WO2006003183A1 - Peptides for blocking fviii inhibitors - Google Patents

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WO2006003183A1
WO2006003183A1 PCT/EP2005/053139 EP2005053139W WO2006003183A1 WO 2006003183 A1 WO2006003183 A1 WO 2006003183A1 EP 2005053139 W EP2005053139 W EP 2005053139W WO 2006003183 A1 WO2006003183 A1 WO 2006003183A1
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Definitions

  • inhibitors [5,6] Antibodies that form against the coagulation factor VIII and impair biological activity are called inhibitors [5,6], These
  • X 8 K, W or Y
  • the peptides of the invention may be modified at the N and / or C-terminus of the amino acid sequence with groups which delay degradation of the peptide. Furthermore, the peptides listed under points a) -e) are claimed, provided that they are composed of the amino acids in the corresponding D configuration.
  • the manufacturing technology is established and is accepted for the production of drugs, the small size of the peptides promises low immune responses, only the affected patient population must be treated,) - if it turns out that antibodies to different epitopes must be blocked, a variety of substances can be made available and that only minor side effects are to be expected.
  • the detection method chosen is the chemiluminescence measurement, which is characterized by its high sensitivity.
  • Either anti-human IgG peroxidase (secondary antibody system) or streptavidin-peroxidase (biotin-streptavidin system) can be used as the conjugate.
  • biotin-streptavidin system the inhibitor antibodies are directly labeled with biotin, thereby bypassing nonspecific signals that may be caused by the secondary antibody. Biotin labeling is carried out by means of NHS-activated biotin via free amino groups of the antibodies.
  • the peptides of the invention were tested for displacement of inhibitors by liquid phase displacement assays.
  • microtiter plates are coated with FVIII and then incubated with a mixture of inhibitor IgG and increasing peptide concentrations.
  • the detection of bound inhibitors takes place with peroxidase-bound conjugate and chemiluminescence measurement.
  • IC 50 is used as a measure for comparing the individual peptides. This is the peptide concentration at which 50% of the inhibitors can be displaced.
  • Peptides with the strongest displacement effect (IC 50 as low as possible) are chosen and conjugated with polyethylene glycol. This step should be followed by re-running the displacement assay to ensure that PEGylated peptides are still biologically active.
  • the peptides were tested for their effect in displacement tests. Since interesting peptides should have the broadest possible spectrum of activity, i. To block different inhibitors, they were tested with several inhibitor sera.
  • the peptides Sl / 173 ( Figure 16), Sl / 139 ( Figure 17) and Sl / 151 ( Figure 18) show displacing action on the inhibitors, followed by aggregation.
  • Peptide Sl / 173 displaces inhibitors 5 and 6 in a concentration range of 0.05-0.1 mg / ml.
  • Peptide Sl / 139 points to inhibitors 1 and 6 in> concentration range 0.025-0.5 mg / ml displacement effect and peptide Sl / 151 displaces inhibitor 6 between 0.05 and 0.1 mg / m! Peptide. The displacement becomes visible through decreasing bond strength.

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Abstract

The invention relates to the use of a peptide comprising between 8 and 15 amino acids for blocking the effect of FVIII inhibitors, the amino acid sequence simultaneously containing the following amino acids: at least two Tyr; at least one amino acid that carries a positive or negative total charge number under physiological conditions; at least one amino acid comprising a hydrophobic aromatic radical; an amino acid selected from the group consisting of Pro, Arg, Tyr or Phe, on the N-terminal end; and Asp, Phe, Arg, Lys or His on the C-terminal end. The amino acid sequence does not contain any Cys and/or Val-Val.

Description

Peptide zur Blockierung von FVIII-Inhibitoren Peptides for blocking FVIII inhibitors
Ca 35 % der Hämophilie A Patienten mit großen Gendeletionen, Geninversionen und Stopmutationen entwickeln Autoantikörper und Alloantikörper gegen Blutgerinnungsfaktor VIII (FVIII) [l,2],die auch Inhibitoren genannt werden, weil sie die biologische Aktivität von FVIII beeinträchtigen. Dies führt dazu, dass die Substitutionstherapie mit FVIII aus Plasma oder rekombinanten FVIIIAbout 35% of hemophilia A Patients with large gene deletions, geninases, and stop mutations develop autoantibodies and allo-antibodies to coagulation factor VIII (FVIII) [1,2], also called inhibitors, because they affect the biological activity of FVIII. This leads to substitution therapy with FVIII from plasma or recombinant FVIII
(rFVIII) nicht mehr wirkt. Weiters wird immer häufiger beobachtet, dass(rFVIII) no longer works. Furthermore, it is increasingly observed that
Patienten mit normalem Gerinnungsstatus Autoantikörper gegen FVIII entwickeln [3]. Die Gruppe der spontanen Inhibitorpatienten ist ebenfalls sehr schwer zu therapieren.Patients with normal coagulation status develop autoantibodies to FVIII [3]. The group of spontaneous inhibitor patients is also very difficult to treat.
FVIII ist ein Protein, das aus 2332 Aminosäuren besteht, und als Kofaktor für den aktivierten Faktor IX in der eigentlichen Blutgerinnungskaskade wirkt. FVIII ist aus 6 Domänen mit der Anordnung A1-A2-B-A3-C1-C2 aufgebaut. Die Al und A2 Domäne stellen die leichte Kette dar, die A3-C1-C2 Domänen die schwere Kette. Die Funktion der B-Domäne ist nicht bekannt. FVIII liegt als Komplex mit dem von Willebrand Faktor (vWF) vor [4],FVIII is a protein that consists of 2332 amino acids and acts as a cofactor for the activated factor IX in the blood clotting cascade itself. FVIII is composed of 6 domains with the arrangement A1-A2-B-A3-C1-C2. The Al and A2 domains represent the light chain, the A3-C1-C2 domains the heavy chain. The function of the B domain is unknown. FVIII is a complex with von Willebrand factor (vWF) [4],
Hämophilie A ist eine X-Chromosomen-abhängige rezessive Krankheit, die durch Abwesenheit oder unzureichende Mengen an funktionellen FVIII charakterisiert ist und sich in Blutungen in Gelenken, Muskeln und weichen Geweben niederschlägt. Patienten mit weniger als 1% an normalen funktionellen FVIII werden als schwere Hämophile bezeichnet und repräsentieren ca. 50% des Patientenkollektives. 10% des Patientenkollektives haben einen funktionellen FVIII-Spiegel von 1-5% des Normalwertes und werden als mittelschwer eingestuft. Der Rest, die Patienten mit milder Hämophilie, haben eine FVIII- Aktivität im Bereich von 5-30% des Normalwertes. Der derzeitige Stand der Therapie ist die Substitutionstherapie mit FVIII aus Plasma oder rekombinantem FVIILHemophilia A is an X-chromosome-dependent recessive disease characterized by the absence or inadequate levels of functional FVIII, which results in bleeding in joints, muscles and soft tissues. Patients with less than 1% normal functional FVIII are referred to as severe hemophilia and represent approximately 50% of the patient population. 10% of the patient population has a functional FVIII level of 1-5% of normal and is considered moderate. The remainder, the patients with mild hemophilia, have an FVIII activity in the range of 5-30% of normal. The current state of therapy is substitution therapy with FVIII from plasma or recombinant FVIIL
Antikörper die sich gegen den Blutgerinnungsfaktor VIII bilden und die biologische Aktivität beeinträchtigen werden Inhibitoren genannt [5,6], DieseAntibodies that form against the coagulation factor VIII and impair biological activity are called inhibitors [5,6], These
Antikörper gehören der Klasse IgG an und haben ein physiologisch normales Subklassenprofil [7]. Die Frage stellt sich, ob sich die Inhibitoren gegen eine bestimmte Domäne richten oder zufällig ein Bereich im FVIII-Molekül betroffen ist (Tabelle 1). Letzte Untersuchungsergebnisse deuten darauf hin, dass Inhibitoren vermehrt gegen bestimmte Domänen gerichtet sind, obwohl man früher der Meinung war, dass Inhibitoren an allen verfügbaren Stellen angreifen.Antibodies belong to the class IgG and have a physiologically normal subclass profile [7]. The question arises whether the inhibitors against a certain domain or coincidentally an area in the FVIII molecule is affected (Table 1). Recent findings indicate that inhibitors are increasingly targeted against specific domains, although inhibitors were previously thought to attack at all available sites.
Tabelle 1: Zusammenfassung der Epitope von FVIII-In hibitoren.Table 1: Summary of epitopes of FVIII inhibitors.
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*) Hat keine Auswirkungen auf den Gerinnungstatus, weil FVIII ohne B-Domäne aktiv ist.*) Does not affect coagulation status because FVIII is active without B domain.
Man glaubte auch, dass Inhibitoren gegen denaturierte Bestandteile des FVIII gebildet werden und Substitutionstherapie mit FVIII schlechter Qualität die Inhibitorenbildung provoziert. Von dieser These ist man mittlerweile abgekommen. Auch bei der Substitutionstherapie mit hochreinem FVIII wurde die Inhibitorbildung in gleicher Frequenz wie bei der Substitutionstherapie mit Plasma-FVIII beobachtet. Vermehrt werden Inhibitoren gegen FVIII- Mutanten, Punktmutation und im Besonderen Deletionen gebildet [2]. Es zeigt sich auch, dass Inhibitoren gegen den FVIII-vWF Komplex eine geringere Affinität haben [17] Dies wird durch sterische Behinderung erklärt. Es wurde auch die Hypothese aufgestellt, dass der FVIII-vWF Komplex die Immunogenität moduliert [18]. Weiters wird vermehrt beobachtet, dass Patienten mit normalem Gerinnungsstatus, die nie mit heterologem FVIII in Kontakt waren spontan Inhibitoren bilden [3], und dass im Serum gesunder Patienten Antikörper gegen FVIII vorhanden sind [3,19-26]. Heute ist man geneigt, die Inhibitorbildung als eine Autoϊmmunkrankheit anzusehen [2]. Man versucht nicht nur die Epitope der Inhibitoren zu erfassen, sondern auch durch Untersuchung der DNA-Sequenzen und der Art wie der Antikörper aufgebaut ist auf den Mechanismus der Inhibitorbiidung rückzuschließen.It was also believed that inhibitors are formed against denatured components of FVIII and replacement therapy with poor quality FVIII provokes inhibitor formation. From this thesis one has meanwhile strayed. Also in the replacement therapy with high-purity FVIII inhibitor formation was observed in the same frequency as in the substitution therapy with plasma FVIII. There are increasing numbers of inhibitors against FVIII mutants, point mutations and in particular deletions [2]. It is also shown that inhibitors against the FVIII-vWF complex have a lower affinity [17]. This is explained by steric hindrance. It has also been hypothesized that the FVIII-vWF complex modulates immunogenicity [18]. Furthermore, it is increasingly observed that patients with normal coagulation status who were never in contact with heterologous FVIII spontaneously form inhibitors [3] and that antibodies to FVIII are present in the serum of healthy patients [3,19-26]. Today, one is inclined to view the inhibitor formation as an autoimmune disease [2]. One tries not only to capture the epitopes of the inhibitors, but also by studying the DNA sequences and the way the antibody is constructed to infer the mechanism of inhibitor formation.
Derzeit werden Patienten mit AiIo- und Autoantikörpern gegen FVIII durch Präparatwechsel, Gabe von tierischem FVIII oder auftretende. Blutungen mit Gerinnungsfaktor FVIIa behandelt (Tabelle 2). Es gibt auch Ansätze, Patienten mit antiidiotypischen Antikörpern gegen Inhibitoren zu immunisieren. Diese Antikörper haben ähnlich strukturelle Eigenschaften wie die Epitope am FVIII- Molekül und können somit die Inhibitoren blockieren. Bei anderen Therapiekonzepten versucht man mit "non-depleting" anti-CD4(+) Antikörpern oder CD20(+) Antikörpern (ReFuximab) die Immunantwort zu modulieren [27- 29]. Dieses Konzept ist aber erst im Versuchsstadium. Die gemeinsame Verabreichung von Gerinnungsfaktoren und anti-CD4 Antikörpern verringerte signifikant das Auftreten von Inhibitoren. Konventionelle Immunsuppressiva wurden auch zur Therapie von Inhibitorpatiervten eingesetzt. Dies stellt aber eine große Belastung dar. Eine andere Methode ist die Gabe von intravenösem Immunglobulin, das antiidiotypische Antikörper gegen FVIII-Inhibitoren enthält [3].Currently, patients with AiIo and autoantibodies to FVIII by drug switching, administration of animal FVIII or occurring. Bleeding with coagulation factor FVIIa treated (Table 2). There are also approaches to immunize patients with anti-idiotypic antibodies to inhibitors. These antibodies have similar structural properties to the epitopes on the FVIII molecule and thus can block the inhibitors. In other therapy concepts, one attempts to modulate the immune response with "non-depleting" anti-CD4 (+) antibodies or CD20 (+) antibodies (reFuximab) [27-29]. This concept is only in the experimental stage. Co-administration of coagulation factors and anti-CD4 antibodies significantly reduced the occurrence of inhibitors. Conventional immunosuppressants have also been used to treat inhibitory patients. However, this is a major burden. Another method is the administration of intravenous immunoglobulin containing anti-idiotypic antibodies against FVIII inhibitors [3].
Die Therapie konzepte versuchen entweder (I) FVIII zu ersetzen, (II) die entstandenen Antikörper zu blockieren oder (III) den Immunantwort zu modulieren (Tabelle 2).The therapy concepts either (I) replace FVIII, (II) block the resulting antibodies or (III) modulate the immune response (Table 2).
Die Suppression der Immunantwort wäre zwar die eleganteste Methode, weil man Antikörper gar nicht entstehen lässt, diese Therapie ist aber mit großen Nebenwirkungen verbunden. Die Gabe antiidiotypischer Antikörper scheint aufs erste attraktiv, weil ebenfalls eine körpereigene Modulation des Immunresponses aktiviert wird, besser ist es über Vakzinierung antiidiotypische Antikörper zu induzieren. Zu bedenken ist aber, dass kreuzreaktive Antikörper induziert werden können, die zu extrem schweren Nebenwirkungen führen können und dass bei erfolgreicher Komplexierung der Inhibitoren eine Glomerulonephritis (die Verstopfung der Nierenkanälchen) auftreten kann. Tabelle 2: Behandlungsmöglichkeiten und Therapiekonzepte für AIIo- und Autoantikörper gegen FVIII.The suppression of the immune response would be the most elegant method because it does not give rise to antibodies, but this therapy is associated with major side effects. The administration of anti-idiotypic antibodies seems attractive at first because a body-specific modulation of the immune response is also activated, it is better to induce by vaccination antiidiotypic antibodies. However, it must be remembered that cross-reactive antibodies can be induced which can lead to extremely serious side effects and that, if the inhibitors have successfully complexed, glomerulonephritis (blockage of renal tubules) can occur. Table 2: Treatment options and therapy concepts for AIIo and autoantibodies against FVIII.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Peptide bereitzustellen, die in der Lage sind, den Inhibitor zu blockieren, ohne die eingangs erwähnten Nachteile zu bewirken. Die erfindungsgemäßen Peptide sollen eine Immunisierung auslösen, damit antiidiotypische Antikörper einen Langzeitschutz gewährleisten.The object of the present invention is to provide peptides which are capable of blocking the inhibitor, without causing the disadvantages mentioned above. The peptides according to the invention are intended to trigger an immunization so that anti-idiotypic antibodies ensure long-term protection.
Beschreibung der ErfindungDescription of the invention
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Peptide mit der Fähigkeit,The present invention relates to peptides having the ability to
Inhibitorantikörper gegen Blutgerinnungsfaktor VIII zu blockieren bzw. aus demBlock inhibitor antibodies against blood coagulation factor VIII or from the
Komplex zwischen Faktor VIII und Inhibitorantikörper zu verdrängen.Displacing complex between factor VIII and inhibitor antibody.
Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Peptids zur Blockierung der Wirkung von FVIII Inhibitoren, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, S - am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.The invention relates to the use of a peptide for blocking the action of FVIII inhibitors, wherein the peptide comprises eight to fifteen amino acids and the following amino acids must simultaneously be present in the amino acid sequence at least two Tyr, at least one amino acid carrying a positive or negative total charge under physiological conditions, at least one amino acid having a hydrophobic aromatic radical, S - an amino acid present at the N-terminal end selected from the group consisting of Pro, Arg , Tyr or Phe at the C-terminal end Asp, Arg, Lys, His or Phe is present, and no Cys and / or VaI-VaI occurs in the amino acid sequence.
3 Es kann bevorzugt sein, dass in der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz höchstens vier Tyr vorhanden sind. Darüber hinaus kann bevorzugt sein, dass die geladene Aminosäure unter physiologischen Bedingungen eine positive Ladung trägt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann es sich bei der positiv geladenen Aminosäure um Lys oder Arg handeln.It may be preferred that at most four Tyr are present in the amino acid sequence of the invention. In addition, it may be preferred that the charged amino acid carries a positive charge under physiological conditions. In a preferred embodiment of the invention, the positively charged amino acid may be Lys or Arg.
Die erfindungsgemäße Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest kann bevorzugt Trp und/oder Phe und/oder Tyr sein.The amino acid with hydrophobic aromatic radical according to the invention may preferably be Trp and / or Phe and / or Tyr.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Aminosäuresequenz ein Dekapeptid umfassen.In a further embodiment of the invention, the amino acid sequence may comprise a decapeptide.
Das erfindungsgemäße Peptid kann ausgewählt sein aus der Gruppe der Peptide mit der Seq. ID No. Sl/1-240, S2/1-131 und S3/1-128. Bevorzugt ist das Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq ID No. S3/58, Sl/238, S2/48, S2/35, S2/129, Sl/160, Sl/171, Sl/173.The peptide of the invention may be selected from the group of peptides with the Seq. ID No. Sl / 1-240, S2 / 1-131 and S3 / 1-128. Preferably, the peptide is selected from the group consisting of SEQ ID NO. S3 / 58, Sl / 238, S2 / 48, S2 / 35, S2 / 129, Sl / 160, Sl / 171, Sl / 173.
Darüber hinaus kann das erfindungsgemäße Peptid mit anderen Molekülen konjugiert sein, die eine Halbwertszeit in vivo verlängern. Beispiele für geeignete Moleküle sind hochmolekulares Polyethylenglycol, Dextran oder Agarose.In addition, the peptide of the invention may be conjugated to other molecules that prolong a half-life in vivo. Examples of suitable molecules are high molecular weight polyethylene glycol, dextran or agarose.
Ferner wird ein Peptid zur Blockierung der Wirkung von FVIII Inhibitoren beansprucht, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist ' aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.Furthermore, a peptide is claimed for blocking the action of FVIII inhibitors, wherein the peptide comprises eight to fifteen amino acids and in the amino acid sequence simultaneously the following amino acids must be present at least two Tyr, at least one amino acid which carries a positive or negative total charge under physiological conditions, at least one amino acid having a hydrophobic aromatic radical, at the N-terminal end an amino acid is present, which is ' selected from the group consisting of Pro, Arg, Tyr or Phe am C-terminal end Asp, Arg, Lys, His or Phe is present, and no Cys and / or VaI-VaI occurs in the amino acid sequence.
Bevorzugt werden Peptide mit den folgenden Strukturen beansprucht: a) Peptid mit der StrukturPreferably, peptides with the following structures are claimed: a) peptide having the structure
RHYX1X2X3X4X5HF mitRHYX 1 X 2 X 3 X 4 X 5 HF with
X1 = Q oder K X2 = Y oder Q X3 = N oder Y X4 = F oder Q X5 = Q oder F.X 1 = Q or KX 2 = Y or QX 3 = N or YX 4 = F or QX 5 = Q or F.
b) Peptid mit der Strukturb) peptide with the structure
X6X7X8X9X10X11YKYD mitX 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 YKYD with
X6 = P oder HX 6 = P or H
X7 = Y oder HX 7 = Y or H
X8 = K, W oder YX 8 = K, W or Y
5 X9 = Y, R, K oder V5 X 9 = Y, R, K or V
X10 = W oder TX 10 = W or T
X" = F oder Q.X "= F or Q.
c) Peptid mit der Struktur wie in b), mit X6 = P und X7 = Y undc) peptide having the structure as in b), with X 6 = P and X 7 = Y and
D X8 = K, W oder YDX 8 = K, W or Y
X9 = Y, R oder KX 9 = Y, R or K.
X10 = W oder TX 10 = W or T
X11 = F oder Q. d) Peptid mit der Struktur wie in b), mit X8 = K, X9 = Y, X10 = T und X11 = F sowie X6 = P oder H und X7 = Y oder H.X 11 = F or Q. d) peptide having the structure as in b), with X 8 = K, X 9 = Y, X 10 = T and X 11 = F and X 6 = P or H and X 7 = Y or H.
e) Peptid mit der Struktur wie in b), mit X10 = W und X11 = Q und X6 = P und X7 \ = Y sowiee) Peptide having the structure as in b), with X 10 = W and X 11 = Q and X 6 = P and X 7 \ = Y as well
X8 = W oder Y und .X 8 = W or Y and.
X9 = R oder K-X 9 = R or K
Die erfindungsgemäßen Peptide können am N- und/oder C-Terminus der ) Aminosäuresequenz mit Gruppen modifiziert sein, die einen Abbau des Peptids verzögern. Ferner werden die unter den Punkten a)-e) aufgeführten Peptide beansprucht, sofern sie aus den Aminosäuren in der entsprechenden D- Konfiguration aufgebaut sind.The peptides of the invention may be modified at the N and / or C-terminus of the amino acid sequence with groups which delay degradation of the peptide. Furthermore, the peptides listed under points a) -e) are claimed, provided that they are composed of the amino acids in the corresponding D configuration.
5 Die erfindungsgemäßen Peptide können in Arzneimitteln enthalten sein. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Peptide bei der Herstellung von Vakzinen verwendet werden.5 The peptides according to the invention can be contained in medicaments. In addition, the peptides of the invention can be used in the preparation of vaccines.
Schließlich wird ein Verfahren beansprucht, durch welches die D erfindungsgemäßen Peptide mittels chemischer oder gentechnischer Verfahren hergestellt werden können.Finally, a method is claimed, by which the D of the invention peptides can be prepared by chemical or genetic engineering methods.
Die erfindungsgemäßen Peptide stellen keine Teilsequenzen von FVIII selbst dar. Die erfindungsgemäßen Peptide scheinen die Epitope der Inhibitoren nachzuahmen, sind aber nicht mit diesen identisch. Dadurch besteht die Möglichkeit, Substanzen zu identifizieren, die nicht nur als Epitop gegen die Bindungsstelle eines Inhibitorantikörpers gerichtet sind, sondern eine Vielzahl unterschiedlicher FVIII-Inhibitoren blockieren können.The peptides of the invention are not partial sequences of FVIII itself. The peptides of the invention appear to mimic but are not identical to the epitopes of the inhibitors. Thereby, it is possible to identify substances that are not only directed as an epitope against the binding site of an inhibitor antibody, but can block a variety of different FVIII inhibitors.
Die Verwendung von relativ kleinen Peptiden, die die erfindungsgemäßen Peptide sind, hat den Vorteil, dass nur die Bindungsstelle der Inhibitoren blockiert wird, durch geeignetes Screening Substanzen mit breiterem Wirkungsspektrum gefunden werden können und somit ein einziges Peptid aufgefunden werden kann, das Inhibitorantikörper mit unterschiedlicher Epitoperkennung binden kann, eine Immunantwort nur gegen die Epitope der Inhibitoren zu erwarten ist und nicht gegen andere Teile, wie bei der konventionellen antiidiotypischen Vakzinierung,The use of relatively small peptides, which are the peptides of the invention, has the advantage that only the binding site of the inhibitors is blocked, by suitable screening substances with a broader spectrum of activity can be found and thus a single peptide can be found can bind the inhibitor antibody with different epitope recognition, an immune response is expected only against the epitopes of the inhibitors and not against other parts, as in the conventional anti-idiotypic vaccination,
- - die Herstellungstechnologie etabliert ist und für die Produktion von Arzneimitteln akzeptiert ist, die geringe Grosse der Peptide geringe Immunreaktionen verspricht, nur das betroffene Patientenkollektiv behandelt werden muss, ) - falls sich herausstellt, dass Antikörper unterschiedlichen Epitops blockiert werden müssen, eine Vielzahl von Substanzen zur Verfügung gestellt werden können und dass nur geringe Nebenwirkungen zu erwarten sind.- - the manufacturing technology is established and is accepted for the production of drugs, the small size of the peptides promises low immune responses, only the affected patient population must be treated,) - if it turns out that antibodies to different epitopes must be blocked, a variety of substances can be made available and that only minor side effects are to be expected.
> Rg. 1 zeigt die Struktur von α-Methoxy-ω-NHS-PEG (mPEG); PEG ist in unterschiedlichen Längen erhältlich.Figure 1 shows the structure of α-methoxy-ω-NHS-PEG (mPEG); PEG is available in different lengths.
Fig. 2 zeigt die Struktur von α-Methoxy-ω-NHS-PEG (mPEG); PEG ist in unterschiedlichen Längen erhältlich. )Fig. 2 shows the structure of α-methoxy-ω-NHS-PEG (mPEG); PEG is available in different lengths. )
Figur 3 zeigt das Chromatogramm einer Reinigung von IgG aus Humanserum mittels Protein A.FIG. 3 shows the chromatogram of a purification of IgG from human serum by means of protein A.
Figur 4 zeigt den Verlauf einer Reinigung von IgG über FVIII-Sepharose zur Gewinnung von Anti-FVIII-AntikÖrpern.Figure 4 shows the course of purification of IgG via FVIII-Sepharose to obtain anti-FVIII antibodies.
Figur 5 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 5 mit Peptid S2/129, IC50 914 μM.FIG. 5 shows the displacement curve of inhibitor 5 with peptide S2 / 129, IC 50 914 μM.
Figur 6 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 5 mit Peptid S2/35, IC50 79.22 μM.FIG. 6 shows the displacement curve of inhibitor 5 with peptide S2 / 35, IC 50 79.22 μM.
Figur 7 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 1 mit Peptid Sl/238, IC5O 20.94 μM. Figur 8 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 5 mit Peptid Sl/238 Serum 5, IC50 1.85 μM.Figure 7 shows the displacement curve of inhibitor 1 with peptide Sl / 238, IC 5 O 20.94 uM. FIG. 8 shows the displacement curve of inhibitor 5 with peptide Sl / 238 serum 5, IC 50 1.85 μM.
Figur 9 zeigt die Verdrängungskurve der Inhibitoren 1, 3 und 5 mit Peptid S S2/48.FIG. 9 shows the displacement curve of inhibitors 1, 3 and 5 with peptide S S2 / 48.
Figur 10 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor K3 mit Peptid Sl/238, IC50 401.78 μM.FIG. 10 shows the displacement curve of inhibitor K3 with peptide Sl / 238, IC 50 401.78 μM.
3 Figur 11 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor K4 mit Peptid Sl/238, IC50 402.73 μM.FIG. 11 shows the displacement curve of inhibitor K4 with peptide Sl / 238, IC 50 402.73 μM.
Figur 12 zeigt die Verdrängungskurve von A) Inhibitor 3 und B) Inhibitor 6 mit Peptid Sl/238. 5FIG. 12 shows the displacement curve of A) inhibitor 3 and B) inhibitor 6 with peptide Sl / 238. 5
Figur 13 zeigt die Verdrängungskurve von A) Inhibitor Kl und B) Inhibitor K2 mit Peptid Sl/238.FIG. 13 shows the displacement curve of A) inhibitor K1 and B) inhibitor K2 with peptide S1 / 238.
Figur 14 zeigt die Verdrängungskurve der Inhibitorantikörper 1, 3, 5 und 6 mit 0 Peptid S3/58.FIG. 14 shows the displacement curve of the inhibitor antibodies 1, 3, 5 and 6 with 0 peptide S3 / 58.
Figur 15 zeigt die Verdrängungskurve der Inhibitorantikörper Kl, K2, K3, und K4 mit Peptid S3/58.FIG. 15 shows the displacement curve of the inhibitor antibodies Kl, K2, K3, and K4 with peptide S3 / 58.
5 Figur 16 zeigt die Verdrängugskurve von A) Inhibitor 5 und B) Inhibitor 6 mit Peptid Sl/173.FIG. 16 shows the displacement curve of A) inhibitor 5 and B) inhibitor 6 with peptide S1 / 173.
Figur 17 zeigt die Verdrängungskurve von A) Inhibitor 1 und B) Inhibitor 6 mit Peptid Sl/139. 0FIG. 17 shows the displacement curve of A) inhibitor 1 and B) inhibitor 6 with peptide S1 / 139. 0
Figur 18 zeigt die Verdrängungskurve von Inhibitor 6 mit Peptid Sl/151.FIG. 18 shows the displacement curve of inhibitor 6 with peptide S1 / 151.
Figur 19 zeigt die Verdrängungskurve von mabO38 mit Peptid Sl/238; IC5O 35.78 μM.Figure 19 shows the displacement curve of mabO38 with peptide Sl / 238; IC 5 O 35.78 μM.
;5 Figur 20 zeigt die Verdrängungskurve von mabO38 mit Peptid Sl/160; IC50 38.72 μM. ; 5 Figure 20 shows the displacement curve of mabO38 with peptide Sl / 160; IC 50 38.72 μM.
Figur 21 zeigt die Verdrängungskurve von mabO38 mit Peptid S2/35. 5Figure 21 shows the displacement curve of mabO38 with peptide S2 / 35. 5
■Figur 22 zeigt die Verdrängungskurve von OBT0037 mit Peptid Sl/171. ■ Figure 22, the displacement curve of OBT0037 171 shows with peptide Sl /.
Figur 23 zeigt die Verdrängungskurve von ESH8 mit Peptid Sl/171.FIG. 23 shows the displacement curve of ESH8 with peptide Sl / 171.
D Figur 24 zeigt einen Verdrängungstest von Serum 3 mit PEGyliertem Peptid Sl/238.Figure 24 shows a displacement assay of serum 3 with PEGylated peptide Sl / 238.
Figur 25 zeigt einen Verdrängungstest von Serum 5 mit PEGyliertem Peptid Sl/238.Figure 25 shows a displacement assay of serum 5 with PEGylated peptide Sl / 238.
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Figur 26 zeigt einen Verdrängungstest von mabO38 mit PEGyliertem Peptid Sl/238.Figure 26 shows a displacement assay of mabO38 with PEGylated peptide Sl / 238.
Sollten die erfindungsgemäßen Peptide eine kurze Halbwertszeit besitzen, kann diese durch Konjugation mit anderen Molekülen wie z. B. hochmolekularemIf the peptides of the invention have a short half-life, this can be achieved by conjugation with other molecules such. B. high molecular weight
Polyethylenglycol, Dextran oder Agarose aufgehoben werden. Durch Auswahl geeigneter Substanzen kann die Halbwertszeit erhöht werden, wobei einePolyethylene glycol, dextran or agarose can be repealed. By selecting suitable substances, the half-life can be increased, with a
Beeinträchtigung der biologischen Aktivität ist nicht zu erwarten ist. EineImpairment of biological activity is not expected. A
Vielzahl unterschiedlicher PEG-Arten mit unterschiedlichem Molekulargewicht sind verfügbar, was eine ideale Anpassung von PEG an die erforderlichenVariety of different PEG types with different molecular weights are available, allowing an ideal match of PEG to the required
Bedürfnisse ermöglicht.Needs.
In Figur 1 ist ein mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) aktiviertes PEG dargestellt, welches auf einer Seite durch eine Methoxygruppe blockiert ist. Dadurch wird ein homogeneres Produkt gewährleistet.FIG. 1 shows an N-hydroxysuccinimide (NHS) -activated PEG which is blocked on one side by a methoxy group. This ensures a more homogeneous product.
Zur Messung der pharmakologische Wirkung der erfindungsgemäßen Peptide, die in der Lage sind, den FVIII vom Inhibitor zu verdrängen, kann in hämophilen Mäusen getestet werden. Dies ist ein großer Vorteil, nachdem im Jahr 1995 zum ersten Mal. hämophile Mäuse gezüchtet wurden [39,40]. Man ist nicht mehr auf größere Tiere angewiesen. Bei diesen Mäusen ist das FVIII-Gen am Exon 17 unterbrochen. Es wurde gezeigt, dass diese Tiere ähnlich wie beim Menschen Antikörper gegen FVIII entwickeln [41,42]. Die Reaktionskinetik der entwickelten Antikörper ist ähnlich wie bei der menschlichen Hämophilie A und die Subklassenverteilung ist normal [41,42]. Somit eignet sich ein solches -Modell ausgezeichnet für die Testung von Substanzen, die Inhibitoren blockieren.To measure the pharmacological activity of the peptides of the invention capable of displacing the FVIII from the inhibitor can be tested in hemophilic mice. This is a big advantage, having been in 1995 for the first time . haemophilic mice were bred [39,40]. One is no longer rely on larger animals. In these mice, the FVIII gene is disrupted at exon 17. Similar to humans, these animals have been shown to develop antibodies to FVIII [41, 42]. The reaction kinetics of the antibodies developed are similar to those of human hemophilia A and the subclass distribution is normal [41,42]. Thus, such a model is excellently suited for the testing of substances that block inhibitors.
Der erste Schritt ist die Auswahl von Patientenseren mit FVIII-Inhibitor-Bildung. Für die Sceeningversuche ist es notwendig, mittels Affinitätschromatographie Inhibitor-IgG aus dem Serum herauszureinigen, um möglichst spezifische Ergebnisse erhalten zu können. Zuerst wird Gesamt-IgG der Subklassen IgGl, IgG2 und IgG4 mittels Protein A erhalten. Die Weiterreinigung erfolgt über .eine Affinitätssäule, an die rekombinanter FVIII gekoppelt wurde. Auf diese Weise werden spezifische FVIII-bindende Antikörper erhalten.The first step is the selection of patient sera with FVIII inhibitor production. For the Sceeningversuche it is necessary to purify inhibitor IgG from the serum by means of affinity chromatography in order to be able to obtain as specific as possible results. First, total IgG of subclasses IgG1, IgG2 and IgG4 is obtained by Protein A. Further purification is via an affinity column to which recombinant FVIII has been coupled. In this way, specific FVIII-binding antibodies are obtained.
Als Detektionsmethode wird die Chemilumineszenzmessung gewählt, die sich durch ihre hohe Empfindlichkeit auszeichnet. Als Konjugat kann entweder Anti- Human-IgG-Peroxidase (Sekundärantikörper-System) oder Streptavidin- Peroxidase (Biotin-Streptavidin-System) verwendet werden. Bei Anwendung des Biotin-Streptavidin-Systems werden die Inhibitorantikörper direkt mit Biotin markiert, wodurch unspezifische Signale, die durch den Sekundärantikörper verursacht werden können, umgangen werden. Die Biotinmarkierung erfolgt mittles NHS-aktiviertem Biotin über freie Aminogruppen der Antikörper.The detection method chosen is the chemiluminescence measurement, which is characterized by its high sensitivity. Either anti-human IgG peroxidase (secondary antibody system) or streptavidin-peroxidase (biotin-streptavidin system) can be used as the conjugate. Using the biotin-streptavidin system, the inhibitor antibodies are directly labeled with biotin, thereby bypassing nonspecific signals that may be caused by the secondary antibody. Biotin labeling is carried out by means of NHS-activated biotin via free amino groups of the antibodies.
Die erfindungsgemäßen Peptide, die z. B. durch Merrifield-Festphasen- Peptidsynthesen [44] hergestellt werden, wurden auf Verdrängung von Inhibitoren mittels Flüssigphasen-Verdrängungstests geprüft. Dazu werden Mikrotiterplatten mit FVIII beschichtet und anschließend mit einer Mischung aus Inhibitor-IgG und steigenden Peptidkonzentrationen inkubiert. Die Detektion gebundener Inhibitoren erfolgt mit Peroxidase-gebundenem Konjugat und Chemilumineszenzmessung. Als Maß zum Vergleich der einzelnen Peptide wird die sogenannte IC50 herangezogen. Dabei handelt es sich um die Peptidkonzentration, bei der 50% der Inhibitoren verdrängt werden können. Peptide mit der stärksten Verdrängungswirkung (möglichst niedrige IC50) werden gewählt und mit Polyethylenglycol konjugiert. Diesem Schritt sollte eine erneute Durchführung des Verdrängungstests folgen, um sicherzustellen, dass PEGylierte Peptide nach wie vor biologisch aktiv sind.The peptides of the invention, z. , Prepared by Merrifield solid phase peptide syntheses [44], were tested for displacement of inhibitors by liquid phase displacement assays. For this purpose, microtiter plates are coated with FVIII and then incubated with a mixture of inhibitor IgG and increasing peptide concentrations. The detection of bound inhibitors takes place with peroxidase-bound conjugate and chemiluminescence measurement. As a measure for comparing the individual peptides, the so-called IC 50 is used. This is the peptide concentration at which 50% of the inhibitors can be displaced. Peptides with the strongest displacement effect (IC 50 as low as possible) are chosen and conjugated with polyethylene glycol. This step should be followed by re-running the displacement assay to ensure that PEGylated peptides are still biologically active.
Beispiel 1example 1
Präparation von Inhibitor-SerenPreparation of inhibitor sera
Inhibitor-SerenInhibitor-sera
Für die durchgeführten Versuche standen 7 Blutseren von Inhibitorpatienten zur Verfügung. Die Eigenschaften, sowie die Herkunftsländer dieser Proben sind in Tabelle 3 angeführt.For the experiments 7 blood sera from inhibitor patients were available. The characteristics as well as the countries of origin of these samples are given in Table 3.
Tabelle 3: Eigenschaften und Herkunft der für Versuche verwendeten Inhibitor-Table 3: Properties and source of the inhibitor used for experiments
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Seren.Sera.
Protein A-AffinitätschromatographieProtein A affinity chromatography
Inhibitor-Seren wurden 2 h mit 0.5 % Triton X-100 virusinaktiviert, anschließend 1:5 mit Äquilibrierungspuffer verdünnt und filtriert.Inhibitor sera were virus inactivated for 2 h with 0.5% Triton X-100, then diluted 1: 5 with equilibration buffer and filtered.
Für die Reinigung von Inhibitor-Seren wurde rProtein A-Sepharose FF (Pharmacia) verwendet. Die gepackte Säule hatte ein Volumen von 7.85 ml. Zum Äquilibrieren der Säule wurde 25 mM Tris/HCI, 0.15 M NaCI, pH 7.2-7.5 verwendet mit einer Flussrate von 3 ml/min. 6-10 ml verdünntes Serum wurden auf die Säule bei einem Fluss von 0.65 ml/min geladen. Die Elution von gebundenem IgG erfolgte mit Hilfe eines Stufengradienten mit 0.1 M Glycin, 0.15 M NaCI, pH 3.0 bei geringer Flussrate von 0.65 ml/min. Die Regeneration der Protein A-Säule wurde mit 0.1 M Glycin, 0.15 M NaCI, pH 2.5 durchgeführt. Abschließend wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer äquilibriert. Gewonnene Eluate wurden sofort mit 1 M Tris neutralisiert und mittels rFVIII-Sepharose weitergereinigt oder bei -800C eingefroren.For the purification of inhibitor sera, rProtein A-Sepharose FF (Pharmacia) was used. The packed column had a volume of 7.85 ml. To equilibrate the column, 25 mM Tris / HCl, 0.15 M NaCl, pH 7.2-7.5 was used at a flow rate of 3 ml / min. 6-10 ml of diluted serum was loaded onto the column at a flow rate of 0.65 ml / min. The elution of bound IgG was carried out using a step gradient with 0.1 M glycine, 0.15 M NaCl, pH 3.0 at a low flow rate of 0.65 ml / min. Regeneration of the protein A column was performed with 0.1 M glycine, 0.15 M NaCl, pH 2.5. Finally, the column was equilibrated with equilibration buffer. Obtained eluates were immediately neutralized with 1 M Tris and further purified by means of rFVIII-Sepharose or frozen at -80 0 C.
FVIII-Affinitä tsch roma tographieFVIII affinity chitography
Zum Beladen von CNBr-activated Sepharose 4 FF (Pharmacia) wurde rFVIII (Fa. Baxter) mit einer FVIII-Aktivität von 6400 U/ml verwendet. Die Herstellung der Affinitätssäule erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Die gepackte Säule hatte ein Volumen von 1.3 ml.To load CNBr-activated Sepharose 4 FF (Pharmacia) rFVIII (Baxter) with a FVIII activity of 6400 U / ml was used. The production of the affinity column was carried out according to the instructions of the manufacturer. The packed column had a volume of 1.3 ml.
Zum Äquilibrieren der Sepharose wurde 10 mM Hepes, 0.1 M NaCI, 5 mM CaCI2, 0.1% Tween 80, pH 7.4 verwendet. Aus der Reinigung mittels Protein A gewonnenes Eluat wurde auf die Säule aufgetragen und spezifische Anti-FVIII- Antikörper mit 0.1 M Glycin, 0.15 M NaCI, 5 mM CaCI2, 0.1% Tween 80, pH 2.8 eluiert und sofort mit 1 M Tris neutralisiert. Nach der Reinigung wurde die Sepharose mit Äquilibrierungspuffer neutralisiert. Gewonnene Eluat wurden sofort für weitere Versuche verwendet oder bei -800C gelagert.To equilibrate the Sepharose, 10 mM Hepes, 0.1 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 0.1% Tween 80, pH 7.4 was used. Eluate recovered from purification by protein A was applied to the column and specific anti-FVIII antibodies were eluted with 0.1 M glycine, 0.15 M NaCl, 5 mM CaCl 2 , 0.1% Tween 80, pH 2.8, and immediately neutralized with 1 M Tris. After purification, the Sepharose was neutralized with equilibration buffer. Won eluate were immediately used for further experiments or stored at -80 0 C.
Aus 6 ml Humanserum wurden so etwa 100 μg Inhibitor-IgG erhalten.From 6 ml of human serum, about 100 μg of inhibitor IgG were thus obtained.
Biotinylierung von Inhibitor-IgGBiotinylation of inhibitor IgG
Vor der Biotinylierung wurde Inhibitor-IgG gegen PBS, pH 7.4 dialysiert, um freie Aminogruppen zu entfernen. Anschließend wurden die Antikörper nach den Angaben des Herstellers (Pharmacia) mit NHS-LC-Biotin markiert.Prior to biotinylation, inhibitor IgG was dialyzed against PBS, pH 7.4, to remove free amino groups. Subsequently, the antibodies were labeled according to the manufacturer (Pharmacia) with NHS-LC-biotin.
Herstellung der Decapeptidlibraries mittels Spotsynthese und ScreeningProduction of decapeptide libraries by spot synthesis and screening
Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide erfolgte auf Cellulosemembranen über einen ß-Alanin-Linker [45] unter Verwendung eines Pipettierroboters. Sämtliche für die Synthese verwendete Aminosäuren liegen als Pentafluorophenyl (OPfp)-Ester vor und sind N-terminal durch 9- Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) geschützt. Als Seitenketten-Schutzgruppen wurden Trityl- für Cystein, Histidin, Asparagin und Glutamin, t-Butyl- für Aspartat, Glutamat, Serin, Threonin und Tyrosin, t-Butoxycarbonyl- für Lysin und Tryptophan sowie Pentamethylchroman- für Arginin verwendet. Die Membran wurde mit 0.2 M Fmoc-ß-Alanin-OH aktiviert, mit 0.24 M Diisopropylcarbodiimid und 0.4 M l-Methylimidazol funktionalisiert, dann wurde ein zusätzlicher ß-Alanin-Rest als Spacer eingefügt. Die Synthese des entsprechenden Peptids wurde mit 0.3 M Aminosäure-Lösungen in N- Methylpyrrolidon durchgeführt.The synthesis of the peptides according to the invention was carried out on cellulose membranes via a β-alanine linker [45] using a pipetting robot. All of the amino acids used for the synthesis exist as pentafluorophenyl (OPfp) esters and are N-terminally protected by 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc). As side-chain protecting groups, trityl- for cysteine, histidine, asparagine and glutamine, t-butyl for aspartate, glutamate, serine, threonine and tyrosine, t-butoxycarbonyl- for lysine and tryptophan and pentamethylchroman- for arginine were used. The membrane was activated with 0.2 M Fmoc-β-alanine-OH, with 0.24 M Diisopropylcarbodiimide and 0.4 M l-methylimidazole functionalized, then an additional ß-alanine residue was inserted as a spacer. The synthesis of the corresponding peptide was carried out with 0.3 M amino acid solutions in N-methylpyrrolidone.
JJ
■ Die Testung -der erfindungsgemäß zu verwendenden Peptide kann ähnlich wie bei einem Western Blot erfolgen. Cellulosemembranen können mit PBS mit 0.1% Tween-20 (PBS-T) äquilibriert werden und 1 Stunde oder über Nacht bei 40C mit 3% BSA in PBS-T blockiert werden. Die Inkubation mit den ■ Testing -the invention to use peptides can be done similar as with a Western blot. Cellulosic membranes can be equilibrated with PBS with 0.1% Tween-20 (PBS-T) and blocked for 1 hour or overnight at 4 ° C. with 3% BSA in PBS-T. Incubation with the
) Inhibitorantikörpem erfolgte in PBS-T mit 1% BSA für 2 Stunden. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS-T wurde entweder 15 Minuten mit Streptavidin- Peroxidase-Konjugat (1:2000) oder 1 Stunde mit Anti-Human-IgG-Peroxidase (1:10000) in PBS-T mit 0.5 M NaCI und 1% BSA inkubiert. Nach erneutem mehrmaligen Waschen wurde gebundenes Konjugat mit Chemilumineszenz- Substrat (SuperSignal®, Pierce) und anschließender Belichtung (Lumilmager) sichtbar gemacht.) Inhibitor antibody was administered in PBS-T with 1% BSA for 2 hours. After washing several times with PBS-T, either 15 minutes with streptavidin-peroxidase conjugate (1: 2000) or 1 hour with anti-human IgG peroxidase (1: 10000) in PBS-T with 0.5 M NaCl and 1% BSA incubated. After repeated washing, bound conjugate with chemiluminescent substrate (SuperSignal®, Pierce) and subsequent exposure (Lumilmager) was visualized.
FestphasenpeptidsyntheseSolid phase peptide synthesis
Insbesondere wurden die erfindungsgemäß zu verwendenden Peptide für Verdrängungstests mit Hilfe eines Peptide Synthesizers 433A (Applied Biosystems) auf einem HMP-Harz als Träger synthetisiert. Die Synthese erfolgte mittels Fmoc-Chemie unter Verwendung von Seitenkettenschutzgruppen für reaktive Aminosäure-Seitenketten.Specifically, the peptides for displacement testing to be used in the present invention were synthesized on a HMP resin as a support using a peptide synthesizer 433A (Applied Biosystems). Synthesis was by Fmoc chemistry using side chain protecting groups for reactive amino acid side chains.
Nach dem Abspalten der Seitenketten-Schutzgruppen wurden die Peptide gereinigt und mittels RP-HPLC und MALDI-TOF-MS analysiert.After cleavage of the side-chain protecting groups, the peptides were purified and analyzed by RP-HPLC and MALDI-TOF-MS.
Verdrängungstestsdisplacement assays
Die Peptide wurden in Verdrängungstests auf ihre Wirkung getestet. Da interessante Peptide ein möglichst breites Wirkungsspektrum aufweisen sollen, d.h. unterschiedliche Inhibitoren blockieren sollen, wurden sie mit mehreren Inhibitorseren getestet.The peptides were tested for their effect in displacement tests. Since interesting peptides should have the broadest possible spectrum of activity, i. To block different inhibitors, they were tested with several inhibitor sera.
Dazu wurden MaxiSorp Mikrotϊterplatten mit 2 μg/ml plasma derived FVIII (pdFVIII) vorgecoatet (2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur). Als Coating-Puffer wurde ein 0.1 M NaHCO3-Puffer, pH 9.6 verwendet. Anschließend wurde 1 Stunde mit 3% BSA in PBS-T blockiert und 2 Stunden mit Mischungen aus Inhibitoren und unterschiedlichen Konzentrationen an Peptid inkubiert. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS-T wurde 1 Stunde mit dem entsprechendem ; Peroxidase-Konjugat in PBS-T mit 1 % BSA inkubiert. Nach Waschen mit PBS-T wurde mit Chernilumineszenzsubstrat (SuperSignal®, Pierce) inkubiert und die Platte am Lumilmager belichtet. Die Lichtintensität ist ein Maß für gebundene Inhibitoren.For this purpose, MaxiSorp microtiter plates were pre-coated with 2 μg / ml plasma-derived FVIII (pdFVIII) (2 hours incubation at room temperature). When Coating buffer, a 0.1 M NaHCO 3 buffer, pH 9.6 was used. It was then blocked for 1 hour with 3% BSA in PBS-T and incubated for 2 hours with mixtures of inhibitors and different concentrations of peptide. After washing several times with PBS-T, 1 hour with the appropriate; Peroxidase conjugate incubated in PBS-T with 1% BSA. After washing with PBS-T, incubation was carried out with cherniluminescence substrate (SuperSignal®, Pierce) and the plate was exposed on the lumi- nem lean. The light intensity is a measure of bound inhibitors.
) Die Verdrängung wird durch das sogenannte "fractional binding" angegeben. Dabei handelt es sich um den Anteil an noch durch Inhibitoren gebundenen FVIIL Dieser Wert sollte bei wirksamen Peptiden schon bei geringen Peptid konzentrationen stark absinken.) The displacement is indicated by the so-called "fractional binding". This is the proportion of FVIIL still bound by inhibitors. This value should drop sharply even with low peptide concentrations in the case of active peptides.
Peptid S2/129 zeigt Verdrängungswirkung auf Inhibitor 5 mit einer IC50 von 914 μM (Figur 5). Für Peptid S2/35 wurde eine IC50 von 79.22 μM für Inhibitor 5 erreicht (Figur 6). Mit Peptid Sl/238 konnten alle sieben bisher untersuchten Inhibitorantikörper verdrängt werden. Wegen Aggregation der Peptide mit den Seren bei Verwendung höherer Peptidkonzentrationen durch Immunkomplexbildung war die Berechnung der IC50 nur für Inhibitor 1, 5, K3 und K4 möglich und lag für Inhibitor 1 bei 20.94 μM (Figur 7), für Inhibitor 5 bei 1.85 μM (Figur 8). Die Inhibitoren K3 und K4 konnten mit diesem Peptid mit einer IC50 von 401.78 μM bzw. 402.73 verdrängt werden (Figur 10 und 11).Peptide S2 / 129 shows displacement effect on inhibitor 5 with an IC 50 of 914 μM (FIG. 5). For peptide S2 / 35, an IC 50 of 79.22 μM was achieved for inhibitor 5 (FIG. 6). With peptide Sl / 238, all seven inhibitor antibodies investigated so far could be displaced. Because of aggregation of the peptides with the sera when using higher peptide concentrations by immune complex formation, the calculation of the IC 50 was only possible for inhibitor 1, 5, K3 and K4 and was for inhibitor 1 at 20.94 μM (FIG. 7), for inhibitor 5 at 1.85 μM (FIG. FIG. 8). The inhibitors K3 and K4 could be displaced with this peptide with an IC 50 of 401.78 μM and 402.73, respectively (FIGS. 10 and 11).
Der Anstieg in der Bindungsstärke nach einem anfänglichen starken Absinken wird durch Aggregation von IgG (bzw. IgG mit Peptid) bei Zugabe des Peptids ab einer bestimmten Konzentration beobachtet. Dieser Effekt könnte von der Peptidsequenz, vom Zustand der IgG-Lösung, vom verwendeten Lösungsmittel, bzw. vom pH-Wert der Inkubationslösung abhängig sein und tritt deshalb manchmal früher, manchmal später oder gar nicht auf. Peptid S3/58 wurde auf seine Verdrängungswirkung auf die Inhibitoren 1, 3, 5 und 6 sowie Kl, K2, K3 und K4 überprüft. In allen Fällen führte das Peptid zu einer starken Verdrängung der Inhibitoren schon bei geringer Peptid konzentration (Figur 14 bzw. 15). Auch die Peptide Sl/173 (Figur 16), Sl/139 (Figur 17) und Sl/151 (Figur 18) zeigen verdrängende Wirkung auf die Inhibitoren, gefolgt von Aggregation. Peptid Sl/173 verdrängt die Inhibitoren 5 und 6 in einem Konzentrationsbereich von 0.05-0.1 mg/ml. Peptid Sl/139 zeigt auf die Inhibitoren 1 und 6 im > Konzentrationsbereich 0.025-0.5 mg/ml Verdrängungswirkung und Peptid Sl/151 verdrängt Inhibitor 6 zwischen 0.05 - und 0.1 mg/m! Peptid. Sichtbar wird die Verdrängung durch sinkende Bindungsstärke.The increase in binding strength after an initial sharp decrease is observed by aggregation of IgG (or IgG with peptide) upon addition of the peptide above a certain concentration. This effect could be dependent on the peptide sequence, on the state of the IgG solution, on the solvent used or on the pH of the incubation solution and therefore sometimes occurs earlier, sometimes later or not at all. Peptide S3 / 58 was tested for its displacement effect on inhibitors 1, 3, 5 and 6 as well as Kl, K2, K3 and K4. In all cases, the peptide led to a strong displacement of the inhibitors even at low peptide concentration (Figure 14 or 15). Also, the peptides Sl / 173 (Figure 16), Sl / 139 (Figure 17) and Sl / 151 (Figure 18) show displacing action on the inhibitors, followed by aggregation. Peptide Sl / 173 displaces inhibitors 5 and 6 in a concentration range of 0.05-0.1 mg / ml. Peptide Sl / 139 points to inhibitors 1 and 6 in> concentration range 0.025-0.5 mg / ml displacement effect and peptide Sl / 151 displaces inhibitor 6 between 0.05 and 0.1 mg / m! Peptide. The displacement becomes visible through decreasing bond strength.
Verdrängungstests wurden zusätzlich mit monoklonalen Antikörpern gegen FVIII ) durchgeführt. Es wurden Antikörper getestet, die gegen unterschiedliche Regionen im FVIII gerichtet sind. MabO38 bindet an die leichte Kette von FVIII und konnte erfolgreich mit den Peptiden Sl/238, Sl/160 und S2/35 verdrängt werden. Die IC50 der Peptide Sl/238 und Sl/160 wurde mit 35.78 μM bzw. 38.72 μM berechnet (Figur 19 und Figur 20). Peptid S2/35 bewirkte eine 5 Verdrängung des Antikörpers, gefolgt von Aggegation (Figur 21).Displacement tests were additionally performed with monoclonal antibodies to FVIII). Antibodies directed against different regions in FVIII were tested. MabO38 binds to the light chain of FVIII and was successfully displaced with the peptides Sl / 238, Sl / 160 and S2 / 35. The IC 50 of the peptides Sl / 238 and Sl / 160 was calculated to be 35.78 μM and 38.72 μM, respectively (FIG. 19 and FIG. 20). Peptide S2 / 35 caused 5% displacement of antibody followed by aggregation (Figure 21).
Bei OBT0037 handelt es sich um einen monoklonalen Antikörper, der gegen die schwere Kette von FVIII gerichtet ist und der mit Peptid Sl/171 verdrängt werden konnte (Figur 22).OBT0037 is a monoclonal antibody directed against the heavy chain of FVIII that could be displaced with peptide Sl / 171 (Figure 22).
ESH8 bindet an die C2-Domäne von FVIII und konnte bei Verwendung von kleinen Peptid konzentrationen mit Peptid Sl/171 verdrängt werden. DieESH8 binds to the C2 domain of FVIII and could be displaced with peptide Sl / 171 using small peptide concentrations. The
Kurvenform könnte auch auf eine leichte Form von Aggregation zurückgeführt werden (Figur 23).Waveform could also be attributed to a slight form of aggregation (Figure 23).
Konjugation von Peptid Sl/238 mit PolvethylenαlvcolConjugation of Peptide Sl / 238 with Polvethylenαlvcol
Peptid Sl/238 ist ein Peptid mit einem sehr breiten Wirkungsspektrum bei gleichzeitig niedriger IC50 und wurde deshalb für Konjugationsversuche gewählt.Peptide Sl / 238 is a peptide with a very broad spectrum of activity with simultaneously low IC 50 and was therefore chosen for conjugation experiments.
Mit der Sequenz PYWKWQYKYD besitzt diese Peptid 3 mögliche Aminogruppen, über die Polyethylenglycol gekoppelt werden kann. 2 Aminogruppen werden durch die Seitenketten der beiden Lysin-Reste zur Verfügung gestellt, die dritteWith the sequence PYWKWQYKYD, this peptide has 3 possible amino groups via which polyethylene glycol can be coupled. Two amino groups are provided by the side chains of the two lysine residues, the third
Aminogruppe ist am N-Terminus zu finden. Die Reinigung der Reaktionsmischung erfolgte mittels RP-HPLC. Die Effizienz der Reinigung wurde mittels RP-HPLC und mittels SEC überprüft. Die Identität des Peptids konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden.Amino group can be found at the N-terminus. The purification of the reaction mixture was carried out by means of RP-HPLC. The efficiency of the purification was checked by RP-HPLC and SEC. The identity of the peptide was confirmed by MALDI-TOF-MS.
Der Verdrängungstest mit PEGyliertem Peptid S1/238-PEG wurde bisher mit den Inhibitorantikörpern 1, 3 und 5, sowie mit den monoklonalen Antikörpern mabO38 und ESH8 durchgeführt. Verdrängungswirkung konnte bei den Inhibitoren 3 (Figur 24) und 5 (Figur 25), sowie mabO38 (Figur 26) erzielt werden. Die IC50 wurde für Inhibitor 3 mit 51.68 μM, für Inhibitor 5 mit 58.33 μM und für mabO38 mit 80.57 μM berechnet. Inhibitor 1 und ESH8 konnten nicht mit Peptid S1/238-PEG verdrängt werden. The displacement test with PEGylated peptide S1 / 238-PEG has hitherto been carried out with the inhibitor antibodies 1, 3 and 5, as well as with the monoclonal antibodies mabO38 and ESH8. Displacement effect could be achieved in the inhibitors 3 (Figure 24) and 5 (Figure 25), and mabO38 (Figure 26). IC 50 was calculated to be 51.68 μM for inhibitor 3, 58.33 μM for inhibitor 5, and 80.57 μM for mabO38. Inhibitor 1 and ESH8 could not be displaced with peptide S1 / 238-PEG.
Literaturliterature
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Seq ID No. S1/1-24QSeq ID no. S1 / 1-24Q
1. FAYRTFYIIR 34. FAYRWQYIIR 67. PYKYVFYISR1. FAYRTFYIIR 34. FAYRWQYIIR 67. PYKYVFYISR
2. FAYRTFYISR 35. FAYRWQYISR 68. PYKYVFYITR2. FAYRTFYISR 35. FAYRWQYISR 68. PYKYVFYITR
3. FAYRTFYITR 36. FAYRWQYITR 69. PYKYVFYIVR 4." FAYRTFYIVR 37. FAYRWQYIVR 70. PYKYVFYITK3. FAYRTFYITR 36. FAYRWQYITR 69. PYKYVFYIVR 4. " FAYRTFYIVR 37. FAYRWQYIVR 70. PYKYVFYITK
5. FAYRTFYITK 38. FAYRWQYITK 71.YHKYVFYIIR5. FAYRTFYITK 38. FAYRWQYITK 71.YHKYVFYIIR
6. FAYRTFYIYD 39. FAYRWQYIYD 72.YHKYVFYISR6. FAYRTFYIYD 39. FAYRWQYIYD 72.YHKYVFYISR
7. PYYRTFYIIR 40. PYYRWQYIIR 73.YHKYVFYrTR7. PYYRTFYIIR 40. PYYRWQYIIR 73.YHKYVFYrTR
8. PYYRTFYISR 41. PYYRWQYISR 74. YH KYVFYIVR8. PYYRTFYISR 41. PYYRWQYISR 74. YH KYVFYIVR
9. PYYRTFYITR 42. PYYRWQYITR 75.YHKYVFYITK9. PYYRTFYITR 42. PYYRWQYITR 75.YHKYVFYITK
10. PYYRTFYIVR 43. PYYRWQYIVR 76. FAKYWQYIIR10. PYYRTFYIVR 43. PYYRWQYIVR 76. FAKYWQYIIR
11. PYYRTFYITK 44. PYYRWQYITK 77. FAKYWQYISR 12.PYYRTFYIYD 45. PYYRWQYIYD 78. FAKYWQYITR 13. YHYRTFYIIR 46. YHYRWQYIIR 79. FAKYWQYIVR 14. YH YRTFYISR 47.YHYRWQYISR 80. FAKYWQYITK 15. YH YRTFYITR . . 48.YHYRWQYITR 81. FAKYWQYIYD 16.YHYRTFYIVR 49. YHYRWQYIVR 82. PYKYWQYIIR11. PYYRTFYITK 44. PYYRWQYITK 77. FAKYWQYISR 12.PYYRTFYIYD 45. PYYRWQYIYD 78. FAKYWQYITR 13. YHYRTFYIIR 46. YHYRWQYIIR 79. FAKYWQYIVR 14. YH YRTFYISR 47.YHYRWQYISR 80. FAKYWQYITK 15. YH YRTFYITR. , 48.YHYRWQYITR 81. FAKYWQYIYD 16.YHYRTFYIVR 49. YHYRWQYIVR 82. PYKYWQYIIR
17. YH YRTFYITK 50. YH YRWQYITK 83. PYKYWQYISR17. YH YRTFYITK 50. YH YRWQYITK 83. PYKYWQYISR
18. YHYRTFYIYD 51. YHYRWQYIYD 84. PYKYWQYITR18. YHYRTFYIYD 51. YHYRWQYIYD 84. PYKYWQYITR
19. FAYRVFYIIR 52. FAKYTFYII R 85. PYKYWQYIVR19. FAYRVFYIIR 52. FAKYTFYII R 85. PYKYWQYIVR
20. FAYRVFYISR 53. FAKYTFYISR 86. PYKYWQYITK20. FAYRVFYISR 53. FAKYTFYISR 86. PYKYWQYITK
21. FAYRVFYITR 54. FAKYTFYITR 87. PYKYWQYIYD21. FAYRVFYITR 54. FAKYTFYITR 87. PYKYWQYIYD
22. FAYRVFYIVR 55. FAKYTFYIVR 88.YHKYWQYIIR22. FAYRVFYIVR 55. FAKYTFYIVR 88.YHKYWQYIIR
23. FAYRVFYITK 56. FAKYTFYITK 89.YHKYWQYISR23. FAYRVFYITK 56. FAKYTFYITK 89.YHKYWQYISR
24. PYYRVFYIIR 57. PYKYTFYIIR 90.YHKYWQYITR24. PYYRVFYIIR 57. PYKYTFYIIR 90.YHKYWQYITR
25. PYYRVFYIS R 1 58. PYKYTFYISR 91. YH KYWQYI VR25. PYYRVFYIS R 1 58. PYKYTFYISR 91. YH KYWQYI VR
26. PYYRVFYITR 59. PYKYTFYITR 92.YH KYWQYITK26. PYYRVFYITR 59. PYKYTFYITR 92.YH KYWQYITK
27. PYYRVFYIVR 60. PYKYTFYIVR 93.YH KYWQYIYD27. PYYRVFYIVR 60. PYKYTFYIVR 93.YH KYWQYIYD
28. PYYRVFYITK 61. PYKYTFYITK 94. FAWKTFYIIR 29.YHYRVFYIIR 62.YHKYTFYIIR 95. FAWKTFYISR 30.YHYRVFYISR ' 63. YH KYTFYISR 96. FAWKTFYITR 31. YHYRVFYITR 64.YH KYTFYITR 97. FAWKTFYIVR 32.YHYRVFYIVR 65. YH KYTFYIVR 98. FAWKTFYITK 33. YH YRVFYITK 66. YH KYTFYITK 99. FAWKTFYIYD 100. PYWKTFYIIR 135. f -AYRTFYKIR 170. PYKYTFYKVR 101. PYWKTFYISR 136. FAYRTFYKSR 171. PYKYTFΎKYD28 PYYRVFYITK 61. PYKYTFYITK 94. FAWKTFYIIR 29.YHYRVFYIIR 62.YHKYTFYIIR 95. FAWKTFYISR 30.YHYRVFYISR '63. YH KYTFYISR 96. FAWKTFYITR 31 YHYRVFYITR 64.YH KYTFYITR 97. FAWKTFYIVR 32.YHYRVFYIVR 65. YH KYTFYIVR 98. FAWKTFYITK 33 YH YRVFYITK 66. YH KYTFYITK 99. FAWKTFYIYD 100. PYWKTFYIIR 135. f -AYRTFYKIR 170. PYKYTFYKVR 101. PYWKTFYISR 136. FAYRTFYKSR 171. PYKYTFΎKYD
102. PYWKTFYITR 137. FAYRTFYKTR 172. YHKYTFYKVR102. PYWKTFYITR 137. FAYRTFYKTR 172. YHKYTFYKVR
103. PYWKTFYIVR 138. FAYRTFYKVR 173. YHKYTFYKYD 104.PYWKTFYITK 139 . FAYRTFYKYD 174. FAKYVFYKTR 105. PYWKTFYIYD 140 . PYYRTFYKTK 175. FAKYVFYKTK 106.YHWKTFYIIR 141 . PYYRTFYKYD 176. FAKYVFYKYD 107.YHWKTFYISR 142 . YHYRTFYKYD 177. PYKYVFYKIR 108. YH WKTFYITR 143 . FAYRVFYKSR 178. PYKYVFYKSR 109.YHWKTFYIVR 144 . FAYRVFYKTK 179. PYKYVFYKTR103. PYWKTFYIVR 138. FAYRTFYKVR 173. YHKYTFYKYD 104.PYWKTFYITK 139. FAYRTFYKYD 174. FAKYVFYKTR 105. PYWKTFYIYD 140. PYYRTFYKTK 175. FAKYVFYKTK 106.YHWKTFYIIR 141. PYYRTFYKYD 176. FAKYVFYKYD 107.YHWKTFYISR 142. YHYRTFYKYD 177. PYKYVFYKIR 108. YH WKTFYITR 143. FAYRVFYKSR 178. PYKYVFYKSR 109.YHWKTFYIVR 144. FAYRVFYKTK 179. PYKYVFYKTR
110. YH WKTFYITK 145 . FAYRVFYKYD 180. PYKYVFYKVR110. YH WKTFYITK 145. FAYRVFYKYD 180. PYKYVFYKVR
111. YH WKTFYIYD 146 . PYYRVFYKIR 181. PYKYVFYKTK 112. PYWKVFYITR 147 . PYYRVFYKSR 182. PYKYVFYKYD111. YH WKTFYIYD 146. PYYRVFYKIR 181. PYKYVFYKTK 112. PYWKVFYITR 147. PYYRVFYKSR 182. PYKYVFYKYD
113. PYWKVFYIVR 148 . PYYRVFYKTR 183. YHKYVFYKIR113. PYWKVFYIVR 148. PYYRVFYKTR 183. YHKYVFYKIR
114. PYWKVFYITK 149 . PYYRVFYKVR 184. YHKYVFYKSR114. PYWKVFYITK 149. PYYRVFYKVR 184. YHKYVFYKSR
115. PYWKVFYIYD 150 . PYYRVFYKTK 185. YHKYVFYKTR 116.YHWKVFYIIR 151 . PYYRVFYKYD 186. YHKYVFYKVR115. PYWKVFYIYD 150. PYYRVFYKTK 185. YHKYVFYKTR 116.YHWKVFYIIR 151. PYYRVFYKYD 186. YHKYVFYKVR
117. FAWKWQYIIR 152 . YHYRWQYKVR 187. YHKYVFYKTK117. FAWKWQYIIR 152. YHYRWQYKVR 187. YHKYVFYKTK
118. FAWKWQYIS R 153 . YHYRWQYKYD 188. YHKYVFYKYD 119. FAWKWQYITR 154 . FAYRWQYKSR 189. FAKYWQYKIR118. FAWKWQYIS R 153. YHYRWQYKYD 188. YHKYVFYKYD 119. FAWKWQYITR 154. FAYRWQYKSR 189. FAKYWQYKIR
120. FAWKWQYIVR 155 . FAYRWQYKTR 190. FAKYWQYKSR 121. FAWKWQYITK 156 . FAYRWQYKVR 191. FAKYWQYKTR120. FAWKWQYIVR 155. FAYRWQYKTR 190. FAKYWQYKSR 121. FAWKWQYITK 156. FAYRWQYKVR 191. FAKYWQYKTR
122. FAWKWQYIYD 157 . FAYRWQYKYD 192. FAKYWQYKVR122. FAWKWQYIYD 157. FAYRWQYKYD 192. FAKYWQYKVR
123. PYWKWQYIIR 158 . PYYRWQYKIR 193. FAKYWQYKYD123. PYWKWQYIIR 158. PYYRWQYKIR 193. FAKYWQYKYD
124. PYWKWQYISR 159, . PYYRWQYKVR 194. PYKYWQYKIR124. PYWKWQYISR 159,. PYYRWQYKVR 194. PYKYWQYKIR
125. PYWKWQYITR 160, . PYYRWQYKYD 195. PYKYWQYKVR 126. PYWKWQYIVR 161. . YHYRWQYKVR 196. PYKYWQYKYD 127. PYWKWQYITK 162, . YHYRWQYKYD 197. YHKYWQYKYD 128. PYWKWQYIYD 163, , FAKYTFYKIR 198. FAWKTFYKIR 129.YHWKWQYIIR 164. , FAKYTFYKSR 199. FAWKTFYKSR 130.YHWKWQYISR 165. , FAKYTFYKTR 200. FAWKTFYKTR 131.YHWKWQYITR 166. , FAKYTFYKVR 201. FAWKTFYKVR 132.YHWKWQYIVR 167. , FAKYTFYKTK 202. FAWKTFYKTK 133.YHWKWQYITK 168. FAKYTFYKYD 203. FAWKTFYKYD 134.YHWKWQYIYD 169. PYKYTFYKIR 204. PYWKTFYKIR 205. PYWKTFYKVR 217. PYWKVFYKTR 229. FAWKWQYKTR125. PYWKWQYITR 160,. PYYRWQYKYD 195. PYKYWQYKVR 126. PYWKWQYIVR 161.. YHYRWQYKVR 196. PYKYWQYKYD 127. PYWKWQYITK 162,. YHYRWQYKYD 197. YHKYWQYKYD PYWKWQYIYD 128. 163, 198. FAKYTFYKIR FAWKTFYKIR 129.YHWKWQYIIR 164, 199. FAKYTFYKSR FAWKTFYKSR 130.YHWKWQYISR 165., 200. FAKYTFYKTR FAWKTFYKTR 131.YHWKWQYITR 166, 201. FAKYTFYKVR FAWKTFYKVR 132.YHWKWQYIVR 167., FAKYTFYKTK 202. FAWKTFYKTK 133.YHWKWQYITK 168. FAKYTFYKYD 203. FAWKTFYKYD 134.YHWKWQYIYD 169. PYKYTFYKIR 204. PYWKTFYKIR 205. PYWKTFYKVR 217. PYWKVFYKTR 229. FAWKWQYKTR
206. PYWKTFYKYD 218. PYWKVFYKVR 230. FAWKWQYKVR206. PYWKTFYKYD 218. PYWKVFYKVR 230. FAWKWQYKVR
207. YHWKTFYKIR 219. PYWKVFYKTK 231. FAWKWQYKTK207. YHWKTFYKIR 219. PYWKVFYKTK 231. FAWKWQYKTK
208. YHWKTFYKYD 220. PYWKVFYKYD 232. FAWKWQYKYD208. YHWKTFYKYD 220. PYWKVFYKYD 232. FAWKWQYKYD
209. FAWKVFYKIR 221. YHWKVFYKIR 233. PYWKWQYKIR209. FAWKVFYKIR 221. YHWKVFYKIR 233. PYWKWQYKIR
2-10. FAWKVFYKSR 222. YHWKVFYKSR 234. PYWKWQYKSR2-10. FAWKVFYKSR 222. YHWKVFYKSR 234. PYWKWQYKSR
211. FAWKVFYKTR 223. YHWKVFYKTR 235. PYWKWQYKTR211. FAWKVFYKTR 223. YHWKVFYKTR 235. PYWKWQYKTR
212. FAWKVFYKVR 224. YHWKVFYKVR 236. PYWKWQYKVR212. FAWKVFYKVR 224. YHWKVFYKVR 236. PYWKWQYKVR
213. FAWKVFYKTK 225. YHWKVFYKTK 237. PYWKWQYKTK213. FAWKVFYKTK 225. YHWKVFYKTK 237. PYWKWQYKTK
214. FAWKVFYKYD 226. YHWKVFYKYD 238. PYWKWQYKYD214. FAWKVFYKYD 226. YHWKVFYKYD 238. PYWKWQYKYD
215. PYWKVFYKIR 227. FAWKWQYKIR 239. YHWKWQYKVR215. PYWKVFYKIR 227. FAWKWQYKIR 239. YHWKWQYKVR
216. PYWKVFYKSR 228. FAWKWQYKSR 240. YHWKWQYKYD 216. PYWKVFYKSR 228. FAWKWQYKSR 240. YHWKWQYKYD
Seq ID No. S2/1-131Seq ID no. S2 / 1-131
I. RHKKNFQFFF 33. RHYQNFQFHF 65. YRYQYN FQH F 2,. RHYKNFQFFF 34. RH KKQYQFH F 66. RH KKN FQFHHI. RHKKNFQFFF 33. RHYQNFQFHF 65. YRYQYN FQH F 2 ,. RHYKNFQFFF 34. RH KKQYQFH F 66. RH KKN FQFHH
3. RHYQNFQFFF 35. RHYKQYQFH F 67.RHYKNFQFHH3. RHYQNFQFFF 35. RHYKQYQFH F 67.RHYKNFQFHH
4. RHKKQYQFFF 36. RHYQQYQFH F 68.RHYQNFQFHH4. RHKKQYQFFF 36. RHYQQYQFH F 68.RHYQNFQFHH
5. RHYKQYQFFF 37. RH KKYNQFH F 69. RHKKQYQFHH5. RHYKQYQFFF 37. RH KKYNQFH F 69. RHKKQYQFHH
6. RHYQQYQFFF 38. RHYKYNQFH F 70.RHYKQYQFHH6. RHYQQYQFFF 38. RHYKYNQFH F 70.RHYKQYQFHH
7. RHKKYNQFFF 39. RHYQYNQFHF 71. RHYQQYQFHH7. RHKKYNQFFF 39. RHYQYNQFHF 71. RHYQQYQFHH
8. RHYKYNQFFF 40. RHKKNFFQHF 72.RHKKYNQFHH8. RHYKYNQFFF 40. RHKKNFFQHF 72.RHKKYNQFHH
9. RHYQYNQFFF 41. RHYKN FFQH F 73. RHYKYNQFHH 10.RHKKQYFQFF 42.RHYQNFFQHF 74. RHYQYN QFH H9. RHYQYNQFFF 41. RHYKN FFQH F 73. RHYKYNQFHH 10.RHKKQYFQFF 42.RHYQNFFQHF 74. RHYQYN QFH H
II. RH YKQYFQFF 43. RH KKQYFQH F 75.RHKKNFFQHH 12. RHYQQYFQFF 44. RHYKQYFQHF 76. RHYKN FFQHH 13. RH KKYN FQFF 45. RHYQQYFQH F 77.RHYQNFFQHH 14.RHYKYNFQFF 46. RH KKYN FQH F 78.RHKKQYFQHH 15. RHYQYNFQFF 47. RHYKYNFQHF 79. RHYKQYFQHH 16.YRKKNFQFFF 48. RHYQYNFQHF 80. RHYQQYFQHH 17.YRYKNFQFFF 49.YRKKNFQFHF 81. RHKKYNFQHHII. RH YKQYFQFF 43. RH KKQYFQH F 75.RHKKNFFQHH 12. RHYQQYFQFF 44. RHYKQYFQHF 76. RHYKN FFQHH 13. RH KKYN FQFF 45. RHYQQYFQH F 77.RHYQNFFQHH 14.RHYKYNFQFF 46. RH KKYN FQH F 78.RHKKQYFQHH 15. RHYQYNFQFF 47 .RHYKYNFQHF 79. RHYKQYFQHH 16.YRKKNFQFFF 48. RHYQYNFQHF 80. RHYQQYFQHH 17.YRYKNFQFFF 49.YRKKNFQFHF 81. RHKKYNFQHH
18. YRKKQYQFFF 50.YRYKNFQFHF 82. RHYKYNFQHH18. YRKKQYQFFF 50.YRYKNFQFHF 82. RHYKYNFQHH
19. YRYKQYQFFF 51. YRYQN FQFH F 83. RHYQYN FQH H19. YRYKQYQFFF 51. YRYQN FQFH F 83. RHYQYN FQH H
20. YRYQQYQFFF 52. YRKKQYQFH F 84.YRKKNFQFHH 21. YRKKYNQFFF 53. YRYKQYQFH F 85.YRYKNFQFHH 22.YRYKYNQFFF 54. YRKKYNQFH F 86.YRYQNFQFHH 23.YRYQYNQFFF 55. YRYKYNQFH F 87.YRKKQYQFHH 24.YRKKN FFQFF 56. YRYQYNQFH F 88.YRYKQYQFHH 25. YRYKN FFQFF 57.YRKKNFFQHF 89. YRYQQYQFH H 26. YRKKQYFQFF 58.YRYKNFFQHF 90.YRKKYNQFHH 27.YRYKQYFQFF 59. YRYQN FFQH F 91. YRYKYNQFHH 28. YRKKYN FQFF 60. YRKKQYFQH F 92. YRYQYNQFH H 29. YRYKYN FQFF 61. YRYKQYFQH F 93.YRKKNFFQHH20. 52. YRYQQYQFFF YRKKQYQFH F 84.YRKKNFQFHH 21 YRKKYNQFFF 53. YRYKQYQFH F 85.YRYKNFQFHH 22.YRYKYNQFFF 54. YRKKYNQFH F 86.YRYQNFQFHH 23.YRYQYNQFFF 55. YRYKYNQFH F 87.YRKKQYQFHH 24.YRKKN FFQFF 56. YRYQYNQFH F 88th YRYKQYQFHH 25. YRYKN FFQFF 57.YRKKNFFQHF 89. YRYQQYQFH H 26. YRKKQYFQFF 58.YRYKNFFQHF 90.YRKKYNQFHH 27.YRYKQYFQFF 59. YRYQN FFQH F 91. YRYKYNQFHH 28. YRKKYN FQFF 60. YRKKQYFQH F 92. YRYQYNQFH H 29. YRYKYN FQFF 61. YRYKQYFQH F 93.YRKKNFFQHH
30. YRYQYN FQFF 62. YRYQQYFQH F 94.YRYKNFFQHH30. YRYQYN FQFF 62. YRYQQYFQH F 94.YRYKNFFQHH
31. RH KKN FQFH F 63.YRKKYNFQHF 95.YRYQNFFQHH 32.RHYKNFQFHF 64.YRYKYNFQHF 96.YRKKQYFQHH 97.YRYKQYFQHH 110. RHYQYNQFYF 123. YRYQYNQFYF31. RH KKN FQFH F 63.YRKKYNFQHF 95.YRYQNFFQHH 32.RHYKNFQFHF 64.YRYKYNFQHF 96.YRKKQYFQHH 97.YRYKQYFQHH 110. RHYQYNQFYF 123. YRYQYNQFYF
98.YRYQQYFQHH 111. RHKKQYFQYF 124. YRKKNFFQYF98.YRYQQYFQHH 111. RHKKQYFQYF 124. YRKKNFFQYF
99.YRKKYNFQHH 112. RHYKQYFQYF 125. YRYKNFFQYF99.YRKKYNFQHH 112. RHYKQYFQYF 125. YRYKNFFQYF
100. YRYKYNFQHH 113. RHYQQYFQYF . 126. YRKKQYFQYF100. YRYKYNFQHH 113. RHYQQYFQYF. 126. YRKKQYFQYF
101. YRYQYIMFQHH 114. RHKKYNFQYF 127. YRYKQYFQYF101. YRYQYIMFQHH 114. RHKKYNFQYF 127. YRYKQYFQYF
102. RHKKNFQFYF 115. RHYKYNFQYF 128. YRYQQYFQYF102. RHKKNFQFYF 115. RHYKYNFQYF 128. YRYQQYFQYF
103. RHYKNFQFYF 116. RHYQYNFQYF 129. YRKKYNFQYF103. RHYKNFQFYF 116. RHYQYNFQYF 129. YRKKYNFQYF
104. RHYQNFQFYF 117. YRKKNFQFYF 130. YRYKYNFQYF104. RHYQNFQFYF 117. YRKKNFQFYF 130. YRYKYNFQYF
105. RHKKQYQFYF 118. YRYKNFQFYF 131. YRYQYNFQYF105. RHKKQYQFYF 118. YRYKNFQFYF 131. YRYQYNFQYF
106. RHYKQYQFYF 119. YRYQNFQFYF106. RHYKQYQFYF 119. YRYQNFQFYF
107. RHYQQYQFYF 120. YRKKQYQFYF107. RHYQQYQFYF 120. YRKKQYQFYF
108. RHKKYNQFYF 121. YRKKYNQFYF108. RHKKYNQFYF 121. YRKKYNQFYF
109. RHYKYNQFYF 122. YRYKYNQFYF 109. RHYKYNQFYF 122. YRYKYNQFYF
Seq lD No. S3/ 1-128Seq lD no. S3 / 1-128
1. AYWKWQYKYD 31. PTWKWQYKYD 61. PYWKIQYKYD1. AYWKWQYKYD 31. PTWKWQYKYD 61. PYWKIQYKYD
2. NYWKWQYKYD 32. PWWKWQYKYD 62. PYWKLQYKYD2. NYWKWQYKYD 32. PWWKWQYKYD 62. PYWKLQYKYD
3. DYWKWQYKYD 33. PVWKWQYKYD 63. PYWKFQYKYD3. DYWKWQYKYD 33. PVWKWQYKYD 63. PYWKFQYKYD
4. QYWKWQYKYD 34. PYAKWQYKYD 64. PYWKYQYKYD4. QYWKWQYKYD 34. PYAKWQYKYD 64. PYWKYQYKYD
5. EYWKWQYKYD 35. PYEKWQYKYD 65. PYW KVQYKYD5. EYWKWQYKYD 35. PYEKWQYKYD 65. PYW KVQYKYD
6. GYWKWQYKYD 36. PYIKWQYKYD 66. PYWKWAYKYD6. GYWKWQYKYD 36. PYIKWQYKYD 66. PYWKWAYKYD
7. HYWKWQYKYD 37. PYLKWQYKYD 67. PYWKWNYKYD7. HYWKWQYKYD 37. PYLKWQYKYD 67. PYWKWNYKYD
8. IYWKWQYKYD 38.PYFKWQYKYD 68. PYWKWDYKYD8. IYWKWQYKYD 38.PYFKWQYKYD 68. PYWKWDYKYD
9. LYWKWQYKYD 39. PYYKWQYKYD 69. PYWKWEYKYD9. LYWKWQYKYD 39. PYYKWQYKYD 69. PYWKWEYKYD
10. KYWKWQYKYD 40. PYVKWQYKYD 70. PYWKWGYKYD10. KYWKWQYKYD 40. PYVKWQYKYD 70. PYWKWGYKYD
11. MYW KWQYKYD 41. PYWAWQYKYD 71. PYWKWHYKYD11. MYW KWQYKYD 41. PYWAWQYKYD 71. PYWKWHYKYD
12. FYWKWQYKYD 42. PYWRWQYKYD 1 72. PYWKWIYKYD12. FYWKWQYKYD 42. PYWRWQYKYD 1 72. PYWKWIYKYD
13. SYWKWQYKYD 43. PYWN WQYKYD 73. PYWKWLYKYD 14.TYWKWQYKYD 44. PYWDWQYKYD 74. PYWKWKYKYD 15. WYWKWQYKYD 45. PYWQWQYKYD 75. PYWKWMYKYD 16.YYWKWQYKYD 46. PYWEWQYKYD 76. PYWKWFYKYD 17.VYWKWQYKYD 47. PYWGWQYKYD 77. PYWKWSYKYD 18. PAWKWQYKYD 48. PYWHWQYKYD 78. PYWKWTYKYD 19.PNWKWQYKYD 49. PYWI WQYKYD 79. PYWKWWYKYD13. 43. SYWKWQYKYD PYWN WQYKYD 73. PYWKWLYKYD 14.TYWKWQYKYD 44. PYWDWQYKYD 74. PYWKWKYKYD 15 WYWKWQYKYD 45. PYWQWQYKYD 75. PYWKWMYKYD 16.YYWKWQYKYD 46. PYWEWQYKYD 76. PYWKWFYKYD 17.VYWKWQYKYD 47. PYWGWQYKYD 77. PYWKWSYKYD 18 PAWKWQYKYD 48 PYWHWQYKYD 78. PYWKWTYKYD 19.PNWKWQYKYD 49. PYWI WQYKYD 79. PYWKWWYKYD
20. PDWKWQYKYD 50. PYWLWQYKYD 80. PYWKWYYKYD20. PDWKWQYKYD 50. PYWLWQYKYD 80. PYWKWYYKYD
21. PQWKWQYKYD 51. PYWMWQYKYD 81. PYWKWVYKYD21. PQWKWQYKYD 51. PYWMWQYKYD 81. PYWKWVYKYD
22. PEWKWQYKYD 52. PYWFWQYKYD 82. PYWKWQAKYD 23.PGWKWQYKYD 53. PYWPWQYKYD 83. PYWKWQN KYD22. PEWKWQYKYD 52. PYWFWQYKYD 82. PYWKWQAKYD 23.PGWKWQYKYD 53. PYWPWQYKYD 83. PYWKWQN KYD
24. PHWKWQYKYD 54. PYWSWQYKYD 84. PYWKWQDKYD24. PHWKWQYKYD 54. PYWSWQYKYD 84. PYWKWQDKYD
25. PIWKWQYKYD 55. PYWTWQYKYD 85. PYWKWQQKYD25. PIWKWQYKYD 55. PYWTWQYKYD 85. PYWKWQQKYD
26. PLWKWQYKYD 56. PYWWWQYKYD 86. PYWKWQEKYD26. PLWKWQYKYD 56. PYWWWQYKYD 86. PYWKWQEKYD
27. PMWKWQYKYD 57. PYWYWQYKYD 87. PYWKWQGKYD27. PMWKWQYKYD 57. PYWYWQYKYD 87. PYWKWQGKYD
28. PFWKWQYKYD 58. PYWVWQYKYD 88. PYWKWQHKYD 29.PPWKWQYKYD 59. PYWKAQYKYD 89. PYWKWQIKYD 30. PSWKWQYKYD 60. PYWKHQYKYD 90. PYWKWQLKYD 91. PYWKWQFKYD 104. PYWKWQYIYD 117. PYWKWQYKED28. PFWKWQYKYD 58. PYWVWQYKYD 88. PYWKWQHKYD 29.PPWKWQYKYD 59. PYWKAQYKYD 89. PYWKWQIKYD 30. PSWKWQYKYD 60. PYWKHQYKYD 90. PYWKWQLKYD 91. PYWKWQFKYD 104. PYWKWQYIYD 117. PYWKWQYKED
92.PYWKWQSKYD 105.PYWKWQYLYD 118.PYWKWQYKGD92.PYWKWQSKYD 105.PYWKWQYLYD 118.PYWKWQYKGD
93. PYWKWQTKYD 106. PYWKWQYMYD 119. PYWKWQYKHD93. PYWKWQTKYD 106. PYWKWQYMYD 119. PYWKWQYKHD
94.PYWKWQWKYD 107.PYWKWQYFYD 120.PYWKWQYKID94.PYWKWQWKYD 107.PYWKWQYFYD 120.PYWKWQYKID
95. PYWKWQVKYD 108. PYWKWQYPYD 121. PYWKWQYKLD95. PYWKWQVKYD 108. PYWKWQYPYD 121. PYWKWQYKLD
96. PYWKWQYAYD 109. PYWKWQYSYD 122. PYWKWQYKFD96. PYWKWQYAYD 109. PYWKWQYSYD 122. PYWKWQYKFD
97.PΫWKWQYRYD 110.PYWKWQYWYD 123. PYWKWQYKPD97.PΫWKWQYRYD 110.PYWKWQYWYD 123. PYWKWQYKPD
98. PYWKWQYNYD 111. PYWKWQYYYD 124. PYWKWQYKSD98. PYWKWQYNYD 111. PYWKWQYYYD 124. PYWKWQYKSD
99. PYWKWQYDYD 112. PYWKWQYVYD 125. PYWKWQYKTD99. PYWKWQYDYD 112. PYWKWQYVYD 125. PYWKWQYKTD
100. PYWKWQYQYD 113. PYWKWQYKAD 126. PYWKWQYKWD100. PYWKWQYQYD 113. PYWKWQYKAD 126. PYWKWQYKWD
101. PYWKWQYEYD 114.PYWKWQYKND 127.PYWKWQYKVD101. PYWKWQYEYD 114.PYWKWQYKND 127.PYWKWQYKVD
102. PYWKWQYDYD 115. PY W KWQYKD D 128. PYW KWQYKYE102. PYWKWQYDYD 115. PY W KWQYKD D 128. PYW KWQYKYE
103. PYWKWQYHYD 116. PYWKWQYKQD 103. PYWKWQYHYD 116. PYWKWQYKQD

Claims

Patentansprüche claims
1. Verwendung eines Peptids zur Blockierung der Wirkung von FVIII1. Use of a peptide to block the action of FVIII
Inhibitoren, wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, - indestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe - am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.Inhibitors, wherein the peptide comprises eight to fifteen amino acids and in the amino acid sequence the following amino acids must be present at least two Tyr, - at least one amino acid which carries a positive or negative total charge under physiological conditions, at least one amino acid with hydrophobic aromatic residue, at the N -terminal end an amino acid is present, which is selected from the group consisting of Pro, Arg, Tyr or Phe - at the C-terminal end Asp, Arg, Lys, His or Phe is present, and no Cys and / or VaI-VaI occurs in the amino acid sequence.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei höchstens vier Tyr in der Aminosäuresequenz vorhanden sind.2. Use according to claim 1, wherein at most four Tyr are present in the amino acid sequence.
3. Verwendung nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die geladene Aminosäure unter physiologischen Bedingungen eine positive Ladung trägt.3. Use according to claim 1 and / or 2, wherein the charged amino acid carries a positive charge under physiological conditions.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die positiv geladene Aminosäure Lys oder Arg ist.4. Use according to claim 3, wherein the positively charged amino acid is Lys or Arg.
5. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest Trp und/oder Phe und/oder Tyr ist.5. Use according to at least one of claims 1 to 4, wherein the amino acid with hydrophobic aromatic radical Trp and / or Phe and / or Tyr is.
6. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Aminosäuresequenz ein Dekapeptid umfasst.6. Use according to any one of claims 1 to 5, wherein the amino acid sequence comprises a decapeptide.
7. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe der Peptide mit der7. Use according to any one of claims 1 to 6, wherein the peptide is selected from the group of peptides with the
Seq ID No. Sl/1-240, S2/1-131 und S3/1-128. Seq ID no. Sl / 1-240, S2 / 1-131 and S3 / 1-128.
8. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Peptid mit anderen Molekülen konjugiert ist, die eine Halbwertszeit in vivo verlängern, wie mit z. B. hochmolekularem Polyethylenglycol, Dextran oder Agarose. 8. Use according to any one of claims 1 to 7, wherein the peptide is conjugated with other molecules that extend a half-life in vivo, as with z. As high molecular weight polyethylene glycol, dextran or agarose.
9. Verwendung nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq ID No. S3/58, Sl/238, S2/48, S2/35, S2/129, Sl/160, Sl/171, Sl/173. 9. Use according to any one of claims 1 to 8, wherein the peptide is selected from the group consisting of Seq ID no. S3 / 58, Sl / 238, S2 / 48, S2 / 35, S2 / 129, Sl / 160, Sl / 171, Sl / 173.
10. Peptid zur Blockierung der Wirkung von FVIII Inhibitoren wobei das Peptid acht bis 15 Aminosäuren umfasst und in der Aminosäuresequenz gleichzeitig folgende Aminosäuren vorhanden sein müssen mindestens zwei Tyr, mindestens eine Aminosäure, die unter physiologischen Bedingungen eine positive oder negative Gesamtladung trägt, - mindestens eine Aminosäure mit hydrophobem aromatischem Rest, am N-terminalen Ende eine Aminosäure vorhanden ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pro, Arg, Tyr oder Phe am C-terminalen Ende Asp, Arg, Lys, His oder Phe vorhanden ist, und kein Cys und/oder VaI-VaI in der Aminosäuresequenz vorkommt.10. A peptide for blocking the action of FVIII inhibitors wherein the peptide comprises eight to fifteen amino acids and in the amino acid sequence simultaneously the following amino acids must be present at least two Tyr, at least one amino acid, which carries a positive or negative total charge under physiological conditions, - at least one Amino acid with hydrophobic aromatic radical, at the N-terminal end of an amino acid is present, which is selected from the group consisting of Pro, Arg, Tyr or Phe at the C-terminal end Asp, Arg, Lys, His or Phe is present, and no Cys and / or VaI-VaI occurs in the amino acid sequence.
11. Peptid mit der Struktur11. Peptide with the structure
RHYX1X2X3X4X5HF mitRHYX 1 X 2 X 3 X 4 X 5 HF with
X1 = Q oder KX 1 = Q or K
X2 = Y oder QX 2 = Y or Q
X3 = N oder YX 3 = N or Y
X4 = F oder QX 4 = F or Q
X5 = Q oder F.X 5 = Q or F.
12. Peptid mit der Struktur12. Peptide with the structure
X6X7X8X9X10X11YKYD mit X6 = P oderHX 6 X 7 X 8 X 9 X 10 X 11 YKYD with X 6 = P or H
X7 = YoderHX 7 = YoderH
X8 = K, WoderYX 8 = K, W or Y
X9 = Y, R, KoderV x10 — WoderTX 9 = Y, R, KoderV x 10 - WoderT
X" = FoderQ.X "= FoderQ.
13. Peptid mit der Struktur nach Anspruch 12, mit X6 = P und X7 = Y13. The peptide having the structure of claim 12, wherein X 6 = P and X 7 = Y
undand
X8 ~" K,WoderYX 8 ~ "K, WoderY
X9 = Y, RoderKX 9 = Y, RoderK
X10 = W oderTX 10 = W or T
X11 = F oderQ.X 11 = F or Q.
14. Peptid mit der Struktur nach Anspruch 12, mit X8 = K, X9 = Y, X10 = T und X" = F sowie X6 = P oder H und X7 = Y oder H.14. A peptide having the structure according to claim 12, wherein X 8 = K, X 9 = Y, X 10 = T and X "= F and X 6 = P or H and X 7 = Y or H.
15. Peptid mit der Struktur nach Anspruch 12, mit X10 = W und X ■11 = Q15. A peptide having the structure of claim 12, wherein X 10 = W and X ■ 11 = Q
undand
X6 = P und X7 = Y sowie X8 = W oder Y und X9 = R oder K.X 6 = P and X 7 = Y and X 8 = W or Y and X 9 = R or K.
16. Peptide nach mindestens einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der N- und/oder C-Terminus der Aminosäuresequenz mit Gruppen modifiziert ist, die einen Abbau des Peptids verzögern. 16. Peptides according to at least one of claims 12 to 15, wherein the N and / or C-terminus of the amino acid sequence is modified with groups which delay degradation of the peptide.
17. Peptide gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, aufgebaut aus den Aminosäuren in der entsprechenden D-Konfiguration. 17. Peptides according to any one of claims 12 to 15, composed of the amino acids in the corresponding D configuration.
18. Arzneimittel enthaltend mindestens eines der in den Ansprüchen 1 bis 17 genannten Peptiden.18. Medicaments containing at least one of the peptides mentioned in claims 1 to 17.
19. Verwendung der in den Ansprüchen 1 bis 17 genannten Peptide zur Herstellung einer Vakzine.19. Use of the peptides mentioned in claims 1 to 17 for the preparation of a vaccine.
20. Verfahren zur Herstellung der in den Ansprüchen 1 bis 17 genannten Peptide mittels chemischer oder gentechnischer Verfahren. 20. A process for the preparation of the peptides mentioned in claims 1 to 17 by means of chemical or genetic engineering methods.
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