers see page 17, lines 26-50) ,
  • the term "associated” is to be understood broadly and includes, for example, a covalent and a non-covalent bond, a direct and an indirect bond, the adsorption to a surface and the inclusion in a depression or a cavity etc.
  • Antibodies or binding partners can be bound to the solid phase or bound to the label via a chemical bond
  • noncovalent binding include surface adsorption, inclusion in cavities or the binding of two specific binding partners, in addition to direct binding to the solid phase or label
  • the antibodies or binding partners are also bound to the solid phase or the label indirectly via specific interaction with other specific binding partners (see also EP-A2-0 411 945) .
  • a biotinylated antibody can be bound via label-bound avidin to the Be bound label or it ka a fluorescein antibody conjugate is bound to the solid phase via solid phase-bound anti-fluorescein antibodies; or the antibody can be bound to the solid phase or label via immunoglobulin-binding proteins.
  • the analyte-specific binding partners are associated with suspendible particles coupled to a component of a signal-forming system, preferably a chemiluminescent compound and a photosensitizer.
  • suspendible particles comprise microparticles, preferably latex particles, which themselves may be associated with, for example, dyes, sensitizers, fluorescers, chemiluminescers, isotopes or other detectable labein.
  • suspendable particles are particles which have an approximate diameter of at least 20 nm and not more than 20 ⁇ m, usually between 40 nm and 10 ⁇ m, preferably between 0.1 and 10 ⁇ m, particularly preferably between 0, 1 and 5 microns, most preferably between 0.15 and 2 microns.
  • the microparticles may be regular or irregular in shape. They can represent spheres, spheroids, spheres with more or less large cavities or pores.
  • the microparticles can be made of organic, of inorganic material or of a mixture or Combination of both exist. They may consist of a porous or non-porous, a swellable or non-swellable material. In principle, the microparticles may have any density, but preferred are particles having a density close to the density of the water, such as from about 0.7 to about 1.5 g / ml.
  • the preferred microparticles are suspendible in aqueous solutions and as long as possible suspension stable. They may be transparent, partially transparent or opaque.
  • microparticles may consist of several layers, for example the so-called "core-and-shell" particles having a core and one or more enveloping layers
  • microparticles includes, for example, dye crystals, metal sols, silica particles, glass particles, magnetic particles, polymer particles, oil drops, Lipid particles, dextran, and protein aggregates
  • Preferred microparticles are particles which can be suspended in aqueous solutions and consist of water-insoluble polymer material, in particular substituted polyethylenes.
  • latex particles for example, of polystyrene, acrylic acid polymers, methacrylic acid polymers, acrylonitrile polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene, polyvinyl acetate acrylate,
  • Latex particles having reactive groups on their surface such as carboxyl, amino or aldehyde groups, which have a covalent bond, e.g. allow specific binding partners to the latex particles.
  • the preparation of latex particles is described for example in EP-B1-0 080 614, EP-B1-0 227 054 and EP-B1-0 246 446.
  • the present inventive method is further characterized in that the sample is diluted in a volume ratio of 1: 1 to 1: 250 and the analyte-specific, polyreactive binding partner in relation to the sum of all substances to which it can bind, in 1, 5 up to 5-fold molar excess is used.
  • the samples such. As blood or plasma samples, in a volume ratio of 1: 2 to 1: 100, more preferably diluted in a ratio of 1: 4 to 1: 32.
  • sample is understood as meaning the material which presumably contains the analyte to be detected.
  • sample includes, for example, biological fluids or tissues, in particular of humans and animals, such as blood, plasma, serum, sputum, exudate, bronchoalveolar lavage. Lymphatic fluid, synovial fluid, seminal fluid, vaginal mucus, feces, urine, cerebrospinal fluid, hair, skin, tissue samples or incisions, cell culture samples, plant fluids or tissues, forensic samples, water and wastewater samples, food, pharmaceuticals, etc.
  • samples must be pretreated Such pretreatment of samples may involve separation and / or lysis of cells, precipitation, hydrolysis or denaturation of sample components such as proteins, for example, to provide the analyte for the detection procedure or to remove interfering sample components.
  • the centrifugation of sample n treating the sample with organic solvents such. As alcohols, especially methanol, treating the sample with detergents.
  • the method according to the invention is characterized in that the signal is measured after a period of joint incubation of both components of the signal-forming system in the reaction mixture of less than 300 seconds, preferably less than 200 seconds and more preferably less than 160 seconds.
  • the limitation of the incubation time to less than 300 seconds allows the measurement of a signal of high specificity and sufficient strength, which allows a precise quantification of the analyte.
  • This measure solves the dilemma of two opposing effects.
  • an increase in the incubation time leads to an increase in the specific signal accompanied, whereby a reliable measurement of the signal is made possible.
  • a decrease in the signal strength also occurs, so that the sum of the measured signal no longer correlates with the amount of analyte.
  • the signal-degrading effect may be due to the excess substance blocking the component of the signal-forming system associated with the polyreactive binding partner through excessive binding to the polyreactive binding partner, thus requiring the interaction with the second component of the signal Systems hindered.
  • analytes can be determined, such.
  • B. proteolytic cleavage products of coagulation factors Factor IX, Factor X and Factor Xl, preferably the cleavage products of factor II ( prothrombin) F 2 and Fi +2 , proteolytic cleavage products of fibrinogen such.
  • fibrinopeptide A or B, or Fibrinogendegradations occur, such as.
  • the sensitivity of the method according to the invention allows the determination of analyte concentration up to about 10 "12 mol / l in the presence of, for example, a 10,000 times molar excess of a cross-reactive with the polyreactive binding partner substance.
  • the following examples relate to the determination according to the invention of the prothrombin fragment Fi +2 in human plasma samples, wherein the F 1 + 2 -specific binding partners are associated with suspendable polystyrene particles (beads), to which in turn a stimulable photosensitizer or a chemiluminescent compound is coupled.
  • the photosensitizer-coupled polystyrene particles are also referred to as sensibeads
  • the chemiluminescent compound-coupled polystyrene particles are referred to as chemibeads.
  • the beads are dextran-coated polystyrene particles, with the sensitibeads labeled with phthalocyanine and the chemibeads with europium chelate.
  • the preparation of the beads was carried out according to Ullman et al. (1996) Clin. Chem. 42 (9): 1518-1526 and the references cited therein or according to WO 01/67105.
  • streptavidin-coated Sensibeads were used which allow via a streptavidin / biotin bond the association of the biotinylated binding partner to the Sensibeads.
  • the photosensitizer is excitable by light of a wavelength of 680 nm and then produces singlet oxygen, which in turn is capable of exciting the chemiluminescent compound, producing a chemiluminescent signal which can be measured and correlated with the amount of Fi + 2 in the sample.
  • a monoclonal antibody As a polyreactive binding partner that binds both Fi +2 and intact prothrombin, a monoclonal antibody (anti-prothrombin MAb) produced by the hybridoma cell line 92-195 / 097 used in the DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig, Germany, under the accession number DSM ACC2607.
  • a monoreactive binding partner with specificity for the carboxy-terminal neoantigen of F 1 + 2 a monoclonal antibody was also used (anti-Fi + 2 -MAK). The preparation of such an antibody is known from the prior art.
  • Example 1 Preparation of reagents necessary for the homogeneous assay
  • the anti-prothrombin antibody was first buffered in a 10 mM NaHCO 3 solution for the biotinylation and the IgG content of the solution was determined photometrically.
  • Biotin-PEO 4 -NHS EZ-Link TM NHS-PEO 4 - Biotin, Pierce, Ill., USA
  • DMSO DMSO DMSO
  • the biotinylated anti-prothrombin antibody was purified on Sephadex® G25 (Amersham Biosciences Europe GmbH, Germany) and adjusted in a suitable buffer to a concentration of 2 mg / ml.
  • An anti-F ⁇ + 2 antibody solution was purified on Sephadex® G25, taken up in 50 mM MES buffer (pH 6.0), quantified photometrically and adjusted to an IgG concentration of 20 mg / ml. 50 mg of the europium chelate-coupled chemibeads were washed by multiple sedimentation and resuspension in MES buffer (pH 6.0) and finally adjusted to a Chemibead concentration of 100 mg / ml.
  • 500 ⁇ l of the anti-F 1 + 2 antibody solution were mixed with 500 ⁇ l Chemibead solution, 2 ⁇ l 4% Tween® 20 solution and 24 ⁇ l NaBH 3 CN solution (25 mg NaBH 3 CN / ml) and Incubated at 37 0 C for 60 hours. Subsequently, 50 .mu.l 0.5 M CMO solution was added and incubated for a further 2 hours at 37 ° C. Finally, the reaction mixture for the separation of unbound reactants and for the homogenization of the particles was treated with ultrasound.
  • the Chemibeads were sedimented by centrifugation, resuspended in MES buffer (pH 6.0) and sonicated. This washing step and subsequent sonication were performed with MES buffer and twice with CB buffer (50 mM HEPES, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg / ml Dextran T-500, 12.5 ⁇ g / ml dextran Sulfate, 16 mg / ml BSA, 2 mg / ml bovine ⁇ -globulin, 0.1% [w / v] Triton X 405, 0.15% [v / v] Proclin 300, 0.1 mg / ml neomycin sulfate , pH 7.2). After the last wash, the anti-Fi + 2 antibody-coated Chemibeads were adjusted to a concentration of 50 mg / ml with CB buffer and subjected to a final sonication.
  • Example 2 LOCI TM to quantify the Fi + 2 content of human plasma samples
  • the reagents were used in the following concentrations: 75 ⁇ g / ml anti-F 1 + 2 chemibeads in CB buffer (pH 7.2), according to Example 1a) prepared biotinylated anti-prothrombin antibody in BA buffer (50mM HEPES, 0.3M NaCl, 1mM EDTA, 1mg / ml Dextran T-500, 0.1% [w / v] Triton X 405, 0.15% [v / v] Proclin 300, 0 , 1 mg / ml streptavidin-coated Sensibeads in SB buffer (50 mM HEPES, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg / ml dextran, 1 mg / ml neomycin sulfate, pH 7.2) diluted 1: 66 T-500, 16 mg / ml BSA, 2 mg / ml bovine saccharide
  • a standard curve was prepared by adjusting purified F- ⁇ +2 -antigen with Ag buffer to a concentration of 1000 pmol / l. From this stock solution, a geometric dilution series (factor 2) was prepared. The standard samples were tested as described in Example 2, ie they were prediluted as well as the plasma samples before the test in a ratio of 1:20. The plotting of the logarithm of the signal level achieved for the individual standards against the logarithm of the F- I + 2 concentrations contained in the standards gives the calibration curve shown in FIG.
  • an optimum can be selected which is less than 300 seconds, which ensures, on the one hand, a quantifiable signal level in the range of high analyte concentrations and, on the other hand, high sensitivity in the range of low analyte concentrations.
  • Example 5 Increase of the assay sensitivity by increasing the amount of biotinylated anti-prothrombin antibody in the reaction mixture
  • Standard human plasma was adjusted to defined concentrations by addition of purified F 1 + 2 antigen and tested with three different dilution steps of the biotinylated anti-prothrombin antibody prepared according to Example 1 (see Example 2).
  • the test series with the highest anti-prothrombin antibody concentration (MAK 1:10) shows lower signals in the range of high analyte concentrations compared to the mean MAK concentration (MAK 1: 100). This effect can be explained by the blockage of sensibeads by the biotinylated anti-prothrombin MAb. At the lowest MAK concentration (MAK 1: 1000), the lowest signal levels were achieved.
  • the determined data are summarized in FIG.
  • the dilution of the plasma samples reduces the influence of prothrombin on the assay.
  • An approximately 10,000-fold molar excess of prothrombin over F 1 + 2 blocks most of the biotinylated anti-prothrombin antibody by prothrombin molecules.
  • the prothrombin is present at a normal concentration of 100 mg / ml in an approximately ⁇ fachmal excess to the antibody. Dilution of the plasma samples shifts the molar ratio of biotinylated anti-prothrombin antibody to prothrombin in favor of the antibody.
  • the ratio of prothrombin to antibody in the reaction mixture is 2: 3.
  • the antibody is thus present in excess of the prothrombin.
  • the determined curves reflect the above-described influence of the prothrombin on the assay.
  • the signals rise first, since the anti-prothrombin MAK is no longer blocked to the same extent as in undiluted samples of prothrombin molecules. Only at higher dilutions do the signal levels begin to decrease due to the decreasing Fi + 2 concentrations. In the range of low dilutions, the assay is therefore dominated by the excess prothrombin. With increasing dilution one arrives in a range of the dilution fastness, in which the signal strength correlates with the F 1 + 2 -concentration.
  • FIG. 1 A first figure.
  • Plasma samples used in the assay were also performed on the standard Fi + 2 samples.
  • the concentrations given here thus do not correspond to the actual F 1 + 2 content, but are additionally due to the

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Abstract

The invention relates to a homogeneous method which allows an analyte to be determined in the presence of one or several cross-reacting substances with the aid of analyte-specific binding partners that are associated with one respective component of a signal-forming system.

Description

Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in Gegenwart eines Überschusses von kreuzreagierenden SubstanzenHomogeneous method for the determination of an analyte in the presence of an excess of cross-reacting substances
Die Erfindung betrifft ein homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, in der zusätzlich ein Überschuss einer Substanz enthalten ist, die mit einem der Analyt-spezifischen Bindungspartner kreuzreagiert.The invention relates to a homogeneous method for the determination of an analyte in a sample, which additionally contains an excess of a substance which cross-reacts with one of the analyte-specific binding partners.
In der medizinischen Diagnostik, aber auch in der Umweltanalytik und anderen Fachgebieten spielt die quantitative, semiquantitative oder qualitative Bestimmung von Analyten in Proben eine zentrale Rolle. Insbesondere für den Nachweis von Biomolekülen steht eine breite Palette von Bindungstesten zur Verfügung, die durch den Einsatz Analyt-spezifischer Bindungspartner eine spezifische Detektion und exakte Quantifizierung ermöglichen. Beispiele für Bindungsteste sind Immunoassays oder Verfahren, bei denen Nukleinsäuren hybridisiert werden.In medical diagnostics, but also in environmental analysis and other disciplines, the quantitative, semi-quantitative or qualitative determination of analytes in samples plays a central role. In particular, for the detection of biomolecules, a wide range of binding tests are available, which allow specific detection and exact quantification by the use of analyte-specific binding partner. Examples of binding tests are immunoassays or methods in which nucleic acids are hybridized.
Man unterscheidet heterogene und homogene Verfahren, wobei sich die homogenen Verfahren dadurch auszeichnen, dass keine Wasch- und Separationsschritte erforderlich sind. Demzufolge sind homogene Verfahren für die Anwendung in automatischen Analysegeräten besonders bevorzugt, da sich der Ablauf eines Testes auf ein Minimum an Verfahrensschritten reduziert, wodurch sich erstens die Anzahl möglicher Fehlerquellen und zweitens die Testdauer verringert.A distinction is made between heterogeneous and homogeneous processes, the homogeneous processes being characterized in that no washing and separation steps are required. Accordingly, homogeneous methods are particularly preferred for use in automatic analyzers, since the sequence of a test is reduced to a minimum of method steps, which firstly reduces the number of possible error sources and secondly the test duration.
Eine besondere Kategorie von Bindungstesten sind die sogenannten Sandwichassays, die dadurch gekennzeichnet sind, dass zwei Analyt-spezifische Bindungspartner mit dem Analyten einen „Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner"- Komplex bilden. Dabei ist mindestens einer der Bindungspartner mit einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert, die die Messung eines quantifizierbaren, nachweisbaren Signals ermöglicht. Heterogene Sandwichassays sind derart konzipiert, dass vor der Induktion bzw. Messung des Signals eine Abtrennung der freien, ungebundenen Bindungspartner bzw. von ungebundenem Analyt notwendig ist, wie z. B. bei ELISA-Testen. Homogene Sandwichassays hingegen ermöglichen die Bestimmung des Messsignals, welches durch den „Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner"-Komplex zustande kommt, auch in Anwesenheit ungebundener, freier Bindungspartner- bzw. Analyt-Moleküle. Der Testansatz, welcher die Analyt-spezifischen Bindungspartner, die signalbildenden Komponenten und die Probe enthält, wird nach oder sogar während der Bindungsreaktion ohne einen weiteren Trenn- und/oder Waschschritt gemessen und das entsprechende Messsignal bestimmt. Beispiele für homogene Sandwichassays [z. B. Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology 7: 401-414] sind viele turbidimetrische oder nephelometrische Methoden, wobei die zum Nachweis verwendeten Analyt- spezifischen Bindungspartner mit Latexpartikeln assoziiert sein können, wie EMIT®- Teste; CEDIA®-Teste.A particular category of binding assays are the so-called sandwich assays, characterized in that two analyte-specific binding partners form a "binding partner / analyte / binding partner" complex with the analyte, at least one of the binding partners being associated with a component of a signal-forming system, Heterogeneous sandwich assays are designed in such a way that, prior to the induction or measurement of the signal, a Separation of the free, unbound binding partner or unbound analyte is necessary, such. In ELISA testing. Homogeneous sandwich assays, on the other hand, allow the determination of the measurement signal generated by the "binding partner / analyte / binding partner" complex, even in the presence of unbound, free binding partner or analyte molecules Components and the sample containing is measured after or even during the binding reaction without further separation and / or washing step and determines the corresponding measurement signal Examples of homogeneous sandwich assays [eg., Boguslaski & Li (1982) Applied Biochemistry and Biotechnology 7: 401-414] are many turbidimetric or nephelometric methods, wherein the specific for the detection of analyte used binding partners may be linked to latex particles, such as the EMIT ® - Test; CEDIA ® -Teste.
Eine besondere Ausführungsform eines homogenen Sandwichassays beruht auf der Verwendung eines signalbildenden Systems, bei welchem die Analyt-vermittelte Paarbildung, eine Wechselwirkung zwischen den beiden signalbildenden Komponenten ermöglicht, die dann ein messbares Signal verursacht. Beispiele für derartige Assays sind Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays oder der Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay, kurz LOCI™ [EP-B1-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. 91 : 5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42: 1518-1526]. Mit Hilfe dieses Verfahrens können zahlreiche Analyten (siehe auch EP-B1-0 515 194, Seiten 7-14) bestimmt und Analytkonzentrationen in einem Bereich von 10"4 bis 10~16 M gemessen werden.A particular embodiment of a homogeneous sandwich assay is based on the use of a signal-generating system in which the analyte-mediated pairing allows interaction between the two signal-forming components which then causes a measurable signal. Examples of such assays are fluorescence polarization immunoassays or Luminescent Oxygen Channeling Immunoassay, LOCI ™ for short [EP-B1-0 515 194; Ullman et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Be. 91: 5426-5430; Ullman et al. (1996) Clinical Chemistry 42: 1518-1526]. With the aid of this method, numerous analytes (see also EP-B1-0 515 194, pages 7-14) can be determined and analyte concentrations in a range from 10 "4 to 10 -16 M can be measured.
Eine Voraussetzung, die zur Verwendung dieses Sandwich-Verfahrens notwendig ist, ist die Verfügbarkeit von zwei Analyt-spezifischen Bindungspartnern. Damit eine Paarbildung und somit die Signal-induzierende Wechselwirkung stattfinden kann, muss gewährleistet sein, dass beide Bindungspartner gemeinsam an ein Analyt- Molekül binden 'können. Im Falle von LOCI™-lmmunoassays wird dies zum Beispiel durch die Verwendung zweier Analyt-spezifischer Antikörper bewerkstelligt, die an zwei unterschiedliche Epitope des Analyten binden. Während einer der Antikörper mit einem Photosensibilisator assoziiert ist, ist der andere Antikörper mit einer Chemilumineszenzverbindung assoziiert. Erst durch die räumliche Nähe der beiden signalgebenden Komponenten wird der Energietransfer vom Photosensibilisator auf die Chemilumineszenzverbindung ermöglicht, so dass die Menge der durch die Paarbildung hervorgerufenen Lumineszenz mit der Analytmenge korreliert.A prerequisite required for using this sandwich method is the availability of two analyte-specific binding partners. In order for pairing and thus the signal-inducing interaction to take place, it must be ensured that both binding partners can bind together to an analyte molecule. In the case of LOCI ™ immunoassays, for example, this is accomplished by the use of two analyte-specific antibodies that bind to two different epitopes of the analyte. While one of the antibodies is associated with a photosensitizer, the other antibody is with one Chemilumineszenzverbindung associated. Only by the spatial proximity of the two signaling components of the energy transfer from the photosensitizer on the chemiluminescent compound is made possible, so that the amount of luminescence caused by the pairing correlated with the amount of analyte.
Es ist jedoch bekannt, dass die Bestimmung verschiedener Analyten mit Hilfe homogener Verfahren, bei welchen das Signal aufgrund einer Paarbildung zustandekommt, problematisch ist. Es handelt sich dabei um Analyten, für die nur ein Analyt-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner verfügbar ist, während ein zweiter zur Verfügung stehender Bindungspartner zwar Analyt-spezifisch, aber polyreaktiv ist.However, it is known that the determination of various analytes is problematic using homogeneous methods in which the signal is due to pairing. These are analytes for which only one analyte-specific, monoreactive binding partner is available, while a second available binding partner is analyte-specific, but polyreactive.
Monoreaktiv im Sinne der vorliegenden Erfindung heißt, dass der Bindungspartner gegenüber anderen Substanzen in der Probe keine oder eine zu vernachlässigende Affinität aufweist und mit hoher Spezifität an den Analyten bindet. Ein Analyt- spezifischer, polyreaktiver Bindungspartner hingegen bindet zwar den Analyten aber auch an mindestens eine weitere Substanz, die in der Probe enthalten ist.Monoreactive in the context of the present invention means that the binding partner has no or negligible affinity for other substances in the sample and binds to the analyte with high specificity. An analyte-specific, polyreactive binding partner, on the other hand, binds the analyte but also to at least one further substance which is contained in the sample.
Die Bestimmung eines Analyten in einer Probe, die wahrscheinlich den Analyten enthält und zusätzlich einen hohen Überschuss einer mit dem polyreaktiven Bindungspartner interagierenden Substanz, ist dadurch erschwert, dass die kreuzreagierende Substanz eine übermäßige bis vollständige Bindung aller polyreaktiven Bindungspartner-Moleküle bewirkt, die somit nicht mehr für die Bindung an den Analyten zur Verfügung stehen. Der Erhöhung der Menge an polyreaktivem Bindungspartner, wodurch diesem Effekt entgegengewirkt werden kann, sind Grenzen gesetzt, da sich mit dieser Maßnahme die Sensitivität des Testes signifikant verschlechtert. Die Anwesenheit von sehr hohen Konzentrationen an Photosensibilisator- bzw. Chemilumineszenzverbindung-gekoppelten Bindungs¬ partnern ruft zunehmend unspezifische Signale hervor, wodurch eine zuverlässige Bestimmung der Analyt-Konzentration unmöglich ist.The determination of an analyte in a sample likely to contain the analyte and, in addition, a high excess of a substance interacting with the polyreactive binding partner is made more difficult by the cross-reacting substance causing excessive to complete binding of all the polyreactive binding partner molecules which is therefore no longer effective be available for binding to the analyte. There are limits to increasing the amount of polyreactive binding partner, which can counteract this effect, since the sensitivity of the test is significantly worsened with this measure. The presence of very high concentrations of photosensitizer or chemiluminescent compound-coupled binding partners increasingly causes nonspecific signals, whereby a reliable determination of the analyte concentration is impossible.
Ein Beispiel für das vorliegende technische Problem ist die Bestimmung der Prothrombin-Fragmente Fi+2 bzw. F2, kurz F2/F1+2 in Blut- oder Plasmaproben. Prothrombin ist das Proenzym von Thrombin, dem zentralen Enzym der Blutgerinnungskaskade. Das Prothrombin-Protein ist modular aufgebaut und besteht aus einem N-terminalen Fi+2-AnteiI und einem C-terminalen Thrombin-Anteil. Durch die proteolytische Aktivität des Faktors Xa wird Prothrombin gespalten, so dass je Prothrombin-Molekül (70 kD) ein Thrombin-Molekül (30 kD) unter Freisetzung eines Prothrombin-Fragmentes F1+2 (35 kD) entsteht. Durch die autokatalytische Spaltung von Prothrombin durch Thrombin kann es des weiteren zur Spaltung der Fragmente F1 und F2 kommen. Da Thrombin in freier Form im Blut nicht vorkommt, sondern unmittelbar im Anschluss an seine Bildung an Inhibitoren und an Fibrin gebunden wird, muss das Ausmaß der Thrombinbildung indirekt erfasst werden, z. B. durch die Bestimmung der Aktivierungsmarker F1+2 und/oder F2. Eine Möglichkeit zum Nachweis oder zum Ausschluss einer gesteigerten Thrombinbildung in vivo ist demnach die Bestimmung der F2/F1+2-Konzentration im Plasma.An example of the present technical problem is the determination of the prothrombin fragments Fi +2 or F 2 , short F 2 / F 1 + 2 in blood or plasma samples. Prothrombin is the proenzyme of thrombin, the central enzyme in the blood clotting cascade. The prothrombin protein is modular and consists of an N-terminal Fi +2 -AnteiI and a C-terminal thrombin portion. Prothrombin is cleaved by the proteolytic activity of factor Xa, so that a thrombin molecule (30 kD) is formed per prothrombin molecule (70 kD) with the release of a prothrombin fragment F 1 + 2 (35 kD). The autocatalytic cleavage of prothrombin by thrombin can further lead to the cleavage of the fragments F 1 and F 2 . Since thrombin does not occur in the blood in free form, but is bound to inhibitors and fibrin immediately after its formation, the extent of thrombin formation must be detected indirectly, e.g. B. by the determination of the activation marker F 1 + 2 and / or F 2 . One possibility for the detection or exclusion of increased thrombin formation in vivo is therefore the determination of the F 2 / F 1 + 2 concentration in the plasma.
Generell tritt bei F2/F1+2-Testen die Schwierigkeit auf, dass Prothrombin in Plasmaproben im Vergleich zu F2/Fi+2 in großem Überschuss vorliegt. Die Prothrombin-Konzentration im Plasma gesunder Individuen variiert zwischen 1 bis 2 μmol/l, während die F1+2-Konzentration in der Regel zwischen 60 und 200 pmol/l liegt und bei akuten venösen Thromboembolien Werte von bis zu 9,5 nmol/l erreichen kann. Das bedeutet, dass verglichen mit der F1+2-Konzentration ein 1 000 bis 10000facher molarer Überschuss an Prothrombin in Plasmaproben vorliegt.In general, the difficulty arises in F 2 / F 1 + 2 tests that prothrombin is present in plasma samples in large excess compared to F 2 / Fi +2 . The prothrombin concentration in the plasma of healthy individuals varies between 1 and 2 μmol / l, while the F 1 + 2 concentration is usually between 60 and 200 pmol / l and values of up to 9.5 nmol in acute venous thromboembolism / l can reach. This means that, compared to the F 1 + 2 concentration, there is a 1,000 to 10,000 fold molar excess of prothrombin in plasma samples.
Der immunologische Nachweis von F2/F1+2 in Gegenwart von Prothrombin wird dadurch erschwert, dass die freigesetzten Prothrombinfragmente F2/F1+2 gegenüber intaktem, ungespaltenem Prothrombin nur über ein einziges F2/F1+2-spezifisches, antigenes Epitop verfügen und zwar den nach der Abspaltung von Thrombin entstehenden Carboxyterminus des F2/F1+2-Peptids (Neoantigen). Ausschließlich Antikörper, die gegen den carboxyterminalen Bereich des F2/F1+2-Peptids gerichtet sind, sind in der Lage spezifisch an die Prothrombinfragmente F2/F1+2 zu binden, ohne gleichzeitig eine Spezifität für intaktes Prothrombin aufzuweisen. Alle anderen Epitope des Fi+2-Fragmentes sind, soweit bislang bekannt, ebenso spezifisch für intaktes Prothrombin. Im Stand der Technik sind monoklonale wie auch polyklonale Antikörper bekannt, die gleichermaßen an F2/Fi+2 und Prothrombin binden, aber auch solche die ausschließlich an F2/F1+2 binden und nicht mit Prothrombin reagieren (EP-B1- 303 983, EP-B1-594 576, US 6,541 ,275). Diese Antikörper eignen sich zur Bestimmung der F2/Fi+2-Konzentration in Plasmaproben in heterogenen Immunoassays, bevorzugt in Form eines Sandwich-ELISA-Verfahrens. Dazu werden die F2/Fi+2-Neoantigen-spezifischen Antikörper an eine Festphase gekoppelt und mit der Probe inkubiert, so dass die F2/Fi+2-Peptide an die immobilisierten Antikörper binden können. Durch einen Waschschritt werden ungebundene Proteine, insbesondere Prothrombin, entfernt, bevor durch Zugabe einer Antikörperlösung, der zweite, F2/F-1+2- und Prothrombin-bindende Antikörper appliziert wird. In der Regel ist dieser Zweitantikörper mit einer signalbildenden Komponente assoziiert, die eine Quantifizierung der F2/Fi+2-Konzentration erlaubt.The immunological detection of F 2 / F 1 + 2 in the presence of prothrombin is complicated by the fact that the released prothrombin fragments F 2 / F 1 + 2 to intact, uncleaved prothrombin only a single F 2 / F 1 + 2 -specific, antigenic Epitope and namely the resulting after the cleavage of thrombin carboxy terminus of the F 2 / F 1 + 2 peptide (neoantigen). Only antibodies directed against the carboxy-terminal region of the F 2 / F 1 + 2 peptide are able to specifically bind to the prothrombin fragments F 2 / F 1 + 2 without at the same time having a specificity for intact prothrombin. All other epitopes of the Fi +2 fragment are, so far known, also specific for intact prothrombin. Monoclonal as well as polyclonal antibodies are known in the prior art which bind equally to F 2 / Fi + 2 and prothrombin, but also those which bind exclusively to F 2 / F 1 + 2 and do not react with prothrombin (EP-B1-303 983, EP-B1-594 576, US 6,541,275). These antibodies are suitable for determining the F 2 / Fi + 2 concentration in plasma samples in heterogeneous immunoassays, preferably in the form of a sandwich ELISA method. For this purpose, the F 2 / Fi +2 neoantigen-specific antibodies are coupled to a solid phase and incubated with the sample, so that the F 2 / Fi + 2 peptides can bind to the immobilized antibodies. By means of a washing step, unbound proteins, in particular prothrombin, are removed before the second, F 2 / F 1 + 2 and prothrombin-binding antibody is applied by addition of an antibody solution. Typically, this second antibody is associated with a signal-forming component that allows quantification of the F 2 / Fi + 2 concentration.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein sensitives homogenes Verfahren bereitzustellen, dass die Bestimmung von Analyten ermöglicht, für welche nur ein monoreaktiver Bindungspartner zur Verfügung steht und die in einer Probe bestimmt werden sollen, die zusätzlich einen Überschuss mindestens einer Substanz enthält, die mit einem zweiten Analyt-spezifischen, aber polyreaktiven Bindungspartner kreuzreagiert.The present invention has for its object to provide a sensitive homogeneous method that allows the determination of analytes for which only one monoreactive binding partner is available and which are to be determined in a sample which additionally contains an excess of at least one substance with a second analyte-specific but polyreactive binding partner cross-reacts.
Die Lösung dieser Aufgabe besteht in der Bereitstellung der in den Ansprüchen beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren und Gegenstände.The solution to this problem is to provide the method and articles described in the claims.
Insbesondere wird die Aufgabe dadurch gelöst, dass einer Probe, die vermutlich den Analyten enthält, ein Analyt-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner und ein Analyt-spezifischer, polyreaktiver Bindungspartner zugegeben wird, wobei der polyreaktive Bindungspartner im Hinblick auf die Summe aller Substanzen, die eine Reaktion mit ihm eingehen, in 1,5 bis 5fach molarem Überschuss, bevorzugt in 2 bis 3fach molarem Überschuss, eingesetzt wird. Die Summe aller Substanzen, die eine Reaktion mit dem Analyt-spezifischen, polyreaktiven Bindungspartner eingeht, setzt sich aus der üblicherweise zu erwartenden Analyt-Menge (mol/l) und der Gesamtmenge kreuzreagierender Substanzen (mol/l), die üblicherweise in dem jeweiligen Probenmaterial enthalten sind, zusammen. Ferner sind die Analyt- spezifischen Bindungspartner mit je einer signalbildenden Komponente assoziiert, die durch die Bildung eines Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner-Komplexes in räumliche Nähe gebracht werden und infolgedessen in eine nachweisbare, quantifizierbare Wechselwirkung treten.In particular, the object is achieved in that a sample, which presumably contains the analyte, an analyte-specific, monoreactive binding partner and an analyte-specific, polyreaktive binding partner is added, the polyreactive binding partner in terms of the sum of all substances that a reaction enter with him, in 1.5 to 5-fold molar excess, preferably in 2 to 3-fold molar excess, is used. The sum of all substances which undergoes a reaction with the analyte-specific, polyreactive binding partner is composed of the usually expected amount of analyte (mol / l) and the total amount of cross-reacting substances (mol / l), which are usually present in the respective sample material are included, together. Furthermore, the analyte specific binding partner associated with each a signal-forming component, which are brought by the formation of a binding partner / analyte / binding partner complex in spatial proximity and consequently in a detectable, quantifiable interaction.
Unter einem „Bindungspartner" ist ein Mitglied eines Bindungspaares zu verstehen. Bei den Mitgliedern eines spezifischen Bindungspaares handelt es sich um zwei Moleküle, die jeweils mindestens eine zu einer Struktur des anderen Moleküls komplementäre Struktur aufweisen, wobei die beiden Moleküle sich über eine Bindung der komplementären Strukturen zu binden vermögen. Der Begriff Molekül umfasst auch Molekülkomplexe wie z. B. Enzyme, die aus Apo- und Coenzym bestehen, Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, Lipoproteine bestehend aus Protein und Lipiden etc. Spezifische Bindungspartner können natürlich vorkommende aber auch z.B. mittels chemischer Synthese, mikrobiologischer Techniken und/oder gentechnologischer Verfahren hergestellte Substanzen sein, wie z. B. Antikörper, Rezeptoren, Enzyme oder Polynukleotide.By a "binding partner" is meant a member of a binding pair, the members of a specific binding pair being two molecules each having at least one structure complementary to a structure of the other molecule, the two molecules being linked by a complementary binding The term molecule also includes molecular complexes such as enzymes consisting of apo- and coenzyme, proteins consisting of several subunits, lipoproteins consisting of protein and lipids, etc. Specific binding partners may be naturally occurring but also eg be produced by chemical synthesis, microbiological techniques and / or genetic engineering methods, such as antibodies, receptors, enzymes or polynucleotides.
Die Reaktion eines monoreaktiven oder polyreaktiven Bindungspartners mit dem Analyten ist eine spezifische Bindung, der z. B. eine wechselseitige Erkennung von komplementären Oberflächenstrukturen oder eine Wechselwirkung von polaren oder apolaren Gruppen zugrundeliegen kann. Beispiele für spezifische Bindungsreaktionen sind Antikörper/Antigen-, Antikörper/Hapten-, Rezeptor/Ligand-, Enzym/Substrat-, DNA/DNA-, DNA/RNA-; Operator/Repressor, Nuclease/Nukleotid, Biotin/Avidin, Lektin/Polysaccharid, Hormon/Hormonrezeptor und andere Interaktionen.The reaction of a monoreactive or polyreactive binding partner with the analyte is a specific binding, e.g. B. mutual recognition of complementary surface structures or an interaction of polar or non-polar groups may be based. Examples of specific binding reactions are antibody / antigen, antibody / hapten, receptor / ligand, enzyme / substrate, DNA / DNA, DNA / RNA; Operator / repressor, nuclease / nucleotide, biotin / avidin, lectin / polysaccharide, hormone / hormone receptor and other interactions.
Der polyreaktive Bindungspartner im Sinne der vorliegenden Erfindung reagiert neben dem Analyten mit mindestens einer weiteren Substanz, die in der Probe enthalten ist. Diese Reaktion kann ebenfalls auf einer spezifischen Bindung beruhen, z. B. wenn die Substanz über identische Oberflächenstrukturen verfügt wie der Analyt bzw. wenn der polyreaktive Bindungspartner den Analyten und die weitere kreuzreagierende Substanz aufgrund eines ihnen gemeinsamen Merkmals oder einer gemeinsamen Eigenschaft erkennt und bindet. Beispiele für polyreaktive Bindungspartner mit Spezifität für mehr als einen Analyten sind z. B. Antikörper die gegen solche Epitope eines Proenzyms gerichtet sind, welche auf den proteolytischen Spaitprodukten des Vorläufermoleküls erhalten bleiben. Ferner ist es möglich, dass der polyreaktive Bindungspartner spezifisch an den Analyten bindet und eine unspezifische Wechselwirkung mit einer oder mehreren weiteren Substanzen eingeht. Derartige unspezifische Reaktionen sind in der Regel dadurch gekennzeichnet, dass sie unabhängig von komplementären Oberflächenstrukturen auftreten können.The polyreactive binding partner in the sense of the present invention reacts with at least one further substance which is contained in the sample in addition to the analyte. This reaction may also be based on specific binding, e.g. B. if the substance has identical surface structures as the analyte or if the polyreactive binding partner recognizes and binds the analyte and the other cross-reacting substance due to a common feature or a common property. Examples of polyreactive binding partners having specificity for more than one analyte are e.g. B. antibodies the are directed against such epitopes of a proenzyme which are retained on the proteolytic spaite products of the precursor molecule. Furthermore, it is possible that the polyreactive binding partner binds specifically to the analyte and enters into a nonspecific interaction with one or more further substances. Such nonspecific reactions are usually characterized in that they can occur independently of complementary surface structures.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Analyt- spezifischen Bindungspartner monoklonale oder polyklonale Antikörper.In a preferred embodiment of the present invention, the analyte-specific binding partners are monoclonal or polyclonal antibodies.
Unter dem Begriff „Antikörper" ist im Sinne dieser Erfindung ein Immunglobulin, z. B. ein Immunglobulin der Klasse bzw. Subklasse IgA, IgD, IgE, IgGi, lgG2a, lgG2b, IgG3, IgG4, IgM, zu verstehen. Darunter sind nicht nur komplette Antikörper zu verstehen, sondern ausdrücklich auch Antikörperfragmente, wie z. B. Fab, Fv, F(ab')2, Fab', sofern die Bindungseigenschaften an das Antigen bzw. den Analyten erhalten sind.For the purposes of this invention, the term "antibody" means an immunoglobulin, for example an immunoglobulin of the class or subclass IgA, IgD, IgE, IgGi, IgG 2a , IgG 2 b, IgG 3 , IgG 4 , IgM This includes not only complete antibodies, but expressly also antibody fragments, such as, for example, Fab, Fv, F (ab ' ) 2 , Fab ' , provided the binding properties to the antigen or the analyte are obtained.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung eines Analyten beruht ferner auf der Verwendung Analyt-spezifischer Bindungspartner, die mit je einer Komponente eines signalbildenden Systems assoziiert sind, wobei es sich wenigstens bei einer Komponente um ein nachweisbares Label handelt.The method according to the invention for the determination of an analyte is further based on the use of analyte-specific binding partners, which are each associated with one component of a signal-forming system, wherein at least one component is a detectable label.
Als Label ist jedes Molekül zu verstehen, das selbst ein Signal produziert oder die Produktion eines Signals induzieren kann, wie z. B. eine fluoreszierende Substanz, eine radioaktive Substanz, ein Enzym oder eine chemilumineszierende Substanz. Das Signal kann beispielsweise anhand der Enzymaktivität, der Lumineszenz, der Lichtabsorption, der Lichtstreuung, der ausgestrahlten elektromagnetischen oder radioaktiven Strahlung oder einer chemischen Reaktion nachgewiesen oder gemessen werden.A label is any molecule that can itself produce a signal or induce the production of a signal such. As a fluorescent substance, a radioactive substance, an enzyme or a chemiluminescent substance. For example, the signal may be detected or measured by enzyme activity, luminescence, light absorption, light scattering, radiated electromagnetic or radioactive radiation, or a chemical reaction.
Ein „signalbildendes System" im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst Komponenten, die bei räumlicher Nähe miteinander in eine nachweisbare Wechselwirkung treten können, z. B. in Form von Energiespendern und Energieempfängern wie beispielsweise Photosensibilisator und chemolumineszierende Substanzen (EP-A2-0 515 194), Photosensibilisator und Fluorophore (WO 95/06877), radioaktives (od125 und Fluorophore [Udenfriend et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 8672-8676], Fluorophore und Fluorophore [Mathis (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959] oder Fluorophore und Fluoreszenz-Quencher (US 3,996,345).For the purposes of the present invention, a "signal-generating system" comprises components which, when in close proximity to one another, can undergo a detectable interaction with one another, for example in the form of energy donors and energy receivers such as, for example, photosensitizer and chemiluminescent substances (EP-A2-0 515 194), photosensitizer and fluorophores (WO 95/06877), radioactive (or 125 and fluorophores [Udenfriend et al., (1985) Proc. Natl. Acad., 82: 8672-8676] , Fluorophores and Fluorophores [Mathis (1993) Clin. Chem. 39: 1953-1959] or fluorophores and fluorescence quenchers (US 3,996,345).
Unter einer Wechselwirkung zwischen den Komponenten ist die direkte Übertragung von Energie zwischen den Komponenten, z. B. durch Licht- oder Elektronenstrahlung sowie über kurzlebige reaktive chemische Moleküle, miteingeschlossen. Ferner umfasst sind hiervon auch Vorgänge, bei denen die Aktivität einer Komponente durch eine oder mehrere andere inhibiert oder verstärkt wird, beispielsweise die Hemmung oder Steigerung der Enzymaktivität oder die Hemmung, Steigerung oder Veränderung (z. B. Wellenlängenverschiebung, Polarisation) des von der beeinflussten Komponente ausgesendeten elektromagnetischen Strahlung. Die Wechselwirkung zwischen den Komponenten umfasst auch Enzymkaskaden. In diesem Fall sind die Komponenten Enzyme, von denen mindestens eines das Substrat für ein anderes liefert, so dass eine maximale oder minimale Reakionsgeschwindigkeit der gekoppelten Substratumsetzung resultiert.Under an interaction between the components, the direct transfer of energy between the components, e.g. As by light or electron radiation and short-lived reactive chemical molecules, miteingeschlossen. Also included are processes in which the activity of one component is inhibited or enhanced by one or more others, for example, the inhibition or enhancement of enzyme activity, or the inhibition, enhancement, or alteration (eg, wavelength shift, polarization) of the affected one Component emitted electromagnetic radiation. The interaction between the components also includes enzyme cascades. In this case, the components are enzymes, at least one of which provides the substrate for another such that a maximum or minimum reaction rate of the coupled substrate reaction results.
Eine effektive Wechselwirkung zwischen den Komponenten findet in der Regel statt, wenn diese räumlich benachbart vorliegen, also z. B. innerhalb eines Abstandsbereiches von wenigen μm, insbesondere innerhalb eines Abstandbereiches von unter 600 nm, bevorzugt unter 400 nm, ganz besonders bevorzugt von unter 200 nm.An effective interaction between the components usually takes place when they are spatially adjacent, so z. B. within a distance range of a few microns, in particular within a distance range of less than 600 nm, preferably below 400 nm, most preferably of less than 200 nm.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der monoreaktive Bindungspartner mit einer Chemolumineszenzverbindung und der polyreaktive Bindungspartner mit einem Photosensibilisator assoziiert oder umgekehrt.In a preferred embodiment of the method according to the invention, the monoreactive binding partner is associated with a chemiluminescent compound and the polyreactive binding partner is associated with a photosensitizer or vice versa.
Beispiele für Chemolumineszenzverbindungen und für Substanzen, die sich als Photosensibilisatoren eignen, sind in EP-B1-0 515 194 beschrieben (Chemi- lumineszenzverbindungen siehe Seite 22, Zeile 42 bis Seite 34, Zeile 15; Photosensibilisatoren siehe Seite 17, Zeilen 26-50). Der Begriff „assoziiert" ist breit zu verstehen und umfasst beispielsweise eine kovalente und eine nicht-kovalente Bindung, eine direkte und eine indirekte Bindung, die Adsorption an eine Oberfläche und den Einschluß in eine Vertiefung oder einen Hohlraum etc. Bei einer kovalenten Bindung sind die Antikörper oder Bindungspartner über eine chemische Bindung an die Festphase oder an das Label gebunden. Beispiele für eine nicht-kovalente Bindung sind die Oberflächenadsorption, der Einschluss in Hohlräume oder die Bindung von zwei spezifischen Bindungspartnern. Neben einer direkten Bindung an die Festphase oder das Label können die Antikörper oder Bindungspartner auch indirekt über spezifische Wechselwirkung mit anderen spezifischen Bindungspartnern an die Festphase oder das Label gebunden sein (s. a. EP-A2-0 411 945). Dies soll anhand von Beispielen näher illustriert werden: Ein biotinylierter Antikörper kann über labelgebundenes Avidin an das Label gebunden werden; oder es kann ein Fluorescein- Antikörperkonjugat über festphasengebundene Anti-Fluorescein-Antikörper an die Festphase gebunden werden; oder der Antikörper kann über Immunglobulin- bindende Proteine an die Festphase oder das Label gebunden werden.Examples of chemiluminescent compounds and of substances which are suitable as photosensitizers are described in EP-B1-0 515 194 (chemiluminescent compounds see page 22, line 42 to page 34, line 15, photosensitizers see page 17, lines 26-50) , The term "associated" is to be understood broadly and includes, for example, a covalent and a non-covalent bond, a direct and an indirect bond, the adsorption to a surface and the inclusion in a depression or a cavity etc. in a covalent bond Antibodies or binding partners can be bound to the solid phase or bound to the label via a chemical bond Examples of noncovalent binding include surface adsorption, inclusion in cavities or the binding of two specific binding partners, in addition to direct binding to the solid phase or label The antibodies or binding partners are also bound to the solid phase or the label indirectly via specific interaction with other specific binding partners (see also EP-A2-0 411 945) .This will be illustrated in more detail by way of examples: A biotinylated antibody can be bound via label-bound avidin to the Be bound label or it ka a fluorescein antibody conjugate is bound to the solid phase via solid phase-bound anti-fluorescein antibodies; or the antibody can be bound to the solid phase or label via immunoglobulin-binding proteins.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform sind die Analyt-spezifischen Bindungspartner mit suspendierbaren Teilchen assoziiert, die mit einer Komponente eines signalbildenden Systems gekoppelt sind, bevorzugt mit einer Chemolumineszenzverbindung und einem Photosensibilisator.In another particular embodiment, the analyte-specific binding partners are associated with suspendible particles coupled to a component of a signal-forming system, preferably a chemiluminescent compound and a photosensitizer.
Diese suspendierbaren Teilchen umfassen Mikropartikel, bevorzugt Latexpartikel, die selbst beispielsweise mit Farbstoffen, Sensibilisatoren, fluoreszierenden Substanzen, chemilumineszierenden Substanzen, Isotopen oder anderen nachweisbaren Labein assoziiert sein können. Unter suspendierbaren Teilchen sind im Sinne dieser Erfindung Teilchen zu verstehen, die einen ungefähren Durchmesser von wenigstens 20 nm und nicht mehr als 20 μm aufweisen, üblicherweise zwischen 40 nm und 10 μm, bevorzugt zwischen 0,1 und 10 μm, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 5 μm, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,15 und 2 μm. Die Mikropartikel können regelmäßig oder unregelmäßig geformt sein. Sie können Kugeln, Spheroide, Kugeln mit mehr oder weniger großen Kavitäten oder Poren darstellen. Die Mikropartikel können aus organischem, aus anorganischem Material oder aus einer Mischung oder Kombination von beiden bestehen. Sie können aus einem porösen oder nicht porösen, einem schwellfähigen oder nicht schwellfähigen Material bestehen. Prinzipiell können die Mikropartikel jegliche Dichte haben, bevorzugt sind jedoch Partikel mit einer Dichte, die der Dichte des Wassers nahe kommt wie etwa 0,7 bis etwa 1 ,5 g/ml. Die bevorzugten Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbar und möglichst lange suspensionsstabil. Sie mögen durchsichtig, teilweise durchsichtig oder undurchsichtig sein. Die Mikropartikel können aus mehreren Schichten bestehen wie beispielsweise die sogenannten „core-and-shell" Partikel mit einem Kern und einer oder mehreren umhüllenden Schichten. Der Begriff Mikropartikel umfasst beispielsweise Farbstoffkristalle, Metallsolen, Silica-Partikel, Glaspartikel, Magnetpartikel, Polymerteilchen, Öltropfen, Lipidpartikel, Dextran, und Proteinaggregate. Bevorzugte Mikropartikel sind in wässrigen Lösungen suspendierbare und aus wasserunlöslichem Polymermaterial bestehende Partikel, insbesondere aus substituierten Polyethylenen. Ganz besonders bevorzugt sind Latexpartikel z.B. aus Polystyrol, Acrylsäurepolymeren, Methacrylsäurepolymeren, Acrylnitril-Polymeren, Acrylnitril-Butadien-Styrol, Polyvinylacetat-Acrylat,These suspendible particles comprise microparticles, preferably latex particles, which themselves may be associated with, for example, dyes, sensitizers, fluorescers, chemiluminescers, isotopes or other detectable labein. For the purposes of this invention, suspendable particles are particles which have an approximate diameter of at least 20 nm and not more than 20 μm, usually between 40 nm and 10 μm, preferably between 0.1 and 10 μm, particularly preferably between 0, 1 and 5 microns, most preferably between 0.15 and 2 microns. The microparticles may be regular or irregular in shape. They can represent spheres, spheroids, spheres with more or less large cavities or pores. The microparticles can be made of organic, of inorganic material or of a mixture or Combination of both exist. They may consist of a porous or non-porous, a swellable or non-swellable material. In principle, the microparticles may have any density, but preferred are particles having a density close to the density of the water, such as from about 0.7 to about 1.5 g / ml. The preferred microparticles are suspendible in aqueous solutions and as long as possible suspension stable. They may be transparent, partially transparent or opaque. The microparticles may consist of several layers, for example the so-called "core-and-shell" particles having a core and one or more enveloping layers The term microparticles includes, for example, dye crystals, metal sols, silica particles, glass particles, magnetic particles, polymer particles, oil drops, Lipid particles, dextran, and protein aggregates Preferred microparticles are particles which can be suspended in aqueous solutions and consist of water-insoluble polymer material, in particular substituted polyethylenes. Very particular preference is given to latex particles, for example, of polystyrene, acrylic acid polymers, methacrylic acid polymers, acrylonitrile polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene, polyvinyl acetate acrylate,
Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat. Von besonderem Interesse sind Latexpartikel mit reaktiven Gruppen an ihrer Oberfläche wie beispielsweise Carboxyl-, Amino- oder Aldehydgruppen, die eine kovalente Bindung z.B. von spezifischen Bindungspartnern an die Latexpartikel erlauben. Die Herstellung von Latexpartikeln ist beispielsweise in EP-B1-0 080 614, EP-B1-0 227 054 und EP-B1-0 246 446 beschrieben.Polyvinylpyridine, vinyl chloride acrylate. Of particular interest are latex particles having reactive groups on their surface, such as carboxyl, amino or aldehyde groups, which have a covalent bond, e.g. allow specific binding partners to the latex particles. The preparation of latex particles is described for example in EP-B1-0 080 614, EP-B1-0 227 054 and EP-B1-0 246 446.
Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in einem Volumenverhältnis von 1 :1 bis 1 :250 verdünnt wird und der Analyt-spezifische, polyreaktive Bindungspartner im Verhältnis zur Summe aller Substanzen, an die er binden kann, in 1 ,5 bis 5fach molarem Überschuss eingesetzt wird.The present inventive method is further characterized in that the sample is diluted in a volume ratio of 1: 1 to 1: 250 and the analyte-specific, polyreactive binding partner in relation to the sum of all substances to which it can bind, in 1, 5 up to 5-fold molar excess is used.
So kann z. B. mit Hilfe eines Vorversuchs die maximale Konzentration des polyreaktiven Bindungspartners ermittelt werden, die eingesetzt werden kann, ohne dass ein Analyt-unabhängiges, unspezifisches Hintergrundsignal erzeugt wird. Anschließend wird die Probe verdünnt, um die Konzentration der kreuzreagierenden Substanz zu reduzieren bis die Verdünnung proportional zum entstehenden Messsignal ist. Auf diese Weise wird die optimale Kombination von polyreaktivem Bindungspartner und Probenverdünnung ermittelt (siehe Beispiele 5 und 6).So z. Example, by means of a preliminary experiment, the maximum concentration of the polyreactive binding partner can be determined, which can be used without an analyte-independent, nonspecific background signal is generated. Subsequently, the sample is diluted to reduce the concentration of the cross-reacting substance until the dilution is proportional to the resulting Measuring signal is. In this way, the optimal combination of polyreactive binding partner and sample dilution is determined (see Examples 5 and 6).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Proben, wie z. B. Blut- oder Plasmaproben, in einem Volumenverhältnis von 1 :2 bis 1 :100, besonders bevorzugt in einem Verhältnis von 1 :4 bis 1 :32 verdünnt.In a preferred embodiment of the present invention, the samples, such. As blood or plasma samples, in a volume ratio of 1: 2 to 1: 100, more preferably diluted in a ratio of 1: 4 to 1: 32.
Unter einer „Probe" ist im Sinne der Erfindung das Material zu verstehen, das den nachzuweisenden Analyten vermutlich enthält. Der Begriff Probe umfasst beispielsweise biologische Flüssigkeiten oder Gewebe insbesondere von Menschen und Tieren wie Blut, Plasma, Serum, Sputum, Exudat, bronchoalveoläre Lavage, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Vaginalschleim, Feces, Urin, Liquor, Haare, Haut, Gewebeproben oder -schnitte. Ferner werden umfasst Zellkulturproben, pflanzliche Flüssigkeiten oder Gewebe, forensische Proben, Wasser- und Abwasserproben, Nahrungsmittel, Arzneimittel. Gegebenenfalls müssen die Proben vorbehandelt werden, um den Analyten für das Nachweisverfahren zugänglich zu machen oder um störende Probenbestandteile zu entfernen. Solche Vorbehandlung von Proben mag die Abtrennung und/oder Lyse von Zellen beinhalten, das Präzipitieren, die Hydrolyse oder die Denaturierung von Probenbestandteilen wie z. B. Proteinen, die Zentrifugation von Proben, das Behandeln der Probe mit organischen Lösungsmitteln wie z. B. Alkohole, insbesondere Methanol, das Behandeln der Probe mit Detergenzien.For the purposes of the invention, a "sample" is understood as meaning the material which presumably contains the analyte to be detected. The term sample includes, for example, biological fluids or tissues, in particular of humans and animals, such as blood, plasma, serum, sputum, exudate, bronchoalveolar lavage. Lymphatic fluid, synovial fluid, seminal fluid, vaginal mucus, feces, urine, cerebrospinal fluid, hair, skin, tissue samples or incisions, cell culture samples, plant fluids or tissues, forensic samples, water and wastewater samples, food, pharmaceuticals, etc. If necessary, the samples must be pretreated Such pretreatment of samples may involve separation and / or lysis of cells, precipitation, hydrolysis or denaturation of sample components such as proteins, for example, to provide the analyte for the detection procedure or to remove interfering sample components. the centrifugation of sample n, treating the sample with organic solvents such. As alcohols, especially methanol, treating the sample with detergents.
Des weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Signal nach einer Dauer der gemeinsamen Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 300 Sekunden, bevorzugt weniger als 200 Sekunden und besonders bevorzugt weniger als 160 Sekunden gemessen wird.Furthermore, the method according to the invention is characterized in that the signal is measured after a period of joint incubation of both components of the signal-forming system in the reaction mixture of less than 300 seconds, preferably less than 200 seconds and more preferably less than 160 seconds.
Überraschenderweise ermöglicht die Beschränkung der Inkubationszeit auf weniger als 300 Sekunden die Messung eines Signals hoher Spezifität und ausreichender Stärke, wodurch eine präzise Quantifizierung des Analyten möglich ist. Durch diese Maßnahme wird das Dilemma zweier gegenläufiger Effekte gelöst. Einerseits geht mit einer Verlängerung der Inkubationszeit eine Erhöhung des spezifischen Signals einher, wodurch eine zuverlässige Messung des Signals ermöglicht wird. Andererseits setzt mit der fortgesetzten Inkubation auch eine Verminderung der Signalstärke ein, so dass die Summe an gemessenem Signal nicht mehr mit der Analyt-Menge korreliert. Der Signal-erniedrigende Effekt ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die im Überschuss vorliegende Substanz durch übermäßige Bindung an den polyreaktiven Bindungspartner, die mit dem polyreaktiven Bindungspartner assoziierte Komponente des signalbildenden Systems abschirmt und so die für die Bildung des Signals erforderliche Wechselwirkung mit der zweiten Komponente des Systems behindert.Surprisingly, the limitation of the incubation time to less than 300 seconds allows the measurement of a signal of high specificity and sufficient strength, which allows a precise quantification of the analyte. This measure solves the dilemma of two opposing effects. On the one hand, an increase in the incubation time leads to an increase in the specific signal accompanied, whereby a reliable measurement of the signal is made possible. On the other hand, with the continued incubation, a decrease in the signal strength also occurs, so that the sum of the measured signal no longer correlates with the amount of analyte. The signal-degrading effect may be due to the excess substance blocking the component of the signal-forming system associated with the polyreactive binding partner through excessive binding to the polyreactive binding partner, thus requiring the interaction with the second component of the signal Systems hindered.
Mit Hilfe des vorliegenden homogenen Verfahrens können verschiedenste Analyten bestimmt werden, wie z. B. Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Steroide und andere. Bevorzugt sind Bestandteile des Gerinnungs- oder Fibrinolysesystems. Besonders bevorzugt sind alle Aktivierungsmarker der Gerinnung, die durch proteolytische Spaltung aktiviert werden, wie z. B. proteolytische Spaltprodukte der Gerinnungsfaktoren Faktor IX, Faktor X und Faktor Xl, bevorzugt die Spaltprodukte von Faktor Il (= Prothrombin) F2 bzw. Fi+2, proteolytische Spaltprodukte des Fibrinogens, wie z. B. Fibrinopetid A oder B, oder Fibrinogendegradationsprodukte, wie z. B. Fragment X, Fragment Y, Fragment D, Fragment E, die eine Beurteilung des Gerinnungsstatus erlauben.With the help of the present homogeneous method a variety of analytes can be determined, such. As proteins, peptides, nucleic acids, steroids and others. Preference is given to components of the coagulation or fibrinolysis system. Particularly preferred are all activation markers of coagulation, which are activated by proteolytic cleavage, such. B. proteolytic cleavage products of coagulation factors Factor IX, Factor X and Factor Xl, preferably the cleavage products of factor II (= prothrombin) F 2 and Fi +2 , proteolytic cleavage products of fibrinogen such. As fibrinopeptide A or B, or Fibrinogendegradationsprodukte, such as. B. Fragment X, Fragment Y, Fragment D, Fragment E, which allow an assessment of the coagulation status.
Die Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht die Bestimmung von Analytkonzentration bis zu etwa 10"12 mol/l in Anwesenheit von einem beispielsweise 10 000fach molaren Überschuss einer mit dem polyreaktiven Bindungspartner kreuzreagierenden Substanz.The sensitivity of the method according to the invention allows the determination of analyte concentration up to about 10 "12 mol / l in the presence of, for example, a 10,000 times molar excess of a cross-reactive with the polyreactive binding partner substance.
Die im folgenden beschriebenen Beispiele dienen der Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens und sind nicht als Einschränkung zu verstehen. BeispieleThe examples described below serve to illustrate the method according to the invention and are not intended to be limiting. Examples
Die folgenden Beispiele betreffen die erfindungsgemäße Bestimmung des Prothrombin-Fragmentes Fi+2 in Humanplasmaproben, wobei die F1+2-spezifischen Bindungspartner mit suspendierbaren Polystyrolpartikeln (Beads) assoziiert sind, an welche wiederum ein anregbarer Photosensibilisator bzw. eine Chemolumineszenzverbindung gekoppelt ist. Die mit einem Photosensibilisator- gekoppelten Polystyrolpartikel werden auch als Sensibeads, die mit einer Chemolumineszenzverbindung-gekoppelten Polystyrolpartikel als Chemibeads bezeichnet. Bei den Beads handelt es sich um Dextran-beschichtete Polystyrolpartikel, wobei die Sensibeads mit Phtalocyanin und die Chemibeads mit Europiumchelat gelabelt sind. Die Herstellung der Beads wurde gemäß Ullman et al. (1996) Clin. Chem. 42(9): 1518-1526 und den darin zitierten Referenzen bzw. gemäß WO 01/67105 durchgeführt. In diesem besonderen Beispiel wurden Streptavidin-beschichtete Sensibeads verwendet, die über eine Streptavidin/Biotin-Bindung die Assoziation des biotinylierten Bindungspartners an die Sensibeads ermöglichen. Der Photosensibilisator ist durch Licht einer Wellenlänge von 680 nm anregbar und produziert dann Singulett-Sauerstoff, der wiederum die Chemolumineszenzverbindung anzuregen vermag, wodurch ein Chemolumineszenzsignal entsteht, welches gemessen werden kann und mit der Menge von Fi+2 in der Probe korreliert.The following examples relate to the determination according to the invention of the prothrombin fragment Fi +2 in human plasma samples, wherein the F 1 + 2 -specific binding partners are associated with suspendable polystyrene particles (beads), to which in turn a stimulable photosensitizer or a chemiluminescent compound is coupled. The photosensitizer-coupled polystyrene particles are also referred to as sensibeads, and the chemiluminescent compound-coupled polystyrene particles are referred to as chemibeads. The beads are dextran-coated polystyrene particles, with the sensitibeads labeled with phthalocyanine and the chemibeads with europium chelate. The preparation of the beads was carried out according to Ullman et al. (1996) Clin. Chem. 42 (9): 1518-1526 and the references cited therein or according to WO 01/67105. In this particular example streptavidin-coated Sensibeads were used which allow via a streptavidin / biotin bond the association of the biotinylated binding partner to the Sensibeads. The photosensitizer is excitable by light of a wavelength of 680 nm and then produces singlet oxygen, which in turn is capable of exciting the chemiluminescent compound, producing a chemiluminescent signal which can be measured and correlated with the amount of Fi + 2 in the sample.
Als polyreaktiver Bindungspartner, der sowohl Fi+2 wie auch intaktes Prothrombin bindet, wurde ein monoklonaler Antikörper verwendet (anti-Prothrombin-MAK), der von der Hybridomzelllinie 92-195/097 produziert wird, die bei der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig, Deutschland, unter der Eingangsnummer DSM ACC2607 hinterlegt ist. Als monoreaktiver Bindungspartner mit Spezifität für das carboxyterminale Neoantigen von F1+2 wurde ebenfalls ein monoklonaler Antikörper verwendet (anti- Fi+2-MAK). Die Herstellung eines solchen Antikörpers ist aus dem Stand der Technik bekannt. Beispiel 1 : Herstellung der für den homogenen Assay notwendigen ReagenzienAs a polyreactive binding partner that binds both Fi +2 and intact prothrombin, a monoclonal antibody (anti-prothrombin MAb) produced by the hybridoma cell line 92-195 / 097 used in the DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b, 38124 Braunschweig, Germany, under the accession number DSM ACC2607. As a monoreactive binding partner with specificity for the carboxy-terminal neoantigen of F 1 + 2 , a monoclonal antibody was also used (anti-Fi + 2 -MAK). The preparation of such an antibody is known from the prior art. Example 1: Preparation of reagents necessary for the homogeneous assay
a) Biotinylierung des polyreaktiven anti-Prothrombin-MAKa) Biotinylation of the polyreactive anti-prothrombin MAb
Der anti-Prothrombin-Antikörper wurde für die Biotinylierung zunächst in eine 10O mM NaHCO3-Lösung umgepuffert und der IgG-Gehalt der Lösung wurde photometrisch bestimmt. In DMSO gelöstes Biotin-PEO4-NHS (EZ-Link™NHS-PEO4- Biotin, Pierce, IL, USA) wurde mit der Antikörperlösung gemischt, so dass ein mehrfacher molarer Überschuss des Biotins gegenüber IgG im Reaktionsansatz entstand. Nach Inkubation des Reaktionsansatzes bei Raumtemperatur wurde der biotinylierte anti-Prothrombin-Antikörper über Sephadex® G25 (Amersham Biosciences Europe GmbH, Deutschland) aufgereinigt und in einem geeigneten Puffer auf eine Konzentration von 2 mg/ml eingestellt.The anti-prothrombin antibody was first buffered in a 10 mM NaHCO 3 solution for the biotinylation and the IgG content of the solution was determined photometrically. Biotin-PEO 4 -NHS (EZ-Link ™ NHS-PEO 4 - Biotin, Pierce, Ill., USA) dissolved in DMSO was mixed with the antibody solution to give a multiple molar excess of biotin to IgG in the reaction. After incubation of the reaction mixture at room temperature, the biotinylated anti-prothrombin antibody was purified on Sephadex® G25 (Amersham Biosciences Europe GmbH, Germany) and adjusted in a suitable buffer to a concentration of 2 mg / ml.
b) Kopplung des monoreaktiven anti-Fi+?-Antikörpers an Chemibeadsb) Coupling of the Monoreactive Anti-Fi + Antibody to Chemibeads
Eine anti-F-ι+2-Antikörper-Lösung wurde über Sephadex® G25 aufgereinigt, in 50 mM MES-Puffer (pH 6,0) aufgenommen, photometrisch quantifiziert und auf eine IgG- Konzentration von 20 mg/ml eingestellt. 50 mg der Europiumchelat-gekoppelten Chemibeads wurden durch mehrfache Sedimentation und Resuspension in MES- Puffer (pH 6,0) gewaschen und schließlich auf eine Chemibead-Konzentration von 100 mg/ml eingestellt. 500 μl der anti-F1+2-Antikörper-Lösung wurden mit 500 μl Chemibead-Lösung, 2 μl 4 %iger Tween® 20-Lösung sowie 24 μl NaBH3CN-Lösung (25 mg NaBH3CN/ml) gemischt und 60 Stunden bei 37 0C inkubiert. Anschließend wurden 50 μl 0,5 M CMO-Lösung zugegeben und weitere 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Abschließend wurde der Reaktionsansatz zur Abtrennung ungebundenener Reaktionspartner sowie zur Homogenisierung der Partikel mit Ultraschall behandelt.An anti-F ι + 2 antibody solution was purified on Sephadex® G25, taken up in 50 mM MES buffer (pH 6.0), quantified photometrically and adjusted to an IgG concentration of 20 mg / ml. 50 mg of the europium chelate-coupled chemibeads were washed by multiple sedimentation and resuspension in MES buffer (pH 6.0) and finally adjusted to a Chemibead concentration of 100 mg / ml. 500 μl of the anti-F 1 + 2 antibody solution were mixed with 500 μl Chemibead solution, 2 μl 4% Tween® 20 solution and 24 μl NaBH 3 CN solution (25 mg NaBH 3 CN / ml) and Incubated at 37 0 C for 60 hours. Subsequently, 50 .mu.l 0.5 M CMO solution was added and incubated for a further 2 hours at 37 ° C. Finally, the reaction mixture for the separation of unbound reactants and for the homogenization of the particles was treated with ultrasound.
Die Chemibeads wurden durch Zentrifugation sedimentiert, in MES-Puffer (pH 6,0) resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Dieser Waschschritt und die anschließende Beschallung wurden mit MES-Puffer und zweimal mit CB-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCI, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 12,5 μg/ml Dextran Sulfat, 16 mg/ml BSA, 2 mg/ml bovines γ-Globulin, 0,1 % [w/v] Triton X 405, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2) wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt wurden die anti-Fi+2-Antikörper-beschichteten Chemibeads mit CB-Puffer auf eine Konzentration von 50 mg/ml eingestellt und einer letzten Ultraschallbehandlung unterworfen.The Chemibeads were sedimented by centrifugation, resuspended in MES buffer (pH 6.0) and sonicated. This washing step and subsequent sonication were performed with MES buffer and twice with CB buffer (50 mM HEPES, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg / ml Dextran T-500, 12.5 μg / ml dextran Sulfate, 16 mg / ml BSA, 2 mg / ml bovine γ-globulin, 0.1% [w / v] Triton X 405, 0.15% [v / v] Proclin 300, 0.1 mg / ml neomycin sulfate , pH 7.2). After the last wash, the anti-Fi + 2 antibody-coated Chemibeads were adjusted to a concentration of 50 mg / ml with CB buffer and subjected to a final sonication.
Beispiel 2: LOCI™ zur Quantifizierung des Fi+2-Gehaltes von HumanplasmaprobenExample 2: LOCI ™ to quantify the Fi + 2 content of human plasma samples
Soweit nicht anders angegeben wurden die Reagenzien in folgenden Konzentrationen verwendet: 75 μg/ml anti-F1+2-Chemibeads in CB-Puffer (pH 7,2), gemäß Beispiel 1a) hergestellter biotinylierter anti-Prothrombin-Antikörper in BA- Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCI, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 0,1 % [w/v] Triton X 405, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2) 1 :66 verdünnt, 1 mg/ml Streptavidin-beschichtete Sensibeads in SB-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCI, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 16 mg/ml BSA, 2 mg/ml bovines γ-Globulin, 0,1 % [w/v] Triton X 405, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2).Unless otherwise stated, the reagents were used in the following concentrations: 75 μg / ml anti-F 1 + 2 chemibeads in CB buffer (pH 7.2), according to Example 1a) prepared biotinylated anti-prothrombin antibody in BA buffer (50mM HEPES, 0.3M NaCl, 1mM EDTA, 1mg / ml Dextran T-500, 0.1% [w / v] Triton X 405, 0.15% [v / v] Proclin 300, 0 , 1 mg / ml streptavidin-coated Sensibeads in SB buffer (50 mM HEPES, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg / ml dextran, 1 mg / ml neomycin sulfate, pH 7.2) diluted 1: 66 T-500, 16 mg / ml BSA, 2 mg / ml bovine γ-globulin, 0.1% [w / v] Triton X 405, 0.15% [v / v] Proclin 300, 0.1 mg / ml Neomycin sulfate, pH 7.2).
Testablauftest procedure
10 μl einer mit Ag-Puffer (1 ,2 g Tris, 3,73 g Titriplex III, 2,93 g NaCI, 3,45 ml Mergal K9N, 100 000 KIU Trasylol, 10 % [v/v] Polygelin pro Liter, pH 7,25) verdünnten Plasmaprobe (1 :20) wurden mit 15 μl anti-F1+2-Chemibead-Lösung gemischt und 417 Sekunden bei 37 0C inkubiert. Im Anschluss wurden 15 μl einer Lösung, welche biotinylierten anti-Prothrombin-Antikörper enthielt, zum Reaktionsansatz gegeben und erneut inkubiert (414 Sekunden, 37 0C). Danach wurden dem Ansatz 25 μl der Sensibead-Lösung zugegeben und 154 Sekunden bei 37 0C inkubiert. Nach Auffüllen des Reaktionsansatzes mit Assay-Puffer (50 mM HEPES, 0,3 M NaCI, 1 mM EDTA, 1 mg/ml Dextran T-500, 16 mg/ml BSA, 0,5 % [w/v] Zwittergent 3-14, 0,15 % [v/v] Proclin 300, 0,1 mg/ml Neomycin Sulfat, pH 7,2) auf ein Gesamtvolumen von 250 μ! erfolgte die Messung. Dazu wurde der Ansatz mit Licht einer Wellenlänge von 680 nm angeregt und das entstehende Chemilumineszenzsignal wurde gemessen. Beispiel 3: Erstellung einer KaI ibrations kurve zur Bestimmung des F1+2-Gehalts von Plasmaproben10 μl of one with Ag buffer (1, 2 g Tris, 3.73 g Titriplex III, 2.93 g NaCl, 3.45 ml Mergal K9N, 100 000 KIU Trasylol, 10% [v / v] polygelin per liter, pH 7.25) diluted plasma sample (1: 20) were mixed with 15 ul anti-F 1 + 2 -Chemibead solution and incubated for 417 seconds at 37 0 C. Subsequently, 15 μl of a solution containing biotinylated anti-prothrombin antibodies were added to the reaction mixture and incubated again (414 seconds, 37 ° C.). Thereafter, the projection 25 were Sensibead ul of solution was added and incubated for 154 seconds at 37 0 C. After replenishing the reaction mixture with assay buffer (50 mM HEPES, 0.3 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mg / ml Dextran T-500, 16 mg / ml BSA, 0.5% [w / v] Zwittergent 3- 14, 0.15% [v / v] Proclin 300, 0.1 mg / ml neomycin sulfate, pH 7.2) to a total volume of 250 μ! the measurement took place. For this purpose, the batch was excited with light of a wavelength of 680 nm and the resulting chemiluminescent signal was measured. Example 3 Creation of a Calibration Curve to Determine the F 1 + 2 Content of Plasma Samples
Zur Quantifizierung der F-ι+2-Konzentration in Humanplasmaproben wurde eine Standardkurve erstellt, indem gereinigtes F-ι+2-Antigen mit Ag-Puffer auf eine Konzentration von 1000 pmol/l eingestellt wurde. Von dieser Stammlösung wurde eine geometrische Verdünnungsreihe (Faktor 2) hergestellt. Die Standardproben wurden wie in Beispiel 2 beschrieben getestet, d. h. sie wurden wie auch die Plasmaproben vor Durchführung des Testes in einem Verhältnis von 1 :20 vorverdünnt. Die Auftragung des Logarithmus der erreichten Signalhöhe der einzelnen Standards gegen den Logarithmus der in den Standards enthaltenen F-I+2- Konzentrationen ergibt die in Figur 1 dargestellte Kalibrationskurve.To quantify the F-ι + 2 concentration in human plasma samples, a standard curve was prepared by adjusting purified F-ι +2 -antigen with Ag buffer to a concentration of 1000 pmol / l. From this stock solution, a geometric dilution series (factor 2) was prepared. The standard samples were tested as described in Example 2, ie they were prediluted as well as the plasma samples before the test in a ratio of 1:20. The plotting of the logarithm of the signal level achieved for the individual standards against the logarithm of the F- I + 2 concentrations contained in the standards gives the calibration curve shown in FIG.
Beispiel 4: Erhöhung der Assay-Sensivität durch Verkürzung der InkubationsdauerExample 4: Increasing Assay Sensitivity by Shortening the Incubation Period
Standard Human Plasma (SHP; Dade Behring Marburg GmbH, Deutschland) wurde durch Zugabe von gereinigtem Fi+2-Antigen auf eine niedrige (169 pmol/l) bzw. eine hohe (3204 pmol/l) Fi+2-Konzentration eingestellt. Die Proben und eine Assay-Puffer-Standard Human Plasma (SHP, Dade Behring Marburg GmbH, Germany) was adjusted to a low (169 pmol / L) and a high (3204 pmol / L) Fi + 2 concentration, respectively, by adding purified Fi + 2 antigen. The samples and an assay buffer
Kontrolle ohne F1+2-Antigen wurden gemäß Beispiel 2 getestet, wobei dieControl without F 1 + 2 antigen were tested according to Example 2, wherein the
Inkubationszeit nach Zugabe der Sensibeads in einem Bereich von etwa 20 bis 450Incubation time after addition of Sensibeads in a range of about 20 to 450
Sekunden variiert wurde. Die gemessenen Signalhöhen nach unterschiedlichen Inkubationszeiten sind in Fig. 2 logarithmisch zusammengestellt.Seconds was varied. The measured signal levels after different incubation times are compiled logarithmically in FIG.
Die Signalentwicklung bei der Probe mit hoher Fi+2-Konzentration zeigt das zu erwartende Verhalten. Je länger die Inkubationszeit, desto höher die erreichten Signale. Bei der Probe mit niedriger Fi+2-Konzentration zeigt sich ein gegenläufiger Effekt. Je länger die Inkubationszeit, desto niedriger die erreichten Signale. Kürzere Inkubationszeiten ermöglichen die Messung maximaler Signalhöhen.The signal evolution in the sample with high Fi +2 concentration shows the expected behavior. The longer the incubation time, the higher the signals achieved. The sample with low Fi +2 concentration shows an opposite effect. The longer the incubation time, the lower the signals achieved. Shorter incubation times allow the measurement of maximum signal levels.
Für die Inkubationsdauer kann ein Optimum gewählt werden, das weniger als 300 Sekunden beträgt, wodurch zum einen eine quantifizierbare Signalhöhe im Bereich hoher Analyt-Konzentrationen und zum anderen eine große Sensitivität im Bereich niedriger Analyt-Konzentrationen gewährleistet ist. Beispiel 5: Erhöhung der Assay-Sensivität durch Erhöhung der Menge an biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper im ReaktionsansatzFor the incubation period, an optimum can be selected which is less than 300 seconds, which ensures, on the one hand, a quantifiable signal level in the range of high analyte concentrations and, on the other hand, high sensitivity in the range of low analyte concentrations. Example 5: Increase of the assay sensitivity by increasing the amount of biotinylated anti-prothrombin antibody in the reaction mixture
Standard Human Plasma wurde durch Zugabe von gereinigtem F1+2-Antigen auf definierte Konzentrationen eingestellt und mit drei verschiedenen Verdünnungsstufen des gemäß Beispiel 1 hergestellten biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörpers getestet (siehe Beispiel 2). Die Messreihe mit der höchsten anti-Prothrombin- Antikörper-Konzentration (MAK 1 :10) zeigt verglichen mit der mittleren MAK- Konzentration (MAK 1 :100) niedrigere Signale im Bereich hoher Analyt- Konzentrationen. Dieser Effekt ist durch die Blockade der Sensibeads durch den biotinylierten anti-Prothrombin-MAK zu erklären. Bei der geringsten MAK- Konzentration (MAK 1 :1000) wurden die niedrigsten Signalhöhen erreicht. Die ermittelten Daten sind in Figur 3 zusammengefasstStandard human plasma was adjusted to defined concentrations by addition of purified F 1 + 2 antigen and tested with three different dilution steps of the biotinylated anti-prothrombin antibody prepared according to Example 1 (see Example 2). The test series with the highest anti-prothrombin antibody concentration (MAK 1:10) shows lower signals in the range of high analyte concentrations compared to the mean MAK concentration (MAK 1: 100). This effect can be explained by the blockage of sensibeads by the biotinylated anti-prothrombin MAb. At the lowest MAK concentration (MAK 1: 1000), the lowest signal levels were achieved. The determined data are summarized in FIG
Aufgrund der hohen Prothrombinkonzentration in den Plasmaproben wird ein Großteil des biotinylierten anti-Prothrombin-Antikörpers blockiert und steht dadurch für die Bildung eines „Bindungspartner/Analyt/Bindungspartner"-Komplexes nicht mehr zur Verfügung. Aus diesem Grund ist die Konzentration dieses Bindungspartners möglichst hoch zu wählen. Eine zu hohe Konzentration des anti- Prothrombin-Antikörpers führt jedoch zu einer Minimierung der Signalhöhen im Bereich hoher Analyt-Konzentrationen.Due to the high prothrombin concentration in the plasma samples, a large part of the biotinylated anti-prothrombin antibody is blocked and is therefore no longer available for the formation of a "binding partner / analyte / binding partner" complex, for which reason the concentration of this binding partner is as high as possible Too high a concentration of the anti-prothrombin antibody, however, leads to a minimization of the signal levels in the range of high analyte concentrations.
Beispiel 6: Erhöhung der Assay-Sensivität durch Verdünnung der PlasmaprobenExample 6: Increasing Assay Sensitivity by Dilution of Plasma Samples
Humanplasmaproben verschiedener F1+2-Konzentration (< 30 pmol/l, 109 pmol/l bzw. 169 pmol/l) wurden mit Assay-Puffer in Verhältnissen von 1 :1 bis 1 :1024 verdünnt und gemäß Beispiel 2 getestet. Die Messergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt.Human plasma samples of different F 1 + 2 concentration (<30 pmol / l, 109 pmol / l or 169 pmol / l) were diluted with assay buffer in ratios of 1: 1 to 1: 1024 and tested according to Example 2. The measurement results are shown in FIG. 4.
Die Verdünnung der Plasmaproben vermindert den Einfluss von Prothrombin auf den Assay. Durch einen ca. 10 000fachen molaren Überschuss von Prothrombin gegenüber F1+2 wird der Großteil des biotinylierten anti-Prothrombin-Antikörpers durch Prothrombinmoleküle blockiert. Betrachtet man das molare Verhältnis zwischen biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper und Prothrombin im Reaktionsansatz bei Messung einer unverdünnten Plasmaprobe, so liegt das Prothrombin bei einer Normalkonzentration von 100 mg/ml in einem ca. δfach molaren Überschuss zum Antikörper vor. Durch eine Verdünnung der Plasmaproben verschiebt sich das molare Verhältnis von biotinyliertem anti-Prothrombin-Antikörper zu Prothrombin zugunsten des Antikörpers.The dilution of the plasma samples reduces the influence of prothrombin on the assay. An approximately 10,000-fold molar excess of prothrombin over F 1 + 2 blocks most of the biotinylated anti-prothrombin antibody by prothrombin molecules. Considering the molar ratio between biotinylated anti-prothrombin antibody and prothrombin in the reaction mixture when measuring an undiluted plasma sample, so the prothrombin is present at a normal concentration of 100 mg / ml in an approximately δfachmal excess to the antibody. Dilution of the plasma samples shifts the molar ratio of biotinylated anti-prothrombin antibody to prothrombin in favor of the antibody.
Bei einer 1 :10 Verdünnung der Plasmaprobe liegt das Verhältnis von Prothrombin zu Antikörper im Reaktionsansatz bei 2:3. Der Antikörper liegt somit im Überschuss zum Prothrombin vor. Die ermittelten Kurvenverläufe spiegeln den oben beschriebenen Einfluss des Prothrombins auf den Assay wider. Im Bereich der niedrigen Verdünnungsstufen steigen die Signale zunächst an, da der anti-Prothrombin-MAK nicht mehr in dem Maße wie bei unverdünnten Proben von Prothrombinmolekülen blockiert wird. Erst bei höheren Verdünnungen beginnen die Signalhöhen aufgrund der abnehmenden Fi+2-Konzentrationen abzufallen. Im Bereich niedriger Verdünnungen wird der Assay also durch das im Überschuss enthaltene Prothrombin dominiert. Mit zunehmender Verdünnung gelangt man in einen Bereich der Verdünnungsechtheit, in welchem die Signalstärke mit der F1+2-Konzentration korreliert. In a 1:10 dilution of the plasma sample, the ratio of prothrombin to antibody in the reaction mixture is 2: 3. The antibody is thus present in excess of the prothrombin. The determined curves reflect the above-described influence of the prothrombin on the assay. In the range of low dilution levels, the signals rise first, since the anti-prothrombin MAK is no longer blocked to the same extent as in undiluted samples of prothrombin molecules. Only at higher dilutions do the signal levels begin to decrease due to the decreasing Fi + 2 concentrations. In the range of low dilutions, the assay is therefore dominated by the excess prothrombin. With increasing dilution one arrives in a range of the dilution fastness, in which the signal strength correlates with the F 1 + 2 -concentration.
Figurencharacters
Figur 1FIG. 1
Kalibrationskurve zur Quantifizierung des F-ι+2-Gehaltes in Plasmaproben. Die gemessenen Signalhöhen (Messeinheit: counts) der einzelnen Standards wurden logarithmisch gegen den Logarithmus der in den Standards enthaltenen F-i+2-Antigen-Calibration curve for the quantification of F-ι +2 content in plasma samples. The measured signal levels (units of measurement: counts) of the individual standards were logarithmically compared to the logarithm of the Fi + 2 antigen contained in the standards.
Konzentrationen [pmol/l] aufgetragen. Die 1 :20 Vorverdünnung, in denen dieConcentrations [pmol / l] applied. The 1:20 pre-dilution in which the
Plasmaproben im Assay eingesetzt werden, wurde bei den Fi+2-Standardproben ebenfalls durchgeführt. Die hier angegebenen Konzentrationen entsprechen somit nicht dem wirklichen F1+2-Gehalt, sondern sind zusätzlich durch denPlasma samples used in the assay were also performed on the standard Fi + 2 samples. The concentrations given here thus do not correspond to the actual F 1 + 2 content, but are additionally due to the
Vorverdünnungsfaktor 20 zu dividieren.Divide predilution factor 20.
Figur 2FIG. 2
Signalentwicklung bei Variation der Inkubationszeit nach Zugabe der Sensibeads zum Reaktionsansatz. Auf der X-Achse sind die Inkubationszeiten (Sekunden) und auf der Y-Achse der Logarithmus der Signalhöhen [counts] aufgetragen. Die Legende gibt die Fi+2-Konzentrationen an. Die Negativkontrolle ohne Fi+2 diente der Messung des Hintergrundsignales.Signal development with variation of the incubation time after addition of the Sensibeads to the reaction mixture. The incubation times (seconds) are plotted on the X axis and the logarithm of the signal counts [counts] on the Y axis. The legend indicates the Fi +2 concentrations. The negative control without Fi +2 was used to measure the background signal.
Figur 3FIG. 3
Signalentwicklung in Abhängigkeit von der Menge an biotinyliertem anti-Prothrombin- Antikörper. Logarithmische Auftragung der gemessen Signale [counts] gegen den Logarithmus der Fi+2-Konzentration der Plasmaproben [pmol/l]. Die Legende gibt die verwendeten Verdünnungsstufen der Stammlösung an biotinyliertem anti- Prothrombin-Antikörper (MAK) an.Signal development as a function of the amount of biotinylated anti-prothrombin antibody. Logarithmic plot of the measured [counts] against the logarithm of the Fi + 2 concentration of the plasma samples [pmol / l]. The legend indicates the dilution levels of the stock solution of biotinylated anti-prothrombin antibody (MAb) used.
Figur 4FIG. 4
Signalentwicklung bei Verdünnung von Plasmaproben unterschiedlicher Fi+2- Konzentrationen in Assay-Puffer. Auf der X-Achse ist die Verdünnungsstufe der Plasmaproben aufgetragen, auf der Y-Achse der Logarithmus der Signale [counts]. Die Legende gibt die Fi+2-Konzentrationen der Proben an. Signaling on dilution of plasma samples of different Fi +2 concentrations in assay buffer. On the X-axis the dilution level of the plasma samples is plotted, on the Y-axis the logarithm of the signals [counts]. The legend indicates the Fi +2 concentrations of the samples.

Claims

Patentansprüche claims
1. Homogenes Verfahren zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe, wobei die quantifizierbare Wechselwirkung zweier Komponenten eines signalbildenden Systems mit der Analyt-Menge korreliert, dadurch gekennzeichnet, dass a) ein Analyt-spezifischer, monoreaktiver Bindungspartner und ein Analyt- spezifischer, polyreaktiver Bindungspartner verwendet werden, b) die Probe in einem Volumenverhältnis von 1 :1 bis 1 :250 verdünnt wird, c) der polyreaktive Bindungspartner im Verhältnis zur Summe aller Substanzen, die er binden kann, in 1 ,5 bis 5fach molarem Überschuss eingesetzt wird und d) das Signal nach einer Dauer der gemeinsamen Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 300 Sekunden gemessen wird.1. Homogeneous method for determining an analyte in a sample, wherein the quantifiable interaction of two components of a signal-generating system correlates with the amount of analyte, characterized in that a) an analyte-specific, monoreactive binding partner and an analyte-specific, polyreaktive binding partner used b) the sample is diluted in a volume ratio of 1: 1 to 1: 250, c) the polyreactive binding partner is used in 1.5 to 5 times the molar excess in relation to the sum of all the substances that it can bind, and d) the signal is measured after a period of co-incubation of both components of the signal-generating system in the reaction batch of less than 300 seconds.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Probe in einem Volumenverhältnis von 1 :2 bis 1 :100, bevorzugterweise in einem Verhältnis von 1 :4 bis 1 :32 verdünnt wird.2. The method according to claim 1, characterized in that the sample in a volume ratio of 1: 2 to 1: 100, preferably in a ratio of 1: 4 to 1: 32 is diluted.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal nach einer Dauer der Inkubation beider Komponenten des signalbildenden Systems in dem Reaktionsansatz von weniger als 200 Sekunden, besonders bevorzugt von weniger als 160 Sekunden gemessen wird.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the signal after a period of incubation of both components of the signal-generating system in the reaction mixture of less than 200 seconds, more preferably less than 160 seconds is measured.
4. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass einer der Bindungspartner mit einer Chemolumineszenzverbindung und der zweite mit einem Photosensibilisator assoziiert ist.4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that one of the binding partners is associated with a chemiluminescent compound and the second with a photosensitizer.
5. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyt-spezifischen Bindungspartner mit suspendierbaren Teilchen, bevorzugt Latexpartikeln, assoziiert sind, die mit Komponenten eines signalbildenden Systems gekoppelt sind. 5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the analyte-specific binding partners are associated with suspendable particles, preferably latex particles, which are coupled to components of a signal-forming system.
6. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Analyt-spezifischen Bindungspartnern um monoklonale oder polyklonale Antikörper handelt.6. Process according to claims 1 to 5, characterized in that the analyte-specific binding partners are monoclonal or polyclonal antibodies.
7. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 zur Bestimmung eines Bestandteils des Gerinnungssystems oder des Fibrinolysesystems, bevorzugt zur Bestimmung von Aktivierungsmarkem der Gerinnung.7. The method according to claims 1 to 6 for the determination of a component of the coagulation system or the Fibrinolysesystems, preferably for the determination of activation markers of coagulation.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 zur Bestimmung des Prothrombin- Fragments F2 oder Fi+2. 8. The method according to claims 1 to 6 for the determination of the prothrombin fragment F 2 or Fi +2 .
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111781345A (en) * 2020-06-30 2020-10-16 上海透景生命科技股份有限公司 Chemiluminescent marker labeled antigen stabilizer and application thereof

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2177624A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-21 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Blood coagulation assays

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991006861A1 (en) * 1989-11-06 1991-05-16 Akzo N.V. Immunoassays for and monoclonal antibodies to prothrombin activation peptides and their degradation products
WO2001084157A2 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 Dade Behring Marburg Gmbh Compositions for detection of multiple analytes
US20030219845A1 (en) * 1988-02-03 2003-11-27 Ruiz Juan A. Immunoassay for F1.2 prothrombin fragment
WO2005062057A1 (en) * 2003-12-01 2005-07-07 Dade Behring Marburg Gmbh Conjugates, and use thereof in detection methods

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3633497A1 (en) * 1986-10-02 1988-04-14 Hoechst Ag IMMUNOMETRIC DETERMINATION PROCEDURE
US5512659A (en) * 1989-08-04 1996-04-30 Syntex (U.S.A.) Inc. Compositions useful in heterogeneous immunoassays
DE69233674T2 (en) * 1991-05-22 2007-10-18 Dade Behring Marburg Gmbh Homogeneous test system for the determination of an analyte
WO1995006877A1 (en) * 1993-09-03 1995-03-09 Behringwerke Ag Fluorescent oxygen channeling immunoassays
DE19521388C2 (en) * 1995-06-13 1997-05-22 Immuno Gmbh Technique for the determination of a specifically bindable substance
US7179660B1 (en) * 2000-03-06 2007-02-20 Dade Behring Marburg Gmbh Carriers coated with polysaccharides, their preparation and use

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030219845A1 (en) * 1988-02-03 2003-11-27 Ruiz Juan A. Immunoassay for F1.2 prothrombin fragment
WO1991006861A1 (en) * 1989-11-06 1991-05-16 Akzo N.V. Immunoassays for and monoclonal antibodies to prothrombin activation peptides and their degradation products
WO2001084157A2 (en) * 2000-05-04 2001-11-08 Dade Behring Marburg Gmbh Compositions for detection of multiple analytes
WO2005062057A1 (en) * 2003-12-01 2005-07-07 Dade Behring Marburg Gmbh Conjugates, and use thereof in detection methods

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; Juni 2004 (2004-06), BAUER R ET AL: "Quantitation of cardiac markers by LOCI(TM) technology." XP009069746 Database accession no. PREV200500002978 & CLINICAL CHEMISTRY, Bd. 50, Nr. 6, Suppl. S, Part 2, Juni 2004 (2004-06), Seite A5, 56TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY (AACC); LOS ANGELES, CA, USA; JULY 25-29, 2004 ISSN: 0009-9147 *
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; Juni 2004 (2004-06), PIERSON-PERRY J ET AL: "Quantitation of anemia markers by LOCI(TM) technology." XP009069743 Database accession no. PREV200400468176 & CLINICAL CHEMISTRY, Bd. 50, Nr. 6, Suppl. S, Part 2, Juni 2004 (2004-06), Seite A59, 56TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY (AACC); LOS ANGELES, CA, USA; JULY 25-29, 2004 ISSN: 0009-9147 *
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; Juni 2004 (2004-06), ROSENWALD S ET AL: "Quantitation of prostate-specific antigen markers By LOCI(TM) technology." XP009069744 Database accession no. PREV200400468219 & CLINICAL CHEMISTRY, Bd. 50, Nr. 6, Suppl. S, Part 2, Juni 2004 (2004-06), Seite A72, 56TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY (AACC); LOS ANGELES, CA, USA; JULY 25-29, 2004 ISSN: 0009-9147 *
DATABASE BIOSIS [Online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; Juni 2004 (2004-06), SCHELP C ET AL: "Quantitation of thyroid markers by LOCI(TM) technology" XP009069745 Database accession no. PREV200400468286 & CLINICAL CHEMISTRY, Bd. 50, Nr. 6, Suppl. S, Part 2, Juni 2004 (2004-06), Seite A91, 56TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CLINICAL CHEMISTRY (AACC); LOS ANGELES, CA, USA; JULY 25-29, 2004 ISSN: 0009-9147 *
ULLMAN E.F. ET AL.: "Luminescent oxygen channeling assay (LOCI TM): sensitive, broadly applicable homogeneous immunoassay method" CLIN. CHEM., Bd. 42, Nr. 9, 1996, Seiten 1518-1526, XP002109518 ISSN: 0009-9147 in der Anmeldung erwähnt *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111781345A (en) * 2020-06-30 2020-10-16 上海透景生命科技股份有限公司 Chemiluminescent marker labeled antigen stabilizer and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP1787123A2 (en) 2007-05-23
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