WO2005107731A1 - Remedies containing vitamin k2 as the active ingredient - Google Patents

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hydrate
menatetrenone
agent
cancer
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Iwata Ozaki
Hao Zhang
Toshihiko Mizuta
Kyosuke Yamamoto
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Eisai R & D Management Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a cyclin D1 expression inhibitor, an NF- ⁇ B activation inhibitor, and an I ⁇ B phosphorylation inhibitor containing vitamin K 2 (eg, menatetrenone) or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a cancer cell growth inhibitor and a cancer therapeutic containing these inhibitors as an active ingredient.
  • the present invention provides an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergic agent, a transplant rejection inhibitor, a therapeutic agent for psoriasis, comprising vitamin K 2 (for example, menatetolenone) or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to an antiviral agent, a therapeutic agent for arteriosclerosis, a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for renal failure.
  • Vitamin K is a coenzyme of ⁇ -daltamyl carboxylase, an enzyme that converts the glutamate residue at the N-terminus of vitamin-dependent protein into bioactive y-carboxyglutamic acid (GLA).
  • Vitamin ⁇ is an essential vitamin for the biosynthesis of vitamin ⁇ -dependent proteins such as blood coagulation factor II (prothrombin), VII, IX and X.
  • Vitamin IV family 1 is composed of natural K 1 (phytonadione), ⁇ 2 (menatetolenone) and synthetic ⁇ 3 (menadione). Vitamin 2, especially menatetrenone, is marketed as a treatment for osteoporosis.
  • Vitamin kappa 2 e.g. menatetrenone has been reported to inhibit the proliferation of hepatoma cell lines (Hep3B, Hep40) (1 _ 3). Moreover, menatetrenone, in leukemia cells (Primary, HL-60, etc.), are known to induce apoptosis and differentiation (4 _ 7). Furthermore, it has been reported that geranylgeraniol, a side chain of menatetrenone, induces apoptosis in tumor cell lines (HL-60, K562, Molt3, Colo320DM) ( 8) , as well as menaquinone-3 and menaquinone-4.
  • Vitamin K 2 power such as menaquinone 1-5 It has been reported to induce apoptosis in primary cultured leukemia cells ( 4) . In recent years, it has been known that menatetrenone suppresses recurrence of liver cancer in patients after liver cancer treatment and increases the survival rate ( 9) . However, the molecular mechanism by which vitamin K2 suppresses cancer cell growth is not fully understood.
  • the present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is to determine the molecular mechanism by which vitamin K2 represented by menatetrenone suppresses cancer cell growth. It is an object of the present invention to provide a highly effective and safe drug and treatment method for cancer patients.
  • Another object of the present invention is to elucidate the molecular mechanism of vitamin K2 and to provide a new therapeutic agent and method for a disease.
  • menatetrenone inhibits the expression of cyclin D1 in liver cancer cells, inhibits NF- / B, and inhibits ⁇ . It was found to inhibit phosphorylation.
  • menatetrenone inhibits cyclin D1 expression, inhibits NF- / cB, and inhibits I / cB phosphorylation, so that menatetrenone is useful in suppressing cancer cell growth and treating cancer Furthermore, they found that the antitumor effect of menatetrenone was enhanced by combining it with an antitumor agent.
  • menatetrenone inhibits NF- ⁇ B activation, anti-inflammatory drugs, anti-rheumatic drugs, immunosuppressants, anti-allergic drugs, transplant rejection suppressants, psoriasis treatment drugs, antiviral drugs, and atherosclerosis treatment
  • the present invention was found to be useful as an agent, a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes or a therapeutic agent for renal failure, and completed the present invention.
  • the present invention relates to the following.
  • An NF- ⁇ B activation inhibitor comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • a ⁇ phosphoric acid inhibitor comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • Anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic, transplant rejection suppressant, psoriasis treatment, anti-viral, arteriosclerosis treatment containing vitamin ⁇ 2 or its hydrate as an active ingredient At least one agent selected from the group consisting of a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for renal failure.
  • a cyclin D1 expression inhibitor comprising vitamin II or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • a method for inhibiting NF- / C ⁇ activation which comprises administering vitamin ⁇ 2 or a hydrate thereof to a living body.
  • a method for inhibiting ⁇ phosphorylation which comprises administering vitamin ⁇ 2 or a hydrate thereof to a living body.
  • Inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral diseases characterized by administering to a patient an effective amount of an agent containing vitamin ⁇ 2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • the agent described in (4) is administered to a patient in an effective amount, which is characterized by inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral disease, arteriosclerosis, ischemic relapse.
  • a method for inhibiting expression of citalin D1 comprising administering vitamin ⁇ ⁇ 2 or a hydrate thereof to a living body.
  • a cancer treatment agent comprising a combination of vitamin 2 or a hydrate thereof and an antitumor substance.
  • a cancer therapeutic agent comprising a combination of vitamin ⁇ 2 or a hydrate thereof and 5-FU.
  • the cancer therapeutic agent according to any one of (19) to (21), wherein the cancer is liver cancer. Further, the present invention relates to the following.
  • a cancer cell growth inhibitor comprising the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) as an active ingredient.
  • a therapeutic agent for cancer comprising as an active ingredient the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5).
  • a method for treating cancer comprising administering an effective amount of the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) to a patient.
  • vitamin ⁇ 2 for example, menatetrenone
  • an antitumor agent enhances the antitumor effect of vitamin ⁇ 2. This has made it possible to greatly improve the quality of life of cancer patients.
  • Vitamin ⁇ 2 inhibits the activation of NF- ⁇ and the phosphorylation of ⁇ ⁇ , and that vitamin K2 activates NF- ⁇ B or phosphorylates I ⁇ B.
  • Vitamin K2 is an effective anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic, transplant rejection inhibitor, psoriasis treatment, anti-will It has become possible to use it as an active ingredient in medicines, arteriosclerosis treatment, ischemic reperfusion injury treatment, diabetes treatment or renal failure treatment.
  • Figure 1 shows the results of analysis of changes in cyclin D1 due to treatment with menatetrenone by Western blotting (A), RT-PCR (B), and luciferase reporter Atsusei (C). .
  • FIG. 2 shows the results of an examination of the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF-cB by gel shift assay.
  • FIG. 3 shows the results of examining the effect of menatetrenone on the transcriptional activity of NF- ⁇ using the NF- / cB luciferase reporter plasmid. 4, in order to investigate the role of transcription factor AP-1 and NF-? Kappa B in cyclin D1 promoter active '1 1 production regulation by menatetrenone, in hepatoma cells, wild-type AP-1 and NF-?
  • Figure 5 shows that NF- ⁇ B dependence of cyclin D1 promoter activity by menatetrenone was confirmed by introducing p65 / RelA, a subunit of NF- / cB, into hepatoma cells and overexpressing the cyclin D1 promoter by menatetrenone. It is a result of examining whether or not the suppression of the activity is released.
  • Figure 6 shows that the subunit of p65 / RelA or cyclin D1 gene was introduced into hepatocellular carcinoma cells HepG2 in order to examine whether the inhibition of hepatoma cell growth was dependent on NF- / cB or cyclin D1. This figure shows the results of examining whether or not reproductive suppression by menatetrenone changes.
  • Figure 7 shows that the NF- ⁇ subunit p65 / RelA or the cyclin D1 gene was added to the hepatoma cell Hep3B in order to examine whether the suppression of hepatoma cell growth was dependent on NF-KB or cytaline D1. Introduced growth suppression by menatetrenone It shows the result of examining whether the system will change.
  • Fig. 8 shows the results of examining the effects of low-concentration 5-FU (5 ⁇ g / ml) and menatetrenone, which do not cause abotosis on hepatoma cells HepG2, Hep3B, and Huh7, on hepatoma cells and the effect on cell proliferation. It is shown.
  • FIG. 9 shows the results of Western blot analysis of the phosphorylation of I ⁇ B, the expression level of I ⁇ ; B protein, and the transfer of ⁇ 65 subunit to the nucleus.
  • FIG. 10 shows the results of examining the effect of menatetrenone on the activation of NF- ⁇ induced by TPA, TNF-a, and IL-1 using a luciferase reporter atsey.
  • FIG. 11 shows the results of an examination of the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF- ⁇ B induced by TPA, TNF-a, and IL-1 by gel shift assay.
  • Figure 12 shows the results of Western blot analysis of the effects of menatetrenone on I ⁇ phosphorylation and I ⁇ protein levels under TPA, TNF-a, and IL-1 ⁇ stimulation. .
  • Figure 13 shows the results of in vitro kinase assay analysis of the effect of menatetrenone on the kinase activity of the IKK complex under the stimulation of TPA and TNF-aIL_1] 3.
  • Vitamin K2 is known to have the effect of suppressing the growth of cancer cells.
  • the present inventors have elucidated the molecular mechanism of this cancer cell growth inhibitory action, and surprisingly found that vitamin ⁇ 2 inhibits the expression of cyclin D1, a factor that plays an important role in cell growth.
  • This inhibition of cyclin D1 expression was caused by the inhibition of phosphorylation of ⁇ , a transcription factor of the cyclin D1 promoter, by vitamin ⁇ 2, thereby inhibiting the activation of NF-zcB.
  • vitamin K2 inhibits the activation of ⁇ by inhibiting ⁇ phosphoric acid, resulting in the inhibition of the expression of cytaline D1, which uses NF- ⁇ as a transcription factor.
  • the present invention provides a cyclin D1 expression inhibitor, an NF- ⁇ activation inhibitor, an I / cB phosphoric acid inhibitor, and an inhibitor comprising these inhibitors, which contain vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • Cancer cell proliferation inhibitor, cancer therapeutic agent, and cyclin D1 expression inhibiting method using vitamin K2 or a hydrate thereof, NF- ⁇ activation inhibiting method, I / cB phosphorylation inhibiting method Provided are a method for suppressing cancer cell growth using an inhibitor and a method for treating cancer.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for cancer comprising a combination of vitamin II or a hydrate thereof and an antitumor substance for cancer patients.
  • vitamin ⁇ 2 inhibits activation of NF- ⁇ and inhibits phosphorylation of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • vitamin ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2 is useful for the treatment of diseases caused by activation of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ or phosphorylation of ⁇ . It is. Therefore, the present invention provides an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergy agent, a transplant rejection inhibitor, a psoriasis treatment agent, an antiviral agent, which contains vitamin ⁇ 2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a therapeutic agent for arteriosclerosis, a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes or renal failure, and a therapeutic method using the same.
  • vitamin 2 or a hydrate thereof may be used as an active ingredient for all or two or more of the above-mentioned agents, or may be used as an active ingredient for one of the above-mentioned agents. it can.
  • vitamin K2 inhibits the activation of NF- ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ and the phosphorylation of ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ in liver cancer cells. Therefore, vitamin ⁇ 2 can be used as an active ingredient of an activation inhibitor of and a phosphorylation inhibitor of ⁇ .
  • NF- ⁇ is one of the transcription factors, forms a complex with I ⁇ B, and is known to exist in the inactive state in the cytoplasm (Baeuerle, PA and Baltimore, D. Science 242). Beg, AA et al. Genes Dev. 7, 2064-2070, 1993; Finco, TS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11883-11888, 1994 ⁇ ).
  • the complex in the inactivated state is activated through phosphorylation of serine (Serine-32) and serine (Serine-36) of the second and third amino acids of I ⁇ B.
  • Activated NF- ⁇ translocates into the nucleus (Finco, TS et al. Proc. Natl. Acad.
  • Vitamin K 2 in order to inhibit the phosphorylation of I kappa B, complex inactivated state active activatable Sarezu, resulting in the this Vitamin K2 NF-? / Activation of B is inhibited Become.
  • an agent for inhibiting the activation of NF- ⁇ B containing vitamin K2 or hydrate thereof, or vitamin K2 or hydrate thereof, and an agent for inhibiting phosphorylation of I ⁇ B are NF -It is possible to suppress an increase in the expression levels of cytokines, chemopotins, adhesion molecules, cyclins, etc., through inhibition of ⁇ activation and inhibition of I / c B phosphorylation. That is, the NF- ⁇ activity inhibitor and the ⁇ phosphate inhibitor are useful for treating diseases caused by these physiologically active substances.
  • the agent is, for example, an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergic agent, a transplant rejection inhibitor, a therapeutic agent for psoriasis, an antiviral agent, a therapeutic agent for atherosclerosis, ischemic reperfusion injury
  • an anti-inflammatory agent for example, an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergic agent, a transplant rejection inhibitor, a therapeutic agent for psoriasis, an antiviral agent, a therapeutic agent for atherosclerosis, ischemic reperfusion injury
  • a therapeutic agent for diabetes or a therapeutic agent for renal failure It also inhibits NF- ⁇ NF activation.
  • Harmful agents and ⁇ phosphorylation inhibitors are also useful as cyclin D1 expression inhibitors. This cyclin D1 is known to play an important role in cell proliferation. That is, the NF- ⁇ activation inhibitor or the ⁇ phosphorylation inhibitor is useful
  • cancer is not particularly limited, and examples thereof include brain tumor, cervical cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, tongue cancer, lung cancer, breast cancer, spleen cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, colon cancer, At least one selected from the group consisting of small intestine and duodenum cancer, colon cancer, rectal cancer, bladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, sarcoma and melanoma can be mentioned.
  • it is liver cancer.
  • vitamin 2 is preferably menatetrenone
  • the target for cell growth suppression and the target for cancer treatment are preferably liver cancer cells and liver cancer.
  • ⁇ phosphorylation inhibitor means an agent having an action of inhibiting the phosphorylation of ⁇ ⁇ required for dissociation from NF- / cB in a living body or a part of the living body.
  • IKK I ⁇ B kinase
  • IKK I ⁇ B kinase
  • NF- ⁇ B activation inhibitor means an agent having an action of inhibiting the function of transcription factor NF- ⁇ B.
  • an agent that inhibits release of NF- / cB from a complex with I ⁇ B in an organism or a part of an organism, an agent that inhibits NF- ⁇ B translocation to the nucleus, NF- ⁇ B examples include an agent that inhibits the DNA binding activity of B, and an agent that inhibits the transcriptional activity of NF- ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the inhibition of the activation of NF- ⁇ or the inhibition of the phosphorylation of I ⁇ can be carried out by administering vitamin 2 or its hydrate to a living body or a part thereof.
  • the dosage and administration method for humans can be referred to the description of the dosage of the pharmaceutical composition containing vitamin 2 described below.
  • the "part of a living body” is a cancer cell line
  • vitamins kappa 2 to 10 '8 to 10, 2 Micromax, preferably 10 ⁇ 7 to 10 ⁇ 3 Micromax, more preferably 10.6 - In a medium containing L0 ' 4 M at a concentration of 12 to 96 hours, preferably
  • the NF- ⁇ B activation inhibitory action and I ⁇ B phosphorylation inhibitory action can also be examined by using the transcriptional activity of NF- ⁇ as an index.For example, they can be examined by the method described in Example 2 or 3. Can be.
  • the “living body” is a living body of a mammal, and in the present invention, the “living body” is preferably a living body of a mammal having cancer, more preferably a living body of a mammal having liver cancer. .
  • “part of a living body” includes each organ, tissue, body fluid (including blood, cerebrospinal fluid, lymph, saliva, etc.) or cells derived from mammals.
  • the “part of the living body” is preferably each organ, tissue or cancer cell that has developed cancer, more preferably liver or liver cancer cell that has developed cancer.
  • the cancer cells may be primary cultured cells or cell lines.
  • a mammal refers to a human or non-human mammal (eg, mouse, rat, hamster, guinea pig, egret, stag, dog, canine, magpie, monkey, etc.).
  • the mammal is preferably a human.
  • vitamin II inhibits cyclin D1 expression in liver cancer cells. Therefore, vitamin II can be used as an active ingredient of a cyclin D1 expression inhibitor.
  • cyclin D1 is known as a protein that regulates the cell cycle.
  • Rb Retinoblastoma protein
  • E2F the transcription factor E2F is released from the E2F-Rb complex, which promotes the transition from the G1 phase to the S phase of the cell cycle and activates cell proliferation (Sherr, CJ Science 274). , 1672-1677, 1996.).
  • vitamin K2 which inhibits the expression of cyclin D1 is useful as a cell-proliferation inhibitor and a therapeutic agent for cancer.
  • vitamin K2 is preferably menatetrenone
  • the subject for suppressing cell growth and the subject for treating cancer are preferably liver cancer cells and liver cancer.
  • the “cyclin D1 expression inhibitor” refers to an agent having an action of decreasing the expression level of cyclin D1 or stopping the expression of cyclin D1 in a living body or a part of the living body.
  • vitamin 2 or a hydrate thereof may be administered to a living body or a part thereof. That is, the activity of the administered vitamin II or a hydrate thereof suppresses the activity of the cyclin D1 promoter and inhibits the expression of cyclin D1.
  • the dosage and administration method for humans can be referred to the description of the dosage of the pharmaceutical composition containing vitamin 2 described below.
  • the "part of a living body” is a cancer cell
  • a vitamin ⁇ 2 10- 8 ⁇ 10- 2 ⁇ preferably 10 - 7 ⁇ : 10 ⁇ 3 Micromax, more preferably 10.6 -
  • the expression of cyclin D1 can be inhibited.
  • the expression level of cyclin D1 can be examined, for example, by measuring the amount of cyclin D1 mRNA by RT "PCR, or by measuring the amount of cyclin D1 protein by dust blotting. It can also be examined, for example, by the method described in Example 1.
  • cancer cell growth inhibitor refers to an agent that has the effect of suppressing the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells, or the function of stopping the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells.
  • the cyclin D1 expression inhibitor, the NF- ⁇ activation inhibitor, and the B phosphorylation inhibitor are effective in suppressing the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells. Therefore, when these inhibitors are administered to a living body or a part thereof, cancer cells, preferably CYCIN D1 expression inhibition, NF- ⁇ B activation inhibition, and / or I / cB phosphorylation inhibition are inhibited. It can suppress the growth of liver cancer cells.
  • the dosage and administration method for Reference can be made to the description of the dosage of the pharmaceutical composition containing Tamine K2.
  • the previous SL "part of a living body" is a cancer cell line
  • vitamins kappa 2 to 10 ⁇ 8 to 10-2 Micromax favored properly is 10 ⁇ 7 ⁇ 10 ⁇ 3 ⁇ , more preferably 10 ' Cell culture can be suppressed by culturing for 12 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, more preferably 48 hours in a medium containing a concentration of 6 to 10 4 ⁇ .
  • Cell growth inhibitory effects can be measured, for example, by measuring nucleic acid uptake (tritiated thymidine method), mitochondrial activity measurement ( ⁇ method, Alamar Blue method, etc.), DNA amount measurement method, glucose A method for measuring consumption, a method for measuring cell number or cell area by image analysis, a method for measuring fluorescence intensity (a method using fluorescently labeled cells), etc., or the method described in Example 4 or 5. , You can also check.
  • cancer treatment refers to suppressing cancer progression in a patient suffering from cancer, eliminating cancer tumors, suppressing tumor growth, preventing the onset of cancer, or recurring cancer. Means to prevent.
  • the “cancer therapeutic agent” refers to an agent used for the above treatment or an agent having a therapeutic effect.
  • the therapeutic agent for cancer of the present invention is administered to a patient, inhibition of cyclin D1 expression, inhibition of NF- ⁇ activation, and / or I / c B phosphate Cancer treatment can be performed through the inhibition of the dagger.
  • the carcinoma to be treated is preferably liver cancer.
  • the effectiveness of cancer treatment can be determined by radiographic findings, CT, MRI, PET, etc., by histopathological diagnosis of biopsy, or by the value of tumor markers.
  • the stage of the cancer is not particularly limited. For example, each stage (stage I, II, III, II, IIIA, III, IV) classified by the TNM classification is included.
  • the cyclin D1 expression inhibitor, NF- ⁇ activation inhibitor, I / c ⁇ phosphorylation inhibitor, anti-inflammatory agent, anti-cyclin D1 expression inhibitor of the present invention comprising vitamin ⁇ 2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
  • Rheumatism, immunosuppressant, antiallergic, transplant rejection suppressant, psoriasis treatment, antiviral, arteriosclerosis treatment, ischemic reperfusion injury treatment, renal failure treatment The agent for suppressing cancer cell proliferation, the agent for treating diabetes, or the agent for treating cancer is hereinafter sometimes collectively referred to as “the pharmaceutical composition of the present invention”.
  • vitamin K 2 used in the present invention is synthesized by intestinal bacteria in a living body, so that various homologs having similar structures exist.
  • the structural formula of menaquinone is shown in the following formula (I).
  • n an integer of 1 to 7.
  • Menatetrenone used in the present invention is a chemical compound represented by the chemical name 2-methyl-3-tetrapreninole-1,4-afphtoquinone (2-methl-3-tetraprenyl-1,4-nahthoqumone), and is a typical vitamin K 2 It is. Its structural formula is shown in the following formula (II).
  • Menatetrenone is a yellow crystalline or oily substance that has no odor and is easily decomposed by light. It is hardly soluble in water. Menatetrenone is also referred to as vitamin II-II and VK-II.
  • vitamin II such as menatetrenone
  • blood coagulation factors prothrombin, VII, IX, and X
  • ⁇ -potency glutamate which has biological activity.
  • the pharmacological action of vitamin K2 such as menatetrenone promotes hepatic synthesis of normal oral thrombin and the like, activates the hemostatic mechanism of the living body, and exerts a physiological hemostatic action.
  • Vitamin-2 preferably menatetrenone, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, may be an anhydride or may form a hydrate. Menatetrenone may have a polymorphism, but is not limited to a particular crystal form. Any one of the crystal forms may be single or a mixture of crystal forms. Furthermore, the present invention also encompasses metabolites generated by decomposing vitamin ⁇ 2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof used in the present invention in a living body.
  • the vitamin 2 or a hydrate thereof used in the present invention can be produced by a known method, and a typical example is disclosed in JP-A-49-55650. It can be easily manufactured by the method. It can also be obtained as a commercial product from a synthesis manufacturer.
  • Menatetrenone or a hydrate thereof used in the present invention can also be produced by a known method, and a typical example is a method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 49-55650. According to the method, it can be easily manufactured and can be easily obtained from a synthesis manufacturer. Menatetrenone is available in capsules (for example, "K2 Capsule” and “Darakei Capsule” (both from Eisai Co., Ltd.)), injections (for example, "K2 ⁇ ⁇ Note” (Eisai Co., Ltd.)), syrups (For example, “K2SILOP” (manufactured by Eisai Co., Ltd.)).
  • capsules for example, "K2 Capsule” and “Darakei Capsule” (both from Eisai Co., Ltd.)
  • injections for example, "K2 ⁇ ⁇ Note” (Eisai Co., Ltd.)
  • syrups for example, “K2SILOP”
  • vitamin V2 used in the present invention a substance which is metabolized in the body to vitamin V2, preferably menatetrenone, may be used.
  • the substance which is metabolized into menatetrenone in the body is not particularly limited, but examples include vitamin Kl and phytonadione. Phytonadion can be obtained as K-One Capsule (trade name) (Eza Co., Ltd.), K-One Tablet (trade name) (Eisa Co., Ltd.) or Kane-san (trade name) (Eisa Co., Ltd.). it can.
  • the vitamin ⁇ 2 of the present invention preferably menatetrenone or its hydrate, is Although a pharmaceutical composition containing the same as a component can be used as it is, usually, a pharmaceutical composition prepared by mixing appropriate additives is used.
  • additives examples include excipients, binders, lubricants, disintegrants, coloring agents, flavoring agents, emulsifiers, surfactants, solubilizing agents, suspending agents, which are generally used in medicine.
  • examples include isotonic dandruffs, buffers, preservatives, antioxidants, stabilizers, absorption promoters, and the like. If desired, these can be used in appropriate combination.
  • the following are examples of the above additives.
  • Excipients lactose, sucrose, glucose, cornstarch, mannitol, sorbitol Le, starch, alpha starch, dextrin, crystalline cellulose, light anhydrous Kei acid, aluminum Kei, calcium Kei acid, magnesium aluminometasilicate, hydrogen phosphate calcium
  • Binders for example, polyvinyl alcohol, methylcellulose, ethylcellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, syrup, hydroxypropylmethyl cenorellose, hydroxypropinoresenolerose, canolepoxymethinoresenolerose sodium, polybierpyrrolidone, Macro goal
  • Lubricants magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, tanolek, polyethylene glycol, colloidal silica
  • Disintegrators crystalline cellulose, agar, gelatin, calcium carbonate, sodium bicarbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, low-substituted hydroxypropyl cerenolose, canoleboximetinolecellulose, phenolic methylcellulose Cros canolemelose sodium, canolepox methinolestarch, canolepoxy methyl starch sodium
  • Coloring agents Iron sesquioxide, yellow sesquioxide, carmine, caramel, beta-potassin, titanium oxide, tanolek, sodium riboflavin phosphate, yellow aluminum lake, etc., which are permitted to be added to pharmaceutical products
  • Flavoring agent cocoa powder, heart-shaped brain, fragrance powder, heart-shaped oil, dragon brain, cinnamon powder emulsifier or surfactant: stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, dariseri monostearate Sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester
  • Solubilizers polyethylene glycol, propylene glycol, benzyl benzoate, ethanol, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium taenoate, polysorbate 80, nicotinic acid amide
  • Suspending agent In addition to the above surfactants, hydrophilic polymers such as, for example, polybutyl alcohol, polybutylpyrrolidone, methinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyshethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.
  • hydrophilic polymers such as, for example, polybutyl alcohol, polybutylpyrrolidone, methinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyshethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.
  • Isotonizing agents include glucose, sodium salt, mannitol, sorbitol, and buffering agents: buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
  • Preservatives methyl paraben, propyl paraben, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid
  • Antioxidants sulfate, ascorbic acid, ⁇ -tocopherol
  • Stabilizer commonly used in medicine
  • Absorption enhancers those commonly used in medicine
  • components such as vitamins and amino acids may be added.
  • the above preparations include tablets, powders, granules, fine granules, capsules, syrups, troches, inhalants, etc .; suppositories, ointments, eye ointments, tapes, eye drops Agents, nasal drops, ear drops, cataplasms, lotions and the like, or external preparations and injections.
  • the oral preparation can be formulated by appropriately combining the above additives. In addition, you may coat these surfaces as needed.
  • the above-mentioned external preparations are, among the above-mentioned additives, particularly excipients, binders, flavoring agents, emulsifiers, surfactants, solubilizing agents, suspending agents, isotonic agents, preservatives, antioxidants, It can be formulated by appropriately combining a stabilizer or an absorption enhancer.
  • the above-mentioned injection includes, among the above-mentioned additives, particularly an emulsifier, a surfactant, a solubilizer, a suspending agent, a tonicity agent, a buffer, a preservative, an antioxidant, a stabilizer, or an absorption enhancer. They can be formulated in appropriate combinations.
  • Menatetrenone capsules are available under the brand name K2 Capsule (Eisai Co., Ltd.) Shike Co., Ltd.), Graquet Capsule (Eisai Co., Ltd.), Syrup as K2 Syrup (Eisai Co., Ltd.), and Injection as K2N Note (Eisai Co., Ltd.) Can be obtained.
  • vitamin K2 used in the present invention a substance which is metabolized in the body to form vitamin K2, preferably menatetrenone (for example, vitamin K1, phytonadione, etc.) can also be used.
  • menatetrenone for example, vitamin K1, phytonadione, etc.
  • the capsenole of Huitonadione is sold under the trade name K-One Capsule (manufactured by Eisai Co., Ltd.), and the tablets are manufactured under the trade name K-One Tablet (manufactured by Eisai Co., Ltd.).
  • K-One Capsule manufactured by Eisai Co., Ltd.
  • K-One Tablet manufactured by Eisai Co., Ltd.
  • the pharmaceutical composition of the present invention containing vitamin ⁇ 2 comprises cyclin D1 expression inhibition, NF- ⁇ activation inhibition, I / c ⁇ phosphorylation inhibition, cancer cells, preferably liver cancer cells, Or it is useful for treating cancer, preferably liver cancer.
  • the preferred dose (effective amount) of vitamin ⁇ 2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof is generally 10 to 20 Omg / day per adult (body weight 6 Okg). Yes, preferably 15-; 135 mg / day, more preferably 30-6 Omg / day (eg 45 mg / day).
  • the administration period is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 days, preferably 7 to 300 days.
  • the dose and the administration period can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect of cancer and the condition of the patient (for example, performance status).
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a patient suffering from cancer, it is possible to obtain a therapeutic effect on cancer without causing side effects (there is only a slight degree that does not affect patients even if side effects occur). is there.
  • the pharmaceutical composition containing vitamin K2 is useful for inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral disease, arteriosclerosis, ischemic reperfusion injury, diabetes, or renal failure It is.
  • the preferred dose (effective amount) of vitamin K2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof is generally 10 to 200 mg per adult (body weight 6 Okg).
  • the administration period is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 days, preferably 7 to 300 days.
  • the dose and the administration period can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect of cancer and the condition of the patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a patient, it does not cause side effects (there is a slight degree that does not affect the patient even if side effects occur), inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergies, transplant rejection , Psoriasis, viral diseases, arteriosclerosis, ischemic reperfusion injury, diabetes or renal failure, and the pharmaceutical composition of the present invention comprises all or a combination of two or more of the above diseases It can be treated or one of the above diseases can be treated. Furthermore, the present invention includes the use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises, as described above, a pharmaceutical composition comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient, and a NF- ⁇ B activation inhibitor or I of the present invention.
  • vitamin K2 is preferably menatetrenone.
  • the present invention provides administering to a patient the pharmaceutical composition of the present invention containing vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient, inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection.
  • vitamin K2 is preferably menatetrenone.
  • a pharmaceutical composition containing vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient, or the NF- ⁇ B activation inhibitor or the ⁇ phosphorylation inhibitor of the present invention as an active ingredient The administration route and administration method of the pharmaceutical composition containing the composition are not particularly limited, and the description of the pharmaceutical composition of the present invention can be referred to. 3.
  • the combination of an agent containing vitamin K2 and an antitumor agent of the present invention is useful for treating cancer, preferably liver cancer. That is, the present invention relates to a cancer therapeutic agent comprising vitamin K2 or a hydrate thereof and an antitumor substance (hereinafter, also referred to as “combination pharmaceutical composition of the present invention”), preferably a liver cancer therapeutic agent. provide.
  • the combined pharmaceutical composition of the present invention can be used for treating cancer, preferably for treating liver cancer.
  • the preferred dose (effective amount) of vitamin K2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof is usually 10 to 200 mg / day, preferably 15 to 20 mg / day for an adult (body weight of 6 O kg). 1135 mg / day, more preferably 30-6 O mg Z day (for example, 45 mg Z day).
  • the administration period is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 days, preferably 7 to 300 days. The dose and the administration period can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect of cancer and the condition of the patient (for example, performance status).
  • an antitumor substance is a substance having an antitumor action such as an action of suppressing tumor growth, an action of slowing down the growth rate of a tumor, an action of reducing a tumor, or an action of eliminating a tumor.
  • anti-JB ulcer substances include fluorouracil (5-FU, trade name 5-FU), CPT-11 (irinotecan, trade name topotecin, campto), mitomycin C (mytomycin C, trade name mitomycin), and cisplatin (cisplatin).
  • the dose of the antitumor substance is preferably in accordance with a normal clinical dose, and can be increased or decreased as appropriate.
  • “combined” means a combination for use in combination with a compound, in which separate substances are used in combination at the time of administration, and as a mixture. Including both forms.
  • vitamin K 2 or a hydrate thereof, or a formulated antitumor substance can be used.
  • the present invention includes the use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing a pharmaceutical composition in combination with an antitumor substance.
  • vitamin K2 is preferably menatetrenone.
  • the above pharmaceutical composition is useful as an agent for treating cancer.
  • the present invention also includes a method for treating cancer, which comprises administering an effective amount of vitamin K2 or a hydrate thereof and an antitumor substance to a patient simultaneously or separately.
  • vitamin K2 is preferably menatetrenone.
  • the route of administration and the method of administration of vitamin K2 or a hydrate thereof and an antitumor substance are not particularly limited, and the description of the pharmaceutical composition of the present invention can be referred to. .
  • the present invention will be described with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto.
  • menatetrenone was used as vitamin K2 (the title in the figure was “vitamine K2").
  • Example 1 Effect of Menatetrenone on Cyclin D1 Expression
  • menatetrenone suppresses proliferation of liver cancer cells in a concentration-dependent manner, and that the mechanism is that the cell cycle is arrested in G1 phase.
  • the effect of menatetrenone on the expression of the cytaline D1 gene was examined.
  • the cyclin D1 promoter luciferase plasmid The effect on non-cyclin Dl promoter activity was examined.
  • the plasmid used was -1745CD1LUC described in Reference Journal of Biological Chemistry. 270 (40), 23589-23597, 1995.
  • luciferase was used. The activity is sometimes shown as a relative value (relative luciferase activity) when the value in the control is taken as 100).
  • cyclin D1 in liver cancer cells was suppressed by menatetrenone in a concentration-dependent manner at both the protein level and the mRNA level (FIGS. 1A, B;).
  • menatetrenone inhibited the activity of cytaline D1 promoter in liver cancer cells in a concentration-dependent manner (Fig. 1C).
  • cyclin D1 has transcription factor AP-1 and NF- / cB binding regions in its promoter region, and its activity is regulated by these transcription factors.
  • the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF- ⁇ was examined by gel shift assay according to a conventional method.
  • the effect of menatetrenone on the transcriptional activity of NF-zcB was examined using NF- / cB luciferase reporter plasmid (Clontech).
  • menatetrenone suppressed the DNA binding activity of NF- ⁇ B in moon-dehydrated cancer cells Hep3B and Huh7 in a concentration-dependent manner (Fig. 2).
  • the DNA binding activity of NF- / B was inhibited by NF- ⁇ non-radioactive competitor, but was not suppressed by mutant NF- ⁇ B having no DNA binding activity.
  • a shift in the binding band of NF-KB was observed with antibodies against p65 and p5'0, which are NF-KB subunits.
  • menatetrenone suppressed the luciferase activity of the NF- / cB reporter plasmid in a concentration-dependent manner (Fig. 3).
  • Luciferase reporter assembly was performed using the mutant AP-1 having no binding activity and the cyclin D1 promoter having an NF- ⁇ B binding site, and the effects of the transcription factors AP-1 and NF-zcB were examined.
  • Menatetrenone was allowed to act on liver cancer cells at concentrations of 0, 10-6, 10-5, and 10-4 M for 48 hours, followed by luciferase reporter accession.
  • p65 / RelA a subunit of NF-cB
  • Menatetrenone 12 hours after the introduction into p65 / RelA bra plasmid of (pcDNA3.1 / p65) HepG2, 0 , 10- 6, was added at a concentration of 10- 5, 1CH M, was allowed to act for 48 hours.
  • p65 / RelA is a subunit of NF- ⁇ B
  • its overexpression in cells increases the expression level of NF- ⁇ . Therefore, when menatetrenone inhibits NF- ⁇ B activation and thereby suppresses cyclin D1 promoter activity, if the expression level of NF- ⁇ B increases, menatetrenone inhibits cyclin D1 promoter activity. The effect is expected to be suppressed.
  • menatetrenone was shown to be wild-type The luciferase activity of the Clin Dl promoter was suppressed (Fig. 4, top 1 and 2). Similar to the wild-type cyclin D1 promoter, the activity of the cyclin D1 promoter (-964AP-lmtCD1LUC) having the mutant AP-1 binding site was suppressed by menatetrenone in a concentration-dependent manner (Fig. 4, top 3). ). However, whereas the cyclin D1 promoter containing the wild-type NF- / cB binding site was repressed by menatetrenone in a concentration-dependent manner (the second row from the bottom in Fig. 4), the mutant NF- ⁇ In the cyclin D1 promoter (_66NF-KBmutCD1LUC), the suppression of promoter activity by menatetrenone was not observed (the first row from the bottom in FIG. 4).
  • menatetrenone exhibits an inhibitory effect on the cyclin D1 promoter activity by suppressing NF-zcB activation.
  • Example 4 Examination of NF- / cB and Citalin D1 Dependence of Hepatoma Cell Proliferation Inhibition by Menatetrenone
  • menatetrenone was reduced to 0, 10 using liver cancer cell HepG2 transfected with luciferase plasmid having a consensus sequence for NF- ⁇ in the promoter region as a reporter gene.
  • the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF- / cB was examined using HepG2 cells without stimulation and under stimulation with TPA, TNF- ⁇ , and IL-lj3 by the gel shift assay using the usual method. did.
  • menatetrenone When menatetrenone was added to HepG2 cells and the activity of NF-zcB was measured using a luciferase reporter assay, menatetrenone inhibited NF- ⁇ activity in a concentration-dependent manner (FIG. 10). Furthermore, ⁇ 20 nM, respective concentrations of TNF- a 10 nM, IL-1 ⁇ 1 nM was added to NF-? Kappa 0 menatetrenone the B in the state of being activated, 10 ⁇ 6, 10 ⁇ 5 , 10 ⁇ 4 M In all cases, the induced NF- / cB activity was suppressed in a concentration-dependent manner (FIG. 10).
  • the phosphorylation reaction by the kinase activity is performed by adding ⁇ -32 ⁇ - ⁇ to a solution containing the substrate GST-IK Bo; (1-54) and adding a certain amount of ⁇ complex to the solution at 37 ° C. minutes reacted, after electrophoresis anti ⁇ product in SDS-PAGE gels and detected phosphorylation of Iotakappabeta alpha by autoradiography scratch.
  • menatetrenone was not stimulated in various liver cancer cells and in various NF- / In the presence of the c B stimulus signal, it was found to have a concentration-dependent inhibitory effect on the activity of NF- ⁇ B.
  • NF- ⁇ p50 / p65 dimer
  • menatetrenone is NF- ⁇ (p50 / p65 dimer) suppresses the translocation to the nucleus and suppresses the phosphorylation of Ba ⁇ Ba, which is stagnated in the cytoplasm, and phosphorylates ⁇ . It shows that the effect is exhibited by suppressing It was.
  • cyclin D1 inhibits the expression of cyclin D1, inhibit NF- ⁇ , and inhibit ⁇ phosphoric acid in cancer cells, preferably in liver cancer cells, by using vitamin ⁇ 2.
  • these inhibitory effects suppress the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells, it has become possible to select and treat patients who can expect a more therapeutic effect.
  • the antitumor effect of menatetrenone is enhanced by using menatetrenone in combination with an antitumor substance. It has made it possible to greatly improve the quality of life of cancer patients.
  • vitamin ⁇ 2 activates NF- ⁇ and I ⁇ Vitamin K2 is an anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, antiallergic, transplant rejection inhibitor, psoriasis treatment, antiviral, arteriosclerosis treatment, ischemic It can be used as an active ingredient in therapeutic agents for perfusion injury, diabetes and renal failure.

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Abstract

NF-κB activation inhibitors and IκB phosphorylation inhibitors, containing vitamin K2 or hydrates thereof as the active ingredient. The invention brings about not only the efficacy of vitamin K2 as the remedy for a patient with liver cancer but also extremely high safeness in long-term administration of vitamin K2, which enables long-term treatment with vitamin K2 and contributes to great improvement in the quality of life of a patient with liver cancer.

Description

明 細 書 ビタミン K 2を有効成分として含む治療剤 技術分野  Description Therapeutic agent containing vitamin K2 as active ingredient
本発明は、 ビタミン K 2 (例えばメナテトレノン） 又はその水和物を有効成分 として含むサイクリン D1発現抑制剤、 NF- κ B活性化阻害剤おょぴ I κ Bリン酸 化阻害剤に関する。 また、 これらの阻害剤を有効成分として含む癌細胞増殖抑制 剤および癌治療剤に関する。 さらに、 本発明は、 ビタミン K 2 (例えばメナテト レノン） 又はその水和物を有効成分として含む抗炎症剤、 抗リウマチ剤、 免疫抑 制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗ウィルス剤、 動脈硬化 治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤および腎不全治療剤に関する。 背景技術  The present invention relates to a cyclin D1 expression inhibitor, an NF-κB activation inhibitor, and an IκB phosphorylation inhibitor containing vitamin K 2 (eg, menatetrenone) or a hydrate thereof as an active ingredient. The present invention also relates to a cancer cell growth inhibitor and a cancer therapeutic containing these inhibitors as an active ingredient. Further, the present invention provides an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergic agent, a transplant rejection inhibitor, a therapeutic agent for psoriasis, comprising vitamin K 2 (for example, menatetolenone) or a hydrate thereof as an active ingredient. The present invention relates to an antiviral agent, a therapeutic agent for arteriosclerosis, a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for renal failure. Background art
ビタミン Kは、 ビタミン 依存性タンパク質の N末端に存在するグルタミン 酸残基を、 生理活性を有する y—カルボキシグルタミン酸 （GLA) に変換する酵 素である γ—ダルタミルカルポキシラーゼの補酵素である。.そして、 ビタミン Κ は血液凝固 II因子 （プロトロンビン）、 VII、 IXや X等のビタミン Κ依存性タン パク質の生合成に不可欠なビタミンである。  Vitamin K is a coenzyme of γ-daltamyl carboxylase, an enzyme that converts the glutamate residue at the N-terminus of vitamin-dependent protein into bioactive y-carboxyglutamic acid (GLA). . Vitamin Κ is an essential vitamin for the biosynthesis of vitamin Κ-dependent proteins such as blood coagulation factor II (prothrombin), VII, IX and X.
ビタミン Κファミリ一は、 天然体の K 1 (フイトナジオン）、 Κ 2 (メナテト レノン） や合成体の Κ 3 (メナジオン） 力 ら構成される。 なかでも、 ビタミン 2、 特にメナテトレノンは骨粗鬆症の治療薬として販売されている。  Vitamin IV family 1 is composed of natural K 1 (phytonadione), Κ 2 (menatetolenone) and synthetic Κ 3 (menadione). Vitamin 2, especially menatetrenone, is marketed as a treatment for osteoporosis.
ビタミン Κ 2、 例えばメナテトレノンは、 肝癌細胞株 （Hep3B、 Hep40) の増 殖を抑制することが報告されている（1 _3 )。 また、 メナテトレノンは、 白血病細 胞 （Primary, HL-60など） において、アポトーシスや分化を誘導することが知ら れている（4_ 7)。 さらには、 メナテトレノンの側鎖であるゲラニルゲラ二オール が、 腫瘍細胞株 （HL-60、 K562、 Molt3、 Colo320DM) においてアポトーシス を誘導することが報告されており （8 )、同様にメナキノンー3、メナキノンー 4及 ぴメナキノン一 5等のビタミン K 2力 初代培養白血病細胞においてアポトーシ スを誘導することが報告されている（4)。また近年、メナテトレノンが肝癌治療後 の患者における肝癌の再発を抑制し、 生存率を高めることが知られている（9 )。 しかしながら、 ビタミン K2が、 どのような分子機構により癌細胞増殖を抑制 するかは十分に解明されていない。 Vitamin kappa 2, e.g. menatetrenone has been reported to inhibit the proliferation of hepatoma cell lines (Hep3B, Hep40) (1 _ 3). Moreover, menatetrenone, in leukemia cells (Primary, HL-60, etc.), are known to induce apoptosis and differentiation (4 _ 7). Furthermore, it has been reported that geranylgeraniol, a side chain of menatetrenone, induces apoptosis in tumor cell lines (HL-60, K562, Molt3, Colo320DM) ( 8) , as well as menaquinone-3 and menaquinone-4. Passing ビ タ ミ ン Vitamin K 2 power such as menaquinone 1-5 It has been reported to induce apoptosis in primary cultured leukemia cells ( 4) . In recent years, it has been known that menatetrenone suppresses recurrence of liver cancer in patients after liver cancer treatment and increases the survival rate ( 9) . However, the molecular mechanism by which vitamin K2 suppresses cancer cell growth is not fully understood.
近年、 抗月重瘍剤による癌治療においては、 抗腫瘍作用を示す分子機構を明らか にすることによって、 より治療効果の期待できる患者を選択して治療する、 いわ ゆるオーダーメイド医療が行われている。 したがって、 癌治療剤の抗腫瘍作用を 示す分子機構を明らかにすることは、 治療効果の期待できる患者を選択する上で 有用である。  In recent years, in the treatment of cancer with anti-menorrhea drugs, so-called personalized medicine has been performed, in which the molecular mechanism of the antitumor effect is clarified to select and treat patients with more promising therapeutic effects. I have. Therefore, elucidating the molecular mechanism of the anti-tumor effect of cancer therapeutics is useful in selecting patients with potential therapeutic effects.
また、 各種炎症性疾患、 リウマチ、 免疫反応性疾患、 癌転移、 ウィルス性疾患 は、 難治性の疾患であり長期間の治療が必要となるため、 副作用の少ない安全性 の高い治療剤が求められている。 参考文献  In addition, various inflammatory diseases, rheumatism, immunoreactive diseases, cancer metastases, and viral diseases are intractable diseases and require long-term treatment, so highly safe therapeutic agents with few side effects are required. ing. References
1 ) Carr BI， Wang Z and Kar S. Journal of Cell Physiology. 193: 263-274, 2002. 2 ) Bouzahzah B, Nishikawa Y, Simon D and. Carr BI. Journal of Cell Physiology. 165： 459-467, 1995.  1) Carr BI, Wang Z and Kar S. Journal of Cell Physiology. 193: 263-274, 2002. 2) Bouzahzah B, Nishikawa Y, Simon D and. Carr BI. Journal of Cell Physiology. 165: 459-467, 1995.
3 ) Nishikawa Y， Carr BI, Wang M, Kar S, Finn F, Dowd P, Zheng ZB, Kerns H and Naganathan S. Journal of Biological Chemistry. 270： 28304-28310, 3) Nishikawa Y, Carr BI, Wang M, Kar S, Finn F, Dowd P, Zheng ZB, Kerns H and Naganathan S. Journal of Biological Chemistry. 270: 28304-28310,
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5 ) Yaguchi M, Miyazawa M， Otawa M, Katagiri T， Nishimaki J, Uc ida Y, Iwase 0， Gotoh A, Kawanishi Y and I yama K. Leukemia, 12： 1392-1397, 5) Yaguchi M, Miyazawa M, Otawa M, Katagiri T, Nishimaki J, Ucida Y, Iwase 0, Gotoh A, Kawanishi Y and I yama K. Leukemia, 12: 1392-1397,
1998 1998
6 ) Nishimaki J, Miyazawa K, Yaguchi M， Katagiri T, Kawanishi Y, Toyama K， Ohyashiki K, Hashimoto S， Nakaya K and Takiguchi T. Leukemia, 13: 1399-1405, 1999 6) Nishimaki J, Miyazawa K, Yaguchi M, Katagiri T, Kawanishi Y, Toyama K, Ohyashiki K, Hashimoto S, Nakaya K and Takiguchi T. Leukemia, 13: 1399-1405, 1999
) Miyazawa K, Yaguchi M, Funato , Gotoh A, Kawanishi Y' Nishizawa Y, You A and Ohyashiki K. Leukemia, 15： 1111-1117, 2001  ) Miyazawa K, Yaguchi M, Funato, Gotoh A, Kawanishi Y 'Nishizawa Y, You A and Ohyashiki K. Leukemia, 15: 1111-1117, 2001
8 ) Ohizumi H, Masuda Y， Nakajo S, Sakai I， Ohsawa S and Nakaya. Journal of Biochemistry. 117： 11-13, 1995  8) Ohizumi H, Masuda Y, Nakajo S, Sakai I, Ohsawa S and Nakaya. Journal of Biochemistry. 117: 11-13, 1995
9 ) 国際公開第 0 3 Z 1 0 5 8 1 9号パンフレツト 発明の開示  9) Disclosure of the invention of International Publication No. 0 3 Z 1 0 5 8 1 9
本発明は、 このような状況に鑑みてなされたものであり、 その解決しようとす る課題は、 メナテトレノンに代表されるビタミン K 2が、 どのような分子機構に より癌細胞増殖を抑制するかを解明し、 癌患者に対して、 有効性が高く、 安全性 に優れた薬剤および治療方法を提供することにある。  The present invention has been made in view of such a situation, and the problem to be solved is to determine the molecular mechanism by which vitamin K2 represented by menatetrenone suppresses cancer cell growth. It is an object of the present invention to provide a highly effective and safe drug and treatment method for cancer patients.
また、 本発明は、 ビタミン K 2の分子機構を解明し、 新たな疾患の治療剤およ び治療方法を提供することにある。  Another object of the present invention is to elucidate the molecular mechanism of vitamin K2 and to provide a new therapeutic agent and method for a disease.
本発明者らは、 上記課題を解決するため、 鋭意検討を重ねた結果、 メナテトレ ノンが肝癌細胞において、 サイクリン D1の発現を阻害すること、 NF- / Bを阻. 害すること、 Ι κ Βのリン酸化を阻害することを見出した。  The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems, and as a result, menatetrenone inhibits the expression of cyclin D1 in liver cancer cells, inhibits NF- / B, and inhibits ΙκΒ. It was found to inhibit phosphorylation.
また、 メナテトレノンがサイクリン D1の発現を阻害すること、 NF- /c Bを阻 害すること、 I /c Bのリン酸化を阻害することから、メナテトレノンが癌細胞増殖 抑制、 癌治療において有用であること、 さらに、 抗腫瘍剤と組み合わせることに より、 メナテトレノンの抗腫瘍作用が增強されることを見出した。  In addition, menatetrenone inhibits cyclin D1 expression, inhibits NF- / cB, and inhibits I / cB phosphorylation, so that menatetrenone is useful in suppressing cancer cell growth and treating cancer Furthermore, they found that the antitumor effect of menatetrenone was enhanced by combining it with an antitumor agent.
さらには、メナテトレノンが NF- κ Bの活性化を阻害することから、抗炎症剤、 抗リウマチ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗 ウィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤または腎 不全治療剤として有用であることを見出し、 本発明を完成するに至った。  Furthermore, since menatetrenone inhibits NF-κB activation, anti-inflammatory drugs, anti-rheumatic drugs, immunosuppressants, anti-allergic drugs, transplant rejection suppressants, psoriasis treatment drugs, antiviral drugs, and atherosclerosis treatment The present invention was found to be useful as an agent, a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes or a therapeutic agent for renal failure, and completed the present invention.
すなわち本発明は、 以下に関する。  That is, the present invention relates to the following.
( 1 ) ビタミン K 2又はその水和物を有効成分として含む、 NF- κ B活性化阻害 剤。 (2) ビタミン K2又はその水和物を有効成分として含む、 ΙκΒリン酸ィヒ阻害 剤。 (1) An NF-κB activation inhibitor comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient. (2) A ΙκΒ phosphoric acid inhibitor comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
(3) ビタミン Κ2又はその水和物を有効成分として含む、 抗炎症剤、 抗リウ マチ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗 ウィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤、 及び腎不全治療剤からなる群から選ばれる 1以上の剤。  (3) Anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic, transplant rejection suppressant, psoriasis treatment, anti-viral, arteriosclerosis treatment containing vitamin Κ2 or its hydrate as an active ingredient At least one agent selected from the group consisting of a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for renal failure.
(4) ビタミン Κ2又はその水和物が NF-zcBの活性化及び Ζ又は ΙκΒのリン 酸化を阻害することを特徴とする、 （3) 記載の剤。  (4) The agent according to (3), wherein the vitamin 又 は 2 or a hydrate thereof inhibits activation of NF-zcB and phosphorylation of Ζ or ΖκΒ.
(5) ビタミン Κ2又はその水和物を有効成分として含む、サイクリン D1発現 阻害剤。  (5) A cyclin D1 expression inhibitor comprising vitamin II or a hydrate thereof as an active ingredient.
(6) ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 （1) 〜 （5) のいずれか 1項記 載の剤。  (6) The agent according to any one of (1) to (5), wherein the vitamin II is menatetrenone.
(7) ビタミン Κ 2又はその水和物を生体に投与することを特徴とする NF- /C Β活性化阻害方法。  (7) A method for inhibiting NF- / CΒ activation, which comprises administering vitamin Κ2 or a hydrate thereof to a living body.
(8) ビタミン Κ2又はその水和物を生体に投与することを特徴とする ΙκΒリ ン酸化阻害方法。 (8) A method for inhibiting ΙκΒ phosphorylation, which comprises administering vitamin Κ2 or a hydrate thereof to a living body.
(9) ビタミン Κ 2又はその水和物を有効成分として含む剤を患者に有効量投 与することを特徴とする、 炎症、 リウマチ、 免疫抑制、 アレルギー、 移植 拒絶反応、乾癬、 ウィルス性疾患、動脈硬化、虚血性再灌流障害、糖尿病、 及ぴ腎不全からなる群から選ばれる 1以上の疾患の治療方法。  (9) Inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral diseases, characterized by administering to a patient an effective amount of an agent containing vitamin Κ2 or a hydrate thereof as an active ingredient. A method for treating one or more diseases selected from the group consisting of arteriosclerosis, ischemic reperfusion injury, diabetes, and renal failure.
(10) (4) 記載の剤を、 患者に有効量投与することを特徴とする、炎症、 リウ マチ、 免疫抑制、 アレルギー、 移植拒絶反応、 乾癬、 ウィルス性疾患、 動 脈硬化、 虚血性再灌流障害、 糖尿病、 及び腎不全からなる群から選ばれる 1以上の疾患の治療方法。  (10) The agent described in (4) is administered to a patient in an effective amount, which is characterized by inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral disease, arteriosclerosis, ischemic relapse. A method for treating one or more diseases selected from the group consisting of perfusion injury, diabetes, and renal failure.
(11) ビタミン Κ2又はその水和物を生体投与することを特徴とするサイタリ ン D1発現阻害方法。 (11) A method for inhibiting expression of citalin D1 comprising administering vitamin 生 体 2 or a hydrate thereof to a living body.
(12) ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 （7) 〜 （11) のいずれか 1 項に記載の方法。 (13) NF-κΒ活性化阻害剤を製造するためのビタミン K2又はその水和物の 使用。 (12) The method according to any one of (7) to (11), wherein the vitamin Κ2 is menatetrenone. (13) Use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing an NF-κΒ activation inhibitor.
(14) ΙκΒリン酸ィ匕阻害剤を製造するためのビタミン Κ2又はその水和物の使 用。  (14) Use of vitamin 2 or a hydrate thereof for producing a ΙκΒ phosphorylation inhibitor.
(15) 抗炎症剤、 抗リウマチ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制 剤、 乾癬治療剤、 抗ウィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療 剤、 糖尿病治療剤、 および腎不全治療剤からなる群から選ばれる 1以上を 製造するための、 ビタミン Κ2又はその水和物の使用。  (15) Anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic, transplant rejection inhibitor, psoriasis treatment, antiviral agent, atherosclerosis treatment, ischemic reperfusion injury treatment, diabetes treatment, and Use of vitamin II or a hydrate thereof for producing one or more selected from the group consisting of therapeutic agents for renal failure.
(16) (4)記載の剤を製造するための、 ビタミン Κ2又はその水和物の使用。 (16) Use of vitamin 2 or a hydrate thereof for producing the agent according to (4).
(17) サイクリン D1発現阻害剤を製造するためのビタミン Κ2又はその水和 物の使用。 (17) Use of vitamin Κ2 or a hydrate thereof for producing a cyclin D1 expression inhibitor.
(18) ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 （13) 〜 （1 7) のいずれか 1項記載の使用。  (18) The use according to any one of (13) to (17), wherein the vitamin Κ2 is menatetrenone.
(19) ビタミン Κ2又はその水和物と、 抗腫瘍物質とを組み合わせてなる癌治 療剤。  (19) A cancer treatment agent comprising a combination of vitamin 2 or a hydrate thereof and an antitumor substance.
( 20 )ビタミン Κ 2又はその水和物と、 5-FUとを組み合わせてなる癌治療剤。 (21) ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 （19) または （20) 記載の 癌治療剤。  (20) A cancer therapeutic agent comprising a combination of vitamin Κ2 or a hydrate thereof and 5-FU. (21) The cancer therapeutic agent according to (19) or (20), wherein the vitamin Κ2 is menatetrenone.
(22) 癌が、 肝癌である、 （19) 〜 （21) のいずれか 1項記載の癌治療剤。 また、 本発明は、 以下に関する。  (22) The cancer therapeutic agent according to any one of (19) to (21), wherein the cancer is liver cancer. Further, the present invention relates to the following.
(23) (1)、 (2) および （5) のいずれか 1項記載の阻害剤を有効成分として 含む、 癌細胞増殖抑制剤。  (23) A cancer cell growth inhibitor comprising the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) as an active ingredient.
(24) (1)、 (2) および （5) のいずれか 1項記載の阻害剤を有効成分として 含む、 癌治療剤。 (24) A therapeutic agent for cancer, comprising as an active ingredient the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5).
(25) ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 （23) または （24) 記載の 剤。  (25) The agent according to (23) or (24), wherein the vitamin II is menatetrenone.
(26) 癌が、 肝癌である、 （23) 〜 （25) のいずれか 1項記載の剤。  (26) The agent according to any one of (23) to (25), wherein the cancer is liver cancer.
(27) (1)、 （2) および （5) のいずれか 1項記載の阻害剤を、 患者に有効量 投与することを特徴とする、 癌細胞の増殖抑制方法。 (27) An effective amount of an inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) for a patient A method for suppressing cancer cell growth, which comprises administering.
(28) (1)、 （2) および （5) のいずれか 1項記載の阻害剤を、 患者に有効量 投与することを特徴とする、 癌の治療方法。  (28) A method for treating cancer, comprising administering an effective amount of the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) to a patient.
(29) ビタミン K2がメナテトレノンである、 （27) または （28) 記載の 方法。  (29) The method according to (27) or (28), wherein the vitamin K2 is menatetrenone.
(30) 癌が、 肝癌である、 （27) 〜 (29) のいずれか 1項記載の方法。 (30) The method according to any one of (27) to (29), wherein the cancer is liver cancer.
(31) (1)、 (2) および （5) のいずれか 1項記載の阻害剤を有効成分として 含む癌細胞増殖抑制剤を製造するためのビタミン K2又はその水和物の使 用。 (31) Use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing a cancer cell growth inhibitor comprising the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) as an active ingredient.
(32) (1)、 （2) および（5) のいずれか 1項記載の阻害剤を有効成分として 含む癌治療剤を製造するためのビタミン K2又はその水和物の使用。 (33) ビタミン K2がメナテトレノンである、 （31) または （32) 記載の 使用。  (32) Use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing a cancer therapeutic containing the inhibitor according to any one of (1), (2) and (5) as an active ingredient. (33) The use according to (31) or (32), wherein the vitamin K2 is menatetrenone.
(34) 癌が、 肝癌である、 （31) 〜 （33) のいずれか 1項記載の使用。 本発明により、 癌細胞、 好ましくは肝癌細胞において、 サイクリン D1の発現 を阻害すること、 NF-/cBの活性化を阻害すること、 ΙκΒのリン酸化を阻害する ことが可能となった。 また、 これらの分子を阻害すると癌細胞、 好ましくは肝癌 細胞の増殖が抑制されるため、 より治療効果の期待できる患者を選択して治療す ることが可能となった。  (34) The use according to any one of (31) to (33), wherein the cancer is liver cancer. According to the present invention, it has become possible to inhibit the expression of cyclin D1, inhibit the activation of NF- / cB, and inhibit the phosphorylation of ΙκΒ in cancer cells, preferably liver cancer cells. In addition, inhibition of these molecules suppresses the growth of cancer cells, preferably hepatocellular carcinoma cells, so that it is possible to select and treat patients who can expect more therapeutic effects.
また、 本発明により、 癌患者に対するビタミン Κ2 (例えばメナテトレノン） の治療剤としての有効性に加え、 ビタミン Κ 2と抗腫瘍剤とを組み合わせて使用 することによりビタミン Κ 2の抗腫瘍作用が増強されることから、 癌患者の生活 の質を大きく改善することが可能となった。  According to the present invention, in addition to the efficacy of vitamin Κ2 (for example, menatetrenone) as a therapeutic agent for cancer patients, the combined use of vitamin Κ2 and an antitumor agent enhances the antitumor effect of vitamin Κ2. This has made it possible to greatly improve the quality of life of cancer patients.
さらには、 本宪明により、 ビタミン Κ2が NF-κΒの活性化および ΙκΒのリ ン酸化を阻害すること力、ら、 ビタミン K2は、 NF- κ Bの活性化または I κ Bのリ ン酸化に関連する疾患の治療に有効であり、 ビタミン K2は、 抗炎症剤、 抗リウ マチ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗ウィル ス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤または腎不全治 療剤の有効成分として用いることが可能となった。 図面の簡単な説明 Furthermore, the present invention demonstrates that vitamin Κ2 inhibits the activation of NF-κΒ and the phosphorylation of 、 κΒ, and that vitamin K2 activates NF-κB or phosphorylates IκB. Vitamin K2 is an effective anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic, transplant rejection inhibitor, psoriasis treatment, anti-will It has become possible to use it as an active ingredient in medicines, arteriosclerosis treatment, ischemic reperfusion injury treatment, diabetes treatment or renal failure treatment. Brief Description of Drawings
図 1は、 メナテトレノン処理によるサイクリン D1の変化をウェスタンブロッ ト法 （A)、 RT-PCR法 （B ) およびルシフェラーゼレポーターアツセィ （C ) に より解析した結果を示したものである。 .  Figure 1 shows the results of analysis of changes in cyclin D1 due to treatment with menatetrenone by Western blotting (A), RT-PCR (B), and luciferase reporter Atsusei (C). .
図 2は、 メナテトレノンが NF- c Bの DNA結合活性に与える影響をゲルシフ トアツセィにより検討した結果を示したものである。  FIG. 2 shows the results of an examination of the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF-cB by gel shift assay.
図 3は、 NF- κ Β の転写活性に与えるメナテトレノンの影響を、 NF- /c Bルシ フェラーゼレポータープラスミドを用いて検討した結果を示したものである。 図 4は、 メナテトレノンによるサイクリン D1プロモーター活'11生調節における 転写因子 AP-1および NF- κ Bの役割を検討するため、 肝癌細胞において、 野生 型 AP-1および NF- /c B結合部位を持つサイクリン D1プロモーターと、 結合活 性のない変異型 AP-1および NF- κ Β結合部位を持つサイクリン D1プロモータ 一とを用いてルシフェラーゼレポーターアツセィを行い、 AP-1 および NF- K B の転写因子の影響を検討した結果を示したものである。 FIG. 3 shows the results of examining the effect of menatetrenone on the transcriptional activity of NF-κΒ using the NF- / cB luciferase reporter plasmid. 4, in order to investigate the role of transcription factor AP-1 and NF-? Kappa B in cyclin D1 promoter active '1 1 production regulation by menatetrenone, in hepatoma cells, wild-type AP-1 and NF-? / C B binding site Transcription of AP-1 and NF-KB by performing luciferase reporter assay using a cyclin D1 promoter with a cyclin D1 promoter and a cyclin D1 promoter with a binding-inactive mutant AP-1 and an NF-κΒ binding site It shows the results of examining the effects of factors.
図 5は、 メナテトレノンによるサイクリン D1プロモーター活性に対する NF- κ B依存性を確認するため、 NF- /c Bのサブユニットである p65/RelAを肝癌細胞 に導入し過剰発現させ、 メナテトレノンによるサイクリン D1プロモーター活性 の抑制が解除されるか否かを検討した結果を示したものである。  Figure 5 shows that NF-κB dependence of cyclin D1 promoter activity by menatetrenone was confirmed by introducing p65 / RelA, a subunit of NF- / cB, into hepatoma cells and overexpressing the cyclin D1 promoter by menatetrenone. It is a result of examining whether or not the suppression of the activity is released.
図 6は、 肝癌細胞の増殖抑制が、 NF- /c Bあるいはサイクリン D1に依存的で あるか否かを検討するため、 のサブュニットである p65/RelAあるいは サイクリン D1遺伝子を肝癌細胞 HepG2に導入しメナテトレノンによる增殖抑 制が変化するかどうかを検討した結果を示したものである。  Figure 6 shows that the subunit of p65 / RelA or cyclin D1 gene was introduced into hepatocellular carcinoma cells HepG2 in order to examine whether the inhibition of hepatoma cell growth was dependent on NF- / cB or cyclin D1. This figure shows the results of examining whether or not reproductive suppression by menatetrenone changes.
図 7は、 肝癌細胞の増殖抑制が、 NF- K Bあるいはサイタリン D1に依存的で あるか否かを検討するため、 NF- κ Βのサブュニットである p65/RelAあるいは サイクリン D1遺伝子を肝癌細胞 Hep3Bに導入しメナテトレノンによる増殖抑 制が変化するかどうかを検討した結果を示したものである。 Figure 7 shows that the NF-κΒ subunit p65 / RelA or the cyclin D1 gene was added to the hepatoma cell Hep3B in order to examine whether the suppression of hepatoma cell growth was dependent on NF-KB or cytaline D1. Introduced growth suppression by menatetrenone It shows the result of examining whether the system will change.
図 8は、 肝癌細胞 HepG2， Hep3B, Huh7にァボトーシスを起こさない低濃度 の 5-FU (5 μ g/ml) とメナテトレノンとを肝癌細胞に作用させ、 細胞増殖に与 える影響を検討した結果を示したものである。  Fig. 8 shows the results of examining the effects of low-concentration 5-FU (5 μg / ml) and menatetrenone, which do not cause abotosis on hepatoma cells HepG2, Hep3B, and Huh7, on hepatoma cells and the effect on cell proliferation. It is shown.
図 9は、 I κ Bのリン酸化、 I κ; Bタンパク質の発現量、 ρ65サブュニットの核 への移行をウェスタンプロット法にて解析した結果を示したものである。  FIG. 9 shows the results of Western blot analysis of the phosphorylation of IκB, the expression level of Iκ; B protein, and the transfer of ρ65 subunit to the nucleus.
図 1 0は、 TPA、 TNF- a、 IL-1 により誘導される NF- κ Βの活性化に対する メナテトレノンの効果を、 ルシフヱラーゼレポーターアツセィで検討した結果を 示したものである。  FIG. 10 shows the results of examining the effect of menatetrenone on the activation of NF-κΒ induced by TPA, TNF-a, and IL-1 using a luciferase reporter atsey.
図 1 1は、 TPA、 TNF- a、 IL-1 により誘導される NF- κ Bの DNA結合活性 に対するメナテトレノンの効果を、 ゲルシフトアツセィで検討した結果を示した ものである。  FIG. 11 shows the results of an examination of the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF-κB induced by TPA, TNF-a, and IL-1 by gel shift assay.
図 1 2は、 TPA、 TNF- a、 IL-1 β刺激下における I κ Βのリン酸化および I κ Β タンパク質量に対するメナテトレノンの効果を、 ウェスタンブロット法により解 析した結果を示したものである。  Figure 12 shows the results of Western blot analysis of the effects of menatetrenone on IκΒ phosphorylation and IκΒ protein levels under TPA, TNF-a, and IL-1β stimulation. .
図 1 3は、 TPA、 TNF- a IL_1 ]3刺激下における IKK複合体のキナーゼ活性 に対するメナテトレノンの効果を、 in vitroキナーゼアツセィで解析した結果を 示したものである。 発明を実施するための最良の形態  Figure 13 shows the results of in vitro kinase assay analysis of the effect of menatetrenone on the kinase activity of the IKK complex under the stimulation of TPA and TNF-aIL_1] 3. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下に本発明の実施の形態について説明する。 以下の実施の形態は、 本発明を 説明するための例示であり、 本発明をこの実施の形態にのみ限定する趣旨ではな い。 本発明は、 その要旨を逸脱しない限り、 さまざまな形態で実施をすることが できる。  Hereinafter, embodiments of the present invention will be described. The following embodiment is an exemplification for describing the present invention, and is not intended to limit the present invention to only this embodiment. The present invention can be implemented in various forms without departing from the gist thereof.
なお、 本明細書において引用した文献、 および公開公報、 特許公報その他の特 許文献は、 参照として本明細書に組み込むものとする。 概要 ビタミン K2は、 癌細胞の増殖を抑制する作用を有することが知られている。 本発明者は、 この癌細胞増殖抑制作用の分子機序を明らかにしたところ、 意外に も、 ビタミン Κ2は、 細胞増殖に重要な役割を担う因子であるサイクリン D1の 発現を阻害することを見出した。 そして、 このサイクリン D1の発現阻害は、 ビ タミン Κ2によって、サイクリン D1プロモーターの転写因子である ΙκΒのリン 酸化が阻害され、 NF-zcB の活性化が阻害されることに起因するものであった。 すなわち、 ビタミン K2は、 ΙκΒのリン酸ィヒを阻害することで、 の活性 化を阻害し、 その結果、 NF-κΒを転写因子とするサイタリン D1の発現が阻害 されることが初めて明らかとなった。 The documents cited in the present specification, as well as published gazettes, patent gazettes and other patent documents, are incorporated herein by reference. Overview Vitamin K2 is known to have the effect of suppressing the growth of cancer cells. The present inventors have elucidated the molecular mechanism of this cancer cell growth inhibitory action, and surprisingly found that vitamin Κ2 inhibits the expression of cyclin D1, a factor that plays an important role in cell growth. Was. This inhibition of cyclin D1 expression was caused by the inhibition of phosphorylation of ΙκΒ, a transcription factor of the cyclin D1 promoter, by vitamin Κ2, thereby inhibiting the activation of NF-zcB. That is, for the first time, it was clarified that vitamin K2 inhibits the activation of ΙκΒ by inhibiting ΙκΒ phosphoric acid, resulting in the inhibition of the expression of cytaline D1, which uses NF-κΒ as a transcription factor. Was.
したがって、 本発明は、 ビタミン K2又はその水和物を有効成分として含む、 サイクリン D1発現阻害剤、 NF-κΒ活性化阻害剤、 I/cBリン酸ィヒ阻害剤、 及び これらの阻害剤を有効成分として含む癌細胞増殖抑制剤、 癌治療剤、 並びにビタ ミン K 2又はその水和物を用いたサイクリン D1発現阻害方法、 NF- κΒ活性化 阻害方法、 I/cBリン酸化阻害方法、および前記抑制剤を用いた癌細胞増殖抑制方 法、 癌の治療方法を提供する。  Therefore, the present invention provides a cyclin D1 expression inhibitor, an NF-κΒ activation inhibitor, an I / cB phosphoric acid inhibitor, and an inhibitor comprising these inhibitors, which contain vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient. Cancer cell proliferation inhibitor, cancer therapeutic agent, and cyclin D1 expression inhibiting method using vitamin K2 or a hydrate thereof, NF-κΒ activation inhibiting method, I / cB phosphorylation inhibiting method, Provided are a method for suppressing cancer cell growth using an inhibitor and a method for treating cancer.
また、 本発明は、 癌患者に対するビタミン Κ2又はその水和物と抗腫瘍物質と を組み合わせてなる癌治療剤を提供する。  The present invention also provides a therapeutic agent for cancer comprising a combination of vitamin II or a hydrate thereof and an antitumor substance for cancer patients.
さらに、 ビタミン Κ2が NF- κ Βの活性化を阻害することおよび ΙκΒのリン 酸ィ匕を阻害することから、 ビタミン Κ2は、 の活性化又は ΙκΒのリン酸 化に起因する疾患の治療に有用である。 従って、 本発明は、 ビタミン Κ2又はそ の水和物を有効成分として含む、 抗炎症剤、 抗リウマチ剤、 免疫抑制剤、 抗ァレ ルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗ウィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血 性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤または腎不全治療剤およびこれらを用いた治 療方法を提供する。 本発明において、 ビタミン Κ2またはその水和物は、 上記の 剤全て又は二つ以上の糸且合せについての有効成分として用いることもできるし、 上記の剤の一つについての有効成分として用いることもできる。  Furthermore, since vitamin Κ2 inhibits activation of NF-κκ and inhibits phosphorylation of ビ タ ミ ン κΒ, vitamin ビ タ ミ ン 2 is useful for the treatment of diseases caused by activation of 又 は κ リ ン 酸 or phosphorylation of ΙκΒ. It is. Therefore, the present invention provides an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergy agent, a transplant rejection inhibitor, a psoriasis treatment agent, an antiviral agent, which contains vitamin Κ2 or a hydrate thereof as an active ingredient. The present invention also provides a therapeutic agent for arteriosclerosis, a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes or renal failure, and a therapeutic method using the same. In the present invention, vitamin 2 or a hydrate thereof may be used as an active ingredient for all or two or more of the above-mentioned agents, or may be used as an active ingredient for one of the above-mentioned agents. it can.
( 1 ) NF-/cB活性化阻害剤、 I Κ Βリン酸化阻害剤 本発明者は、 ビタミン K 2が、 肝癌細胞において NF- κ Βの活性化を阻害する ことおよぴ Ι κ Βのリン酸ィ匕を阻害することを見出した。 従って、 ビタミン Κ 2 は の活性化阻害剤および Ι κ Βのリン酸ィ匕阻害剤の有効成分として用い ることができる。 (1) NF- / cB activation inhibitor, IΚ phosphorylation inhibitor The present inventors have found that vitamin K2 inhibits the activation of NF-κ に お い て and the phosphorylation of リ ン 酸 κ 匕 in liver cancer cells. Therefore, vitamin Κ2 can be used as an active ingredient of an activation inhibitor of and a phosphorylation inhibitor of ΙκΒ.
NF- κ Βは、 転写因子の一つであり、 I κ Bと複合体を形成し、 不活性化状態で 細胞質に存在することが知られている （Baeuerle, P. A. and Baltimore, D. Science 242, 540-546, 1988； Beg, A. A. et al. Genes Dev. 7, 2064-2070, 1993； Finco, T. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91， 11883-11888, 1994·)。 不活性化 状態の複合体は、 I κ Bのァミノ酸配列のうち第 3 2番目のセリン (Serine-32)およ び第 3 6番目のセリン (Serine-36)のリン酸化を介して活性化され、 活性化 NF- κ Βは、 核内へ移行する （Finco, T. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11883-11888, 1994； Brown, K. et al. Science 267, 1485-1488, 1995； Brockman, J. A. et al. Mol. Cell. Biol. 15， 2809-2818， 1995； Traenckner, E. B. et al. EMBO J. 14, 2876-2883, 1995； Chen, Z. J. et al. Cell 84, 853-862， 1996.)。 そして、 さ まざまなタンパク質の転写を活性化し、 サイトカイン、 ケモカイン、 接着分子、 サイタリンなどの発現量を増加させる。  NF-κΒ is one of the transcription factors, forms a complex with IκB, and is known to exist in the inactive state in the cytoplasm (Baeuerle, PA and Baltimore, D. Science 242). Beg, AA et al. Genes Dev. 7, 2064-2070, 1993; Finco, TS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11883-11888, 1994 ·). The complex in the inactivated state is activated through phosphorylation of serine (Serine-32) and serine (Serine-36) of the second and third amino acids of IκB. Activated NF-κΒ translocates into the nucleus (Finco, TS et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11883-11888, 1994; Brown, K. et al. Science 267, 1485-1488, 1995; Brockman, JA et al. Mol. Cell. Biol. 15, 2809-2818, 1995; Traenckner, EB et al. EMBO J. 14, 2876-2883, 1995; Chen, ZJ et al. Cell. 84, 853-862, 1996.). It activates the transcription of various proteins and increases the expression of cytokines, chemokines, adhesion molecules, and cytaline.
ビタミン K 2は、 I κ Bのリン酸化を阻害するため、不活性化状態の複合体は活 性化されず、 その結果、 ビタミン K2によって NF- / Bの活性化が阻害されるこ とになる。 Vitamin K 2, in order to inhibit the phosphorylation of I kappa B, complex inactivated state active activatable Sarezu, resulting in the this Vitamin K2 NF-? / Activation of B is inhibited Become.
従って、 ビタミン K 2又はその水和物、 あるいは、 ビタミン K 2又はその水和 物を含む NF- κ Bの活性化を阻害する剤および I κ Bのリン酸ィ匕を阻害する剤は、 NF- κ Βの活性化阻害および I /c Bのリン酸ィ匕阻害を介して、サイトカイン、ケモ 力イン、 接着分子、 サイクリンなどの発現量の増加を抑制させることが可能とな る。すなわち、 NF- κ Β活性ィ匕阻害剤および Ι κ Βリン酸ィ匕阻害剤は、 これらの生 理活性物質に起因する疾患の治療に有用である。具体的には、当該剤は、例えば、 抗炎症剤、 抗リウマチ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬 治療剤、 抗ウィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療 剤または腎不全治療剤の有効成分として有用である。 また、 NF- κ Β の活性化阻 害剤および Ι κ Βリン酸化阻害剤は、サイクリン D1の発現抑制剤としても有用で ある。 このサイクリン D1は細胞増殖に重要な役割を担うことが知られている。 すなわち、 NF- κ Β活性化阻害剤または Ι κ Βリン酸化阻害剤は、細胞増殖抑制剤 および癌治療剤として有用である。 Therefore, an agent for inhibiting the activation of NF-κB containing vitamin K2 or hydrate thereof, or vitamin K2 or hydrate thereof, and an agent for inhibiting phosphorylation of IκB are NF -It is possible to suppress an increase in the expression levels of cytokines, chemopotins, adhesion molecules, cyclins, etc., through inhibition of κΒ activation and inhibition of I / c B phosphorylation. That is, the NF-κΒ activity inhibitor and the κκ phosphate inhibitor are useful for treating diseases caused by these physiologically active substances. Specifically, the agent is, for example, an anti-inflammatory agent, an anti-rheumatic agent, an immunosuppressant, an anti-allergic agent, a transplant rejection inhibitor, a therapeutic agent for psoriasis, an antiviral agent, a therapeutic agent for atherosclerosis, ischemic reperfusion injury It is useful as an active ingredient of a therapeutic agent, a therapeutic agent for diabetes or a therapeutic agent for renal failure. It also inhibits NF-κNF activation. Harmful agents and ΙκΒ phosphorylation inhibitors are also useful as cyclin D1 expression inhibitors. This cyclin D1 is known to play an important role in cell proliferation. That is, the NF-κΒ activation inhibitor or the ΙκΒ phosphorylation inhibitor is useful as a cell growth inhibitor and a cancer therapeutic agent.
本明細書において、 「癌」 は特に限定されず、 例えば、 脳腫瘍、 頸癌、 食道癌、 甲状腺癌、 舌癌、 肺癌、 乳癌、 脾癌、 胃癌、 肝癌、 胆道癌、 脾臓癌、 大腸癌、 小 腸や十二指腸の癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、腎癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、 精巣癌、 肉腫及びメラノーマからなる群から選択される少なくとも 1つを挙げる ことができるが、 好ましくは肝癌である。 本発明において、 ビタミン Κ 2は、 好 ましくはメナテトレノンであり、 また、 細胞増殖抑制の対象おょぴ癌治療の対象 は、 好ましくは肝癌細胞およぴ肝癌である。  In the present specification, "cancer" is not particularly limited, and examples thereof include brain tumor, cervical cancer, esophageal cancer, thyroid cancer, tongue cancer, lung cancer, breast cancer, spleen cancer, stomach cancer, liver cancer, biliary tract cancer, spleen cancer, colon cancer, At least one selected from the group consisting of small intestine and duodenum cancer, colon cancer, rectal cancer, bladder cancer, kidney cancer, prostate cancer, uterine cancer, ovarian cancer, testicular cancer, sarcoma and melanoma can be mentioned. Preferably, it is liver cancer. In the present invention, vitamin 2 is preferably menatetrenone, and the target for cell growth suppression and the target for cancer treatment are preferably liver cancer cells and liver cancer.
本発明において 「Ι κ Β リン酸化阻害剤」 とは、 生体又は生体の一部において、 NF- /c B との解離に必要な Ι κ Β のリン酸化を阻害する作用を有する剤を意味す る。 I κ Bをリン酸化する I κ Bリン酸化酵素（IKK: I κ B kinase) の阻害剤、 IKK 複合体のリン酸化活性阻害剤も、 本発明における Ι κ Β リン酸化阻害剤に含まれ る。  In the present invention, “ΙκΒ phosphorylation inhibitor” means an agent having an action of inhibiting the phosphorylation of Ικ な required for dissociation from NF- / cB in a living body or a part of the living body. You. Inhibitors of IκB kinase (IKK: IκB kinase) that phosphorylate IκB and inhibitors of the phosphorylation activity of the IKK complex are also included in the ΙκΒ phosphorylation inhibitor of the present invention. .
本癸明において 「NF- κ B活性化阻害剤」 とは、 転写因子 NF- κ Bの機能を阻 害する作用を有する剤を意味する。例えば、生体または生体の一部において、 NF- /c Bが I κ Bとの複合体から解放されるのを阻害する剤、 NF- κ Bの核への移行を 阻害する剤、 NF- κ Bの DNA結合活性を阻害する剤、 NF- κ Βの転写活性を阻害 する剤などが挙げられる。  In the present invention, “NF-κB activation inhibitor” means an agent having an action of inhibiting the function of transcription factor NF-κB. For example, an agent that inhibits release of NF- / cB from a complex with IκB in an organism or a part of an organism, an agent that inhibits NF-κB translocation to the nucleus, NF-κB Examples include an agent that inhibits the DNA binding activity of B, and an agent that inhibits the transcriptional activity of NF-κ な ど.
NF- κ Βの活性化の阻害、又は I κ Βのリン酸化の阻害は、生体又はその一部に ビタミン Κ 2又ほその水和物を投与することで行うことができる。例えば前記「生 体」 がヒトである場合、 ヒトへの投与量、 投与方法は、 後述のビタミン Κ 2を含 有する医薬組成物の投与量の記載を参照できる。 また、例えば前記「生体の一部」 が癌細胞株である場合は、ビタミン Κ 2を 10'8〜10·2Μ、好ましくは 10·7〜10·3Μ、 より好ましくは 10·6〜： L0'4Mの濃度で含有する培地で 12〜96時間、 好ましくはThe inhibition of the activation of NF-κ or the inhibition of the phosphorylation of IκΒ can be carried out by administering vitamin 2 or its hydrate to a living body or a part thereof. For example, when the “organism” is a human, the dosage and administration method for humans can be referred to the description of the dosage of the pharmaceutical composition containing vitamin 2 described below. When, for example, the "part of a living body" is a cancer cell line, vitamins kappa 2 to 10 '8 to 10, 2 Micromax, preferably 10 · 7 to 10 · 3 Micromax, more preferably 10.6 - : In a medium containing L0 ' 4 M at a concentration of 12 to 96 hours, preferably
24〜72時間、 より好ましくは 48時間培養すると、 NF- c Bの活性化を阻害し、 及び Z又は I κ Bのリン酸化を阻害することができる。 When cultured for 24 to 72 hours, more preferably 48 hours, inhibits the activation of NF-cB, And phosphorylation of Z or IκB.
NF- κ B活性化阻害作用及ぴ I κ Bリン酸化阻害作用は、 NF- κ Βの転写活性を 指標に検討することもでき、 例えば、 実施例 2または 3に記載の方法により検討 することができる。 本明細書において 「生体」 とは哺乳動物の生体であり、本発明において 「生体」 は、 好ましくは癌に罹患した哺乳動物の生体であり、 より好ましくは肝癌に罹患 した哺乳動物の生体である。 また、本明細書において、 「生体の一部」 とは、 哺乳 動物由来の各臓器、 組織、 体液 （血液、 脳脊髄液、 リンパ液、 唾液などを含む）、 又は細胞が含まれる。 本発明において 「生体の一部」 は、 好ましくは癌を発症し た各臓器、 組織または癌細胞であり、 より好ましくは癌を発症した肝臓または肝 癌細胞である。 癌細胞は、 初代培養細胞であってもよいし、 細胞株であってもよ レ、。  The NF-κB activation inhibitory action and IκB phosphorylation inhibitory action can also be examined by using the transcriptional activity of NF-κ as an index.For example, they can be examined by the method described in Example 2 or 3. Can be. In the present specification, the “living body” is a living body of a mammal, and in the present invention, the “living body” is preferably a living body of a mammal having cancer, more preferably a living body of a mammal having liver cancer. . In addition, in the present specification, “part of a living body” includes each organ, tissue, body fluid (including blood, cerebrospinal fluid, lymph, saliva, etc.) or cells derived from mammals. In the present invention, the “part of the living body” is preferably each organ, tissue or cancer cell that has developed cancer, more preferably liver or liver cancer cell that has developed cancer. The cancer cells may be primary cultured cells or cell lines.
本明細書において、 哺乳動物は、 ヒトまたは非ヒト哺乳動物 （例えばマウス、 ラット、 ハムスター、 モルモット、 ゥサギ、 プタ、 ィヌ、 ゥマ、 ゥシ、 サルなど） を意味する。 本明細書において、 哺乳動物は好ましくはヒトである。  As used herein, a mammal refers to a human or non-human mammal (eg, mouse, rat, hamster, guinea pig, egret, stag, dog, canine, magpie, monkey, etc.). As used herein, the mammal is preferably a human.
( 2 ) サイクリン D 1発現阻害剤 (2) Cyclin D1 expression inhibitor
本発明者は、 ビタミン Κ 2が肝癌細胞においてサイクリン D1の発現を阻害す ることを見出した。 従って、 ビタミン Κ 2は、 サイクリン D1発現阻害剤の有効 成分として用いることができる。  The present inventors have found that vitamin II inhibits cyclin D1 expression in liver cancer cells. Therefore, vitamin II can be used as an active ingredient of a cyclin D1 expression inhibitor.
ここで、 サイクリン D1は、 細胞周期を調節するタンパク質として知られてお り、 サイクリン D1の発現量が増加すると、 Rb (Retinoblastoma protein) と呼 ばれるタンパク質をリン酸ィ匕する。そして Rbがリン酸化されると、転写因子 E2F が E2F-Rb複合体から遊離し、 細胞周期の G1期から S期への移行が促進され、 細胞増殖が活性化される （Sherr, C. J. Science 274, 1672-1677, 1996.)。  Here, cyclin D1 is known as a protein that regulates the cell cycle. When the expression level of cyclin D1 increases, it phosphorylates a protein called Rb (Retinoblastoma protein). When Rb is phosphorylated, the transcription factor E2F is released from the E2F-Rb complex, which promotes the transition from the G1 phase to the S phase of the cell cycle and activates cell proliferation (Sherr, CJ Science 274). , 1672-1677, 1996.).
細胞增殖性疾患としては、 癌などがあることから、 サイクリン D1の発現を阻 害するビタミン K 2は、 細胞增殖抑制剤および癌治療剤として有用である。 本発 明において、 ビタミン K 2は、 好ましくはメナテトレノンであり、 また、 細胞增 殖抑制の対象および癌治療の対象は、 好ましくは肝癌細胞および肝癌である。 本発明において 「サイクリン D1発現阻害剤」 とは、 生体または生体の一部に おいて、 サイクリン D1の発現量を減少させる作用、 またはサイクリン D1の発 現を停止させる作用を有する剤をいう。 Since cell-proliferative diseases include cancer and the like, vitamin K2, which inhibits the expression of cyclin D1, is useful as a cell-proliferation inhibitor and a therapeutic agent for cancer. Departure As described above, vitamin K2 is preferably menatetrenone, and the subject for suppressing cell growth and the subject for treating cancer are preferably liver cancer cells and liver cancer. In the present invention, the “cyclin D1 expression inhibitor” refers to an agent having an action of decreasing the expression level of cyclin D1 or stopping the expression of cyclin D1 in a living body or a part of the living body.
サイクリン D1の発現を阻害するには、 生体又はその一部にビタミン Κ 2又は その水和物を投与すればよい。 すなわち、 投与されたビタミン Κ 2又はその水和 物の作用によって、 サイクリン D1プロモーターの活性が抑制され、 サイクリン D1 の発現が阻害される。 例えば前記 「生体」 がヒトである場合、 ヒトへの投与 量、 投与方法は後述のビタミン Κ 2を含有する医薬組成物の投与量の記載を参照 できる。 また、 例えば前記 「生体の一部」 が癌細胞である場合は、 ビタミン Κ 2 を 10—8~10—2Μ、 好ましくは 10·7〜： 10·3Μ、 より好ましくは 10·6〜： 10—4Μの濃度で 含有する培地で 12〜96時間、 好ましくは 24〜72時間、 より好ましくは 48時間 培養すると、 サイクリン D1の発現を阻害することができる。 In order to inhibit the expression of cyclin D1, vitamin 2 or a hydrate thereof may be administered to a living body or a part thereof. That is, the activity of the administered vitamin II or a hydrate thereof suppresses the activity of the cyclin D1 promoter and inhibits the expression of cyclin D1. For example, when the “living body” is a human, the dosage and administration method for humans can be referred to the description of the dosage of the pharmaceutical composition containing vitamin 2 described below. When, for example, the "part of a living body" is a cancer cell, a vitamin Κ 2 10- 8 ~ 10- 2 Μ , preferably 10 - 7 ~: 10 · 3 Micromax, more preferably 10.6 - When cultivated for 12 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, more preferably 48 hours in a medium containing 10 to 4 %, the expression of cyclin D1 can be inhibited.
サイクリン D1の発現量は、例えば、 RT"PCR法によりサイクリン D1の mRNA 量を測定することで検討することができるし、 ゥヱスタンブロット法によりサイ クリン D1のタンパク質量を測定することで検討することもでき、 例えば、 実施 例 1に記載の方法により検討することができる。 ( 3 ) 癌細胞増殖抑制剤、 癌治療剤  The expression level of cyclin D1 can be examined, for example, by measuring the amount of cyclin D1 mRNA by RT "PCR, or by measuring the amount of cyclin D1 protein by dust blotting. It can also be examined, for example, by the method described in Example 1. (3) Cancer cell growth inhibitor, cancer therapeutic
本明細書において 「癌細胞増殖抑制剤」 とは、 癌細胞、 好ましくは肝癌細胞の 増殖を抑制させる作用、 または癌細胞、 好ましくは肝癌細胞の増殖を停止する作 用を有する剤をいう。 上記のように、 サイクリン D1発現阻害剤、 NF- κ Β活性 化阻害剤、 および B リン酸化阻害剤は、 癌細胞、 好ましくは肝癌細胞の増殖 抑制に有効である。 したがって、 これらの阻害剤を生体又はその一部に投与する と、 サイクリン D1発現阻害、 NF- κ B活性化阻害、 および/または I /c Bリン酸 化阻害を介して、 癌細胞、 好ましくは肝癌細胞の増殖を抑制することができる。 例えば前記 「生体」 がヒトである場合、 ヒトへの投与量、 投与方法は後述のビ タミン K 2を含有する医薬組成物の投与量の記載を参照できる。 また、 例えば前 記 「生体の一部」 が癌細胞株である場合は、 ビタミン Κ 2を 10·8〜10-2Μ、 好ま しくは 10·7〜10·3Μ、 より好ましくは 10'6〜10·4Μの濃度で含有する培地で 12〜 96時間、 好ましくは 24〜72時間、 より好ましくは 48時間培養すると、 細胞増 殖を抑制することができる。 細胞増殖の抑制作用は、 例えば、 核酸の取り込み量 を測定する方法（トリチウムチミジン法など）、 ミ トコンドリア活性を測定する方 法 （ΜΤΤ法、 Alamar Blue法など）、 DNA量を測定する方法、 グルコース消費 量を測定する方法、 画像解析による細胞数または細胞面積を測定する方法、 蛍光 強度を測定する方法 （蛍光標識された細胞を用いた方法） 等、 あるいは実施例 4 又は 5に記載の方法によって、 確認することもできる。 As used herein, the term "cancer cell growth inhibitor" refers to an agent that has the effect of suppressing the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells, or the function of stopping the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells. As described above, the cyclin D1 expression inhibitor, the NF-κΒ activation inhibitor, and the B phosphorylation inhibitor are effective in suppressing the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells. Therefore, when these inhibitors are administered to a living body or a part thereof, cancer cells, preferably CYCIN D1 expression inhibition, NF-κB activation inhibition, and / or I / cB phosphorylation inhibition are inhibited. It can suppress the growth of liver cancer cells. For example, when the “living body” is a human, the dosage and administration method for Reference can be made to the description of the dosage of the pharmaceutical composition containing Tamine K2. Further, for example, if the previous SL "part of a living body" is a cancer cell line, vitamins kappa 2 to 10 · 8 to 10-2 Micromax, favored properly is 10 · 7 ~10 · 3 Μ, more preferably 10 ' Cell culture can be suppressed by culturing for 12 to 96 hours, preferably 24 to 72 hours, more preferably 48 hours in a medium containing a concentration of 6 to 10 4 Μ. Cell growth inhibitory effects can be measured, for example, by measuring nucleic acid uptake (tritiated thymidine method), mitochondrial activity measurement (ΜΤΤ method, Alamar Blue method, etc.), DNA amount measurement method, glucose A method for measuring consumption, a method for measuring cell number or cell area by image analysis, a method for measuring fluorescence intensity (a method using fluorescently labeled cells), etc., or the method described in Example 4 or 5. , You can also check.
本発明において 「癌治療」 とは、 癌に罹患した患者の癌進行を抑制すること、 癌腫瘍を消失させること、腫瘍の増大を抑制すること、癌の発症を予防すること、 又は癌の再発を予防することを意味する。 「癌治療剤」 とは、前記の治療に用いる 剤、 治療効果を有する剤をいう。 本発明の癌治療剤を患者に投与すると、 有効成 分として含まれるビタミン K 2またはその水和物によるサイクリン D1発現阻害、 NF- κ Β活性化阻害、および/または I /c Bリン酸ィ匕阻害を介して、癌の治療を行 うことができる。  In the present invention, “cancer treatment” refers to suppressing cancer progression in a patient suffering from cancer, eliminating cancer tumors, suppressing tumor growth, preventing the onset of cancer, or recurring cancer. Means to prevent. The “cancer therapeutic agent” refers to an agent used for the above treatment or an agent having a therapeutic effect. When the therapeutic agent for cancer of the present invention is administered to a patient, inhibition of cyclin D1 expression, inhibition of NF-κΒ activation, and / or I / c B phosphate Cancer treatment can be performed through the inhibition of the dagger.
本発明において、 治療の対象となる癌腫は、 好ましくは肝癌である。  In the present invention, the carcinoma to be treated is preferably liver cancer.
癌治療の効果の有無は、 レントゲン写真、 CT、 MRI、 PET等の所見や生検の 病理組織診断により、 あるいは腫瘍マーカーの値により判断することができる。 癌の病期は特に限定されるものではない。 例えば TNM分類により分類される各 ステージ （stage ΙΑ， ΙΒ， ΙΙΑ， ΠΒ， IIIA, ΠΙΒ, IV) のものが含まれる。  The effectiveness of cancer treatment can be determined by radiographic findings, CT, MRI, PET, etc., by histopathological diagnosis of biopsy, or by the value of tumor markers. The stage of the cancer is not particularly limited. For example, each stage (stage I, II, III, II, IIIA, III, IV) classified by the TNM classification is included.
2 . 医薬組成物 2. Pharmaceutical composition
本発明において、 ビタミン Κ 2又はその水和物を有効成分として含む、 本発明 のサイクリン D1発現阻害剤、 NF- κ Β活性化阻害剤、 I /c Βリン酸化阻害剤、 抗 炎症剤、 抗リウマチ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治 療剤、抗ウィルス剤、動脈硬化治療剤、虚血性再灌流障害治療剤、腎不全治療剤、 癌細胞增殖抑制剤、糖尿病治療剤、 または癌治療剤を、以下、 「本発明の医薬組成 物」 と総称することもある。 In the present invention, the cyclin D1 expression inhibitor, NF-κΒ activation inhibitor, I / cΒ phosphorylation inhibitor, anti-inflammatory agent, anti-cyclin D1 expression inhibitor of the present invention comprising vitamin Κ2 or a hydrate thereof as an active ingredient. Rheumatism, immunosuppressant, antiallergic, transplant rejection suppressant, psoriasis treatment, antiviral, arteriosclerosis treatment, ischemic reperfusion injury treatment, renal failure treatment, The agent for suppressing cancer cell proliferation, the agent for treating diabetes, or the agent for treating cancer is hereinafter sometimes collectively referred to as “the pharmaceutical composition of the present invention”.
本発明で使用するビタミン K 2 (メナキノン、 menaquinone) は、 生体中にお いて腸内細菌により合成されるため、 構造の類似する種々の同属体が存在するこ とが知られている。 メナキノンの構造式を以下の式 （I) に示す。  It is known that vitamin K 2 (menaquinone) used in the present invention is synthesized by intestinal bacteria in a living body, so that various homologs having similar structures exist. The structural formula of menaquinone is shown in the following formula (I).
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0001
式（I)中、 nは 1〜7の整数を示す。本発明においては、ビタミン K 2のうち、 n = 4 (メナキノンー 4 ) のオールトランス体である、 メナテトレノンを使用す ることが好ましい。  In the formula (I), n represents an integer of 1 to 7. In the present invention, it is preferred to use menatetrenone, which is an all-trans form of n = 4 (menaquinone-4) among vitamin K2.
本発明で使用するメナテトレノンとは、 化学名 2—メチルー 3—テトラプレニ ノレ一 1， 4—ァフトキノン ( 2 -methl- 3 -tetraprenyl- 1 , 4-na hthoqumone ) でめ り、 代表的なビタミン K 2である。 その構造式を以下の式 （II) に示す。  Menatetrenone used in the present invention is a chemical compound represented by the chemical name 2-methyl-3-tetrapreninole-1,4-afphtoquinone (2-methl-3-tetraprenyl-1,4-nahthoqumone), and is a typical vitamin K 2 It is. Its structural formula is shown in the following formula (II).
Figure imgf000017_0002
メナテトレノンは黄色の結晶又は油状の物質であり、 におい及ぴ味はなく、 光 により分解しやすい。また、水にはほとんど溶けない。なお、メナテトレノンは、 ビタミン Κ— I I、 V K - I Iとも称される。
Figure imgf000017_0002
Menatetrenone is a yellow crystalline or oily substance that has no odor and is easily decomposed by light. It is hardly soluble in water. Menatetrenone is also referred to as vitamin II-II and VK-II.
メナテトレノンなどのビタミン Κ 2の薬理作用は、 血液凝固因子 （プロトロン ビン、 VII、 IX、 X) の生合成過程において、 グルタミン酸残基を、 生理活性を有 する γ—力ルポキシグルタミン酸に変換する際のカルボキシルイ匕反応に関与する ものである。 すなわち、 メナテトレノン等のビタミン K2の薬理作用は、 正常プ 口トロンビン等の肝合成を促進し、 生体の止血機構を賦活して生理的に止血作用 を発現するものである。 The pharmacological action of vitamin II, such as menatetrenone, occurs during the biosynthesis of blood coagulation factors (prothrombin, VII, IX, and X) by converting glutamic acid residues to γ-potency glutamate, which has biological activity. Is involved in the carboxylation reaction Things. That is, the pharmacological action of vitamin K2 such as menatetrenone promotes hepatic synthesis of normal oral thrombin and the like, activates the hemostatic mechanism of the living body, and exerts a physiological hemostatic action.
本発明の医薬組成物の有効成分であるビタミン Κ2、 好ましくはメナテトレノ ンは、 無水物であってもよいし、 水和物を形成していてもよい。 また、 メナテト レノンには結晶多形が存在することもあるが特定の結晶形に限定されず、 いずれ かの結晶形が単一であってもよいし、 結晶形混合物であってもよい。 さらに、 本 発明に使用するビタミン Κ2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物が 生体内で分解されて生じる代謝物も本発明に包含される。  Vitamin-2, preferably menatetrenone, which is an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, may be an anhydride or may form a hydrate. Menatetrenone may have a polymorphism, but is not limited to a particular crystal form. Any one of the crystal forms may be single or a mixture of crystal forms. Furthermore, the present invention also encompasses metabolites generated by decomposing vitamin Κ2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof used in the present invention in a living body.
本発明に使用するビタミン Κ 2またはその水和物は、 公知の方法で製造するこ とができ、 代表的な例としては、 特開昭 4 9 - 5 5 6 5 0号公報に開示される方 法によって、 容易に製造することができる。 また、 合成メーカーから市販品とし て入手することもできる。  The vitamin 2 or a hydrate thereof used in the present invention can be produced by a known method, and a typical example is disclosed in JP-A-49-55650. It can be easily manufactured by the method. It can also be obtained as a commercial product from a synthesis manufacturer.
また、 本発明に使用するメナテトレノンまたはその水和物も、 公知の方法で製 造することができ、 代表的な例として、 特開昭 4 9一 5 5 6 5 0号公報に開示さ れる方法によれば容易に製造することができるほか、 合成メーカーから容易に入 手することもできる。 また、 メナテトレノンは、 カプセル剤 （例えば、 「ケイツー カプセル」、「ダラケーカプセル」（以上、エーザィ株式会社製)）、注射剤（例えば、 「ケイツー Ν注」 （エーザィ株式会社製)）、 シロップ剤 （例えば、 「ケイツーシロ ップ」 （エーザィ株式会社製)） 等の製剤としても入手できる。  Menatetrenone or a hydrate thereof used in the present invention can also be produced by a known method, and a typical example is a method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 49-55650. According to the method, it can be easily manufactured and can be easily obtained from a synthesis manufacturer. Menatetrenone is available in capsules (for example, "K2 Capsule" and "Darakei Capsule" (both from Eisai Co., Ltd.)), injections (for example, "K2 ツ ー Note" (Eisai Co., Ltd.)), syrups (For example, “K2SILOP” (manufactured by Eisai Co., Ltd.)).
さらに、本発明に使用するビタミン Κ2には、体内で代謝されてビタミン Κ2、 好ましくはメナテトレノンとなる物質を用いることもできる。 体内で代謝されて メナテトレノンとなる物質は特に限定されないが、 例えば、 ビタミン Kl、 フィ トナジオン等が挙げられる。 フィトナジオンは、 ケーワンカプセル（商品名） （ェ —ザィ株式会社製)、 ケーワン錠 （商品名） （エーザィ株式会社製） またはケーヮ ン散 （商品名） （エーザィ株式会社製） として入手することができる。 本発明のビタミン Κ 2、 好ましくはメナテトレノンまたはその水和物を有効成 分として含む医薬組成物は、 そのまま用いることもできるが、 通常、 適当な添加 剤を混和し製剤化したものを使用する。 Further, as vitamin V2 used in the present invention, a substance which is metabolized in the body to vitamin V2, preferably menatetrenone, may be used. The substance which is metabolized into menatetrenone in the body is not particularly limited, but examples include vitamin Kl and phytonadione. Phytonadion can be obtained as K-One Capsule (trade name) (Eza Co., Ltd.), K-One Tablet (trade name) (Eisa Co., Ltd.) or Kane-san (trade name) (Eisa Co., Ltd.). it can. The vitamin Κ2 of the present invention, preferably menatetrenone or its hydrate, is Although a pharmaceutical composition containing the same as a component can be used as it is, usually, a pharmaceutical composition prepared by mixing appropriate additives is used.
上記添加剤としては、 一般に医薬に使用される、 賦形剤、 結合剤、 滑沢剤、 崩 壊剤、 着色剤、 矯味矯臭剤、 乳化剤、 界面活性剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張 ィ匕剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、安定化剤、吸収促進剤等を挙げることができ、 所望により、 これらを適宜組み合わせて使用することもできる。 以下に上記添加 剤の例を挙げる。  Examples of the above additives include excipients, binders, lubricants, disintegrants, coloring agents, flavoring agents, emulsifiers, surfactants, solubilizing agents, suspending agents, which are generally used in medicine. Examples include isotonic dandruffs, buffers, preservatives, antioxidants, stabilizers, absorption promoters, and the like. If desired, these can be used in appropriate combination. The following are examples of the above additives.
賦形剤：乳糖、 白糖、 ブドウ糖、 コーンスターチ、 マンニトール、 ソルビトー ル、デンプン、 α化デンプン、デキストリン、結晶セルロース、軽質無水ケィ酸、 ケィ酸アルミニウム、 ケィ酸カルシウム、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、 リン酸水素カルシウム Excipients: lactose, sucrose, glucose, cornstarch, mannitol, sorbitol Le, starch, alpha starch, dextrin, crystalline cellulose, light anhydrous Kei acid, aluminum Kei, calcium Kei acid, magnesium aluminometasilicate, hydrogen phosphate calcium
結合剤：例えばポリビニルアルコール、メチルセルロース、ェチルセルロース、 アラビアゴム、 トラガント、 ゼラチン、 シヱラック、 ヒドロキシプロピルメチル セノレロース、 ヒ ドロキシプロピノレセノレロース、 カノレポキシメチノレセノレロースナト リウム、 ポリビエルピロリ ドン、 マクロゴール  Binders: for example, polyvinyl alcohol, methylcellulose, ethylcellulose, gum arabic, tragacanth, gelatin, syrup, hydroxypropylmethyl cenorellose, hydroxypropinoresenolerose, canolepoxymethinoresenolerose sodium, polybierpyrrolidone, Macro goal
滑沢剤：ステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸カルシウム、 フマル酸ステ ァリルナトリウム、 タノレク、 ポリエチレングリコール、 コロイドシリカ  Lubricants: magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, tanolek, polyethylene glycol, colloidal silica
崩壊剤：結晶セルロース、 寒天、 ゼラチン、 炭酸カルシウム、 炭酸水素ナトリ ゥム、 クェン酸カルシウム、 デキストリン、 ぺクチン、 低置換度ヒドロキシプロ ピルセノレロース、 カノレボキシメチノレセルロース、 力ノレボキシメチルセルロース力 ノレシゥム、 クロスカノレメロースナトリウム、 カノレポキシメチノレスターチ、 カノレポ キシメチルスターチナトリウム  Disintegrators: crystalline cellulose, agar, gelatin, calcium carbonate, sodium bicarbonate, calcium citrate, dextrin, pectin, low-substituted hydroxypropyl cerenolose, canoleboximetinolecellulose, phenolic methylcellulose Cros canolemelose sodium, canolepox methinolestarch, canolepoxy methyl starch sodium
着色剤：三二酸化鉄、 黄色三二酸化鉄、 カルミン、 カラメル、 β—力ロチン、 酸化チタン、 タノレク、 リン酸リボフラビンナトリウム、 黄色アルミニウムレーキ 等、 医薬品に添加することが許可されているもの  Coloring agents: Iron sesquioxide, yellow sesquioxide, carmine, caramel, beta-potassin, titanium oxide, tanolek, sodium riboflavin phosphate, yellow aluminum lake, etc., which are permitted to be added to pharmaceutical products
矯味矯臭剤：ココア末、 ハツ力脳、 芳香散、 ハツ力油、 竜脳、 桂皮末 乳化剤または界面活性剤：ステアリルトリエタノールァミン、 ラウリル硫酸ナ トリウム、 ラウリルアミノプロピオン酸、 レシチン、 モノステアリン酸ダリセリ ン、 ショ糖脂肪酸エステル、 グリセリン脂肪酸エステル Flavoring agent: cocoa powder, heart-shaped brain, fragrance powder, heart-shaped oil, dragon brain, cinnamon powder emulsifier or surfactant: stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, dariseri monostearate Sucrose fatty acid ester, glycerin fatty acid ester
溶解補助剤：ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール、 安息香酸ベン ジル、 エタノール、 コレステロール、 トリエタノールァミン、 炭酸ナトリウム、 タエン酸ナトリゥム、 ポリソルベート 8 0、 ニコチン酸アミ ド  Solubilizers: polyethylene glycol, propylene glycol, benzyl benzoate, ethanol, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium taenoate, polysorbate 80, nicotinic acid amide
懸濁化剤：前記界面活性剤のほか、 例えばポリビュルアルコール、 ポリビュル ピロリ ドン、 メチノレセノレロース、 ヒドロキシメチノレセノレロース、 ヒ ドロキシェチ ルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子  Suspending agent: In addition to the above surfactants, hydrophilic polymers such as, for example, polybutyl alcohol, polybutylpyrrolidone, methinoresenorelose, hydroxymethinoresenorelose, hydroxyshethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.
等張化剤としては、 ブドウ糖、 塩ィ匕ナトリウム、 マンニトール、 ソルビトーノレ 緩衝剤： リン酸塩、 酢酸塩、 炭酸塩、 クェン酸塩などの緩衝液  Isotonizing agents include glucose, sodium salt, mannitol, sorbitol, and buffering agents: buffers such as phosphate, acetate, carbonate, and citrate.
防腐剤：メチルパラベン、 プロピルパラベン、 クロロブタノール、 ベンジルァ ノレコール、 フエネチルアルコール、 デヒ ドロ酢酸、 ソルビン酸  Preservatives: methyl paraben, propyl paraben, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, dehydroacetic acid, sorbic acid
抗酸化剤：硫酸塩、 ァスコルビン酸、 α—トコフェロール Antioxidants: sulfate, ascorbic acid, α -tocopherol
安定化剤：一般に医薬に使用されるもの  Stabilizer: commonly used in medicine
吸収促進剤：一般に医薬に使用されるもの  Absorption enhancers: those commonly used in medicine
また、 必要に応じて、 ビタミン類、 アミノ酸等の成分を配合してもよい。  Further, if necessary, components such as vitamins and amino acids may be added.
また、 上記製剤としては、 錠剤、 散剤、 顆粒剤、 細粒剤、 カプセル剤、 シロッ プ剤、 トローチ剤、 吸入剤等の経口剤；坐剤、 軟膏剤、 眼軟膏剤、 テープ剤、 点 眼剤、 点鼻剤、 点耳剤、 パップ剤、 ローション剤等の外用剤または注射剤を挙げ ることができる。  The above preparations include tablets, powders, granules, fine granules, capsules, syrups, troches, inhalants, etc .; suppositories, ointments, eye ointments, tapes, eye drops Agents, nasal drops, ear drops, cataplasms, lotions and the like, or external preparations and injections.
上記経口剤は、上記添加剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。なお、 必要に応じてこれらの表面をコーティングしてもよい。  The oral preparation can be formulated by appropriately combining the above additives. In addition, you may coat these surfaces as needed.
上記外用剤は、上記添加剤のうち、特に賦形剤、結合剤、矯味矯臭剤、乳化剤、 界面活性剤、 溶解補助剤、 懸濁化剤、 等張化剤、 防腐剤、 抗酸化剤、 安定化剤ま たは吸収促進剤を適宜組み合わせて製剤化することができる。  The above-mentioned external preparations are, among the above-mentioned additives, particularly excipients, binders, flavoring agents, emulsifiers, surfactants, solubilizing agents, suspending agents, isotonic agents, preservatives, antioxidants, It can be formulated by appropriately combining a stabilizer or an absorption enhancer.
上記注射剤は、 上記添加剤のうち、 特に乳化剤、 界面活性剤、 溶解補助剤、 懸 濁化剤、 等張化剤、 緩衝剤、 防腐剤、 抗酸化剤、 安定化剤または吸収促進剤を適 宜組み合わせて製剤化することができる。  The above-mentioned injection includes, among the above-mentioned additives, particularly an emulsifier, a surfactant, a solubilizer, a suspending agent, a tonicity agent, a buffer, a preservative, an antioxidant, a stabilizer, or an absorption enhancer. They can be formulated in appropriate combinations.
また、 メナテトレノンのカプセル剤は、 商品名ケイツーカプセル （エーザィ株 式会社製)、 グラケ一カプセル （エーザィ株式会社製） として、 また、 シロップ剤 は、 商品名ケイツーシロップ （エーザィ株式会社製） として、 注射剤は商品名ケ イツー N注 （エーザィ株式会社製） として入手することができる。 Menatetrenone capsules are available under the brand name K2 Capsule (Eisai Co., Ltd.) Shike Co., Ltd.), Graquet Capsule (Eisai Co., Ltd.), Syrup as K2 Syrup (Eisai Co., Ltd.), and Injection as K2N Note (Eisai Co., Ltd.) Can be obtained.
さらに、 上記のとおり本発明に使用するビタミン K2には、 体内で代謝されて ビタミン K2、 好ましくはメナテトレノンとなる物質 （例えば、 ビタミン Kl、 フイトナジオン等） を用いることもできる。 フイトナジオンのカプセノレ剤は、 商 品名ケーワンカプセル （エーザィ株式会社製） として、 また、 錠剤は、 商品名ケ 一ワン錠 （エーザィ株式会社製） として、 散剤は、 商品名ケーワン散 （エーザィ 株式会社製） として入手することができる。  Further, as described above, as the vitamin K2 used in the present invention, a substance which is metabolized in the body to form vitamin K2, preferably menatetrenone (for example, vitamin K1, phytonadione, etc.) can also be used. The capsenole of Huitonadione is sold under the trade name K-One Capsule (manufactured by Eisai Co., Ltd.), and the tablets are manufactured under the trade name K-One Tablet (manufactured by Eisai Co., Ltd.). Can be obtained as
本発明において、 ビタミン Κ2を含有する本発明の医薬組成物は、 サイクリン D1発現阻害、 NF- κ Β活性化阻害、 I /c Β リン酸化阻害、 癌細胞、 好ましくは肝 癌細胞の増殖抑制、 又は癌、 好ましくは肝癌の治療に有用である。 当該阻害、 抑 制、 治療において、 ビタミン Κ2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和 物の好ましい投与量 （有効量） としては、 成人 （体重 6 Okg) あたり、 通常、 1 0〜20 Omg/日であり、 好ましくは 1 5〜； 1 3 5mg/日であり、 さらに好 ましくは 30〜6 Omg/日 （例えば 4 5mg/日） である。 投与期間は、 特に 限定されるものではなく、 例えば、 1〜1 0 00日、 好ましくは 7〜 300日で ある。投与量および投与期間は、癌の治療効果と患者の状態（例えば Performance status) を勘案しながら、 適宜設定することができる。  In the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention containing vitamin Κ2 comprises cyclin D1 expression inhibition, NF-κΒ activation inhibition, I / cΒ phosphorylation inhibition, cancer cells, preferably liver cancer cells, Or it is useful for treating cancer, preferably liver cancer. In the inhibition, suppression, and treatment, the preferred dose (effective amount) of vitamin Κ2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof is generally 10 to 20 Omg / day per adult (body weight 6 Okg). Yes, preferably 15-; 135 mg / day, more preferably 30-6 Omg / day (eg 45 mg / day). The administration period is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 days, preferably 7 to 300 days. The dose and the administration period can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect of cancer and the condition of the patient (for example, performance status).
本発明の医薬組成物を癌に罹患した患者に投与すると、 副作用を生じることな く （副作用が生じても患者に影響のない微弱な程度である）、癌の治療効果を得る ことが可能である。 本発明において、 ビタミン K2を含有する医薬組成物は、 炎症、 リウマチ、 免 疫抑制、 アレルギー、 移植拒絶反応、 乾癬、 ウィルス性疾患、 動脈硬化、 虚血性 再灌流障害、 糖尿病、 または腎不全に有用である。 これらの疾患を治療するに際 し、 ビタミン K2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物の好ましい投 与量 （有効量） としては、 成人 （体重 6 Okg) あたり、 通常、 1 0〜200mg /日であり、 好ましくは 1 5〜1 3 5 m g /日であり、 さらに好ましくは 3 0〜 6 0 m gノ日 （例えば 4 5 m g Z日） である。 投与期間は、 特に限定されるもの ではなく、 例えば、 1〜 1 0 0 0日、 好ましくは 7〜 3 0 0日である。 投与量お よび投与期間は、 癌の治療効果と患者の状態を勘案しながら、 適宜設定すること ができる。 When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a patient suffering from cancer, it is possible to obtain a therapeutic effect on cancer without causing side effects (there is only a slight degree that does not affect patients even if side effects occur). is there. In the present invention, the pharmaceutical composition containing vitamin K2 is useful for inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral disease, arteriosclerosis, ischemic reperfusion injury, diabetes, or renal failure It is. In treating these diseases, the preferred dose (effective amount) of vitamin K2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof is generally 10 to 200 mg per adult (body weight 6 Okg). / Day, preferably 15 to 135 mg / day, more preferably 30 to 60 mg / day (for example, 45 mg / day Z). The administration period is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 days, preferably 7 to 300 days. The dose and the administration period can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect of cancer and the condition of the patient.
本発明の医薬組成物を患者に投与すると、 副作用を生じることなく （副作用が 生じても患者に影響のない微弱な程度である）、炎症、 リゥマチ、免疫抑制、 ァレ ルギ一、移植拒絶反応、 乾癬、 ウィルス性疾患、 動脈硬化、 虚血性再灌流障害、 糖尿病または腎不全の治療効果を得ることが可能であり、本発明の医薬組成物は、 上記疾患の全部又は二つ以上の組合せを治療対象とすることもできるし、 上記疾 患の一つを治療対象とすることもできる。 さらに、 本発明には、 本発明の医薬組成物を製造するための、 ビタミン K 2又 はその水和物の使用も含まれる。本発明の使用において、本発明の医薬組成物は、 上記の通り、 ビタミン K 2又はその水和物を有効成分として含む医薬組成物、 及 び本発明の NF- κ B活性化阻害剤又は I κ B リン酸化阻害剤を有効成分として含 む医薬組成物である。また、ビタミン K 2は、好ましくはメナテトレノンである。 また、 本発明は、 ビタミン K 2又はその水和物を有効成分として含む本発明の 医薬組成物を患者に投与することを特徴とする、 炎症、 リウマチ、 免疫抑制、 ァ レルギ一、移植拒絶反応、乾癬、 ウィルス性疾患、動脈硬化、虚血性再灌流障害、 糖尿病、 及び腎不全からなる群から選ばれる 1以上の疾患の治療方法、 癌細胞の 増殖抑制方法、 及び癌の治療方法を含むものである。 本発明の方法において、 ビ タミン K 2は、 好ましくはメナテトレノンである。 本発明の方法において、 ビタ ミン K 2又はその水和物を有効成分として含む医薬組成物、 又は本発明の NF- κ B活性化阻害剤若しくは Ι κ Β リン酸ィ匕阻害剤を有効成分として含む医薬組成物 の投与経路および投与方法は特に限定されないが、 上記本発明の医薬組成物の記 載を参照することができる。 3 . 抗腫瘍剤との組み合わせ When the pharmaceutical composition of the present invention is administered to a patient, it does not cause side effects (there is a slight degree that does not affect the patient even if side effects occur), inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergies, transplant rejection , Psoriasis, viral diseases, arteriosclerosis, ischemic reperfusion injury, diabetes or renal failure, and the pharmaceutical composition of the present invention comprises all or a combination of two or more of the above diseases It can be treated or one of the above diseases can be treated. Furthermore, the present invention includes the use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing the pharmaceutical composition of the present invention. In the use of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention comprises, as described above, a pharmaceutical composition comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient, and a NF-κB activation inhibitor or I of the present invention. A pharmaceutical composition comprising a κ B phosphorylation inhibitor as an active ingredient. Also, vitamin K2 is preferably menatetrenone. In addition, the present invention provides administering to a patient the pharmaceutical composition of the present invention containing vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient, inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection. , Psoriasis, viral diseases, arteriosclerosis, ischemic reperfusion injury, diabetes, and renal insufficiency, a method for treating one or more diseases, a method for suppressing the growth of cancer cells, and a method for treating cancer. . In the method of the present invention, vitamin K2 is preferably menatetrenone. In the method of the present invention, a pharmaceutical composition containing vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient, or the NF-κB activation inhibitor or the ΙκΒ phosphorylation inhibitor of the present invention as an active ingredient The administration route and administration method of the pharmaceutical composition containing the composition are not particularly limited, and the description of the pharmaceutical composition of the present invention can be referred to. 3. Combination with antitumor agent
本凳明のビタミン K 2を含有する剤と抗腫瘍剤との組み合わせは、 癌、 好まし くは肝癌治療に有用である。 すなわち、 本発明は、 ビタミン K 2又はその水和物 と、抗腫瘍物質とを組み合わせてなる癌治療剤（以下、「本発明の併用医薬組成物」 ともいう。）、 好ましくは肝癌治療剤を提供する。 本発明の併用医薬組成物は、 癌 の治療、 好ましくは肝癌の治療に使用できる。  The combination of an agent containing vitamin K2 and an antitumor agent of the present invention is useful for treating cancer, preferably liver cancer. That is, the present invention relates to a cancer therapeutic agent comprising vitamin K2 or a hydrate thereof and an antitumor substance (hereinafter, also referred to as “combination pharmaceutical composition of the present invention”), preferably a liver cancer therapeutic agent. provide. The combined pharmaceutical composition of the present invention can be used for treating cancer, preferably for treating liver cancer.
ビタミン K 2、 好ましくはメナテトレノン、 またはその水和物の好ましい投与 量 （有効量） としては、 成人 （体重 6 O kg) あたり、 通常、 1 0〜2 0 0 m g 日であり、 好ましくは 1 5〜1 3 5 m g /日であり、 さらに好ましくは 3 0〜 6 O m g Z日 （例えば 4 5 m g Z日） である。 投与期間は、 特に限定されるもので はなく、 例えば、 1〜1 0 0 0日、 好ましくは 7〜3 0 0日である。 投与量およ ぴ投与期間は、癌の治療効果と患者の状態 （例えば Performance status) を勘案 しながら、 適宜設定することができる。  The preferred dose (effective amount) of vitamin K2, preferably menatetrenone, or a hydrate thereof is usually 10 to 200 mg / day, preferably 15 to 20 mg / day for an adult (body weight of 6 O kg). 1135 mg / day, more preferably 30-6 O mg Z day (for example, 45 mg Z day). The administration period is not particularly limited, and is, for example, 1 to 100 days, preferably 7 to 300 days. The dose and the administration period can be appropriately set in consideration of the therapeutic effect of cancer and the condition of the patient (for example, performance status).
一方、 抗腫瘍物質とは、 腫瘍の増殖を抑制する作用、 腫瘍の増殖速度を減速さ せる作用、 腫瘍を縮小させる作用、 あるいは腫瘍を消失させる作用などの抗腫瘍 作用を有する物質である。 抗 JB瘍物質の例には、 フルォロウラシル （5-FU、 商品 名 5-FU)、 CPT-11 (イリノテカン、 商品名トポテシン、 カンプト）、 マイトマイ シン C (mytomycin C、 商品名マイトマイシン）、 シスプラチン (cisplatin、 商 品名ランダ、 ブリブラチン、 アイエーコール、 コナプリ）、 カルポプラチン (carboplatin, 商品名パラプラチン）、 ォキサリブラチン （oxaliplatin、 商品名 Eloxatin (登録商標））、 力ぺシタビン （capecitabine、 商品名ゼローダ）、 ゲムシ タビン （gemcitabine、 商品名ジェムザ一ル）、 ドキソルビシン （doxorubicin、 商品名アドリアシン）、 パクリタキセル （商品名タキソール （taxol) )、 ドセタキ セル （docetaxel、 商品名タキソテール） などがあげられ、 好ましくは 5-FUであ る。 抗腫瘍物質の投与量は、 通常の臨床用量に従うことが好ましく、 適宜、 増量 または減量することができる。  On the other hand, an antitumor substance is a substance having an antitumor action such as an action of suppressing tumor growth, an action of slowing down the growth rate of a tumor, an action of reducing a tumor, or an action of eliminating a tumor. Examples of anti-JB ulcer substances include fluorouracil (5-FU, trade name 5-FU), CPT-11 (irinotecan, trade name topotecin, campto), mitomycin C (mytomycin C, trade name mitomycin), and cisplatin (cisplatin). , Brand names Landa, bribratin, iacol, conapri), carpoplatin (carboplatin, brand name paraplatin), oxaliplatin (oxaliplatin, brand name Eloxatin (registered trademark)), capecitabine (brand name Xeloda), gemcitabine (gemcitabine) And trade name: gemzall, doxorubicin (doxorubicin, trade name adriacin), paclitaxel (trade name taxol), docetaxel (docetaxel, trade name taxotere) and the like, and preferably 5-FU. The dose of the antitumor substance is preferably in accordance with a normal clinical dose, and can be increased or decreased as appropriate.
本楽明において 「組み合わせてなる」 とは、 化合物を併用して用いるための組 み合わせを意味し、 別々の物質を投与時に併用する形態、 および混合物としての 形態の両方を含む。 投与時に併用する形態の場合、 ビタミン K 2若しくはその水 和物、 又は抗腫瘍物質は製剤化されたものを用いることができる。 In the present description, “combined” means a combination for use in combination with a compound, in which separate substances are used in combination at the time of administration, and as a mixture. Including both forms. In the case of a form to be used at the time of administration, vitamin K 2 or a hydrate thereof, or a formulated antitumor substance can be used.
さらに、 本発明には、 抗腫瘍物質と組み合わせてなる医薬組成物を製造するた めのビタミン K 2またはその水和物の使用も含まれる。 本発明の使用において、 ビタミン K 2は好ましくはメナテトレノンである。また、本発明の使用において、 上記医薬組成物は、 癌治療剤として有用である。  Furthermore, the present invention includes the use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing a pharmaceutical composition in combination with an antitumor substance. In the use according to the invention, vitamin K2 is preferably menatetrenone. In the use of the present invention, the above pharmaceutical composition is useful as an agent for treating cancer.
また、本発明は、ビタミン K 2又はその水和物と、抗腫瘍物質とを同時又は別々 に患者に有効量投与することを特徴とする癌の治療方法をも含むものである。 本 発明の治療方法において、 ビタミン K 2は好ましくはメナテトレノンである。 本 発明の治療方法において、 ビタミン K 2またはその水和物と、 抗腫瘍物質との投 与径路及び投与方法は特に限定されないが、 上記本発明の医薬組成物の記載を参 照することができる。 以下に、 具体的な例をもって本発明を示すが、 本発明はこれに限られるもので はない。  The present invention also includes a method for treating cancer, which comprises administering an effective amount of vitamin K2 or a hydrate thereof and an antitumor substance to a patient simultaneously or separately. In the treatment method of the present invention, vitamin K2 is preferably menatetrenone. In the treatment method of the present invention, the route of administration and the method of administration of vitamin K2 or a hydrate thereof and an antitumor substance are not particularly limited, and the description of the pharmaceutical composition of the present invention can be referred to. . Hereinafter, the present invention will be described with reference to specific examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例中、 ビタミン K 2として、 メナテトレノンを用いた （図中の標記は 「ビ タミン K2」 とした。）。 実施例 1 メナテトレノンのサイクリン D1の発現に対する効果  In the examples, menatetrenone was used as vitamin K2 (the title in the figure was "vitamine K2"). Example 1 Effect of Menatetrenone on Cyclin D1 Expression
メナテトレノンが肝癌細胞に対し濃度依存的に増殖を抑制し、 その機序として 細胞周期が G1期で停止することを既に示している。 この分子機構を明らかにす るため、 G1期から S期への細胞周期の進行に必須の分子であるサイタリン D1 遺伝子の発現に対するメナテトレノンの効果を検討した。培養肝癌細胞株 HepG2, Huh7, Hep3Bに対し、 メナテトレノンを 0, 10'6， 10·5, 10·4 Μの濃度で 48時間作 用させた後サイクリン D1 の発現を常法にしたがいウェスタンプロット法及ぴ RT-PCR法にて検討した。 It has already been shown that menatetrenone suppresses proliferation of liver cancer cells in a concentration-dependent manner, and that the mechanism is that the cell cycle is arrested in G1 phase. To elucidate this molecular mechanism, the effect of menatetrenone on the expression of the cytaline D1 gene, a molecule essential for cell cycle progression from G1 to S phase, was examined. Cultured hepatoma cell lines HepG2, Huh7, Hep3B respect, 0 menatetrenone, 10 '6, 10, 5, Western blotting by a conventional method the expression of the 10.4 After for 48 hours operation at a concentration of Μ cyclin D1 This was examined by RT-PCR.
また、 ウェスタンプロット法及び RT-PCR法による検討と同時に、 常法にした がいサイクリン D1プロモータールシフェラーゼプラスミドを用いてメナテトレ ノンのサイクリン Dlプロモ^"ター活性に与える影響を検討した。プラスミドは、 文献 Journal of Biological Chemistry. 270(40), 23589-23597, 1995 に記載の -1745CD1LUCを用いた。 本明細書において、 ルシフヱラーゼ活性は、 対照にお ける値を 100としたときの相対値 （相対ルシフェラーゼ活性） として示す場合が ¾)る In addition, at the same time as the Western blot method and the RT-PCR method, the cyclin D1 promoter luciferase plasmid The effect on non-cyclin Dl promoter activity was examined. The plasmid used was -1745CD1LUC described in Reference Journal of Biological Chemistry. 270 (40), 23589-23597, 1995. In the present specification, luciferase was used. The activity is sometimes shown as a relative value (relative luciferase activity) when the value in the control is taken as 100).
その結果、 メナテトレノンにより肝癌細胞におけるサイクリン D1の発現は、 タンパク質レベル、 mRNAレベルの両方で濃度依存的に抑制された（図 1 A、 B；)。 同様にメナテトレノンは、 肝癌細胞におけるサイタリン D1プロモーター活性を 濃度依存的に抑制した （図 1 C)。  As a result, the expression of cyclin D1 in liver cancer cells was suppressed by menatetrenone in a concentration-dependent manner at both the protein level and the mRNA level (FIGS. 1A, B;). Similarly, menatetrenone inhibited the activity of cytaline D1 promoter in liver cancer cells in a concentration-dependent manner (Fig. 1C).
以上の結果から、 メナテトレノンは、 サイクリン D1遺伝子の発現をそのプロ モーター活性を抑制することで調節しており、 これが肝癌細胞における細胞周期 の G1期停止に寄与していることが明らかになつた。 実施例 2 メナテトレノンによる転写因子 NF- κ Bの活性に対する影響  These results demonstrated that menatetrenone regulates cyclin D1 gene expression by suppressing its promoter activity, which contributes to the G1 arrest of the cell cycle in liver cancer cells. Example 2 Effect of Menatetrenone on Activity of Transcription Factor NF-κB
サイクリン D1は、 そのプロモーター領域に転写因子 AP-1や NF- /c Bの結合 領域を持ち、 これらの転写因子によりその活性が調節されていることが知られて いる。 本実施例では、 メナテトレノンが NF- κ Βの DNA結合活性に与える影響 を常法にしたがいゲルシフトアツセィにより検討した。 同時に、 NF- zc B の転写 活性に与えるメナテトレノンの影響を NF- /c Bルシフェラーゼレポータープラス ミド （クロンテック社製） を用いて検討した。  It is known that cyclin D1 has transcription factor AP-1 and NF- / cB binding regions in its promoter region, and its activity is regulated by these transcription factors. In this example, the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF-κΒ was examined by gel shift assay according to a conventional method. At the same time, the effect of menatetrenone on the transcriptional activity of NF-zcB was examined using NF- / cB luciferase reporter plasmid (Clontech).
ゲルシフトアツセィの結果、 メナテトレノンは、 月干癌細胞 Hep3B， Huh7にお いて濃度依存的に NF- κ Bの DNA結合活性を抑制した（図 2 )。 NF- / Bの DNA 結合活性は、 NF- κ Β非放射性競合物により阻害されたが、 DNA結合活性有し ない変異 NF- κ Bでは抑制されなかつた。 また、 NF- κ Bのサブュニットである p65および p5'0に対する抗体にて NF- K Bの結合バンドのシフトが認められた。 また、 HepG2細胞では、 メナテトレノンは、 NF- /c Bレポータープラスミドの ルシフェラーゼ活性を濃度依存的に抑制した （図 3 )。  As a result of gel shift assay, menatetrenone suppressed the DNA binding activity of NF-κB in moon-dehydrated cancer cells Hep3B and Huh7 in a concentration-dependent manner (Fig. 2). The DNA binding activity of NF- / B was inhibited by NF-κκ non-radioactive competitor, but was not suppressed by mutant NF-κB having no DNA binding activity. In addition, a shift in the binding band of NF-KB was observed with antibodies against p65 and p5'0, which are NF-KB subunits. In HepG2 cells, menatetrenone suppressed the luciferase activity of the NF- / cB reporter plasmid in a concentration-dependent manner (Fig. 3).
以上の結果から、 メナテトレノンは、 肝癌細胞における NF- c Bの DNA結合 活性、 転写活性を特異的に抑制することが明らかになった。 実施例 3 メナテトレノンのサイクリン D1プロモーター活性抑制における転 写因子 NF- κ B依存性の検討 These results indicate that menatetrenone binds to NF-cB DNA in hepatoma cells. Activity and transcriptional activity. Example 3 Investigation of Transcription Factor NF-κB Dependence on Menatetrenone Inhibition of Cyclin D1 Promoter Activity
メナテトレノンによるサイクリン D1プロモーター活性調節における転写因子 AP-1および NF- κ Βの役割を検討するため、肝癌細胞において、野生型 AP- 1お ょぴ NF- zc B結合部位を持つサイクリン D1プロモーターと、 結合活性のない変 異型 AP-1および NF- κ B結合部位を持つサイクリン D1プロモーターとを用い てルシフェラーゼレポーターアツセィを行い、 転写因子 AP-1および NF- zc Bの 影響を検討した。 メナテトレノンを肝癌細胞に 0, 10-6, 10-5, 10-4 Mの濃度で 48 時間作用させた後、ルシフェラーゼレポーターアツセィを行った。プラスミドは、 文献 Journal of Biological Chemistry. 270(40)， 23589.23597， 1995、 Molecular and Cellular Biology. 19(8)， 5785.5799， 1999 および Cancer Research. 62, 3997-4006, 2002.に記載の- 1745CD1LUC、 -964CD1LUC, -96 AP- lmtCDlLUC, -66CD1LUC、 -66NF- κ BmutCDlLUCを用いた。  To examine the role of the transcription factors AP-1 and NF-κ に お け る in the regulation of cyclin D1 promoter activity by menatetrenone, in liver cancer cells, a cyclin D1 promoter with a wild-type AP-1 and NF-zcB binding site, Luciferase reporter assembly was performed using the mutant AP-1 having no binding activity and the cyclin D1 promoter having an NF-κB binding site, and the effects of the transcription factors AP-1 and NF-zcB were examined. Menatetrenone was allowed to act on liver cancer cells at concentrations of 0, 10-6, 10-5, and 10-4 M for 48 hours, followed by luciferase reporter accession. Plasmids are described in the journals Journal of Biological Chemistry. 270 (40), 23589.23597, 1995, Molecular and Cellular Biology. 19 (8), 5785.5799, 1999 and Cancer Research. 62, 3997-4006, 2002. 964CD1LUC, -96 AP-lmtCD1LUC, -66CD1LUC, -66NF-κBmutCD1LUC were used.
また、 メナテトレノンによるサイクリン Dlプロモーター活性に対する NF- κ B依存性を確認するため、 NF- c B のサブユニットである p65/RelAを肝癌細胞 HepG2に導入し過剰発現させ、メナテトレノンによるサイクリン D1プロモータ 一活性の抑制が解除されるか否かを検討した。メナテトレノンは、 p65/RelAブラ スミド（pcDNA3.1/p65) を HepG2に導入した 12時間後に、 0， 10-6， 10-5， 1CH M の濃度で添加し、 48時間作用させた。 To confirm NF-κB dependence on cyclin Dl promoter activity by menatetrenone, p65 / RelA, a subunit of NF-cB, was introduced into hepatoma cells HepG2 and overexpressed, and the cyclin D1 promoter activity by menatetrenone was confirmed. It was examined whether the suppression of the situation was released. Menatetrenone, 12 hours after the introduction into p65 / RelA bra plasmid of (pcDNA3.1 / p65) HepG2, 0 , 10- 6, was added at a concentration of 10- 5, 1CH M, was allowed to act for 48 hours.
ここで、 「p65/RelA」 は、 NF- κ B のサブユニットであるため、 細胞に過剰発 現させることにより、 NF- κ Βの発現量が増加する。 そのため、 メナテトレノン が NF- κ B活性化を抑制することにより、 サイクリン D1プロモーター活性に対 する抑制作用を示す場合には、 NF- κ B の発現量の増加に伴い、 メナテトレノン によるサイクリン D1プロモーター活性に対する作用が抑制されることが予想さ れる。  Here, since “p65 / RelA” is a subunit of NF-κB, its overexpression in cells increases the expression level of NF-κΒ. Therefore, when menatetrenone inhibits NF-κB activation and thereby suppresses cyclin D1 promoter activity, if the expression level of NF-κB increases, menatetrenone inhibits cyclin D1 promoter activity. The effect is expected to be suppressed.
その結果、 肝癌細胞においては、 メナテトレノンは、 濃度依存的に野生型サイ クリン Dlプロモーターのルシフヱラーゼ活性を抑制した （図 4上から 1， 2段 目）。 変異 AP-1 結合部位を有するサイ ク リ ン D1 プロモーター (-964AP-lmtCDlLUC ) ではメナテトレノンにより野生型サイクリン D1プロ モーターと同様にその活性は濃度依存的に抑制された（図 4上から 3段目）。 しか し、 野生型 NF- /c B結合部位を有するサイクリン D1プロモーターがメナテトレ ノンにより濃度依存的に抑制を受けたのに対し （図 4下から 2段目）、 変異 NF- κ Β結合部位を有するサイクリン D1プロモーター (_66NF-KBmutCDlLUC )で は、 メナテトレノンによるプロモーター活性の抑制が見られなかった （図 4下か ら 1段目）。 As a result, in hepatocellular carcinoma cells, menatetrenone was shown to be wild-type The luciferase activity of the Clin Dl promoter was suppressed (Fig. 4, top 1 and 2). Similar to the wild-type cyclin D1 promoter, the activity of the cyclin D1 promoter (-964AP-lmtCD1LUC) having the mutant AP-1 binding site was suppressed by menatetrenone in a concentration-dependent manner (Fig. 4, top 3). ). However, whereas the cyclin D1 promoter containing the wild-type NF- / cB binding site was repressed by menatetrenone in a concentration-dependent manner (the second row from the bottom in Fig. 4), the mutant NF-κΒ In the cyclin D1 promoter (_66NF-KBmutCD1LUC), the suppression of promoter activity by menatetrenone was not observed (the first row from the bottom in FIG. 4).
さらに、 NF- κ Βのサブュ-ットである P65/RelAを予め肝癌細胞に導入して おくと、 サイクリン D1のプロモーター活性は、 メナテトレノンによって抑制さ れなくなった （図 5 「HepG2/pcDNA3.1/p65」）。  Furthermore, when P65 / RelA, a submit of NF-κΒ, was introduced into hepatoma cells in advance, the cyclin D1 promoter activity was not suppressed by menatetrenone (Fig. 5 “HepG2 / pcDNA3.1 / p65 ").
本実施例から、 メナテトレノンは、 NF- zc B活性化を抑制することにより、 サ イクリン D1プロモーター活性に対する抑制作用を示すことが明らかとなった。 実施例 4 メナテトレノンによる肝癌細胞增殖抑制作用の NF- /c B、 サイタリ ン D1依存性の検討  This example revealed that menatetrenone exhibits an inhibitory effect on the cyclin D1 promoter activity by suppressing NF-zcB activation. Example 4 Examination of NF- / cB and Citalin D1 Dependence of Hepatoma Cell Proliferation Inhibition by Menatetrenone
上記の結果から、 メナテトレノンによる肝癌細胞増殖抑制作用は、 転写因子 NF- κ Βの活性化抑制を通じてターゲット遺伝子の一つであるサイタリン D1を 抑制しているものと考えられるが、 実際に、 肝癌細胞の増殖抑制が、 NF- κ Β あ るいはサイタリン D1に依存的であるか否かを検討するため、 NF- κ Β のサブュ ニットである p65/RelAあるいはサイタリン D1遺伝子を肝癌細胞に導入しメナ テトレノンによる増殖抑制作用が変化するかどうかを常法にしたがい細胞增殖ァ ッセィにより検討した。  From the above results, it is considered that the action of menatetrenone to suppress the growth of hepatocellular carcinoma cells suppresses cytaline D1, one of the target genes, by suppressing the activation of the transcription factor NF-κΒ. To examine whether the growth inhibition of NF-κΒ or cytaline D1 is dependent on NF-κΒ or cytaline D1, the NF-κ あ る い は subunit p65 / RelA or the cytaline D1 gene was introduced into hepatoma cells. Whether or not the growth inhibitory effect of tetrenone was changed was examined by a cell culture assay according to a conventional method.
肝癌細胞 HepG2に対し NF- /c Bのサプユニットである p65/RelAあるいはサイ クリン D1遺伝子を一過性に導入した 12時間後に、メナテトレノンを 0, 10-6, 10-5, 12 hours after transiently introducing the NF- / cB subunit p65 / RelA or cyclin D1 gene into hepatoma cells HepG2, menatetrenone was changed to 0, 10-6, 10-5,
10·4 Μの濃度で 48時間作用させた。 その結果、親株、 mock遺伝子導入細胞では その増殖が抑制されたのに対し、 p65/RelAあるいはサイクリン D1遺伝子が導入 された細胞ではメナテトレノンによる増殖抑制作用が消失していた（図 6 )。同様 の結果は、 Hep3B細胞でも観察された （図 7 )。 At a concentration of 10 · 4 Micromax was allowed to act for 48 hours. As a result, the growth was suppressed in the parent strain, mock gene-transfected cells, while p65 / RelA or cyclin D1 gene was transfected. In these cells, the growth inhibitory effect of menatetrenone was lost (Fig. 6). Similar results were observed with Hep3B cells (Figure 7).
以上の結果は、 メナテトレノンによる肝癌細胞増殖抑制作用が転写因子 NF- κ Bおよびそのターゲット遺伝子の一つであるサイクリン D1の抑制を通じて発現 されるものであることを示している。 実施例 5 肝癌細胞増殖に対するメナテトレノンと 5-PTJとの相互作用  The above results indicate that the action of menatetrenone to suppress hepatoma cell proliferation is expressed through suppression of the transcription factor NF-κB and cyclin D1, one of its target genes. Example 5 Interaction between Menatetrenone and 5-PTJ on Hepatoma Cell Proliferation
上記のように、 メナテトレノンの肝癌細胞増殖抑制作用が、 NF- κ B の抑制を 介して起こっていることが示された。 臨床的に肝細胞癌にもよく使用されている 抗腫瘍剤である 5-FUは、 NF- κ Βを活性化することが知られている。 そこで、 肝癌細胞 HLEA Hep3B, Huh7にメナテトレノンを 24時間作用させた後、さらに、 前記肝癌細胞にアポトーシスを起こさない低濃度の 5-FU (5 μ g/ml) を 24時間 作用させ、 細胞増殖に与える影響を検討した。 細胞増殖は、 BrdU (5-ブロモ -2，- デォキシゥリジン） 存在下で細胞を培養したときの、 BrdUの取り込み率で評価 した。 As described above, it was shown that the action of menatetrenone to suppress the growth of liver cancer cells occurs through the suppression of NF-κB. It is known that 5-FU, an antitumor agent often used clinically for hepatocellular carcinoma, activates NF-κΒ. Then, after hepatoma cells were allowed to act for 24 hours with menatetrenone on HLE A Hep3B and Huh7, a further low-concentration 5-FU (5 μg / ml) that did not cause apoptosis on the hepatoma cells was allowed to act for 24 hours, and cell proliferation was carried out. The effect on the was examined. Cell proliferation was evaluated by the BrdU incorporation rate when the cells were cultured in the presence of BrdU (5-bromo-2, -deoxyperidine).
その結果、 5-FUを 5 ； u g/mlの濃度で肝癌細胞に作用させると、 5-FUは、 肝 癌細胞における DNA合成を 50-60。/。程度抑制するが、 この濃度ではアポトーシ スは観察されなかった。 これにメナテトレノンを作用させると濃度依存的に肝癌 細胞の DNA合成が抑制され、 その抑制の程度は、 メナテトレノン単独よりも強 く認められた （図 8 )。 . 実施例 6 5-FUによる NF- κ Bの活性化とメナテトレノンによる NF- κ B活 性ィ匕の抑制機序の検討  As a result, when 5-FU was allowed to act on liver cancer cells at a concentration of 5; ug / ml, 5-FU reduced DNA synthesis in liver cancer cells by 50-60. /. At this concentration, apoptosis was not observed. When menatetrenone acted on this, DNA synthesis of liver cancer cells was inhibited in a concentration-dependent manner, and the degree of the suppression was more strongly observed than with menatetrenone alone (Fig. 8). Example 6 5-FU Activation of NF-κB and Inhibitory Mechanism of NF-κB Activity by Menatetrenone
NF- κ Β活性ィ匕の抑制機序を検討するため、 通常、 細胞質中で と結合 し NF- κ Bの活性化および核への移行を調節する I κ Bの動態を検討した。 I κ Β のリン酸化、 Ι κ Βタンパク質の発現量、 p65サブュニットの核への移行をウェス タンプロット法にて解析した。  To investigate the mechanism of inhibition of NF-κΒ activation, the dynamics of IκB, which normally binds to in the cytoplasm and regulates NF-κB activation and translocation to the nucleus, were examined. Phosphorylation of IκΒ, expression of ΙκΒ protein, and translocation of p65 subunit to the nucleus were analyzed by Western blotting.
その結果、 5-FU (5 μ g/ml) を肝癌細胞 HepG2に作用させると Ι κ Βリン酸 化が増加し、 ΙκΒタンパク質量は減少し、 核での p65の増加が観察された （図 9
Figure imgf000029_0001
のレーン）。 これにメナテトレノンを加えると濃度依存的に I /cBリン酸化が抑制され、 逆に I/cBのタンパク質量は回復し、 核への p65は再 ぴ減少した （図 9 「5FU5^ig/ral + VK2」 の各レーン）。 As a result, when 5-FU (5 μg / ml) was allowed to act on HepG2 hepatoma cells, Increased nuclear activity, decreased 量 κΒ protein levels and increased nuclear p65 (Fig. 9
Figure imgf000029_0001
Lane). When menatetrenone was added to this, the phosphorylation of I / cB was suppressed in a concentration-dependent manner, whereas the amount of I / cB protein was restored, and p65 to the nucleus was reduced again (Fig. 9 “5FU5 ^ ig / ral + VK2 ”lanes).
以上の結果から、 メナテトレノンは、 ΙκΒ リン酸化を抑制することにより、 Based on the above results, menatetrenone inhibited ΙκΒ phosphorylation,
NF- κ Β活性化を抑制していることが明らかになった。 実施例 7 TPA、 TNF- α、 IL-1 刺激下における NF- K B活性化に対するメナ テトレノンの効果の検討 It was found that NF-κΒ activation was suppressed. Example 7 TPA, TNF- α, study of the effect of Mena Tetorenon against NF-? K B activation under IL-1 stimulation
発癌プロモーターと して知られる TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate)により誘導される NF- /c B活性化に対するメナテトレノンの影響、 お ょぴ生理的な条件下で NF- κΒを活性化する炎症性サイトカインである TNF- や IL-l 3により誘導される NF-/cB活性化に対するメナテトレノンの影響をルシ フェラーゼレポーターァッセィおよびゲルシフトァッセィ法で検討した。  Influence of menatetrenone on NF- / cB activation induced by TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate), known as a tumor promoter, activates NF-κΒ under physiological conditions The effects of menatetrenone on NF- / cB activation induced by the proinflammatory cytokines TNF- and IL-l3 were examined by luciferase reporter assay and gel shift assay.
プロモーター領域に NF- κΒに対するコンセンサス配列を持つルシフェラーゼ プラスミ ドをレポーター遺伝子として トランスフエクショ ンした肝癌細胞 HepG2を用いて、 非刺激下および TPA、 TNF- a IL_1 刺激下において、 メナ テトレノンを 0、 10·6、 10·5、 10·4Μの各濃度でカ卩え、 常法にしたがいルシフェラ ーゼレポーターアツセィを行い、 NF-/cB活性を測定した。 また、 常法にしたが いゲルシフトアツセィ法により HepG2細胞を用いて非刺激下および TPA、TNF- α、 IL-lj3刺激下において、 NF-/cB の DNA結合活性に与えるメナテトレノン の効果を検討した。 Using non-stimulated and stimulated TPA and TNF-aIL_1, menatetrenone was reduced to 0, 10 using liver cancer cell HepG2 transfected with luciferase plasmid having a consensus sequence for NF-κΒ in the promoter region as a reporter gene. · 6, 10 · 5, 10 · 4 Ka卩E at each concentration of Micromax, performed luciferase reporter mediation Si in a conventional manner, was measured NF-? / cB activity. In addition, the effect of menatetrenone on the DNA binding activity of NF- / cB was examined using HepG2 cells without stimulation and under stimulation with TPA, TNF-α, and IL-lj3 by the gel shift assay using the usual method. did.
HepG2細胞に対してメナテトレノンを添加して NF-zcBの活性をルシフェラ ーゼレポーターアツセィにて測定すると、 メナテトレノンは、 濃度依存性に NF- κΒ活性を抑制した （図 1 0 )。 さらに、 ΤΡΑ20 nM、 TNF- a 10 nM、 IL-1 β 1 nMを加えて NF- κ Bを活性化させた状態でメナテトレノンを 0、 10·6、 10·5、 10·4 Mの各濃度で加えたところ、いずれの場合においても誘導された NF- /cB活性を 濃度依存性に抑制した （図 1 0)。 同様の条件下で、 HepG2細胞でゲルシフトアツセィを行い、 NF-zcBの DNA 結合活性を検討したところ、 非刺激下では NF-zcBの弱い DNA結合活性を、 メ ナテトレノンは濃度依存的に抑制した。 TPA、 TNF- a , IL_1 j3による刺激下では 誘導された NF- の DNA結合活性は、 いずれの場合においてもメナテトレノ ンにより濃度依存性に抑制された （図 11)。 実施例 8 TPA、 TNF- a、 IL-1 β刺激下における I κ Βリン酸化に対するメナ テトレノンの効果の検討 When menatetrenone was added to HepG2 cells and the activity of NF-zcB was measured using a luciferase reporter assay, menatetrenone inhibited NF-κΒ activity in a concentration-dependent manner (FIG. 10). Furthermore, ΤΡΑ20 nM, respective concentrations of TNF- a 10 nM, IL-1 β 1 nM was added to NF-? Kappa 0 menatetrenone the B in the state of being activated, 10 · 6, 10 · 5 , 10 · 4 M In all cases, the induced NF- / cB activity was suppressed in a concentration-dependent manner (FIG. 10). Under the same conditions, gel shift assay was performed on HepG2 cells, and the DNA binding activity of NF-zcB was examined.Un-stimulated, menatetrenone inhibited the weak DNA binding activity of NF-zcB in a concentration-dependent manner. . Under the stimulation with TPA, TNF-a, and IL_1j3, the induced DNA binding activity of NF- was suppressed by menatetrenone in any case in a concentration-dependent manner (Fig. 11). Example 8 Investigation of the effect of menatetrenone on IκΒ phosphorylation under stimulation of TPA, TNF-a and IL-1β
非刺激下および TPA、 TNF- α、 IL-li3刺激下における I κ Bリン酸化および I κΒタンパク質量に対するメナテトレノンの効果について、抗リン酸化 Ικ 抗 体おょぴ抗 ΙκΒα抗体を用いてウェスタンブロット法により検討した。 また、 I K B αのリン酸化を調節しているキナーゼである ΙΚΚ複合体の活性へ与える影響 を in vitro キナーゼァッセィで検討した。  Western blot analysis of the effects of menatetrenone on IκB phosphorylation and IκΒ protein levels under unstimulated and TPA, TNF-α, and IL-li3 stimulation using anti-phosphorylated Ικ antibody and anti-ΙκΒα antibody It was examined by. The effect of 影響 complex, a kinase that regulates phosphorylation of IKBα, on the activity was examined in an in vitro kinase assay.
非刺激下おょぴ TPA、 TNF- a , IL-1 )3刺激下で回収した細胞の破碎液を、 IKK 複合体のサブユニットのひとつである ΙΚΚαに対する抗体を用いて免疫沈降を 行い遠心した。 得られた上清を protein Gセファロースカラムにかけ、 IKK複合 体タンパク質を溶出して回収した。 in vitroキナーゼアツセィの基質となる I/cB αは、 GST-I/cBひ（1-54)融合タンパク質をコードするプラスミド pGST-ΙκΒα; (1-54)を強制発現させ生成したタンパク質を GSTカラムにかけて回収調製した。 キナーゼ活性によるリン酸ィ匕反応は、基質である GST-IK Bo; (1-54)の存在する溶 液中に γ -32Ρ-ΑΤΡを加え、 一定量の ΙΚΚ複合体と 37°Cで 30分間反応させ、 反 応産物を SDS-PAGEゲルにて電気泳動後、 オートラジオグラフィ一により ΙκΒ αのリン酸化を検出した。 (Unstimulated TPA, TNF-a, IL-1) The lysate of the cells collected under stimulation (3) was subjected to immunoprecipitation using an antibody against ΙΚΚα, one of the subunits of the IKK complex, and centrifuged. . The obtained supernatant was applied to a protein G Sepharose column, and the IKK complex protein was eluted and recovered. The i n vitro kinase mediation Si substrate and becomes I / cB alpha of, GST-I / cB Monument (1-54) plasmid pGST-ΙκΒα encoding a fusion protein; a protein produced forced to express (1-54) It was collected and prepared by applying to a GST column. The phosphorylation reaction by the kinase activity is performed by adding γ-32ΑΤΡ-ΑΤΡ to a solution containing the substrate GST-IK Bo; (1-54) and adding a certain amount of ΙΚΚ complex to the solution at 37 ° C. minutes reacted, after electrophoresis anti応産product in SDS-PAGE gels and detected phosphorylation of Iotakappabeta alpha by autoradiography scratch.
その結果、 非刺激下においてメナテトレノンを添加すると ΙκΒαリン酸化 (図 12 「ρΙκΒα」 ）は減少を示し、 ΙκΒひタンパク質量 （図 1 2 「ΙκΒα」） は逆 に増加を示した （図 1 2 )。 ΤΡΑ 20 nM, TNF- a 10 nM, IL-1 i3 1 nMを添加す ると I κΒαリン酸化は増加し、 ΙκΒαタンパク質量は逆に減少した。 これにメ ナテトレノンを添カ卩しておくと TPA、 TNF- a、 IL-1 ]3による ΙκΒαリン酸化の 増加は、 メナテトレノンの濃度依存性に抑制され、 ΙκΒ aタンパク質量の減少は 抑制されタンパク質量が回復した （図 12)。 As a result, when menatetrenone was added without stimulation, ΙκΒα phosphorylation (Fig. 12 “ρΙκΒα”) decreased and ΙκΒ protein content (Fig. 12 “ΙκΒα”) increased conversely (Fig. 12). . Addition of 20 nM, 10 nM of TNF-a, and 1 nM of IL-1 i31 increased IκΒα phosphorylation and conversely decreased the amount of ΙκΒα protein. When menatetrenone is added to this, phosphorylation of ΙκΒα by TPA, TNF-a, IL-1] 3 The increase was suppressed in a menatetrenone-concentration-dependent manner, and the decrease in the amount of Ικ 抑制 a protein was suppressed, and the amount of protein recovered (Fig. 12).
これに対応して in vitro キナーゼアツセィにより IKK複合体のキナーゼ活性 を測定すると、非刺激下ではキナーゼ活性（図 13 「GST-IKBa」） を抑制した。 TPA20nM, TNF- a 10 nM, IL"li3 1 nMの存在下ではキナーゼ活性は増加する 力 これにメナテトレノンを添加しておくとメナテトレノンの濃度依存性にキナ ーゼ活性は抑制された （図 13)。 メナテトレノンによる抑制の程度は TNF-a, IL-li3添加例においてより顕著に見られた （図 13)。 以上の結果から、 メナテトレノンは、 種々の肝癌細胞において非刺激下および 種々の NF- /c B刺激シグナルの存在下で濃度依存性に NF- κ Bの活性下を抑制す る作用を有することが明らかとなった。 この NF- / B活性化抑制作用の機序とし て、 メナテトレノンは、 NF-κΒ (p50/p65二量体） の核への移行を抑制し細胞質 に停めている Ικ Baのリン酸ィ匕を抑制しており、 ΙκΒαをリン酸化する ΙΚΚ複 合体のキナーゼ活性を抑制することによりその作用を発揮していることが示され た。 産業上の利用の可能性 When measuring the kinase activity of the IKK complex by in vitro kinase mediation Si Correspondingly, under unstimulated inhibited kinase activity (Fig. 13, "GST-I K B a"). Kinase activity increases in the presence of TPA20 nM, TNF-a 10 nM, IL "li31 nM Force of addition of menatetrenone suppresses kinase activity in a menatetrenone concentration-dependent manner (Fig. 13). The degree of suppression by menatetrenone was more remarkable in the TNF-a and IL-li3 addition cases (Fig. 13) From the above results, menatetrenone was not stimulated in various liver cancer cells and in various NF- / In the presence of the c B stimulus signal, it was found to have a concentration-dependent inhibitory effect on the activity of NF-κB. As a mechanism of the inhibitory effect on NF- / B activation, menatetrenone is NF-κΒ (p50 / p65 dimer) suppresses the translocation to the nucleus and suppresses the phosphorylation of BaκBa, which is stagnated in the cytoplasm, and phosphorylates ΙκΒα. It shows that the effect is exhibited by suppressing It was. Industrial Applicability
本発明により、 癌細胞、 好ましくは肝癌細胞において、 ビタミン Κ2を用いる と、 サイクリン D1の発現を阻害すること、 NF-κΒを阻害すること、 ΙκΒリン 酸ィ匕を阻害することが可能となった。 また、 これらの阻害作用により癌細胞、 好 ましくは肝癌細胞の增殖を抑制するため、 より治療効果の期待できる患者を選択 して治療することが可能となった。  According to the present invention, it has become possible to inhibit the expression of cyclin D1, inhibit NF-κΒ, and inhibit ΙκΒ phosphoric acid in cancer cells, preferably in liver cancer cells, by using vitamin Κ2. . In addition, since these inhibitory effects suppress the growth of cancer cells, preferably liver cancer cells, it has become possible to select and treat patients who can expect a more therapeutic effect.
また、 本発明により、 癌患者に対するビタミン Κ2 (例えばメナテトレノン） の治療剤としての有効性に加え、 メナテトレノンと抗腫瘍物質とを組み合わせて 使用することによりメナテトレノンの抗腫瘍作用が増強されることから、 癌患者 の生活の質を大きく改善することが可能となった。  Further, according to the present invention, in addition to the efficacy of vitamin Κ2 (for example, menatetrenone) as a therapeutic agent for cancer patients, the antitumor effect of menatetrenone is enhanced by using menatetrenone in combination with an antitumor substance. It has made it possible to greatly improve the quality of life of cancer patients.
さらには、 本発明により、 ビタミン Κ2が NF- κ Β活性化および I Κ Βリン酸 化を阻害すること力 ら、 ビタミン K 2は、抗炎症剤、抗リゥマチ剤、免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、移植拒絶抑制剤、乾癬治療剤、抗ウィルス剤、動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤および腎不全治療剤の有効成分として用 いることが可能となった。 Furthermore, according to the present invention, vitamin Κ2 activates NF-κΒ and IΚ Vitamin K2 is an anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, antiallergic, transplant rejection inhibitor, psoriasis treatment, antiviral, arteriosclerosis treatment, ischemic It can be used as an active ingredient in therapeutic agents for perfusion injury, diabetes and renal failure.

Claims

請求 の 範 囲 The scope of the claims
I . ビタミン K 2又はその水和物を有効成分として含む、 NF- κ Β活性化阻害 剤。 I. An NF-κΒ activation inhibitor comprising vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
2. ビタミン Κ2又はその水和物を有効成分として含む、 ΙκΒリン酸ィヒ阻害剤, 2. ΙκΒ phosphate inhibitor containing vitamin Κ2 or its hydrate as an active ingredient,
3. ビタミン Κ2又はその水和物を有効成分として含む、 抗炎症剤、 抗リウマ チ剤、 免疫抑制剤、 抗アレルギー剤、 移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗ゥ ィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤、 及 ぴ腎不全治療剤からなる群から選ばれる 1以上の剤。 3. Anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic, transplant rejection inhibitor, anti-psoriatic, anti-viral, anti-atherosclerotic agent containing vitamin II or its hydrate as an active ingredient At least one agent selected from the group consisting of a therapeutic agent for ischemic reperfusion injury, a therapeutic agent for diabetes, and a therapeutic agent for renal failure.
4. ビタミン Κ2又はその水和物が NF-κΒの活性ィ匕及び/又は ΙκΒのリン 酸化を阻害することを特徴とする、 請求項 3記載の剤。 4. The agent according to claim 3, wherein vitamin 2 or a hydrate thereof inhibits NF-κΒ activation and / or {κ 又 は phosphorylation.
5. ビタミン K2又はその水和物を有効成分として含む、 サイクリン D1発現 阻害剤。 5. A cyclin D1 expression inhibitor containing vitamin K2 or a hydrate thereof as an active ingredient.
6. ビタミン K2がメナテトレノンである、 請求項 1〜 5のいずれか 1項記載 の剤。  6. The agent according to any one of claims 1 to 5, wherein the vitamin K2 is menatetrenone.
7. ビタミン K2又はその水和物を生体に投与することを特徴とする NF- KB 活性化阻害方法。  7. A method for inhibiting NF-KB activation, which comprises administering vitamin K2 or a hydrate thereof to a living body.
8. ビタミン K2又はその水和物を生体に投与することを特徴とする ΙκΒ リ ン酸化阻害方法。  8. A method for inhibiting ΙκΒ phosphorylation, which comprises administering vitamin K2 or a hydrate thereof to a living body.
9. ビタミン Κ2又はその水和物を有効成分として含む剤を患者に有効量投与 することを特徴とする、 炎症、 リウマチ、 免疫抑制、 アレルギー、 移植拒 絶反応、 乾癬、 ウィルス性疾患、 動脈硬化、 虚血性再灌流障害、 糖尿病、 及び腎不全からなる群から選ばれる 1以上の疾患の治療方法。 9. Inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral disease, arteriosclerosis characterized by administering an effective amount of an agent containing vitamin Κ2 or its hydrate as an active ingredient to a patient. A method for treating one or more diseases selected from the group consisting of ischemic reperfusion injury, diabetes, and renal failure.
10. 請求項 4記載の剤を、患者に有効量投与することを特徴とする、炎症、 リ ゥマチ、 免疫抑制、 アレルギー、 移植拒絶反応、 乾癬、 ウィルス性疾患、 動脈硬化、 虚血性再灌流障害、 糖尿病、 及び腎不全からなる群から選ばれ る 1以上の疾患の治療方法。 10. An inflammation, rheumatism, immunosuppression, allergy, transplant rejection, psoriasis, viral disease, atherosclerosis, ischemic reperfusion injury characterized by administering an effective amount of the agent according to claim 4 to a patient. A method for treating one or more diseases selected from the group consisting of diabetes, diabetes, and renal failure.
I I. ビタミン Κ2又はその水和物を生体投与することを特徴とするサイクリ ン Dl発現阻害方法。 I I. A cycle characterized in that vitamin Κ2 or a hydrate thereof is administered to a living body. Dl expression inhibition method.
12. ビタミン K2がメナテトレノンである、 請求項 7~11のいずれか 1項 に記載の方法。  12. The method according to any one of claims 7 to 11, wherein the vitamin K2 is menatetrenone.
13. NF-/cB活性化阻害剤を製造するためのビタミン K2又はその水和物の 使用。  13. Use of vitamin K2 or a hydrate thereof for producing an NF- / cB activation inhibitor.
14. ΙκΒリン酸ィヒ阻害剤を製造するためのビタミン Κ2又はその水和物の使 用。  14. Use of Vitamin II or its hydrates for the manufacture of ΙκΒ phosphoric acid inhibitors.
15. 抗炎症剤、抗リゥマチ剤、免疫抑制剤、抗ァレルギ一剤、移植拒絶抑制剤、 乾癬治療剤、 抗ウィルス剤、 動脈硬化治療剤、 虚血性再灌流障害治療剤、 糖尿病治療剤、 および腎不全治療剤からなる群から選ばれる 1以上を製造 するための、 ビタミン Κ2又はその水和物の使用。  15. Anti-inflammatory, anti-rheumatic, immunosuppressant, anti-allergic agent, transplant rejection inhibitor, psoriasis treatment, antiviral, atherosclerosis treatment, ischemic reperfusion disorder treatment, diabetes treatment, and Use of vitamin 2 or a hydrate thereof for producing one or more selected from the group consisting of therapeutic agents for renal failure.
16. 請求項 4記載の剤を製造するための、 ビタミン Κ2又はその水和物の使 用。  16. Use of vitamin II or a hydrate thereof for producing the agent according to claim 4.
17. サイクリン D1発現阻害剤を製造するためのビタミン Κ 2又はその水和物 の使用。  17. Use of vitamin 2 or a hydrate thereof for producing a cyclin D1 expression inhibitor.
18. ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 請求項 13〜17のいずれか 1 項記載の使用。  18. The use according to any one of claims 13 to 17, wherein vitamin 2 is menatetrenone.
19. ビタミン Κ2又はその水和物と、 抗腫瘍物質とを組み合わせてなる肝癌 治療剤。  19. A therapeutic agent for liver cancer, comprising a combination of vitamin II or a hydrate thereof and an antitumor substance.
20. ビタミン Κ2又はその水和物と、 5-FUとを組み合わせてなる肝癌治療剤。  20. A therapeutic agent for liver cancer, which comprises a combination of vitamin Κ2 or a hydrate thereof and 5-FU.
21. ビタミン Κ2がメナテトレノンである、 請求項 19または 20記載の肝 癌治療剤。 21. The therapeutic agent for liver cancer according to claim 19 or 20, wherein the vitamin II is menatetrenone.
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