Verfahren zur Analyse von Cytosinmethylierungen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ana- lyse von methylierten Cytosinpositionen in DNA.
Hintergrund der Erfindung
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spieLt eine wichtige biologische Rolle, u.a. bei der Transkriptions- regulation, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese (zur Übersicht: Millar et al . : Five not four: History and significance of the fifth base. In: Ttie Epi- genome, S. Beck and A. Olek (eds.), Wiley-VCH Verlag Weinheim 2003, S. 3-20). Die Identifizierung -von 5- Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichen Interesse. Ein Nachweis der Methy- lierung ist allerdings schwierig, da Cytosin -und 5- Methylcytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweisen. Viele der herkömmlichen, auf Hybridisierung beruhenden Nachweisverfahren vermögen daher nicht zwischen Cytosin und Methylcytosin zu unterscheiden. Zudem geht die Methylierungsinformation bei einer PCR-Amplifikation vollständig verloren.
Die herkömmlichen Methoden zur Methylierungsanalyse arbeiten im wesentlichen nach zwei unterschiedlichen Prinzipien. Zum einen werden methylierungsspezifiscjhe Re- striktionsenzyme benutzt, zum anderen erfolgt eine selektive chemische Umwandlung von nicht-methylierten Cytosi- nen in Uracil (sog. : Bisulfit-Behandlung, siehe etwa: DE
101 54 317 AI; DE 100 29 915 AI) . Da die Behandlung mit methylierungsspezifischen Restriktionsenzymen durch die Sequenzspezifität der Enzyme auf bestimmte Sequenzen beschränkt ist, wird für die meisten Anwendungen eine Bi- sulfit-Behandlung durchgeführt (zur Übersicht DE 100 29 915 AI S.2, Zeilen 35-46) . Die chemisch vorbehandelte DNA wird dann meist amplifiziert und kann auf unterschiedliche Weise analysiert werden (zur Übersicht: WO 02/072880 S. 1 ff; Fraga and Esteller: DNA Methylation: A Profile of Methods and Applications. Biotechniques 33:632-649, Sept. 2002). Eine selektive Amplifikation nur der methylierten (bzw. bei umgekehrten Ansatz: unmethylierten) DNA kann über die Verwendung methylierungsspezifischer Primer oder Blocker erfolgen (sog. methylierungssensitive PCR/MSP bzw. Heavy Methyl-Verfahren, vgl.: Herman et al . : Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation Status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei U S A. 1996 Sep 3 ; 93 (18) : 9821-6 ; Cottrell et al . : A real-time PCR assay for DNA-methylation using methylation-specific blockers. Nucl . Acids. Res. 2004 32: elO) . Die Detektion der Amplifikate geschieht über unterschiedliche Verfahren, etwa über Gelelektrophorese, Chromatographie, Mas- senspektrometrie, Hybridisierung an Oligomer-Arrays, Sequenzierung, Primer-Extension oder Real-Time-PCR- Varianten (vgl. Fraga and Esteller 2002, a.a.O. ) .
Aufgrund der besonderen biologischen und medizinischen Bedeutung der Cytosinmethylierung besteht ein besonderes technisches Bedürfnis an sensitiven, einfachen, schnellen und kostengünstigen Verfahren zur Methylierungsanalyse . Im folgenden ist ein solches Verfahren beschrieben. Dabei
erfolgt zunächst eine Bisulfitumwandlung der DNA. Danach wird die bisulfitierte DNA in RNA transkribiert, und die Transkripte werden anschließend weiter analysiert . Die Analyse der Transkripte hat im Vergleich zur Analyse der DNA mehrere technische Vorteile . So ist die RNA etwa für eine massenspektrometrische Untersuchung besser geeignet als DNA (s.u.). Auch kann ein Nachweis über Hybridisierung aufgrund der Einzelsträngigkeit der RNA einfacher erfolgen (s.u.). Weiterhin kann die RNA - nicht aber die DNA - chemisch oder enzymatisch so fragmentiert werden, dass das Fragmentierungsmuster abhängig von dem ursprünglichen Methylierungsstatus der DNA ist (s.u.) . Nicht zuletzt erlaubt die Umwandlung in RNA auch die Anwendung von auf Transkription basierenden Amplifi- kationsverfahren. Dies ist mit mehreren Vorteilen verbunden (s.u.) .
Zwar sind einzelne der im folgenden beschriebenen besonderen Ausführungsformen bereits für die Analyse von Muta- tionen oder Polymorphismen bekannt. Die vorliegende Erfindung kombiniert allerdings zum ersten Mal eine Bisul- fitierung mit einer Umwandlung der DNA in RNA und einer anschließenden Analyse der RNA. Der Methylierungsanalyse wird daher erstmals ein Zugang zu diesen bereits etab- lierten Technologien zur Nukleinsäureanalytik eröffnet. Aufgrund der besonderen Bedeutung der Cytosinmethylierung und aufgrund des großen technischen Bedürfnis an schlagkräftigen Verfahren zur Methylierungsanalyse stellt das Eröffnen dieser Technologie einen bedeutenden technischen Fortschritt dar.
Eine besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Methylierungsanalyse ist dadurch gekennzeichnet, dass die bisulfitierte DNA mittels eines auf Transkription basierenden Amplifikationsverfahrens (TAS- transcription based amplification System) in RNA umgewandelt wird. Hierzu gehören etwa NASBA™, 3SR™ oder TMA™. Die Einzelheiten dieser Verfahren sind dem Fachmann bekannt (zur Übersicht: Deiman et al . , Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) .Mol Biotechnol 2002 Feb;20 (2) : 163-79 mit weiteren Nachweisen) . Die Anwendung der TAS- Amplifikationsverfahren hat gegenüber den bekannten PCR- Verfahren hat mehrere Vorteile, die im Detail in den oben zitierten Veröffentlichungen beschrieben sind. Hierzu zählt insbesondere der isotherme Reaktionsverlauf .
In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausführungsform des TAS-Verfahren erfolgt die Amplifikation in Gegenwart von sog. Blockeroligonukleotiden. Die Blocker binden an die sog. „Hintergrund-Nukleinsäuren" und erschweren deren Amplifikation. So kann eine Spezifität- serhöhung der Methylierungsanalyse erreicht werden. Unter Hintergrund-Nukleinsäure wird diejenige RNA bzw. DNA verstanden, die dieselbe Basensequenz wie die DNA trägt, die nachgewiesen werden soll, allerdings über einen anderen Methylierungsstatus verfügt. Ein häufiges Problem in der Methylierungsanalyse, insbesondere bei diagnostischen Anwendungen, besteht darin, dass sich in dem Probenmaterial neben der nachzuweisenden (etwa: krankheitsspezifische) DNA auch eine große Menge an Hintergrund-DNA befindet.
Wird auch diese Hintergrund-DNA detektiert, so kommt es
zu falsch-positiven Ergebnissen. Der erfindungsgemäße Einsatz von Blocker-Oligonukleotiden führt dagegen zu einer erhöhten Spezifitat und einer verringerten Gefahr falsch-positiver Ergebnisse.
Die Verwendung von methylierungsspezifsehen Blockeroligo- nukleotiden in der methylierungsspezifsehen PCR ist bereits bekannt (sog. HeavyMethyl™-Verfahren, Cottrell et al 2004, a.a.O.). Die Verwendung von Blockern in einer isothermen Amplifikationsverfahren zur Methylierungsanalyse ist allerdings noch nicht beschrieben.
Eine weitere besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Methylierungsanalyse ist dadurch ge- kennzeichnet, dass die bisulfitierte DNA in RNA überführt wird, und die RNA anschließend chemisch oder enzymatisch so fragmentiert wird, dass das Fragmentierungsmuster abhängig von dem ursprünglichen Methylierungsstatus der DNA ist. Die Fragmente können dann u.a. chromatographisch o- der massenspektrometrisch nachgewiesen werden (s.u.). Dieses Verfahren hat mehrere Vorteile gegenüber den bekannten Methoden zur Methylierungsanalyse. So ist es möglich, detaillierte Methylierungsmuster innerhalb einer CpG-Insel in einem Allel aufzuklären. Die gängigen Ver- fahren zur methylierungsspezifischen Detektion sind dagegen kaum in der Lage, die Methylierungszustände mehrerer Cytosinpositionen gleichzeitig zu erfassen. Lediglich Bisulfit-Sequenzierungsverfahren erlauben den Nachweis individueller Cytosinmethylierungen. Die Bisulfit- Sequenzierung hat jedoch den Nachteil, dass Positionen in unmittelbarer Nähe des Sequenzierprimers nur schwer nach-
gewiesen werden können. Das gleiche gilt für Positionen, die vom Sequenzierstart weit entfernt sind. Zudem ist das ezrfindungsgemäße Verfahren schneller, kostengünstiger und leichter automatisierbar als die Sequenzierung.
In einer weiteren besondere Ausführungsform des erfin- dingsgemäßen Verfahrens werden die Transkripte massen- spektroskopisch analysiert. RNA ist für eine mas- senspektrometrische Analyse besser geeignet als DNA. So stabilisiert die 2 'OH-Gruppe des Ribose-Rings die N- giykosidische Bindung zwischen Nukleinbase und Ribose. Die bei einer massenspektrometrischen Analyse typische Depurinierung wird so verhindert . Dadurch ist RNA für diese Art der Analyse besser als DNA geeignet (vgl . : Kir- pekar et al . : Matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of enzymatically synthesized RNA up to 150 kDa. Nucl. Acids. Res . 1994 22: 3866-3870; Nordhoff et al . : Ion stability of nucleic acids in infrared ma- turix-assisted laser desorption/ionization mass spectrome- try; Nucl. Acids. Res. 1993 21: 3347-3357).
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Ausfüh- rungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens kombiniert eine methylierungsspezifische enzymatische Fragmentierung (s.o.) mit einer anschließenden massenspektrometrischen Analyse. So wird die RNA bevorzugt mittels des Enzyms RNAase Tl fragmentiert und anschließend mittels MALDI a- nalysiert. Ähnliche Verfahren zum Nachweis von Einzel- nukleotidpolymorphimen (SNP) oder kurzen Tandem Wiederho- lungen (STR) sind bereits beschrieben (Krebs et al . : RNa- seCut : a MALDI mass spectrometry-based method for SNP
discovery. Nucleic Acids Res. 2003 Apr 1;31 (7) :e37. ; Seichter et al . : Rapid and accurate characterisation of Short tandem repeats by MALDI-TOF analysis of endonucle- ase cleaved RNA transcripts. Nucleic Acids Res. 2004 Jan 20;32 (2) : E16. ; Hartmer et al . : RNase Tl mediated base- specific cleavage and MALDI-TOF MS for high-throughput comparative sequence analysis. Nucleic Acids Res. 2003 May 1;31 (9) :e47) . Bei der SNP oder STR-Analyse erfolgt die Transkription und die Fragmentierung allerdings nur, um eine massenspektrometrische Analyse der DNA zu erleichtern.. Dabei ist die Anzahl der Enzymschnittstellen gleichbleibend und die entstandenen kurzen RNA Fragmente unterscheiden sich nur aufgrund der Basenzusammensetzung. Dadurch k nnen die Massenunterschiede der Fragmente sehr klein sein (ca. 1-40 Da bei SNPs) . Ein Rückschluß von dem Fragmentierungsmuster auf die zu untersuchenden Positionen ist nach den bereits beschriebenen Verfahren nicht möglich. Die Anwendung der bereits bekannten Methodik auf die Methylierungsanalyse führt daher zu unerwarteten Vor- teilen, cLa hier die Anzahl der Enzymschnittstellen direkt mit der Methylierung der zu untersuchenden DNA korre- liert .
Beschreibung Bei der Erfindung handelt es sich um ein Verfahren zur Analyse von Cytosinmethylierungen in DNA, bei dem folgende Schritte durchgeführt werden:
1) die zu untersuchende DNA wird so umgesetzt, dass 5- Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethy- lieartes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base
umgewandelt wird, die sich im Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, 2) in die DNA wird eine Promotorsequenz eingeführt, 3) es wird RNA transkribiert, 4) die RNA wird analysiert, 5) es wird auf den Methylierungsstatus der untersuchten DNA geschlossen.
Im ersten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die zu untersuchende DNA mit einer Chemikalie oder mit einem Enzym so umgesetzt, dass 5-Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil o- der in eine andere Base umgewandelt wird, die sich im Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet . Dabei kann die zu untersuchende DNA je nach diagnostischer oder wissenschaftlicher Fragestellung aus unterschiedlichen Quellen stammen. Für diagnostische Fragestellungen dienen als Ausgangsmaterial bevorzugt Gewebeproben, aber auch Körperflüssigkeiten, insbesondere Serum. Möglich ist auch, die DNA aus Sputum, Stuhl, Urin oder Gehirn- Rückenmarks-Flüssigkeit zu verwenden. Vorzugsweise wird die DNA zunächst aus der biologischen Probe isoliert. Die DNA-Extraktion erfolgt nach Standardmethoden, aus Blut etwa unter Verwendung des Qiagen UltraSens DNA Extrakti- ons-Kits. Die isolierte DNA kann dann z.B. durch Umsatz mit Restriktionsenzymen fragmentiert werden. Die Reaktionsbedingungen und die in Frage kommenden Enzyme sind dem Fachmann bekannt und ergeben sich etwa aus den von den Herstellern mitgelieferten Protokollen. Anschließend wird die DNA chemisch oder enzymatisch umgewandelt. Bevorzugt erfolgt eine chemische Umsetzung mittels Bisulfit. Die
Bisulfitumwandlung ist dem Fachmann in unterschiedlichen Variationen bekannt (siehe etwa: Frommer et al . : A geno- mic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA Strands. Proc Natl Acad Sei U S A. 1992 Mar 1; 89 (5) : 1827-31; Olek, A modified and improved method for bisulphite based cyto- sine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 15;24(24) :5064-6. ; DE 100 29 915; DE 100 29 915). Besonders bevorzugt erfolgt die Bisulfitumwandlung in Gegen- wart von denaturierenden Lösemitteln, etwa Dioxan, und eines Radikalfängers (vgl.: DE 100 29 915). In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die DNA nicht chemisch, sondern enzymatisch umgewandelt. Dies ist etwa durch Einsatz von Cytidin-Deaminasen denkbar, die un- methylierte Cyidine schneller umsetzen als methylierte Cytidine. Ein entsprechendes Enzym ist kürzlich identifiziert worden (Bransteitter et al . : Activation-induced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single- stranded DNA but requir-es the action of RNase. Proc Natl Acad Sei U S A. 2003 Apir 1;100(7) :4102-7) .
Im zweiten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in die vorbehandelte DNA ein Promotor eingeführt, der eine Umwandlung der zu untersuchenden DNA in RNA ermög- licht. Dem Fachmann sind hierzu unterschiedliche Verfahren bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine PCR durchgeführt, bei der einer der Primer eine Promotorsecjuenz trägt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird das NASBA-Verfahren oder ein anderes auf Transkription basierendes Amplifikations- verfahren benutzt, bei dem ausgehend von DNA RNA-
Amplifikate hergestellt werden können (siehe im einzelnen unten) . Es ist aber auch denkbar, andere Amplifikations- verfahren, etwa das Rolling Circle-Verfahren, zu benutzen. Bevorzugt erfolgt die Amplifikation methylierungs- unspezifisch. Es ist jedoch auch möglich, einen größeren Sequenzbereich methylierungsspezifiseh zu amplifizieren und bestimmte Cytosinpositionen innerhalb dieser Sequenz mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens zu analysieren. Die Kombination von methylierungsspezifischer Ampli- fikation und RNA Transkription ermöglicht es aus einer Mischung verschiedener DNAs zunächst die in der Primer- bindungssequenz methylierte Subpopulation zu vermehren und diese genauer auf ihre Methylierung hin zu untersuchen. Dadurch können spezielle Methylierungsmuster genau- er untersucht werden, etwa bei der Untersuchung von Sequenzen die an ihrem 5 ■ -Ende methyliert und am 3 ' -Ende unmethyliert vorliegen. Diese Sequenzen sind besonders interessant für die Ausbreitung der DNA-Methylierung.
Weiterhin ist es denkbar, die Promotorsequenzen unabhängig von einer Amplifikation an die DNA zu ligieren. Dies ist etwa möglich, wenn die Bisulfit-DNA in einen Vektor kloniert wird, der bereits einen Promotor trägt. Eine Li- gation ohne vorherige Amplifikation hat dann den Vor- teil, dass die Menge an RNA., die später durch die Transkription erzeugt wird, in einer linearen Abhängigkeit zu der eingesetzten DNA steht. Die PCR-basierten Verfahren führen dagegen zu einer exponentiellen Amplifi- kation, was eine Quantifizierung erschweren könnte.
Als Promotoren werden bevorzugt 17- , T3- oder SP6- Sequenzen eingesetzt. Es können aber auch andere RNA- Polymerase-Promotoren verwendet werden. Die Promotorsequenzen sind dem Fachmann bekannt .
Im dritten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Transkription. Die hierzu, erforderlichen RNA- Polymerasen richten sich nach den eingebauten Promotorsequenzen. Die Transkriptionsbedingungren sind von der ein- gesetzten Polymerase abhängig. Einzelheiten sind dem Fachmann bekannt .
Im vierten Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Transkripte analysiert . Aus den Ergebnissen kann dann im fünften Schritt auf den ursprünglichen Methylierungsstatus der untersuchten DNA geschlossen werden. Die Analyse der Transkripte kann über eine Vielzahl von bekannten molekularbiologischen Verfahren geschehen, etwa über Hybridisierung oder Sequenzierung. In einer bevor- zugten Ausführungsform erfolgt die Detektion über eine Hybridisierung an einen Mikroarray. Ein Mikroarray- basierter Nachweis kann mit Transkripten einfacher sein als mit DNA, da die RNA bereits in einzelsträngiger Form vorliegt und daher vor der Hybridisierung nicht mehr de- naturiert werden muß. Dabei sind dem Fachmann Maßnahmen bekannt, die einen Abbau der RNA verhindern. Für die Hybridisierung an einen Array wird die RNA zuvor mit einer Markierung, bevorzugt einer Fluoreszenzmarkierung, versehen. Dies kann etwa mit Hilfe eines Transkripti- onskits erfolgen, bei dem AminoAllyl markierten Nucleoti- den in die RNA eingebaut werden (Amino Allyl MessageAmp™ Kit; Ambion, USA) . Die AminoAllyl Ntikleotide werden von den RNA-Polymerasen mit nahezu gleicher Effizienz wie natürliche Nukleotide verwendet. Nach der Transkription
wird an die modifizierten Nukleotide ein Farbstoff gekoppelt. Weitere VerJEahren zur Markierung von RNA gehören zum Stand der Technik (vgl. etwa: Monnot et al. : Labeling during cleavage (L.DC) , a new labeling approach for RNA. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2001 Apr-Jul;20 (4- 7): 1177-9. Proudnilko and Mirzabekov: Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling. Nucleic Acids Res. 1996 Nov 15;24(22) :4535-42) .
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Analyse der RNA über massenspektrometrische Verfahren, etwa über Elektrospray oder PSD-MassenspeJ trometrie (vgl.: Little et al.: Veri- fication of 50- to 100-mer DNA and RNA sequences with high-resolution mass spectrometry. Proc Natl Acad Sei U S A. 1995 Mar 14 ; 92 (6) :2318-22) . Die Verwendung von RNA statt DNA hat hier den Vorteil, dass die RNA während der massenspektrometrischen Analyse stabiler ist ind über bessere Flugeigenschaften verfügt als DNA. In einer wei- teren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt eine Analyse der RNA über ein RNA- Protection-Assay. Einzelheiten sind dem Fachmann bekannt. Es sind weitere Analysemethoden denkbar, die die Ein- zelsträngigkeit d x RNA oder ihre besonderen chemischen oder physikalischen Eigenschaften ausnutzen und daher vorteilhafter sind als ein direkter Nachweis der DNA. Die Verwendung dieser Methoden ist ebenfalls Teil dieser Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die RNA vor der Analyse chemisch oder enzymatisch fragmentiert. So kann insbesondere die massenspektrometrische Analyse erleichteret werden (vgl.: Krebs et al. 2003,
a.a.O.; Seichter et al. 2004, a.a.O.; Hartmer et al.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen - Einsatz auf Transkription basierender Amplifikationsverfahren
In einer besonders bevorrzugten Ausführungsform des erfira- dungsgemäßen Verfahrens erfolgen die Einführung der Pro- motorsequenz und die Transkription parallel mittels einem auf Transkription basierenden Amplifikationsverfahrens . Dementsprechend läßt sich diese Ausführungsform wie folgt beschreiben: Verfahren zur Analyse -von Cytosinmethylierungen in DNA, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: 1) die zu untersuchende DNA wird so umgesetzt, dass 5- Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt wird, die sich im Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet, 2) die umgewandelte DNA wird mittels eines aixf Transkription basierenden Amplifikationsverfahrens amplifiziert, 3) die Amplifikate weirden analysiert, 4) es wird auf den Methlyierungsstatus der untersuchten DNA geschlossen.
Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren können hierzu die oben genauer beschriebenen Proben dienen. Die Bisulfitumwandlung erfolgt ebenfalls wie oben
dargestellt. Im zweiten Schritt dieser Ausführungsform erfolgt eine Amplifikation der umgewandelten DNA mittels eines auf Transkription basierenden Amplifikationsverfah- rens, insbesondere mittels NASBA™, 3SR™ oder TMA™. Diese Verfahren sind dem Fachmann im Deta.il bekannt (vgl. etwa Deiman et al 2002, a.a.O.) . Eine Anwendung dieser Verfahren auf die Untersuchung von Cytosin-Methylierungen ist allerdings - soweit ersichtlich - noch nicht beschrieben.
Die auf Transkription basierenden Amplifikationsverfahren sind der retroviralen Replikation n-achgeahmt . Die Amplifikation der Zielsequenz erfolgt in der Regel mittels zweier Primer und dreier Enzyme . Ober einen der Primer wird in die Zielsequenz ein T7-Pzromotorsequenz einge- führt, über den dann mittels einer T7-Polymerase RNA generiert werden kann. Die RNA wirrd über eine Reverse Transkriptase wiederum in DNA umgewandelt, und zwischenzeitlich auftretenden RNA-DNA-Internαediate werden mittels einer RNAse-H abgebaut. Die Amplifϊikation erfolgt iso- therm, in der Regel bei 41°C. Die generierten Amplifikate können über eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden de- tektiert werden, etwa über Gelelektrophorese, diverse chromatographische Verfahren oder die Verwendung von markierten, insbesondere fluoreszenzmaxkierten Sonden. Auch der Einsatz von Real-Time-Sonden (l olecular Beacon) ist inzwischen beschrieben (vgl.: Deiman et al 2002, a.a.O.). In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis über methylierungsspezische Sonden, die spezifisch nur an Amplifikate mit einem bestimmten Methylierungsstatus bin- den.
Dem Fachmann ist bekannt, wie er die oben beschriebenen Verfahren durchzuführen hat. Insbesondere sind ihm die Reaktionsbedingungen, die Reaktionskomponenten, das Design der Primer und die Analyseverfahrten bekannt (zur Ü- bersicht siehe: Deiman et al 2002, a.a_o) .
Erfindungsgemäß werden die auf Transkrription basierenden Amplifikationsverfahren angewendet, um spezifisch die DNA eines bestimmten Methylierungsstatus nachzuweisen. Dies ist zum einen über eine methylierungsspezifische Amplifi- kation mittels methylierungsspezifisch^r Primer oder me- thylierungsspezifischer Blockeroligon-ukleotide möglich (zu den Blockern siehe im einzelnen unten) . Daneben ist es auch denkbar, die DNA methyliermngsunspezifseh zu amplifizieren, aber die Amplifikate mittels methylierungsspezifischer Sonden nachzuweisen. Es ist auch möglich, methylierungsspezifische Amplifkation und methylierungsspezifische Detektion zu kombinierren.
Das Prinzip der Verwendung und des Designs methylierungsspezifscher Primer ist dem Fachmann insbesondere aus dem sogenannten „MSP-Verfahren" (methylierungsspezifische PCR) bekannt (vgl.: Herman et al 1996, a.a.O.). Methylierungsspezifische Primer binden bevorzugt nur an diejenige DNA, die den Methylierungsstatus aufweist, der nachgewiesen werden soll. Dementsprechend tragen die methylierungsspezifische Primer mindestens ein CpG-Dinukleotid (für den Nachweis methylierter DNA) bzw. ein methylierungsspezifisches TG oder CA-Dinukleotid (für den Nach- weis nicht-methylierter DNA auf den beiden möglichen DNA- Strängen) . Die Prinzipien zum Design der methylie-
rungsspezifischen Primer sind dem Fachmann bekannt: Je höher die Anzahl der methylierungsspezif!sehen Dinukleo- tide und je kürzer die Länge der Primer, desto höher ist die Spezifitat der Amplifikation. Auf deir anderen Seite ist der Anwendungsbereich der Verfahren aufgrund der Se- quenzanforderungen umso stärker eingeschränkt , je mehr methylierungsspezifische Dinukleotide in den Primern enthalten sein sollen. In der Regel werden bei MSP Primer 1 bis 4 methylierungsspezifischen Dinukleotiden verwendet .
Die aus der MSP bekannten Kriterien zum Prrimerdesign gelten im Prinzip auch für das erfindungsgeinäße Verfahren. Hier ist allerdings zu berücksichtigen, dass die Amplifi- kation isotherm bei nur 41°C erfolgt. Daher müssen die Primer im Vergleich zu MSP mehr methylieirungsspezifische Dinukleotide enthalten, um eine vergleich-bare Spezifitat zu erreichen.
Im Prinzip ist es erfindungsgemäß ausreichend, wenn nur einer der beiden Primer methylierungsspezifiseh konstruiert ist. Es ist jedoch bevorzugt, wenn beide Primer methylierungsspezifiseh sind.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen - Einsatz auf Transkription basierender Amplifikationsve-rfahren in Kombination mit methylierungsspezifischen Blockermolekülen.
Wie oben bereits beschrieben besteht insbesondere für diagnostische Anwendungen ein großen technisches Bedürfnis an Verfahren, die in der Lage sind, spezifisch Methy-
lierungsmuster nachzuweisen, wenn in der Probe neben der nachzuweisenden DNA ein starker Hintergrund von DNA derselben Sequenz, aber eines unterschiedlichen Methylie- rungsmusters vorliegt. Hier besteht insbesondere die Ge- fahr falsch-positiver Ergebnisse. Eine Möglichkeit, um die Spezifitat der Amplifikation zu erhöhen, ist die Verwendung von methylierungsspezifischen Blockermolekülen. Diese Blocker binden spezifisch an die Hintergrund-DNA und verhindern so deren Amplifikation. Ein solcher Ein- satz von Blockern in einer methylierungsspezifischen PCR ist bereits mehrmals beschrieben (sog. HeavyMethyl™- Verfahren,PCT/EP02/02572) . Die Verwendung von methylierungsspezifischen Blockern hat mehrere Vorteile im Vergleich zur Verwendung methylierungsspezifischer Primer (siehe: Cottrell et al 2004) .
Die folgende besondere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kombiniert zum ersten Mal die Amplifikation bisulfitierter DNA mittels eines auf Transkription basierenden Amplifikationsverfahrens mit dem Einsatz methylierungsspezifischer Blocker. Diese Ausführungsform läßt sich wie folgt beschreiben:
Verfahren zur Analyse von Cytosinmethylierungen in DNA, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Schritte durchgeführt werden: 1) die zu untersuchende DNA wird so umgesetzt, dass 5- Methylcytosin unverändert bleibt, während unmethyliertes Cytosin in Uracil oder in eine andere Base umgewandelt, die sich im Basenpaarungsverhalten von Cytosin unterscheidet,
2) die umgewandelte DNA wird mittels eines auf Transkription basierenden Amplifikationsverfahr-ens amplifiziert, wobei die Amplifikation in Gegenwart mindestens eines methylierungsspezifischen Blockzer- moleküls stattfindet, das spezifisch an die Hinter- grund-Nukleinsäure bindet, und deren Amplifika ion behindert , 3) die Amplifikate werden analysiert, 4) es wird auf den Methlyierungsstatus der untersuch-ten DNA geschlossen.
Unter „Hintergrund-Nukleinsäure" ist dabei eine Nukle in- säure zu verstehen, die auf eine DNA zurückzuführen ist, die über dieselbe Sequenz, aber einen anderen Methyl ie- rungsstatus als die nachzuweisende DNA verfügt. Da die auf Transkription basierende Amplifikation überwiegend über RNA-Intermediate erfolgt, können methylierungsspe zi- fische Blocker an die Hintergrund-RNA binden, und de-ren Amplifikation verhindern. Gleichwohl erfolgt der Ampliü- kationszyklus auch über eine Primerverlangerung. Dieser Schritt würde für die Hintergrund-DNA blockiert, wenn die Blocker an die Hintergrund-DNA bindet. Im optimalen Fs.ll blockiert der Blocker die Amplifizierung sowohl über die RNA wie auch über die DNA.
Im Prinzip ist für die oben beschriebene Ausführungsform die aus dem „Heavy-Methyl"™-Verfahren bekannte Blockertechnologie anwendbar. Diese ist im Detail in der WO- Anmeldung PCT/EP02/02572 beschrieben, auf die hier aus- drücklich verwiesen wird. Bei den Blockern handelt es sich bevorzugt um Oligonukleotide, es können aber auch
andere Moleküle, insbesondere PNA verwendet werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch RNA-Blocker eingesetzt werden, da RNA-RNA-Hybride besonders stabil sind. Die Blocker sind methylierungsspezifiseh, d.h. sie tragen mindestens ein CpG- bzw. ein methylierungsspezif- sches TG- oder CA-Dinukleotid (s.o. zu den Primern). Die Primer werden bevorzugt im Überschuss zum Reaktionsansatz gegeben. In besonderen Ausführungsformen werden zwei oder mehr Blocker verwendet, die vorzugsweise mit den Bin- dungssteilen der Primer überlappen, um so zusätzlich eine Amplifikation zu verhindern. Ausserdem können die Blocker chemisch so modifiziert sein, dass eine Verlängerung oder ein Abbau der Blocker durch die Polymerase im Zuge der Amplifikation nicht erfolgt (siehe im einzelnen: PCT/EP02/02572; Cottrell et al . 2004, a.a.o). Dem Fachmann ist bekannt, dass alle bekannten und insbesondere in den oben zitierten Veröffentlichungen beschriebenen Ausführungsformen der Blockertechnologie weitgehend auch auf die erfindungsgemäße Kombination aus auf Transkription basierenden Amplifikationsverfahren und Blockereinsatz anwenden lassen. Die entsprechenden Ausführungsformen sind daher auch Teil dieser Erfindung.
Zwar der Einsatz von Blockern in der methylierungsspezi- fischen PCR schon bekannt, das erfindungsgemäße Verfahren bietet jedoch einen entscheidenden Vorteil gegenüber den bereits beschriebenen Verfahren. Die Blockeroligonukleo- tide binden an die Hintergrund-RNA und bilden so RNA-DNA- Hybride. Der RNA-Teil dieser Hybride kann im Reaktions- zyklus durch das RNAse H-Enzym abgebaut und somit der gesamten Amplifikationsreaktion entgültig entzogen werden.
Der Einsatz von Blockern führt hier also nicht - wie bei dem bekannten Heavy-Methyl™-Verfahren - nur zu einer Blockierung der Amplifikation der Hintergrund-Nukleinsäure, sondern darüberhinaus zu einem Abbau der Hintergrund- Nukleinsäure . Hieraus resultiert zu eine erhöhten Spezifitat der Reaktion.
In dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Amplifikation sowohl mittels methylie- rungsspezifischer Primer (s.o.) wie auch mittels methy- lierungsunspezifischer Primer erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden methylierungsunspezifische Primer eingesetzt.
Die Amplifikation erfolgt in Gegenwart mindestens eines methylierungsspezifischen Blockeroligomers. Diese tragen dementsprechend mindestens eine CpG-Position bzw. eine methylierungsspezifische TG oder CA- Position. Bevorzugt tragen die Oligomere 3-5 methylierungsspezifische Positi- onen. Bevorzugt werden Oligonukleotide verwendet, da die entsprechenden Hybride aus Blocker und RNA besonders effektiv von der RNAse-H erkannt werden können. Die Blocke- roligonukleotide sind bevorzugt zwischen 10 bis 25 Nukle- otide lang. Die Blocker werden im Reaktionsansatz im Ü- berschuß zu den Primern hinzugegen, besonders bevorzugt in einer 3 bis 15-fach höheren Konzentration.
Die Blocker können chemisch am 3' und/oder 5 '-Ende modifiziert sein, um eine Verlängerung bzw. einen Abbau der Blocker zu verhindern. Einzelheiten sind dem Fachmnn bekannt (PCT/EP02/02572) .
Die Amplifikation findet dann unter den oben beschriebenen Bedingungen statt. Bevorzugt wird eine NASBA-Reaktion durchgeführt. Dementsprechend trägt einer der Primer ei- nen T7-Promotor, der als Transkriptionsstartpunkt für die RNA-Polymerase dient. Der Primer hybridisiert an den (+) Strang der Zielsequenz. Hierzu erfolgt in der Regel ein kurzer Erhitzungsschritt. Der Primer wird durch die Reverse Transkriptase unter Bildung eines DNA- Doppelstranges verlängert. Nach einem weiteren Erhitzungschritt kann der zweite Primer an die soeben generierten (-) DNA-Strang binden. Durch eine weitere Prime- rextension wird dann ein DNA-Doppelsträng gebildet, der ein vollständigen T7-Promotor trägt. Die Bindung der me- thylierungspezifischen Blocker an die Hintergrund-DNA blockiert hier eine Verlängerung der Hintergrund-DNA. Aus dem T7-Promotor heraus werden anschließend Transkripte generiert, die über RNA-DNA-Hybride wiederum in DNA- Doppelstränge umgewandelt werden. Dabei binden die methy- lierungsspezifischen Blockeroligonukleotide wiederum an die Hintergrund-RNA und verhindern so deren Amplifikation. Der RNA-Teil der gebildeten Blocker-RNA-Hybride wird dabei von der RNAse H abgebaut . Die Hintergrund-RNA steht daher für weitere Amplifikationsrunden als Templat nicht mehr zur Verfügung. Die Amplifikation der nachzuweisende
DNA/RNA wird dagegen von den Blockern nicht beeinträchtigt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Detektion der Ampli- fikate mit Hilfe von Real-Time-Sonden. Eine Real-Time- Detektion von NASBA-Amplifikaten mit Hilfe von Molecular beacons ist bereits beschrieben (Deiman et al 2002, a.a.O.) . Es sind aber auch die Verwendung anderer Real-
Time-Sonden denkbar, insbesondere der Einsatz von Light- cycler™-Sonden. Bevorzugt sind diese Sonden methylierungsspezifiseh, d.h. sie tragen zumindest ein methylierungsspezifisches Dinukleotid (s.o.). Einzelheiten zum Aufbau entsprechender Sonden sind dem Fachmann bekannt (vgl.: PCT/EP02/02572; US 6,331,393)
Die besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung methylierungsspezif- scher Blockeroligonukloetide ist in Tabelle 1 dargestellt. Dort findet sich auch ein Vergleich zu dem bereits bekannten NASBA-Verfahren. Besonders bevorzugte Ausführungsformen - Analyse über Fragmentierung der RNA
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die RNA vor der Analyse chemisch oder enzymatisch fragmentiert. So kann insbesondere die massenspektrometrische Analyse erleichtert werden (vgl.: Krebs et al . 2003, a.a.O.; Seichter et al . 2004, a.a.O.; Hartmer et al . 2003, a.a.O.).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen Verfahrens wird die RNA vor der Analyse in Abhängigkeit von dem Methylierungsstatus der DNA fragmentiert. Aus dem Fragmentierungsmuster kann dann auf das Methylierungsmuster geschlossen werden. Grundlage für die Möglichkeit einer methylierungsabhangigen Fragmentierung ist die Bisulfit-Umwandlung (bzw. eine analoge chemische oder enzymatischen Umwandlung) in Kombination mit einer Amplifikation. Hierdurch ist es möglich, Nukleinsäuren zu
generieren, die Cytosine oder Guanine exakt nur an den Stellen tragen, an denen sich in der ursprünglichen DNA ein Methylcytosin befand. Die Nukleinsäuren werden dann spezifisch an den C- bzw. G-Positionen geschnitten. Es ergeben sich dann für den ursprünglichen Methylierungs- zustand spezifische Fragmentierungsmuster, die über unterschiedliche Methoden analysiert werden können.
Bei denr Bisulfitumwandlung werden zunächst alle Cytosine in Uracil überführt, während methylierte Cytosine unverändert bleiben. Es entstehen so zwei DNA-Stränge, die nicht mehr zueinander komplementär sind. Nach einer Amplifikation allerdings gibt es wieder zwei komplementäre DNA-Stränge. Einer der Stränge enthält nur an den Stellen Cytosine, an denen sich in ursprünglichen DNA Me- thylcytosine befanden. Dieser Strang wird im folgenden als G-ireich bezeichnet, da er an Cytosinen vergleichsweise arm ist. Wurde in diesen G-reichen Strang eine Promo- torsequenz eingeführt, so kann ein komplementäres - nun C-reiches - RNA Molekül transkribiert werden. In diesem
C-reichen Molekül sind nur an den Stellen Guanine vertreten, an denen sich in der ursprünglichen DNA Methylcyto- sine befanden. Die Guanine bilden in diesem RNA Transkaript also exakt den Methylierungsstatus der Ur- sprungs-DNA ab. Entsprechend kann ein RNA-Molekül generiert werden, bei dem alle Cytosine ein Methylcytosin widerspiegeln. Die Guanin- oder Cytosinpositionen können dann spezifisch geschnitten werden. Hierzu sind sowohl enzymatische wie auch chemische Verfahren denkbar. Zur spezifischen enzymatischen Spaltung an G-Positionen wird besonders bevorzugt das Enzym RNAse Tl eingesetzt (vgl.:
Hartmer et al. 2003, a.a.O.; Krebs et al . 2003, a.a.O.). Das Enzym ist von verschiedenen Herstellern kommerziell verfügbar (z.B. Röche Diagnostics Mannheim, Deutschland). Eine spezifische Spaltung von RNA an C-Positionen ist et- wa mittels der RNAse-A möglich, sofern in der Transkription chemisch modifizierte Uracil-Ribonukleotide eingesetzt werden (vgl.: Krebs et al.2003, a.a.O.). Eine spezifische chemische Spaltung an C- oder G-Positionen ist mit Hilfe unterschiedlicher Reagenzien möglich (vgl . : Peattie: Direct chemical method for sequencing RNA. Proc Natl Acad Sei U S A. 1979 Apr; 76 (4) : 1760-49) ; Krebs et al. 2003, a. a.o. ) .
Durch die Spaltungen ergeben sich spezifische Fragmentie- rungsmuster , die der örtlichen Verteilung der Methylcyto- sine auf der ursprünglich zu untersuchenden DNA entsprechen. Jedes entstehende Fragment stellt dabei den Bereich zwischen zwei methylierten Cytosinen in der Ursprungs-DNA dar. Die Anzahl der entstehenden Fragmente korreliert di- rekt mit der Anzahl der methylierten Cytosine. Die Eigenschaft, dass nur die ursprünglich methylierten Positionen Angriffspunkt für eine Fragmentierung sind, stellt einen entscheidendes Merkami dieser besonders bevorzugten Ausführungsform dar. Denn bei den bekannten Verfahren zur Mutations/ Polymorphismen-Analyse ist die Anzahl der Fragmentierxingsstellen unabhängig von der Sequenz der Ausgangsprobe. Es entstehen nach einer Fragmentierung folglich immer die gleiche Anzahl an Fragmenten, die sich nicht in der Anzahl der Nukleotide, sondern nur in der Basenzusammensetzung unterscheiden. Dies führt in der Regel zu eher kleinen chemisch-physikalischen Unterschieden
der Fragmente, die während der Analyse unter Umständen nicht mehr aufgelöst werden können. Zusätzlich ist diese Fragmentierung an sequenzunspezifischen Stellen dadurch gekennzeichnet, dass tendenziell sehr viele Fragmente entstehen (statistisch wird jedes vierte Nukleotid geschnitten) , die damit sehr klein und schwer analysierbar sind. Insbesondere bei einer chromatographischen Analyse sind diese kleinen Fragmente nicht unterscheidbar.
Die hier beschriebene Methode überwindet diese Nachteile. Darüber hinaus beinhaltet sie einen weiteren entscheidenden Vorteil . Da die Fragmentierung nur an ursprünglich methylierten Stellen erfolgt, stellt jedes entstehende Fragment die Sequenz zwischen den benachbarten methylierten Cytosinen dar. Befinden sich dazwischen beispielswei- se unmethylierte CpG Stellen, so kann für ein einziges Ausgangs-DNA-Molekül eine gekoppelte Aussage über die Me- thylierung dieser CpGs getroffen werden. Desweiteren be- einflusst eine Fragmentierung an einer ursprünglich methylierten Stelle auch das benachbarte Fragment, da of- fensichtlich zwei benachbarte Fragment Aufschluss über dieselbe CpG Stelle geben. Damit kann auch dieses benachbarte Fragment und der damit widergespiegelte Methylie- rungszustand einem einzigen Ausgangs-DNA-Molekül zugeordnet werden. Auf diese Weise kann z.B. die genetische Prä- gung, die allelspezifisch erfolgt, oder die Aktivität von Methyltransferasen genauer untersucht werden. Diese eindeutige Zuordnung des Methylierungsstatus zu einem einzigen Ausgangsmolekül kann mit methylierungsunspezifischen Fragmentierungen nicht getroffen werden. Dies ist gerade bei DNA-Mischungen von Interesse, die in der Regel ein komplexes Gemisch an verschieden methylierten DNA Molekü-
en enthält, von denen meistens nur Subpopulationen von Interesse sind. Im Vergleich zu anderen fragmentierungsbasierten Methoden tritt bei der hier beschriebenen Methode eine eher wenig -komplexe Fragmentierung auf, da nur an ursprünglich methylierten CpG Stellen geschnitten wird. Dies ermöglicht im Umkehrschluss die Analyse von eher komplexen Analyten. Damit können zum Beispiel mehrere unterschiedliche Loci im Genom simultan in der gleiche Reaktion untersucht wer- de. Diese Methode ist daher multiplexierbar, was ein entscheidender Vorteil ist, wenn nur eine limitierte Menge an Ausgangsprobenmaterial zur Verfügung steht. Andere .Fragmentierungsmethoden erzeugen eine große Menge kleiner Fragmente, diese können in einer Multiplexreaktion nicht mehr den einzelnen Loci zugeordnet werden.
Über eine geeignete Analyse der entstandenen Fragmente Jcann der Methylierungsstatus aller in dem DNA-Amplifikat enthaltenen Cytosine festgestellt werden (vgl. Abb 1). Hierfür stehen unterschiedliche Verfahren zur Verfügung. n einer bevorzugten Ausführungsform werden massenspektrometrische Verfahren, insbesondere MALDI-TOF, eingesetzt. Über die genaue Masse der Fragmente und die Kenntnis der Sequenz der Ursprungs-DNA kann so exakt be- stimmt werden, welche zwei Cytosine - nämlich die das Fragment eingrenzenden - methyliert waren. Einzelheiten zur MALDI-TOF Analyse sind dem Fachmann bekannt. Insbesondere sind in der US-Patentanmeldung US20030129589 eine Vielzahl von Möglichkeiten zur massenspektrometrischen Analyse angegeben, die in vielen Fällen entsprechend für
das erfindungsgemäße Verfahren anwendbar sind. In anderen bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die Analyse des Fragmentierungsmusters der RNA über elektrophoretische oder chromatographische Methoden (z. B. Kapillargele- lektrophorese oder HPLC) . Diese Verfahren ermöglichen eine Quantifizierung der entstandenen RNA Fragmente durch Integration der Signalintensitäten (dem Fachmann ist dies bekannt) . Liegt die zu untersuchende DNA als ein Gemisch von verschieden methylierten Spezies vor, so kann über diese Quantifizierung ein Rückschluß auf das vorliegende Mischungsverhältnis dieser Spezi getroffen werden.
Andere fragmetierungsbasierte Verfahren sind für solche elektrophoretischen und chromatographischen Analysemethoden nur beding geeignet, da sich bei der methylierung- sunspezifischen Fragmentierung nur die Basenzusammensetzung und nicht die Basenanzahl in einem Fragment unterscheidet. Dies kann z.B. mit Kapillargelelektrophorese nicht aufgelöst werden. Dies stellt einen weiteren Vorteil der beschriebenen Methode dar.
In einer besonders bevorzugten Aus ührungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden neben dem Promotor zusätzlich Kontrollsequenzen in die DNA eingeführt, an Hand deren die Vollständigkeit der Fragmentierung überprüft wer- den kann. Trägt etwa der G-reiche Primer die Kontrollsequenz „TCTTTTC", so resultiert eine RNA mit der zusätzlichen Sequenz "GAAAAGA" . Alle anderen Guanine in dieser RNA stammen aus methylierten Cytosinen in der ursprünglichen DNA. Über einen Nachweis der Kontrollsequenzfragmen- te läßt sich die Vollständigkeit der Fragmentierungsreaktion kontrollieren (vgl.: Beispiele; Abbildung 2).
Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren
Besonders bevorzugt werden die oben beschriebenen Verfah- ren zur Diagnose oder Prognose von Krebserkrankungen oder anderen mit einer Veränderung des Methylierungsstatus assoziierten Krankheiten verwendet. Hierzu gehören u.a. CNS-Fehlfunktionen, Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konse- quenzen von GSehirnschädigungen; psychotische Störungen und Persönlich ceitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des AtmungsSystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehl- funktion. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerdem zur Vorhersage von unerwünschten Ärzneimittelwir- kungen und zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Erfindungsgemäße Kits
Erfindungsgemäß sind auch folgende Kits:
Ein Kit, der aus einer Bisulfitreagenz -und aus mindestens einem Primern, der einen Promotor trägt, besteht.
Ein solcher Kit, der zusätzlich Enzyme und/oder weitere Komponenten zur Durchführung eines auf Transkription basierenden Amplifikationsbverfahren enthält.
Ein solcher Kit, der zusätzlich mindestens ein methrylie- rungsspezifsches Blockeroligomer enthält.
Ein Kit, der aus einer Bisulfitreagenz, Primern und einem Enzym, das RNA nukleotidspezifiseh schneidet, besteht und optional eine Polymerase und weiteren für eine Ampli ±ikation erforderlichen Reagenzien enthält.
Beispiele
Beispiel 1: Untersuchung des Promotorbereichs des humanen Adenomatosis Polyposis Coli (APC) Gens
Der Methylierungsstatus des Promotorbereichs des humanen Adenomatosis Poly osis Coli (APC) Gens (NM_000038.2) sollte untersucht werden. Verwendet wurde hierbei eine DNA, die durch ein Enzym, welches alle Cytosine im CpG- Kontext methyliert , künstlich methyliert wurde (Sssl Me- thyltransferase) . Nach einer Bisulfitbehandlung der DNA wurde ein Bereich des Promotors mittels einer PCR a pli- fiziert. Für die PCR wurden folgende Bedingungen gewählt: 1U (0,2 μl) HotStarTaq Polymerase (Qiagen) , 0,2 μl dNTP- Mix (je 25 mmol/1 dATP, dGTP, dCTP und dTTP, Fermentas) , 2,5 μl 10-fach PCR-Puffer (Qiagen), 2 μl Primermix: (je 6,25 μmol/1, MWG Biotech AG), 1 μl partiell desaminierte DNA (10 ng) , 19,1 μl Wasser, Temperaturprogramm: lO min
95° und anschließend 40 Zyklen mit 30 s 95°C, 45 s 55°C und 1:30 min 72°C. Für diese Amplifikation wurden folgende beiden Primer verwandt: TCTTTTCGGTTAGGGTTAGGTAGGTTGT (G-reich) (Seq ID1) und GTAATAC ACTCACTATAGGGAGACTACAC- CAATACAACCACATATC (C-reich) (Seq ID 2) . Der unterstrichene Teil des C-reichen Primers stellt dabei den Promotor für die T7-Polymerase dar. In dem G-reichen Primer ist noch eine zusätzliche Sequenz enthalten (unterstrichen) , die nach der Transkription des PCR-Produktes in ein RNA- Molekül am 3 '-Ende dieses Produkztes revers komplementär lokalisiert ist und damit nach der Abspaltung durch die RNase Tl ein Signal ergibt, welches die Vollständigkeit der Transkription anzeigt. Diese Sequenz stellt damit ein Kontrollfragment nach der Endomukleasebehandlung dar, welches unabhängig vom Methylierungsstatus immer entsteht. Für die Transkription des PCR-Produktes wurden folgende Bedingungen gewählt: 10 pΛ. PCR-Produkt , 5 μl 5- fach T7 RNA-Polymerase Puffer (Fermentas) , 1 μl T7 Polymerase (20 U/μl, Fermentas), 0,5 μl NTP-Mix (Fermentas, je 25 mmol/1) , 8,5 μl Wasser. Die Inkubation erfolgte 1,5 h bei 37°C. Anschließend erfolgte der RNase Verdau durch Zugabe von 2,5 μl RNase Tl (10 ü/ p.1 , Fermentas) bei einer 45-minütigen Inkubation bei 37 °C . Dieser Reaktionsansatz wurde dann mit ca. 20 mg „clean aresins" der Firma Seque- nom inkubiert, um die Na+- und Kπ--Ionenkonzentration der Lösung zur verringern. Schließlich wurden 0,5 μl des Mi- xes mit 0,5 μl 3-Hydroxypikolinsäure vermischt und mit einem Bruker Reflex 2 MALDI-TOF Massenspektrometer im negative Ionen Modus untersucht. Da3oei wurde der Reflektor- Modus verwendet.
Die Transkription des PCR-Produktes ergibt ein Produkt folgender Sequenz (Seq ID 3) : GGGAGACUA-CACCAAUACAACCACAU- AUCGAUCACGUACGCCCACACCCAACCAAUCGACGAACUCCCGACGAAAAUAAAA- AACGCCCUAAUCCGCAUCCAACGAAUUACACAACUACUUCUCUCUCCGCUUCCC- GACCCGCACUCCGCAAUAAAACACAAAACCCCGCCCAACCGCACAACCUACCU- AACCCUAACCGAAAAGA. Die "GGGAG" Sequenz zu Beginn dieses Moleküls stellt hierbei den verwendeten. Promotors der T7 Polymerase dar, welcher teilweise mit "transkribiert wurde. Die Sequenz "GAAAAGA" am Ende des R--NA-Moleküls resul- tiert aus der dem G-reichen Primer zusätzlich angehängten Kontrollsequenz. Alle anderen Guanine in diesem Molekül resultierten aus methylierten Cytosinen in der ursprünglichen DNA. Wäre diese DNA an diesen Stellen nicht methyliert gewesen, wären Adenine anstelle der Guanine zu fin- den. Die RNase Tl spaltet nun die RNA hinter dem Guanin und führt zu einem Fragmentierungsmust r, welches den Methylierungsstatus der ursprünglichen DNA widerspiegelt. Die entstehenden Fragmente sind mit ihiren entsprechenden m/z-Werten in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2: Fragmente und ihre m/z-Werte der RNA nach einem Verdau des APC-198 Transkripts mit RNase Tl.
In Abbildung 3 sind die mittels Maldi-TOF Massenspektro- metrie detektierten Fragmente gezeigt, die aus dem RNase Tl Verdau des Transkriptes resultierten. Dort ist zu erkennen, dass fast alle Fragmente nachgewiesen werden konnten, die nach Tabelle 2 charakteristisch für die vollständig methylierte DNA sind. Lediglich Fragmente kleiner als m/z 980 konnten nicht detektiert werden, da in diesem Bereich die für die Maldi-TOF Analyse verwendete Matrix ein zu großes Hintergrundsignal erzeugt. Mittels dieses Spektrums konnte nun eindeutig bewiesen werden, dass die ursprüngliche DNA an allen Cytosinen im CpG Kontext methyliert war.
Beispiel 2 : Untersuchung des Methylierungszustands des CDH13 Gens Der Methylierungszustand des CDH13-Gens sollte untersucht werden. Dazu wurden Sssl-methylierte DNA, unmethylierte
Phi-DNA und ein geklöntes methyliertes PCR-Amplifikat un_- tersucht. Zur Kontrolle wurde eine Sequenzierung durchgeführt. Das erfindungsgemäße Verfahren wurde wie oben beschrieben angewendet. Als Primer wurden folgende Sequen— zen benutzt: TCTTTTTCTTTGTATTAGGTTGGAAGTGGT (Seq ID4) ;
GTAATACGACTCACTATAGGGAGCCCAAATAAATCAACAACAACA (Seq ID5). Die Transkription der Amplifikate ergab folgende Produkte: Methylierte DNA: GGGAGCCCAAAUAAAUCAACAACAACAUCACGAA-
AACAUUAAAUAAAAACUAΆUAACCAAAACCAAUAACUUUACAAAACGAΆUUCCUUC- CUAACGCUCCCUCGUUUUACAUAACAAAUACGAAAUAAACACCUCGCGAAAAAC- GAACCCCGCGAAAAUAACAUCCCAUUUACUUCUUUAAACUAUUAAAACUCAACCU- CACAAAUCACGCUAAACAAUACCAACUAAUUCCACUUUUCCAAAAAAUAAAAUUA-
CACGAAAAΆCUAACGACCACUUCCAACCUAAUACAAAGAAAAAGA (Seq ID 6) ; Methylierter Klon: GGGAGCCCAAAUAAAUCAACAACAACAUCACAAAAA— CAUUAAAUAAAAACUAAUAACCAAAACAAUAACUUUACAAAACGAAUUCCUUCCU— AΆCGCUCCCUCGUUUUACAUAACAAΆUACGAAAUAAACACCUCGCGAAAAC- GAACCCCGCGAAAAUAΆCAUCCCAUÜUACUUCUUUAAACUAUUAAΆACUCAACCU— CACAAAUCACGCUAAACAAUACCAACUAAUUCCACUUUUCCAGAAAAUAAAAUUA- CACGAAAAACUGACGACCACUUCCAACCUAAUACAAAGAAAAAGA (SEQ ID7) _ Die entstehenden Fragmente sind mit ihren entsprechenden m/z-Werten in Tabelle 3 aufgeführt.
Abbildung 4 zeigt die mittels Maldi-TOF Massenspektro- metrie detektierten Fragmente, die aus dem RNase Tl Veir- dau des Transkriptes resultierten. Dabei konnten bei der künstlich aufmethylierten DNA alle Fragmente nachgewiesen werden, die charakteristisch für komplett methylierte DISTA (Tabelle 3, Spalte 1 und 2) sind, lediglich Fragmente kleiner 980 (m/z) und größer 15250 (m/z) konnten gerätebedingt nicht nachgewiesen werden. In Tabelle 3 (Spalte 3 und 4) ist zusätzlich die Fragmentierung der klonierten DNA gezeigt. Hierbei sind die im folgenden beschriebenen
Unterschiede zu der künstlich aufmethylierten DNA sichtbar. Das 8619,3 (m/z) Fragment ist nicht mehr detektier- bar. Dies liegt darin begründet, dass das Cytosin, welches im methylierten Zustand der zu untersuchenden DNA zu der Bildung des 8619,3 (m/z) und des 15723,7 (m/z) Fragmentes führen würde, offensichtlich nicht methyliert war. Dadurch entsteht ein 24021,8 (m/z) Fragment, welches dem Zusammenschluss dieser beiden Fragmente entspricht. Dieses Fragment konnte aber aufgrund seiner Größe gerätebe- dingt nicht detektiert werden. Bei der klonierten DNA sind mit dem 10103,1 (m/z) und dem 5166,2 (m/z) Fragment noch zwei Fragmente detektierbar, die zunächst nicht erwartet wurden. Ihre Entstehung resultiert aus einer - während der Bisulfitbehandlung der DNA - nicht stattge- fundenen Umwandlung eines Cytosines ausserhalb des CpG Kontextes. Dadurch hatte das erwartet 15253,3 (m/z) Fragment eine zusätzliche Schnittstelle, welche eben diese beiden Fragmente bedingt . Die gleiche Ursache hat auch das Vorhandensein des 2602,6 (m/z) Fragmentes bei der klonierten DNA anstelle des zu erwartenden 3566,2 (m/z) Fragmentes. Auch hier war wieder ein Cytosin ausserhalb des CpG Kontextes nicht bei der Bisulfitbehandlung desa- miniert worden und resultierte in einer Spaltung des 3566,2 (m/z) Fragmentes in ein 2602,6 (m/z) und ein 979,6 (m/z) (nicht detektierbar) Fragment. In Abbildung 4 ist zusätzlich noch das Spektrum der unmethylierten DNA gezeigt. Wie zu erwarten, treten hier neben dem 1991,3 (m/z) Fragment keine weiteren detektierbaren Fragmente auf, da das RNA Transkript der unmethylierten, bisulfi- tierten DNA keine weiteren Schnittstellen aufweist als die der bereits beschriebenen Kontrollsequenz am Ende des
Transkriptes. All diese Interpretationen konnten durch eine Sequenzierung bestätigt werden (Daten nicht gezeigt) .
Tabelle 3: Fragmente und ihre m/z-Werte der RNA nach einem Verdau des CDH13 Transkripts mit RNase Tl.
Beispiel 3 Analyse von klinischen Proben Um die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Analyse klinischer Fragestellungen zu zeigen, wurden zusätzlich mehrere Colon-Proben untersucht. Hierzu wurden jeweils zwei Tumor DNA-Proben mit einem hohen Methylie-
rungsgrad und zwei normale Colon-Proben mit einem geringen Methylierungsgrad ausgewählt. Jeweils 10 Klone der amplifizierten Promotorregion des CDH13 Gens wurden wie unter Beispiel 2 beschrieben analysiert und mit Sequen- zierungsdaten vergleichen (Abb 5) . Es zeigt sich eine sehr gute Korrelation zwischen beiden Methoden sowohl für die überwiegend methylierten (Tl, T2) wie auch für die überwiegend unmethylierten Proben (Nl, N2) . Teilweise war die Sequenzierung nicht in der Lage, den Methylie- rungsstatus in den Positionen 32, 258 and 269 zu detek- tieren. Diese Positionen befinden sich entweder nahe am Sequenzierungsprimer oder am Ende der Sequenz . Auf der anderen Seite erlaubte der begrenzte Messbereich des verwendeten MALDI-Spektrometers keine eindeutige Zuordnung aller CpG-Positionen. So kann die Abwesenheit eines Fragments nicht zwangsläufig als Abwesenheit der Methylierung an der untersuchten Position interpretiert werden, es sei denn diese Aussage ist durch den Nachweis eines längeren Fragments gerechtfertigt.
In den Klonen A und J der Probe Tl wird die Anwesenheit des Fragments 6+7 (m/z=5117) durch eine Methylierung an den Positionen 122 und 138, die die unmethylierte Position 136 einrahmen, verursacht. In dem Fall, dass mehrere benachbarte CpG-Positionen unmethyliert sind, werden die resultierenden Fragmente größer und damit schwerer zu de- tektieren. So erscheinen die Positionen 154 und 210 nicht analysierbar, da die entsprechenden Fragmente entweder so groß sind, dass sie sich nicht mehr verlässlich detektie- ren lassen, oder so klein sind, dass sie sich nicht mehr vom Hintergrundrauschen abheben. Dies stellt jedoch keine
grundsä zliche Einschränkung der Anwendbarkeit des erfin- dungsgemäßen Verfahrens dar. Denn inzwischen sind Maldi- Geräte bekannt, die RNA bis zu einer Länge von 2180 Nukleotiden analysieren können, und die in der Lage sind, RNA- oder DNA-Fragmente in der Länge von 50 bis 100 Nukleotiden zu sequenzieren (Berkenkamp et al . , Infrared MALDI mass spectrometry of large nucleic acids. Science, 281, 260-262, 1998; Little et al . Verification of 50- to 100-mer DNA and RNA sequences with high-resolution mass spectrometry. Proc Natl Acad Sei U S A, 92, 2318-2322, 1995) .
Beispiel 4 Direkte Analyse klinischer Proben Schließlich wurde ein Aliquot der bisulfitierten Colon- DNA-Proben direkt (ohne vorherige Klonierung) untersucht. Dazu wurde zunächst ein Standard aus unterschiedlichen Mischung-en methylierter und unmethylierter DNA (0, 20, 40, 50, 60, 80, 100% methyliert) hergestellt und analysiert (Abb 6) . Wie erwartet führt eine verringerte Methy- lierungsrate zu einer verringerten Intensität der detektierten Fragmente. Die gilt allerdings nicht für das Kontrollfragment (m/z = 1991) , das unabhängig von dem Methy- lierungsgrad gebildet wird und daher für die Signalnormalisierung verwendet werden kann. Im Vergleich zu dem Standard, zeigen die klinischen Proben eine andere Intensitätsrate. Dies ist drauf zurückzuführen, dass einige benachbarte CpG-Positionen eine stärkere Comethylierung aufweisen als andere. Dies ergab sich bereits aus der A- nalyse der Klone (s.o.). So zeigt das starke Signal für die Fragmente 6, 8, 9, 13 und 14 in der Tumor Probe Tl einen relativ hohen Grad an Comethylierung bei den Posi-
tionen 122, 136, 138, 145, 152, 154, 258 und 269. Hierbei handelt es sich um exakt die Positionen, die in den meisten analysierten Fällen eine Comethylierung aufweisen (Abb 5) . Die normalisierten relativen Intensitäten zeigen ein Minimum von 50% Methylierung in diesen Positionen. Dagegen ist die Abwesenheit eines Signals bzw. die Anwesenheit eines nur schwachen Signals für die Fragmente 1, 3, 4 und 5 darauf zurückzuführen, dass an den Positionen 32, 81, 96 und 104 nur ein geringer Grad an Comethylie- rung vorliegt . Diese Beobachtungen entsprechen den Klon- Daten aus Beispiel 2. Ein ähnliches Methylierungsmuster wurde für die Tumor-Probe T2 gefunden. Die geringere Intensität korrespondiert sehr gut mit der nur geringen Anzahl an Klonen, die in dieser Probe eine Comethylierung zeigen. Die normalen Colon Proben Nl und N2 zeigen weder bei der direkten Analyse noch bei der Klonanalyse eine Comethylierung. Insgesamt korrelieren die Ergebnisse der direkten Analyse der klinischen Proben sehr gut mit denen der Klonanalyse.
Die Comethylierung von Promotorregionen ist für viele klinische Fragestellungen von entscheidender Bedeutung. Wie in Abbildung 6 gezeigt, kann das erfindungsgemäße Verfahren die Anwesenheit von Comethylierungen in zwei oder mehr benachbarten Positionen nachweisen. Diese Selektivität stellt eine großen Vorteil gegenüber der direkten Bisulfit-Sequenzierung dar. Diese ist nicht in der Lage, zwischen spezifischen Methylierungsmustern und zufälliger Methylierung ohne klinische Bedeutung zu diffe- renzieren (vgl.: Song et al . : Hypermethylation trigger of
the glutathione-S-transferase gene (GSTP1) in prostate cancer cells. Oncog-ene, 21, 1048-1061, 2002) .
Beispiel 5: Kombination aus allelspezifischer Amplifikation und Tl RNAse-Charakterisierung
Es sollten Sequenz:en aus dem Homo sapiens v-erb-b2 e- rythroblastic leuke ia viral oncogene homolog 2 Gen (Pub- Med Referenznummer: NM_004448) untersucht werden. Dazu wurde DNA durch eine „molecular displacement amplificati- on" hergestellt. Da in der Amplifikation nur Cytosin, nicht aber Methylcytosin eingebaut wird, ist diese DNA arm an 5-Methylcytosin. Ein Teil dieser DNA wurde anschließend mittels der Sssl-Methylase behandelt. So ent- steht eine vollständig methylierte DNA. Anschließend wurde die DNA bisulfitiert und mit einer Polymerase Kettenreaktion sequenzspezifisch vervielfältigt. Dabei kamen Primer zum Einsatz, die in ihrer Sequenz Nukleotide enthielten, die nur in einem Bisulfit-Strang aus ursprüng- lieh methylierter DNA vorkommen. Diese Primer amplifi- zierten daher nur bisulfitierte methylierte DNA. Folgende Primer wurden eingesetzt: TCTTTTTCATATACGTGTGGGTATAAAATC (Seq ID 8) ; GTAATACGACTCACTATAGGGAGCAAAaaTCAaaCAaCAACGA (Seq ID 9) . Diese Primer wurden in einer Endkonzentration von je 0.25 μmol/1 mit lxfach QiagenHotStar Puffer, 0,2 mmol/1 dNTP (jedes dNTP), 0,04 U/μl HotStarTaq von Qiagen in 25 μl mit je 10 ng DNA Templat vermischt und PCR prozessiert . Dazu wurde folgendes PCR Programm verwendet : 95°C, 15 min; 95°C, 1 min; 55°C, 45 S; 72°C, 1:30 min; 72°C, 10 min; 41 Wiederholungen. Diese PCR Produkte wur-
den auf einem Agarose Gel analysiert (siehe Abbildung 7) . Nach der PCR Reaktion wurden 10 μl des PCR Mixes mit 15 μl Transkriptions-Mix vermengt. Dieser Mix war so geartet, dass folgende Endkonzentrationen in einer 25 μl Re- aktion verwendet wurden: lx MBI Fermentas T7-Puffer, 0.8 U/μl T7-RNA-Polymerase, 0,5 mmol/1 NTPs (jedes). Diese Mischung wurde 1 h bei 37° inkubiert und dann wurde 1 μl Tl RNAse [50U/μl] hinzu gegeben. Nach der Zugabe wurde erneut lh bei 37° inkubiert . Anschließend wurde der Rak- tionsansatz wie oben beschrieben massenspektrometriseh untersucht. Ein so erzeugtes Spektrum ist in Abbildung 8 dargestellt. Tabelle 4 zeigt die bei vollständiger Methylierung erwarteten und die bei der Messung detektierten Massen. Es wurden alle für den Fall der vollständigen Me- thylierung theoretisch vorhergesagten Massen, die größer als 1000 Da waren, detektiert. Die untersuchte Sequenz war komplett methyliert. Dies war nach der Behandlung mit Sssl Methylase zu erwarten. Die Masse 1991,2 Da AAAAAGp, welche aus dem 5 ' -Schwanz des G-reichen Primers resul- tierte zeigte die vollständige Transkription des PCR- Produktes .
Tabelle 4: Fragmente und ihre m/z-Werte der RNA aus Beispiel 3 nach einem Verdau mit RNase Tl.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 zeigt schematisch das Prinzip einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens . In die chemisch umgewandelte DNA wird ein Promotor eingeführt, aus dem heraus eine C-reiche RNA transkribiert wird. Durch einen Tl-RNase-Verdau entsteht ein methylierungsspezifisches Fragmentierungsnruster.
Abbildung 2 zeigt schematisch das Prinzip der in Abbildung 1 beschriebenen erfindungsgemäßen Ausführungsform unter zusätzlicher Verwendung eines „control tags".
Abbildung 3 zeigt das MALDI-TOF Massenspektrum des mit RNase Tl verdauten Transkriptes des künstlich methylierten APC-Genes (Bsp.l). Die Nummerierung der Peaks entspricht der aus Tabelle 2.
Abbildung 4 zeigt das MALDI-TOF Massenspektrum Beispiels 2.
Abbildung 5 zeigt das Ergebnis des Beispiels 3. Es wurden CpG-Methyl ierungen in 10 Klonen (A-J) ans zwei bisulfit- umgewandel ten Colon-Tumor-DNA-Proben (Tl, T2) und zwei normalen Colon DNA Proben (Nl, N2) analysiert. Gezeigt sind die Ergebnisse nach RNA-Spaltung und MALDI-TOF (links) bz-v. Sequenzierung (rechts) . Die schwarzen Kreise kennzeichnen die methylierten CpG-Positionen, die weissen
Kreise kennzeichnen die unmethylierten CpG-Positionen, die grauen Kreise kennzeichnen Fragmente , die nicht klar zuzuordnen waren, und die Kreuze kennzeichnen CpG-
Positionen , die der Analyse nicht zugänglich waren.
Abbildung 6 zeigt das Ergebnis des Beispiels 4. Es erfolgte eine direkte Analyse zweier bisulfit-umgewandelter Colon-Tumor-DNA-Proben (Tl, T2) und zweier normaler Co- lon-DNA-Proben (Nl, N2) über eine PCR, eine in vitro- Transkription, eine RNAse-Tl-Spaltung und. eine anschlies- sende MALDI-TOF-Analyse. Als Vergleich die DNA-Mischungen eines Standards (oben: Massenspektrum der Proben Tl, T2, Nl und N2; unten: Spektrum der DNA-Gemische mit unterschiedlichen, definierten Methylierungsgraden.
Abbildung 7 zeigt das Agarosegel des Beispiels 3. Dargestellt ist die Amplifikation von bisulfitierter DNA von methylierter und unmethylierter DNA mittels methylierungsspezifischen T7-Domänen-Primern. Die Primer sind so gewählt, dass sie auf genomischer DNA und auf bisulfi- tierter DNA -von unmethylierter DNA kein Produkt bilden. Sssl Methylase behandelte bisulfitierte DNA jedoch kann amplifiziert werden
Abbildung 8 zeigt das MALDI-TOF Spektrum des Beispiels 3.
Nachfolgend ist die Tabelle 1 wiedergegeben:
P 1437PC00-Tabellel .doc
P 1437PC00-Tabellel .doc DNA-NASBA Stand der Technik Erfinderisches Verfahren: DNA-NASBA zum sensitiven Nachweis von DNA-Methylierung
Denatuπeren von - Extrahierte DNA aus #1 Aufheizen des Gemisches - Bisulfit-konvertierte DNA aus #2 Wie beschneben im DNA- Templat-DNA und aller erforderlichen NASBA Stand der Technik Anlagerung von - DNA-Oligonukleotide (T7-taιled pnmer), die Nukleinsaure- - DNA-Oligonukleotide (T7-tailed pnmer), die in ihrem 5'- Oligonukleotiden in ihrem 5'-Bereich aus einer Basensequenz Komponeneten sollte Bereich aus einer Basensequenz bestehen, die der bestehen, die der Promotersequeπz der T7 sicher stellen, dass die Promotersequenz der T7 DNA abhängigen RNA - DNA abhängigen RNA -Polymerase DNA-Doppelhelix und alle Polymerase (T7DdRp) entspricht, und in ihrem 3'-Bereich (T7DdRp) entspricht, und in ihrem 3'-Bereιch Sekundar-Strukturen aus einer Sequenz bestehen, die revers komplementär aus einer Sequenz bestehen, die reversaulgebrochen werden, zum (+)-Strang der Zielsequenz innerhalb der Templat- komplementär zum seπse-Strang der welches eine wichtige DNA (typischerweise 15 bis 30 bp) ist. Letztere Sequenz Zielsequenz innerhalb der Templat DNA Voraussetzung für das (Zielsequenz im Templat) darf keine CpG- oder TpG- (typischerweise 15 bis 30 bp) ist. spezifische Binden der Position enthalten - DNA Oligonukleotide (2
nd pnmer), die eine Primer an deren revers- - DNA Oligonukleotide (2" pnmer), die eine Basensequenz enthalten, die revers- komplementare Basensequenz enthalten, die revers-komplementar zu komplementar zu einer Zielsequenz Sequenzen in der einem Sequenzbereich (typischerweise 15 bis 30 bp) des (typischerweise 15 bis 30 bp) des antisense Templat-DNA im (-)-Strangs der Zielsequenz innerhalb der Templat-DNA ist Strangs innerhalb der Templat-DNA ist und Anlagerungsschπtt bei und 50 bis 500 bp unterhalb (downstream) der 50 bis 500 bp unterhalb (downstream) der 41 °C ιst Zielsequenz des T7-taιled Oligonukleotids liegt Auch hier Zielsequenz des T7-taιled Oligonukleotids Abhängig von der DNA darf diese Zielsequenz keine CpG- oderTpG-Position liegt Zusammensetzung ist das enthalten. - falls der Nachweis mittels einer Deπatuπeren durch - DNA-NuKleotide (Blocker), die eine Sequenz enthalten, spezifischen Sonde erfolgt. Sonden- Erhitzen ein optionaler die revers komplementär zu einem Bereich im (-)-Strang Oligonukleotide (typischerweise Molecular Schritt, der nicht unbedingt der Zielsequenz sind welche TpG-Positionen aulweist und Beacon, oder LightCycler Sonden) welche notwendig ist typischerweise 4-30 bp lang ist Weiterhin sind diese Sequenzen enthalten (typischerweise 15 bis Blocker durch eine Modifikation ihres 3'-Endes vor 30 bp), die revers- komplementär zu einem Verlängerung geschützt Bevorzugterweise handelt es sense-Bereich der Target-DNA sind, der sich hierbei um Phosphoryherung. Diese Sequenz kann durch die Pnmer (je einen der oben mit der Sequenz des 2ten Primers überlappen beschriebenen) begrenzt ist - falls der Nachweis mittels einer spezifischen Sonde - NASBA-Reaktions-Puffer (typischerweise erfolgt: Sonden-Oligonukleotide (typischerweise Molecular enthaltend Tris, MgCI2, KCI, Dithiothreitol, Beacon, oder LightCycler Sonden) welche Sequenzen DMSO, jedes dNTP, jedes NTP) enthalten (typischerweise 15 bis 30 bp), die revers- komplementar zu einem (+)-Bereιch der Target-DNA sind, - Gerat zur Hitzeinkubation der der durch die Pnmer (je einen der oben beschriebenen) Reaktionsgefäße begrenzt ist und 1-4 CpG-Dinukleotide aufweist. Angemessene Mengen der oben - NASBA-Reaktions-Puffer beschπebenen Komponenten werden in geeigneten Reaktionsgefaßen gemischt und - Gerat zur Hitzeinkubation der Reaktionsgefaße für eine kurze Zeit (typischerweise 2 min) bei hohen Temperaturen (typischerweise 95°C) Appropπate amounts of components described above are und nachfolgend für eine kurze Zeit mixed in a suitable reaction vessel and incubated fora {typischerweise 2 min) bei mittleren short fjme (typically 2 min) at high temperatures (typically Temperaturen (typischerweise 41 °C) 95°C) and subsequently for a Short time (typically 2 min) at inkubiert medium temperatures (typically 41°C)
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