WO2005103654A2 - Method for identification of compounds active in hiv virus replication - Google Patents
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Definitions
- This effect is considered to be a functional activity of VPR potentially involved in the cytoplasm-nucleus translocation process of the complex of pre-integration of HIV-1 into quiescent cells infected with the virus.
- the research carried out within the framework of the invention also made it possible to characterize the process of activation of actin polymerization by VPR by identifying the peptide domains of VPR responsible for this effect.
- Research carried out within the framework of the invention has in particular demonstrated that the 55-75 sub-domain of the alpha 3 helix of the VPR protein, vectorized in malignant cells induces a reappearance of actin filaments and a restoration of intercellular interactions, which corresponds to a reversal of the tumor phenotype.
- the sequence of fragment 55-75 is given in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO.6. Consequently, the agents inhibiting the specific mechanism of actin polymerization induced by VPR can be considered as inhibitors of the function of VPR potentially having an inhibitory effect on the replicative cycle of HIV-1 acting on the cytoplasm-nucleus translocation. of the PIC.
- the subject of the present invention is therefore a fragment or a derivative of VPR, characterized in that it is capable of inducing a strong increase in the kinetics of polymerization of cellular actin and in that it comprises the sequence of the fragment 55 -75 of VPR.
- VPR fragment is meant a polypeptide which has a length less than that of the native VPR protein.
- the present invention also relates to a method of identifying compounds capable of acting on the replication of an HIV type virus, characterized in that the polymerization of actin induced by the VPR protein, an fragment or a derivative thereof on a cell or a cell extract comprising actin, in the presence of said compound.
- cell extracts comprising actin which can be used in the method of the invention
- the protein concentration of said cell extract in the reaction medium is between 10 ⁇ g / ml and 10 mg / ml, preferably between 0.1 mg / ml and 1 mg / ml.
- fragment or derivative of VPR means a fragment or derivative of VPR as described above.
- the concentrations of the compound to be tested are between 10 ⁇ M and 100 ⁇ M in the reaction medium, preferably between 100 ⁇ M and 10 ⁇ M and more particularly between 1 nM and 5 ⁇ M.
- the method of the invention comprises the analysis of the polymerization of actin in the presence and in the absence of VPR. The method of the invention then comprises the additional steps of: (iii) bringing into contact, in a reaction medium, a cell or a cell extract comprising actin, preferably a cell extract comprising actin, with the compound to be tested; and (iv) analysis of the actin polymerization in the reaction medium following step (iii).
- the start of the actin polymerization is obtained by the introduction into the medium reaction of a buffer containing ATP and MgCl 2 .
- the method of the invention then comprises the introduction into the reaction medium of ATP and MgCl 2 in step (i) and optionally in step (iii).
- concentrations of ATP and MgCl 2 can be added to the reaction medium to obtain the start of the actin polymerization. For example, a concentration of 500 ⁇ M ATP and 1 mM MgCl 2 can be used in the reaction medium.
- the present invention also relates to a kit for implementing the method described above.
- a kit for implementing the method described above.
- Such a kit includes:
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Abstract
Description
METHODE D'IDENTIFICATION DE COMPOSÉS ACTIFS SUR LA RÉPLICATION DU VIRUS HIV. METHOD FOR IDENTIFYING COMPOUNDS ACTIVE IN THE REPLICATION OF HIV VIRUS.
La présente invention concerne le domaine du criblage de composés pour leur activité sur la réplication d'un virus du type VIH. Le VIH est un rétrovirus de la famille des lentivirus. Le génome viral du VIH est composé d'un ARN de 9Kb codant pour les trois protéines essentielles précurseurs communes à tous les rétrovirus (GAG, POL et ENV) et pour de nombreuses protéines régulatrices, spécifiques du VIH (Figure 1). Le VIH est le plus complexe des rétrovirus et au total le génome viral code pour 13 protéines dont 8 essentielles et 5 de régulation. L'ARN viral messager est épissé pour donner un ARN de 4Kb et un ARN de 2Kb. L'ARN de 4Kb servira de matrice pour synthétiser la Gpl20, la Gp41 et trois protéines de régulation (VIF, VPR et VPU). L'ARN de 2Kb est à l'origine de trois autres protéines régulatrices (TAT, REV et NEF). Les protéines virales essentielles sont les suivantes: - Membrane (ENV) : Gpl20 et Gp41 ; - Protéines de structure (GAG) : Matrice pl7, Capside p24 et Nucléocapside Ncp7 ; - Enzymes virales (POL) : RT p66, Intégrase INT p32 et Protéase p9. Les protéines de régulation sont les suivantes: TAT, REV, VPU, NEF, VPR et VIF. Les lentivirus se différencient des autres rétrovirus par leur capacité à infecter des cellules non multipliantes (monocytes, macrophages). Cette capacité infective nécessite entre autre que le matériel viral compétent pour assurer le processus d'intégration (complexe de préintégration) puisse franchir la membrane nucléaire. Cette aptitude à la translocation cytoplasme-noyau est due aux propriétés de certaines protéines virales, notamment de VPR qui semble jouer un rôle clé dans ce processus. VPR est une protéine basique de 14 kDa et de 96 amino acides qui confère un avantage réplicatif significatif aux virus qui l'expriment. Cet effet, négligeable dans les cellules en voie de multiplication active, devient important dans les monocytes et macrophages en phase GO. Ainsi, les virions exprimant VPR présentent un cycle réplicatif plus rapide et la production de particules est elle-même légèrement augmentée. Cette augmentation de production est nettement prononcée pour HIV-1 et HIV-2 dans les macrophages. Parmi toutes les protéines accessoires, VPR est la seule qui soit incorporée dans le virion, probablement par une interaction avec le précurseur GAG p55 via son domaine C-terminal et la protéine p6 (Lu et al., 1995). L'association de VPR avec le virion indique clairement son niveau d'intervention dans les étapes précoces du cycle viral. On envisage que VPR pourrait agir au niveau des étapes de transcription inverse, de translocation ou d'intégration en stabilisant les structures de type ADN-ARN ou ADN-ADN. Un effet de VPR au niveau de l'étape de préintégration a été suggéré en 1 ' identifiant comme composant participant avec la protéine de matrice Gag pl7 et l'intégrase (IN) au transport vers le noyau du complexe de préintégration (PIC) dans les macrophages à l'état stationnaire (Heinzinger et al., 1994). Comme indiqué sur la figure 2, VPR semble faire partie intégrante du complexe de translocation composé des protéines du PIC, dont certaines présentent un NLS classique, de l'alpha importine et de nucléporines. Ce complexe semble être compétent pour la translocation cytoplasme-noyau via le pore nucléaire. Par ailleurs, un nouveau concept permettant d'expliquer 1 ' entrée du PIC dans le noyau a été proposé par Segura-Totten et Noronha (Segura-Totten et Wilson, 2001; Noronha et al, 2001). Le modèle suggère que VPR, détachée du CPI, entre dans le noyau par les pores nucléaires et désorganise la structure filamenteuse de la lamina présente sous l'enveloppe nucléaire. Cet événement induirait la décondensation de la chromatine et la rupture momentanée de l'enveloppe nucléaire permettant ainsi au PIC de pénétrer dans le noyau. Il est remarquable de constater que dans les cellules infectées, VPR a une localisation essentiellement nucléaire. VPR semble interagir spécifiquement avec une protéine cellulaire et est transportée vers le noyau selon un mécanisme différent de celui observé en présence d'un signal de localisation classique. VPR pourrait enfin agir également en transactivant modérément le LTR et augmenter ainsi le niveau de l'expression des gènes viraux. Cette transactivation serait suffisante pour promouvoir l'activité du LTR immédiatement après 1 ' intégration et avant la synthèse de la protéine TAT (Hrimech et al., 1999; Sa aya et al., 2000; Vanitharani et al., 2001). L'interaction de VPR avec certains facteurs de transcription comme TFIIB et SPl serait à la base de ce mécanisme (Agostini et al., 1999 et Wang et al., 1995). VPR semble par ailleurs interférer avec les processus de multiplication cellulaire. Cette découverte découle de l'observation selon laquelle, des cellules de rhabdomyosarcorne (TE671 et RD) et d' ostéosarcome (D17) infectées par le VIH entraient dans un processus de différenciation accompagné d'un blocage de la multiplication (Levy et al, 1993). Il a aussi été montré que cette protéine indépendamment de tout contexte viral bloque le cycle cellulaire en G2. Une des hypothèses émises à ce jour est que VPR, en s 'associant à la Ser/Thr- protéine phosphatase PP2A, qui elle-même intervient dans la régulation de la PKC, pourrait bloquer le cycle cellulaire. À noter incidemment que PP2A est la cible de l'acide okadaïque, une toxine produit par le dinoflagellé Prorocentrum lima . En fait l'action de VPR tant sur le plan de son implication dans 1 ' infectivité du VIH que sur celui de la perturbation du cycle cellulaire reste énigmatique. Toutefois, il est important de remarquer que : - VPR semble jouer un rôle prépondérant dans l'infection par le VIH des cellules quiescentes, ce qui est cohérent avec son action présumée de facilitation de la translocation du complexe de préintégration du cytoplasme vers le noyau. De ce point de vue, la perturbation de cette activité fonctionnelle représente une approche thérapeutique possible. - Introduit dans une cellule, en dehors de tout contexte viral, VPR induit clairement le blocage du cycle cellulaire. Sur le plan théorique, cela peut être mis à profit dans un objectif d'action antiproliférative en cancérologie. Il a maintenant été observé que des cellules infectées par le VIH montrent d'une manière constante des modifications structurales du réseau d'actine, notamment au niveau périnucléaire. Ces modifications sont caractérisées par la formation d ' invaginations d ' actine au niveau de la membrane nucléaire dont l'apparence est celle de filopodes. La croissance des filopodes intervenant habituellement au niveau des membranes cellulaires est le résultat d'un processus de polymérisation de l'actine G (forme monomérique) qui donne naissance à de long filament d'actine F (polymère). La polymérisation de l'actine est sous le contrôle d'un certain nombre de protéines cellulaires dont certaines sont capables d'induire sa polymérisation. C'est notamment le cas de la protéine WASP qui interagit et est activée par CDC42-GTP, et peut ensuite stimuler la polymérisation des filaments d'actine en activant le complexe nucléateur ARP2/3. C'est également le cas de la zyxine qui contribue à la structuration de l'ensemble du cytosquelette et intervient dans les processus de motilité. Shafer et al . (Mol . Cell . Biol . , vol.11, p :559A, 2000) décrit la fixation de VPR à l'actine F et la stabilisation consécutive des filaments d'actine in vitro. Matarrese et al . ( Cell Death and Differentiation, vol.7, p : 25-36, 2000) décrit la modification de la structure des filaments d'actine dans des cellules exprimant la protéine VPR et l'homologie entre VPR et la protéine de levure Sac-lp qui se lie potentiellement à l'actine. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont permis de montrer que la protéine VPR pourrait moduler la « dynamique » de polymérisation de l'actine. Cette modulation pourrait ainsi mieux expliquer les modifications structurales observées dans les réseaux d'actine périnucléaire et éventuellement la perturbation du cycle cellulaire. Les inventeurs ont ainsi montré, en présence de VPR, une très forte augmentation de la constante de vitesse de polymérisation ainsi qu'une valeur très élevée de la concentration d'actine F à l'état stationnaire. Ces augmentations sont bien supérieures à celles obtenues en présence de phalloïdine à des concentrations saturantes. Ces résultats suggèrent un mécanisme d'action de VPR sur la polymérisation de l'actine différent notamment de celui de la phalloïdine qui stabilise l'actine F en se fixant à celle-ci, et implique vraisemblablement également l'inhibition de l'activité de certaines protéines impliquées dans la dépolymérisation de l'actine. Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que l'augmentation de la polymérisation de l'actine en présence de VPR pourrait résulter de la fixation de VPR à PP2A. En effet, cette phosphatase se trouve être un modulateur de la LIM kinase qui elle-même intervient dans l'inhibition de la cofiline, laquelle est impliquée dans la déstructuration de l'actine F. Ainsi, l'inhibition de la phosphatase par VPR induirait l'activation de la LIM kinase, induisant elle-même l'inhibition de la cofiline. L'inhibition de PP2A par VPR serait donc responsable d'une diminution de la vitesse de dépolymérisation de l'actine et expliquerait la très forte augmentation de la constante de vitesse de polymérisation ainsi que la valeur très élevée de la concentration d'actine F à l'état stationnaire au regard de la phalloïdine. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de la présente invention ont donc permis de mettre en évidence que VPR exerce in vitro une forte augmentation de la cinétique de polymérisation de 1 ' actine cellulaire présente dans des extraits de fibroblastes. Cet effet est considéré comme une activité fonctionnelle de VPR potentiellement impliquée dans le processus de translocation cytoplasme-noyau du complexe de préintégration du VIH-1 dans les cellules quiescentes infectées par le virus. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de l'invention ont également permis de caractériser le processus d'activation de la polymérisation de l'actine par VPR en identifiant les domaines peptidiques de VPR responsables de cet effet. Les travaux de recherche réalisés dans le cadre de 1 ' invention ont tout particulièrement mis en évidence que le sous-domaine 55-75 de l'hélice alpha 3 de la protéine VPR, vectorisé dans des cellules malignes induit une réapparition des filaments d'actine et une restauration des interactions intercellulaires, ce qui correspond à une réversion du phénotype tumoral. La séquence du fragment 55-75 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.6. En conséquence, les agents inhibiteurs du mécanisme spécifique de polymérisation de l'actine induit par VPR peuvent être considérés comme des inhibiteurs de la fonction de VPR ayant potentiellement un effet inhibiteur du cycle réplicatif du VIH-1 agissant au niveau de la translocation cytoplasme- noyau du PIC. La présente invention a donc pour objet un fragment ou un dérivé de VPR caractérisé en ce qu'il est capable d'induire une forte augmentation de la cinétique de polymérisation de l'actine cellulaire et en ce qu'il comprend la séquence du fragment 55-75 de VPR. Par fragment de VPR, on entend un polypeptide qui présente une longueur inférieure à celle de la protéine VPR native. Avantageusement, le fragment polypeptidique selon l'invention a une longueur inférieure à 70 acides aminés, de préférence inférieure à 60 acides aminés et de manière particulièrement préférée inférieure à 50 acides aminés. À titre d'exemple de tels fragments polypeptidiques, on peut citer les fragments 52-96, 60-80 et 55-75 de VPR, de préférence le fragment 55-75. La séquence du fragment 52-96 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.4. La séquence du fragment 60-80 est donnée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEQ ID NO.5. On entend par dérivés de VPR, des protéines ou peptides dont la séquence est obtenue à partir celle de la protéine VPR ou de ses fragments, en supprimant, ajoutant ou modifiant un ou plusieurs acides aminés. Il peut aussi s'agir de modifications chimiques opérées à l'une ou l'autre des extrémités de la protéine ou du fragment ou au niveau de la chaîne latérale d'un ou plusieurs des acides aminés. À titre d'exemple de tels dérivés, on peut citer les formes cyclisées. La présente invention a également pour objet une méthode d'identification de composés capables d'agir sur la réplication d'un virus du type VIH, caractérisée en ce que l'on analyse la polymérisation de l'actine induite par la protéine VPR, un fragment ou un dérivé de celle-ci sur une cellule ou un extrait cellulaire comprenant de l'actine, en présence dudit composé. Les composés mis en évidence grâce à la méthode deThe present invention relates to the field of screening for compounds for their activity on the replication of a virus of the HIV type. HIV is a retrovirus of the lentivirus family. The HIV viral genome is composed of a 9Kb RNA coding for the three essential precursor proteins common to all retroviruses (GAG, POL and ENV) and for many regulatory proteins, specific to HIV (Figure 1). HIV is the most complex of retroviruses and in total the viral genome codes for 13 proteins, 8 of which are essential and 5 of which are regulatory. The messenger viral RNA is spliced to give a 4Kb RNA and a 2Kb RNA. 4Kb RNA will be used as a template to synthesize Gpl20, Gp41 and three regulatory proteins (VIF, VPR and VPU). 2Kb RNA is the source of three other regulatory proteins (TAT, REV and NEF). The essential viral proteins are the following: - Membrane (ENV): Gpl20 and Gp41; - Structural proteins (GAG): Matrix pl7, Capside p24 and Nucleocapsid Ncp7; - Viral enzymes (POL): RT p66, Integrase INT p32 and Protease p9. The regulatory proteins are: TAT, REV, VPU, NEF, VPR and VIF. Lentiviruses differ from other retroviruses by their ability to infect non-multiplying cells (monocytes, macrophages). This infectious capacity requires, among other things, that the viral material competent to ensure the integration process (pre-integration complex) can cross the nuclear membrane. This aptitude for cytoplasm-nucleus translocation is due to the properties of certain viral proteins, notably from VPR which seems to play a key role in this process. VPR is a basic protein of 14 kDa and 96 amino acids which gives a significant replicative advantage to the viruses which express it. This effect, negligible in cells in the process of active multiplication, becomes significant in monocytes and macrophages in the GO phase. Thus, virions expressing VPR exhibit a faster replicative cycle and the production of particles is itself slightly increased. This increase in production is clearly pronounced for HIV-1 and HIV-2 in macrophages. Among all the accessory proteins, VPR is the only one which is incorporated into the virion, probably by an interaction with the precursor GAG p55 via its C-terminal domain and the protein p6 (Lu et al., 1995). The association of VPR with the virion clearly indicates its level of intervention in the early stages of the viral cycle. It is envisaged that VPR could act at the stages of reverse transcription, translocation or integration by stabilizing structures of the DNA-RNA or DNA-DNA type. An effect of VPR at the level of the pre-integration step has been suggested by identifying it as a participating component with the matrix protein Gag pl7 and integrase (IN) in the transport to the nucleus of the pre-integration complex (PIC) in the stationary macrophages (Heinzinger et al., 1994). As shown in Figure 2, VPR appears to be an integral part of the translocation complex made up of PIC proteins, some of which have classical NLS, alpha importine and nucleporins. This complex seems to be competent for cytoplasm-nucleus translocation via the nuclear pore. Furthermore, a new concept explaining the entry of the PIC into the nucleus has been proposed by Segura-Totten and Noronha (Segura-Totten and Wilson, 2001; Noronha et al, 2001). The model suggests that VPR, detached from the CPI, enters the nucleus through the nuclear pores and disrupts the filamentary structure of the lamina present under the nuclear envelope. This event would induce the decondensation of the chromatin and the momentary rupture of the nuclear envelope thus allowing the PIC to penetrate into the nucleus. It is remarkable to note that in infected cells, VPR has an essentially nuclear localization. VPR appears to interact specifically with a cellular protein and is transported to the nucleus by a mechanism different from that observed in the presence of a conventional localization signal. Finally, VPR could also act by moderately transactivating the LTR and thereby increasing the level of expression of viral genes. This transactivation would be sufficient to promote the activity of the LTR immediately after integration and before the synthesis of the TAT protein (Hrimech et al., 1999; Sa aya et al., 2000; Vanitharani et al., 2001). The interaction of VPR with certain transcription factors such as TFIIB and SPl is the basis of this mechanism (Agostini et al., 1999 and Wang et al., 1995). VPR also appears to interfere with cell multiplication processes. This discovery stems from the observation that HIV-infected rhabdomyosarcorne (TE671 and RD) and osteosarcoma (D17) cells entered into a differentiation process accompanied by a blockage of multiplication (Levy et al, 1993 ). It has also been shown that this protein, independently of any viral context, blocks the cell cycle in G2. One of the hypotheses put forward to date is that VPR, by associating with Ser / Thr- protein phosphatase PP2A, which itself intervenes in the regulation of PKC, could block the cell cycle. Incidentally, note that PP2A is the target of okadaic acid, a toxin produced by the dinoflagellate Prorocentrum lima. In fact, the action of VPR both in terms of its involvement in HIV infectivity and in that of disturbing the cell cycle remains enigmatic. However, it is important to note that: - VPR seems to play a predominant role in HIV infection of quiescent cells, which is consistent with its presumed action of facilitating the translocation of pre-integration complex from the cytoplasm to the nucleus. From this point of view, the disruption of this functional activity represents a possible therapeutic approach. - Introduced into a cell, outside of any viral context, VPR clearly induces the blocking of the cell cycle. On a theoretical level, this can be used for the purpose of antiproliferative action in oncology. It has now been observed that cells infected with HIV constantly show structural changes in the actin network, particularly at the perinuclear level. These modifications are characterized by the formation of actin invaginations at the level of the nuclear membrane, the appearance of which is that of filopods. The growth of filopods usually occurring at the level of cell membranes is the result of a process of polymerization of actin G (monomeric form) which gives rise to long filament of actin F (polymer). Actin polymerization is under the control of a number of cellular proteins, some of which are capable of inducing its polymerization. This is particularly the case for the WASP protein which interacts and is activated by CDC42-GTP, and can then stimulate the polymerization of actin filaments by activating the ARP2 / 3 nucleator complex. This is also the case with zyxin, which contributes to the structuring of the entire cytoskeleton and intervenes in the motility processes. Shafer et al. (Mol. Cell. Biol., Vol.11, p: 559A, 2000) describes the binding of VPR to actin F and the subsequent stabilization of actin filaments in vitro. Matarrese et al. (Cell Death and Differentiation, vol.7, p: 25-36, 2000) describes the modification of the structure of actin filaments in cells expressing the VPR protein and the homology between VPR and the yeast protein Sac-lp which potentially binds to actin. Research carried out in the context of the present invention has made it possible to show that the VPR protein could modulate the “dynamics” of polymerization of actin. This modulation could thus better explain the structural modifications observed in the perinuclear actin networks and possibly the disturbance of the cell cycle. The inventors have thus shown, in the presence of VPR, a very strong increase in the polymerization rate constant as well as a very high value of the actin F concentration in the stationary state. These increases are much greater than those obtained in the presence of phalloidin at saturated concentrations. These results suggest a mechanism of action of VPR on the polymerization of actin, in particular that of phalloidin which stabilizes actin F by binding to it, and probably also involves the inhibition of the activity of certain proteins involved in the depolymerization of actin. The inventors have thus demonstrated that the increase in the polymerization of actin in the presence of VPR could result from the binding of VPR to PP2A. Indeed, this phosphatase is found to be a modulator of the LIM kinase which itself intervenes in the inhibition of cofilin, which is involved in the destructuring of actin F. Thus, the inhibition of phosphatase by VPR would induce the activation of LIM kinase, itself inducing the inhibition of cofilin. The inhibition of PP2A by VPR would therefore be responsible for a decrease in the rate of depolymerization of actin and would explain the very large increase in the polymerization rate constant as well as the very high value of the actin concentration F at steady state with regard to phalloidin. The research carried out in the context of the present invention has therefore made it possible to demonstrate that VPR exerts in vitro a strong increase in the kinetics of polymerization of the cellular actin present in fibroblast extracts. This effect is considered to be a functional activity of VPR potentially involved in the cytoplasm-nucleus translocation process of the complex of pre-integration of HIV-1 into quiescent cells infected with the virus. The research carried out within the framework of the invention also made it possible to characterize the process of activation of actin polymerization by VPR by identifying the peptide domains of VPR responsible for this effect. Research carried out within the framework of the invention has in particular demonstrated that the 55-75 sub-domain of the alpha 3 helix of the VPR protein, vectorized in malignant cells induces a reappearance of actin filaments and a restoration of intercellular interactions, which corresponds to a reversal of the tumor phenotype. The sequence of fragment 55-75 is given in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO.6. Consequently, the agents inhibiting the specific mechanism of actin polymerization induced by VPR can be considered as inhibitors of the function of VPR potentially having an inhibitory effect on the replicative cycle of HIV-1 acting on the cytoplasm-nucleus translocation. of the PIC. The subject of the present invention is therefore a fragment or a derivative of VPR, characterized in that it is capable of inducing a strong increase in the kinetics of polymerization of cellular actin and in that it comprises the sequence of the fragment 55 -75 of VPR. By VPR fragment is meant a polypeptide which has a length less than that of the native VPR protein. Advantageously, the polypeptide fragment according to the invention has a length of less than 70 amino acids, preferably less than 60 amino acids and particularly preferably less than 50 amino acids. By way of example of such polypeptide fragments, mention may be made of fragments 52-96, 60-80 and 55-75 of VPR, preferably fragment 55-75. The sequence of fragment 52-96 is given in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO.4. The sequence of fragment 60-80 is given in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO.5. By VPR derivatives is meant proteins or peptides whose sequence is obtained from that of the VPR protein or of its fragments, by removing, adding or modifying one or more amino acids. It can also be chemical modifications carried out at one or the other of the ends of the protein or of the fragment or at the level of the side chain of one or more of the amino acids. By way of example of such derivatives, mention may be made of cyclized forms. The present invention also relates to a method of identifying compounds capable of acting on the replication of an HIV type virus, characterized in that the polymerization of actin induced by the VPR protein, an fragment or a derivative thereof on a cell or a cell extract comprising actin, in the presence of said compound. The compounds highlighted by the method of
1 ' invention constituent des composés candidats pour le développement d'inhibiteurs de la réplication des virus et donc pour le traitement du SIDA. Avantageusement, la méthode de l'invention comprend les étapes de : (i) mise en contact, dans un milieu réactionnel, d'une cellule ou d'un extrait cellulaire comprenant de l'actine, de préférence d'un extrait cellulaire comprenant de l'actine, avec la protéine VPR, un fragment ou un dérivé de celle-ci, et le composé à tester, et (ii) analyse de la polymérisation de l'actine dans le milieu réactionnel suite à l'étape (i), de préférence au plateau (état stationnaire). L'homme du métier pourra déterminer simplement les cellules ou extraits cellulaires comprenant de l'actine qui peuvent être utilisés dans la méthode de l'invention. À titre d'exemple d'extraits cellulaires comprenant de l'actine utilisables dans la méthode de l'invention, on peut citer des extraits obtenus par la lyse, par des procédés usuels (lyse mécanique ou à l'aide de tensio-actifs, éventuellement centrifugation et récupération du surnageant), de lignées cellulaires telles que des lignées de fibroblastes, notamment des fibroblastes de souris comme la lignée 3T3. Avantageusement, la concentration protéique dudit extrait cellulaire dans le milieu réactionnel est comprise entre 10 μg/ml et 10 mg/ml, de préférence entre 0,1 mg/ml et 1 mg/ml. Par fragment ou dérivé de VPR, on entend un fragment ou un dérivé de VPR tel que décrit précédemment. Avantageusement, la concentration de VPR, de fragment ou de dérivé de celle-ci est inférieure ou égale à 50 μM dans le milieu réactionnel, de préférence inférieure ou égale à 10 μM et de manière particulièrement préférée inférieure ou égale à 5 μM. Avantageusement encore, la concentration de VPR, de fragment ou de dérivé de celle-ci est supérieure ou égale à 100 nM dans le milieu réactionnel, de préférence supérieure ou égale à 500 nM et de manière particulièrement préférée supérieure ou égale à 1 μM Tout composé pourra être testé dans la méthode de l'invention. La méthode de l'invention peut être mise en œuvre avec des concentrations fixes ou des concentrations variables du composé à tester. Avantageusement, les concentrations du composé à tester sont comprises entre 10 pM et 100 μM dans le milieu réactionnel, de préférence entre 100 pM et 10 μM et de manière particulièrement préférée entre 1 nM et 5 μM. Avantageusement, la méthode de l'invention comprend l'analyse de la polymérisation de l'actine en présence et en absence de VPR. La méthode de l'invention comprend alors les étapes supplémentaires de: (iii) mise en contact, dans un milieu réactionnel, d'une cellule ou d'un extrait cellulaire comprenant de l'actine, de préférence un extrait cellulaire comprenant de l'actine, avec le composé à tester; et (iv) analyse de la polymérisation de l'actine dans le milieu réactionnel suite à l'étape (iii). Ainsi et à titre d'exemple, la mise en œuvre du test peut comprendre la mesure de la dynamique de la polymérisation de l'actine cellulaire d'une part en présence de 5 μM de VPR et d'autre part en absence de VPR (contrôle). Avantageusement encore, la méthode de l'invention comprend en outre l'étape de : (v) comparaison des résultats de polymérisation obtenus aux étapes (ii) et (iv). De préférence, la méthode de l'invention comprend alors une étape supplémentaire (vi) de sélection des composés permettant d'inhiber la polymérisation de l'actine à l'étape (i) et de préférence pas à l'étape (iii). Selon une deuxième forme de réalisation particulière de la méthode de l'invention, et de préférence dans le cas d'un extrait cellulaire comprenant de l'actine, le démarrage de la polymérisation de l'actine est obtenu par l'introduction dans le milieu réactionnel d'un tampon contenant de l'ATP et du MgCl2. La méthode de l'invention comprend alors l'introduction dans le milieu réactionnel d'ATP et de MgCl2 à l'étape (i) et éventuellement à l'étape (iii). L'homme du métier pourra déterminer simplement les concentrations d'ATP et de MgCl2 à ajouter au milieu réactionnel pour obtenir le démarrage de la polymérisation de l'actine. À titre d'exemple, on peut utiliser une concentration de 500 μM d'ATP et de 1 mM de MgCl2 dans le milieu réactionnel. Avantageusement, le composé à tester est ajouté dans le milieu réactionnel à l'étape (i) et éventuellement à l'étape (iii) avant l'induction de la polymérisation d'actine. Le milieu réactionnel pourra également comprendre d'autres composants permettant d'améliorer la polymérisation et/ou de maintenir cette activité dans le temps comme le sucrose ou encore le DTT. Selon une troisième forme de réalisation particulière de la méthode de l'invention, la méthode de l'invention comprend en outre l'introduction dans le milieu réactionnel d'un traceur permettant de suivre la polymérisation de l'actine à l'étape (i) et éventuellement à l'étape (iii). Un tel traceur correspond à de l'actine marqué, de préférence par un fluorophore comme l'actine G-alexa. La cinétique de polymérisation de 1 ' actine dans les extraits cellulaires pourra alors être mesurée en suivant l'augmentation de l' anisotropie de fluorescence (AF) à l'étape (ii) et éventuellement à l'étape (iv). Avantageusement l'analyse de la variation d' anisotropie est mesurée en continu, par exemple dans un appareil BEACON 2000 (PANVERA) . Le paramètre de la dynamique de polymérisation d'actine mesuré dans la méthode de l'invention à l'étape (ii) et éventuellement à l'étape (iv) est alors de préférence la valeur d ' anisotropie de fluorescence (AF) au plateau (état stationnaire) . Dans les conditions de mesures standard, le plateau de polarisation de fluorescence (anisotropie) est obtenu après 2 à 5 minutes d'incubation et reste stable pendant plusieurs dizaines de minutes. Dans un souci de standardisation, les valeurs d' anisotropie sont évaluées 10 minutes après l'induction de la réaction. Les mesures effectuées sont alors les suivantes :1 the invention are candidate compounds for the development of inhibitors of virus replication and therefore for the treatment of AIDS. Advantageously, the method of the invention comprises the steps of: (i) bringing into contact, in a reaction medium, a cell or a cell extract comprising actin, preferably a cell extract comprising actin, with the VPR protein, a fragment or a derivative thereof, and the compound to be tested, and (ii) analysis of the actin polymerization in the reaction medium following step (i), preferably on the platform (steady state). Those skilled in the art can simply determine the cells or cell extracts comprising actin which can be used in the method of the invention. By way of example of cell extracts comprising actin which can be used in the method of the invention, mention may be made of extracts obtained by lysis, by usual methods (mechanical lysis or using surfactants, optionally centrifugation and recovery of the supernatant), cell lines such as fibroblast lines, in particular mouse fibroblasts such as line 3T3. Advantageously, the protein concentration of said cell extract in the reaction medium is between 10 μg / ml and 10 mg / ml, preferably between 0.1 mg / ml and 1 mg / ml. By fragment or derivative of VPR means a fragment or derivative of VPR as described above. Advantageously, the concentration of VPR, of fragment or of derivative thereof is less than or equal to 50 μM in the reaction medium, preferably less than or equal to 10 μM and more particularly preferably less than or equal to 5 μM. Advantageously also, the concentration of VPR, fragment or derivative thereof is greater than or equal to 100 nM in the reaction medium, preferably greater than or equal to 500 nM and more particularly preferably greater than or equal to 1 μM Any compound could be tested in the method of the invention. The method of the invention can be implemented with fixed concentrations or variable concentrations of the compound to be tested. Advantageously, the concentrations of the compound to be tested are between 10 μM and 100 μM in the reaction medium, preferably between 100 μM and 10 μM and more particularly between 1 nM and 5 μM. Advantageously, the method of the invention comprises the analysis of the polymerization of actin in the presence and in the absence of VPR. The method of the invention then comprises the additional steps of: (iii) bringing into contact, in a reaction medium, a cell or a cell extract comprising actin, preferably a cell extract comprising actin, with the compound to be tested; and (iv) analysis of the actin polymerization in the reaction medium following step (iii). Thus, by way of example, the implementation of the test may include measuring the dynamics of the polymerization of cellular actin on the one hand in the presence of 5 μM of VPR and on the other hand in the absence of VPR ( control). Advantageously also, the method of the invention further comprises the step of: (v) comparison of the polymerization results obtained in steps (ii) and (iv). Preferably, the method of the invention then comprises an additional step (vi) of selection of the compounds making it possible to inhibit the polymerization of actin in step (i) and preferably not in step (iii). According to a second particular embodiment of the method of the invention, and preferably in the case of a cell extract comprising actin, the start of the actin polymerization is obtained by the introduction into the medium reaction of a buffer containing ATP and MgCl 2 . The method of the invention then comprises the introduction into the reaction medium of ATP and MgCl 2 in step (i) and optionally in step (iii). Those skilled in the art can simply determine the concentrations of ATP and MgCl 2 to be added to the reaction medium to obtain the start of the actin polymerization. For example, a concentration of 500 μM ATP and 1 mM MgCl 2 can be used in the reaction medium. Advantageously, the compound to be tested is added to the reaction medium in step (i) and optionally in step (iii) before the induction of actin polymerization. The reaction medium may also comprise other components making it possible to improve the polymerization and / or to maintain this activity over time such as sucrose or even DTT. According to a third particular embodiment of the method of the invention, the method of the invention further comprises the introduction into the reaction medium of a tracer making it possible to follow the polymerization of actin in step (i ) and possibly in step (iii). Such a tracer corresponds to actin labeled, preferably with a fluorophore such as actin G-alexa. The kinetics of actin polymerization in cell extracts can then be measured by following the increase in fluorescence anisotropy (AF) in step (ii) and optionally in step (iv). Advantageously, the analysis of the variation in anisotropy is measured continuously, for example in a BEACON 2000 device (PANVERA). The parameter of the actin polymerization dynamic measured in the method of the invention in step (ii) and optionally in step (iv) is then preferably the value of fluorescence anisotropy (AF) on the plateau. (steady state). Under standard measurement conditions, the fluorescence polarization plateau (anisotropy) is obtained after 2 to 5 minutes of incubation and remains stable for several tens of minutes. For the sake of standardization, the anisotropy values are evaluated 10 minutes after the induction of the reaction. The measurements are then as follows:
- Valeur de l'AF au plateau en présence de VPR ;- AF value at the plateau in the presence of VPR;
- Valeur de l'AF au plateau en présence de VPR et du composé à tester ; - Valeur de l'AF au plateau en absence de VPR ;- Value of AF on the plateau in the presence of VPR and of the compound to be tested; - AF value at the plateau in the absence of VPR;
- Valeur de l'AF au plateau en absence de VPR et en présence du composé à tester. Ces différentes mesures permettent de discriminer un effet inhibiteur de polymérisation d'actine, d'un effet inhibiteur de VPR (polymérisation de l'actine VPR-dépendante) . La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre de la méthode décrite précédemment. Un tel kit comprend :- Value of AF on the plateau in the absence of VPR and in the presence of the compound to be tested. These various measures make it possible to discriminate an inhibitory effect of actin polymerization, from an inhibitory effect of VPR (polymerization of actin VPR-dependent). The present invention also relates to a kit for implementing the method described above. Such a kit includes:
- un extrait ou lysat cellulaire contenant de l'actine, - de l'actine marqué, par exemple par un fluorophore, par exemple l'actine-alexa (G-acti-alexa 488),- an extract or cell lysate containing actin, - actin labeled, for example with a fluorophore, for example actin-alexa (G-acti-alexa 488),
- un tampon de polymérisation de l'actine,- an actin polymerization buffer,
- un tampon général d'actine (tampon G : tampon de dilution de l'extrait ou lysat cellulaire contenant de l'actine), - la protéine VPR purifiée, un fragment ou un dérivé de celle- ci,- a general actin buffer (buffer G: dilution buffer for the extract or cell lysate containing actin), - the purified VPR protein, a fragment or a derivative thereof,
- avantageusement un mode opératoire. D ' autres avantages et caractéristiques de la méthode de l'invention apparaîtront des exemples de qui suivent. EXEMPLES 1) Identification des domaines peptidiqu.es actifs sur la polymérisation de l'actine dans des extraits cellulaires. a) Domaines peptidiques : La figure 3 représente la structure tridimensionnelle complète de VPR obtenue par RMN (Wecker et al., Eur. J. Biochem. 269, 3779-3788, 2002). Cette structure relativement symétrique entre les domaines N et C-terminal avec trois hélices alpha structurées bien caractérisées. La structure tertiaire, en forme de trapèze semble également bien stabilisée par la présence des deux "tours" en 34-36 et 52-54 malgré la présence des zones flexibles adjacentes (foncées). Les hélices sont amphiphatiques et se caractérisent par une alternance d'acides aminés hydrophiles et hydrophobes. Cette architecture induit une répartition dissymétrique des résidus hydrophiles et hydrophobes comme indiqué dans la figure 4. Il convient de noter que certains domaines ont un caractère hydrophobe marqué, telle l'hélice alpha 3 qui présente dans sa séquence 11 leucines ou isoleucines. Afin d ' obtenir des informations sur les domaines de VPR responsables de la polymérisation de l'actine, les fragments peptidiques de VPR ci-dessous ont été synthétisés : VPR (1-96) : SEQ ID NO.l VPR (1-51) : SEQ ID NO.2 VPR (70-96) : SEQ ID NO.3 VPR (52-96) : SEQ ID NO.4 VPR (60-80) : SEQ ID NO.5 VPR (55-75) : SEQ ID NO.6 b) Cellules et préparation des extraits. Les fibroblastes 3T3 exprimant la protéine de fusion EWS- Fll (EF) ont été cultivés selon les techniques courantes. Cette protéine de fusion EWS-F11 (EF) est responsable du sarcome d'E ing. Les cellules exprimant cette protéine sont hautement tumorigenes et se caractérisent entre autres par une diminution significative de l'expression de la zyxine. Cette sous-expression de zyxine est accompagnée d'une forte altération de la morphologie cellulaire, de l'adhérence cellule-cellule et de la motilité. Les cellules ont été lavées dans un tampon usuel. Les membranes cellulaires ont ensuite été rompues en utilisant les procédés usuels. Les extraits bruts ont alors été centrifugés à 10 000 g pendant 30 min, puis le surnageant a été filtré avec un filtre à 0,45 μm. Le surnageant a été complété avec du sucrose à 150 mM final, de l'ATP et du DTT. L'extrait cellulaire obtenu a alors été aliquoté et conservé à —80°C. c) Composition des milieux réactionnels standard. Extraits de cellules de fibroblastes 3T3 exprimant la protéine de fusion EWS-Fll (EF): 0,20 mg/ml de protéines alexa 500 μM (G-acti-alexa 488, molecular probes) ATP : 500 μM MgC12 : 1 mM VPR ou fragments de VPR (SEQ ID NO.1 à 6) : 5 μM ou VPR de 0 à 10 μM d) Réaction de polymérisation de l'actine en présence de- advantageously an operating mode. Other advantages and characteristics of the method of the invention will appear from the examples which follow. EXAMPLES 1) Identification of the peptide domains active on the polymerization of actin in cell extracts. a) Peptide domains: FIG. 3 represents the complete three-dimensional structure of VPR obtained by NMR (Wecker et al., Eur. J. Biochem. 269, 3779-3788, 2002). This relatively symmetrical structure between the N and C-terminal domains with three well characterized structured alpha helices. The tertiary structure, in the shape of a trapezoid, also seems to be well stabilized by the presence of the two "towers" in 34-36 and 52-54 despite the presence of the adjacent flexible zones (dark). The propellers are amphiphatic and are characterized by an alternation of hydrophilic and hydrophobic amino acids. This architecture induces an asymmetric distribution of hydrophilic and hydrophobic residues as indicated in FIG. 4. It should be noted that certain domains have a marked hydrophobic character, such as the alpha 3 helix which has in its sequence 11 leucines or isoleucines. In order to obtain information on the domains of VPR responsible for the actin polymerization, the peptide fragments of VPR below were synthesized: VPR (1-96): SEQ ID NO.l VPR (1-51) : SEQ ID NO.2 VPR (70-96): SEQ ID NO.3 VPR (52-96): SEQ ID NO.4 VPR (60-80): SEQ ID NO.5 VPR (55-75): SEQ ID NO.6 b) Cells and preparation of extracts. The 3T3 fibroblasts expressing the EWS-Fll (EF) fusion protein were cultured according to current techniques. This EWS-F11 fusion protein (EF) is responsible for the ing. The cells expressing this protein are highly tumorigenic and are characterized, among other things, by a significant reduction in the expression of zyxin. This under-expression of zyxin is accompanied by a strong alteration in cell morphology, cell-cell adhesion and motility. The cells were washed in usual buffer. The cell membranes were then ruptured using the usual methods. The crude extracts were then centrifuged at 10,000 g for 30 min, then the supernatant was filtered with a 0.45 μm filter. The supernatant was made up with final 150 mM sucrose, ATP and DTT. The cell extract obtained was then aliquoted and stored at -80 ° C. c) Composition of standard reaction media. Extracts of 3T3 fibroblast cells expressing the EWS-Fll fusion protein (EF): 0.20 mg / ml of alexa 500 μM proteins (G-acti-alexa 488, molecular probes) ATP: 500 μM MgC12: 1 mM VPR or fragments of VPR (SEQ ID NO.1 to 6): 5 μM or VPR from 0 to 10 μM d) Actin polymerization reaction in the presence of
VPR Pour le test manuel, la réaction a été réalisée dans une cuvette du Beacon 2000. Dans un aliquote d'extrait cellulaire, on a ajouté 1 mM d' actine-alexa. La réaction de polymérisation a été induite par l'addition d'un volume égal à celui de l'extrait d'un tampon contenant de l'ATP 1 mM et du MgCl2 2 mM. La protéine VPR a été ajoutée avant l'addition du tampon de polymérisation. La variation d' anisotropie de fluorescence a été mesurée automatiquement toutes les 30 secondes. e) Résultats : Les résultats obtenus avec la VPR sont représentés sur la figure 5. On observe une très forte augmentation de la vitesse de polymérisation de l'actine et une très forte augmentation du niveau d'actine polymérisée à l'état stationnaire. Cet effet est bien supérieur à celui observé en présence de phalloïdine à concentration saturante. Des résultats similaires ont été obtenus avec les fragments SEQ ID NO.4 et 5. En revanche, aucune modification de la polymérisation de l'actine n'est observé en présence des fragments VPR SEQ ID NO.2 et 3. Les valeurs d' anisotropie de fluorescence en présence de différentes concentrations de VPR et à l'état stationnaire sont représentés sur la figure 6. Les résultats montrent que l'effet activateur de VPR sur la polymérisation de l'actine est concentration dépendante. Les extraits cellulaires contiennent a priori tous les éléments régulateurs intervenant dans la dynamique de l'actine. De très nombreuses protéines peuvent intervenir dans ce processus. La figure 6 représente la dynamique de l'actine simplifiée intervenant au niveau cellulaire. D'une manière simplifiée (figure 7), les éléments suivants peuvent être pris en compte : 1- Vitesse de polymérisation : La vitesse de polymérisation est dépendante de la concentration en actine G-ATP des extraits. Ce paramètre est constant dans toutes les expériences. . La vitesse de polymérisation est dépendante des premières étapes de nucléation de l'actine G (formation de dimères et trimères d'actine). Dans nos conditions opératoires, ce paramètre ne semble pas intervenir dans la mesure où au départ de la réaction, la nucléation est déjà effectuée. . La constante de vitesse apparente est le résultat de la vitesse de polymérisation et de la vitesse de dépolymérisation. Ce paramètre est donc indicatif de la dynamique et notamment du turnover du système. 2- Quantité d'actine F à l'état stationnaire (valeur d' anisotropie au plateau). Cette valeur est le reflet des valeurs respectives de vitesse de polymérisation et dépolymérisation à l'état stationnaire. La vitesse de dépolymérisation dépend entre autres de la stabilité des filaments d'actine. Les agents connus de stabilisation de l'actine F comme la phalloïdine augmentent notablement la valeur du plateau en se fixant à l'actine F et limitent ainsi sa dépolymérisation. Pour autant, dans le cas de la protéine VPR, les résultats montrent une très forte augmentation de la quantité d'actine F à l'état stationnaire et aussi de la constante de vitesse de polymérisation (figure 5), lesquelles sont bien supérieures aux valeurs obtenues avec des agents stabilisant l'actine F comme la phalloïdine. Ces fortes augmentations suggèrent un mécanisme de stabilisation de l'actine F par VPR différents de celui d'agents comme la phalloïdine associé à une forte diminution de la vitesse de dépolymérisation de l'actine. En fait, la vitesse de dépolymérisation de l'actine F dépend également de plusieurs protéines et notamment de la cofiline (figure 7), laquelle accélère fortement la dépolymérisation de l'actine F. Comme nous l'avons mentionné précédemment, l'activité de la cofiline se trouve sous le contrôle de la Lim kinase laquelle est notamment sous le contrôle de la phosphatase PP2A. Dans le cas de VPR, les résultats suggèrent donc que l'augmentation de la constante de polymérisation et de la quantité d'actine F à l'état stationnaire résultent majoritairement d'une inhibition par VPR de l'activité d'enzymes impliquées dans la dépolymérisation de l'actine F, et vraisemblablement de la colifine. On ne peut toutefois écarter l'hypothèse que l'interaction décrite entre VPR et l'actine F intervienne également dans le mécanisme de stabilisation des filaments d'actine par VPR. 2) Identification des domaines peptidiques actifs sur la polymérisation de l'actine dans des extraits cellulaires. L'effet de ces différents fragments peptidiques a également été sur la polymérisation de l'actine endogène des cellules 3T3 EF. Le paramètre retenu est la valeur de la quantité d'actine F présente à l'état stationnaire. La figure 8 montre les résultats obtenus avec différentes concentrations de fragments peptidiques (2,5 ou 10 μM) . Les résultats obtenus montrent que le domaine N-terminal (1-51) et le domaine extrême C-terminal (zone en partie flexible 70-96) sont inactifs sur la polymérisation de l'actine. En revanche, le fragment 52-96 est actif ainsi que le fragment 60-80. On peut en déduire que le domaine actif de VPR sur la polymérisation de l'actine correspond à l'hélice alpha 3 (55-For the manual test, the reaction was carried out in a Beacon 2000 cuvette. In an aliquot of cell extract, 1 mM actin-alexa was added. The polymerization reaction was induced by the addition of a volume equal to that of the extract of a buffer containing 1 mM ATP and 2 mM MgCl 2 . The VPR protein was added before the addition of the polymerization buffer. The change in fluorescence anisotropy was automatically measured every 30 seconds. e) Results: The results obtained with the VPR are shown in FIG. 5. There is a very strong increase in the rate of actin polymerization and a very strong increase in the level of actin polymerized in the stationary state. This effect is much greater than that observed in the presence of phalloidin at a saturated concentration. Similar results were obtained with the fragments SEQ ID NO.4 and 5. On the other hand, no modification of the actin polymerization is observed in the presence of the VPR fragments SEQ ID NO.2 and 3. The values of fluorescence anisotropy in the presence of different concentrations of VPR and in the stationary state are represented in FIG. 6. The results show that the activating effect of VPR on the polymerization of actin is concentration dependent. The cellular extracts contain a priori all the regulatory elements involved in the dynamics of actin. Many proteins can be involved in this process. FIG. 6 represents the dynamics of the simplified actin intervening at the cellular level. In a simplified way (figure 7), the following elements can be taken into account: 1- Polymerization rate: The polymerization rate is dependent on the actin G-ATP concentration of the extracts. This parameter is constant in all the experiments. . The rate of polymerization is dependent on the first stages of actin G nucleation (formation of actin dimers and trimers). In our operating conditions, this parameter does not seem to intervene insofar as at the start of the reaction, nucleation is already carried out. . The apparent rate constant is the result of the rate of polymerization and the rate of depolymerization. This parameter is therefore indicative of the dynamics and in particular of the turnover of the system. 2- Amount of actin F in the stationary state (value of anisotropy on the plateau). This value is a reflection of the respective values for stationary polymerization and depolymerization rates. The rate of depolymerization depends inter alia on the stability of the actin filaments. Known agents for stabilizing actin F such as phalloidin notably increase the value of the plateau by binding to actin F and thus limit its depolymerization. However, in the case of the VPR protein, the results show a very large increase in the amount of actin F in the stationary state and also in the polymerization rate constant (FIG. 5), which are much higher than the values obtained with F-actin stabilizing agents such as phalloidin. These large increases suggest a mechanism of stabilization of actin F by VPR different from that of agents like phalloidin associated with a strong decrease in the speed of depolymerization of actin. In fact, the speed of depolymerization of actin F also depends on several proteins and in particular on cofilin (FIG. 7), which strongly accelerates the depolymerization of actin F. As we have mentioned previously, the activity of cofilin is under the control of Lim kinase which is in particular under the control of phosphatase PP2A. In the case of VPR, the results therefore suggest that the increase in the polymerization constant and the amount of actin F in the steady state result mainly from an inhibition by VPR of the activity of enzymes involved in the depolymerization of actin F, and presumably colifin. However, we cannot rule out the hypothesis that the interaction described between VPR and actin F also intervenes in the mechanism of stabilization of actin filaments by VPR. 2) Identification of the peptide domains active on the polymerization of actin in cell extracts. The effect of these different peptide fragments was also on the polymerization of the endogenous actin of 3T3 EF cells. The parameter retained is the value of the amount of actin F present in the stationary state. Figure 8 shows the results obtained with different concentrations of peptide fragments (2.5 or 10 μM). The results obtained show that the N-terminal domain (1-51) and the C-terminal extreme domain (partly flexible zone 70-96) are inactive on the polymerization of actin. On the other hand, the fragment 52-96 is active as well as the fragment 60-80. We can deduce that the active domain of VPR on the actin polymerization corresponds to the alpha 3 helix (55-
83) et ceci, aussi bien dans les extraits cellulaires que dans les cellules. Ce résultat a été confirmé par la transfection du fragment peptidique 55-75, laquelle a entraîné une stimulation de la polymérisation de l'actine. Ces résultats confirment ceux obtenus au cours des expériences réalisées in vitro décrites précédemment. Il convient de remarquer que la protéine virale de nucléocapside NCp7 qui est également une protéine virale basique présente dans le complexe de préintégration, exerce un effet plus faible que VPR, mais significatif sur la dynamique de polymérisation l'actine. 3) Test de criblage d'inhibiteurs de VPR. a) Rappel VPR exerce in vitro une forte augmentation de la cinétique de polymérisation de l'actine cellulaire présente dans des extraits de fibroblastes. Cet effet est considéré comme une activité fonctionnelle de VPR impliquée dans le processus de translocation cytoplasme-noyau du complexe de préintégration du VIH-1 dans les cellules quiescentes infectées par le virus. Les agents inhibiteurs de la polymérisation d'actine induite par VPR peuvent par conséquent être considérés comme des inhibiteurs de la fonction de VPR ayant potentiellement un effet inhibiteur du cycle réplicatif du VIH-1 agissant au niveau de la translocation cytoplasme- noyau du PIC. b) Principe du test L'actine cellulaire est obtenue par la préparation d'extraits de fibroblastes de souris. La cinétique de polymérisation de 1 ' actine des extraits cellulaires est mesurée par l'augmentation de 1 ' anisotropie de fluorescence d'actine G-alexa utilisée comme traceur et ajoutée dans les extraits cellulaires. Pour la mise en œuvre du test, la dynamique de la polymérisation de l'actine cellulaire est mesurée d'une part en présence de 5 μM de VPR et d'autre part en absence de VPR (contrôle) . Le démarrage de la polymérisation d ' actine est obtenu par l'introduction dans le milieu réactionnel d'un tampon contenant 500 μM d'ATP et 1 mM de MgC12. La molécule à tester est ajoutée à concentration fixe ou à concentration variable dans le milieu réactionnel avant l'induction de la polymérisation d'actine. La variation d' anisotropie est mesurée en continue dans un appareil BEACON 2000 (PanVera). Le paramètre de la dynamique de polymérisation d'actine mesuré dans le test est la valeur d' anisotropie de fluorescence au plateau (état stationnaire). Dans les conditions de mesures standard, le plateau de polarisation de fluorescence (anisotropie) est obtenu après 2 à 5 minutes d'incubation et reste stable pendant plusieurs dizaines de minutes. Dans un souci de standardisation, les valeurs d' anisotropie seront évaluées 10 minutes après l'induction de la réaction. Les mesures effectuées sont les suivantes : Valeur de l'AF au plateau en présence de VPR Valeur de l'AF au plateau en présence de VPR + la molécule à tester Valeur de l'AF au plateau en absence de VPR Valeur de l'AF au plateau en absence de VPR + la molécule à tester Cela permet de discriminer un effet inhibiteur de polymérisation d'actine d'un effet inhibiteur de VPR (polymérisation de l'actine VPR-dépendante ) . c) Réalisation pratique du test - Cellules et préparation des extraits : Des fibroblastes 3T3 ont été cultivés selon les techniques courantes. Les cellules ont été lavées dans du tampon Krebs pH 7.40 sans calcium. Les membranes cellulaires ont ensuite été rompues en utilisant les procédés usuels. Les extraits bruts ont été centrifugés à 10.000 g pendant 30 min. La concentration protéique du surnageant obtenu a été ajustée à 0,40 mg/ml puis le surnageant a été aliquoté et conservé à -80°C. - Composition des milieux réactionnels : Extraits de cellules de fibroblastes 3T3 : 0,20 mg/ml de protéines Actine-alexa 500 μM (G-acti-alexa 488, molecular probes) ATP : 500 μM MgC12 : 1 mM VPR : 5 μM pour le test manuel, des concentrations variables des molécules à tester ont été utilisées (max 5 μM) . Molécule à tester : 5 μM pour un test robotisé d) Mesure de la dynamique de polymérisation - Expérience contrôle sans VPR : Pour le test manuel, la réaction a été réalisée dans une cuvette du Beacon 2000. 1 mM d' actine-alexa a été ajouté dans un aliquote d'extrait cellulaire. La réaction de polymérisation a ensuite été induite par l'addition d'un volume égal à celui de l'extrait d'un tampon contenant ATP 1 mM, MgC12 2 mM. La variation d' anisotropie de fluorescence a ensuite été mesurée automatiquement toutes les 30 secondes. - Expérience contrôle avec VPR : La séquence des opérations était identique à celle précédemment décrite en présence d'une concentration finale de VPR de 5 μM. La protéine VPR a été ajoutée avant l'addition du tampon de polymérisation. - Expérience en présence de molécule à tester : Les conditions expérimentales et la séquence des opérations étaient identiques aux expériences contrôles en présence de concentrations variables de molécules à tester (ajouter avec VPR avant l'induction de la polymérisation d'actine). Afin de valider le principe de la méthode d'identification d'agents inhibiteurs de la polymérisation de l'actine induite par VPR, de la phalloïdine (5 μM, Sigma) a été utilisé à titre de contrôle négatif (inhibiteur de la polymérisation de l'actine non VPR dépendant) et un anticorps de lapin polyclonal dirigé contre le fragment 55-75 de VPR a été utilisé (dilution finale 1/1000) à titre de contrôle positif (inhibiteur spécifique de la polymérisation de l'actine VPR-dépendante) . e) Test robotisé Le test est adaptable à la robotisation en utilisant des plaques de 96 puits. Dans ce cas, les molécules testées sont ajoutées à la concentration finale de 5 μM. 83) and this, both in cell extracts and in cells. This result was confirmed by the transfection of the peptide fragment 55-75, which resulted in stimulation of the actin polymerization. These results confirm those obtained during the in vitro experiments described above. It should be noted that the viral nucleocapsid protein NCp7 which is also a basic viral protein present in the pre-integration complex, exerts a weaker effect than VPR, but significant on the dynamics of actin polymerization. 3) Screening test for VPR inhibitors. a) Reminder VPR exerts in vitro a strong increase in the kinetics of polymerization of cellular actin present in fibroblast extracts. This effect is considered to be a functional activity of VPR involved in the cytoplasm-nucleus translocation process of the HIV-1 preintegration complex in quiescent cells infected with the virus. Agents inhibiting the actin polymerization induced by VPR can therefore be considered as inhibitors of the function of VPR potentially having an inhibitory effect on the replicative cycle of HIV-1 acting at the cytoplasm-nucleus translocation of the PIC. b) Principle of the test Cell actin is obtained by the preparation of extracts of mouse fibroblasts. The kinetics of actin polymerization of cell extracts is measured by the increase in the anisotropy of actin G-alexa fluorescence used as a tracer and added in the cell extracts. For the implementation of the test, the dynamics of the polymerization of cellular actin is measured on the one hand in the presence of 5 μM of VPR and on the other hand in the absence of VPR (control). The start of actin polymerization is obtained by the introduction into the reaction medium of a buffer containing 500 μM ATP and 1 mM MgCl 2. The molecule to be tested is added at a fixed concentration or at a variable concentration in the reaction medium before the induction of actin polymerization. The variation in anisotropy is measured continuously in a BEACON 2000 device (PanVera). The parameter of the actin polymerization dynamic measured in the test is the value of fluorescence anisotropy at the plateau (steady state). Under standard measurement conditions, the fluorescence polarization plateau (anisotropy) is obtained after 2 to 5 minutes of incubation and remains stable for several tens of minutes. For the sake of standardization, the anisotropy values will be evaluated 10 minutes after the induction of the reaction. The measurements carried out are as follows: Value of AF on the plateau in the presence of VPR Value of AF on the plateau in the presence of VPR + the molecule to be tested Value of AF on the plateau in the absence of VPR Value of AF at the plateau in the absence of VPR + the molecule to be tested This makes it possible to discriminate an inhibitory effect of actin polymerization from an inhibitory effect of VPR (polymerization of VPR-dependent actin). c) Practical realization of the test - Cells and preparation of extracts: 3T3 fibroblasts were cultured according to current techniques. The cells were washed in Krebs pH 7.40 buffer without calcium. The cell membranes were then ruptured using the usual methods. The crude extracts were centrifuged at 10,000 g for 30 min. The protein concentration of the obtained supernatant was adjusted to 0.40 mg / ml and then the supernatant was aliquoted and stored at -80 ° C. - Composition of the reaction media: Extracts of 3T3 fibroblast cells: 0.20 mg / ml of Actin-alexa 500 μM proteins (G-acti-alexa 488, molecular probes) ATP: 500 μM MgC12: 1 mM VPR: 5 μM for the manual test, variable concentrations of the molecules to be tested were used (max 5 μM). Molecule to be tested: 5 μM for a robotic test d) Measurement of the polymerization dynamics - Control experiment without VPR: For the manual test, the reaction was carried out in a Beacon 2000 cuvette. 1 mM actin-alexa was added in an aliquot of cell extract. The polymerization reaction was then induced by the addition of a volume equal to that of the extract of a buffer containing 1 mM ATP, 2 mM MgCl 2. The change in fluorescence anisotropy was then automatically measured every 30 seconds. - Control experiment with VPR: The sequence of operations was identical to that previously described in the presence of a final concentration of VPR of 5 μM. The VPR protein was added before the addition of the polymerization buffer. - Experience in the presence of molecule to be tested: The experimental conditions and the sequence of operations were identical to the control experiments in the presence of variable concentrations of molecules to be tested (add with VPR before the induction of actin polymerization). In order to validate the principle of the method for identifying agents that inhibit actin polymerization induced by VPR, phalloidin (5 μM, Sigma) was used as a negative control (inhibitor of the polymerization of l actin non-VPR dependent) and a polyclonal rabbit antibody against the 55-75 fragment of VPR was used (final dilution 1/1000) as a positive control (specific inhibitor of VPR-dependent actin polymerization). e) Robotic test The test is adaptable to robotization using 96-well plates. In this case, the molecules tested are added to the final concentration of 5 μM.
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