WO2006015742A2 - Tumormarker zur diagnose von kolorektalen karzinomen und/oder davon abstammender metastasen - Google Patents

Tumormarker zur diagnose von kolorektalen karzinomen und/oder davon abstammender metastasen Download PDF

Info

Publication number
WO2006015742A2
WO2006015742A2 PCT/EP2005/008274 EP2005008274W WO2006015742A2 WO 2006015742 A2 WO2006015742 A2 WO 2006015742A2 EP 2005008274 W EP2005008274 W EP 2005008274W WO 2006015742 A2 WO2006015742 A2 WO 2006015742A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
genes
metastases
nos
gene
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/008274
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2006015742A3 (de
Inventor
Wolfgang Michael BRÜCKL
Axel Wein
Marc Munnes
Ralph Markus Wirtz
Original Assignee
Friedrich-Alexander- Universität Erlangen- Nürnberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Friedrich-Alexander- Universität Erlangen- Nürnberg filed Critical Friedrich-Alexander- Universität Erlangen- Nürnberg
Priority to EP05777075A priority Critical patent/EP1776475A2/de
Priority to US11/659,250 priority patent/US20080311567A1/en
Publication of WO2006015742A2 publication Critical patent/WO2006015742A2/de
Publication of WO2006015742A3 publication Critical patent/WO2006015742A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • Tumor marker for the diagnosis of carcinomas and / or metastases derived therefrom Tumor marker for the diagnosis of carcinomas and / or metastases derived therefrom
  • the invention comprises a method (i) for detecting a carcinoma, in particular an adenocarcinoma, preferably a gastrointestinal carcinoma and particularly preferably a colorectal carcinoma, (ii) for the prediction of metastases, preferably liver metastases, depending on a primary colon carcinoma and / or (iii ) for predicting the response of metastases to 5-fluorouracil-containing chemotherapy comprising determining a gene expression profile of 120 marker genes or a selection thereof.
  • the 120 genes are defined by their sequences as shown in SEQ ID NOs: 1 to 181.
  • kits for carrying out the inventive method and diagnostic kits are also disclosed. Further embodiments of the invention relate to the use of the marker genes disclosed herein and / or the marker gene combinations disclosed herein.
  • the invention relates to the use of non-human mammals or cultured cells thereof whose genetic material has been altered with respect to one or more of the genes carried out in this invention.
  • Non-human mammals or cultured cells whose DNA has been altered can be used in particular for testing alternative therapies or therapeutics for primary colorectal carcinomas and metastases derived therefrom.
  • Colorectal carcinomas are the third most common tumor entity in Western countries. In Germany, approximately 50,000 patients develop colorectal cancer each year. Annually, around 20,000 patients with colorectal carcinoma syndrome or metachron lung or liver metastases occur. In Germany, approximately 4,000 of the 20,000 patients with distant metastases have a curative metastasis resection (RO), which is associated with a 5-year survival rate of approximately 30%, technically possible.
  • RO curative metastasis resection
  • Responder refers to patients who have a complete (CR, complete remission) or a partial (PR, partial remission) remission in imaging procedures, as “non-responders” those patients who have a stable (SD, stable disease) or progressive (PD) progressive tumor progression in imaging.
  • the response to chemotherapy correlates with colorectal cancer with patient survival. Factors that can predict the response to chemotherapy are referred to as predictive markers. Based on predictive markers, individualized therapy could be provided. Despite many studies in this area, the molecular predictive markers described so far in metastatic colorectal carcinoma have not been sufficient.
  • SIATL1 novel sialyltransferase gene whose expression is downregulated in human breast tumor tissue cell lines compared to normal breast tissue cell lines.
  • the abnormal expression and enzymatic activity of sialyltransferases in tumor cells leads to the formation of tumor-associated carbohydrate antigens, which can be used in particular in immunotherapy.
  • Dolnick (1996) Advan. Enzyme Regul. 36, 165-180 and Dolnick (1996) Cancer Res. 56, 3207-3210 detect two gene products of the r-thymidylate synthase gene, designated rTS ⁇ and rTS ⁇ . In the two cell lines H630-1 and H630-10, an altered activity of thymidylate synthase is detected.
  • Maxwell (2003) Cancer Res. 63, 4602-4606 shows a change in gene expression in cell lines in 619 genes by means of DNA microchip technology.
  • the studies were performed on MCF-7 breast cancer cells, as well as on H630 and H630-R10 colon carcinoma cell lines.
  • An expression-activating effect of 5-FU and increased expression of the spermine / spermidine acetyltransferase gene, annexin II gene, the thymosin ⁇ -10 gene, the chaperonin-10 gene and especially the MAT-8 gene are shown. Biran (1986) Clin. Pathol.
  • G266-G269 addressed the question of whether activation of the peroxisome proliferative activated receptor ⁇ (PPAR ⁇ ) accelerates or slows the growth of colorectal carcinomas, as activation of the peroxisome proliferative activated receptor ⁇ (PPAR ⁇ ) by ligand binding cultured the proliferation of colorectal cancer cells or adversely affected by colorectal carcinoma in the mouse model. Mouawad (2002) Melanoma Res.
  • Hox genes function as a network for transcriptional regulation and participate in the processes of cell-cell communication during normal morphogenesis.
  • Wang (2002) Cancer Letters 179, 71-77 compared expression levels of the CASK and Reelin genes in human gastric, colon, and esophageal carcinoma using RT-PCR, immunohistochemistry, and Western blot.
  • 87.5% of the investigated esophageal carcinomas an increased expression of the CASK and the Reelin gene was found in comparison to healthy esophageal tissue.
  • an increase in CASK expression level was detected compared to normal tissue, whereas the reelin level did not change.
  • ADA adenosine deaminase
  • 5'-NT 5'-nucleotidase
  • Galmarini (2002) Brit. J. Haematol. 117, 860-868 investigated the mechanism of resistance to cytarabine in acute myeloid leukemia (AML). He found that expression of 5'-nucleotidase, hENTl and DNA polymerase ⁇ at the time of diagnosis caused cytarabine resistance in patients with acute myeloid leukemia.
  • Oncology 64, 245-250 investigated the expression of tenascin-C in the connective tissue of 314 gastric carcinoma patients in an immunohistochemical study.
  • Tenascin-C is a hexameric extracellular matrix glycoprotein expressed during embryonic development and in proliferative processes such as wound healing or tumorigenesis. The author found that tenascin-C expression apparently correlated with the survival of gastric cancer patients but did not provide significant prognostic information.
  • Riedl (1995) Int. J. Cancer 64, 65-69 determined the serum level of tenascin in a study of 118 patients with colorectal cancer and a control group of 51 healthy subjects.
  • 671-678 investigated whether expression of IMP-I, -2 and -3 in ovarian epithelial tumors was associated with patient survival.
  • the expression level of the IMP genes in 59 ovarian epithelial carcinomas and 7 normal ovaries was determined by a semiquantitative PCR method. Expression of IMP genes was found in all tumor tissues examined, including breast, lung, colon, prostate and ovarian cancers, with the exception of pancreatic cancer.
  • Riede (1998) Langenbecks Arch. Chir. Suppl. 115, 299-302 analyzed expression and regulation of expression of the MUC2 gene in normal colon, colon carcinoma and metastatic tissue.
  • epiregulin is a plays a crucial role in tumorigenesis in vivo in humans. Dionigi (2000) Am. J. Clin. Pathol. 114, 111-122 examined by immunostaining 23 ovarian metastases of colorectal primary tumors and 23 primary ovarian carcinomas to identify criteria for the diagnostic differentiation of the two cancers. In immunostaining, antibodies to anti-necritic Ml antigen, CA125, vimentin, estrogen and progesterone receptors, cytokeratins 7 and 20, alfa-inhibin and cathepsin E were used.
  • BMC Cancer 3 uses a method to create a microarray-based tumor gene profile from a blood sample.
  • monocytes from the blood of 23 patients with advanced colorectal cancer who were in Phase III clinical treatment with SU5416.
  • the author identified 4 transcripts suitable for classifying patients according to the treatment method (CD24, lactoferrin, lipocallin 2, and MMP-9), but was unable to exclude with certainty that the altered expression of these 4 genes was also due to the mode of administration or concomitant medications has been.
  • Mariadason (2003) Cancer Res. 63, 8791-8812 used a microarray-based study of 30 colon tumor cell lines to generate an expression profile of 430 genes that allows statements to be made regarding the tumor's response to various chemotherapeutic agents. In terms of responding to colon cancer to 5-FU therapy, he focuses his selection on 50 genes.
  • the technical problem is solved by providing the embodiments disclosed herein, and more particularly by the claims characterized by the invention.
  • the invention therefore comprises a method for
  • (c) predicting the response, in particular metastases, to a 5-FU-containing therapy comprising determining a gene expression profile of 120 marker genes (SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 181) or a selection thereof.
  • the invention relates to the expression profiles of certain genes which are of importance in carcinomas, in particular adenocarcinomas, preferably in gastrointestinal carcinomas and particularly preferably in primary colorectal carcinomas and metastases derived therefrom, preferably liver metastases.
  • the invention also includes the benefit of the knowledge of this expression and the creation of expression profiles for possible diagnosis, prognosis, prediction of response to therapeutic measures, in particular e.g. a chemotherapy and preferably a 5-FU-containing chemo and / or combination therapy.
  • markers defined herein which in the simplest manner are derived from / in body fluids, such as blood or blood serum, but also e.g. (Peritoneal) ascites or lymph fluid, can be determined.
  • the presented invention can serve to monitor the course of therapy of carcinomas, in particular primary colorectal carcinomas and metastases derived therefrom, preferably liver metastases.
  • the 120 genes (marker genes) of the invention are defined in particular in Table D and are represented by their corresponding coding sequence (s). Thus, the corresponding individual (marker) genes are partially characterized by multiple SEQ ID NOs.
  • the individual sequences of the defined marker genes are e.g. Variants, in particular Splicetinen or genes of high homology.
  • colonal carcinoma refers in particular to polypoid, platelike, ulcerous, and laminar (cirrhotic) forms that are histologically transformed into solid, mucous, or glandular adenocarcinomas.
  • Ringlet cell carcinomas, squamous, adenosquamous, cribriform, squamous, or undifferentiated carcinomas can be typed according to the WHO classification. (Becker, Hohenberger, Junginger, Schlag Surgical Oncology, Thieme, Stuttgart 2002).
  • inventive methods are not limited to colorectal carcinomas.
  • adenocarcinoma refers to a cancerous tumor originating from an epithelial cell layer of the glandular portion of a mucous membrane.Adenocarcinoma is a distinct, morphologically clearly defined portion of the carcinoma.
  • the term "detection" of a carcinoma, in particular of a colorectal carcinoma, comprises in particular the in vitro determination of a possible (colorectal) carcinoma.Preferably, this recognition is an early recognition.
  • early detection in connection with the invention means that a (colorectal) carcinoma can be detected as early as possible in its genesis, genesis and / or manifestation.
  • “Early detection” therefore includes the detection of (colorectal) carcinomas at an early stage of the disease, in which the disease is still confined to the tumor and has no abnormalities in the lymphatics / lymph nodes (LO, NO), other organs (MO) or
  • this "early diagnosis” refers, inter alia, to the diagnostic analysis during check-ups, as well as in routine or follow-up examinations, eg after resection of an already existing primary tumor.
  • prediction in the context of this invention refers to the determination of the biological, biomedical state of tissue or individual cells, particularly in determining whether a given tissue / cell is proliferatively altered Metastasis, preferably a liver metastasis, actually has a proliferative change and / or is actually a secondary disease site due to a primary proliferative and / or tumorogenic disease.
  • the primary proliferative disease in the context of this invention is preferably a colorectal carcinoma and the secondary disease site is a metastasis. preferably a liver metastasis.
  • the term "prediction" in connection with the method according to the invention for determining the response of a tumor and in particular of metastases, again preferably liver metastases, to a 5-fluoro-5-fluorouracil-containing chemo and / or combination therapy includes the determination of the possible " Responsiveness "or” response "of a metastatic cell or metastatic tissue to therapy
  • responsiveness is the triggering of a single cell response, one that promotes the cure of a disease or a disease (in this context, a proliferative disease)
  • responsiveness includes the sensitivity of individual (proliferatively altered and / or metastatic) cells, a cell population, or a cell assemblage / tissue to 5-FU alone or in combination with other medicines to react.
  • responders and “non-responders” are known to the person skilled in the art and have already been explained above.
  • Responders are patients who have a complete remission (CR) or a partial remission (PR) and non-responders are those who have stable (SD) or progressive disease (SD).
  • SD stable
  • SD progressive disease
  • PD progressive disease
  • the response to chemotherapy correlates with colorectal cancer with patient survival. Factors that could predict the response to treatment would, in the case of a "responder”, lead to recommending the therapy and, in the case of a "non-responder", offering the patient alternative therapies.
  • prognostic factor A role also plays here the "prognostic factor” and the “predictive factor”.
  • Clinical, pathohistological and molecular prognostic factors were assessed in 2000 by the American Joint Committee on Cancer Prognostic Factors (AJCC) for colorectal cancer (Compton C. et al., Cancer 88, 1739-57 (2000).) Clear prognostic relevance has been attributed to the pT category, the pN category, venous and lymphatic vessel invasion, the resmd tumor R classification, and the preoperative CEA value. The molecular markers are considered heretofore not yet sufficiently validated.
  • the "predictive factor” is a variable that exerts an independent influence on the response of a mchtoperativen therapy.Also, molecular factors for the prediction of palliative chemotherapy in colorectal cancer are not yet sufficient validated.
  • the proliferatively altered (metastatic) cell / cell cluster is dying due to the 5-FU therapy and / or stopped in its / its proliferation.
  • a combination therapy with 5-FU includes the additional administration of additional drugs to the patient, preferably these are also anticancer drugs.
  • the drugs may also include, for example, immunostimulatory drugs.
  • Other drugs that can be used in cancer or chemotherapy are platinum compounds (such as cisplatin or oxaliplatin).
  • the further administration of eg folic acid is a combination therapy in the sense of this invention.
  • the invention presented here can also be used, in particular, in palliative first-line therapy, whereby in the specific example 5-FU with oxaliplatin was used.
  • 5-fluorouracil (5-FU) -based chemotherapy is the mainstay of colorectal cancer chemotherapy. Folinic acid is usually added to biomodulation. Previously, the 5-FU was applied as a bolus (so-called Mayo regimen), but now there are studies that show that the therapy as a 24-h infusion (so-called AIO-regime) is much more compatible (less diarrhea, mucositis and Other treatment options include therapy with the orally available 5-FU derivative Xeloda ® (which is administered without folinic acid) or combination therapy with, for example, folinic acid, irinotecan, cisplatin Other combinations currently under review in Phase I-III studies are 5-FU-containing regimens in combination with, for example, cetuximab, erlotinib, bevacizumab or vatalanib.
  • metastases in the context of the above-mentioned method for prediction / determination of the response to a therapy, preferably to a 5-FU-containing chemo and / or combination therapy, comprises "scattered (tumor) cells" in the affected patient's body.
  • metastases according to the invention comprises liver, lung, brain, bone and / or peritoneal metastases and especially liver metastases.
  • the term “gene expression profile” encompasses both the determination of “expression profiles” and “expression levels” or “expression levels” of the corresponding genes.
  • the term “expression level”, as well as the term “expression profile” according to the invention comprises both the quantity of the expression product, as well as the quality of the expression product, such as products of alternative Splicevor réelle, methylations, glycosylations, phosphorylations, etc.
  • attention is essentially paid to the quantity of the corresponding gene products (RNA / protein).
  • the level of expression is also considered in terms of quantity, but possibly in comparison to other tissues or tissues and cells of other (preferably healthy) individuals Modifications in the gene product (such as mutations) are also determined in comparison to other tissues Corresponding embodiments are shown in the experimental section and are also shown in particular in the tables, preferably in Tables A, B, C.
  • the invention comprises the above-mentioned method, wherein the expression profile of at least two of the 120 marker genes, as shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 181, is determined.
  • the 120 marker genes are also defined by variants, which are again shown in Table D.
  • this expression profile is compared with the expression profile of a "reference.”
  • a reference can be, for example, the expression profile of healthy tissue (eg, intestinal tissue or tissue of the liver, lung, etc.)
  • healthy tissue tissue of the affected individual (patient ), which tissue is known to be non-proliferative or even metastatic.
  • reference tissue of the affected individual (patient ), which tissue is known to be non-proliferative or even metastatic.
  • reference or “reference value” also data from tissues of foreign individuals, preferably (healthy) can be used.
  • the determination of the expression profiles is carried out in particular in tissues and / or individual cells of the tissue.
  • Single cell analyzes are known in the art and also include DNA or RNA determinations; See, inter alia, the determination of single copies of individual genes as shown in Klein (1999) PNAS 96, 4494-4499 or the determination of genomic imbalances as described, for example, in Solinas-Toldo (1997) Gene, Chromosomes, Cancer 20, 399-407.
  • techniques such as in situ hybridizations, determination of the copy number of individual genes (DNA copy number) by comparative genomic hybridization possible.
  • the determination of the expression profile therefore include (within the meaning of this invention) the determination by means of PCR methodology and the use of biochips (see also experimental part of the invention).
  • the determination of the "expression profile” or of the "expression level” comprises in particular the quantitative, optionally comparative determination of the gene expression products, in particular of RNA (but also of proteins).
  • the following methods can be used: immunodetection of the proteinose gene product (eg Western blot, ELISA techniques or immunodetection with microscopic analysis); biochemical determinations of the expression product (eg immunoprecipitations, enzyme tests).
  • preferably not all of the genes mentioned here are preferably examined, but the best results are achieved if at least 80, preferably at least 70, more preferably at least 60, more preferably at least 50, more preferably at least 40, more preferably at least 30 more preferably at least 30, more preferably at least 20, more preferably at least 15, more preferably at least 10, more preferably at least 10, more preferably at least 5, more preferably three, more preferably at least two genes, or their expression profile, or expression level is determined.
  • the person skilled in the art can certainly combine the technical teaching of this invention with the determination of other parameters, in particular other markers, marker genes, in order to be able to make further diagnostic statements, if appropriate. For example, additional tumor markers and / or metastatic markers can be determined.
  • Tumor markers are, for example, p53, ecoc fetoprotein, CEA (carcinoembryonic antigen).
  • CEA is a standard tumor marker for the assessment of colon tumors.
  • clinical, pathohistological and molecular prognostic factors are described and suggested by the American Joint Committee on Cancer Diagnostic Factors (Compton (2000), loc. Cit.).
  • the marker genes shown here selected from the group of the 120 gene / gene segments as described in US Pat SEQ ID NOs: 1 to 181). Further embodiments can be found in the experimental part.
  • the method of detecting a (colorectal) carcinoma mentioned in sub-item (a) may include the selection and determination of the expression profile of at least one, preferably at least two and most preferably at least three genes of the 120 marker genes as shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 181, comparing the expression profile of the genes with the average expression profile from normal intestinal mucosa.
  • the normal Darrnmucosa may come from the patient or from other individuals.
  • the following embodiments preferably show genes which can be used in the inventive method for the detection of a colorectal carcinoma.
  • the method for detecting a colorectal carcinoma comprises in particular the determination of the gene expression profile of at least two genes, wherein at least one of the two genes (as shown in SEQ ID NOs: 1 to 120) from the “minimal sets” or “subsets”, as in defined below is used.
  • These "minimal sets” preferably comprise the correspondingly named and selected genes 72, 55, 33, 18, 17 or 3.
  • a particularly preferred "minimal set" for the determination / predication of a colorectal carcinoma comprises the 3 marker genes, such as in SEQ ID NOS: 25, 41 and 68. Variants of these 3 marker genes are shown in SEQ ID NOS: 136 to 138.
  • a selection of the marker genes of the expression profile of at least one gene, preferably at least two genes, preferably at least 3 genes, of the 72 marker genes shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 72 or SEQ ID NO: 121 to SEQ ID NO: 156 are shown, hit and evaluated. Again, e.g. (and preferably) determines the expression profile of these 72 genes (or a selection thereof) in the tissue to be tested and compared to healthy tissue. Corresponding embodiments and tissue details can be found in the experimental section.
  • the invention includes a method of detecting a (colorectal) carcinoma, wherein the expression profile of at least one gene, preferably at least two genes, more preferably at least three genes of 55 marker genes is determined.
  • 55 genes are defined in Table D particularly by SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 and SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 120, but also include variants of these genes, such as in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 to 181.
  • the invention includes a method of detecting a (colorectal) carcinoma, wherein the expression profile of at least one gene, preferably at least two genes, more preferably at least three genes of the marker genes 33 is determined.
  • These 33 genes are shown in Table D, in particular via SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70 , 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115 and 118, but also include variants of these genes, as shown in SEQ ID NOs: 122, 124, 136 to 140, 157, 159 to 162, 170, 171, 172, 174 and 177 to 180.
  • the invention comprises a method of detecting a (colorectal) carcinoma, wherein the expression profile of at least one gene, preferably at least two genes, more preferably at least three Genes of the 18 marker genes is determined.
  • These 18 genes are shown in Table D, in particular via SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68 and 70 but also include variants of these genes as shown in SEQ ID NOs: 122, 124 and 136-140.
  • Another, but also inventive selection of the at least 18 genes in this embodiment comprises the determination of at least one gene, preferably at least two, more preferably at least three genes of the 18 marker genes which contain the genes as shown in SEQ ID NOs: 25, 41 , 68, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115 or 118, but also include variants of these genes, as in SEQ ID NOs: 136 to 138 , 157, 159 to 162, 170 to 172, 174 and 177 to 180.
  • the invention comprises a method for the detection of a (colorectal) carcinoma, wherein the expression profile of at least one, preferably at least two, more preferably all three of the three marker genes is / are determined.
  • These 3 genes are defined in Table D particularly by SEQ ID NOs: 25, 41 and 68, but also include variants of these genes as shown in SEQ ID NOs: 136 to 138 and also include other variants and homologues of these genes.
  • marker genes for the purposes of this invention encompasses not only the specific gene sequences (or the corresponding gene products) as shown in the specific nucleotide sequences, but also gene sequences which are homologous, preferably highly homologous, to these sequences. include sequences which are at least 80%, preferably at least 90%, most preferably at least 95% homologous to the sequences shown in SEQ ID NOS: 1 to 181.
  • “highly homologous sequences” also include sequences that encode gene products (e.g., RNA or proteins) that are at least 80% identical to the defined gene products of SEQ ID NOS: 1 to 181.
  • the sequence identity can be conventionally achieved by using computer programs such.
  • the Bestfit program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711). Bestfit uses the local homology algorithm of Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489 to find the segment with highest sequence identity between two sequences.
  • the parameters are preferably set so that the percentage of identity over the entire length of the Reference sequence is calculated and that homology gaps of up to 5% of the total number of nucleotides in the reference sequence are allowed.
  • the so-called optional parameters are preferably left at their default values.
  • the deviations that occur in the comparison of a given sequence with the sequences of the invention described above may be caused for example by addition, deletion, substitution, insertion or recombination.
  • sequence comparison can also be carried out with the program DNASIS (Version 6.0, Hitachi Software Engineering Co. Ltd., 1984, 1990). You should also use the "default" parameter settings (Cut off Score: 16, Ktup: 6).
  • the data of the experimental part show that by determining at least one, preferably two, or most preferably three marker genes, as above Table D, also SEQ ID NOS: 25, 41 and 68 are defined (and also by the variants as in SEQ ID NOS: 136-138) a clear determination of colorectal carcinomas can be made; see also examples 1 to 3 and 17.
  • the method already mentioned in subsection (b) for the prediction of metastases, preferably of liver metastases, depending on a primary (colorectal) carcinoma may in particular the selection and determination of the expression profile of at least one gene, preferably at least two genes of the 120 marker genes disclosed herein wherein these genes are defined by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 181 and wherein the expression profile of the genes obtained from potential metastatic cells or tissue, preferably in liver cells or liver tissue, having the expression profile obtained from primary colorectal tumor cells or tissue is compared.
  • the samples for obtaining the two expression profiles can be from the same patient, but also from different patients.
  • genes are preferably displayed which can be used in the inventive method for the prediction of metastases, preferably liver metastases, as a function of a primary (colorectal) carcinoma.
  • the method comprises the determination of the gene expression profile of at least one, preferably at least two genes, wherein at least one of the two genes from the 120 marker genes (as shown in SEQ ID NOs: 1 to 181) from the "minimal sets", as in These "minimal sets” include, inter alia and preferably, the 72, 55, 22, 20 or 2 genes named in the context of this embodiment.
  • other "minimal sets" / "subsets” or gene panels can also be put together, the ones named here being preferred.
  • the expression profile of these 72 genes are obtained from potentially metastatic cells or tissues, preferably liver cells or liver tissue, and compared to the expression profile from primary colorectal tumor cells or tissue.
  • the invention comprises a method for predicting metastases as a function of a primary carcinoma, in particular a colorectal carcinoma, preferably the prediction of liver metastases, wherein the expression profile of at least one gene of the 55 marker genes defined in Table 3 is determined.
  • These 55 genes are defined in Table D particularly by SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 and SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 120, but include also variants of these genes, as shown in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 to 181. In this as well as the following embodiments, it will be understood by those skilled in the art that these are preferred embodiments.
  • the invention comprises a method of predicting metastases dependent on a primary carcinoma, in particular a colorectal carcinoma, preferably the prediction of liver metastases, wherein the expression profile of at least one gene, preferably at least 2, more preferably at least 3, more preferably at least 5 of the 22 marker genes also defined in Table C are / are determined.
  • These 22 genes are shown in Table D, in particular via SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69 , 71, 72, 74 and 109, but also include variants of these genes as shown in SEQ ID NOs: 125, 133, 134, 135, 151, 152, 156 and 177.
  • the invention comprises a method for the prediction of metastases as a function of a primary carcinoma, in particular a colorectal carcinoma, preferably the prediction of liver metastases, wherein the expression profile of at least one gene, preferably at least two genes, more preferably at least three genes, more preferably at least 5 genes of the 20 marker genes are determined.
  • These 20 genes are shown in Table D, in particular via SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69 , 71 and 72, but also include variants of these genes, as shown in SEQ ID NOs: 125, 133, 134, 135, 151, 152 and 156.
  • the invention comprises a method for prediction of metastases as a function of a primary (colorectal) carcinoma, preferably of liver metastases, wherein the expression profile of at least one of the two marker genes, as in SEQ ID NOs: 74 and 109 is determined.
  • the prediction of metastases of a primary colorectal carcinoma is of particular relevance to the clinician, as it can have a decisive influence on the further treatment of the patient. If there are no metastases (neither lymph node metastases nor distant metastases) it is UICC stage I or II. These tumors, if colon carcinomas, are treated exclusively by surgery. Further, adjuvant chemotherapy is not provided (outside clinical trials).
  • lymph node metastases UCC stage III
  • postoperative adjuvant chemotherapy is required in accordance with the guidelines of the German Cancer Society and other international societies.
  • the ajduvante chemotherapy results in a disease-free 3-year survival of the patients of about 80%, without subsequent chemotherapy, the 3-year survival is only about 60%.
  • Overall survival is also significantly affected by adjuvant chemotherapy.
  • preoperative chemoradiotherapy is recommended as it significantly reduces the incidence of local recurrence in the rectum.
  • preoperative chemoradiotherapy can significantly improve the number of patients who receive a continent-preserving treatment, which significantly improves postoperative quality of life in these patients.
  • colorectal carcinoma UCC stage IV
  • palliative chemotherapy should be performed after curative surgery of the primary tumor to prolong patient survival.
  • palliative therapy allows up to 15% of patients who were considered inoperable with respect to distant metastases to undergo secondary curative surgery and have a 5-year overall survival of approximately 30%.
  • CT computed tomography
  • MRI magnetic resonance tomography
  • PET positron emission tomography
  • preoperative endosnography in rectal cancer are often unable to produce small Accumulations of tumor cells (so-called micrometastases) in lymph nodes or in other organs to detect.
  • the actual tumor stage is often considered to be too low and a possibly necessary adjuvant or palliative therapy is not administered. Therefore, the molecular prediction of metastases is dependent on a primary colorectal carcinoma, that is, the prediction of individuals already colonized by the primary tumor Tumor cells and clinically not yet manifested metastases in remote body regions, mostly lymph nodes and liver, as disclosed in the invention, of particular clinical relevance because it leads to therapeutic decisions that can be life-prolonging and improving the quality of life for patients with colorectal carcinomas.
  • the markers disclosed in this invention are also useful for the early detection of metastases and their precursors.
  • the method mentioned above in subsection (c) for predicting the response to a therapy, in particular the response of metastases to a 5-FU-containing chemotherapy or combination therapy may in particular the selection and determination of the expression profile of at least one, preferably at least two genes , more preferably at least three genes from the group of the 120 marker genes disclosed herein, these genes being defined by SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 181 and wherein the expression profile of the genes obtained from tumor or metastasis samples, preferably metastasis samples of patients who respond to therapy compared with the expression profile from metastatic samples from patients who are not responding to therapy.
  • the corresponding therapy is a 5-FU-containing chemotherapy and / or a 5-FU-containing combination therapy.
  • the corresponding marker genes can be determined not only in tumor and / or metastasis samples but also in other biological samples such as blood or blood serum.
  • "acute phase” markers / "acute phase” proteins / "acute phase” genes in the blood / blood serum (or other body fluids, such as peritoneal ascites or lymph) may be determined to be “responders” To distinguish “non-responders”.
  • genes are preferably presented which can be used in the inventive method for predicting the response of metastases to a therapy.
  • the method comprises the determination of the gene expression profile of at least one, preferably at least two genes, wherein at least one of the two genes from the 120 marker genes (as shown in SEQ ID NOs: 1 to 181) from the "minimal sets", as in the following
  • These "minimal sets” include, inter alia and preferably, the named 72, 55, 34, 28 or 7 genes.
  • other "minimal sets" gene panels selected from the 120 marker genes shown here can also be put together, which leads to the determination of "responders” and / or "non-responders”.
  • a "minimal set" subset / gene panel of the 120 marker genes defined herein may be selected, the determination of which is facilitated in biological fluids, samples (such as and in particular blood / blood serum or even lymphatic fluid).
  • a "minimal set” subset includes, e.g. For example, the "Acute Phase Proteins / Genes" disclosed herein.
  • the invention in one embodiment, the determination and / or predication, differentiation of "responders” / "non-responders” to a 5-FU-containing chemo and / or combination therapy, the determination of serum markers.
  • the determination of serum markers from the blood or other body fluids and stool of the patients, especially before chemotherapy is suitable.
  • the so-called acute-phase proteins should be mentioned here, which are already used in everyday clinical practice for monitoring the progress of inflammation under antibiotic therapy and have proved to be robust and valid parameters at infection stations.
  • these markers are also useful for predicting the response of primary tumors and metastases to chemotherapy.
  • the genes of the underlying acute phase proteins are: complement component 1, q subcomponent, beta polypeptides [Affymetrix number 202953_at], SEQ ID number 4; Apolipoprotein E [Affymetrix number 203382_s_at], SEQ ID number 6; Apolipoprotein C-I [Affymetrix number 204416_x_at], SEQ ID number 13; Coagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix number 204714_s_at], SEQ ID number 18; Fibrinogen, B beta polypeptides [Affymetrix number 204988_at], SEQ ID number 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at], SEQ ID number 22; Apolipoprotein B (including Ag (x) antigen) [Affymetrix number 205108_s_at], SEQ ID number 23; Fibrinogen, A alpha polypeptides [Affymetrix number 205
  • the abovementioned genes / gene products thus represent another "minimal set” gene panel or “subset” of the invention.
  • the expression profile of at least one, more preferably at least 3, more preferably at least 5, most preferably at least 7 of the above-mentioned "Acute Phase” genes (or gene products) for prediction of "responders” and “non-responders” to a 5-FU-containing therapy certainly. Further details can also be found in the experimental part and the tables.
  • a selection of the 72 marker genes of the expression profile defined in Table 1, which are shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 72 or SEQ ID NO: 121 to SEQ ID NO: 156 are taken and evaluated.
  • the expression profile of the genes obtained from metastasis samples from patients responding to therapy with the expression profile from metastatic samples from patients who are not responding to therapy.
  • the invention comprises a method for predicting the response of metastases to a therapy, in particular to a 5-FU-containing chemotherapy, wherein the expression profile of at least one gene of the 55 marker genes defined in Table 4 is determined.
  • These 55 genes are in Table D in particular via SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 and SEQ ID NO: 73 to SEQ ID NO: 120 defined, but also include variants of these genes, as in SEQ ID NOs: 136, 137th , 138, 153, 154, 155, 157 to 181.
  • the invention comprises a method for predicting the response of metastases to a therapy, wherein the expression profile of at least one, preferably at least two, more preferably at least 3, more preferably at least 5 gene (s) in Table A defined 34 marker genes is determined.
  • the invention comprises a method for predicting the response of metastases to a therapy, wherein the expression profile of at least one, preferably at least two, more preferably at least 3, more preferably at least 5 gene (s) in Table A defined 28 marker genes is determined.
  • the invention comprises a method for predicting the response of metastases to a therapy, wherein the expression profile of at least one gene, preferably at least two, more preferably at least three of the following seven marker genes is determined.
  • These 7 genes are in the table D in particular over the SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63 and 68 but also include variants of these genes as shown in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154 and 155.
  • marker gene in the context of this invention comprises according to the invention a gene or a gene segment which is at least 60% homologous, preferably at least 65% homologous, more preferably at least 70% homologous, more preferably at least 75% homologous, more preferably at least 80% homologous, more preferably at least 85% homologous, more preferably at least 90% homologous, more preferably at least 95% homologous, more preferably at least 96% homologous, more preferably at least 97% homologous, more preferably at least 98% homologous, more preferably at least 99% homologous , most preferably at least 100% is homologous to the sequences shown in SEQ ID NOs 1 to SEQ ID NOs 181 in the form of deoxyribonucleotides or corresponding ribonucleotides or the proteins derived therefrom, among one of the 120 marker genes (defined in SEQ ID NOs: 1 to 181, for example, in Table D) derived protein in this invention according to the invention a
  • the "recovery of an expression profile" of the marker genes according to the invention comprises obtaining the previously described expression profile from one or more samples of one or more individuals.
  • these "individuals” are primarily humans, but the invention can also be applied to other mammals and especially to monkeys, mice, rats, pigs, horses, dogs, cats, rabbits, rabbits, hamsters and guinea pigs the term "individual” means both ill and healthy representatives of the aforementioned species.
  • a “sample” is understood as meaning one or more cells, tissue, a complete organ or a part thereof, and tumor tissue / tumor cells / metastatic tissue / metastatic cells may also be “samples".
  • the sample is selected from the group consisting of surgical specimen, tissue biopsy, peritoneal fluid, blood, serum, plasma, lymphatic fluid, lymphatic tissue, urine and stool.
  • the in vitro method presented herein may also be performed, inter alia, on biological fluids such as blood and / or blood serum.
  • the "samples" to be analyzed are not limited to samples taken fresh, but the samples may also include frozen or frozen material.
  • the present invention is not limited to the study of virgin material, and the results of the present invention can also be obtained by examining a fixed material, for example, paraffin material.
  • a fixed material for example, paraffin material.
  • RNA-specific primers and probes at exon-exon boundaries within the gene instead of probes against the 3 'region of the genes.
  • the existing examination material ie FFPE tissue of the primary tumor, which originated from tumor resection prior to chemotherapy
  • the person skilled in the art will rather use these detection methods.
  • RNA of paraffin-embedded Tumors colonal carcinoma, lymph node metastases, peritoneal carcinomatosis or distant metastases (eg liver, lung) confirmed the genes: Orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at], SEQ ID number 22, Peroxismoe proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix number 208510_s_at], SEQ ID Number 41; Homeo box Di [Affymetrix number 214604_at], SEQ ID number 62; Mitogen-activated protein kinase kinase 5 [Affymetrix number 203837_at], SEQ ID number 81; Spondin 1 (f-spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix number 209436_at], SEQ ID number 98, Homeo box A9 [Affymetrix number 209905_at], SEQ ID number 99.
  • Orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at], S
  • Gene profile / gene expression level of the gene identified by SEQ ID NO: 4 marked “up” in Table 1 (gene expression is higher in the case of “non-responders” than in “responders") and in Table 5 with “i”, since in Table 5 "responders” against “non-responders” is compared. Table 5 thus shows that the gene is lower in its expression level in responders than in non-responders.
  • a "minimal set" of the 120 marker genes defined herein can be used set'VSubset includes, for example, the following genes / gene markers: complement component 1, qsubcomponent, beta polypeptides [Affymetrix number 202953_at], SEQ ID number 4; apolipoprotein E [affymetrix number 203382_s_at], SEQ ID number 6; apolipoprotein CI [affymetrix number204416_x_at], SEQ ID number 13; coagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix number 204714_s_at], SEQ ID number 18; Fibrinogen, B beta polypeptides [Affymetrix number 204988_at], SEQ ID number 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at],
  • Tables 1, 4 and 5 provide information on the changes in the expression profile of individual genes in comparison between “responders” and “non-responders” / “non-responders.”
  • “responders "versus” non-responders” “according to Table 5 the following gene expression qualities are given (where” down “means that the corresponding gene expression is downregulated in” responders "compared to” non-responders "):
  • Apolipoprotein E [Affymetrix number 203382_s_at], SEQ ID number 6: down
  • Apolipoprotein C-I [Affymetrix number 204416_x_at], SEQ DD number 13: down
  • Coagulation factor V proaccelerator, labile factor [Affymetrix number 204714_s_at], SEQ ID number 18: down
  • Apolipoprotein B (including Ag (x) antigen) [Affymetrix number 205108_s_at], SEQ ID number 23: down
  • Complement component 1 q subcomponent, alpha polypeptides [Affymetrix number 218232_at], SEQ ID number 67: down
  • the serum markers according to Tab. 5 are then indicative of a "5-FU responder" if, in contrast to “non-responders", these are downregulated.
  • the above-mentioned serum markers are therefore particularly suitable for analyzing the success or the potential success of a therapy, in particular a 5-FU-containing chemotherapy / combination therapy, by investigations of body fluids, in particular blood and / or blood serum.
  • a therapy in particular a 5-FU-containing chemotherapy / combination therapy
  • body fluids in particular blood and / or blood serum.
  • the gene expression profile (the gene product amount) in responders is downregulated ("weaker” expression), see also Table 5.
  • “A” means a weaker expression of the corresponding gene in "responders” versus “non-responders”.
  • the skilled person is not required to examine all of the genes / gene products / gene passages shown here, but instead becomes a "minimal set" subset comprising at least 2, preferably at least 3, more preferably at least 5 of those shown here Use marker genes for in vitro diagnosis.
  • At least 1, preferably at least 2, more preferably at least 3 and even more preferably at least 5 of the marker genes shown here are examined for their expression profile (expression level.)
  • a positive finding is (colon carcinoma, prediction of a metastasis or the response to a 5-FU-containing chemotherapy / combination therapy (in particular the response of a metastasis) is present if at least 60%, more preferably at least 70%, more preferably 80%, preferably at least 90%, more preferably at least 95% , more preferably at least 96%, and most preferably at least 97% of the marker genes tested alteration to either healthy tissue (in the determination of colon carcinoma or metastasis) or to sample material from patients who do not respond to 5-FU-containing therapy / respond (prediction of the response of tumors / metastases a 5-FU halt ige chemo- / combination therapy).
  • the attached Table 5 also shows, by way of example and not limitation, that not only diagnostic statements can be made for the methods presented here, if all selected marker genes have 100% of the changes set out in the tables.
  • patient T has been determined to be a 5-FU responder according to the present invention, although individual marker genes show deviations from gene expression profiles as in the standard (see Table 5, column 6) 5 marked in bold.
  • the expression profile of the 120 marker genes disclosed herein is determined by measuring the quantity of marker gene mRNA.
  • This quantity of marker gene mRNA can be e.g. by Genchiptechnologie, (RT) PCR (for example, also on fixed material), Northern hybridization, dot blotting or in situ hybridization can be determined.
  • the inventive method can also be performed by having the skilled person measure and determine the gene products (if present at the protein or peptide level).
  • the invention encompasses the methods described herein in which the gene expression products are determined in terms of their synthesized proteins (or peptides).
  • both the quantity and the quality can be determined.
  • the expression profile of the marker genes is determined by measuring the polypeptide quantity of the marker genes and, if desired, compared with a reference value.
  • the reference value has already been described above and may be from healthy or diseased tissue.
  • the polypeptide level or the polypeptide quantity of the marker genes can be determined by ELISA, RIA, (immuno) blotting, FACS or immunohistochemical methods, in particular also the determination of serum markers (as defined here), can also be carried out with protein-biochemical methods.
  • the expression pattern of the "acute phase proteins" defined herein selected from the 120 marker genes disclosed herein may be performed via such (proter-) biochemical methods as ELISA, RIA, immunoblotting, etc. As illustrated herein, such methods are particularly in the determination of "responders” and “non-responders” on a chemo- and / or combination therapy, in particular a 5-FU-containing therapy of benefit.
  • the invention also relates to a method comprising the following steps:
  • the invention will provide the above method for determining whether the patient is suffering from a carcinoma, preferably an adenocarcinoma. Also, the method is not limited to the determination of liver metastases or the response of the metastases to a 5-FU-containing therapy. The same applies, mutatis mutandis, for the other methods of the invention.
  • the invention also relates to a kit for carrying out the methods described herein, wherein the kit comprises specific (nucleotide) probes, primers (pairs), antibodies, aptamers for the determination of at least two of the 120 marker genes described in SEQ ID NO: 1 to 181, or for the determination of at least two gene products of the 120 marker genes comprising the marker genes encoded in SEQ ID NO: 1 to 181.
  • the kit is preferably a diagnostic kit.
  • a "microarray” or a "gene chip” is also referred to as a "kit”.
  • the invention also encompasses the use of one of the 120 marker genes or a group (in particular of the "minimal sets” or also a selection of these genes defined herein) of the 120 marker genes shown in SEQ ID NO: 1 to 181 to determine whether the patient
  • transgenic mouse that over- or under-expresses one or more of the markers.
  • a transgenic mouse can serve to represent a model system for, for example, liver metastasis in humans.
  • metastasis which has so far only been partially understood, could be made clear and new insights into the metastasis pathway of colorectal carcinoma or other carcinomas could be gained.
  • a transgenic mouse could be used to test therapeutic or toxic substances.
  • a similar principle also underlies the knock-out analyzes that could be performed using the genes of this invention.
  • the animal according to the invention can also be used for screening methods (screening method).
  • the invention also relates to the use of a transgenic non-human animal that over- or under-expresses one or more of the marker genes defined herein in a drug screening process.
  • This screening method is particularly suitable for the screening of agents in cancer therapy, in particular in the treatment of colorectal carcinomas and / or metastases, preferably liver metastases.
  • transgenic cell that over- or under-expresses one or more of the marker genes defined herein in a drug screening process.
  • drugs for cancer therapy are screened.
  • this is for use in a screening procedure for drugs for the treatment of colorectal carcinomas; and / or metastases, preferably liver metastases.
  • the gene sequences, oligonucleotides or other fragments of the marker genes of this invention can be used to detect and quantify differential gene expression.
  • Qualitative and quantitative methods for such measurements are well known in molecular genetics.
  • antibodies to one epitope or protein or multiple epitopes or multiple proteins produced for the genes described in this invention may be produced. These antibodies can be used to quantify the protein content in a human cell. Protocols for detecting and quantifying protein expression by monoclonal or polyclonal antibodies are well known in molecular genetics. Examples are ELISA, RIA and FACS analysis.
  • the gene sequences or gene fragments or complementary nucleic acids of the marker genes of this invention can also be used in gene therapy.
  • the cDNA of one or more genes of the invention can be introduced ex vivo into target cells. Once stable integration and transcription or translation is assured, the cells can be returned to the patient's tumor and may possibly correct for mutations associated with under or over expression of this protein.
  • the cDNA of one or more genes of the invention can be introduced in vivo using vectors such as retroviruses, adenoviruses, HS viruses, or bacterial plasmids.
  • Non-viral methods also include the introduction of cationic liposomes, polylysine conjugates or the direct injection of DNA.
  • Another possible application of the invention is the ability to use therapeutically the proteins encoded by the marker genes of the invention, their ligands or complementary nucleic acid sequences.
  • the combination of various such drugs may act synergistically on the tumor reduction or result in no metastasis occurring.
  • these drugs could also be used synergistically with already established substances in the treatment of colorectal cancer.
  • the selected genes which form the basis of the present invention are preferably used in the form of a "minimal kit” or a "gene panel", ie a library comprising the particular genetic sequences and / or their expression products of the present invention.
  • Generation of the gene paneling allows rapid and specific analysis of specific aspects of cancers, particularly carcinoma, particularly adenocarcinoma, preferably gastrointestinal carcinoma, and more preferably colorectal carcinoma, metastasis, especially colon tumors, and response to specific chemotherapeutic treatment procedures, especially to a 5-FU-containing chemo / combination therapy.
  • the gene panels as described and used in this invention can be used with surprisingly high efficiency for the diagnosis, treatment and monitoring as well as analysis of a predisposition to intestinal cell proliferative disorders.
  • the marker genes (or a Subsets, minimal sets thereof) can be used in the form of gene panels to be analyzed (gene expression panels) in in vitro diagnostics.
  • use of a diverse array of the genes presented herein allows a relatively high degree of sensitivity and specificity compared to single gene analyzes.
  • the particular combination of genes according to the invention described above and also characterized in the claims provides a particularly sensitive and specific means of identifying proliferative cell diseases of intestinal tissues, in particular colon mucosa or derived metastases available.
  • the gene panels as described and used in this invention can be used with surprisingly high efficiency for the treatment and the determination of the course of treatment of proliferative diseases of the intestinal cells, in particular the colon), by predicting the outcome of the treatment with a therapy containing a or more 5-FU-containing active ingredients.
  • Analysis of each gene of the panel contributes to the evaluation of patient responsiveness, so in a less preferred embodiment, patient evaluation can be accomplished by analyzing only one gene. Analysis of a single member of the 'gene panel' would provide a cheap but less accurate means of evaluating patient responsiveness; analysis by many members of the panel would provide a more expensive means of performing the procedure, however higher accuracy (the technically preferred solution).
  • a carcinoma in particular an adenocarcinoma, preferably a gastrointestinal carcinoma and more preferably a colorectal carcinoma and the determination of metastases described herein, in particular liver metastases.
  • the methods according to the invention generally comprise at least the examination of the expression profile of two, preferably at least three, preferably at least four, preferably at least five, preferably at least six, preferably at least seven, preferably at least eight, preferably at least new, preferably at least ten, preferably at least 15, preferably at least 20, preferably at least 25, preferably at least 30, preferably at least 35, preferably at least 40, preferably at least 45, preferably at least 50, preferably at least 55, preferably at least 60, preferably at least 65, preferably at least 70, preferably at least 75, preferably at least 80, preferably at least 85, preferably at least 90, preferably at least 100, preferably at least 110 of the 120 marker genes described herein.
  • the methods of the present invention are used for the improved detection, treatment and monitoring of proliferative diseases of intestinal cells, in particular colon mucosa.
  • the present invention moreover relates to the diagnosis and / or prognosis of events which are detrimental or relevant to the patients or individuals in whom the gene expression of the here depicted 120 marker genes (or a minimal set thereof), with another set of gene expression parameters (eg healthy controls or 5-FU responders / non-responders), the differences serving as a basis for the diagnosis and / or prognosis of events that are detrimental or relevant to patients or individuals.
  • the gene expression of the here depicted 120 marker genes or a minimal set thereof
  • another set of gene expression parameters eg healthy controls or 5-FU responders / non-responders
  • chemotherapy is understood to mean the use of active ingredients of the chemical substances, in particular of 5-FU-containing substances and substance mixtures, for the treatment of cancer and / or metastases.
  • Table 1 contains the genes differentially different in the present invention
  • Table 2 contains the genes differentially different in the present invention
  • Table 3 contains the annotations, gene names and Affymetrix E) Nos. Of the genes described in Tables 1-3.
  • the pictures show:
  • Figure 1 shows schematically the methodical procedure that is necessary for the generation of a gene expression profile with predictive significance and thus for the invention. (Further details can be found in the examples of the invention).
  • Figure 2 shows the process of statistical evaluation through a training test set procedure. In this case, the procedure is shown under A., as listed under Example 4a, under B. is shown, as was done under Example 4b. (Nurtured versions can be found in the examples of the invention).
  • Figure 3 shows "heat-maps" of the expression profiles, which uses mathematical algorithms to create the similarity of the signatures and to divide into groups
  • Figure 3A shows the supervised cluster analysis of the training set
  • Figure 3b the cluster analysis performed with one from the training set independent test set.
  • Figure 4 shows the evaluation of the Principal Componant Analysis.
  • Each sphere symbolizes the gene expression profile from a tissue (tumor or metastasis).
  • the close proximity of spheres from both responders (green) to non-responders (reddish brown) to 5-FU-containing chemotherapy and the spatial separation between green and reddish brown spheres shows the good possibility of discriminating against both forms of response. (Further details can be found in the examples of the invention).
  • FIG. 5 shows computed tomography (CT) images of Pat. T. before and after first-line treatment with 5-FU-containing therapy.
  • CT computed tomography
  • PR partial response
  • This patient also shows the response profile in the gene expression profile from the liver metastasis shown.
  • the tissue samples of the normal colonic mucosa, colorectal carcinomas and the corresponding liver metastases were obtained intraoperatively, immediately frozen in liquid nitrogen and then archived at -80 0 C.
  • Cryotome was used to prepare 5 ⁇ m sections of the tumor specimens, which were mounted on glass slides and stained using hematoxylin-eosin (HE). Only those tumor samples that had a microscopically determined tumor cell fraction of at least 80% were selected for further processing. Subsequently, with the cryotome 30 .mu.m thick sections of the selected tumor samples were prepared on special slide slides (Membrane South for Laser microdissection; Molecular Machines & Industries AG; CH-8152 Glattbrugg) and converted immediately into 70% ethanol.
  • HE hematoxylin-eosin
  • the tumor cell areas were then cut out with a laser microdissection device (LMD) from Leica and transferred to a reaction vessel. Subsequently, the total RNA was isolated from the tumor cell areas using a RNeasy Mini-Kit (Order No. 74104) from Qiagen according to the manufacturer's protocol. Corresponding protocols are available from the manufacturer or published on the internet.
  • LMD laser microdissection device
  • RNeasy Mini-Kit Order No. 74104
  • the quality of the isolated total RNA was checked with the aid of a Lab-on-a-Chip device (Agilent) and only quantitatively sufficient total RNA (> 100 ng) and high-quality RNA were used for the following steps.
  • Example 2 Production and amplification of aRNA from isolated total RNA
  • RNA amino-allyl-labeled cRNA
  • Eberwine method van funds RN et al (1990) PNAS USA. 87: 1663-7
  • MessageAmp kit the company Ambion carried out according to the manufacturer's protocol.
  • Corresponding protocols are available from the manufacturer or published on the Internet.
  • the labeled cRNA was purified and concentrated with Qiagen's "RNeasy mini" kit, and the necessary steps were performed according to the protocol of the manufacturer, which is also published in the Liternet.
  • the probe to be used for hybridization was prepared by fragmentation of labeled cRNA. Subsequently, HG U133-A Microarrys from Affymetrix were hybridized with this probe, unbound probe removed and the raw data read with the GeneArray scanner from Agilent. The procedures for performing the procedures mentioned were carried out as described in the manual for gene expression analysis (Affymetrix). The signal intensities and the detection signals (“detection calls”) were created using the GeneChip 5.0 software from Affymetrix.
  • the data collected by the GeneArray Scanner with respect to the hybridization of the labeled cRNA fragments with microarray sequences were then statistically evaluated. This evaluation was carried out in two ways: a) The procedure involved creating a training collective and reviewing the data obtained in a test collective.
  • the data sets are "published” using Affymetrix ® software, ie made comparable.
  • the invention provides 72 and 55 (marker) genes whose expression profile and / or expression level both for (early) detection of colorectal carcinoma, for the prediction of metastases (preferably liver metastases) in response to a primary colorectal carcinoma and / or prediction the response of metastases to a 5-FU therapy (chemotherapy) can be used. Since the genes presented here of 72 and 55 genes have overlaps, a total of 120 genes are provided here (shown in SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 181 and shown in Table 2 and 3, as well as in Table D), with which the person skilled in the art can carry out the methods of the invention as well as the use of the invention. SEQ ID NO: 1 to 120 refer to individual genes corresponding to the 120 marker genes.
  • SEQ ID NO: 121 to 181 are variants of single marker genes.
  • the corresponding correlation of the individual marker genes (120) to the sequences (181) can be found in the tables, in particular Table D.
  • the "kits” of the invention are also defined and reworked by these genes.
  • the tables attached hereto (especially Tables 1 to 5 and A, B, C, D) allow one skilled in the art to determine and analyze the selected expression profiles.
  • Example 5 72 genes and a selection thereof from Table 2, which are suitable as marker genes for the detection of colorectal carcinoma
  • Group-specific component vitamin D binding protein
  • Profilin 2 [Affymetrix number 204992_s_at], SEQ ID Nos. 21 or 124; LGN protein [Affymetrix number 205240_at], SEQ ID number 25; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix number 205969_at], SEQ ID number 33; Down Syndrome critical region gene 6 [Affymetrix number 207267_s_at], SEQ ID number 38; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix number 208510_s_at], SEQ ID Nos.
  • Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix number 209901_x_at], SEQ ID Nos. 45, 139 or 140; Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1 [Affymetrix number 211991_s_at], SEQ ID number 49; Aldehyde dehydrogenase 1 family, member Al [Affymetrix number 212224_at], SEQ ID number 50; Plexin Dl [Affymetrix number 212235_at], SEQ ID number 51; Hypothetical protein PP1665 [Affymetrix number 213343_s_at], SEQ ID number 54; Complement component 3 [Affymetrix number 217767_at], SEQ ID number 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix number 219508_at], SEQ ID number 68; A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 [
  • the values of one or more (preferably at least two) of the described genes or their translated proteins are determined, for example, in the blood.
  • the determination of RNA in the blood takes place via the isolation of RNA from the citrated plasma, rewriting into cDNA and subsequent PCR.
  • the determination of proteins in the blood can be done by Western blot, ELISA or Lurninex ® technology.
  • the values thus obtained are compared with the normal values of an individual (or with healthy tissue of the patient) in order to be able to diagnose a colorectal carcinoma at an early stage.
  • the person skilled in the art will preferably examine at least one, more preferably at least two, and most preferably at least three of the marker genes shown here in the form of their expression profile.
  • the expression profile is defined by the following genes: LGN protein [Affymetrix number 205240_at], SEQ ID number 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Number 208510_s_at], SEQ E ) number 41, 136, 137 or 138; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix number 219508_at], SEQ ID number 68.
  • Example 6 55 genes and a selection thereof from Table 3, which are useful as marker genes for the detection of colorectal carcinoma
  • Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 [Affymetrix number 205097_at], SEQ ID number 83; Pleiomorphic adenoma gene 1 [Affymetrix number 205372_at], SEQ ID number 85; KIAA0672 gene product [Affymetrix number 205414_s_at], SEQ ID number 86; PTK7 protein tyrosine kinase 7 [Affymetrix number 20701 l_s_at], SEQ ID Nos.
  • Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix number 21253 l_at], SEQ ID number 104; Paraneoplastic antigen [Affymetrix number 213230_at], SEQ ID number 105; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix number 214677_x_at], SEQ ID Nos. 109 or 177; Chromosomes 14 open reading frame 18 [Affymetrix number 217988_at], SEQ ID Nos.
  • Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 [Affymetrix number 219697_at], SEQ ID number 114; LBP protein; orthologue of mouse CRTR-I [Affymetrix number 219735_s_at], SEQ ID number 115; Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 [Affymetrix number 220658_s_at], SEQ ID NO. 118.
  • the values of one or more (preferably at least two) of the described genes or their translated proteins are determined, for example, in the blood and compared with the normal values of an individual in order to be able to diagnose a tumor disease at an early stage.
  • the "normal values of an individual” may be the values of an unaffected individual or else, as mentioned above, come from healthy tissue of the diseased patient.
  • Example 7 Selection of genes of Tables 2 and 3, which are particularly well suited as marker genes for the detection of colorectal carcinoma
  • the gene selection from the 72 genes of Table 2 (Example 5) combined with the gene selection from the 55 genes of Table 3 (Example 6) represent a first, "set” of 33 marker genes, which differed in a particularly significant differential Expression, measured in terms of p ⁇ 0.05 in the T test (Table 2 and Table 3, Column 7), stands out from the total of 120 marker genes and is therefore of particular diagnostic relevance
  • the genes are: Major histocompatibility complex class II, DP beta 1 [Affymetrix number 201137_s_at], SEQ ID number 2, CD163 antigen [Affymetrix number 203645_s_at], SEQ ID number 7, phospholipase C, beta4 [Affymetrix number 203895_at], SEQ ID number 8 or 122; Solute carrier family 31 (copper transporters), member 2 [Affymetrix Number 204204_at], SEQ ID No.
  • vitamin D binding protein group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix number 204965_at], SEQ ID number 19; profilin 2 [affymetrix number 204992_s_at] , SEQ ID Nos. 21 or 124; LGN protein [Affymetrix number 205240_at], SEQ ID number 25; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix number 205969_at], SEQ ID number 33; Down Syndrome critical region gene 6 [Affymetrix number 207267_s_at], SEQ ID number 38; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix number 208510_s_at], SEQ ID Nos.
  • group-specific component vitamin D binding protein
  • Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix number 209901_x_at], SEQ ID No. 45, 139 or 140; Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1 [Affymetrix number 211991_s_at], SEQ ID number 49; Aldehyde dehydrogenase 1 family, member Al [Affymetrix Number 212224_at], SEQ ID No.
  • Plexin Dl [Affymetrix number 212235_at], SEQ DD number 51; Hypothetical protein PP 1665 [Affymetrix number 213343_s_at], SEQ DD number 54; Complement component 3 [Affymetrix number 217767_at], SEQ ID number 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix number 219508_at], SEQ ID number 68; Disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 [Affymetrix number 222162_s_at], SEQ ID number 70; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix number 203708_at], SEQ ID Nos.
  • Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 [Affymetrix number 205097_at], SEQ ID number 83; Pleiomorphic adenoma gene 1 [Affymetrix number 205372_at], SEQ DD number 85; KIAA0672 gene product [Affymetrix number 205414_s_at], SEQ ID number 86; PTK7 protein tyrosine kinase 7 [Affymetrix number 20701 l_s_at], SEQ DD Nos.
  • Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix number 21253 l_at], SEQ ID number 104; Paraneoplastic antigen [Affymetrix number 213230_at], SEQ DD number 105; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix number 214677_x_at], SEQ ID Nos.
  • Chromosomes 14 open reading frame 18 [Affymetrix number 217988_at], SEQ DD number 112; Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 [Affymetrix number 219697_at], SEQ ID number 114; LBP protein; likely orthologue of mouse CRTR-I [Affymetrix number 219735_s_at], SEQ DD number 115; Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 [Affymetrix number 220658_s_at], SEQ DD number 118.
  • at least 18 of the gene collection of 33 genes shown here are again determined, these 18 being able to serve for the early detection of a colorectal carcinoma.
  • Preferred choices in these 18 marker genes are, for example, the genes having SEQ ID NOs: 2, 7, 8 (or 122), 12, 19, 21 (or 124), 25, 33, 38, 41 (or 136, 137, 138 ), 45 (or 139, 140), 49, 50, 51, 54, 66, 68 and 70 (see also Example 5) or the genes having SEQ ID NOs: 25, 41 (or 136, 137, 138), 68, 78 (or 157), 83, 85, 86, 92 (or 159, 160, 161, 162), 99 (or 170), 101 (or 171, 172), 103 (or 174), 104, 105, 109 (or 177), 112, 114, 115 and 118 (see also Example 6).
  • the genes are: LGN protein [Affyrnetrix number 205240_at], SEQ ID number 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affyrnetrix number 208510_s_at], SEQ ID Nos. 41, 136, 137 or 138; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix number 219508_at], SEQ ID number 68.
  • Table B shows the difference in the expression profile / level of expression of the defined genes in comparison of healthy mucosa (Muc) and the tumor tissue (Tu). hereby means that the corresponding gene in mucosa has a lower expression level with respect to tumors, whereas a “T” means that the corresponding gene has a higher expression level in healthy tissue compared to the tumor tissue. Conversely, this means that "'! ⁇ " In Table B means that the corresponding gene shows a higher level of expression in the tumor tissue than in the healthy mucosa and that "t” means that the corresponding gene shows a lower level of expression in the tumor tissue than in the healthy mucosa.
  • Example 8 and the following examples show that the 120 genes according to the invention (SEQ ID NOs: 1 to 181) are likewise suitable for determining a liver metastasis of a colorectal carcinoma.
  • a liver metastasis depending on a colorectal carcinoma, preferably an already diagnosed colorectal carcinoma can be determined.
  • Example 8 The 72 genes from Table 2 can also be used to predict liver metastases from colorectal carcinomas
  • Example 9 Minimal selection ("minimal set") of genes from Table 2, which are particularly well suited for the prediction of liver metastases in the case of colorectal carcinoma
  • aldolase B fructose-bisphosphate [Affymetrix number 204705_x_at], SEQ ID number 17; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix number 204965_at], SEQ ID number 19; Fibrinogen, B beta polypeptides [Affymetrix number 204988_at], SEQ ID number 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at], SEQ ID number 22; Alpha-1-microglobulin / bikunin precursor [Affymetrix number 205477_s_at], SEQ ID number 26; Fibrinogen A alpha polypeptides [Affymetrix number 205650_s_at], SEQ ID Nos.
  • Coagulation factor II thrombin
  • Pre-alpha globulin
  • H3 polypeptides Affymetrix number 205755_at] SEQ ID number 31
  • Arylacetamide deacetylase esterase
  • Asialoglycoprotein receptor 2 Affymetrix number 206130_s_at] SEQ ID Nos.
  • Amyloid P component serum [Affymetrix number 206350_at], SEQ ID number 37; Haptoglobin [Affymetrix number 208470_s_at], SEQ ID number 40; Alpha-1 antitrypsin [Affymetrix number 211429_s_at], SEQ ID Nos.
  • Transferrin [Affymetrix number 214063_s_at], SEQ ID number 58; Complement component 4A [Affymetrix number 214428_x_at], SEQ ID number 59; Similar to Human Ig rearranged gamma chain mRNA, VJC region [Affymetrix number 214669_x_at], SEQ ID number 64; Complement component 3 [Affymetrix number 217767_at], SEQ ID number 66; Fibrinogen, gamma polypeptides [Affymetrix number 219612_s_at], SEQ ID number 69 or 156; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix number 37020_at], SEQ ID number 71; Hemopexin [Affymetrix Number 39763] SEQ ID Nos.
  • the aforementioned 20 genes are a particularly suitable selection that, in a standard study of these marker genes, allows the presence or growth of liver metastases to be examined for primary colorectal carcinoma.
  • t means that the corresponding gene in the metastasis is upregulated with respect to the primary tumor, while "4.” means that the gene is downregulated accordingly.
  • Example 10 The 55 genes from Table 3 can be used to predict liver metastases in the case of a diagnosed colorectal carcinoma
  • Example 11 Minimal Selection of Genes from Table 3, which are particularly well-suited for the prediction of liver metastases in the case of a diagnosed colorectal carcinoma
  • the aforementioned two genes are a particularly suitable selection that allows a standard study of these marker genes to investigate the growth of liver metastases due to a primary colorectal carcinoma.
  • these two genes are optionally used in combination with other genes for appropriate diagnostics.
  • these two genes are combined with at least one other gene from Table C, Table 2 and / or Table 3, but other genes of SEQ ID Nos. 1 to 73, 75 to 108, 110 to 176 and 178 to 181 used for diagnostics.
  • the corresponding information is also in column 10 of Tables 2 and 3.
  • aldolase B fructose-bisphosphate
  • Affymetrix number 204705_x_at SEQ ID number 17, group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix number 204965_at], SEQ ID number 19, fibrinogen, B beta polypeptides [Affymetrix number 204988_at], SEQ ID number 20, Orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at], SEQ ID number 22, Al ⁇ ha-1 microglobulin / bikunin precursor [Affymetrix number 205477_s_at], SEQ ID number 26, fibrinogen A alpha polypeptides [Affymetrix Number Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix number 205754_at], SEQ ID number 30, pre-alpha (globin).
  • Amyloid P component serum [Affymetrix number 206350_at], SEQ ID number 37; Haptoglobin [Affymetrix number 208470_s_at], SEQ ID number 40; Alpha-1 antitrypsin [Affymetrix number 211429_s_at], SEQ ID Nos.
  • Transferrin [Affymetrix number 214063_s_at], SEQ ID number 58; Complement component 4A [Affymetrix number 214428_x_at], SEQ ID number 59; Similar to Human Ig rearranged gamma chain mRNA, VJC region [Affymetrix number 214669_x_at], SEQ ID number 64; Complement component 3 [Affymetrix number 217767_at], SEQ ID number 66; Fibrinogen, gamma polypeptides [Affymetrix number 219612_s_at], SEQ ID number 69 or 156; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix number 37020_at], SEQ ID number 71; Hemopexin [Affymetrix number 39763_at] SEQ ID number 72; Tenascin C (hexabrachione) [Affymetrix number 201645_at], SEQ ID number 74; Immunoglobulin lambda joining 3
  • liver metastases are preferably examined in the following examples.
  • Example 13 72 genes from Table 1, which are suitable for predicting the course of therapy of patients with liver metastases of colorectal carcinoma in the case of a 5-FU-containing chemotherapy or combination therapy
  • Table A sets out that the level of expression of the individual genes can be determined and, in particular, distinguished between “responders” and “non-responders".
  • Data for the 120 genes according to the invention are listed in Tables 1 and 4.
  • Li Table A shows the preferred genes to be analyzed.
  • “T” means that the corresponding gene expresses more strongly in patients who respond to a 5-FU-containing chemo and / or combination therapy ("responders") to the non-responders
  • the "4>” means a weaker expression of the corresponding gene in "responders" versus "non-responders”.
  • the term "level of expression” thus means a measurable value of the expression of the gene to be examined, this value, as shown in the tables and shown in Example 2, on the expression profile of the RNA in the sample
  • the person skilled in the art can determine the expression level by other analyzes (eg determination of the amount of protein produced by the genes SEQ ID NOs: 1 to 181 encoded proteins, peptides or peptide segments.)
  • analyzes include, for example and not limited to, immunodetection methods such as Western blot, ELISA, RIA, immunoprecipitation, as well as FACS analyzes.
  • Example 14 55 genes from Table 4, which are suitable for predicting the course of therapy of patients with liver metastases of colorectal carcinoma in the case of a 5-FU-containing chemotherapy or combination therapy
  • one or more of the described genes, gene fragments, complementary nucleic acids or translated proteins are well suited for predicting the effectiveness of a 5-FU-based chemotherapy or combination therapy (5-FU, for example, in combination with folinic acid, irinotecan, oxaliplatin and others).
  • Example 15 Selection of genes from Tables 1 and 4, which can be used as marker genes for predicting the course of therapy of patients with liver metastases of colorectal carcinoma in the case of a 5-FU-containing chemotherapy or combination therapy
  • apolipoprotein E [Affymetrix number 203382_s_at], SEQ DD number 6; CD163 antigen [Affymetrix number 203645_s_at], SEQ ID number 7; Phospholipase C, beta 4 [Affymetrix number 203895_at], SEQ ID number 8 or 122; Chromosome 11 open reading frame 9 [Affymetrix number 204073_s_at], SEQ ID number 10; Apolipoprotein CI [Affymetrix number 204416_x_at], SEQ ID number 13; Sialyltransferase [Affymetrix number 204542_at], SEQ ID number 14; Coagulation factor C homologue, cochlin (Limulus polyphemus) [Affymetrix number 205229_s_at], SEQ ID number 24; LGN protein [Affymetrix number 205240_at], SEQ ID number 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix number 20
  • Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix number 209901_x_at], SEQ ID Nos. 45, 139 or 140; Hyaluronoglucosaminidase 1 [Affymetrix Number 210619_s_at], SEQ ID Nos. 46, 141, 142, 143, 144, 145, 146 or 147; Alpha-1 antitrypsin [Affymetrix number 211429_s_at], SEQ ID Nos.
  • Low density lipoprotein receptor-related protein 4 [Affymetrix number 212850_s_at], SEQ ID number 52; Hypothetical protein PP 1665 [Affymetrix number 213343_s_at], SEQ ID number 54; Serum amyloid A2 [Affymetrix number 214456_x__at], SEQ ID number 60; Orosomucoid 2 [Affymetrix number 214465_at], SEQ ID number 61; Eyes absent homolog 1 (Drosophila) [Affymetrix number 214608_s_at], SEQ ID Nos.
  • H factor (complement) -like 1 [Affymetrix number 215388_s_at], SEQ ID number 65; Complement component 3 [Affymetrix number 217767_at], SEQ ID number 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix number 219508_at], SEQ ID number 68; Fascin homolog 1, actin-bundling protein (Strongylocentrotus purpuratus) [Affymetrix number 201564_s_at], SEQ ID number 73; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix number 203708_at], SEQ ID Nos.
  • Biliverdin reductase A [Affymetrix number 203771_s_at], SEQ ID number 79; IGF-II mRNA-binding protein 3 [Affymetrix number 203819_s_at], SEQ ID number 80; Cathepsin E [Affymetrix number 205927_s_at], SEQ ID No. 89 or 181; Keratin 6A [Affymetrix number 209125_at], SEQ ID Nos. 97, 167 or 168; spondin 1, (f-spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix number 209436_at], SEQ ID Nos.
  • Interleukin 1 receptor type II [Affymetrix number 211372_s_at], SEQ ID Nos. 101, 171 or 172; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix number 21253 l_at], SEQ ID number 104; G protein-coupled receptor 49 [Affymetrix number 213880_at], SEQ ID No. 107; Spondin 1, (f-spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix number 213994_s_at], SEQ ID Nos.
  • the invention preferably represents a selection from the 120 genes shown, namely 34, preferably 28, which can be used in particular for determining the responsiveness to 5-FU-containing therapies.
  • the "responsiveness" to a 5-FU-containing chemotherapy / combination therapy also determines the expression profile of specific serum markers in blood
  • serum markers are also contained in the 120 marker genes defined herein and include in particular the following marker genes (and their variants and homologues): Complement component 1, qsubcomponent, beta polypeptides [Affymetrix number 202953_at], SEQ ID number 4, apolipoprotein E [Affymetrix number 203382_s_at], SEQ ID number 6, apolipoprotein CI [Affymetrix number 204416_x_at], SEQ ID number 13, coagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix number 204714_s_at], SEQ ID number 18, fibrinogen, B beta polypeptides [Affymetrix number 204988_at], SEQ ID number 20, orosomucoid 1 [Affymetrix number 205041_s_at], SEQ ID number 22, apolipoprotein B (including Ag (Affymetrix number
  • One or more (preferably at least two, more preferably at least three) of the described genes, gene fragments, complementary nucleic acids or translated proteins are therefore particularly well suited for predicting the effectiveness of a 5-FU based chemotherapy or combination therapy (5-FU eg Combination with folinic acid, irinotecan, oxaliplatin and others).
  • At least 3 genes are genes 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, represented in the SEQ ID NOs: chromosomes 11 open reading frame 9 [Affymetrix number 204073_s_at], SEQ ID number 10; Sialyltransferase [Affymetrix number 204542_at], SEQ ID number 14; LGN protein [Affymetrix number 205240_at], SEQ ID number 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix number 208510_s_at], SEQ ID Nos.
  • Low density lipoprotein receptor-related protein 4 [Affymetrix number 212850_s_at], SEQ ID number 52; Eyes absent homolog 1 (Drosophila) [Affymetrix number 214608_s_at], SEQ ID Nos. 63, 153, 154 or 155; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix number 219508_at], SEQ ID number 68.
  • Example 16 Individual therapy of liver metastases of a colorectal carcinoma derived from the expression data of the respective patients
  • Mr. T. is a 42-year-old patient who was diagnosed with subtotal stenosing sigmoid carcinoma with liver metastases in July 2003.
  • the primary tumor was completely resected on 18.07.2003 (RO) and in parallel a biopsy was obtained from one of the liver metastases.
  • This liver metastasis was laser-microdissected (according to Examples 1-4), the RNA isolated and amplified. Subsequently, the amplified RNA was hybridized on an Affymetrix chip HG U133-A and read the expression pattern. The result of the analyzes was confirmed on September 5, 2003 (see Table 5, column 4) and gave a gene signature that predicted a good response (Examples 13 to 15).
  • the patient was treated after surgery with palliative chemotherapy consisting of folinic acid and 5-fluorourcil as a 24-h infusion (AIO regimen) and with oxaliplatin every 2 weeks.
  • palliative chemotherapy consisting of folinic acid and 5-fluorourcil as a 24-h infusion (AIO regimen) and with oxaliplatin every 2 weeks.
  • CT computer tomography
  • a partial remission reduction of liver metastases by> 50%
  • CTx 3rd and 4th cycle of this chemotherapy
  • the reference metastasis has changed from original (CT findings of 04.08.2003, before chemotherpapia) 12.9 x 9.0 cm to now 4.2 x 7.6 cm (CT findings of 25.03.2004; after 4 cycles of chemotherapy) reduced (reduction by 72.6%, corresponds to a partial response according to WHO criteria)
  • CT findings of this patient before chemotherapy and after the 4th chemotherapy cycle are shown in Figure 5.
  • the other liver metastases were size-reduced and no new metastases occurred.
  • the patient is currently living (May 2004) and even a secondary curative metastatic surgery is being discussed.
  • Example 17 Validation of marker genes also defines SEQ ID NOS: 25, 41 and 68 as diagnostic markers for colorectal carcinomas
  • biopsies of both normal colon and rectum mucosa and biopsies of the tumor were obtained preoperatively from an independent set of 12 patients with colorectal carcinoma.
  • the biopsies were frozen immediately after collection in liquid nitrogen and then archived at -80 0 C.
  • the samples were treated as described in Examples 1 to 3, i. the RNA is extracted from the samples, the RNA amplified and labeled and hybridized with HG U133-A microarrays from Affymtrix.
  • the procedures for performing the procedures mentioned were carried out as described in the manual for gene expression analysis (Affymetrix).
  • the signal intensities and the detection signals (“detection calls") were created using the GeneChip 5.0 software from Affymetrix.
  • Table 1 lists all 72 genes which, after the evaluation of the raw data according to the statistical method from Example 4a, are relevant for a comparison of the responder gene expression (Resp) with that of non-responders (Non-Resp) in response to response are a 5-FU-containing palliative chemotherapy for metastatic colorectal cancer.
  • Lm Liver metastasis
  • Table 3 lists all 55 genes which, after evaluation of the raw data according to the statistical procedure of Example 4b, are relevant for a comparison of gene expression between normal tissue (normal colon mucosa (Muc)), colorectal primary tumor (Tu) and
  • Lm Liver metastasis
  • Table 4 lists all 55 genes which, after the evaluation of the raw data according to the statistical method from Example 4b, are relevant for a comparison of the responder gene expression (Resp) with those of non-responders (Non-Resp) with respect to
  • Table 5 compares the change in the level of expression between patient T, responder (Resp) and non-responder (non-resp).
  • Table 6 lists the Seq IDs which, according to recital 9, allow differentiation of normal intestinal mucosa and colorectal carcinoma.
  • Column 6 shows the significance level in the T-test
  • Column 7 shows the extent to which the individual genes in the tumor are up or down (compared to normal tissue)
  • Column 8 contains the names of the genes
  • Column 9 contains the gene symbol
  • variant in this invention encompasses both splice variants and homologous or highly homologous genes with respect to the 120 marker genes disclosed herein.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren (i) zur Erkennung eines Karzinoms, insbesondere eines Adenokarzinoms, bevorzugterweise eines gastrointestinalen Karzinoms und besonders bevorzugt eines kolorektalen Karzinoms, (ii) zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären Kolonkarzinoms und/oder (iii) zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil-haltige Chemotherapie umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen oder einer Auswahl daraus.

Description

Tumormarker zur Diagnose von Karzinomen und/oder davon abstammender Metastasen
Die Erfindung umfasst ein Verfahren (i) zur Erkennung eines Karzinoms, insbesondere eines Adenokarzinoms, bevorzugterweise eines gastrointestinalen Karzinoms und besonders bevorzugt eines kolorektalen Karzinoms, (ii) zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären Kolonkarzinoms und/oder (iii) zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil-haltige Chemotherapie umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen oder einer Auswahl daraus. Die 120 Gene sind durch ihre Sequenzen wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181 definiert. Ebenfalls offenbart werden Kits zur Durchführung des erfinderischen Verfahrens und diagnostische Kits. Weitere Ausführungsformen der Erfindung betreffen die Verwendung der hierin offenbarten Markergene und/oder der hierin offenbarten Kombinationen von Markergenen. Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung nicht¬ menschlicher Säuger oder kultivierter Zellen daraus, deren Erbgut in Bezug auf eines oder mehrere der in dieser Erfindung ausgeführten Gene verändert wurde. Die nicht-menschlichen Säuger oder die kultivierten Zellen, deren Erbgut verändert wurde, können insbesondere für Tests alternativer Therapien oder Therapeutika in Bezug auf primäre kolorektale Karzinome und daraus abgeleiteter Metastasen eingesetzt werden.
Kolorektale Karzinome stellen die dritthäufigste Tumorentität in westlichen Ländern dar. In Deutschland erkranken ca. 50.000 Patienten pro Jahr an kolorektalen Karzinomen. Jährlich treten bei etwa 20.000 Patienten mit kolorektalem Karzinom synchron oder metachron Lungen- oder Lebermetastasen auf. In Deutschland ist bei ca. 4.000 der 20.000 Patienten mit Fernmetastasen eine kurative Metastasenresektion (RO), die mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von ca. 30% einhergeht, technisch möglich.
Bei den übrigen 16.000 Patienten ist aus verschiedensten Gründen (multinodulär, ungünstige Lokalisation an Gefäßen und Gallengängen, extrahepatisch) eine Resektion nicht möglich. In diesen Fällen sind palliative Therapieoptionen indiziert. Ziel der palliativen Behandlung ist neben der Aufrechterhaltung einer guten Lebensqualität die Verlängerung der Überlebenszeit. Derzeit steht eine Vielzahl von Therapieregimen auf der Grundlage von 5-FU/Folinsäure zur Verfügung. Ohne Hinzunahme weiterer Substanzen kann ein Ansprechen von etwa 40% erzielt werden. Die Kombination von 5-FU/Folinsäure mit Mnotecan oder Oxaliplatin führte in mehreren Studien zu einer Verbesserung der Ansprechrate auf bis zu 50% der behandelten Patienten. Darüber hinaus werden derzeit weitere Substanzen bei der palliativen Therapie des kolorektalen Karzinoms überprüft, wie etwa Antikörper gegen VEGR und EGF-R oder sog. "small molecules" gegen die Tyrosinkinase-Domäne von VEGF-R oder EGF-R. Eine endgültige Wertigkeit dieser neuen Substanzen bleibt zunächst weiteren Untersuchungen im Rahmen präklinischer Testung und klinischen Phase I-III Studien vorbehalten. Ein allgemein akzeptiertes Standardregime der Erstbehandlung kann aufgrund der Vielzahl von relevanten Studienergebnissen mit unterschiedlichen Regimen nicht gegeben werden. Das Ansprechen auf die Therapie wird nach WHO Richtlinien (World Health Organization. Handbook for Reporting Results of Cancer Treatment. WHO Offset Publication No. 48. Geneva: WHO 1979) bewertet. Als „Responder" werden Patienten bezeichnet, die in bildgebenden Verfahren eine komplette (CR, complete remission) oder eine partielle (PR, partial remission) Remission aufweisen, als „Non-Responder" diejenigen Patienten, die einen stabilen (SD, stable disease) oder progredienten (PD, progressive disease) Tumorverlauf in der Bildgebung zeigen. Das Ansprechen auf die Chemotherapie korreliert beim kolorektalen Karzinom mit dem Überleben der Patienten. Faktoren, die das Ansprechen auf die Chemotherapie vorhersagen können, werden als prädiktive Marker bezeichnet. Basierend auf prädiktiven Markern könnte eine individualisierte Therapie zur Verfügung gestellt werden. Trotz vielfältiger Untersuchungen auf diesem Gebiet sind die bisher in der Literatur beschriebenen molekularen prädiktiven Marker beim metastasierten kolorektalen Karzinom nicht ausreichend.
Watson (2003) Clin. Sei. 104, 537-545 zeigt in einer Genotypisierungs-Studie, dass Polymorphismen des Apolipoprotein E-Gens das Risiko an einem kolorektalen Karziniom zu erkranken beeinflussen. Laut Untersuchung, haben Personen mit einem ε2/ε2-Genotyp im Unterschied zu dem verbreitet auftretenden ε3/ε3 -Genotyp ein erhöhtes Risiko an einem kolorektalen Karzinom zu erkranken, wobei eine deutliche Geschlechtsspezifität in Bezug auf die Erkrankung bestimmt wird. Sladek (2002) Cancer Chemother. Pharmacol. 49, 309-321 und Sreerama (2001) Cancer Chemother. Pharmacol. 47, 255-362 weisen auf die Möglichkeit hin, durch die Bestimmung des zellulären Expressionsniveaus der Aldehyd-Dehydrogenasen ALDHlAl und ALDH3A1 das Ansprechen von Brustkrebs auf eine cyclophosphamid (oder andere Oxazaphosphorine z.B.: Ifosfamid) -basierte Chemotherapie zu prädizieren. Kemmner (1994) Clin. Exp. Metastasis 12, 245-254 stellt dar, dass in humanen kolorektalen Tumoren die Expression von zwei Sialyltransferasen gegenüber normalem Gewebe erhöht sei, und dass daher eine quantitative Bestimmung der spezifischen Sialyltransferase-Aktivität zur Detektion und Überwachung von Kolonkarzinomen geeignet sein könne. Sotiropoulou (2002) Mol. Med. 8, 42-55 identifiziert ein neues Sialyltransferase-Gen (SIATLl), dessen Expression in humanen Brusttumorgewebe-Zelllinien im Vergleich zu normalen Brustgewebe-Zelllinien herunterreguliert ist. Die anormale Expression und enzymatische Aktivität von Sialyltransferasen in Tumorzellen führt zur Bildung von tumor-assozierten Kohlenhydrat- Antigenen, welche insbesondere in der Immuntherapie eingesetzt werden können. Dolnick (1996) Advan. Enzyme Regul. 36, 165-180 und Dolnick (1996) Cancer Res. 56, 3207-3210 weisen zwei Genprodukte des rThymidylate Synthase-Gens nach, die als rTSα und rTSß bezeichnet werden. In den beiden Zelllinien H630-1 und H630-10, wird eine veränderte Aktivität der Thymidylate Synthase festgestellt. Maxwell (2003) Cancer Res. 63, 4602-4606 zeigt bei 619 Genen mittels DNA-Mikrochip-Technologie eine Veränderung der Genexpression in Zelllinien auf. Die Untersuchungen wurden an MCF-7-Brustkrebszellen, sowie an H630- und H630-R10-Kolonkarzinom-Zelllinien durchgeführt. Ein expressionsaktivierender Effekt von 5-FU und gesteigerte Expression des Spermin/Spermidin Acetyl-Transferase Gens, Annexin II-Gens, des Thymosin ß-10-Gens, des Chaperonin-10 Gens und besonders des MAT-8 Gens werden dargestellt. Biran (1986) Clin. Pathol. 39, 794- 797 misst in einer Studie an 160 Lungenkrebs-Patienten die Konzentration von Serum Amyloid A und weist darauf hin, dass eine aktive Krankheit mit einem hohen Titer im Vergleich zum nicht-aktiven Stadium der Krankheit verknüpft ist. Serienuntersuchungen ergaben eine gute Übereinstimmung zwischen der Veränderung der Serum Amyloid A- Konzentration und dem klinischen Verlauf. Bruno (2003) Clin. Cancer Res. 9, 1077-1082 untersucht 180 Lungenkrebs-Patienten (NSLCL) und stellt dar, dass (X1 -saures Glycoprotein ein Protein zur Vorhersage von Behandlungseffekten in Lungenkrebs-Patienten sei. OΗanlon (2002) Anticancer Res. 22, 1289-1293 weist in einer Studie zu Akute Phase Proteinen die Konzentrationen von C-reaktivem Protein und von Serum Amyloid A in 92 Patienten mit Brustkrebs und 31 Patienten mit gutartiger Brustgewebeveränderung nach. Die Serienuntersuchungen ergaben signifikant erhöhte Konzentrationen der beiden Proteine in Patienten im UICC Stadium IV und insbesondere in T4 ulzerierenden Tumoren. Simpson (1995) Clin. Exp. Immunol. 99, 143-147 behandelte 24 Patienten, die an metastasierenden kolorektal Karzinomen litten mit einer Kombinationstherapie bestehend aus rekombinantem Interleukin 2 (rIL-2), gefolgt von 5-Fluorouracil und Folrnsäure. Der Therapieverlauf wurde durch Messungen der Konzentrationen von C reaktivem Protein, Retinol Bindungsprotein, Alpha 1 -Antitrypsin, Transferrin und Albumin untersucht. Lediglich 7 der 24 Patienten sprachen auf die rIL-2-basierte Therapie an. Glojnaric (2001) Clin. Chem. Lab. Med. 39, 129- 133 bestimmte zu 12 Zeitpunkten (vor der Operation, nach der Operation und vor jedem der 9 nicht näher spezifizierten Chemotherapie Zyklen) bei 67 Patienten mit kolorektalem Karzinom die Konzentrationen von Serum Amyloid A Protein, von C reaktiven Protein, von αrAntichymotrypsin und von o^-saures Glycoprotein. Von den vier untersuchten Akute Phase Proteinen erwies sich das Serum Amyloid A Protein als das mit der höchsten Spezifität und Sensitivität. Der Autor schlägt daher lediglich das Serum Amyloid A Protein als verlässlichen, nicht-spezifischen Tumormarker für kolorektale Karzinome im klinischen Alltag vor. McMillan (2003) Br. J. Surg. 90, 215-219 untersuchte die Veränderung der Konzentration des C reaktiven Proteins in 174 Patienten mit kolorektalem Karzinom vor und nach der Resektion. Der Autor stellte fest, dass die Aussagekraft dieses Parameters gering ist. Koeffler (2003) Clin. Cancer Res. 9, 1-9 beschreibt, dass es unterschiedliche Ansichten über den Zusammenhang des Peroxisome proliferative activated receptor γ (PP ARγ) in Verbindung mit Krebs gibt. Das Gen wird nur durch die Bindung eines Liganden aktiviert. Einige Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass PPARγ als Tumor-Suppressor fungiert, wohingegen andere Forschungsergebnisse aus Mausmodellen dafür sprechen, dass unter bestimmten Bedingungen PPARγ Liganden die Bildung von Krebs fördern. Gupta (2002) Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283, G266-G269 ging der Frage nach, ob eine Aktivierung des Peroxisome proliferative activated receptor γ (PPARγ) das Wachstum von kolorektalen Karzinomen beschleuningt oder verlangsamt, da eine Aktivierung des Peroxisome proliferative activated receptor γ (PPARγ) durch Ligandenbindung die Proliferation von kultivierten kolorektalen Krebszellen oder von kolorektalen Karzinomen im Mausmodell negativ beeinflusst. Mouawad (2002) Melanoma Res. 12, 343-348 bestimmte in 81 Patienten mit metastasierendem, malignen Melanom und 50 normalen Freiwilligen das Expressionsniveau der Caspase-1, um eine Korrelation zwischen diesem, an apoptotischen Prozessen beteiligten Enzym und dem pathologischen Zustand des Patienten herzustellen. Den Patienten wurde Cisplatin, rekombinantes Interleukin-2 und α-Interferon verabreicht. Das durchschnittliche Caspase-1 -Niveau der Melanom-Patienten lag deutlich über dem der Kontrollgruppe. De Vita (1993) Eur. J. Cancer 29, 887-893 beschreibt, dass einige Hox-Gene in primären Kolontumoren und davon abstammenden hepatischen Metastasen ein erhöhtes Expressionsniveau aufweisen, was einen Zusammenhang dieser Gene mit Kolontumorwachstum nahe legt. Kawazoe (2002) Develop. Growth Differ. 44, 77-84 wies durch in situ-Hybridisierungsstudien die Expression verschiedener Hox-Gene zum Zeitpunkt 12,5 Tage postembryonal im Darm der Maus nach. Für die Gene der HoxD-Gene in Bezug auf die Expression im Kolon wiesen sie eine Expression von HoxD-4, HoxD-8 und HoxD-9 nach. Nunes (2003) Pesqui. Odontol. Bras. 17, 94-98 stellte aus der aktuellen Literatur die Ergebnisse zu der These zusammen, dass es viele Zusammenhänge zwischen normaler Entwicklung und Tumorbildung gibt. Cillo (1994-95) Invasion Metastasis 14, 38-49 untersuchte das Expressionsmuster der Hox-Gene in gesunden humanen Organen, in Nieren- und Kolonrumoren, Kleinzelligen Bronchialkarzinomen (SCLC) und metastasierenden Varianten davon. Er kommt zu dem Ergebnis, dass Hox-Gene als ein Netzwerk zur Transkriptionsregulation fungieren und an den Prozessen der Zell-Zell-Kommunikation während der normalen Morphogenese beteiligt sind. Wang (2002) Cancer Letters 179, 71-77 verglich das Expressionsniveau des CASK- und des Reelin-Gens in humanen Magen-, Kolon- und Ösophaguskarzinomen mittels RT-PCR, immunhistochemischen Methoden und per Western Blot. In 87,5 % der untersuchten Ösophaguskarzinome wurde eine erhöhte Expression des CASK- und des Reelin-Gens im Vergleich zu gesundem Ösophagusgewebe festgestellt. In 50 % der Magenkarzinome und 64,3 % der Kolonkarzinome wurde eine Steigerung des CASK-Expressionsniveaus gegenüber normalem Gewebe nachgewiesen, wohingegen der Reelin-Level keine Veränderung aufwies. Der Autor kommt zu dem Ergebnis, dass das CASK-Gen in die Tumorgenese des Ösophagus involviert ist, indem es die Transkription des Reelin-Gens beeinflusst. Dennoch ist die exakte Funktion des CASK- und des Reelin-Gens und deren Interaktion untereinander nach wie vor unklar. Kuno (1997) JBC 272, 556-562 berichtet von ADAMTS-I aus der ADAM Genfamilie. Untersuchungen ergaben, dass die intravenöse Verabreichung von Lipopolysacchariden bei Mäusen die Transkription des ADAMTS-I -Gens selektiv in Niere und Herz aktivierte. Aus den Ergebnissen schlössen die Autoren, dass das ADAMTS-I -Gen an verschiedenen Entzündungsprozessen, sowie an der Ausbildung von Tumorkachexieen beteiligt sei. Iruela- Arispe (2003) Ann. NY Acad. Sei. 995, 183-190 isolierte eine sekretorische Metalloproteinase (METHl /ADAMTSl) und zeigte, dass sie in vitro das Wachstum von Endothelzellen unterbindet und in vivo die, durch Wachstumsfaktoren ausgelöste neovaskuläre Antwort blockiert. Die Autoren fanden Hinweise dafür, dass zwei Domänen des Proteins benötigt werden, um die antiangiogene/ antitumor Aktivität von ADAMTSl auszubilden. Rathnakumar (2000) Indian J. Cancer. 37, 23-26 weist darauf hin, dass eine Vielzahl an biochemischen Tests zur Diagnose von Lebermetastasen vor und nach einer Operation durchgeführt wurden. Durch die kürzlich eingeführten hoch auflösenden bildgebenden Verfahren, wie Computertomographie oder Ultrasonograpliie, hat der Wert dieser biochemischen Methoden jedoch abgenommen. Es wurden verschiedene biochemische Marker zur Identifizierung von Lebermetastasen vorgeschlagen und der Autor spricht sich in seiner Studie für die Bestimmung des 5'-Nukleotidase-Gehalts aus, da er dieses Gen als sensitivsten Marker für Lebermetastasen ansieht. Eroglu (2000) Med. Oncol. 17, 319-324 ist der Auffassung, dass zur Charakterisierung von kolorektalen Tumoren viel Augenmerk auf enzymatische Studien gelegt wurde, jedoch wenig über den Zusammenhang zwischen dem Level von Schlüsselenzymen des Purin-Nukleotid-Signalwegs und einigen klinischen und biologischen Indikatoren der Invasivität und Aggression von Tumor bekannt ist. In seiner Studie hat der Autor den Gehalt der Adenosin Deaminase (ADA) und der 5 '-Nukleotidase (5'-NT) in gesundem und Tumorgewebe von 38 Patienten mit kolorektalen Karzinomen bestimmt. Das Ergebnis der Studie war, dass der Enzym-Gehalt im Primärtumor deutlich über dem normaler Mucosa lag. Galmarini (2002) Brit. J. Haematol. 117, 860-868 untersuchte bei akuter myeloischer Leukämie (AML) den Resistenzmechanismus auf Cytarabin. Er stellte fest, dass die Expression von 5 '-Nukleotidase, hENTl und DNA Polymerase α zum Zeitpunkt der Diagnose die Cytarabin-Resistenz in Patienten mit akuter myeloider Leukämie verursacht. Wiksten (2003) Oncology 64, 245-250 untersuchte die Expression von Tenascin-C im Bindegewebe von 314 Magenkarzinom-Patienten in einer immunhistochemischen Studie. Tenascin-C ist ein hexameres, extrazelluläres Matrix-Glykoprotein, das während der embryonalen Entwicklung und bei proliferativen Prozessen, wie der Wundheilung oder Tumorgenese exprimiert wird. Der Autor fand heraus, dass dem Anschein nach die Tenascin- C-Expression mit der Überlebensrate von Patienten mit Magenkrebs korreliert, aber keine signifikante prognostische Information darstellt. Riedl (1995) Int. J. Cancer 64, 65-69 bestimmte in einer Studie mit 118 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einer Kontrollgruppe von 51 gesunden Personen den Serumgehalt an Tenascin. Es zeigte sich, dass Patienten mit kolorektalen Karzinomen einen signifikant höheren Serumspiegel an Tenascin aufwiesen, als die Kontrollgruppe. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass in Patienten mit Fernmetastasen der Serumspiegel an Tenascin deutlich über dem von Patienten ohne Fernmetastasen lag. Emoto (2001) Cancer 92, 1419-1426 untersuchte in einer Studie die Korrelation der Überexpression von Annexin II und Tenascin-C in kolorektalen Karzinomen. Mit imniunhistochemischen Methoden maß er die Expression beider Gene in 105 primären kolorektalen Tumoren. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl Annexin II, als auch Tenascin-C in fortgeschrittenen kolorektalen Karzinomen überexprimiert werden. Gu (2004) Int. J. Oncol 24, 671-678 ging in einer Studie der Frage nach, ob die Expression von IMP-I, -2 und -3 in Eierstockepithel-Tumoren mit der Überlebensrate der Patienten verknüpft wäre. Dazu wurde mit einem semiquantitativen PCR- Verfahren das Expressionsniveau der IMP-Gene in 59 Eierstockepithel-Karzinomen und 7 normalen Eierstöcken bestimmt. Eine Expression der IMP-Gene wurde in allen untersuchten Tumorgeweben, einschließlich Brust-, Lunge-, Kolon-, Prostata- und Eierstockkrebs, mit Ausnahmen von Pankreaskrebs festgestellt. Riede (1998) Langenbecks Arch. Chir. Suppl. Kongressbd. 115, 299-302 analysierte die Expression und die Regulation der Expression des MUC2-Gens in normalem Kolon-, Kolonkarzinom- und Metastasengewebe. Der Autor stellte fest, dass die MUC2-Expression in Metastasen signifikant niedriger, als in normaler Mucosa und primärem Tumor war und mit dem normalen Metastasierungsprozess scheinbar nicht in Verbindung steht. Manne (2000) Clin. Canc. Res. 6, 4017-4025 untersuchte den prognostischen Wert der Korrelation zwischen der Expression von MUCl- und MUC2-Gen in kolorektalen Adenokarzinomen und der Aggressivität der kolorektalen Adenokarzinome in Bezug auf Unterschiede innerhalb der Bevölkerung. Die Expression von MUCl und MUC2 wurde immunhistochemisch in 166 Proben kolorektaler Adenokarzinome bestimmt, von denen 58 afroamerikanischen und 108 kaukasischen Ursprungs waren. Ein prognostischer Nutzen von MUC2 konnte in dieser Studie weder bei Kaukasieren, noch bei Afroamerikanern festgestellt werden. Akyurek (2002) Pathol. Res. Pract. 198, 665-675 betrachtete eine mögliche Verbindung zwischen MUCl- und MUC2-Expression mit der Überlebensdauer von 143 Magenkarzinom-Patienten. Der Autor fasste seine Studie mit dem Ergebnis zusammen, dass die MUCl -Expression einen brauchbaren prognostischen Faktor zur Vorhersage der Überlebenswahrscheinlichkeit von Magenkarzinom-Patienten darstellt, wohingegen die Rolle der MUC2-Expression unklar bleibt. Baba (2000) Cancer Res. 60, 6886-6889 vertritt die Auffassung, dass die Aktivierung des Ki-Ras-Signalwegs einen Faktor darstellt, der zur Überexpression von Epiregulin in humanen Kolonkrebszellen führt. Außerdem ist er der Meinung, dass Epiregulin eine entscheidende Rolle bei der Tumorgenese in vivo beim Menschen spielt. Dionigi (2000) Am. J. Clin. Pathol. 114, 111-122 untersuchte mittels Immunofärbungen 23 Eierstockmetastasen kolorektaler Primärtumore und 23 primäre Eierstockkarzinome, um Kriterien zur diagnostischen Unterscheidung der beiden Krebsarten zu identifizieren. Bei den Immunofärbungen wurden Antikörper gegen Antigastritisches-Ml -Antigen, CA125, Vimentin, Östrogen- und Progesteron-Rezeptoren, Zytokeratine 7 und 20, Alfa-Inhibin und Kathepsin E eingesetzt. Die Studie ergab, dass sich die Immunreaktion von Zytokeratin 20 und die nicht auftretende Immunreaktion auf das Antigastritische-Ml -Antigen, CA125 und Zytokeratin 7 zur diagnostischen Unterscheidung zwischen Eierstockmetastasen kolorektaler Primärtumore und primärer Eierstockkarzinome eignet. DePrimo (2003) BMC Cancer 3, 3 nutzt in seiner Studie ein Verfahren, um ein Microarray basiertes Tumor-Genprofil aus einer Blutprobe zu erstellen. In seinen Untersuchungen setzt er Monozyten aus dem Blut von 23 Patienten mit fortgeschrittenem kolorektalem Karzinom ein, die sich in einer klinischen Behandlung der Phase III mit SU5416 befanden. Im Verlauf der Studie wurde nach Veränderungen im Expressionsprofü gesucht, die auf die Behandlung mit SU5416 zurückzuführen waren. Der Autor identifizierte 4 Transkripte, die sich zur Klassifizierung der Patienten entsprechend der Behandlungsmethode eignen (CD24, Lactoferrin, Lipocallin 2 und MMP-9), konnte jedoch nicht mit Sicherheit ausschließen, dass die veränderte Expression dieser 4 Gene auch durch die Verabreichungsart oder Begleitmedikamente verursacht wurde. Mariadason (2003) Cancer Res. 63, 8791-8812 erstellte in einer Microarray basierten Studie aus 30 Kolontumor-Zelllinien ein Expressionsprofil von 430 Genen, dass Aussagen bezüglich des Ansprechens des Tumors auf verschiedene Chemotherapeutika zulässt. In Bezug auf das Ansprechen von Kolonkrebs auf eine 5-FU-Therapie fokussiert er seine Auswahl auf 50 Gene.
Der Stand der Technik hat damit bereits Marker für diverse proliferative Erkrankungen bereitgestellt. Problematisch ist dennoch eine verlässliche Diagnostik bereit zu stellen, die zu individuellen Therapien und insbesondere zu höheren Ansprechraten auf Therapeutika führen kann.
Das technische Problem ist durch die Bereitstellung der hierin offenbarten Ausführungsformen und insbesondere durch die die Erfindung charakterisierten Ansprüche gelöst. Die Erfindung umfasst daher ein Verfahren zur
(a) Erkennung eines kolorektalen Karzinoms;
(b) Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms; und/oder
(c) Prädiktion des Ansprechens, insbesondere von Metastasen auf eine 5-FU- haltige Therapie; umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen (SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181) oder einer Auswahl daraus.
Die Erfindung bezieht sich auf die Expressionsprofile bestimmter Gene, die von Bedeutung bei Karzinomen, insbesondere Adenokarzinomen, bevorzugterweise bei gastro-intestinalen Karzinomen und besonders bevorzugt bei primären kolorektalen Karzinomen und daraus abgeleiteten Metastasen, vorzugsweise Lebermetastasen sind. Die Erfindung beinhaltet ebenfalls den Nutzen aus dem Wissen dieser Expression und die Erstellung von Expressionsprofilen zur möglichen Diagnose, Prognose, Prädiktion des Ansprechens auf therapeutische Maßnahmen, insbesondere z.B. einer Chemotherapie und bevorzugt einer 5- FU-haltigen Chemo- und/ oder Kombinationstherapie. Insbesondere für diese Ausführungsform der Erfindung können überraschenderweise auch hierin definierte Marker herangezogen werden, welche in einfachster Weise aus/in Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Blutserum, aber auch z.B. (Bauchhöhlen-)Ascites oder Lymphflüssigkeit, bestimmt werden können. Weiterhin kann die vorgelegte Erfindung dazu dienen, den Therapieverlauf von Karzinomen, inbesondere von primären kolorektalen Karzinomen und daraus abgeleiteten Metastasen, vorzugsweise Lebermetastasen zu beobachten.
Die 120 Gene (Markergene) der Erfindung sind insbesondere in der Tabelle D definiert und werden durch ihre entsprechenden codierende(n) Sequenz(en) dargestellt. Somit sind die entsprechenden, einzelnen (Marker-)Gene teilweise durch mehrere SEQ ID NO charakterisiert. Die einzelnen Sequenzen der definierten 120 Markergene stellen z.B. Varianten, insbesondere Splicevarianten oder Gene hoher Homologie dar.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung bezeichnet der Begriff „kolorektales Karzinom" insbesondere polypoide, plateauförmige, ulzeröse und flächenhafte (szirrhöse) Formen, die histologisch in solide, schleimbildende oder drüsige Adenokarzinome, Siegelringzellenkarzinome, squamöse, adenosquamöse, kribriforme, plattenepithelartige oder undifferenzierte Karzinome entsprechend der WHO-Klassifikation typisiert werden. (Becker, Hohenberger, Junginger, Schlag. Chirurgische Onkologie. Thieme, Stuttgart 2002). Wie oben erwähnt, sind die erfinderischen Verfahren nicht auf kolorektale Karzinome beschränkt.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung betrifft der Begriff „Adenokarzinom" eine Krebsgeschwulst, die von einer epithelialen Zellschicht des drüsigen Anteils einer Schleimhaut ausgeht. Das Adenokarzinom stellt einen eigenen, morphologisch klar umgrenzten Teil der Karzinome dar.
Der Begriff „Erkennung" eines Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms umfasst insbesondere die in vitro Bestimmung eines möglichen (kolorektalen) Karzinoms. Vorzugsweise handelt es sich bei dieser Erkennung um eine Früherkennung. Der Begriff „Früherkennung" im Zusammenhang mit der Erfindung bedeutet, dass ein (kolorektales) Karzinom frühmöglichst in seiner Genese, Entstehung und/ oder Manifestation erkannt werden kann. „Früherkennung" umfasst daher die Detektion von (kolorektalen) Karzinomen in einem frühen Stadium der Erkrankung, in der die Erkrankung noch auf den Tumor beschränkt ist und noch keine Absiedelungen in die Lymphgefäße/Lymphknoten (LO, NO), andere Organe (MO) oder Gefäßeinbrüche (VO) stattgefunden haben, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Diese „Früherkennung" bezieht sich, inter alia, auf die diagnostische Analyse bei Vorsorgeuntersuchungen, als auch in Routineuntersuchungen oder Nachsorgeuntersuchungen, z.B. nach erfolgter Resektion eines bereits verhandenen Primärtumors.
Der Begriff „Prädiktion" bezeichnet im Kontext dieser Erfindung die Bestimmung des biologischen, biomedizinischen Zustande von Gewebe oder einzelnen Zellen, insbesondere bei der Bestimmung ob ein gegebenes Gewebe/ eine gegebene Zelle proliferativ verändert ist. Im Zuge dieser Erfindung wird vorzugsweise bestimmt, ob eine potentielle Metastase, vorzugsweise eine Lebermetastase, tatsächlich eine proliferative Veränderung aufweist und/ oder tatsächlich ein sekundärer Krankheitsherd infolge einer primären proliferativen und/ oder tumorogenen Erkrankung ist. Die primäre proliferative Erkrankung ist im Kontext dieser Erfindung vorzugsweise ein kolorektales Karzinom und der sekundäre Krankheitsherd ist eine Metastase, vorzugsweise eine Lebermetastase. Der Begriff „Prädiktion" im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung des Ansprechens eines Tumors und insbesondere von Metastasen, wiederum bevorzugt Lebermetastasen, auf eine 5-FU (5-Fluorouracil)-haltige Chemo- und/ oder Kombinationstherapie beinhaltet die Bestimmung der möglichen „Responsivität" oder eines „Ansprechens" einer metastatischen Zelle oder eines metastatischen Gewebes auf die Therapie. Somit stellt die „Responsivität" das Auslösen einer die Heilung einer Krankheit oder eines Leidens (in diesem Zusammenhang, einer proliferativen Erkrankung) begünstigenden Reaktion einer einzelnen Zelle, einer Zellpopulation, eines Zellverbandes, eines Gewebes, eines Organs oder eines Organismus dar. Insbesondere umfasst der Begriff „Responsibilität" die Empfindlichkeit einzelner (proliferativ veränderter und/ oder metastatischer) Zellen, einer Zellpopulation oder eines Zellverbandes/ Gewebes auf 5-FU allein oder in Kombination mit weiteren Medikamenten zu reagieren. Der Begriff „Responder" und „Non-Responder" sind dem Fachmann bekannt und wurden bereits oben erläutert. Als „Responder" werden Patienten bewertet, die eine komplette (CR, complete remission) oder eine partielle (PR, partial remission) Remission aufweisen, als „Non- Responder" diejenigen Patienten, die einen stabilen (SD, stable disease) oder progredienten (PD, progressive disease) Tumorverlauf in der Bildgebung zeigen. Das Ansprechen auf die Chemotherapie korreliert beim kolorektalen Karzinom mit dem Überleben der Patienten. Faktoren, die das Ansprechen auf die Therapie vorhersagen könnten, würden im Falle eines „Responders" dazu fuhren, die Therapie zu empfehlen und im Falle eines „Non-Responders" dem Patienten bestehende Therapiealternativen anzubieten.
Eine Rolle spielt hierbei auch der „prognostische Faktor" und der „prädiktive Faktor". Dabei ist der „prognostische Faktor" eine Variable, die einen unabhängigen Einfluss auf den Krankheitsverlauf ausübt. Klinische, pathohistologische und molekulare Prognosefaktoren wurden 2000 vom American Joint Comittee on Cancer Prognostic Factors (AJCC) beim kolorektalen Karzinom bewertet (Compton C. et al, Cancer 88, 1739-57 (2000)). Eindeutige prognostische Relevanz wurde der pT-Kategorie, der pN-Kategorie, der Venen- und Lymphgefäßinvasion, der Resmdaltumor-R-Klassifikation, sowie dem präoperativen CEA Wert zugeschrieben. Die molekularen Marker gelten als bisher noch nicht ausreichend validiert.
Der „prädiktive Faktor" ist eine Variable, die einen unabhängigen Einfluß auf das Ansprechen einer mchtoperativen Therapie ausübt. Auch hier sind molekulare Faktoren für die Prädiktion einer palliativen Chemotherapie beim kolorektalen Karzinom noch nicht ausreichend validiert.
Vorzugsweise wird die proliferativ veränderte (metastatische) Zelle/ der Zellverband aufgrund der 5-FU Therapie absterben und/ oder in ihrer/ seiner Proliferation gestoppt. Eine Kombinationstherapie mit 5-FU umfasst, inter alia, die zusätzliche Verabreichung weiterer Medikamente an den Patienten, vorzugsweise sind dies ebenfalls Krebsmedikamente. Die Medikamente können aber auch z.B. immunstimulierende Medikamente umfassen. Weitere einsetzbare Medikamente in der Krebs- oder Chemotherapie sind Platinum- Verbindungen (wie zum Beispiel Cisplatin oder Oxaliplatin). Auch die weitere Verabreichung von z.B. Folsäure ist eine Kombinationstherapie im Sinne dieser Erfindung. In den Beispielen wird belegt, dass die hier dargestellt Erfindung insbesondere auch in der palliativen Erstlinientherapie nutzbar ist, wobei im konkreten Beispiel 5-FU mit Oxaliplatin eingesetzt wurde. Die 5 -Fluorouracil (5-FU) basierte Chemotherapie stellt die wichtigste Säule der Chemotherapie kolorektaler Karzinome dar. Zur Biomodulation wird in aller Regel Folinsäure hinzugefügt. Früher wurde das 5-FU als Bolus (sog. Mayo-Regime) appliziert, mittlerweile liegen aber Studien vor, die zeigen, dass die Therapie als 24-h Infusion (sog. AIO-Regime) wesentlich verträglicher ist (weniger Diarrhoe, Mucositis und Hand-Fuß- Syndrom auftritt und die Therapie auch mit einem besseren Ansprechen verbunden ist. Andere Therapieoptionen stellen die Therapie mit dem oral verfügbaren 5-FU Derivat Xeloda® dar (das ohne Folinsäure appliziert wird) oder die Kombinationstherapie mit z.B. Folinsäure, Irinotecan, Cisplatin oder Oxaliplatin. Weitere Kombinationen, die derzeit in Phase I- III Studien überprüft werden sind 5-FU haltige Schemata in Kombination mit z.B. Cetuximab, Erlotinib, Bevacizumab oder Vatalanib.
Der Begriff „Metastasen" umfasst im Zusammenhang mit dem oben genannten Verfahren zur Prädiktion/ Bestimmung des Ansprechens auf eine Therapie, bevorzugt auf eine 5-FU-haltige Chemo- und/ oder Kombinationstherapie, „gestreuten (Tumor-)Zellen" im befallenen Patientenkörper. Insbesondere umfasst der Begriff „Metastasen" erfindungsgemäß Leber-, Lungen-, Hirn-, Knochen- und/oder Peritoneal- Metastasen und besonders Lebermetastasen.
Im Zusammenhang mit der Erfindung umfasst der Begriff „Genexpressionsprofil" sowohl die Bestimmung von „Expressionsprofilen", als auch „Expressionslevels" oder „Expressionsniveaus" der entsprechenden Gene. Der Begriff „Expressionsniveau", als auch der Begriff „Expressionsprofil" umfasst erfindungsgemäß sowohl die Quantität des Expressionsprodukts, als auch die Qualität des Expressionsprodukts, wie z.B. Produkte alternativer Splicevorgänge, Methylierungen, Glykosylierungen, Phosphorylierungen, etc. Somit wird bei der Bestimmung des „Expressionsprofils" im Zusammenhang mit der Erfindung im wesentlichen auf die Quantität der entsprechenden Genprodukte (RNA/ Protein) geachtet. Beim Expressionsniveau wird ebenfalls die Quantität beachtet, jedoch gegebenenfalls in Vergleich zu anderen Geweben oder Geweben und Zellen von anderen (vorzugsweise gesunden) Individuen gestellt. Gegebenenfalls werden auch Modifikationen im Genprodukt (wie z.B. Mutationen) im Vergleich zu anderen Geweben bestimmt. Entsprechende Ausführungsbeispiele sind im experimentellen Teil belegt und auch insbesondere in den Tabellen, vorzugsweise in den Tabellen A, B, C dargestellt.
In einer besonderen Ausfuhrungsform umfasst die Erfindung das oben genannte Verfahren, wobei das Expressionsprofil von mindestens zwei der 120 Markergene, wie in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ED NO: 181 dargestellt, bestimmt wird. Wie oben erwähnt, sind die 120 Markergene auch durch Varianten definiert, die wiederum in der Tabelle D dargestellt sind. Vorzugsweise wird dieses Expressionsprofil mit dem Expressionsprofil einer „Referenz" verglichen. Eine Referenz kann zum Beispiel das Expressionsprofil von gesundem Gewebe (z.B. Darmgewebe oder Gewebe der Leber, Lunge etc.) sein. Als „gesundes Gewebe" kann hierbei Gewebe des betroffenen Individuums (Patient) verwendet werden, wobei von diesem Gewebe bekannt ist, dass es nicht proliferativ verändert oder gar metastatisch ist. Entsprechende Beispiele sind im experimentellen Teil der Erfindung dargestellt. Allerdings können als „Referenz" oder „Referenzwert" auch Daten von Geweben von fremden Individuen, vorzugsweise (Gesunden) herangezogen werden.
Die Bestimmung der Expressionsprofile wird insbesondere in Geweben und/oder einzelnen Zellen des Gewebes durchgeführt. Einzelzellanalysen sind im Stand der Technik bekannt und umfassen auch DNA- oder RNA-Bestimmungen; siehe, inter alia, die Bestimmung einzelner Kopien einzelner Gene, wie dargestellt in Klein (1999) PNAS 96, 4494- 4499 oder die Bestimmung von genomischen Unausgewogenheiten („genomic imbalances"), wie z.B. beschrieben in Solinas-Toldo (1997) Genes, Chromosomes, Cancer 20, 399- 407. Auch sind zur Bestimmung des Expressionsprofils der hierin dargestellten Gene (Genabschnitte) Techniken wie in situ-Hybridisierungen, Bestimmung der Kopienanzahl einzelner Gene (DNA copy number) durch komparative genomische Hybridisierung möglich. Weitere Verfahren zur Bestimmung des Expressionsprofils umfassen daher (im Sinne dieser Erfindimg) die Bestimmung mittels PCR-Methodik und die Verwendung von Biochips (siehe auch experimentellen Teil der Erfindung). Wie im experimentellen Teil belegt, umfasst die Bestimmung des „Expressionsprofils" bzw. des „Expressionsniveaus" insbesondere die quantitative, gegebenenfalls vergleichende Bestimmung der Genexpressionsprodukte, insbesondere von RNA (aber auch von Proteinen) Ebenfalls zur Bestimmung des Expressionsprofils der hierin offenbarten Gene (oder Genabschnitte) können folgende Verfahren herangezogen werden: Immunodetektion des Proteinosen Genprodukts (z.B. Westernblot, ELISA-Techniken oder Immunodetektion mit mikroskopischer Analyse); biochemische Bestimmungen des Expressionsprodukts (z.B. hnmunopräzipitationen, Enzymtests). Im Zuge dieser Erfindung werden vorzugsweise nicht ausschließlich alle hier genannten Gene untersucht, jedoch werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn zumindest 80, vorzugsweise mindestens 70, mehr bevorzugt mindestens 60, mehr bevorzugt mindestens 50, mehr bevorzugt mindestens 40, mehr bevorzugt mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 30, mehr bevorzugt mindestens 20, mehr bevorzugt mindestens 15, mehr bevorzugt mindestens 10, mehr bevorzugt mindestens 10, mehr bevorzugt mindestens 5, mehr bevorzugt drei, mehr bevorzugt mindestens zwei Gene, beziehungsweise deren Expressionsprofil, oder Expressionsniveau, bestimmt wird. Der Fachmann kann durchaus die technische Lehre dieser Erfindung mit der Bestimmung anderer Parameter, insbesondere anderer Marker, Markergene kombinieren, um gegebenenfalls weitere diagnostische Aussagen treffen zu können. Zum Beispiel können weitere Tumormarker und/oder Metastasemarker bestimmt werden. Diese weiteren Tumormarker sind der Fachwelt bekannt. Tumormarker sind zum Beispiel p53, oc- fetoprotein, CEA (carcino-embryonales Antigen). CEA ist ein Standardtumorrnarker zur Einschätzung von Dickdarmtumoren. Wie oben erwähnt, werden klinische, pathohistologische und molekulare Prognosefaktoren vom American Joint Comittee on Cancer Diagnostic Factors (Compton (2000), loc. cit.) beschrieben und vorgeschlagen.
Wie unten dargelegt wird, sollen erfindungsgemäß im Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms mindestens drei, vorzugsweise jedoch mindestens zwei der hier dargestellten Markergene (ausgewählt aus der Gruppe der 120 Gene/ Genabschnitte, wie in den SEQ ID NOs: 1 bis 181 gezeigt) bestimmt werden. Weitere Ausführungsformen sind dem experimentellen Teil zu entnehmen.
Das vorher in Unterpunkt (a) erwähnte Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms kann insbesondere die Auswahl und Bestimmung des Expressionsprofils von mindestens einem, bevorzugt mindestens zwei und am meisten bevorzugt von mindestens drei Genen der 120 Markergene, wie gezeigt in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 umfassen, wobei das Expressionsprofil der Gene mit dem durchschnittlichen Expressionsprofil aus normaler Darmmucosa verglichen wird. Wie bereits oben erwähnt kann die normale Darrnmucosa vom Patienten stammen oder aber auch von anderen Individuen.
hi den folgenden Ausführungsformen werden bevorzugt Gene dargestellt, die im erfinderischen Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms herangezogen werden können.
Somit umfasst das Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms insbesondere die Bestimmung des Genexpressionsprofils von mindestens zwei Genen, wobei mindestens eines der beiden Gene (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 120) aus den „Minimal sets" oder „Subsets", wie im folgenden definiert, verwendet wird. Diese „Minimal sets" umfassen vorzugsweise die entsprechend benannten und ausgewählten 72, 55, 33, 18, 17 oder 3 Gene. Aus den hierin definierten „Minimalsets"/Genpanels/„Subsets" können erfindungsgemäß einzelne Gene/Genexpressionsprofile bestimmt werden, um in vitro ein Karzinom, vorzugsweise ein kolorektales Karzinom zu erkennen. Weitere Details sind auch dem experimentellen Teil und den Tabellen zu entnehmen. Wie hier überraschenderweise gefunden, umfasst zum Beispiel ein besonders bevorzugtse „Minimal set" zur Bestimmung/Prädikation eines kolorektalen Karzinoms die 3 Markergene, wie in den SEQ ID NOS: 25, 41 und 68 charakterisiert. Varianten dieser 3 Markergene sind in den SEQ ID NOS: 136 bis 138 dargestellt.
In dieser als auch den folgenden Ausführungsformen ist für den Fachmann verständlich, dass es sich hierbei um bevorzugte Ausfuhrungsformen handelt. Der Fachmann wird ebenfalls nur einzelne Gene, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens 3 Gene (beziehungsweise deren Genexpressionsprofile/ Genexpressionsniveaus) erfindungsgemäß bestimmen. Er wird dabei auch auf eine Auswahl der verschiedenen, hier dargestellten „Minimal sets" zurück greifen/ zurück greifen können.
In einer bevorzugten Ausführungsform des die Erfindung umfassenden Verfahrens zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms wird eine Auswahl der Markergene des Expressionsprofils von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, vorzugsweise mindestens 3 Genen, der 72 Markergene, die in den SEQ TD NO: 1 bis SEQ ID NO: 72 oder SEQ ID NO: 121 bis SEQ ID NO: 156 dargestellt sind, getroffen und ausgewertet. Wiederum kann z.B. (und bevorzugt) das Expressionsprofil dieser 72 Gene (oder einer Auswahl davon) im zu testenden Gewebe bestimmt und mit gesundem Gewebe verglichen werden. Entsprechende Ausführungsformen und Gewebe-Details können dem experimentellen Teil entnommen werden.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, mehr bevorzugt von mindestens drei Genen von 55 Markergenen bestimmt wird. Diese 55 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 und SEQ ID NO: 73 bis SEQ ID NO: 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 bis 181 dargestellt.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, mehr bevorzugt von mindestens drei Genen der 33 Markergene bestimmt wird. Diese 33 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115 und 118 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 124, 136 bis 140, 157, 159 bis 162, 170, 171, 172, 174 und 177 bis 180 dargestellt.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, mehr bevorzugt von mindestens drei Genen der 18 Markergene bestimmt wird. Diese 18 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68 und 70 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 124 und 136 bis 140 dargestellt. Eine andere, aber auch erfindungsgemäße Auswahl der mindestens 18 Gene umfasst in dieser Ausruhrungsform die Bestimmung mindestens eines Gens, vorzugsweise mindestens von zwei, mehr bevorzugt von mindestens drei Genen der 18 Markergene, welche die Gene, wie in den SEQ ID NOs: 25, 41, 68, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115 oder 118 dargestellt, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136 bis 138, 157, 159 bis 162, 170 bis 172, 174 und 177 bis 180 dargestellt.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform im Sinne der Erfindung, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Erkennung eines (kolorektalen) Karzinoms, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt alle drei der 3 Markergene bestimmt wird/werden. Diese 3 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 25, 41 und 68 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136 bis 138 dargestellt und umfassen ebenfalls weitere Varianten und Homologe dieser Gene.
Wie unten definiert, umfasst der Begriff „Markergene" im Sinne dieser Erfindung nicht nur die spezifischen Gensequenzen (oder die entsprechenden Genprodukte) wie in den spezifischen Nucleotidsequenzen dargestellt, sondern auch Gensequenzen, die homolog, vorzugsweise hochhomolog zu diesen Sequenzen sind. „Hochhomologe Sequenzen" umfassen Sequenzen, die mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, am meisten bevorzugt mindestens 95% homolog zu den in den SEQ ID NOS: 1 bis 181 dargestellten Sequenzen sind. Im Kontext dieser Erfindung umfassen „hochhomologe Sequenzen" auch Sequenzen, die Genprodukte (z.B. RNA oder Proteine) codieren, welche zumindest 80% identisch zu den definierten Genprodukten der SEQ ID NOS: 1 bis 181 sind.
Die Sequenzidentität kann konventionell durch Verwendung von Computerprogrammen wie z. B. das Bestfit-Programm (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive Madison, WI 53711) bestimmt werden. Bestfit nützt den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Advances in Applied Mathematics 2 (1981), 482-489, um das Segment mit höchster Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen zu finden. Bei der Anwendung von Bestfit oder einem anderen Sequenz-Alignment-Programm zur Bestimmung, ob eine bestimmte Sequenz beispielsweise zu 95% identisch ist mit einer Referenzsequenz der vorliegenden Erfindung, werden die Parameter vorzugsweise so eingestellt, daß der Prozentanteil der Identität über die gesamte Länge der Referenzsequenz berechnet wird und daß Homologielücken ("gaps") von bis zu 5% der Gesamtzahl der Nukleotide in der Referenzsequenz erlaubt sind. Bei der Verwendung von Bestfit werden die sogenannten optionalen Parameter vorzugsweise bei ihren voreingestellten ("default") Werten belassen. Die Abweichungen, die bei dem Vergleich einer gegebenen Sequenz mit den oben beschriebenen Sequenzen der Erfindung auftreten, können beispielsweise durch Addition, Deletion, Substitution, Insertion oder Rekombination verursacht sein. Vorzugsweise kann ein derartiger Sequenzvergleich auch mit dem Programm DNASIS (Version 6.0, Hitachi Software Engineering Co. Ltd., 1984, 1990) durchgeführt werden. Hierbei sollten ebenfalls die "default" -Parametereinstellungen (Cut off Score: 16, Ktup: 6) verwendet werden.
Die Daten des experimentellen Teiles zeigen, dass durch die Bestimmung von mindestens einem, vorzugsweise von zwei oder am meisten bevorzugt von drei Markergenen wie über die Tabelle D auch SEQ ID NOS: 25, 41 und 68 definiert (und ebenfalls durch die Varianten wie in den SEQ ID NOS: 136 bis 138 dargestellt) eine klare Bestimmung von kolorektal Karzinomen vorgenommen werden kann; siehe auch Beispiel 1 bis 3 und 17.
Das bereits in Unterpunkt (b) erwähnte Verfahren zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, kann insbesondere die Auswahl und Bestimmung des Expressionsprofils von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens zwei Genen von den hier offenbarten 120 Markergenen umfassen, wobei diese Gene über SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 definiert sind und wobei das Expressionsprofil der Gene, gewonnen aus potentiellen metastatischen Zellen oder Gewebe, vorzugsweise in Leberzellen oder Lebergewebe, mit dem Expressionsprofil gewonnen aus primären kolorektalen Tumorzellen oder -gewebe verglichen wird. Die Proben zur Gewinnung der beiden Expressionsprofile können vom gleichen Patienten stammen, aber auch von unterschiedlichen Patienten. In den folgenden Ausführungsformen werden bevorzugt Gene dargestellt, die im erfinderischen Verfahren zur Prädiktion von Metastasen, vorzugsweise von Lebermetastasen, in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, herangezogen werden können. Somit umfasst das Verfahren insbesondere die Bestimmung des Genexpressionsprofils von mindestens einem, vorzugsweise mindestens von zwei Genen, wobei mindestens eines der beiden Gene von den 120 Markergenen (wie dargestellt in SEQ ED NOs: 1 bis 181) aus den „Minimal sets", wie im folgenden definiert, verwendet wird. Diese „Minimal sets" umfassen, inter alia und bevorzugt, die im Zusammenhang mit dieser Ausfuhrungsform benannten 72, 55, 22, 20 oder 2 Gene. Wie auch bei den anderen Ausführungsformen können aber auch andere „Minimal Sets"/„Subsets" bzw. Genpanels zusammengestellt werden, wobei die hier benannten bevorzugt sind. Wie in den Tabellen 2 und 3 zu entnehmen, sind bei der Bestimmung der Expressionsdaten nicht alle 120 Gene absolut rein indikativ (mit „none" gekennzeichnet) sind. Diese Gene, bzw. deren Expressionsprofil kann jedoch ebenfalls erfindungsgemäß bestimmt werden und die entsprechenden Ergebnisse können, inter alia, als interne Kontrollen dienen. Weitere Details sind auch dem experimentellen Teil, als auch den Tabellen (Tabellen 2 und 3) zu entnehmen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform des die Erfindung umfassenden Verfahrens zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, vorzugsweise von Lebermetastasen, wird eine Auswahl der Markergene des Expressionsprofils von mindestens einem Gen der in Tabelle 2 definierten 72 Markergene, die auch in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 72 oder SEQ ED NO: 121 bis SEQ ED NO: 156 dargestellt sind, getroffen und ausgewertet. Wiederum kann z.B. (und bevorzugt) das Expressionsprofil dieser 72 Gene aus potentiell metastatischen Zellen oder Gewebe, vorzugsweise Leberzellen oder Lebergewebe gewonnen werden und mit dem Expressionsprofil aus primären kolorektalen Tumorzellen oder -gewebe verglichen werden.
En einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, vorzugsweise der Prädiktion von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der in Tabelle 3 definierten 55 Markergene bestimmt wird. Diese 55 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 und SEQ ED NO: 73 bis SEQ ED NO: 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 bis 181 dargestellt. In dieser, als auch den folgenden Ausführungsformen ist für den Fachmann verständlich, dass es sich hierbei um bevorzugte Ausführungsformen handelt. Der Fachmann wird ebenfalls nur einzelne Gene, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens 3 Gene (beziehungsweise deren Genexpressionsprofile/ Genexpressionsniveaus) erfindungsgemäß bestimmen. Er wird dabei auch auf eine Auswahl der verschiedenen, hier dargestellten „Minimal sets" oder Genpanels zurück greifen/ zurück greifen können, wobei diese „Minimalsets" bereits eine Auswahl der erfmdungsgemässen 120 Markergene darstellen. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, vorzugsweise der Prädiktion von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens 2, mehr bevorzugt mindestens 3, mehr bevorzugt mindestens 5 der auch in Tabelle C definierten 22 Markergene bestimmt wird/werden. Diese 22 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71, 72, 74 und 109 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 125, 133, 134, 135, 151, 152, 156 und 177 dargestellt.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären Karzinoms, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, vorzugsweise der Prädiktion von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens zwei Gene, mehr bevorzugt mindestens drei Gene, mehr bevorzugt mindestens 5 Gene der 20 Markergene bestimmt wird. Diese 20 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71 und 72 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 125, 133, 134, 135, 151, 152 und 156 dargestellt.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform im Sinne der Erfindung, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären (kolorektalen) Karzinoms, vorzugsweise von Lebermetastasen, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem der zwei Markergene, wie in den SEQ ID NOs: 74 und 109 dargestellt, bestimmt wird. Die Prädiktion von Metastasen eines primären kolorektalen Karzinoms ist für den Kliniker von besonderer Relevanz, da es die weitere Behandlung des Patienten entscheidend beeinflussen kann. Finden sich keine Metastasen (weder Lymphknotenmetastasen noch Fernmetastasen) handelt es sich um das UICC Stadium I oder II. Diese Tumore werden, wenn es Kolonkarzinome sind, ausschließlich mittels Operation behandelt. Eine weitere, adjuvante Chemotherapie ist (außerhalb klinischer Studien) nicht vorgesehen. Finden sich dagegen Lymphknotenmetastasen (UICC Stadium III), so wird gemäß den Leitlinien der Deutschen Krebsgesellschaft und anderer internationaler Gesellschaften eine postoperative adjuvante Chemotherapie gefordert. Durch die ajduvante Chemotherapie ergibt sich ein krankheitsfreies 3 Jahres Überleben der Patienten von etwa 80%, ohne anschließende Chemotherapie liegt das 3 Jahres Überleben nur bei etwa 60%. Auch das Gesamtüberleben wird durch die adjuvanten Chemotherapie signifikant beeinfmsst. Beim Rektumkarzinom ist es ebenfalls von entscheidender Bedeutung, ob bereits Lymphknotenmetastasen vorliegen. In diesen Fällen wird die präoperative Radiochemotherapie empfohlen, da sie das Auftreten von Lokalrezidiven im Rektum signifikant vermindert. Zudem können durch eine präoperative Radiochemotherapie signifikant mehr Patienten kontinenzerhaltend operiert werden, was bei diesen Patienten zu einer wesentlichen Verbesserung der postoperativen Lebensqualität beiträgt.
Liegen bei einem kolorektalen Karzinom bereits Fernmetastasen vor (UICC Stadium IV), so sollte nach kurativer Operation des Primärtumors eine palliative Chemotherapie erfolgen, um das Überleben der Patienten zu verlängern. Durch die palliative Therapie können außerdem bis zu 15% der Patienten, die bezüglich der Fernmetastasen als nicht operabel galten, sekundär kurativ operiert werden und haben ein 5-Jahres Gesamtüberleben von etwa 30%. Die üblichen, in der Diagnostik und Therapieplanung von kolorektalen Karzinomen eingesetzten bildgebenden Verfahren (z.B. Computertomografie (CT), Magnet Resonanz - Tomografie (MRT), Positronen-Emissions Tomografie (PET) oder präoperative Endosnografie bei Rektumkarzinomen) sind häufig nicht in der Lage, kleine Ansammlungen von Tumorzellen (sog. Mikrometastasen) in Lymphknoten oder in anderen Organen zu detektieren. Daher wird das eigentliche Tumorstadium oftmals als zu gering eingeschätzt und eine möglicherweise notwendige adjuvante oder palliative Therapie nicht verabreicht. Daher ist die molekulare Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms, also das Vorhersagen bereits vom Primärtumor abgesiedelter einzelner Tumorzellen und von klinisch noch nicht manifestierten Metastasen an entfernten Körperregionen, meist Lymphknoten und Leber, wie in der Erfindung offenbart, von besonderer klinischer Relevanz, weil sie zu Therapieentscheidungen führt, die für Patienten mit kolorektalen Karzinomen lebensverlängernd und Lebensqualität verbessernd sein können. Überraschenderweise eignen sich die in dieser Erfindung offenbarten Marker auch zur frühen Detektion von Metastasen und deren Vorläufern. Zudem ist eine bevorzugte Ausführungsform als Messung von Proteinen bzw. Proteinfragmenten und Peptiden, der translatierten Gensequenzen der 120 Gene, im Serum oder Plasma durch einfache Blutabnahme in den Rahmen der üblichen Standarddiagnostik leicht integrierbar und erfordert keine zusätzlichen, invasiven Eingriffe bei gleichzeitig zusätzlicher Aussagekraft bezüglich des Therapiemanagements. Dies unterstreicht die technische und diagnostische Überlegenheit der in dieser hier offenbarten in vitro Verfahren und der entsprechenden diagnostischen Kits gegenüber den bisher üblichen Standardverfahren.
Das zuvor in Unterpunkt (c) genannte Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens auf eine Therapie, insbesondere das Ansprechen von Metastasen auf eine 5-FU-haltige Chemo- oder Kombinationstherapie, kann insbesondere die Auswahl und Bestimmung des Expressionsprofils von mindestens einem, vorzugsweise mindestens zwei Genen, mehr bevorzugt mindestens drei Genen aus der Gruppe der hier offenbarten 120 Markergene umfassen, wobei diese Gene über die SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 definiert sind und wobei das Expressionsprofil der Gene, gewonnen aus Tumor- oder Metastasenproben, vorzugsweise Metastasenproben von Patienten, die auf eine Therapie ansprechen mit dem Expressionsprofil aus Metastasenproben von Patienten, die nicht auf eine Therapie ansprechen verglichen wird. Die entsprechende Therapie ist eine 5-FU-haltige Chemotherapie und/oder eine 5-FU-haltige Kombinationstherapie.
Jedoch können die entsprechenden Markergene nicht nur in Tumor- und/oder Metastasenproben, sondern auch in anderen biologischen Proben, wie z.B. Blut oder Blutserum bestimmt werden. Wie unten weiter ausgeführt, können z.B. „Akute Phase"- Marker/„Akute Phase" Proteine/„Akute Phase" Gene im Blut/Blutserum (oder gegebenenfalls anderen Körperflüssigkeiten, wie Bauchhöhlen-Ascites oder Lymphflüssigkeit) bestimmt werden, um „Responder" von „Non-Respondern" zu unterscheiden. In den folgenden Ausfuhrungsformen werden bevorzugt Gene dargestellt, die im erfinderischen Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie herangezogen werden können. Somit umfasst das Verfahren insbesondere die Bestimmung des Genexpressionsprofils von mindestens einem, bevorzugt mindestens zwei Gene, wobei mindestens eines der beiden Gene von den 120 Markergenen (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181) aus den „Minimal sets", wie im folgenden definiert, verwendet wird. Diese „Minimal sets" umfassen, inter alia und bevorzugt, die benannten 72, 55, 34, 28 oder 7 Gene. Jedoch können ebenfalls, je nach Bedürfnis, auch andere „Minimal sets'VGenpanel ausgewählt aus den 120 hier dargestellten Markergenen zusammengestellt werden, welche zur Bestimmung von „Respondern" und/oder „Non-Respondern" führt. Zum Beispiel kann, bevorzugterweise, ein „Minimal set'VSubset/Genpanel der hierin definierten 120 Markergene ausgewählt werden, deren Bestimmung in biologischen Flüssigkeiten, Proben (wie zum Beispiel und insbesondere Blut/Blutserum oder auch lymphatische Flüssigkeit) vereinfacht ist. Ein solches „Minimal set'VSubset umfasst, z. B. die hierin offenbarten „Akute Phase Proteine/Gene".
Daher umfasst die Erfindung, in einer Ausfuhrungsform die Bestimmung und/oder Prädikation, Differenzierung von „Respondern"/„Non-Respondern" auf eine 5-FU-haltige Chemo- und/oder Kombinationstherapie die Bestimmung von Serummarkern. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung zur Differenzierung von Respondern und Non-Respondern auf eine 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie eignet sich die Bestimmung von Serummarkern aus dem Blut oder anderer Körperflüssigkeiten sowie Stuhl der Patienten, insbesondere vor Chemotherapie. Hier sind insbesondere die sog. Akute-Phase Proteine zu nennen, die bereits im klinischen Alltag zur Verlaufsbeobachtung bei Entzündungen unter antibiotischer Therapie eingesetzt werden und sich auf Infektionsstationen als robuste und valide Parameter erwiesen haben. Überraschenderweise eignen sich diese Marker auch zur Prädiktion des Ansprechens von Primärtumoren und Metastasen auf Chemotherapie. Bei den Genen, der zugrunde liegenden Akute Phase Proteine - die auch in Tabelle 1 aufgeführt sind - handelt es sich um: Complement component 1, q subcomponent, beta Polypeptide [Affymetrix Nummer202953_at], SEQ ID Nummer 4; Apolipoprotein E [Affymetrix Nummer 203382_s_at], SEQ ID Nummer 6; Apolipoprotein C- I [Affymetrix Nummer204416_x_at], SEQ ID Nummer 13; Koagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix Nummer204714_s_at], SEQ ID Nummer 18; Fibrinogen, B beta Polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Apolipoprotein B (including Ag(x) antigen) [Affymetrix Nummer 205108_s_at], SEQ ID Nummer 23; Fibrinogen, A alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Serum amyloid A2 [Affymetrix Nummer 214456_x_at], SEQ ID Nummer 60; Orosomucoid 2 [Affymetrix Nummer 214465_at], SEQ DD Nummer 61; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Complement component 1, q subcomponent, alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 218232_at], SEQ ID Nummer 67; Fibrinogen, gamma Polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71. Die oben genannten Gene/Genprodukte stellen somit ein anderes „Minimal Set'VGenpanel oder „Subset" der Erfindung dar. Vorzugsweise wird das Expressionsprofil von mindestens einem, mehr bevorzugt von mindestens 3, mehr bevorzugt von mindestens 5, am meisten bevorzugt von mindestens 7 der oben genannten „Akute Phase" Gene (oder Genprodukte) zur Prädiktion von „Respondern" und „Non-Respondern" auf eine 5-FU-haltige Therapie bestimmt. Weitere Details sind auch dem experimentellen Teil und den Tabellen zu entnehmen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des die Erfindung umfassenden Verfahrens zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-FU-haltige Therapie wird eine Auswahl der in Tabelle 1 definierten 72 Markergene des Expressionsprofils, die in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 72 oder SEQ ID NO: 121 bis SEQ ID NO: 156 dargestellt sind, getroffen und ausgewertet. Wiederum kann z.B. (und bevorzugt) das Expressionsprofil der Gene, gewonnen aus Metastasenproben von Patienten, die auf eine Therapie ansprechen mit dem Expressionsprofil aus Metastasenproben von Patienten, die nicht auf eine Therapie ansprechen verglichen werden.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, insbesondere auf eine 5-FU- haltige Chemotherapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen der in Tabelle 4 definierten 55 Markergene bestimmt wird. Diese 55 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68 und SEQ ID NO: 73 bis SEQ ID NO: 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 136, 137, 138, 153, 154, 155, 157 bis 181 dargestellt. In dieser als auch den folgenden Ausführungsformen ist für den Fachmann verständlich, dass es sich hierbei um bevorzugte Ausführungsformen handelt. Der Fachmann wird ebenfalls nur einzelne Gene, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens 3 Gene (beziehungsweise deren Genexpressionsprofile/ Genexpressionsniveaus) erfindungsgemäß bestimmen. Diese Gene können aus verschiedenen hier definierten „Minimal sets" stammen.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem, bevorzugt von mindestens zwei, mehr bevorzugt von mindestens 3, mehr bevorzugt von mindestens 5 Gen(e) der in Tabelle A definierten 34 Markergene bestimmt wird. Diese 34 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 10, 13, 14, 24, 25, 41, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 63, 65, 66, 68, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117 und 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 136 bis 147, 151 bis 155, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181 dargestellt.
In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem, bevorzugt von mindestens zwei, mehr bevorzugt von mindestens 3, mehr bevorzugt von mindestens 5 Gen(e) der in Tabelle A definierten 28 Markergene bestimmt wird. Diese 28 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 13, 24, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 65, 66, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117 und 120 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ID NOs: 122, 139 bis 147, 151, 152, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181 dargestellt.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform im Sinne der Erfindung, umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine Therapie, wobei das Expressionsprofil von mindestens einem Gen, vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens drei der folgenden 7 Markergene bestimmt wird. Diese 7 Gene sind in der Tabelle D insbesondere über die SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63 und 68 definiert, umfassen aber ebenfalls Varianten dieser Gene, wie in SEQ ED NOs: 136, 137, 138, 153, 154 und 155 dargestellt.
Der Begriff „Markergen" im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfasst erfindungsgemäß ein Gen oder einen Genabschnitt, der mindestens zu 60 % homolog, vorzugsweise mindestens 65 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 70 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 75 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 80 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 85 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 90 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 95 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 96 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 97 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 98 % homolog, mehr bevorzugt mindestens 99 % homolog, am meisten bevorzugt mindestens 100 % homolog zu dem in den SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NOs 181 dargestellten Sequenzen in Form von Desoxyribonnukleotiden oder entsprechenden Ribonunkleotiden bzw. den daraus abgeleiteten Proteinen ist. Unter einem aus den 120 Markergenen (definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 181, zum Beispiel in Tabelle D) abgeleiteten Protein wird in dieser Erfindung erfindungsgemäß ein Protein, ein Proteinfragment oder ein Polypeptid verstanden, das im nativen Leserahmen (in frame) translatiert wurde.
Die „Gewinnung eines Expressionsprofils" der Markergene umfasst erfindungsgemäß die Gewinnung des zuvor beschriebenen Expressionsprofils aus einer oder mehrer Proben eines oder mehrerer Individuen.
Bei diesen „Individuen" handelt es sich erfindungsgemäß primär um Menschen, jedoch kann die Erfindung auch bei anderen Säugetieren und besonders bei Affen, Mäusen, Ratten, Schweinen, Pferden, Hunden, Katzen, Hasen, Kaninchen, Hamster und Meerschweinchen angewandt werden. Ferner umfasst der Begriff „Individuum" sowohl kranke, als auch gesunde Vertreter der zuvor genannten Arten.
Unter einer „Probe" wird erfindungsgemäß eine oder mehrere Zellen, Gewebe, ein vollständiges Organ oder ein Teil davon verstanden. Auch Tumorgewebe/Tumorzellen/ Metastasengewebe/Metastasezellen können „Proben" sein. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist die Probe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Operationspräparat, Gewebsbiopsie, Peritoneal-Flüssigkeit, Blut, Serum, Plasma, lymphatische Flüssigkeit, lymphatisches Gewebe, Urin und Stuhl. Wie hier definiert und auch im experimentellen Teil dargestellt kann das hierin dargestellte in vitro Verfahren unter anderem auch an biologischen Flüssigkeiten, wie Blut und/oder Blutserum durchgeführt werden. Die zu analysierenden „Proben" sind nicht auf frisch entnommen Proben beschränkt, sondern die Proben können auch fixiertes oder eingefrorenes Material umfassen.
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung nicht limitiert auf die Untersuchung von Frischmaterial und die erfindungsgemässen Ergebnisse können ebenfalls durch die Untersuchung von fixiertem Material, zum Beispiel Paraffinmaterial, erhalten werden. So gelang auch der Übertrag der hier dargestellten Ergebnisse von kolorektalem Frischgewebe auf kolorektales, paraffϊniertes Gewebe, obgleich die beiden Materialien nicht unwesentliche Unterschiede aufweisen z.B. Primärtumorgewebe statt Metastase-Gewebe, Fixiertes Gewebe statt Frischgewebe, Mischgewebe statt mikrodissoziierte Tumorzellen. Gleichzeitig konnte nachgewissen werden, dass die hier dargestellten Verfahren nicht nur mit Genchips nachzuarebiten sind, sondern dass auch andere Verfahren, wie z.B RT-PCR genutzt werden können. In fixiertem Material wird insbesondere auch vorzugsweise andere Detektionsverfahren zum Nachweis der Gene/Genexpressionsprodukte genutzt, z.B. RNA spezifische Primer und Sonden an Exon-Exon Grenzen innerhalb des Gens statt Sonden gegen den 3 '-Bereich der Gene. In der klinischen Situation ist meist das vorhandenen Untersuchungsmaterials (i.e. FFPE Gewebe des Primärtumors, das aus der Tumorresektion vor Chemotherapie stammte) fixiert. Daher wird der Fachmann erfindugnsgemäss eher diese Nachweisverfahren anwenden. Die Versuche an fixiertem Material bestätigten in eindruckvoller Weise die Validität der hier vorgelegen und definierten (Marker-)Gene und „Minimalsets"/ „Subsets" sowohl in der in vitro Diagnostik von kolorektalen Karzinomen, als die auch (in einem völlig unterschiedlichen exprerimentellen Ansatz) eine Auftrennung von Ansprechern („Respondern") und Nicht-Ansprechern („Nicht-Respondern") auf die 5-FU haltige Therapie. Zudem waren mehrere der untersuchten Prirnärtumore nicht in die ursprüngliche Findung (Frischgewebeproben der Metastasen) eingegangen und können demnach als unabhängige Validierung der Signifikanz der Markergene gelten. Zur Bestätigung der Signifikanz der hier beschriebenen 120 Markergene (und Markergenprodukte) wurde RNA aus zum Teil mehr als 4 Jahre alten Paraffingeweben von Primärtumoren und Metastasen extrahiert und beispielhaft ein Genset von 6 Genen aus den 120 Markergenen wie hierin definiert, analysiert. Unterschiede in der Genexpression zwischen „Respondern" und „Non-Respondern" in der RNA des in Paraffin eingebetteten Tumore (kolorektales Karzinom, Lymphknotenmetastasen, Peritonealkarzinose oder distante Metastasen (z.B. Leber, Lunge) bestätigten sich für die Gene: Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ED Nummer 22; Peroxismoe proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41; Homeo box Di l [Affymetrix Nummer 214604_at], SEQ ID Nummer 62; Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 [Affymetrix Nummer 203837_at], SEQ ID Nummer 81; Spondin 1 (f- spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix Nummer 209436_at], SEQ ID Nummer 98; Homeo box A9 [Affymetrix Nummer 209905_at], SEQ ID Nummer 99. Diese Daten stehen im Einklang mit den Ergebnissen, die mit Frischmaterial gewonnen werden. Entsprechende Verschiebungen der Genexpression im Vergleich von „Respondern" und „Non-Respondern" können inbesondere auch in den Tabellen 1 und 4 abgelesen/bestimmt werden. Beachtlich ist auch hier, dass ein Gen/eine Genexpression, welches/welche im Vergleich zwischen Non- Respondern und Respondern heraufreguliert ist mit „up" markiert wird, während ein Gen/eine Genexpression welches/welche ein Vergleich zwischen Non-Respondern und Respondern herunterreguliert ist mit „down" markiert ist. In der ebenfalls angehängten Tabelle 5 werden ähnliche Daten dargestellt und Daten gegenübergestellt, welche aus einen spezifischen Patienten (Pat. T) stammen. In der Tabelle 5; Spalte 6 wird (im Gegensatz zu den Tabellen 1 und 4) die Veränderung des Experssionsprofils/niveaus bei Respondern (im Vergleich zu Nichtrespondern/Non-Respondern) dargestellt. Somit ist z.B. das
Genprofil/Genexpressionsniveau des mit der SEQ ID NO: 4 gekennzeichneten Gens in der Tabelle 1 mit „up" markiert (Genexpression ist bei „Non-Respondern" höher als bei „Respondern") und in der Tabelle 5 mit „i" bestimmt, da in der Tabelle 5 „Respondern" gegen „Non-Responder" verglichen wird. In der Tabelle 5 wird somit dargestellt, dass das Gen in seinem Expressionsniveau bei „Respondern" niedriger ist als bei „Non-Respondern".
Wie experimentell dargestellt, kann insbesondere in einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung zur Differenzierung von „Respondern" oder „Non-Respondern" einer 5-FU- haltigen Chemotherapie/Kombinationstherapie ein „Minimal set" der hierin definierten 120 Markergene verwendet werden. Ein entsprechendes „Minimal set'VSubset umfasst z.B. die folgenden Gene/Genmarker: Complement component 1, q subcomponent, beta Polypeptide [Affymetrix Nummer202953_at], SEQ ID Nummer 4; Apolipoprotein E [Affymetrix Nummer 203382_s_at], SEQ ID Nummer 6; Apolipoprotein C-I [Affymetrix Nummer204416_x_at], SEQ ID Nummer 13; Koagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix Nummer204714_s_at], SEQ ID Nummer 18; Fibrinogen, B beta Polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Apolipoprotein B (including Ag(x) antigen) [Affymetrix Nummer 205108_s_at], SEQ ID Nummer 23; Fibrinogen, A alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4 A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Serum amyloid A2 [Affymetrix Nummer 214456_x_at], SEQ ID Nummer 60; Orosomucoid 2 [Affymetrix Nummer 214465_at], SEQ ID Nummer 61; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Complement component 1, q subcomponent, alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 218232_at], SEQ ID Nummer 67; Fibrinogen, gamma Polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020__at], SEQ ID Nummer 71.
Der Fachmann wird gegebenenfalls wiederum aus diesem Subset nur einzelne Gene (Genprodukte), vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens drei, mehr bevorzugt mindestens fünf Gene (oder Genprodukte) zur Bestimmung von „Respondern" oder „Non-Respondern" analysieren.
Insbesondere die angehängten Tabellen 1, 4 und 5 geben Auskunft zu den Veränderungen des Expressionsprofϊls einzelner Gene im Vergleich zwischen „Respondern" und „Nicht- Respondern"/„Non-Respodern". Somit kann zum Beispiel für die oben genannten Gene im Vergleich „Responder" versus „Non-Responder" gemäß Tabelle 5 folgende Genexpressionsqualitäten angegeben werden (wobei „down" bedeutet, dass die entsprechende Genexpression bei „Respondern" im Vergleich zu „Non-Respondern" herunterreguliert ist):
- Complement component 1, q subcomponent, beta Polypeptide [Affymetrix Nummer202953_at], SEQ ID Nummer 4: down
- Apolipoprotein E [Affymetrix Nummer 203382_s_at], SEQ ID Nummer 6: down
- Apolipoprotein C-I [Affymetrix Nummer204416_x_at], SEQ DD Nummer 13: down
- Koagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix Nummer204714_s_at], SEQ ID Nummer 18: down
- Fibrinogen, B beta Polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20: down
- Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22: down
- Apolipoprotein B (including Ag(x) antigen) [Affymetrix Nummer 205108_s_at], SEQ ID Nummer 23: down
- Fibrinogen, A alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29: down
- Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30: down
- Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58: down
- Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59: down
- Serum amyloid A2 [Affymetrix Nummer 214456_x_at], SEQ ID Nummer 60: down
- Orosomucoid 2 [Affymetrix Nummer 214465_at], SEQ ID Nummer 61 : down
- Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66: down
- Complement component 1, q subcomponent, alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 218232_at], SEQ ID Nummer 67: down
- Fibrinogen, gamma Polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69: down
- C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrjx Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71: down
Somit sind die Serummarker gemäss Tab. 5 dann indikativ für einen „5-FU Responder", wenn diese, im Gegensatz zu „Nicht-Respondern", herunter-reguliert sind.
Die oben genannten Serummarker sind daher insbesonders geeignet, um durch Untersuchungen von Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut und/oder Blutserum, den Erfolg oder den potentiellen Erfolg einer Therapie, insbesondere einer 5-FU haltigen Chemo- /Kombinationstherapie zu analysieren. Wie oben dargestellt, ist das Genexpessionsprofil (die Genproduktmenge) in Respondern im Vergleich zu Nicht-Respondern herunterreguliert („down"; schwächere Expression), siehe auch Tabelle 5. Im Zusammenhang mit der Tabelle 5 bedeutet „A" eine schwächere Expression des entsprechenden Gens in „Respondern" versus „Non-Respondern". Auch in dieser Ausfuhrungsform gilt, dass der Fachmann nicht sämtliche der hier dargestellten Gene/Genprodukte/Genexpessionen untersuchen muss/wird, sondern er wird ein „Minirnalset'7 „Subset" umfassend mindestens 2, vorzugweise mindestens 3, mehr bevorzugt mindestens 5 der hier dargestellten Markergene zur in vitro Diagnose verwenden.
In allen hier dargestellten in vitro Verfahren werden vom Fachmann erfϊndungsgemäss mindestens 1, vorzugweise mindestens 2, mehr bevorzugt mindestens 3 und noch mehr bevorzugt mindestens 5 der hier dargestellten 120 Markergene auf ihr Expressionsprofil(Experssionlevel untersucht. Ein positiver Befund liegt (Kolonkarzinom, Prädiktion einer Metastase oder das Ansprechen auf eine 5-FU-haltige Chemo- /Kombinationstherapie (insbesondere das Ansprechen einer Metastase) liegt vor, wenn wenigstens 60%, mehr bevorzugt mindestens 70%, mehr bevorzugt 80%, bevorzugt mindestens 90%, mehr bevorzugt mindestens 95%, mehr bevorzugt mindestens 96% und am meisten bevorzugt mindestens 97% der untersuchten Markergene eine Veränderung gegenüber entweder gesundem Gewebe (bei der Bestimmung des Kolonkarzinoms oder einer Metastase) oder gegenüber Probenmaterial von Patienten, die nicht auf eine 5-FU-haltige Therapie reagieren /ansprechen (Prädiktion des Ansprechens von Tumoren/Metastasen eine 5- FU haltige Chemo-/Kombinationstherapie) aufweisen. Entsprechende Daten können auch dem experimentellen Teil und den Tabellen entnommen werden, auf die hiermit Bezug genommen wird. Sollte nur ein (Marker-)Gen der hier dargestellten Auswahl der 120 Markergene untersucht werden, so soll die Veränderung zum Kontrollgewebe/Kontrollmaterial 100% betragen, um einen postiven Befund zu liefern. Jedoch werden, in einen besonders bevorzugten Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung mindestens zwei, vorzugweise mindestens 3, mehr bevorzugt mindestens 5, mehr bevorzugt mindestens Genexpessionsprofüe (und somit Genprodukte der einzelnen Markergene) analysiert. Werden zum Beispiel 5 Gene (bzw. deren Expressionsprofil) aus den 120 hier dargestellten Markergenen untersucht, sollten vorzugsweise 3 dieser 5 Gene (60%), mehr bevorzugt 4 dieser 5 Gene (80%), mehr bevorzugt alle 5 Gene (100%) das gleiche Expressionsprofil wie die entsprechenden Kontrollen (siehe auch die angehängten Tabellen) zeigen, um „positiv" zu sein.
Die angehängte Tabelle 5 zeigt ebenfalls, exemplarisch und nicht limitierend, dass für die hier dargestellten Verfahren nicht nur diagnostische Aussagen getroffen werden können, wenn sämtliche ausgewählten Markergene zu 100% die in den Tabellen dargelegten Veränderungen aufweisen. Zum Beispiel ist der Patient T durchaus als 5-FU „Responder" erfindungsgemäß bestimmt worden, obgleich es bei einzelnen Markergenen zu Abweichungen gegenüber den Genexpressionsprofilen, wie im Standard (siehe Tabelle 5, Spalte 6) kommt. Einzelne, minimal Veränderungen sind in der Tabelle 5 durch Fettdruck markiert.
Wie auch im experimentellen Teil der Erfindung dargestellt, wird das Expressionsprofil der hier offenbarten 120 Markergene (oder einer Auswahl daraus), vorzugsweise, durch die Messung der Quantität an Markergen-mRNA bestimmt. Diese Quantität von Markergen- mRNA kann z.B. mittels Genchiptechnologie, (RT-) PCR (zum Beispiel auch an fixiertem Material), Northern Hybridisierung, Dot-Blotting oder in situ Hybridisierung bestimmt werden. Allerdings kann das erfinderische Verfahren auch durchgeführt werden, indem der Fachmann die Genprodukte (falls vorhanden auf Protein- oder Peptidebene) misst und bestimmt. Somit umfasst die Erfindung die hier beschriebenen Verfahren, bei denen die Genexpressionsprodukte in Form ihrer synthetisierten Proteine (oder Peptide) bestimmt werden. Hierbei kann sowohl die Quantität, als auch die Qualität (z.B. Modifikationen, wie Phosphorylierungen oder Glycosylierungen) bestimmt werden. Vorzugsweise wird in diesem Zusammenhang jedoch das Expressionsprofil der Markergene durch die Messung der Polypeptidquantität der Markergene bestimmt und ,falls gewünscht, mit einem Referenzwert verglichen. Der Referenzwert wurde oben bereits beschrieben und kann von gesundem oder krankem Gewebe stammen. Das Polypeptidlevel, bzw. die Polypeptidquantität der Markergene kann durch ELISA, RIA, (Immuno-) Blotting, FACS oder immunhistochemische Methoden bestimmt werden, insbesondere auch die Bestimmung von Serummarkern (wie hier definiert), kann auch mit protein-biochemischen Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann das Expressionsmuster der hier definierten „Akute Phase Proteine", ausgewählt aus den hierin offenbarten 120 Markergenen, über solche (protern-) biochemischen Verfahren, wie ELISA, RIA, Immunoblotting etc. durchgeführt werden. Wie hier dargestellt, sind solche Verfahren insbesondere bei der Bestimmung von „Respondern" und „Non-Respondern" auf eine Chemo- und/oder Kombinationstherapie, inbesondere einer 5-FU-haltigen Therapie, von Nutzen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) Erstellen des Expressionsprofils, wie oben definiert, in einer Patientenprobe; und (b) Bestimmen mit Hilfe des in (a) erstellten Genexpressionsprofils, ob der Patient an i. einem kolorektalen Karzinom leidet; ii. als Folge eines kolorektalen Karzinoms Lebermetastasen aufweist; und/oder iii. auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie anspricht.
Die oben genannten Ausführungsformen gelten ebenfalls für das hier dargestellte Verfahren. Ebenfalls wird die Erfindung das oben genannten Verfahren bereitstellen, um zu bestimmen, ob der Patient an einem Karzinom, vorzugsweise an einem Adenokarzinom leidet. Auch ist das Verfahren nicht auf die Bestimmung von Lebermetastasen oder auf das Ansprechen der Metastasen auf eine 5-FU-haltige Therapie beschränkt. Das gleiche gilt, mutatis mutandis, für die weiteren erfindungsgemäßen Verfahren.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Kit zur Durchführung der Verfahren die hier beschrieben sind, wobei das Kit spezifische (Nukleotid-) Sonden, Primer (-paare), Antikörper, Aptamere zur Bestimmung von mindestens zwei der 120 Markergene, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 dargestellt sind, oder zur Bestimmung von mindestens zwei Genprodukten der 120 Markergene die von den Markergenen, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 codiert werden, umfasst. Der Kit ist vorzugsweise ein diagnostischer Kit. Als „Kit" im Sinne der Erfindung wird auch ein „Microarray" oder ein „Genchip" bezeichnet.
Somit umfasst die Erfindung ebenfalls die Verwendung eines der 120 Markergene oder eine Gruppe (insbesondere der hierin definierten „Minimal Sets" oder auch einer Auswahl dieser Gene) der 120 Markergene, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 dargestellt wurden, zur Bestimmung, ob der Patient
(a) an einem kolorektalen Karzinom leidet;
(b) als Folge eines kolorektalen Karzinoms Lebermetastasen aufweist; und/oder
(c) auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie anspricht, insbesondere ob die gestreuten Tumorzellen (Metastasen) auf eine solche Therapie ansprechen.
Eine weitere mögliche Anwendung der Erfindung kann in der Herstellung eines transgenen, nicht menschlichen Tieres, vorzugsweise einer transgenen Maus bestehen, die eines oder mehrere der Marker über- oder unterexprimiert. So eine transgene Maus kann dazu dienen, ein Modellsystem für z.B. die Lebermetastasierung beim Menschen darzustellen. Damit könnte der bisher nur teilweise verstandene Prozess der Metastasierung deutlich gemacht werden und neue Erkentnisse über den Metastasierungsweg des kolorektalen Karzinoms oder auch anderer Karzinome gewonnen werden. Darüber hinaus könnte mit Hilfe so einer transgenen Maus therapeutische oder toxische Substanzen getestet werden. Ein ähnliches Prinzip liegt auch den Knock-out Analysen zugrunde, die mit Hilfe der Gene dieser Erfindung durchgeführt werden könnten. Somit kann das erfindungsgemäße Tier auch zu Durchmusterungsverfahren (Screeningverfahren) herangezogen werden.
Daher betrifft die Erfindung auch die Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, das eines oder mehrere der hier definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel. Dieses Durchmusterungsverfahren ist insbesondere für die Durchmusterung von Mitteln in der Krebstherapie, insbesondere in der Behandlung von kolorektalen Karzinomen und/ oder Metastasen, vorzugsweise Lebermetastasen geeignet.
Ebenfalls Teil der Erfindung ist die Verwendung einer transgenen Zelle, die eines oder mehrere der hier definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel. Auch hier werden vorzugsweise Medikamente zur Krebstherapie durchmustert. Somit stellt auch dies vorzugsweise eine Verwendung in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel zur Behandlung von kolorektalen Karzinomen; und/ oder Metastasen, bevorzugt Lebermetastasen, dar.
Wie bereits oben diskutiert, können die Gensequenzen, Oligonukleotide oder andere Fragmente der Markergene dieser Erfindung benutzt werden, um die differentielle Genexpression zu detektieren und zu quantifizieren. Qualitative und quantitative Methoden für solche Messungen sind in der Molekulargenetik gut bekannt. Des weiteren können Antikörper gegen ein Epitop oder ein Protein oder mehrere Epitope oder mehrere Proteine, die für die in dieser Erfindung beschriebenen Gene produziert werden. Diese Antikörper können dazu benutzt werden, um den Proteingehalt in einer menschlichen Zelle zu quantifizieren. Protokolle zur Detektion und zur Quantifizierung der Proteinexpression durch monoklonale oder polyklonale Antikörper sind in der Molekulargenetik gut bekannt. Beispiele sind ELISA, RIA und FACS-Analyse. Die Gensequenzen oder Gen-Fragmente oder komplementäre Nukleinsäuren der Markergene dieser Erfindung können auch in der Gen-Therapie genutzt werden. Beispielsweise kann die cDNA einer oder mehrerer Gene der Erfindung ex vivo in Zielzellen eingeschleusst werden. Nachdem die stabile Integration und Transkription oder Translation sicher gestellt ist, können die Zellen in den Tumor des Patienten zurückgegeben werden und können möglicherweise Mutationen korrigieren, die mit der Unter- oder Überexpression dieses Proteins verbunden sind. Alternativ können die cDNA einer oder mehrerer Gene der Erfindung in vivo eingeschleusst werden, indem Vektoren, wie etwa Retroviren, Adenoviren, HS-Viren oder bakterielle Plasmide benutzt werden. Nicht virale Methoden stellen zudem die Einschleussung kationischer Liposomen, Polylysin-Konjugate oder die direkte Injektion der DNA dar.
Eine weitere mögliche Anwendung der Erfindung ist in der Möglichkeit, die durch die Markergene der Erfindung kodierten Proteine, ihre Liganden oder komplementäre Nukleinsäure-Sequenzen therapeutisch einzusetzen. Insbesondere kann die Kombination verschiedener solcher Medikamente synergistisch auf die Tumorreduktion wirken oder dazu fuhren, dass keine Metastasierung auftritt. Darüber hinaus könnten diese Medikamente auch synergistisch mit bereits etablierten Substanzen in der Therapie des kolorektalen Karzinoms eingesetzt werden.
Die ausgewählten Gene, die die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, werden bevorzugterweise in Form eines „Minimalsets" oder in Form eines „Gen Panels", d.h. einer Sammlung, die die besonderen genetischen Sequenzen und/oder deren Expressionsprodukte der vorliegenden Erfindung umfaßt, verwendet. Die Bildung vom Gen Paneln ermöglicht eine schnelle und spezifische Analyse von spezifischen Aspekten von Krebserkrankungen, insbesondere des Karzinoms, insbesondere eines Adenokarzinoms, bevorzugterweise eines gastrointestinalen Karzinoms und besonders bevorzugt eines kolorektalen Karzinoms, Metastasenbildung insbesondere von Kolontumoren und auch das Ansprechen auf spezifische chemotherapeutische Behandlungsverfahren, insbesodnere auf eine 5-FU haltige Chemo- /Kombinationstherapie. Die Gen Panel, wie in dieser Erfindung beschrieben und verwendet, können mit einer überraschend hohen Effizienz für die Diagnose, Behandlung und Überwachung und auch Analyse einer Prädisposition gegenüber Darmzell-proliferativen Erkrankungen verwendet werden. Insbesondere die hier dargestellten Markergene (oder eines Subsets, Minimalsets davon) können in Form von zu analysierenden Genpanels (Genexpressionspanels) in der in vitro Diagnostik verwendet werden. Zusätzlich ermöglicht die Verwendung einem diversen Array der hier vorgelegten Gene ein relativ hohes Ausmaß an Sensitivität und Spezifität im Vergleich mit Einzelgenanalysen. Von den Genen, deren unterschiedliches Gen(-expressions)profϊl hier beschrieben wird, stellt die besondere Kombination der Gene gemäß der oben beschriebenen und auch in den Ansprüchen charakterisierten Erfindung ein besonders sensitives und spezifisches Mittel zur Identifizierung von proliferativen Zellerkrankungen von Darmgeweben, insbesondere Kolonmucosa oder davon abstammender Metastasen zur Verfügung.
Die wie in dieser Erfindung beschriebenen und verwendeten Gen-Panel können mit überraschend hoher Effizienz für die Behandlung und der Bestimmung des Behandlungsverlaufes von proliferativen Erkrankungen der Darmzellen, insbesondere des Kolons) verwendet werden, durch die Vorhersage des Ausgangs der Behandlung mit einer Therapie, die einen oder mehrere 5-FU haltige Wirkstoffe umfaßt. Die Analyse jedes Gens des Panels trägt zu der Evaluierung der Patienten-Responsivität bei, so kann in einer weniger bevorzugten Ausführungsform die Patientenevaluierung durch die Analyse nur eines Gens erreicht werden. Die Analyse eines einzelnen Mitglieds des 'Genpanels' würde ein billiges, jedoch weniger genaues Mittel der Evaluierung der Patienten-Responsivität zur Verfügung stellen, die Analyse von vielen Mitgliedern des Panels würde ein wirklich teureres Mittel der Durchführung des Verfahrens zur Verfugung stellen, jedoch mit eine höheren Genauigkeit (die technisch bevorzugte Lösung). Das gleiche, gilt, mutatis mutantis, für die Bestimmung eines Karzinoms, insbesondere eines Adenokarzinoms, bevorzugterweise eines gastrointestinalen Karzinoms und besonders bevorzugt eines kolorektalen Karzinoms und der hierin beschriebenen Bestimmung von Metastasen, insbesondere von Lebermetastasen. Daher umfassen die erfindungsgemässen Verfahren in der Regel mindestens die Untersuchung des Expressionsprofils von zwei, vorzugweise mindestens drei, vorzugweise mindestens vier, vorzugweise mindestens fünf, vorzugweise mindestens sechs, vorzugweise mindestens sieben, vorzugweise mindestens acht, vorzugweise mindestens neuen, vorzugweise mindestens zehn, vorzugweise mindestens 15, vorzugweise mindestens 20, vorzugweise mindestens 25, vorzugweise mindestens 30, vorzugweise mindestens 35, vorzugweise mindestens 40, vorzugweise mindestens 45, vorzugweise mindestens 50, vorzugweise mindestens 55, vorzugweise mindestens 60, vorzugweise mindestens 65, vorzugweise mindestens 70, vorzugweise mindestens 75, vorzugweise mindestens 80, vorzugweise mindestens 85, vorzugweise mindestens 90, vorzugweise mindestens 100, vorzugweise mindestens 110 der hierin beschrieben 120 Markergenen.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden für den verbesserten Nachweis, die Behandlung und Überwachung von proliferativen Erkrankungen von Darmzellen, insbesondere der Kolonmucosa, verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen, die nachteilig oder relevant für die Patienten oder Individuen sind, in denen die Genexpression der hier dargestellen 120 Markergene (oder eines Minimalsets davon), mit einem anderen Set von GenexpressionsParametern (z.B. von gesundem Kontrollen oder von 5 -FU Respondern/Nicht-Respondern) verglichen werden können, wobei die Unterschiede als eine Basis für die Diagnose und/oder Prognose von Ereignissen dienen, die für Patienten oder Individuen nachteilig oder relevant sind.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird der Ausdruck "Chemotherapie" als die Verwendung von Wirkstoffen der chemischen Substanzen, insbesondere von 5-FU haltigen Substanzen und Substanzgemischen, zur Behandlung von Krebs und/oder Metastasen bedeutend verstanden.
Im folgenden soll die Erfindung genauer auf der Basis der Sequenzen, Tabellen und Beispiele beschrieben werden, ohne darauf begrenzt zu werden.
Die Tabellen zeigen:
Tabelle 1 enthält die Gene, die in der vorliegenden Erfindung differentiell zwischen
Primärtumor und Lebermetastase exprimiert werden. (Nähere Ausfuhrungen zu Tabelle 1 finden sich in der Beschreibung der Erfindung).
Tabelle 2 enthält die Gene, die in der vorliegenden Erfindung differentiell zwischen
Lebermetastasen von Respondern und Non-Respondern auf eine 5-FU haltige Chemotherapie exprimiert werden. (Nähere Ausführungen zu Tabelle 2 finden sich in der Beschreibung der
Erfindung). Tabelle 3 enthält die Annotationen, Gen-Namen und Affymetrix E) Nr. der in Tabellen 1-3 beschriebenen Gene.
Tabelle 4 Expressionsdaten nach statistischer Auswertung entsprechend Beispiel 4b von
Responder (Resp) versus Non-Responder (Non-Resp) auf eine 5-FU haltige palliative
Chemotherapie
Tabelle 5 Expressionsdaten von Respondern (Resp), Non-Respondern (Nonresp) und Pat. T. von Beispiel 16
Tabelle 6 Expressionsdaten von Kolon/Rektum Muköse (gesund) versus kolorektalem
(Primär-)tumor
Tabelle A Prädiktion des Ansprechens von Lebermetastasen auf eine 5-FU haltige
Chemotherapie durch den Vergleich von Respondern (Resp; n= 10) und Non-Respondern
Tabelle B Früherkennung eines kolorektalen Karzinoms durch den
Vergleich von gesunder Mucosa (Muc; n=3) und kolorektalem Karzinom
Tabelle C Prädiktion von Lebermetastasen durch den
Vergleich von Lebermetastasen (Lm; n= 20) und kolorektalem Karzinom
Tabelle D Kongruenzliste der vergebenen SEQ ID Nos
Die Abbildungen zeigen:
Abbildung 1 zeigt schematisch das methodische Vorgehen, das zur Erstellung eines Genexpressionsprofils mit prädiktiver Bedeutung und damit für die Erfindung notwendig sind. (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung). Abbildung 2 zeigt den Ablauf der statistischen Auswertung durch ein Trainings-Test Set Verfahren. Dabei ist unter A. das Vorgehen gezeigt, wie es unter Beispiel 4a aufgeführt ist, unter B. wird gezeigt, wie unter Beispiel 4b vorgegangen wurde. (Nährere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).
Abbildung 3 zeigt „heat-maps" der Expressionsprofile, die über mathematische Algorithmen die Ähnlichkeit der Signaturen erstellt und eine Aufteilung in Gruppen vornimmt. Figur 3A. zeigt die überwachte (supervised) Clusteranalyse des Trainingssets, Figur 3b die daraufhin durchgeführte Clusteranalyse mit einem vom Trainingsset unabhängigen Test-Set. (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung). Abbildung 4 zeigt die Auswertung der Principal Componant Analyse. Jede Kugel symbolisiert dabei das Genexpressionsprofil aus einem Gewebe (Tumor oder Metastase). Die räumliche Nähe der Kugeln von sowohl Respondern (grün) als Non-Respondern (rotbraun) auf die 5 -FU haltige Chemotherapie und die räumliche Trennung zwischen grünen und rotbraunen Kugeln zeigt die gute Möglichkeit zur Diskriminierung beider Formen des Ansprechens. (Nähre Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung). Abbildung 5 zeigt Computertomografie (CT) Aufnahmen des Pat. T. vor und nach First-line Behandlung mit einer 5-FU haltigen Therapie. Deutlich ist die Größenregredienz der Lebermetastasen (rot umrandet) nach Einleitung der Behandlung zu erkennen. Es handelt sich hier nach WHO Kriterien um eine partielle Remission (PR), also ein Ansprechen auf die Chemotherapie. Dieser Pat. zeigt das Ansprech-Profil auch im Genexpressionsprofil aus der dargestellten Lebermetastase. (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).
Abbildung 6 zeigt eine Kaplan-Meier (Absterbe) Kurve. Dargestellt ist auf der X-Achse die Überlebenszeit in Wochen, auf der Y-Achse das kummulative Überleben bzw. Absterben in %. Stratifiziert wurde nach dem Genexpressionsprofil zwischen Respondern (durchgezogene Linie) und Non-Respondern (gestrichelt). Deutlich ist der Überlebensvorteil der Patienten mit der Response-Signatur zu Erkennen. In der log-rank Analyse ergab sich eine statistische Signifkanz von p=0.030 (Nähere Ausführungen finden sich in den Beispielen zur Erfindung).
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung und schränken sie in keinster Weise ein.
Beispiel 1: Gewinnung des Gewebes und dessen Aufreinigung
Die Gewebeproben der normalen Kolonmucosa, der kolorektalen Karzinome und der korrespondierenden Lebermetastasen wurden intraoperativ gewonnen, sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und anschließend bei -80 0C archiviert. Mittels Kryotom wurden 5 μm dicke Schnitte der Tumorproben hergestellt, die auf Glas-Objektträger aufgezogen und mittels Hämatoxilin-Eosin (HE) gefärbt wurden. Nur solche Tumorproben, die einen mikroskopisch bestimmten Tumorzellanteil von mindestens 80 % aufwiesen wurden für die weitere Bearbeitung ausgewählt. Anschließend wurden mit dem Kryotom 30 μm dicke Schnitte der ausgewählten Tumorproben angefertigt, die auf spezielle Folienobjektträger (Membrane Südes for Laser microdissection; Molecular Machines & Industries AG; CH-8152 Glattbrugg) aufgezogen und umgehend in 70 % Ethanol überführt wurden.
Zur Vorbereitung der Laser-Mikrodissektion schlössen sich folgende Inkubationsschritte an:
1. 30 Sekunden in Mayers Hämalaunlösung
2. spülen in RNase freiem Wasser
3. ca. 30 Sekunden bläuen lassen in RNase freiem Wasser
4. 60 Sekunden in 70% Ethanol waschen
5. 60 Sekunden in 95% Ethanol waschen
6. 30 Sekunden in Eosin Y-Lösung
7. 60 Sekunden in 95 % Ethanol waschen
8. 60 Sekunden in 95 % Ethanol waschen
9. 60 Sekunden in 100 % Ethanol waschen
10. 5 Minuten in 100 % Xylol waschen
11. Schnitte an der Luft trocknen und eventuell mit einem fusselfreien Tuch Xylol- Reste entfernen
Die Tumorzellareale wurden nun mit einem Laser-Mikrodissektionsgerät (LMD) der Firma Leica ausgeschnitten und in ein Reaktionsgefäß überführt. Anschließend wurde die Gesamt-RNA aus den Tumorzellarealen mit einem RNeasy Mini-Kit (Best. -Nr. 74104) der Firma Qiagen nach dem Protokoll des Herstellers isoliert. Entsprechende Protokolle sind beim Hersteller erhältlich bzw. im internet veröffentlicht.
Die Qualität der isolierten Gesamt-RNA wurde mit Hilfe eines Lab-on-a-Chip Gerätes (Firma Agilent) überprüft und nur quantitativ ausreichende Gesamt-RNA (>100 ng) sowie qualitativ hochwertige RNA für die folgenden Arbeitsschritte verwendet.
Beispiel 2: Herstellung und Amplifikation von aRNA aus isolierter Gesamt-RNA
Die Herstellung amino-allyl markierter cRNA (aRNA) aus Gesamt-RNA und deren Amplifikation erfolgte nach der Eberwine-Methode (van Geldern RN et al. (1990); PNAS USA 87: 1663 - 7) und wurde mit dem MessageAmp®-Kit der Firma Ambion nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Entsprechende Protokolle sind beim Hersteller erhältlich bzw. im Internet veröffentlicht. Die markierte cRNA wurde mit dem „RNeasy mini" Kit der Firma Qiagen aufgereinigt und konzentriert. Die dazu notwendigen Arbeitsschritte wurden entsprechend dem Protokoll des Herstellers durchgeführt, das auch im Liternet veröffentlich ist.
Beispiel 3: Benutzung des Affymetrix Genarrayers
Die Sonde die zur Hybridisierung eingesetzt werden sollte, wurde durch Fragmentierung markierter cRNA hergestellt. Anschließend wurden HG U133-A Microarrys der Firma Affymetrix mit dieser Sonde hybridisiert, ungebundene Sonde entfernt und die Rohdaten mit dem GeneArray Scanner der Firma Agilent ausgelesen. Die Arbeitsschritte zur Durchführung der genannten Prozeduren wurden entsprechend der Angaben im Handbuch zur Genexpressionsanalyse (Firma Affymetrix) ausgeführt. Die Signalintensitäten und die Detektionssignale („detection calls") wurden mit Hilfe der GeneChip 5.0 Software der Firma Affymetrix erstellt.
Beispiel 4: Statistische Auswertung der gewonnenen Daten
Die durch den GeneArray Scanner gesammelten Daten in Bezug auf die Hybridisierung der markierten cRNA-Fragmente mit Microarray-Sequenzen wurden anschließend statistisch ausgewertet. Diese Auswertung erfolgte auf zwei Wegen: a) Das Verfahren umfasste die Erstellung eines Traininings-Kollektives und die Überprüfung der gewonnen Daten an einem Test-Kollektiv.
1. Die Datensätze werden mittels Affymetrix® Software „gepublished", d.h. vergleichbar gemacht.
2. Voraus Wertung mittels Affymetrix Data mining tool (average Resp, average Non-Responder, fold-change, T-test Resp. vs. Non-responder p < 0.05. Das Trainings-Kollektiv (n=10) wird dabei zufällig zusammengestellt. 726 Gene sind signifikant differentiell exprimiert.
3. Die Daten werden in Excel übertragen. Anschließend werden die im T- test signifikant unterschiedlich exprimierten Gene weiter reduziert durch Einengung auf Gene, die > 3 -fach unterschiedlich exprimiert werden. Reduktion auf 168 Gene. 4. Die weitere Filterung geschieht durch Einengung auf Gene die einen average Signalwert in mindestens einer Gruppe von > 300 aufweisen. Reduktion auf 82 Gene.
5. Entfernen von doppelt und mehrfach gelisteten Genen auf dem Chip. Reduktion auf 72 Gene.
6. Das Expressionsprofü dieser 72 Gene (auch dargestellt in Tabelle 2) wird auf das Testkollektiv (n=7) angewandt und hierarchisch nach Korrelation geclustert (Spotfire® Software). Es ergeben sich zwei Cluster, die zu 100 % den Respondern und Non-Respondern entsprechen. Es werden die Überlebensdaten der Patienten (Zeitpunkt Tod bzw. Last date Leben minus Zeitpunkt der Operation) berechnet und eine Kaplan-Meier Kurve mit der Variable „bad"-„good" response erstellt. Es ergibt sich eine Signifikanz für das Gesamtüberleben von p=0.04 im Log-rank Test.
b) Eine alternative Methode zur statistischen Auswertung der Rohdaten ging von den vorhandenen 30 Datensätzen aus und bildete fünf Gruppen daraus: Gruppe_l LM responder; Grappe_2 LM non responder; Grappe_3 PR responder; Gruppe_4 PR non responder und Gruppe_5 Undefiniertes klinisches Ansprechen. Die Findungsphase wurde in zwei parallel verlaufende Abschnitte A und B unterteilt. Li dem Findungsabschnitt A wurden mittels T-Test, Welch, Wilcoxon und Kolgomorov-Smirnov Analyse die statistisch signifikant differentiell regulierten Gene zwischen den Gruppen _1 und _2 mit jeweils n=8 bzw. n=9 Datensätzen identifiziert. Hierbei wurde der cutoff-level für die Signifikanz bei p=0.05 gesetzt. Aus dieser Analyse ging eine Gruppe von 806 Genen aus dem gesamten Genpool von 22.283 Genen als signifikant hervor, m einer zweiten Stufe wurden diese Gene dann einer Qualitätsanalyse unterworfen bei der sich 230 Gene als mit dem Affymetrix Genechip System nicht valide messbar erwiesen und weitere 3 Gene unterhalb des gesetzten Detektions-schwellenwerts von 30 RLU lagen. In einem weiteren Analyseschritt wurden von den verbleibenden 573 Genen all jene Gene getrennt die in ihrer biologischen Funktion in Zusammenhang mit entzündlichen Reaktionen oder dem Immunsystem zu sehen sind. Dieses geschah basierend auf zuvor erstellten Genlisten und auf Literatur- wie Datenbank (NCBI, OMIM, UNIGENE) -angaben. Um nur jene Gene als prädiktiv zu identifizieren, die in ihrer relativen Expressionsänderung deutlich messbar sind wurden nochmals jene Gene Entfernt bei denen das delta in der Expression zwischen Gruppe_l und Gruppe_2 größer als ein Faktor 2 war. Dieses Kriterium erfüllten 191 Gene. In einem Crossvalidierungsschritt wurde mittels der KNN (k nearest neighbour ) Analyse und unter Hinzunahme der Gruppe_5 sowie der Anwendung eines sog. Generankings die Anzahl der Gene auf 55 reduziert. Durch Einsatz dieser Gene wurden in der KNN-Analyse nur drei Datensätze fehlklassifiziert bei einem fc=3 und 25% test-set Fraktion sowie 10.000 Iterationen.
In dem zweiten unabhängigen Findungsansatz wurde ausgehend von den gleichen Gruppen _1 und _2 mittels einer vorgeschalteten Qualitätsanalyse von 22.283 Genen nur rund 15.000 als valide (hinreichend gut differentiell expremiert) in diesem Analyseaufbau betrachtet. Mit diesen rund 15.000 Genen wurde dann eine Genreduktion basierend auf SVM (Support Vector Machines) -Algorithmen die sich als besonders gut geeignet zur Lösung von n- dimensionalen Problemen mit zwei oder mehr Klassen erwiesen haben (Weston and Watkins, Proceedings of the Seventh European Symposium On Artificial Neural Networks, April 1999; Vapnik, The Nature of Statistical Learning Theory, 1995, Springer, New York; Vapnik, Statistical Learning Theory, 1998, Wiley, New York; Burges, Data Mining and Knowledge Discovery, 2(2):955-974, 1998). Mit Hilfe dieser Algorithmen wird im n- dimensionalen Raum eine hyperplane (Trennungsebene) definiert, die aus den „Vektoren" der einzelnen Gene und deren Expressionsstärke besteht. Die Reduktion ergab 181 für eine prädiktive Trennung notwendige Gene. Nach Übeφrüfung der Daten auf „doppelte"-Nennungen, die durch die mehrfache Repräsentanz von Genen auf den GeneChip Microarrays entstehen, und der Reduktion von Immunsystem-Genen standen für eine erste, wie bereits zuvor beschriebene Kreuzvalidierung 57 Gene zur Verfügung. Die Schnittmenge der beiden Gengruppen aus den Analyseabschnitten A und B belief sich auf 55 (55 Gene, wie aufgeführt in Tabelle 3). hi einem nun folgenden Analyseabschnitt C wurden die bislang nicht eingesetzten Datensätze der Gruppen_3 und _4 in einer Validierung mit KNN-Algorithmen und in einer PCA (principle component analysis) eingesetzt. Bis auf einen Datensatz aus der Gruppe_4 wurden alle primären Tumorproben korrekt den jeweiligen Gruppen „responder" oder „non responder" zugeordnet.
Somit stellt die Erfindung 72 und 55 (Marker-)Gene bereit, deren Expressionsprofil und/ oder Expressionsniveau sowohl zur (Früh-)erkennung eines kolorektalen Karzinoms, zur Prädiktion von Metastasen (bevorzugt Lebermetastasen) in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms und/ oder zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5- FU haltige Therapie (Chemotherapie) herangezogen werden können. Da die hier dargebotenen Gene von 72 und 55 Genen Überlappungen aufweisen, werden hier insgesamt 120 Gene bereitgestellt (dargestellt in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 181 und gezeigt in Tabelle 2 und 3, als auch in Tabelle D), mit welchen der Fachmann die Verfahren der Erfindung, als auch die Verwendung der Erfindung durchführen kann. SEQ ID NO: 1 bis 120 beziehen sich dabei auf einzelne Gene, die den 120 Markergenen entsprechen. Die zusätzlichen Sequenzen wie in SEQ ID NO: 121 bis 181 dargestellt, sind Varianten von einzelnen Markergenen. Die entsprechende Korrelation der einzelnen Markergene (120) zu den Sequenzen (181) ist den Tabellen, insbesondere Tabelle D zu entnehmen. Auch die „Kits" der Erfindung sind durch diese 120 Gene definiert und nachzuarbeiten. Die hier beigefügten Tabellen (insbesondere Tabelle 1 bis 5 und A, B, C, D) erlauben es dem Fachmann die ausgewählten Expressionsprofile zu bestimmen und zu analysieren.
Beispiel 5: 72 Gene und eine Auswahl davon aus Tabelle 2, die als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms geeignet sind
Die Werte der Spalte 7 in Tabelle 2 zeigen eine signifikant differenzielle Expression der 72 beschriebenen Gene für Kolonmucosa und kolorektale Karzinome. Daraus erschließt sich der Einsatz dieser Gene als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms. Aufgrund einer besonders hohen Signifikanz von p < 0,05 im T-Test (Spalte 7, Tabelle 2), eignet sich folgende Genauswahl (18 Gene) besonders gut im Einsatz als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms: Major histocompatibility complex, class II, DP beta 1 [Affymetrix Nummer 201137_s_at], SEQ ID Nummer 2; CD163 antigen [Affymetrix Nummer 203645_s_at], SEQ ID Nummer 7; phospholipase C, beta 4 [Affymetrix Nummer 203895_at], SEQ ID Nummer 8 oder 122; Solute carrier family 31 (copper transporters), member 2 [Affymetrix Number 204204_at], SEQ ID Nummer 12; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Profilin 2 [Affymetrix Nummer 204992_s_at], SEQ ID Nummer 21 oder 124; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Down Syndrome critical region gene 6 [Affymetrix Nummer 207267_s_at], SEQ ID Nummer 38; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix Nummer 209901_x_at], SEQ ID Nummer 45, 139 oder 140; Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1 [Affymetrix Nummer 211991_s_at], SEQ ID Nummer 49; Aldehyde dehydrogenase 1 family, member Al [Affymetrix Nummer 212224_at], SEQ ID Nummer 50; Plexin Dl [Affymetrix Nummer 212235_at], SEQ ID Nummer 51; Hypothetical protein PP1665 [Affymetrix Nummer 213343_s_at], SEQ ID Nummer 54; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 [Affymetrix Nummer 222162_s_at], SEQ ID Nummer 70.
Im diagnostischen Einsatz werden die Werte eines oder mehrerer (vorzugsweise mindestens zweier) der beschriebenen Gene oder ihrer translatierten Proteine beispielsweise im Blut bestimmt. Die Bestimmung von RNA im Blut erfolgt über die Isolierung von RNA aus dem Citratplasma, Umschreibung in cDNA und anschließender PCR. Die Bestimmung von Proteinen im Blut kann mittels Western- Blot, ELISA oder Lurninex® Technologie erfolgen. Die so erhaltenen Werte werden mit den Normalwerten eines Individuums (oder mit gesundem Gewebe des Patienten) verglichen, um ein kolorektales Karzinom frühzeitig diagnostizieren zu können. Der Fachmann wird zur Bestimmung eines kolorektalen Karzinoms oder zu dessen Früherkennung vorzugsweise mindestens eines, mehr bevorzugt mindestens zwei und am meisten bevorzugt mindestens drei der hier dargestellten Markergene in Form ihres Expressionsprofils untersuchen. Am meisten bevorzugt wird das Expressionsprofϊl definiert durch die folgenden Gene: LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ E) Nummer 41, 136, 137 oder 138; Glucosaminyl (N- acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68.
Beispiel 6: 55 Gene und eine Auswahl davon aus Tabelle 3, die als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms geeignet sind
Die Werte der Spalte 7 in Tabelle 3 (T-Test) zeigen eine signifikant differenzielle Expression der 55 beschriebenen Gene für Kolonmucosa und kolorektale Karzinome. Daraus erschließt sich der Einsatz dieser Gene, als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms. Aufgrund einer besonders hohen Signifikanz von p < 0,05 im T-Test (Spalte 7, Tabelle 3), eignet sich folgende Genauswahl (18 Gene) besonders gut im Einsatz als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms: LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (Phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix Nummer 203708_at], SEQ ID Nummer 78 oder 157; Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 [Affymetrix Nummer 205097_at], SEQ ID Nummer 83; Pleiomorphic adenoma gene 1 [Affymetrix Nummer 205372_at], SEQ ID Nummer 85; KIAA0672 gene product [Affymetrix Nummer 205414_s_at], SEQ ID Nummer 86; PTK7 protein tyrosine kinase 7 [Affymetrix Nummer 20701 l_s_at], SEQ ID Nummer 92, 159, 160, 161 oder 162; Homeo box A9 [Affymetrix Nummer 209905_at], SEQ ID Nummer 99 oder 170; Interleukin 1 receptor, type II [Affymetrix Nummer 211372_s_at], SEQ ID Nummer 101, 171 oder 172; Protein O- fucosyltransferase 1 [Affymetrix Nummer 212349_at], SEQ ID Nummer 103 oder 174; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix Nummer 21253 l_at], SEQ ID Nummer 104; Paraneoplastic antigen [Affymetrix Nummer 213230_at], SEQ ID Nummer 105; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177; Chromosome 14 open reading frame 18 [Affymetrix Nummer 217988_at], SEQ ID Nummer 112, 178, 179 oder 180; Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 [Affymetrix Nummer 219697_at], SEQ ID Nummer 114; LBP protein; likely ortholog of mouse CRTR-I [Affymetrix Nummer 219735_s_at], SEQ ID Nummer 115; Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 [Affymetrix Nummer 220658_s_at], SEQ ID Nummer 118.
Im diagnostischen Einsatz werden die Werte eines oder mehrerer (vorzugsweise mindestens zweier) der beschriebenen Gene oder ihrer translatierten Proteine beispielsweise im Blut bestimmt und mit den Normalwerten eines Individuums verglichen, um eine Tumorerkrankung frühzeitig diagnostizieren zu können. Die „Normalwerte eines Individuums" können die Werte eines nicht erkrankten Individuums sein oder aber auch, wie oben erwähnt, von gesundem Gewebe des erkrankten Patienten stammen.
Beispiel 7: Auswahl an Genen der Tabellen 2 und 3, die besonders gut als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms geeignet sind
Die Genauswahl aus den 72 Genen der Tabelle 2 (Beispiel 5) kombiniert mit der Genauswahl aus den 55 Genen der Tabelle 3 (Beispiel 6) stellen ein erstes ,,minrmal set" von 33 Markergenen dar, das sich in Bezug auf eine besonders signifikant differentielle Expression, gemessen an p < 0,05 im T-Test (Tabelle 2 und Tabelle 3, Spalte 7) aus der Menge der gesamten 120 Markergene abhebt und daher von besonderer diagnostischer Relevanz ist. Bei den Genen handelt es sich um: Major histocompatibility complex, class II, DP beta 1 [Affymetrix Nummer 201137_s_at], SEQ ID Nummer 2; CD 163 antigen [Affymetrix Nummer 203645_s_at], SEQ ID Nummer 7; phospholipase C, beta 4 [Affymetrix Nummer 203895_at], SEQ ID Nummer 8 oder 122; Solute carrier family 31 (copper transporters), member 2 [Affymetrix Number 204204_at], SEQ ID Nummer 12; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Profilin 2 [Affymetrix Nummer 204992_s_at], SEQ ID Nummer 21 oder 124; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Down Syndrome critical region gene 6 [Affymetrix Nummer 207267_s_at], SEQ ID Nummer 38; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix Nummer 209901_x_at], SEQ ED Nummer 45, 139 oder 140; Major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1 [Affymetrix Nummer 211991_s_at], SEQ ID Nummer 49; Aldehyde dehydrogenase 1 family, member Al [Affymetrix Nummer 212224_at], SEQ ED Nummer 50; Plexin Dl [Affymetrix Nummer 212235_at], SEQ DD Nummer 51; Hypothetical protein PP 1665 [Affymetrix Nummer 213343_s_at], SEQ DD Nummer 54; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; A disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 [Affymetrix Nummer 222162_s_at], SEQ ID Nummer 70; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (Phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix Nummer 203708_at], SEQ ID Nummer 78 oder 157; Solute carrier family 26 (sulfate transporter), member 2 [Affymetrix Nummer 205097_at], SEQ ID Nummer 83; Pleiomorphic adenoma gene 1 [Affymetrix Nummer 205372_at], SEQ DD Nummer 85; KIAA0672 gene product [Affymetrix Nummer 205414_s_at], SEQ ID Nummer 86; PTK7 protein tyrosine kinase 7 [Affymetrix Nummer 20701 l_s_at], SEQ DD Nummer 92, 159, 160, 161 oder 162; Homeo box A9 [Affymetrix Nummer 209905_at], SEQ ID Nummer 99 oder 170; Interleukin 1 receptor, type II [Affymetrix Nummer 211372_s_at], SEQ ID Nummer 101, 171 oder 172; Protein O-fucosyltransferase 1 [Affymetrix Nummer 212349_at], SEQ ID Nummer 103 oder 174; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix Nummer 21253 l_at], SEQ ID Nummer 104; Paraneoplastic antigen [Affymetrix Nummer 213230_at], SEQ DD Nummer 105; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177; Chromosome 14 open reading frame 18 [Affymetrix Nummer 217988_at], SEQ DD Nummer 112; Heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase 2 [Affymetrix Nummer 219697_at], SEQ ID Nummer 114; LBP protein; likely ortholog of mouse CRTR-I [Affymetrix Nummer 219735_s_at], SEQ DD Nummer 115; Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 [Affymetrix Nummer 220658_s_at], SEQ DD Nummer 118. Vorzugsweise werden aus der hier dargestellten Gensammlung von 33 Genen wiederum mindestens 18 bestimmt, wobei diese 18 zur Früherkennung eines kolorektalen Karzinoms dienen können. Bevorzugte Auswahl bei diesen 18 Markergenen sind z.B. die Gene mit den SEQ ID NOs: 2, 7, 8 (oder 122), 12, 19, 21 (oder 124), 25, 33, 38, 41 (oder 136, 137, 138), 45 (oder 139, 140), 49, 50, 51, 54, 66, 68 und 70 (siehe auch Beispiel 5) oder die Gene mit den SEQ DD NOs: 25, 41 (oder 136, 137, 138), 68, 78 (oder 157), 83, 85, 86, 92 (oder 159, 160, 161, 162), 99 (oder 170), 101 (oder 171, 172), 103 (oder 174), 104, 105, 109 (oder 177), 112, 114, 115 und 118 (siehe auch Beispiel 6). Der Fachmann kann durchaus die hier dargestellten Ergebnisse zur Zusammenstellung weiterer diagnostischer Auswahlen verwenden. So ist es ihm, inter alia, möglich aus den beigefügten Tabellen die relevanten diagnostischen Markergene zu bestimmen und die entsprechende Auswahl zu treffen. Die hierin als bevorzugt benannten Markergenauswahlen umfassen bevorzugte Ausführungsformen. So kann der Fachmann durchaus die 18 Gene, wie in Beispiel 6 dargestellt, kombinieren.
Durch den Vergleich der Gene, die entsprechend Tabelle 2 und Tabelle 3 eine differentielle Expression zwischen kolorektalen Karzinomen und Mucosa aufwiesen, ließen sich drei Gene identifizieren, die in beiden Auswahlen (Beispiel 5 und Beispiel 6) berücksichtigt wurden und die eine besonders signifikant differentielle Expression aufwiesen. Diese drei Gene sind in Form einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung zur Früherkennung eines kolorektalen Karzinoms anzusehen. Bevorzugt wird mindestens eines dieser drei Gene, mehr bevorzugt mindestens zwei und am meisten bevorzugt alle drei Gene bestimmt. Der Fachmann wird daraus auch das Expressionsprofil weiterer Gene (z.B. ausgewählt aus den „Minimal sets" der hier genannten 72, 55, 33, 18 Gene) zur Diagnostik heranzuziehen. Die besondere Auswahl dieser drei Gene stellt ein weiteres „minimal set" dar, dass von großer diagnostischer Relevanz ist. Bei den Genen handelt es sich um: LGN protein [Affyrnetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affyrnetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68.
Die Gene dieser hier dargestellten „minimal sets" sind im Rahmen einer Krebs- Vorsorgeuntersuchung von besonderem Interesse, da diese 33, 18, 18 bzw. drei Gene als Markergene zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms besonders gut geeignet sind. Entsprechende Daten sind ebenfalls der Tabelle B zu entnehmen. Tabelle B zeigt den Unterschied im Expressionsprofil/Expressionsniveau der definierten Gene im Vergleich von gesunder Mucosa (Muc) und dem Tumorgewebe (Tu). Ein „4." bedeutet hierbei, dass das entsprechende Gen in Mucosa gegenüber Tumoren ein niedrigeres Expressionsniveau hat, während ein „T" bedeutet, dass das entsprechende Gen in gesundem Gewebe gegenüber dem Tumorgewebe ein höheres Expressionsnivau hat. Im Umkehrschluss bedeutet dies, dass „«!<" in der Tabelle B bedeutet, dass das entsprechende Gen im Tumorgewebe ein höheres Expressionsniveau zeigt, als in der gesunden Mucosa und dass „t" bedeutet, dass das entsprechende Gen im Tumorgewebe ein niedrigeres Expressionsniveau zeigt, als in der gesunden Mucosa.
m Beispiel 8 und den folgenden Beispielen wird dargelegt, dass sich die erfindungsgemäßen 120 Gene (SEQ ID NOs: 1 bis 181) ebenfalls zur Bestimmung einer Lebermetastase von einem kolorektalen Karzinom eignen. Somit kann eine Lebermetastase, abhängig von einem kolorektalen Karzinom, vorzugsweise eines bereits diagnostizierten kolorektalen Karzinoms bestimmt werden.
Beispiel 8: Die 72 Gene aus Tabelle 2 lassen sich ebenfalls zur Prädiktion von Lebermetastasen von kolorektalen Karzinomen einsetzen
Die Werte aus Spalte 10 der Tabelle 2 zeigen eine differenzielle Expression der 72 beschriebenen Gene zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen. In Spalte 10 wird der T-Test zwischen Lebermetastasen gegenüber dem Tumor dargestellt. Aus diesem Grund eignen sich diese Gene als Markergene zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms.
Beispiel 9: Minimal- Auswahl („minimal set") an Genen aus Tabelle 2, die zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines kolorektalen Karzinoms besonders gut geeignet sind
Unter Berücksichtigung der Signifikanz ab einem Wert kleiner als 0,05 im T-Test in Spalte 10 der Tabelle 2, ließen sich 20 Gene identifizieren, bei denen eine besonders deutliche differentielle Expression zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen zu verzeichnen war (siehe auch Tabelle C, erste Spalte). Bei den Genen handelt es sich um: Aldolase B, fructose-bisphosphate [Affymetrix Nummer 204705_x_at], SEQ ID Nummer 17; Group-specific component (vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Fibrinogen, B beta Polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Alpha- 1-microglobulin/bikunin precursor [Affymetrix Nummer 205477_s_at], SEQ ID Nummer 26; Fibrinogen A alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29 oder 125; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Pre-alpha (globulin) inhibitor, H3 Polypeptide [Affymetrix Nummer 205755_at], SEQ ID Nummer 31; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Asialoglycoprotein receptor 2 [Affymetrix Nummer 206130_s_at], SEQ ID Nummer 35, 133, 134 oder 135; Amyloid P component, serum [Affymetrix Nummer 206350_at], SEQ ID Nummer 37; Haptoglobin [Affymetrix Nummer 208470_s_at], SEQ ID Nummer 40; Alpha- 1 Antitrypsin [Affymetrix Nummer 211429_s_at], SEQ ID Nummer 48, 151 oder 152; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Similar to Human Ig rearranged gamma chain mRNA, V-J-C region [Affymetrix Nummer 214669_x_at], SEQ ID Nummer 64; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Fibrinogen, gamma Polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69 oder 156; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71; Hemopexin [Affymetrix Nummer 39763_at] SEQ ID Nummer 72. Die zuvor genannten 20 Gene stellen eine besonders geeignete Auswahl dar, die es im Rahmen einer Standarduntersuchung dieser Markergene ermöglicht, das Vorhandensein bzw. das Wachstum von Lebermetastasen aufgrund eines primären kolorektalen Karzinoms zu untersuchen. Beim entsprechenden Expressionsprofil/ Expressionsniveau eines einzelnen zu bestimmenden Gens in der Tabelle C bedeutet „t", dass das entsprechende Gen in der Metastase gegenüber dem Primär-Tumor hochreguliert ist, während „4." bedeutet, dass das Gen entsprechend herunter reguliert ist.
Beispiel 10: Die 55 Gene aus Tabelle 3, lassen sich zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms einsetzen
Die Werte aus Spalte 10 der Tabelle 3 zeigen eine differenzielle Expression der 55 beschriebenen Gene zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen. Aus diesem Grund eignen sich diese Gene als Markergene zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines bereits diagnostizierten kolorektalen Karzinoms; siehe Tabelle 3.
Beispiel 11: Minimal- Auswahl an Genen aus Tabelle 3, die zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms besonders gut geeignet sind
Unter Berücksichtigung der Signifikanz ab einem Wert kleiner als 0,05 im T-Test in Spalte 10 der Tabelle 3, ließen sich zwei Gene identifizieren, bei denen eine besonders deutliche differentielle Expression zwischen kolorektalen Karzinomen und korrespondierenden Lebermetastasen zu verzeichnen war. Bei den Genen handelt es sich um: Tenascin C (hexabrachion) [Affymetrix Nummer 201645_at], SEQ ID Nummer 74; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ ID Nummer 109 oder 177; siehe auch Tabelle C. Beim entsprechenden Expressionsprofil/ Expressionsniveau eines einzelnen zu bestimmenden Gens in der Tabelle C bedeutet „t", dass das entsprechende Gen in der Metastase gegenüber dem Primär-Tumor hochreguliert ist, während „l" bedeutet, dass das Gen entsprechend herunter reguliert ist.
Die zuvor genannten zwei Gene stellen eine besonders geeignete Auswahl dar, die es im Rahmen einer Standarduntersuchung dieser Markergene ermöglicht, das Wachstum von Lebermetastasen aufgrund eines primären kolorektalen Karzinoms zu untersuchen.
Vorzugsweise werden diese beiden Gene gegebenenfalls in Kombination mit weiteren Genen zur entsprechenden Diagnostik herangezogen. In einer bevorzugten Diagnostik werden diese beiden Gene mit mindestens einem weiteren Gen aus Tabelle C, Tabelle 2 und/ oder Tabelle 3 kombiniert, jedoch können auch andere Gene der SEQ ID NOs 1 bis 73, 75 bis 108, 110 bis 176 und 178 bis 181 zur Diagnostik herangezogen werden. Die entsprechende Information befindet sich ebenfalls in der Spalte 10 der Tabellen 2 und 3. Beispiel 12: Auswahl an Genen der Tabellen 2 und 3, die sich besonders gut zur Prädiktion von Lebermetastasen im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms eignen
Die Summe der 20 ausgewählten Gene aus Tabelle 2 und die zwei ausgewählten Gene aus Tabelle 3 stellen das bevorzugte „minimal set" an Markergenen dar und sind daher von sehr großer diagnostischer Bedeutung; siehe auch Tabelle C mit den entsprechenden Erklärungen in den vorhergehenden Beispielen. Bei den Genen handelt es sich um: Aldolase B, fructose-bisphosphate [Affymetrix Nummer 204705_x_at], SEQ ID Nummer 17; Group-specific component (Vitamin D binding protein) [Affymetrix Nummer 204965_at], SEQ ID Nummer 19; Fibrinogen, B beta Polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Alρha-1- microglobulin/bikunin precursor [Affymetrix Nummer 205477_s_at], SEQ ID Nummer 26; Fibrinogen A alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ DD Nummer 29 oder 125; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Pre-alpha (globulin) inhibitor, H3 Polypeptide [Affymetrix Nummer 205755_at], SEQ DD Nummer 31; Arylacetamide deacetylase (esterase) [Affymetrix Nummer 205969_at], SEQ ID Nummer 33; Asialoglycoprotein receptor 2 [Affymetrix Nummer 2O613O_s_at], SEQ ID Nummer 35, 133, 134 oder 135; Amyloid P component, serum [Affymetrix Nummer 206350_at], SEQ ID Nummer 37; Haptoglobin [Affymetrix Nummer 208470_s_at], SEQ ID Nummer 40; Alpha-1 Antitrypsin [Affymetrix Nummer 211429_s_at], SEQ ID Nummer 48, 151 oder 152; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Similar to Human Ig rearranged gamma chain mRNA, V-J-C region [Affymetrix Nummer 214669_x_at], SEQ ID Nummer 64; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Fibrinogen, gamma Polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69 oder 156; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71; Hemopexin [Affymetrix Nummer 39763_at] SEQ ID Nummer 72; Tenascin C (hexabrachion) [Affymetrix Nummer 201645_at], SEQ ID Nummer 74; Immunoglobulin lambda joining 3 [Affymetrix Nummer 214677_x_at], SEQ HD Nummer 109 oder 177. Die Untersuchung der Expressionsniveaus dieser ausgewählten Gene ist im Falle eines diagnostizierten kolorektalen Karzinoms von besonders großem Interesse, da sich die 22 Gene besonders gut als Markergene für den Nachweis bereits ausgeprägter, korrespondierender Lebermetastasen einsetzen lassen.
Die folgenden Beispiele belegen, dass die hier identifizierten 120 Gene auch zur Bestimmung/ Prädiktion des Therapieverlaufs einer 5-FU-hatigen Chemotherapie bei der Behandlung von Metastasen, insbesondere von Lebermetastasen, verwendet werden können. Hierbei werden in den folgenden Beispielen bevorzugt Lebermetastasen untersucht.
Beispiel 13: 72 Gene aus Tabelle 1, die sich zur Prädiktion des Therapieverlaufs von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms im Falle einer 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie eignen
Durch den Vergleich der Genexpression in Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms zwischen Patienten, die auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen („responder") und Patienten, die nicht auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen („non-responder"), konnte eine signifikant differentielle Expression bei 72 Genen identifiziert werden, siehe auch Tabelle 1 und Tabelle A erste Spalte. Eines oder mehrere der beschriebenen Gene, Genfragmente, komplementäre Nukleinsäuren oder translatierte Proteine eignen sich aus diesem Grund gut zur Prädiktion der Effektivität einer 5-FU basierten Chemo- oder Kombinationstherapie (5-FU z.B. in Kombination mit Folinsäure, Irinotecan, Oxaliplatin und anderen).
hl Tabelle A wird für dieses Beispiel (und die folgenden Beispiele) dargelegt, dass sich das Expressionsniveau der einzelnen Gene bestimmen und insbesondere zwischen „Respondern" und „Non-Respondern" unterscheiden lässt. Daten für die 120 erfindungsgemäßen Gene sind in den Tabellen 1 und 4 aufgeführt. Li Tabelle A werden die bevorzugt zu analysierenden Gene dargestellt. Hierbei bedeutet „T", dass das entsprechende Gen bei Patienten, die auf eine 5-FU-haltige Chemo- und/ oder Kombinationstherapie ansprechen („Responder") gegenüber den Patienten, die nicht ansprechen („Non-Responder") stärker exprimiert („hochreguliert") ist. Dagegen bedeutet das „4>" eine schwächere Expression des entsprechenden Gens in „Respondern" versus „Non-Respondern". Generell im Kontext mit dieser Erfindung bedeutet das Wort „Expressionsniveau" somit einen messbar zu bestimmenden Wert der Expression des zu untersuchenden Gens, wobei dieser Wert sich, wie in den Tabellen dargelegt und in Beispiel 2 dargestellt, auf das Expressionsprofil der RNA. in der Probe bezieht. Der Fachmann kann jedoch in den hier dargestellten Verfahren (zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms, zur Prädiktion von Metastasen, als auch zur Prädiktion des Ansprechens auf eine 5 -FU Therapie) das Expressionsniveau durch andere Analysen bestimmen (z.B. Bestimmung der Proteinmenge, der durch die Gene SEQ ID NOs: 1 bis 181 kodierten Proteine, Peptide oder Peptidabschnitte). Diese Analysen umfassen, z.B. und nicht limitierend, rmmundetektionsverfahren wie Westernblot, ELISA, RIA, Immunopräzipitation, als auch FACS-Analysen.
Beispiel 14: 55 Gene aus Tabelle 4, die sich zur Prädiktion des Therapieverlaufs von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms im Falle einer 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie eignen
Durch den Vergleich der Genexpression in Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms zwischen Patienten, die auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen und Patienten, die nicht auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen, konnte eine signifikant differentielle Expression bei 55 Genen identifiziert werden; siehe Tabelle 4 und Tabelle A (zweite Spalte).
Eines oder mehrere der beschriebenen Gene, Genfragmente, komplementäre Nukleinsäuren oder translatierte Proteine eignen sich aus diesem Grund gut zur Prädiktion der Effektivität einer 5-FU basierten Chemo- oder Kombinationstherapie (5-FU z.B. in Kombination mit Folinsäure, Irinotecan, Oxaliplatin und anderen).
Beispiel 15: Auswahl an Genen aus Tabellen 1 und 4, die sich als Markergene zur Prädiktion des Therapieverlaufs von Patienten mit Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms im Falle einer 5-FU haltigen Chemo- oder Kombinationstherapie einsetzen lassen
Durch den Vergleich der Genexpression in Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms zwischen Patienten, die auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen und Patienten, die nicht auf eine 5-FU haltige Chemotherapie ansprechen, unter Berücksichtigung der Signifikanzen in der vergleichenden statistischen Analyse (t-, Welsh- und Wilcoxon-Test); siehe Tabelle A Spalte 7, 8, 9 und 10 konnten in den Tabellen 1 und 4 insgesamt 34 besonders signifikant differentiell exprimierte Gene identifiziert werden. Neben der statistischen Auswahl zur Reduktion der Genliste wurden auch die Daten der „Principal Component Analyse" (PCA) herangezogen. Bei der „Principal Component Analyse" (PCA) handelt es sich um ein Verfahren, mit dem man Variablen gemäß ihrer korrelativen Beziehungen in voneinander relativ unabhängige Gruppen klassifizieren kann und eine Reduktion der vorhandenen Dimensionen auf wenige Grundkomponenten durchführen kann. Das Ergebnis der Faktorenanalyse sind wechselseitig voneinander relativ unabhängige Faktoren, welche die Zusammenhänge zwischen den in ihnen gebündelten Variablen erklären. Sie ist somit ein datenreduzierendes und hypothesengenerierendes Verfahren, welches geeignet ist, die Dimensionalität komplexer Merkmale zu überprüfen. Anhand der „Ladungen" (ähnliche Gene) der einzelnen Konstrukte auf den Hauptkomponenten können die Dimensionen inhaltlich definiert werden. Ladungen informieren im Rahmen faktorenanalytischer Verfahren allgemein darüber, wie gut eine Variable zu einer Variablengruppe passt. Hierbei wurden jene Gene, die in der ersten Auswahl, siehe Tabelle A, Spalten 1 und 2, eine deutliche Trennung zwischen Lebermetastasen und Primärtumor, unabhängig von ihrem prädiktiven Potential bzgl. Ansprechen, zeigten nicht für die Auswahl der 28 Gene in Tabelle A, Spalte 4 berücksichtigt. Die hier repräsentierten Gene stellen somit das Optimum bzgl. Responseprädiktion und statistischer Signifikanz dar.
Bei diesen Genen handelt es sich um: Apolipoprotein E [Affymetrix Nummer 203382_s_at], SEQ DD Nummer 6; CD163 antigen [Affymetrix Nummer 203645_s_at], SEQ ID Nummer 7; Phospholipase C, beta 4 [Affymetrix Nummer 203895_at], SEQ ID Nummer 8 oder 122; Chromosome 11 open reading frame 9 [Affymetrix Nummer 204073_s_at], SEQ ID Nummer 10; Apolipoprotein C-I [Affymetrix Nummer 204416_x_at], SEQ ID Nummer 13; Sialyltransferase [Affymetrix Nummer 204542_at], SEQ ID Nummer 14; Coagulation factor C homolog, cochlin (Limulus polyphemus) [Affymetrix Nummer 205229_s_at], SEQ ID Nummer 24; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Allograft inflammatory factor 1 [Affymetrix Nummer 209901_x_at], SEQ ID Nummer 45, 139 oder 140; Hyaluronoglucosaminidase 1 [Affymetrix Nummer 210619_s_at], SEQ ID Nummer 46, 141, 142, 143, 144, 145, 146 oder 147; Alpha-1 Antitrypsin [Affymetrix Nummer 211429_s_at], SEQ ID Nummer 48, 151 oder 152; Low density lipoprotein receptor- related protein 4 [Affymetrix Nummer 212850_s_at], SEQ ID Nummer 52; Hypothetical protein PP 1665 [Affymetrix Nummer 213343_s_at], SEQ ID Nummer 54; Serum amyloid A2 [Affymetrix Nummer 214456_x__at], SEQ ID Nummer 60; Orosomucoid 2 [Affymetrix Nummer 214465_at ], SEQ ID Nummer 61; Eyes absent homolog 1 (Drosophila) [Affymetrix Nummer 214608_s_at], SEQ ID Nummer 63, 153, 154 oder 155; H factor (complement)-like 1 [Affymetrix Nummer 215388_s_at], SEQ ID Nummer 65; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68; Fascin homolog 1, actin-bundling protein (Strongylocentrotus purpuratus) [Affymetrix Nummer 201564_s_at], SEQ ID Nummer 73; Phosphodiesterase 4B, cAMP-specific (Phosphodiesterase E4 dunce homolog, Drosophila) [Affymetrix Nummer 203708_at], SEQ ID Nummer 78 oder 157; Biliverdin reductase A [Affymetrix Nummer 203771_s_at], SEQ ID Nummer 79; IGF-II mRNA-binding protein 3 [Affymetrix Nummer 203819_s_at], SEQ ID Nummer 80; Cathepsin E [Affymetrix Nummer 205927_s_at], SEQ ED Nummer 89 oder 181; Keratin 6A [Affymetrix Nummer 209125_at], SEQ ID Nummer 97, 167 oder 168; spondin 1, (f-spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix Nummer 209436_at], SEQ ID Nummer 98 oder 169; Interleukin 1 receptor, type II [Affymetrix Nummer 211372_s_at], SEQ ID Nummer 101, 171 oder 172; Lipocalin 2 (oncogene 24p3) [Affymetrix Nummer 21253 l_at], SEQ ID Nummer 104; G protein-coupled receptor 49 [Affymetrix Nummer 213880_at], SEQ ED Nummer 107; Spondin 1, (f- spondin) extracellular matrix protein [Affymetrix Nummer 213994_s_at], SEQ ID Nummer 108 oder 176; Frizzled homolog 10 (Drosophila) [Affymetrix Nummer 219764_at], SEQ ID Nummer 116; Deafhess locus associated putative guanine nucleotide exchange factor [Affymetrix Nummer 220482_s_at], SEQ ID Nummer 117; CDW52 antigen (CAMPATH-I antigen) [Affymetrix Nummer 34210_at], SEQ ED Nummer 120. Dementsprechend stellt die Erfindung vorzugsweise eine Auswahl aus den 120 dargestellten Genen dar, nämlich 34, vorzugsweise 28, welche insbesondere zur Bestimmung der Responsivität auf 5-FU-haltige Therapien herangezogen werden können. Ebenfalls wird im Sinne dieser Erfindung die „Responsivität" auf eine 5-FU- haltige Chemotherapie/Kombinationstherapie das Expressionsprofil von spezifischen Serummarkern in Blut bestimmt. Auch diese Serummarker sind in den hierin definierten 120 Markergenen enthalten und umfassen insbesondere die folgenden Markergene (und deren Varianten und Homologe): Complement component 1, q subcomponent, beta Polypeptide [Affymetrix Nummer202953_at], SEQ ID Nummer 4; Apolipoprotein E [Affymetrix Nummer 203382_s_at], SEQ ID Nummer 6; Apolipoprotein C-I [Affymetrix Nummer204416_x_at], SEQ ID Nummer 13; Koagulation factor V (proaccelerin, labile factor) [Affymetrix Nummer204714_s_at], SEQ ID Nummer 18; Fibrinogen, B beta Polypeptide [Affymetrix Nummer 204988_at], SEQ ID Nummer 20; Orosomucoid 1 [Affymetrix Nummer 205041_s_at], SEQ ID Nummer 22; Apolipoprotein B (including Ag(x) antigen) [Affymetrix Nummer 205108_s_at], SEQ ID Nummer 23; Fibrinogen, A alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 205650_s_at], SEQ ID Nummer 29; Coagulation factor II (thrombin) [Affymetrix Nummer 205754_at], SEQ ID Nummer 30; Transferrin [Affymetrix Nummer 214063_s_at], SEQ ID Nummer 58; Complement component 4A [Affymetrix Nummer 214428_x_at], SEQ ID Nummer 59; Serum amyloid A2 [Affymetrix Nummer 214456_x_at], SEQ ID Nummer 60; Orosomucoid 2 [Affymetrix Nummer 214465_at], SEQ ID Nummer 61; Complement component 3 [Affymetrix Nummer 217767_at], SEQ ID Nummer 66; Complement component 1, q subcomponent, alpha Polypeptide [Affymetrix Nummer 218232_at], SEQ ID Nummer 67; Fibrinogen, gamma Polypeptide [Affymetrix Nummer 219612_s_at], SEQ ID Nummer 69; C-reactive protein, pentraxin-related [Affymetrix Nummer 37020_at], SEQ ID Nummer 71.
Eines oder mehrere (vorzugsweise mindestens zwei, mehr bevorzugt mindestens drei) der beschriebenen Gene, Genfragmente, komplementäre Nukleinsäuren oder translatierte Proteine eignen sich aus diesem Grund besonders gut zur Prädiktion der Effektivität einer 5-FU basierten Chemo- oder Kombinationstherapie (5-FU z.B. in Kombination mit Folinsäure, Irinotecan, Oxaliplatin und anderen). Bevorzugte mindestens 3 Gene sind, inter alia, die Gene 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, dargestellt in den SEQ ED NOs: Chromosome 11 open reading frame 9 [Affymetrix Nummer 204073_s_at], SEQ ID Nummer 10; Sialyltransferase [Affymetrix Nummer 204542_at], SEQ ID Nummer 14; LGN protein [Affymetrix Nummer 205240_at], SEQ ID Nummer 25; Peroxisome proliferative activated receptor, gamma [Affymetrix Nummer 208510_s_at], SEQ ID Nummer 41, 136, 137 oder 138; Low density lipoprotein receptor-related protein 4 [Affymetrix Nummer 212850_s_at], SEQ ID Nummer 52; Eyes absent homolog 1 (Drosophila) [Affymetrix Nummer 214608_s_at], SEQ ID Nummer 63, 153, 154 oder 155; Glucosaminyl (N-acetyl) transferase 3, mucin type [Affymetrix Nummer 219508_at], SEQ ID Nummer 68.
Beispiel 16: Individuelle Therapie von Lebermetastasen eines kolorektalen Karzinoms abgeleitet aus den Expressionsdaten der jeweiligen Patienten
Herr T. ist ein 42-jähriger Patient, bei dem im Juli 2003 ein subtotal stenosierendes Sigmakarzinom mit Lebermetastasierung diagnostiziert wurde. Der Primärtumor wurde am 18.07.2003 komplett (RO) reseziert und parallel dazu wurde aus einer der Lebermetastasen eine Biopsie gewonnen. Diese Lebermetastase wurde (gemäß der Beispiele 1- 4) laser-mikrodisseziert, die RNA isoliert und amplifiziert. Anschließend wurde die amplifizierte RNA auf einem Affymetrix-Chip HG U133-A hybridisiert und das Expressionsmuster ausgelesen. Das Ergebnis der Analysen stand am 05.09.2003 fest (siehe Tabelle 5, Spalte 4) und ergab eine Gen-Signatur, die ein gutes Ansprechen prädizierte (Beispiele 13 bis 15).
Der Patient wurde nach der Operation mit einer palliativen Chemotherapie, bestehend aus Folinsäure und 5-Fluorourcil als 24-h Infusion (AIO-Regime) sowie mit Oxaliplatin alle 2 Wochen behandelt. Am 06.08.2004 wurde mit dem ersten Zyklus der Behandlung begonnen und es zeigte sich bereits bei der ersten Kontrolle des Tumor-Ansprechens mittels Computertomografie (CT) am 24.09.2003 ein Ansprechen auf die Chemotherapie. Nach Beendigung des zweiten Zyklus konnte eine partielle Remission (Verkleinerung der Lebermetastasen um > 50%) erreicht werden. Es wurde daher ein 3. und ein 4. Zyklus dieser Chemotherapie (CTx) gegeben. Die vorläufig letzte Kontrolle des Tumor-Ansprechens fand am 23.03.2004 statt. Die Referenzmetastase hat sich von ursprünglich (CT Befund vom 04.08.2003; vor Chemotherpapie) 12,9 x 9,0 cm auf nunmehr 4,2 x 7,6 cm (CT Befund vom 25.03.2004; nach 4 Zyklen Chemotherapie) verkleinert (Reduktion um 72,6 %; entspricht einer partiellen Remission nach WHO-Kriterien) Die CT-Befunde dieses Patienten vor Chemotherapie und nach dem 4. Chemotherapie-Zyklus finden sich in der Abbildung 5. Auch die anderen Lebermetastasen waren größenregredient und es traten keine neuen Metastasen auf. Der Patient lebt zum jetzigen Zeitpunkt (Mai 2004), es wird sogar eine sekundär kurative Metastasenchirurgie diskutiert.
Die Genexpressionsprofile, so wie sie in den Beispielen 13 bis 15 beschrieben sind, wurden an diesem Patienten prospektiv getestet, da das Ergebnis der Untersuchungen bereits am 05.09.2004, also 15 Tage vor der ersten Tumorkontrolle unter Chemotherapie feststand und das Genexpressions-Profil das Ansprechen auf die Therapie richtig prädizierte.; siehe Tabelle 5.
Beispiel 17: Validierung der Markergene definiert auch SEQ ID NOS: 25, 41 und 68 als diagnostische Marker für kolorektale Karzinome
Zur weiteren Validierung der oben genannten Ergebnisse wurden von einem unabhängigen Set von 12 Patienten mit kolorektalen Karzinomen präoperativ Biopsien sowohl der normalen Kolon- bzw. Rektummukosa sowie Biopsien des Tumors entnommen. Die Biopsien wurden nach der Gewinnung sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und anschließend bei -800C archiviert.
Anschließend wurden die Proben wie in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben behandelt, d.h. die RNA aus den Proben extrahiert, die RNA amplifiziert und gelabelt und mit HG U133-A Microarrays der Firma Affymtrix hybridisiert. Die Arbeitsschritte zur Durchführung der genannten Prozeduren wurden entsprechend der Angaben im Handbuch zur Genexpressionsanalyse (Firma Affymetrix) ausgeführt. Die Signalintensitäten und die Detektionssignale („detection calls") wurden mit Hilfe der GeneChip 5.0 Software der Firma Affymetrix erstellt.
Die Daten des hier beschriebenen „Minimal-Sets" an diagnostischen Markern zur Erkennung des kolorektalen Karzinoms umfassend das Expressionsprofil von den mit den Seq ID 25, 41 und 68 und 136 bis 138 definierten Markergenen wurden nun anhand des oben beschriebenen Kollektivs validiert. Dazu wurden über die Affy-Nr. die entsprechenden Expressionswerte der 12 Mucosa-Tumor Paare herausgesucht, die fold-change und der T-Test (p<0.05) der Paare berechnet. Es zeigt sich, wie in Tabelle 6 ersichtlich, für die drei Gene charakterisiert durch SEQ ID NOS: 5, 41 und 68 ein signifikanter Unterschied zwischen Mukosa und Tumor. Bemerkenswert dabei ist, dass auch die Richtung des Unterschieds (direction Tu vs Muc) mit der Tabelle 2 übereinstimmt, d.h. das Gen mit der Seq ID 25 ist im Tumor (im Vergleich zum Normalgewebe) heraufreguliert und die Gene der Seq ID 41 und 68 im Tumor (im Vergleich zum Normalgewebe) herunterreguliert. Es konnte damit gezeigt werden, dass die hierin beschriebenen Verfahren und insbesondere die hierin charakterisierten Gensets und ganz besonders die „Minimal-Sets" in der Lage ist, an einem unabhängigen Kollektiv von n=12 kolorektalen Karzinomen, Tumor und Mukosa in 100% exakt zu differenzieren.
TABELLEN
Tabelle 1
Expressionsdaten nach statistischer Auswertung entsprechend Beispiel 4a von Responder (Resp) versus Non-
Responder (Non-Resp) auf eine 5-FÜ haltige palliative Chemotherapie
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Ul
Beschreibung zur Tabelle 1
In Tabelle 1 sind alle 72 Gene aufgeführt, die nach der Auswertung der Rohdaten entsprechend dem statistischen Verfahren aus Beispiel 4a relevant für eine Vergleich der Genexpression von Respondern (Resp) mit denen von Non-Respondern (Non-Resp) in Bezug auf ein Ansprechen auf eine 5-FU haltige palliative Chemotherapie beim metastasierten kolorektalen Karzinom sind.
Spalte 1 enthält die SEQ ID NOS der Gene
Spalte 2 enthält die Affymetrix Accession Numbers auf dem HG U-133-A Microarray
Spalte 3 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=8) Respondern
Spalte 4 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=9) Non-Respondern
Spalte 5 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Respondern und Non-Respondern, angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 6 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test
Spalte 7 zeigt an inwieweit die einzelnen Gene bei den Non-Respondern herauf- (up) oder herunterreguliert (down) sind (im Vergleich zu den
Respondern)
SpalteS enthält die Namen der Gene
Spalte 9 enthält das Gensymbol
Tabelle 2
Expressionsdaten Kolonmukosa (Muc) versus kolorektaler Primärtumor (Tu) versus Lebermetastase (Lm) nach statistischer Auswertung entsprechend Beispiel 4a
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Beschreibung zur Tabelle 2
In Tabelle 2 sind alle 72 Gene aufgeführt, die nach der Auswertung der Rohdaten entsprechend dem statistischen Verfahren aus Beispiel 4a relevant für eine Vergleich der Genexpressionen zwischen Normalgewebe (normale Kolonmukosa (Muc)), kolorektalem Primärtumor (Tu) und
Lebermetastase (Lm) dieser kolorektalen Karzinome sind.
Spalte 1 enthält die SEQ ID NOS der Gene
Spalte 2 enthält die Affymetrix Accession Numbers auf dem HG U-133-A Microarray
Spalte 3 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=3) normaler Mukosa
Spalte 4 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=10) kolorektalen Primärtumoren
Spalte 5 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=20) Lebermetastasen (korespondierend mit kolorektalen Karzinomen)
Spalte 6 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Tumor und Normalgewebe angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 7 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test
Spalte 8 zeigt an, inwieweit die einzelnen Gene im Tumor herauf- (up) oder herunterreguliert (down) oder nicht signifikant unterschiedlich
(none) sind (im Vergleich zum Normalgewebe)
Spalte 9 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Lebermetastase und Tumor angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 10 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test
Spalte 11 zeigt an inwieweit die einzelnen Gene in der Lebermetastase herauf- (up) oder herunterreguliert (down) oder nicht signifikant unterschiedlich (none) sind (im Vergleich zum Tumor)
SpalteH enthält die Namen der Gene
Spalte 13 enthält das Gensymbol
Tabelle 3
Expressionsdaten Kolonmukosa (Muc) versus kolorektaler Primärtumor (Tu) versus Lebermetastase (Lm) nach statistischer Auswertung entsprechend Beispiel 4b
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
-4 -4
Figure imgf000078_0001
Beschreibung zur Tabelle 3
In Tabelle 3 sind alle 55 Gene aufgeführt, die nach der Auswertung der Rohdaten entsprechend dem statistischen Verfahren aus Beispiel 4b relevant für eine Vergleich der Genexpressionen zwischen Normalgewebe (normale Kolonmukosa (Muc)), kolorektalem Primärtumor (Tu) und
Lebermetastase (Lm) dieser kolorektalen Karzinome sind.
Spalte 1 enthält die SEQ ID NOS der Gene
Spalte 2 enthält die Affymetrix Accession Numbers auf dem HG U-133-A Microarray
Spalte 3 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=3) normaler Mukosa
Spalte 4 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=10) kolorektalen Primärtumoren
Spalte 5 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=20) Lebermetastasen (korespondierend mit kolorektalen Karzinomen)
Spalte 6 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Tumor und Normalgewebe angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 7 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test
Spalte 8 zeigt an, inwieweit die einzelnen Gene im Tumor herauf- (up) oder herunterreguliert (down) oder nicht signifikant unterschiedlich (none) sind (im Vergleich zum Normalgewebe)
Spalte 9 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Lebermetastase und Tumor angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 10 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test
Spalte 11 zeigt an inwieweit die einzelnen Gene in der Lebermetastase herauf- (up) oder herunterreguliert (down) oder nicht signifikant unterschiedlich (none) sind (im Vergleich zum Tumor) Spaltell enthält die Namen der Gene Spalte 13 enthält das Gensymbol Spalte 14 markiert die Gene, die sowohl in Tabelle 2, als auch in Tabelle 3 ausgewählt wurden mit einem „x"
-4
Tabelle 4
Expressionsdaten nach statistischer Auswertung entsprechend Beispiel 4b von Responder (Resp) versus Non-
Responder (Non-Resp) auf eine 5-FU haltige palliative Chemotherapie
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Beschreibung zur Tabelle 4
In Tabelle 4 sind alle 55 Gene aufgeführt, die nach der Auswertung der Rohdaten entsprechend dem statistischen Verfahren aus Beispiel 4b relevant für einen Vergleich der Genexpression von Respondern (Resp) mit denen von Non-Respondern (Non-Resp) in Bezug auf ein
Ansprechen auf eine 5-FU haltige palliative Chemotherapie beim metastasierten kolorektalen Karzinom sind.
Spalte 1 enthält die SEQ ID NOS der Gene
Spalte 2 enthält die Affymetrix Accession Numbers auf dem HG U-133-A Microarray
Spalte 3 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=8) Respondern
Spalte 4 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (tt=9) Non-Respondern OO
Spalte 5 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Respondern und Non-Respondern, angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 6 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test
Spalte 7 zeigt an inwieweit die einzelnen Gene bei den Non-Respondern herauf- (up) oder herunterreguliert (down) sind (im Vergleich zu den
Respondern)
SpalteS enthält die Namen der Gene
Spalte 9 enthält das Gensymbol
Tabelle 5
Ex ressionsdaten von Res ondern Res Non-Res ondern Nonres und Pat. T. von Beis iel 16
OO
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000088_0001
OO
Figure imgf000089_0001
Beschreibung zur Tabelle 5
In Tabelle 5 wird die Veränderung des Expressionsniveaus zwischen Patient T., Respondern (Resp) und Non-Respondern (Non-Resp) gegenübergestellt.
Spalte 1 enthält die SEQ E) NOS der Gene
Spalte 2 enthält die Affymetrix Accession Numbers auf dem HG U- 133- A Microarray
Spalte 3 enthält die Genexpression in der Lebermetastase von Patient T.
Spalte 4 enthält die Mittelwerte der Genexpression in den Lebermetastase von Respondern (Resp)
Spalte 5 enthält die Mittelwerte der Genexpression in den Lebermetastase von Non-Respondern (Non-Resp)
Spalte 6 zeigt die durchschnittliche Veränderung des Expressionsniveaus bei Respondern
Spalte 7 zeigt die Veränderung des Expressionsniveaus bei Patient T.
Man sieht eine gute Übereinstimmung zwischen Spalte 6 und 7 (die nicht übereinstimmenden Veränderungen des Expressionsniveaus wurden mit Fettdruck hervorgehoben) Insgesamt konnten 66 der 72 Gene aus Tabelle 1 (91,7%) und 50 von 55 Genen aus Tabelle 4 (90,9%) richtig zugeordnet werden, was bedeutet, dass Patient T. in Bezug auf die Gen-Signatur mit hoher Wahrscheinlichkeit zu den Respondern zählt.
Insbesondere stimmen 27 der 28 Gene des „Minimal sets" überein (lediglich eine Abweichung bei Nummer 116). Es liegt damit eine
Wahrscheinlichkeit von 96% vor, dass Patient T. ein Responder ist.
(Die Expressionsdaten von Patient T. flössen nicht in die Berechnungen ein, die den Spalten 4 und 5 zugrunde liegen).
Tabelle 6
Expressionsdaten Kolon/Rektum Mukosa (Mac) versus kolorektalem Primärtumor (Tu) von n=12 unabhängigen Patienten entsprechend Beispiel 17 als Validerung von Tabelle
2
Figure imgf000090_0001
Beschreibung zu Tabelle 6
In Tabelle 6 sind die Seq ID aufgeführt, die nach Ansprach 9 eine Differenzierung von normaler Darmmukosa und kolorektalem Karzinom zulassen.
Spalte 1 enthalt die SEQ ID NOS der Gene
Spalte 2 enthält die Affymetrix Accession Numbers auf dem HG U-133-A Microarray
Spalte 3 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=12) Kolon/Rektum Mucosa
Biopsien
Spalte 4 enthält die Mittelwerte der Genexpression von (n=12; zu Spalte 3 korrespondierenden) Kolon/Rektum Karzinom Biopsien
Spalte 5 enthält die Unterschiede der Genexpression zwischen Tumor und Normalgewebe angegeben als fold-change (Fc)
Spalte 6 zeigt das Signifikanzniveau im T-Test Spalte 7 zeigt an inwieweit die einzelnen Gene im Tumor herauf- (up) oder herunterreguliert (down) sind (im Vergleich zum Normalgewebe) Spalte 8 enthält die Namen der Gene Spalte 9 enthält das Gensymbol
Tabelle A
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
Tabelle B
Figure imgf000094_0001
Tabelle C
Figure imgf000095_0001
Tabelle D
Kongruenzliste der vergebenen SEQ ID NOs
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000100_0001
Der Begriff „Variante" umfasst in dieser Erfindung bezüglich der hier offenbarten 120 Markergene sowohl Splicevarianten, als auch homologe oder hochhomologe Gene.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur
(a) Erkennung eines kolorektalen Karzinoms;
(b) Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms; und/oder
(c) Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil-haltige Chemotherapie; umfassend die Bestimmung eines Genexpressionsprofils von 120 Markergenen (wie dargestellt in SEQ ID NOs: 1 bis 181) oder einer Auswahl daraus.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Expressionsprofil mindestens zweier der 120 Markergene (SEQ ID NOs: 1 bis 181) bestimmt und mit einem Referenzwert verglichen wird.
3. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem das Expressionsniveau mindestens zweier der 120 Gene ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NOs: 1 bis 181 bestimmt und mit dem durchschnittlichen Expressionsniveau der Gene aus normaler Darmmucosa verglichen wird.
4. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 72 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 72 oder 121 bis 156 bestimmt wird.
5. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüchen 1 bis 3, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 55 Markergenen, wie definiert in den SEQ ED NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 73 bis 120, 136, 137, 138, 153, 154, 155 und 157 bis 181, bestimmt wird.
6. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 33 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115, 118, 122, 124, 136 bis 140, 157, 159 bis 162, 170, 171, 172, 174 und 177 bis 180, bestimmt wird.
7. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 18 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 2, 7, 8, 12, 19, 21, 25, 33, 38, 41, 45, 49, 50, 51, 54, 66, 68, 70, 122, 124 und 136 bis 140, bestimmt wird.
8. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5 und 6, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 18 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 25, 41, 68, 78, 83, 85, 86, 92, 99, 101, 103, 104, 105, 109, 112, 114, 115, 118, 136 bis 138, 157, 159 bis 162, 170 bis 172, 174 und 177 bis 180, bestimmt wird.
9. Verfahren zur Erkennung eines kolorektalen Karzinoms nach einem der Anspüche 1 bis 8, bei dem das Expressionsprofil von mindestens einem der drei Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 25, 41, 68 und 136 bis 138, bestimmt wird.
10. Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem das Expressionsniveau oder Expressionsprofil in einer Probe eines primären kolorektalen Karzinoms von mindestens zwei der 120 Gene ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NOs: 1 bis 181 bestimmt und mit dem Expressionsniveau in Lebeπnetastasen und/ oder in Lebergewebe verglichen wird.
11. Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2 und 10, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 72 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 72 oder 121 bis 156, bestimmt wird.
12. Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2 und 10, bei dem das Expressionsprofll von mindestens zwei Genen von 55 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 73 bis 120, 136, 137, 138, 153, 154, 155 und 157 bis 181, bestimmt wird.
13. Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2 und 10, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 22 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71, 72, 74, 109, 125, 133, 134, 135, 151, 152, 156 und 177, bestimmt wird.
14. Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2, 10, 11 und 13, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 20 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 17, 19, 20, 22, 26, 29, 30, 31, 33, 35, 37, 40, 48, 58, 59, 64, 66, 69, 71, 72, 125, 133, 134, 135, 151, 152 und 156, bestimmt wird.
15. Verfahren zur Prädiktion von Metastasen in Abhängigkeit eines primären kolorektalen Karzinoms nach einem der Ansprüche 1, 2, 10, 12 und 13 bei dem das Expressionsprofil von mindestens einem der beiden Markergene, wie definiert in den SEQ ID NOs: 74, 109 und 177, bestimmt wird.
16. Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil- haltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem das Expressionsniveau/ Expressionsprofil in einer Probe einer Metastase mindestens zweier der 120 Gene ausgewählt aus der Gruppe der SEQ ID NO: 1 bis 181 bestimmt und mit dem Expressionsniveau von Respondern und/ oder Non-Respondern verglichen wird.
17. Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil- haltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1, 2 und 16 bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 72 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 1 bis 72 oder 121 bis 156, bestimmt wird.
18. Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil- haltige Chemotherapie nach einem der Ansprüchen 1, 2 und 16, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 55 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 73 bis 120, 136, 137, 138, 153, 154, 155, und 157 bis 181, bestimmt wird.
19. Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil- haltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1, 2 und 16, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 34 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 10, 13, 14, 24, 25, 41, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 63, 65, 66, 68, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117, 120, 122, 136 bis 147, 151 bis 155, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181, bestimmt wird.
20. Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil- haltige Chemotherapie nach nach einem der Ansprüche 1, 2, 16 und 19, bei dem das Expressionsprofil von mindestens zwei Genen von 28 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 6, 7, 8, 13, 24, 45, 46, 48, 52, 54, 60, 61, 65, 66, 73, 78, 79, 80, 89, 97, 98, 101, 104, 107, 108, 116, 117, 120, 122, 139 bis 147, 151, 152, 157, 167, 168, 169, 171, 172, 176 und 181, bestimmt wird.
21. Verfahren zur Prädiktion des Ansprechens von Metastasen auf eine 5-Fluorouracil- haltige Chemotherapie nach einem der Ansprüche 1, 2, 16 bis 19, bei dem das Expressionsprofil von mindestens einem Gen von 7 Markergenen, wie definiert in den SEQ ID NOs: 10, 14, 25, 41, 52, 63, 68, 136, 137, 138, 153, 154, 155, bestimmt wird.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, bei dem die Bestimmung des (Gen-) Expressionsprofils die Bestimmung mindestens eines Markergens umfasst, das mindestens 60 % homolog zu einem der in SEQ ID NO: 1 bis 120 dargestellten Markergene ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, wobei das Expressionsprofil der Markergene aus einer Probe des Patienten gewonnen wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Probe ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gewebsbiopsie, peritoneal Flüssigkeit, Blut, Urin, Serum und Stuhl.
25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Expressionsprofil der Markergene durch die Messung der Quantität an Markergen-mRNA bestimmt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Quantität von Markergen-mRNA mittels Genchiptechnologie, (RT-) PCR, Northern Hybridisierung, Dot-Blotting oder in situ Hybridisierung bestimmt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Expressionprofil der Markergene durch die Messung der Polypeptidquantität der Markergene bestimmt wird.
28. Verfahren nach Ansprach 27, wobei die Polypeptidquantität der Markergene durch ELISA, RIA, (Immuno-) Blotting, FACS oder immunhistochemische Methoden bestimmt wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 28, das die folgenden Schritte umfasst:
(a) Erstellen des Genexpressionsprofils, wie in einem der Ansprüche 1 bis 28 definiert, in einer Patientenprobe; und
(b) Bestimmen mit Hilfe des in (a) erstellten Genexpressionsprofils, ob der Patient i. an einem kolorektalen Karzinom leidet; ii. als Folge eines kolorektalen Karzinoms Metastasen aufweist; und/oder iii. auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie der Metastasen anspricht.
30. Kit zur Durchführung der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 29, wobei das Kit spezifische (Nukleotid-) Sonden, Primer (-paare), Antikörper, Aptamere zur Bestimmung von mindestens zwei von 120 Markergenen, die in SEQ ID NO: 1 bis 181 dargestellt sind, oder zur Bestimmung von mindestens zwei Genprodukten die von den 120 Markergenen, die in SEQ DD NO: 1 bis 181 codiert werden, umfasst.
31. Kit nach Ansprach 30, der ein diagnostisches Kit ist.
32. Verwendung mindestens eines der 120 Markergene oder einer Gruppe dieser 120
Markergene, dargestellt in SEQ ID NO: 1 bis 181 zur Bestimmung, ob der Patient (a) an einem kolorektalen Karzinom leidet;
(b) als Folge eines kolorektalen Karzinoms Metastasen aufweist; und/oder
(c) auf eine 5-FU-haltige Chemotherapie der Metastasen anspricht.
33. Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres, das eines oder mehrere der in Anspruch 1 definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel.
34. Verwendung einer transgenen Zelle, die eines oder mehrere der in Anspruch 1 definierten Markergene über- oder unterexprimiert in einem Durchmusterungs¬ verfahren für Arzneimittel.
35. Verwendung eines transgenen nicht-menschlichen Tieres gemäß Anspruch 33 oder einer transgenen Zelle gemäß Anspruch 34, in einem Durchmusterungsverfahren für Arzneimittel zur Behandlung von kolorektalen Karzinomen; und/ oder Metastasen.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2, 10 bis 21 und 29 und Verwendung nach Anspruch 32 und 35, wobei die Metastasen Lebermetastasen sind.
PCT/EP2005/008274 2004-08-04 2005-07-29 Tumormarker zur diagnose von kolorektalen karzinomen und/oder davon abstammender metastasen WO2006015742A2 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05777075A EP1776475A2 (de) 2004-08-04 2005-07-29 Tumormarker zur diagnose von karzinomen und/oder davon abstammender metastasen
US11/659,250 US20080311567A1 (en) 2004-08-04 2005-07-29 Tumor Markers for Use in the Diagnosis of Colorectal Carcinomas and/or Metastases Originating Therefrom

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102004037860A DE102004037860A1 (de) 2004-08-04 2004-08-04 Turmormarker zur Diagnose von Karzinomen und/oder davon abstammender Metastasen
DE102004037860.6 2004-08-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2006015742A2 true WO2006015742A2 (de) 2006-02-16
WO2006015742A3 WO2006015742A3 (de) 2006-07-13

Family

ID=35207558

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2005/008274 WO2006015742A2 (de) 2004-08-04 2005-07-29 Tumormarker zur diagnose von kolorektalen karzinomen und/oder davon abstammender metastasen

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20080311567A1 (de)
EP (1) EP1776475A2 (de)
DE (1) DE102004037860A1 (de)
WO (1) WO2006015742A2 (de)

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009037572A2 (en) * 2007-06-04 2009-03-26 Diagnoplex Biomarker combinations for colorectal cancer
WO2009132909A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh A method for predicting a clinical response of a patient suffering from or at risk of developing cancer towards a given mode of treatment
JP2009539082A (ja) * 2006-06-02 2009-11-12 アトラス・アンティボディーズ・アクチボラゲット 結腸直腸癌のためのマーカーとしてのタンパク質ｓａｔｂ２の使用
EP2169078A1 (de) 2008-09-26 2010-03-31 Fundacion Gaiker Verfahren und Kits zur Diagnose und Abstufung von Kolorektalkrebs
EP2223121A1 (de) * 2007-12-20 2010-09-01 Index Diagnostics AB (publ) Verfahren und kit zur verwendung bei der differenzierung von ibd und ibs und der weiteren unterscheidung zwischen ibd-krankheitstypen
US20100233719A1 (en) * 2006-03-03 2010-09-16 University Of Southern California Genetic Markers for Predicting Disease and Treatment Outcome
ES2367285A1 (es) * 2010-04-12 2011-11-02 Dominion Pharmakine, Sl Conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal y kit para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal.
EP2463659A1 (de) * 2010-12-13 2012-06-13 Université de Liège Biomarker für die Krebsdiagnose
US8420788B2 (en) 2008-10-06 2013-04-16 Atlas Antibodies Ab Epitopes derived from SATB2 and uses thereof
WO2013064163A1 (en) * 2011-11-01 2013-05-10 Academisch Medisch Centrum Methylation markers for colorectal cancer
WO2013092960A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Fundacion Gaiker Methods and kits for the diagnosis of colorectal cancer
JP2014073132A (ja) * 2008-06-03 2014-04-24 Sumitomo Chemical Co Ltd 化学物質が有する発生毒性の予測方法
WO2018078142A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Means and methods for determining efficacy of fluorouracil (5-fu) in colorectal cancer (crc) therapy
CN108064273A (zh) * 2015-01-30 2018-05-22 深圳华大基因研究院 结直肠癌相关疾病的生物标志物

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006271880A1 (en) * 2005-07-21 2007-01-25 Stichting Katholieke Universiteit Plexin D1 as a target for tumor diagnosis and therapy
EP2546365B1 (de) * 2008-09-03 2016-11-09 The Johns Hopkins University Genetische Veränderungen bei Isocitrat-dehydrogenase und anderen Genen bei malignem Gliom
EP2270510A1 (de) * 2009-07-02 2011-01-05 EMBL (European Molecular Biology Laboratory) Diagnoseverfahren zur Vorhersage des Krebsrekurrenzrisikos basierend auf Histon-macroH2A-Isoformen
US9562906B2 (en) 2010-06-10 2017-02-07 National University Of Singapore Methods for detection of gastric cancer
JP5548872B2 (ja) * 2010-08-26 2014-07-16 株式会社島津製作所 大腸がん肝転移マーカー、及び試料中の大腸がん肝転移マーカーの分析方法
ES2942585T3 (es) * 2012-04-26 2023-06-02 Stichting Vumc Biomarcadores
DE102013202183A1 (de) * 2013-02-11 2014-08-14 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zum Anfärben von Zellproben für die Mikroskopie
JP2018517892A (ja) 2015-04-10 2018-07-05 アプライド プロテオミクス，インク． 結腸直腸癌と進行腺腫を検知するためのタンパク質バイオマーカーパネル
CN112646878A (zh) * 2021-01-22 2021-04-13 丁建强 血清中用于肝脏损伤疾病早期诊断的分子标记物
CN112746104A (zh) * 2021-01-22 2021-05-04 丁建强 血清中用于肝脏损伤疾病早期诊断的分子标记物
WO2023021330A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 University Of Oslo Compositions and methods for determining a treatment course of action

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999060161A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Diadexus Llc A novel method of diagnosing, monitoring, and staging colon cancer
WO2000022130A2 (en) * 1998-10-15 2000-04-20 Chiron Corporation Metastatic breast and colon cancer regulated genes
WO2002012332A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20030008284A1 (en) * 2000-06-15 2003-01-09 Giulia Kennedy Polynucleotides related to colon cancer
US20030148314A1 (en) * 2001-08-01 2003-08-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of colon cancer
US20040146921A1 (en) * 2003-01-24 2004-07-29 Bayer Pharmaceuticals Corporation Expression profiles for colon cancer and methods of use

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4736866A (en) * 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999060161A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Diadexus Llc A novel method of diagnosing, monitoring, and staging colon cancer
WO2000022130A2 (en) * 1998-10-15 2000-04-20 Chiron Corporation Metastatic breast and colon cancer regulated genes
US20030008284A1 (en) * 2000-06-15 2003-01-09 Giulia Kennedy Polynucleotides related to colon cancer
WO2002012332A2 (en) * 2000-08-07 2002-02-14 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20030148314A1 (en) * 2001-08-01 2003-08-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of colon cancer
US20040146921A1 (en) * 2003-01-24 2004-07-29 Bayer Pharmaceuticals Corporation Expression profiles for colon cancer and methods of use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1776475A2 *

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100233719A1 (en) * 2006-03-03 2010-09-16 University Of Southern California Genetic Markers for Predicting Disease and Treatment Outcome
US8067190B2 (en) 2006-06-02 2011-11-29 Atlas Antibodies Ab Use of protein SATB2 as a marker for colorectal cancer
JP2009539082A (ja) * 2006-06-02 2009-11-12 アトラス・アンティボディーズ・アクチボラゲット 結腸直腸癌のためのマーカーとしてのタンパク質ｓａｔｂ２の使用
US8465934B2 (en) 2006-06-02 2013-06-18 Atlas Antibodies Ab Use of protein SATB2 as a marker for colorectal cancer
EP2211180A1 (de) 2006-06-02 2010-07-28 Atlas Antibodies AB Verwendung des Proteins SATB2 als Marker für kolorektale Karzinome
US8241859B2 (en) 2006-06-02 2012-08-14 Atlas Antibodies Ab Use of protein SATB2 as a marker for colorectal cancer
JP2012073260A (ja) * 2006-06-02 2012-04-12 Atlas Antibodies Ab 結腸直腸癌のためのマーカーとしてのタンパク質ｓａｔｂ２の使用
US8697350B2 (en) 2007-06-04 2014-04-15 Diagnoplex Biomarker combinations for colorectal cancer
WO2009037572A3 (en) * 2007-06-04 2009-11-26 Diagnoplex Biomarker combinations for colorectal cancer
WO2009037572A2 (en) * 2007-06-04 2009-03-26 Diagnoplex Biomarker combinations for colorectal cancer
CN101971033A (zh) * 2007-06-04 2011-02-09 戴诺普雷克斯公司 用于结直肠癌的生物标志物组合
JP2011517765A (ja) * 2007-06-04 2011-06-16 ダイアグノプレックス エセアー 結腸直腸癌のためのバイオマーカの組み合わせ
EP2223121A1 (de) * 2007-12-20 2010-09-01 Index Diagnostics AB (publ) Verfahren und kit zur verwendung bei der differenzierung von ibd und ibs und der weiteren unterscheidung zwischen ibd-krankheitstypen
EP2223121A4 (de) * 2007-12-20 2010-12-29 Index Diagnostics Ab Publ Verfahren und kit zur verwendung bei der differenzierung von ibd und ibs und der weiteren unterscheidung zwischen ibd-krankheitstypen
EP2562544A1 (de) * 2007-12-20 2013-02-27 InDex Diagnostics AB Kit zur Verwendung bei der Differenzierung von IBD und IBS und der weiteren Unterscheidung zwischen IBD-Krankheitstypen
WO2009132909A1 (en) * 2008-04-29 2009-11-05 Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh A method for predicting a clinical response of a patient suffering from or at risk of developing cancer towards a given mode of treatment
JP2014073132A (ja) * 2008-06-03 2014-04-24 Sumitomo Chemical Co Ltd 化学物質が有する発生毒性の予測方法
US9783852B2 (en) 2008-06-03 2017-10-10 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for assessing embryotoxicity
EP2169078A1 (de) 2008-09-26 2010-03-31 Fundacion Gaiker Verfahren und Kits zur Diagnose und Abstufung von Kolorektalkrebs
US8420788B2 (en) 2008-10-06 2013-04-16 Atlas Antibodies Ab Epitopes derived from SATB2 and uses thereof
ES2367285A1 (es) * 2010-04-12 2011-11-02 Dominion Pharmakine, Sl Conjunto de marcadores para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal y kit para la detección de metástasis hepática de cáncer colorrectal.
WO2012079978A1 (en) 2010-12-13 2012-06-21 Universite De Liege Biomarkers, uses of biomarkers and a method of identifying biomarkers for colorectal carcinoma (crc) liver metastasis
EP2463659A1 (de) * 2010-12-13 2012-06-13 Université de Liège Biomarker für die Krebsdiagnose
WO2013064163A1 (en) * 2011-11-01 2013-05-10 Academisch Medisch Centrum Methylation markers for colorectal cancer
WO2013092960A1 (en) 2011-12-22 2013-06-27 Fundacion Gaiker Methods and kits for the diagnosis of colorectal cancer
CN108064273A (zh) * 2015-01-30 2018-05-22 深圳华大基因研究院 结直肠癌相关疾病的生物标志物
WO2018078142A1 (en) 2016-10-28 2018-05-03 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Means and methods for determining efficacy of fluorouracil (5-fu) in colorectal cancer (crc) therapy

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006015742A3 (de) 2006-07-13
DE102004037860A1 (de) 2006-03-16
US20080311567A1 (en) 2008-12-18
EP1776475A2 (de) 2007-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2006015742A2 (de) Tumormarker zur diagnose von kolorektalen karzinomen und/oder davon abstammender metastasen
EP3237638B1 (de) Therapeutisches, diagnostisches und prognostisches verfahren für blasenkrebs
TWI585411B (zh) 檢測膀胱癌之尿液標記物
EP3520775A1 (de) Verfahren zur behandlung von krebs und zur vorhersage der arzneimittelreaktion bei krebspatienten
JP5971769B2 (ja) アントラサイクリン療法を用いて乳癌を処置する方法
CA3056896A1 (en) Genomic stability profiling
Shin et al. Addressing the challenges of applying precision oncology
CA2838736A1 (en) Molecular profiling for cancer
Tura et al. Analysis of monosomy‐3 in immunomagnetically isolated circulating melanoma cells in uveal melanoma patients
Chng et al. Gene expression profiling of pulmonary mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma identifies new biologic insights with potential diagnostic and therapeutic applications
WO2020081414A1 (en) Methods for the treatment of solid tumor cancers using illudins and biomarkers
EP3186394B1 (de) Nachweis von melanomen
Naskou et al. EZH2 loss drives resistance to carboplatin and paclitaxel in serous ovarian cancers expressing ATM
Chan et al. A retrospective study investigating the rate of HER2 discordance between primary breast carcinoma and locoregional or metastatic disease
WO2010015538A2 (en) Predictive marker for egfr inhibitor treatment
EP2092087B1 (de) Prognostische marker für die klassifizierung von kolorektalen karzinomen basierend auf expressionsprofilen von biologischen proben
Bartram et al. Characterization of a splice-site mutation in the tumor suppressor gene FLCN associated with renal cancer
US20230160016A1 (en) Methods of selecting a treatment for cancer patients
Takaoka et al. ELF3 overexpression as prognostic biomarker for recurrence of stage II colorectal cancer
EP2568290B1 (de) Verfahren zur Vorhersage diffuser großer B-Zellen-Lymphome
EP2732287B1 (de) Verfahren zur Prognose von chronischer lymphozytischer Leukämie
JP2011520456A (ja) 抗癌療法に対する応答を予測するための組み合わせ方法
Di Leo et al. An ITMO group study on second-line treatment in advanced epithelial ovarian cancer: an attempt to identify clinical and biological factors determining prognosis
JP2006518031A (ja) ガンの予測および予後、ならびにガン治療を監視するための方法
DE102007048636B4 (de) Marker zur Diagnose von Krebs

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU LV MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005777075

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005777075

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 11659250

Country of ref document: US