WO2005087798A1 - An der hydroxylgruppe midifizierte ‘d-ser!8-cyclosporine mit schaltbarer hemmung der proteinphosphatase calzineurin und dadurch gezielter manipulierbarkeit der immunosuppressiven wirkung unter beibehaltung der peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (ppi) inhibition z.b. zur behandlung von autoimmunerkrankungen - Google Patents

An der hydroxylgruppe midifizierte ‘d-ser!8-cyclosporine mit schaltbarer hemmung der proteinphosphatase calzineurin und dadurch gezielter manipulierbarkeit der immunosuppressiven wirkung unter beibehaltung der peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (ppi) inhibition z.b. zur behandlung von autoimmunerkrankungen Download PDF

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cyclosporin
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methyl
cyclosporin analogue
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Gunter Fischer
Yixing Zhang
Ria Baumgrass
Frank Erdmann
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MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/645—Cyclosporins; Related peptides
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • Pathobiochemical changes in the immune system are based on a large group of autoimmune diseases and chronic inflammation, such as the following diseases: systemic lupus erythematosus (SLE), chronic rheumatoid arthritis, type 1 diabetes, inflammatory bowel diseases, biliary cirrhosis, uveitis, multiple sclerosis and other diseases such as Crohn's disease, ulcerative colitis, builous pemphigoid, sarcosidosis, psoriasis, atopic dermatitis, ichthyosis or Graves opthalmopathy.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • chronic rheumatoid arthritis type 1 diabetes
  • inflammatory bowel diseases e.g., chronic rheumatoid arthritis
  • type 1 diabetes e.g., type 1 diabetes
  • inflammatory bowel diseases e.g., chronic rheumatoid arthritis
  • CsA cyclosporin A
  • HAV human immunodeficiency virus
  • CsA CsA nephrotoxicity and also side effects such as abnormal liver function, hirsutism, gum hypertrophy, tremor, hyperesthesia and gastrointestinal disorders and increase in the incidence for different tumors (e.g.: Herman M. Journal of Laboratory & Clinical Medicine 137 (1): 14-20, 2001; Landewe RBM et al. Nature Medicine 5 (7): 714, 1999).
  • Cyclosporins are a family of immunosuppressive compounds which can be obtained by fermenting various fungi, such as Tolypocladium inflatum (Lexicon of Biochemistry, Spektrumverlag, Germany). In general, the class of cyclosporins can be described as cyclic peptides with 11 amino acids (formula I).
  • Formula I The compound cyclosporin A (CsA) R 1 stands for methyl (4R) -4 - [(E) -2-butenyl] -4-methyl!
  • R 2 for ⁇ -aminobutyric acid
  • R 3 for N -Methyl-glycine
  • R 4 , R 6 , R 9 and R 10 for N-methyl-L-leucine
  • R 5 for L-valine
  • R 7 for L-alanine
  • R 8 for D-alanine
  • R 11 for N methyl-L-valine.
  • CsA The biological activity of CsA is diverse. CsA thus inhibits the activity of the enzyme peptidyl-prolyl cis / trans isomerase (PPIase) of the cyclophilin type, as is also shown in Example 1a.
  • PPIase peptidyl-prolyl cis / trans isomerase
  • These proteins also known as folding helper enzymes or as peptidyl prolyl cis / trans isomerases, hereinafter referred to as PPIases, are described in accordance with the recommendations of the "Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology"("EnzymeNomenclature", Academic Press, 1992) under the EC number 5.2.1.8.
  • CsA The protection of the lungs from CsA administration against hypoxic damage is also used therapeutically, for example: Matthew et al. American Journal of Physiology - Lung Cellular & Molecular Physiology. 20 (5): L786-L795, 1999). Such effects could be verified in various studies on larger patient groups (for example: Lock SH et al American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 153 (2): 509-514, 1996 ;.
  • Another important pharmacological effect of CsA is its strong inhibitory effect against retroviruses, especially against the human immunodeficiency virus (HIV). This effect has been demonstrated by a wide variety of authors, such as: Franke EK. and Luban J. Viroiogy.
  • CsA also has neuroprotective or regenerative properties in various neurological indications such as in Alzheimer's, amyotrophic lateral sclerosis, or Parkinson's.
  • the antimicrobial High KP. Transplantation. 57 (12): 1689-700, 1994
  • antiparasitic e.g.: Bell A. et al. General Pharmacoiogy. 27 (6): 963-71, 1996; Chappell LH et al. Parasitology. 105 Suppl: S25-40, 1992
  • the object on which the present application is based is to provide new cyclosporin derivatives which are immunosuppressive by inhibiting the
  • Protein phosphatase calzineurin act, but can be manipulated in a targeted manner and can lose this property while maintaining PPIase inhibition.
  • Another object of the invention is to provide pharmaceutical
  • Cyclosporin derivatives are suitable in medicine, and of auxiliaries with which
  • Another object of the invention is to provide processes with which the cyclosporin derivatives according to the invention can be produced.
  • the substances of the types Cs10 and Cs12 and their analogues can be prepared in large quantities in a wide variety of ways.
  • the analogues A10 and A12 listed below correspond in their properties with regard to the inhibition based on Cyp18 or calcineurin, the substances Cs10 and Cs12 and can be as follows:
  • R 2 represents ⁇ -aminobutyric acid (Abu) or a derivative of this amino acid fluorinated at one or more positions on the side chain; such as -NH-CH (CO) - wherein X 1 to X 5 independently of one another are H or F, with the proviso that at least one of the Xi, X 2 , X 3 , X4 and X 5 is F;
  • R 3 represents N-methyl-glycine (Sar), N-methyl-D-alanine or a fluorinated derivative thereof;
  • R 4 , R 6 , R 9 and R 10 independently represent N-methyl-L-leucine (MeLeu) or a fluorinated derivative thereof;
  • R 5 represents L-valine (Val) or a fluorinated derivative thereof
  • R 7 is L-AIa or a fluorinated derivative thereof
  • R 11 is L-MeVal or a fluorinated derivative thereof.
  • R 2 represents Abu
  • R 3 represents Sar or D-MeAla
  • R 4 , R 6 , R 9 and R 10 can independently represent MeLeu or a fluorinated analog
  • R 5 represents Val or a fluorinated analog
  • R 7 represents Ala
  • R 11 represents MeVal or a fluorinated analog.
  • Another embodiment are cyclosporin analogs of the formula (I), where R 1 is
  • R 2 represents Abu
  • R 3 represents Sar
  • R 4 , R 6 , R 9 and R 10 stand for MeLeu;
  • R 5 represents Val
  • R 7 represents Ala
  • R 11 stands for MeVal.
  • R 8 stands for (a) -NH-CH (CO) - Y-CH-X- (CH 2 ) m C (0) NH (CH 2 ) n -Z
  • X stands for O or S.
  • Y represents H or methyl
  • m has a value between 0 and 5
  • n is an integer between 3 and 10
  • Z represents NR 12 R 13 or NHC (0) OR 14 , where R 12 represents H, methyl, Ethyl, n-propyl, isopropyl or a photolyzable group and R 13 stands for H or a C1-C8-alkyl radical, and R 14 stands for an acid / base labile or an enzymatically cleavable group; or
  • the photolyzable group can be an optionally substituted nitroaryl group.
  • the optionally substituted nitroaryl group are 2-nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), ⁇ -carboxy-2-nitrobenzyl (CNB), 1- (2-nitrophenyl) ethyl (NPE), 1- (4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) ethyl (DMNPE) or 5-carboxymethoxy-2-nitrobenzyl (CMNB).
  • the acid-base labile or enzymatically cleavable group can be, for example, methyl, ethyl, methoxymethyl (MOM), -CH 2 CH 2 F, methylthiomethyl (MTIVI), ⁇ -glucuronide, D-glucopyranosyl, ⁇ -D-galactopyranosyl, tetra-O-acetyl-D -Glucopyranosyl, or tetra-O-acetyl- ⁇ -D-gafactopyranosyl.
  • MOM methoxymethyl
  • MTIVI methylthiomethyl
  • Preferred examples of compounds according to the invention are the [O- (NVOCNH (CH 2 ) 5 NHC (0) CH 2 -) D-Ser] 8 CsA or the [0- (NH 2 (CH 2 ) 5NHC (0) CH 2 -) D-Ser] 8 CsA.
  • the compounds of type A12 according to the invention can be prepared by conventional methods using [D-Ser] 8 or [D-Cys] 8 -CsA (D-Ser or D-Cys can also be replaced by other suitable amino acids), CPG- Bromoacetate and a compound of the formula NH 2 (CH 2 ) n NH-APG are prepared, where n is an integer between 3 and 10, APG is an amino protecting group and CPG is a carboxyl protecting group.
  • the compounds of the type A10 according to the invention can likewise be prepared by conventional methods using [D-Ser] 8 - or [D-Cys] 8 -CsA (D-Ser or D-Cys can also be replaced by other suitable amino acids), CPG -Bromoacetate and a compound selected from the group comprising NVOC, CNB, NPE, DMNPE and CMNB, where n is an integer between 3 and 10, APG means an amino protecting group and CPG means a carboxyl protecting group.
  • the usual protective groups can be used as amino or carboxyl protecting groups, as are known to the person skilled in the art, for example from N. Sewald, H.-D. Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Verlag Wiley-VCH are known.
  • examples for Amino protecting groups are carbobenzoxy, Boc, Fmoc, Bpoc, NPS, triphenylmethyl or tosyl.
  • Examples of carboxy protecting groups are methyl, ethyl, tert. Butyl, benzyl, nitrobenzyl or methoxybenzyl. Tert are preferred. Butyl as a carboxy protecting group and Boc as an amino protecting group. Examples of the preparation of the compounds according to the invention are given in Examples 7, 8 and 9.
  • the suitable method for changing the specificity of a substance of type A10 to a substance of type A12 is determined by the activatable grouping.
  • Such activatable groups and their suitable activation methods are known to the person skilled in the art and have been described in detail several times.
  • UV light with a wavelength of approximately 330 nm is preferably used to convert substance Cs10 into substance Cs12. choice
  • the light source and the duration of the irradiation of the substance in order to achieve the desired conversion from A10 to A12 naturally depend on other factors in addition to the photolabile group and strength of the light source used. For example, if A10 is in body fluids such as blood, parts of the light energy will also be absorbed by absorbing blood components. When irradiating skin areas, other disruptive effects are to be expected, such as due to different pigmentation. However, optimal activation can easily be recognized by the rate of formation of A12 as shown in Example 3.
  • Example 5 shows the targeted hydrolysis of such a parent substance A10 using the example of an ester grouping.
  • Place of activation In addition to the application for scientific purposes, where the activation and conversion of the substance A10 to A12 takes place while changing the specificity in a cuvette, a main area of application for medical purposes can be seen. It can be advantageous here to administer the substance A10 externally, nasally, orally, intracranially, parenterally, by means of a drip, catheter or similar auxiliary means, in order to subsequently activate the immunosuppressive property by means of targeted activation by converting the compound A10 into A12 locally in the desired tissue / Pick up blood cells.
  • the radiation can be carried out locally over the skin, as is customary, for example, for the treatment of elevated bilirubin (US3877437, US6464715, US6045575) or by means of a catheter, as described, for example, in US5503721 or US6176842.
  • it can also be an advantage to have extracorporeal body fluids at times, cell matter! or to subject entire organs to such an activation that only the substance portions of substance A10 located in these body fluids, cells or organs are converted into A12.
  • Methods for temporarily obtaining extracorporeal liquids are known to clinical physicians.
  • largely cell-free body fluid can be obtained by means of piasmapheresis (for example: US6099734).
  • body fluid is continuously extracorporeally, is accessible for activation here and is then returned to the natural body fluid flow.
  • a discontinuous procedure can also be advantageous.
  • Body fluids, organs, tissues or cells such as bone marrow can be removed in order to make these or only parts of these body fluids, organs, tissues or cells accessible for activation in order to eliminate the immunosuppressive properties of Cs10 by converting them into Cs12.
  • these body fluids, organs, tissues or cells or components of these body fluids, organs, tissues or cells can again be used by techniques known to the person skilled in the art, either from the person from whom the material was removed or, if beneficial, administered to another person so that the benefits obtained by converting A10 to A12 have therapeutic benefits for the recipient.
  • Administration of the Substances Substances which are summarized under A10 or A12 can either be contained as a single substance or as a mixture in therapeutic applications and should also be referred to as an effective agent. It can be advantageous to produce A12 from A10 during therapy by substance activation. In cases where the immunosuppressive effect of compounds of type A10 is completely undesirable, it may also be advantageous to dispense with substance activation and to administer compounds of type A12 therapeutically.
  • the administrations themselves can be administered orally, topically or parenterally in formulations.
  • the formulations may additionally contain conventional non-toxic pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants and solvents.
  • parenteral means subcutaneous, intravenous, intramuscular, intracranial or intrastemale injections or infusion techniques.
  • compositions may contain the active ingredient (s) or, optionally with A10, their precursor in a form suitable for oral use, e.g. as aerosol, tablets, troches, candies, aqueous or oily suspensions, powders or granules, emulsions, hard or soft capsules, in syrups or elixirs.
  • Aerosols where aerosol is understood to mean a dispersion of solid or liquid particles in gases, can be prepared using a variety of methods known to the person skilled in the art, in particular by providing vessels to be operated by the patient, which can contain the therapeutic agent and, if appropriate, further substances, the therapeutic applicable aerosol is generated immediately before use.
  • Technical solutions in particular for the production of aerosols, which can be readily absorbed through the lungs due to their physical nature of an effective droplet size, have been widely described and can be used, for example: US06136295, US05985309, US06447753, US06447752, US06436443, US06399102, US06338809 , USRE037053, US05855913.
  • compositions intended for oral use can be prepared using methods known to those skilled in the art. Such compositions can contain further substances which enable a pharmaceutically elegant preparation and furthermore bring about positive acceptance by the patient, such as one or more substances which can be selected from the group of sweeteners, flavorings or colorants. Tablets which contain the active agent as an admixture with non-toxic pharmaceutically acceptable substances can be produced by methods known to the person skilled in the art. Various substances can be used as a drug carrier or as an important means for the production of tablets.
  • calcium carbonate, lactose, calcium phosphate or sodium phosphate for example, calcium carbonate, lactose, calcium phosphate or sodium phosphate; as (b) granulating substance, for example starch or alginic acid; as (c) a supporting substance, for example gelatin, starch or gum arabic, and as (d) a dispersing agent, for example magnesium stearate, stearic acid or talc.
  • the tablets themselves can be unprotected or provided with an outer protective cover in order to delay the dwell time in the digestive tract and thus achieve a longer-lasting effect.
  • Materials that influence the residence time are, for example, glycerol monostearate or glycerol distearate.
  • Known techniques for example: US4256108, US4160452, US4265874) can also be used to produce tablets which release the active agent from the tablet in defined areas at a controlled time or in relation to the digestive tract.
  • gelatin capsules in which the active agent is mixed with one or more other inert substances.
  • substances can e.g. Calcium carbonate, calcium phosphate or kaolin.
  • the gelatin capsules can also contain water or oils, e.g. Contain nut oil, olive oil or paraffin oil.
  • Aqueous suspensions usually contain the active agent in mixtures with additions which are necessary for their preparation, such as (a) suspension-imparting substances such as sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxypropyl methyl cellulose, sodium algenate, polyvinyl pyrrolidone, Tragacanth and gum arabic; (b) dispersing or wetting agents, such as naturally occurring phosphatides such as lecithin; (c) condensation products of an alkylene oxide with a fatty acid such as polyoxyethylene stearate; (d) condensation products of an ethylene oxide with a long chain aliphatic alcohol such as heptadekaethyleneoxycetanol; (e) condensation products of an ethylene oxide with a partial ester formed by a fatty acid and a hexitol, such as polyoxyethylene sorbitol monooleate, or (f) condensation products of an ethylene oxide with a partial ester formed by a fatty acid and a hexitol anhydride
  • the aqueous suspensions can also contain one or more preservatives, such as ethyl or N-propyl p-hydroxybenzoate; contain one or more coloring agents, one or more flavoring agents and one or more flavoring agents such as sucrose or saccharin.
  • preservatives such as ethyl or N-propyl p-hydroxybenzoate
  • coloring agents such as ethyl or N-propyl p-hydroxybenzoate
  • flavoring agents such as sucrose or saccharin.
  • Oily suspensions can be made by adding the active agent to a vegetable oil or mixtures of these oils, e.g. Arachis oil, olive oil, sesame oil, nut oil or in a mineral oil, e.g. liquid paraffin.
  • the oily suspension can be a thickening agent such as e.g. Contain beeswax, paraffin or cetyl alcohol.
  • sweeteners, flavors or colorants can be added to achieve good patient acceptance.
  • antioxidants such as e.g. Ascorbic acid may be added.
  • the addition of dispersing powders of different grain sizes can also be advantageous for the preparation of the aqueous solution. These additives enable a relatively homogeneous and stable mixture together with all other advantageous additives mentioned above.
  • the pharmaceutical composition can also be in the form of an oil-in-water emulsion.
  • the oily phase can contain a vegetable oil, such as olive oil or arachis oil, or a mineral oil, such as liquid paraffin or a mixture of these oils.
  • Emulsifier or stabilizing additives can be: (1) naturally occurring gums, such as gum arabic or tragacanth, (2) naturally occurring phosphatides, such as from soybean or lecithin, (3) esters or partial esters derived from fatty acids and hexitol anhydrides such as sorbitol monooleate, (4) condensation products of the above-mentioned partial esters with ethylene oxide, e.g. Polyoxyethylene monooleate.
  • Emulsions themselves can contain additives such as sweeteners, flavors or colorants.
  • Syrups and elixirs can be mixed with sweeteners, such as glycerin, propylene glycol, sorbitol or sucrose.
  • sweeteners such as glycerin, propylene glycol, sorbitol or sucrose.
  • These formulations can additionally contain other substances, such as a demulsifier, an emulsifier, a preservative, a flavoring, a color or several of these additives.
  • the pharmaceutical composition can also be in the form of a sterile injectable aqueous or oily suspension. Such suspensions can be produced by methods known to the person skilled in the art by using dispersing, emulsifying or wetting additives, such as those listed above.
  • the sterile injectable composition can also be in the form of a sterile injectable solution or suspension with a non-toxic parenterally compatible solvent or diluent such as 1,3-butanediol.
  • Acceptable additives include in particular water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • Sterile, non-volatile, pharmaceutically used oils can also be used as solvents or suspension additives, including synthetic mono- or diglycerides.
  • fatty acids such as oleic acid can be contained in these injectable preparations.
  • An active agent of formula 1 can also be contained in a suppository which is customary for rectal or intravaginal use.
  • a suppository which is customary for rectal or intravaginal use.
  • Such suppositories which are customary for rectal use, can be produced by methods known to the person skilled in the art and by using known substances and additives.
  • the active agent is mixed with a customary, non-irritating drug carrier, which is characterized in that it is solid at room temperature and liquid at body temperature and therefore melts in the rectum and can thus release the active agent.
  • Common drug carriers for making rectal suppositories are e.g. B. cocoa butter and various polyethylene glycols.
  • creams, ointments, foams, lotions or suspensions containing the active agent can be used.
  • the amount of active agent which is combined with one or more of the carrier materials listed above to produce one of the application forms listed above can vary widely. The amount depends on both the type of application and the application goal. So can contain, for example, a formulation for the oral intake of 5 mg to 1 g of the active agent, the additives listed above being able to make up between 5 and 95% of the total amount. However, it may also be necessary in some cases to use considerably smaller amounts of the active agent or else amounts which exceed 1 g.
  • Preferred dosage forms can contain between 25 and 500 mg of the active agent.
  • Figure 1 shows the dependence of the calcineurin activity on the concentration of
  • Figure 2 describes the competition of calcineurin inhibition by CsA and is in
  • Embodiment 2 explained in more detail.
  • FIG. 3 shows the influence of photoswitching and various cyclosporin derivative concentrations on transfected stimulated Jurkat cells using a luciferase assay. The experimental procedure is described in Examples 4 and 5.
  • FIG. 4 shows the photoconversion of Cs10 into Cs12 using HPLC separations and is explained in more detail in Example 4.
  • Figure 5 Figure 5a describes the influence of Cs12 on the proliferation of stimulated blood cells compared to CsA.
  • FIG. 5b shows the influence of Cs12 on the cytokine formation in stimulated blood cells in comparison to CsA. The experimental procedure is described in Examples 3, 5, 11 and 12.
  • the inhibition of the PPIase activity of the commercially available human PPIase Cyp18 (Sigma: C3805) and the phosphatase activity of the commercially available calcineurin (Sigma: C1907) was used.
  • the PPIase activity assay was carried out according to Fischer et al. Biomed. Biochim Acta 43 (1984) 1101, with Suc-AFPF-NHNp as substrate and alpha-chymotrypsin (Merck, Darmstdt) as auxiliary protease in 30 mM HEPES buffer at pH 7.8 and 7 ° C.
  • the RH peptide was phosphorylated with PKA and gamma 33 P-ATP and subsequently purified to a chromatographic uniformity (HPLC, 0 to 100% acetonitrile gradient) using a 1 ml RP-C2 extraction column (Amchro, Sulzbach).
  • the peptide (PRII) thus prepared was in the "Scintillation Proximity" assay was used.
  • calmodulin 50 nM
  • calcineurin 1.32 nM
  • assay buffer 40 mM Tris / HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 6 mM MgCI 2 , 0.5 mM DTT, 1 mM CaC! 2 , 0.1 mg / ml BSA
  • PRII was added at a final concentration of 100 nM at a final volume of 100 /! for a further 30 min Incubated at 30 ° C.
  • the phosphatase activity of calcineurin can be inhibited by the Cyp18 / CsA complex.
  • the administration of 1 p of this complex leads to an almost complete inhibition of a CaN concentration of 1.32 nM, as shown in Figure 1 (Example 1). Since only the Cyp18 / CsA complex can inhibit CaN, but not the Cyp18 / Cs12 complex, the inhibition of CaN activity by CsA can be competed for depending on the concentration of Cyp18.
  • Figure 2a shows a CaN inhibition only at higher CsA concentrations at a concentration of 100 pM Cyp18, whereas such an effect can no longer be observed when the Cyp18 concentration is increased to 500 nM.
  • T cell proliferation In order to determine the influence of the inhibitors on T cell proliferation, 2 ⁇ 10 6 cells (peripheral mononuclear blood cells, PBMC) per ml were labeled with 5- (6-) carboxyflucoresceine diacetate succinimide diesters and with anti-CD3 plus anti -CD28 antibodies in the presence of suitable inhibitor concentrations (inhibitor stock solution: 1 mg / ml DMSO) at a final DMSO concentration of 0.5% for 5 days at 37 ° C and then subjected to a flow cytometry (BD FACScalibur). Cytokine production: For this purpose, 2 ⁇ 10 6 cells (PBMC) with the desired inhibitor concentration were pre-incubated at 37 ° C. for 10 min.
  • PBMC peripheral mononuclear blood cells
  • the cells were then incubated with 10 ng / ml PMA and 1 ⁇ l ionomycin (Sigma, Steinheim) for 2 hours and after adding Brefeldin A (5 / g / ml) for a further 3 hours. After fixation of the cells with 2% paraformaidehyde for 20 min, permeabilization with a solution of 0.5% saponin and 1% FCS in PBS, the cytokine concentration could be determined by means of flow cytometry and anticytokine PE-conjugated antibodies (BD Biosciences). This procedure for the detection of cytokine production has been comprehensively developed by Wittmann, B. et al. Published in 1999 in Blood (Vol. 94, pages 1717-1726).
  • Luciferase Reporter Genassay In order to be able to visualize the influence of desired inhibitor concentrations and photoswitching, Jurkat cells were produced with NFAT-luc reporter plasmid (Strategene, Netherlands) by electroporation (Amaxa, Cologne). After incubating these cells for 20 min and a further incubation with or without irradiation at 366 nm for 30 min, the cells were stimulated by adding 10 ng / ml PMA and 1 g / ml ionomycin and incubated for a further 5 h. The concentration of luciferase was then determined using a commercial luciferase assay (Promega, Mannheim).
  • Example 4 Photoswitching (I) The photoconversion of Cs10 to Cs12 can easily be carried out by RP-HPLC separation and subsequent mass spectrometry, as is shown here by way of example. To do this, light is applied to a ethanol sample of Cs10 (10 mg / ml) at 23 ° C in one with a hand lamp (Dr. Gröbel UV-Elektronik GmbH, 2-5062, 254 / 366nm) for 10, 20, 30 or 60 min Cuvette directed. Immediately after the irradiation, the sample is separated by means of HPLC. Figure 4 shows a typical running behavior of the substance irradiated at different times in comparison to the untreated sample. The mass spectrograms of the separated samples corresponded to the compound Cs10 (before irradiation) or Cs12 (after 60 min. Irradiation).
  • the NFAT reporter gene assay listed in Example 3 is well suited to visualize the effect of an activation of the substance Cs10 to Cs12 on the basis of the NFAT translocation.
  • Jurkat cells transfected with reporter plasmid were incubated with Cs10 in concentrations of 20 to 100 nM for 20 min, then irradiated for 30 min with a light source (366nm) and then after stimulation of the cells with PMA / ionomycin Luciferase activity measured over 5 h. To control the observed effects, radiation was dispensed with, or the pure substance Cs12 compared to Cs10 was used.
  • a commercial carboxylesterase (Sigma, E3019) from pig liver was used as the esterase under the following reaction conditions: 100 ⁇ g of CsA 8 -CH 2 -0-CH 2 C (0) NH (CH 2 ) 2 NHC (0) OC 2 H 5 dissolved in 100 ⁇ ⁇ DMSO and then added to 2 ml of 25 mM Tris buffer (pH 8), which contains 30 units of esterase and left overnight at room temperature (approx. 23 ° C.).
  • the separation of the reaction mixture by means of HPLC shows a reaction conversion corresponding to FIG. 4 with almost complete formation of the substance CsA 8 -CH 2 -0-CH 2 C (0) NH (CH 2 ) 2 NH 2, which corresponds to the analogue A12.
  • the conversion of the substance by means of enzymatic hydrolysis can be prevented by adding an appropriate amount of esterase inhibitor, such as, for example, the human esterase inhibitor C-1 (Sigma, E0518).
  • Example 8 Synthesis of [O-carboxymethyl D-Ser f CsA (Cs6) A solution of 60 mg of [D-Ser] 8 CsA, te / f-butyl bromoacetate (20 mg) and 5 mg of benzyltriethylammonium chloride in 1 ml of CH 2 Cl 2 was stirred with 2 ml of 30% NaOH aqueous solution at 23 ° C. for two hours. The solution was then diluted with 10 ml of water and extracted twice with ether. The organic phase was then dried using Na 2 SO 4 . 30 ml of methanolic KOH solution (60 mM) were then added without further separation steps and the mixture was stirred for a further three hours.
  • Cs12 is either synthesized chemically in accordance with Example 8 or produced by irradiation from Cs10 (Example 3).
  • Blood cells PBMCs
  • CFSE Blood cells
  • anti-CD3 / anti-CD28 as indicated in Example 2 (T cell proliferation).
  • T cell proliferation After incubation with DMSO (as a control), Cs12 (1 // M) or CsA (50 nM) for 5 days, the label is measured as a function of the cell number using FACS. The result is shown in Figure 5a. The percentages entered correspond to the concentration of proiiferating cells. In contrast to CsA, Cs12 has no influence on the proliferation of these cells.
  • Example 12 Influence of Cs12 on cytokine formation
  • Cs12 is either synthesized chemically in accordance with Example 8 or produced from Cs10 (Example 4) by irradiation.
  • the effectors are added to the PBM cells at 37 ° C. 10 minutes before the stimulation described above.
  • Figure 5b shows the result of the effect.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue cyclische Peptide aus der Cyclosporin-Reihe, deren Fähigkeit die Proteinphosphatase Calzineurin inhibieren zu können und dadurch immunsuppressiv zu wirken, geschaltet werden kann. Unerwarteterweise wurde gefunden, dass sich durch Modifikation der Hydroxylgruppe eines [D-Ser]8­- Cyclosporins mittels geeigneter aktivierbarer Substitutienten die immunsuppressive Wirkung solcher Cyclosporinderivate ausschalten lässt. Da therapeutisch verwendete Dosen von Cyclosporin A zahlreiche unerwünschte Nebenwirkungen besitzen, besteht der Wert vorliegender Erfindung darin, dass die immunsuppressive Aktivität der bereitgestellten Cyclosporinderivate abgeschaltet werden kann. Es besteht auch die Möglichkeit, das nicht-immunsuppressive Cyclosporinderivat im Gemisch mit der Muttersubstanz oder aber ausschliesslich therapeutisch einzusetzen. Bei therapeutischer Anwendung erfindungsgemässer schaltbarer Cyclosporinderivate kann deren Wirkung während der Therapie beeinflusst werden.

Description

AN DER HYDROXYLGRUPPE MODIFIZIERTE lD-SER ! 8-CYCLOSPORINE MIT SCHALTBARER HEMMUNG DER PROTEINPHOSPHATASE CALZINEURIN UND DADURCH GEZIELTER MANIPULIERBARKEIT DER IMMUNOSUPPRESSIVEN WIRKUNG UNTER BEIBEHALTUNG DER PEPTIDYL-PROLYL-CIS-TRANS- ISOMERASE (PPI) INHIBITION Z.B. ZUR BEHANDLUNG VON AUTOIMMUNERKRANKUNGEN
Hintergrund der Erfindung
Pathobiochemische Veränderungen des Immunsystems liegen einer großen Gruppe von Autoimmunerkrankungen und chronischen Entzündungen zu Grunde, wie z.B folgende Erkrankungen.: Systemischer lupus Erythematosus (SLE), Chronische rheumatoide Arthritis, Typ 1 Diabetes, chronisch entzündliche Darmerkrankungen, Gallenzirrhose, Uveitis, multiple Sklerose und andere Erkrankungen wie Morbus Crohn, Colitis ulzerosa, builöses Pemphigoid, Sarkosidose, Psoriasis, atopische Dermatitis, Ichthyosis oder Graves Opthalmopathie. Obwohl die zugrunde liegende Pathogenese jeweils unterschiedlich sein kann, ist das gemeinsame biochemische Merkmal dieser Erkrankungen das Auftreten von Autoantikörpern bzw. autoaggressiven Lymphozyten, welche zur Entzündung und letztendlich Zerstörung der betroffenen Zellen führen. In gleicher Weise kann es nach Knochenmark- oder Organtransplantation zur Bildung von Antikörpern, bzw. gegen das Transplantat gerichteten Immunzellen kommen, was letztendlich zur Transplantatabstoßung führt. Wie zahlreiche Publikationen (z.B.: Altschuh D. Journal of Molecular Recognition. 15(5):277-285, 2002; Griffiths B. und Emery P. Lupus. 10(3)r\ 65-170, 2001/ Nasonov EL Et al. Terapevticheskii Arkhiv. 72(5):67-71 , 2000; Winkler M. Biodrugs. 14(3): 185- 193, 2000) und Patentschriften (z.B.: US491488;US5948755) zeigen, lassen sich Transplantatabstoßungen therapeutisch durch Gabe von Cyclosporinen verhindern. Ein weiterer relativ gut untersuchter Indikationsbereich bestimmter Cyclosporine, wie z.B. Cyclosporin A (CsA) liegt in der beobachteten Hemmwirkung gegen das Humane Immunodefizienzvirus (HIV) (wie z. B.: Zavyalov V.P. et al. APMIS. 103(6):401-415, 1995). Untersuchungen an kortikosteorid-abhängigen Asthmapatienten zeigen, daß hier die Lungenfunktion durch CsA als Therapeutikum verbessert werden kann (z.B.: Powell N. et al. Journal of Allergy & Clinical Immunology. 108(6):915-917, 2001; Eckstein J.W. und Fung J. Expert Opinion on Investigational Drugs. 12(4):647-653, 2003). Die bekannteste Nebenwirkung von CsA ist seine Nephrotoxizität und darüber hinaus auch Nebenwirkungen wie abnormale Leberfunktion, Hirsutismus, Zahnfleischhypertrophie, Tremor, Hyperästhesie und gastrointestinale Störungen und Zunahme der inzidenz für unterschiedliche Tumore (z.B.: Herman M. Journal of Laboratory & Clinical Medicine 137(1 ): 14-20, 2001 ; Landewe R.B.M. et al. Nature Medicine 5(7):714, 1999).
Cyclosporine sind eine Familie von immunsuppressiven Verbindungen, welche sich durch Fermentation verschiedener Pilze, wie z.B. Tolypocladium inflatum gewinnen lassen (Lexikon der Biochemie, Spektrumverlag, Deutschland). Generell kann die Klasse der Cyclosporine als cyclische Peptide mit 11 Aminosäuren (Formel I) beschrieben werden. (Formel I)
Figure imgf000004_0001
Dabei steht bei der Verbindung Cyclosporin A (CsA) R1 für Methyl(4R)-4-[(E)-2- butenyl]-4-methy!-L-threonin, R2 für α-Aminobuttersäure, R3 für N-Methyl-glycin, R4, R6,R9 und R10 für N-Methyl-L-Ieucin, R5 für L-Valin, R7 für L-AIanin, R8 für D-Alanin und R11 für N-Methyl-L-valin.
Die biologische Aktivität von CsA ist vielfältig. So hemmt CsA die Aktivität des Enzyms Peptidyl-Prolyl cis/trans - Isomerase (PPIase) vom Cyclophilin-Typ, wie dies auch in Beispiel 1a dargestellt ist. Diese auch als Faltungshelferenzyme oder als Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomerasen bezeichneten Proteine, im weiteren als PPIasen bezeichnet, werden entsprechend den Empfehlungen des „Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" („Enzyme Nomenclature",. Academic Press, 1992) unter der EC Nummer 5.2.1.8 zusammengefaßt. Diese Enzyme können die c s/fräns-Isomerisierung von Peptidbindungen in Peptiden und Proteinen katalysieren (Schiene-Fischer C. et al. Biological Chemistry. 383(12):1865-1873, 2002; Tradier T. et al. FEBS Letters. 407(2):184-190, 1997; Ivery M.T.G. Medicinal Research Reviews. 20(6):452-484, 2000. Es konnte in zahlreichen Publikationen gezeigt werden, daß diese Katalyse sowohl bei der Proteinfaltung als auch bei der zellulären Signalweiterleitung eine Schalterfunktion ausüben kann. Von den verschiedenen Mitgliedern dieser PPIasen, im humanen Genom sind mindestens 12 genetisch unterschiedliche Cyclophiline kodiert, wird insbesondere der Interaktion zu Cyclophilin 18 (Cyp18) eine besondere Bedeutung für die Immunsuppression zugeschrieben. So hemmt der binäre CsA/Cyp18 - Komplex die Proteinphosphatase Calzineurin (Liu et al.: Cell 66(1991)807), wie dies auch in Beispiel 1b zusammenfassend dargestellt ist. Die Hemmung dieser Phosphatase in Lymphozyten führt letztendlich, wie zahlreiche Publikationen zeigen (z.B.: Ho et al.: Clin. Immun, and Immunopathology 80(1996)40), zur Immunsuppression. Die Bestimmung dieser Wirkung ist in Beispiel 2 dargestellt. Die Interaktion von CsA zu Cyp18 erfolgt über die Reste 9, 10, 11, 1, 2 des CsA, die auch als „binding domain" bezeichnet werden. Demgegenüber bindet Calzineurin an CsA über die als „effector domain" bezeichneten Reste 4, 5, 6, 7, 8 des CsA. Eine weitere pharmakologisch wichtige Wirkung von CsA ist die Sensitivierung von Krebszellen gegenüber Chemotherapeutika, wie Vincistin (VCR) oder Daunorubicin (DNR). So wird seit längerem ein als „multi drug resistance" (MDR) in der Literatur bezeichnetes Phänomen beobachtet (z.B.: Duraj J. et al. Anticancer Research. 22(6A):3425-8, 2002; Chorvath B. et al. International Journal of Cancer. 72(5):916-7, 1997; Li G. et al. Chinese Journal of Oncoiogy. 24(4):370-4, 2002; Suarez L. et al. Haematologica. 86(12):1287-95, 2001), daß tumorzellen gegenüber anfänglich wirksamen Therapeutika resistent werden. Daß diese unerwünschte Resistenz durch therapeutische Verabreichung von CsA vorteilhaft beeinflußt werden kann, konnte in mehreren Untersuchungen dargestellt werden, so z.B.: Yamamoto M et al. Anti-Cancer Drugs. 6(4):570-7, 1995;SIater L. et al. Proc. Am Assoc. Cancer Res. 27(1982)392; Pallis M.et al. Leukemia & Lymphoma. 43(6):1221-8, 2002; Jachez B. und Loor F. Anti-Cancer Drugs. 4(6):605-15, 1993; Malingre M.M. et al. British Journal of Cancer. 84(1):42-7, 2001. Möglicherweise über eine Inhibierung der Allergen induzierten Proliferation und IL-5 Produktion spezieller weißer Blutzellen (periphere mononucleäre Blutzellen (PBMC)) bewirkt CsA eine Verbesserung der Lungenfunktion bei Asthmatikern (Powell N. et al. Journal of Allergy & Clinical Immunology. 108(6):915-917, 2001). Auch der Schutz der Lunge durch CsA-Gaben gegenüber hypoxischen Schäden wird therapeutisch genutzt, z.B.: Matthew et al. American Journal of Physiology - Lung Cellular & Molecular Physiology. 20(5):L786-L795, 1999). Solche Effekte konnten in verschiedenen Studien an größeren Patientenkollektiven abgesichert werden (so z.B.: Lock S.H. et al American Journal of Respiratory & Critical Care Medicine. 153(2):509-514, 1996;. Eine weitere wichtige pharmakologische Wirkung von CsA ist seine starke Hemmwirkung gegen Retroviren, insbesondere gegenüber dem humanen Immundefizienzvirus (HIV). Diese Wirkung konnte von unterschiedlichsten Autoren nachgewiesen werden, so z.B.: Franke EK. und Luban J. Viroiogy. 222(1 ):279-82, 1996; Drewe J. et al. Biochemical Pharmacoiogy. 57(10):1147-52, 1999;Tourne L. et al. Journal of the American Academy of Dermatology. 37(3 Pt 1):501-2, 199; Saphire AC et al. Immunologie Research. 21 (2-3):211-7, 2000 oder wurde in Patentschriften niedergelegt, z.B.: WO97/04005;US6270957;US5948755. Während CsA als Immunsuppressivum in den unterschiedlichsten Rezepturen derzeit weltweit angewendet wird, ist sein Einsatz zur Behandlung der MDR oder von HIV-Infektionen auf Grund der benötigten hohen Dosen und den damit verbundenen Nebenwirkungen nicht möglich. Allerdings legen einige Arbeiten nahe, daß nicht- immunsuppressiv wirkende Cyclosporine, obwohl noch Inhibitoren der PPIase- aktivität, sowohl zur Behandlung von HIV-Infektionen (Bartz et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sei USA 92:5381 , Rosenwirth et al. (1994) Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 38:1763; US6270957) als auch der MDR (Lopez et al. Leukemia Research 27(5):413-423, 2003; Atadja P. et al. Cancer & Metastasis Reviews 17(2): 163-168, 1998; Naito M. Tsuruo T. Cancer Chemotherapy & Pharmacoiogy. 40(SuppI S):S 20-S 24, 1997) geeignet sind, ohne die für CsA beobachteten Nebenwirkungen zu zeigen.
Wie zahlreiche Untersuchungsbefunde belegen (Pong K. und Zaleska MM. Current Drug Targets - Cns & Neurological Disorders. 2(6):349-56, 2003; Gold BG. und Villafranca JE. Current Topics in Medicinal Chemistry. 3(12): 1368-75, 2003; Udina E. und Navarro X. Neurologia. 17(4):200-13, 2002 ) besitzt CsA auch neuroprotective bzw. regenerative Eigenschaften bei verschiedenen neurologischen Indikationen wie z.B. bei Alzheimer, Amyotropher Lateralsclerose, oder Parkinson. Weiterhin sind insbesondere die antimikrobiellen (High KP. Transplantation. 57(12):1689-700, 1994) und antiparasitären (z.B.: Bell A. et al. General Pharmacoiogy. 27(6):963-71, 1996; Chappell LH et al. Parasitology. 105 Suppl:S25- 40, 1992) Eigenschaften in der Tier- und Humanmedizin beschrieben.
Nicht-immunsuppressive Cyclosporine
Um selektiv die unterschiedlichen Wirkungen von CsA entweder als Inhibitor der PPIase-Aktivität von Cyclophilinen oder die über Hemmung der Calzineurinaktivität führende immunsuppressive Eigenschaft nutzen zu können, wurden zahlreiche Veränderungen an cyclischen Peptiden der Cyciosporin-Reihe durchgeführt. So gelang es insbesondere durch Änderungen an der „effector domain" Cyclosporinderivate zu schaffen, die nicht-immunsuppressiv wirken und Calzineurin nicht mehr inhibieren. Allgemein sind nicht mmunsuppressive cyclische Peptide der Cyclosporin-Reihe unter anderem in US4914188, EP484281 oder WO9704005 beansprucht. Die dort konkret aufgeführten Substanzen, wie z.B. (gamma-Hydroxy- N-methy!leucin)-Cyclosporin, Melle-4-Cyclosporin oder MeVaI-4-Cyclosporin und MeAla-6- oder MeAbu-6-Cyclosporin haben praktisch keine immunsuppressive Aktivität. Obwohl diese Substanzen die PPIase-Aktivität von Cyp18 noch inhibieren, wirken sie nicht mehr nephrotoxisch (US4914188). Überraschenderweise können diese nicht-immunsuppressiven Substanzen bei gleichzeitiger Gabe von immunsuppressivem CsA dessen nephrotoxische Eigenschaft lindern, ohne dessen immunsuppressive Eigenschaften zu verschlechtern, wie dies in der Patentschrift US4914188 und auch in der Literatur, wie z.B. Lazarova T et al.: J. Med. Chem. 46(3003)674 aufgeführt ist. Ein möglicher Kompensationsmechanismus dieser nicht- immunsuppresiven Verbindungen ergibt sich aus Beispiel 2.
Die der vorliegenden Anmeldung zugrundeliegende Aufgabe ist die Bereitstellung neuer Cyclosporinderivate, die immunsuppressiv durch Hemmung der
Proteinphosphatase Calzineurin wirken, aber gezielt manipuiierbar diese Eigenschaft verlieren können, unter Beibehaltung der PPIase-Inhibition.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von pharmazeutischen
Zusammensetzungen, die für die therapeutische Anwendung der bereitgestellten
Cyclosporinderivate in der Medizin geeignet sind, sowie von Hilfsmitteln, mit deren
Hilfe die Eigenschaften der bereitgestellten Cyclosporinderivate gezielt in gewünschter Weise verändert werden können.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung, ist die Bereitstellung von Verfahren, mit denen die erfindungsgemäßen Cyclosporinderivate hergestellt werden können.
Die Lösung dieser Aufgaben sind die in den Ansprüchen beschriebenen erfindungsgemäßen Gegenstände.
Entsprechend dem oben aufgeführten Konzept einer „Effector Domain" sollten chemische Modifizierungen der R8-Position (N-Methyl-glycin), die noch zu dieser Domäne gehören, die Inhibierungskonstanten der Proteinphosphatase Calzineurin und damit die immunsuppressiven Eigenschaften von CsA signifikant beeinflussen. Wie in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt, beeinflussen erstaunlicherweise selbst großvolumige Änderungen, wie die Einführung eines (Nitroveratryl)oxycarbonylrestes die Inhibierung von Calzineurin nur unwesentlich (Verbindung 11, Tabelle 1).
Tabie 1 . Cyp 18- und CaN-Inhibition verschied ener CsA-Derivate
Figure imgf000008_0001
aWeniger als 5% Inhibierung von Calzineurin bei 10 μM Cyp18. bSD<20%. CSD<10%.
Auch die Einführung stark geladener Gruppen, wie die Einführung unterschiedlicher Phosphoryl-D-Serine (Verbindung 3, 4, und 5), oder die Einführung eines O-Methyl- bzw. O-Carboxymethyl-D-Serins (Verbindung 2 bzw. 6) haben kaum Einfluß auf die Calzineurin-Inhibierung. Das gleiche gilt für die umfangreichen Änderungen, die in den Strukturen der Verbindungen 7 bis 11 der Tabelle 1 aufgeführt sind. Um so überraschender war, daß unter den gewählten Testbedingungen für die Verbindung Cs12 und ihre nicht in der Tabelle aufgeführten Analoga, die durch Zuführung von geeigneter Energie, wie z.B.: UV-Licht von 330 nm (Beispiel 3,4) oder durch Einwirkung eines Enzyms (Beispiel 5) oder durch Änderung des pH-Wertes (Beispiel 6) aus einer Verbindung Cs10 oder ihren Analoga hergestellt werden kann, keine Inhibition der Proteinphosphatase Calzineurin mehr feststellbar war. Damit werden mit dieser überraschenden Entdeckung zwei unterschiedliche Cyclosporinderivate (Cs10 und Cs12) bereitgestellt: Cs10:
Verbindungen, welche der Struktur von Cs10 entsprechen und die PPIase-aktivität von Cyp18 signifikant inaktivieren können, wobei hier unter signifikant ein ICso-Wert von kleiner 10 pM verstanden wird, die weiterhin die Eigenschaft besitzen Calzineurin signifikant zu inhibieren, wobei hier unter signifikant ein IC5o-Wert von kleiner 10 pM verstanden wird, und welche die Eigenschaft besitzen, sich mittels geeigneter Aktivierung in eine Verbindung, welche der Struktur von Cs12 oder ihren Analoga in Tabelle 1 entspricht, umwandeln lassen, wobei die Aktivierung bei photolabilen Gruppen mittels geeigneten Lichtquellen erfolgt, bei pH-sensitiven Gruppen durch eine ausreichende pH-Änderung und bei katalyseempfindlichen Gruppen durch die Wirkung des entsprechenden Enzyms. Cs12:
Verbindungen, welche aus der Struktur Cs10 (Tabelle 1) oder ihren Analoga mittels geeigneter Aktivierung erhalten wurden und der Struktur Cs12 oder ihren Analoga entsprechen, oder gezielt mittels chemischer Synthese hergestellt wurden und der Struktur Cs12 oder ihren Analoga entsprechen, wobei all- diese Verbindungen die Eigenschaft besitzen,- die PPIase-aktivität von Cyp18 signifikant inaktivieren zu können, wobei hier unter signifikant ein IC5o-Wert von kleiner 10 p verstanden wird, und wobei für diese Substanzen weiterhin gilt, daß sie die Eigenschaft besitzen, Calzineurin nicht signifikant zu inhibieren, wobei hier unter nicht signifikant ein ICso- Wert von größer 10 pM verstanden wird.
Wie in den Beispielen (7, 8, 9) aufgeführt wurde, lassen sich die Substanzen des Typs Cs10 und Cs12 sowie ihre Analoga auf unterschiedlichste Weise in größeren Mengen herstellen. Die im weiteren aufgeführten Analoga A10 und A12 entsprechen in ihren Eigenschaften bezüglich der Inhibition bezogen auf Cyp18 bzw. Calzineurin den Substanzen Cs10 und Cs12 und können wie folgt beschaffen sein:
R 0-R11-R1-R2-R3 R: 9 (Formel I)
Figure imgf000010_0001
worin R1 für Methyl(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-L-threonin (MeBMT) oder Dihydro- MeBMT steht;
R2 für α-Aminobuttersäure (Abu) oder ein an einer oder mehreren Positionen der Seitenkette fluoriertes Derivat dieser Aminosäure steht; wie z.B. -NH-CH(CO)-
Figure imgf000010_0002
worin X1 bis X5 unabhängig voneinander für H oder F stehen, mit der Maßgabe, daß mindestens eins der X-i, X2, X3, X4 and X5 für F steht;
R3 für N-Methyl-glycin (Sar), N-Methyl-D-alanin oder ein fluoriertes Derivat davon steht;
R4,R6, R9 and R10 unabhängig voneinander für N-Methyl-L-Ieucin (MeLeu) oder ein fluoriertes Derivat davon stehen;
R5 für L-Valin (Val) oder ein fluoriertes Derivat davon steht; R7 für L-AIa oder ein fluoriertes Derivat davon steht, und R11 für L-MeVal oder ein fluoriertes Derivat davon steht.
Eine weitere Ausführungsform sind Cyclosporin-Analoga der Formel (I), worin R1 für
MeBmt oder Dihydro-MeBmt steht;
R2 für Abu steht;
R3 für Sar oder D-MeAla steht;
R4,R6, R9 und R10 unabhängig voneinander für MeLeu oder ein fluoriertes Analog stehen können;
R5 für Val oder ein fluoriertes Analog steht;
R7 für Ala steht; und
R11 für MeVal oder ein fluoriertes Analog steht. Eine weitere Ausführungsform sind Cyclosporin-Analoga der Formel (I), wobei R1 für
MeBmt steht;
R2 für Abu steht;
R3 für Sar steht;
R4,R6,R9 and R10 für MeLeu stehen;
R5 für Val steht;
R7 für Ala steht; und
R11 für MeVal steht.
In allen oben ausgeführten Verbindungen steht R8 für (a) -NH-CH(CO)- Y-CH-X-(CH2)mC(0)NH(CH2)n-Z wobei X für O oder S steht, Y für H oder Methyl steht, m einen Wert zwischen 0 und 5 hat, n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, Z für N-R12R13 oder NHC(0)OR14 steht, wobei R12 für H, Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl oder eine photolysierbare Gruppe steht und R13 für H oder einen C1-C8-Alkylrest steht, und R14 für eine säure-/basenlabile oder eine enzymatisch spaltbare Gruppe steht; oder
(b) -NH-CH(CO)- Y-cΗ-X-(CH2)mNHC(0)(CH2)n-Z wobei X für 0, S oder CH2 steht, Y für H oder Methyl steht, m einen Wert zwischen 0 und 5 hat, n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, Z für N-R12R13 oder NHC(0)OR14 steht, wobei R12 für H, Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl oder eine photolysierbare Gruppe steht, und R13 für H oder einen C1-C8-Alkylrest steht, und R14 für eine säure-/basenlabiie oder eine enzymatisch spaltbare Gruppe steht.
Die photolysierbare Gruppe kann eine gegebenenfalls substituierte Nitroarylgruppe sein. Beispiele für die gegebenenfalls substituierte Nitroarylgruppe sind 2- Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), α-Carboxy-2-Nitrobenzyl (CNB), 1-(2- Nitrophenyl)ethyl (NPE), 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)ethyl (DMNPE) oder 5- Carboxymethoxy-2-NitrobenzyI (CMNB). Die säureVbasenlabile oder enzymatisch spaltbare Gruppe kann z.B. Methyl, Ethyl, Methoxymethyl (MOM), -CH2CH2F, Methylthiomethyl (MTIVI), ß-Glucuronid, D-GIucopyranosyl, ß-D-Galactopyranosyl, tetra-O-Acetyl-D-Glucopyranosyl, oder tetra-O-Acetyl-ß-D-Gafactopyranosyl sein.
Bevorzugte Beispiele erfindungsgemäßer Verbindungen sind das [O- (NVOCNH(CH2)5NHC(0) CH2-)D-Ser]8 CsA oder das [0-(NH2(CH2)5NHC(0)CH2-) D-Ser]8 CsA.
Die erfindungsgemäße Verbindungen vom Typ A12 können nach üblichen Verfahren unter Verwendung von [D-Ser]8-oder [D-Cys]8-CsA (wobei D-Ser oder D-Cys auch durch andere geeignete Aminosäuren ersetzt werden können), CPG-Bromacetat und einer Verbindung der Formel NH2 (CH2)n NH-APG hergestellt werden, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, APG eine Aminoschutzgruppe und CPG eine Carboxylschutzgruppe bedeutet.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen vom Typ A10 können gleichermaßen nach üblichen Verfahren unter Verwendung von [D-Ser]8- oder [D-Cys]8-CsA (wobei D-Ser oder D-Cys auch durch andere geeignete Aminosäuren ersetzt werden können), CPG-Bromacetat und einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend NVOC, CNB, NPE, DMNPE und CMNB hergestellt werden, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, APG eine Aminoschutzgruppe und CPG eine Carboxylschutzgruppe bedeutet.
Als Amino- bzw. Carboxylschutzgruppen können übliche Schutzgruppen verwendet werden, wie sie dem Fachmann z.B. aus N. Sewald, H.-D. Jakubke, Peptides: Chemistry and Biology, Verlag Wiley-VCH bekannt sind. Beispiele für Aminoschutzgruppen sind Carbobenzoxy, Boc, Fmoc, Bpoc, NPS, Triphenylmethyl oder Tosyl. Beispiele für Carboxyschutzgruppen sind Methyl, Ethyl, tert. Butyl, Benzyl, Nitrobenzyl oder Methoxybenzyl. Bevorzugt sind tert. Butyl als Carboxyschutzgruppe und Boc als Aminoschutzgruppe. Beispiele für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind in den Beispielen 7, 8 und 9 angegeben.
Spezifitätsänderung Die geeignete Methode zur Änderung der Spezifität einer Substanz des Typs A10 zu einer Substanz des Typs A12, wird durch die aktivierbare Gruppierung bestimmt. Solche aktivierbaren Gruppierungen und ihre geeigneten Aktivierungsmethoden sind dem Fachmann bekannt und wurden mehrfach ausführlich beschrieben. Je nach beabsichtigter Methode lassen sich durch Beeinflussung dieser chemischen Funktionalitäten aus einer Muttersubstanz gezielt eine oder mehrere Tochtersubstanzen herstellen, wobei die Tochtersubstanz erfindungsgemäß eine gegenüber der Proteinphosphatase Calzineurin geänderte Spezifität aufweist.
a) Photoschaltung: Durch Licht schaltbare chemische Gruppierungen sind seit längerem bekannt und Gegenstand zahlreicher Patentschriften so z.B. in US6392089, US6242258, US6160024, US5952311 , US5767288, US6057096, US5786198, US5780287, EP1208079 oder US5503721 bzw. sind in Übersichtsarbeiten, wie z.B.: Pirrung, M.C. et al. J.Org.Chem 60(1995)1116; Gurney A.M. et al, Physiological Reviews 67(1987)583; Pillai V.N.R. Reviewspp 1-27(1980); Cameron J.F. et al. J. Chem. Soc. Chem. Commun 923(1995); Pirrung M.C. et al. J.Org.Chem 59(1994)3890; McCray J.A. et al. Annu.Rev.Biophys.Chem. 18(1989)239; Cummings R.T. et al. Tetrahedron Letters 29(1988)65; Mendel D. et al. J.Am. Chem. Soc. 113(1991)2578 oder Sheehan J.C. et al. J. Am. Chem. Soc 93(1971)7222 beispielgebend dargestellt.
Ebenso wurden zahlreiche Verfahren dokumentiert, mit deren Hilfe die gewünschte Aktivierung durchgeführt werden kann, so z.B. in US6461567, US6524447, US6397102, US6433343, US5459322, US6258319, US5854967, US5683661 oder US5503721. So wird zum Beispiel zur Umwandlung von Substanz Cs10 in Substanz Cs12 vorzugsweise UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 330 nm benutzt. Wahl der Lichtquelle und Dauer der Bestrahlung der Substanz um die gewünschte Umwandlung von A10 nach A12 zu erreichen, hängen naturgemäß neben der verwendeten photolabilen Gruppe und Stärke der Lichtquelle von weiteren Faktoren ab. Befindet sich A10 z.B. in Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, werden Teile der Lichtenergie auch von absorbierenden Blutbestandteilen absorbiert werden. Beim Bestrahlen von Hautbereichen, sind wiederum andere störende Effekte, wie z.B. durch unterschiedliche Pigmentierung zu erwarten. Eine optimale Aktivierung ist aber leicht an der Bildungsgeschwindigkeit von A12 zu erkennen wie dies in Beispiel 3 dargestellt ist.
b)Enzymatische Schaltung: Die gezielte Einführung von Substratanaloga in eine als Elternsubstanz bezeichnete Verbindung, aus der dann durch Wirkung unterschiedlicher Enzyme eine gewünschte Tochtersubstanz entsteht, ist dem Fachmann bekannt und in der Literatur umfassend dokumentiert (z.B.:Gum A.W. et al. Chem.Eur.J. 6(2000)3714; deBont D.B.A. et al. BioorganIcMedicinal Chemistry 5(1997)405; Lazarova T. et al J.Med.Chem. 46(2003)674). So kann z.B. durch Einführung einer Estergruppierung die Aktivität von Hydrolasen/Esterasen, durch Einführung einer geeigneten sensitiven Peptidbindung die Aktivität von Proteasen oder bei Verwendung von Glucose- oder Galactosederivaten die Aktivität von Glycosidasen genutzt werden, um A10 in A12 zu verwandein. Beispiel 5 zeigt die gezielte Hydrolyse einer solchen Muttersubstanz A10 am Beispiel einer Estergruppierung.
c) pH-Schaltung: Die gezielte Einführung von Substratanaloga in eine als Elternsubstanz bezeichnete Verbindung, aus der dann durch Säure- oder Basenkatalyse eine gewünschte Tochtersubstanz entsteht, ist dem Fachmann bekannt und in der Literatur umfassend dokumentiert, wie z.B. in „Catalysis in Chemistry and Enzymology" von William P. Jencks. (1987). Geeignet für diese nichtenzymatische Katalyse sind chemische Bindungen, welche gegenüber Säuren - oder Basen, im einfachsten Fall gegenüber Protonen oder Hydroxylionen, empfindlich sind. Charakteristisches Kennzeichen solcher chemischer Bindungen ist, daß die Hydrolysegeschwindigkeit in einem direkten Zusammenhang zur Konzentration der katalytisch wirksamen Ionen steht. Beispiel 6 zeigt die Umwandlung eines Substanzanalogen der Verbindung A10 in die Verbindung A12 mittels erhöhter Hydroxylionenkonzentration.
Ort der Aktivierung: Neben der Anwendung für wissenschaftliche Zwecke, wo die Aktivierung und Wandlung der Substanz A10 zu A12 bei gleichzeitiger Änderung der Spezifität in einer Küvette erfolgt, ist ein Hauptgebiet der Anwendung für medizinische Zwecke zu sehen. Hier kann es von Vorteil sein, die Substanz A10 äußerlich, nasal, oral, intrakraniaf, parenteral, mittels Tropf, Katheter oder ähnlicher Hilfsmittel zu verabreichen, um anschließend mittels gezielter Aktivierung die immunsuppressive Eigenschaft durch Wandlung der Verbindung A10 in A12 lokal im gewünschten Gewebe/Blutzellen aufzuheben. Die Bestrahlung kann dabei großflächig über die Haut, wie z.B. zur Behandlung von erhöhtem Bilirubin üblich (US3877437, US6464715, US6045575) oder mittels Katheter, wie z.B. in US5503721 oder US6176842 beschrieben, lokal durchgeführt werden. Es kann aber auch von Vorteil sein, zeitweise extrakorporal befindliche Körperflüssigkeiten, Zellmateria! oder ganze Organe so einer Aktivierung zu unterziehen, daß nur die sich in diesen Körperflüssigkeiten, Zellen oder Organen befindlichen Substanzanteile der Substanz A10 in A12 überführt werden. Methoden um zeitweise extrakorporale Flüssigkeiten zu erhalten sind dem klinischen Mediziner bekannt. So kann z.B. mittels Piasmapherese (z.B.:US6099734) weitgehend zellfreie Körperflüssigkeit erhalten werden. Oder es kann mittels der weit angewendeten Dialysetechniken (z.B.: US5277820) Blut extrakorporal kontinuierlich zugänglich gemacht werden. Beiden Methoden ist gemeinsam, daß kontinuierlich Körperflüssigkeit extrakorporal verbracht wird, hier einer Aktivierung zugänglich ist und anschließend dem natürlichen Körperflüssigkeitslauf wieder zugeführt wird. Es kann aber auch ein diskontinuierliches Vorgehen von Vorteil sein. So können Körperflüssigkeiten, Organe, Gewebe oder Zellen wie z.B. Knochenmark, entnommen werden um diese oder nur Bestandteile dieser Körperflüssigkeiten, Organe, Gewebe oder Zellen einer Aktivierung zugänglich zu machen, um die immunsuppressiven Eigenschaften von Cs10 durch Überführen in Cs12 zu eliminieren. Anschließend können diese Körperflüssigkeiten, Organe, Gewebe oder Zellen bzw. Bestandteile dieser Körperflüssigkeiten, Organe, Gewebe oder Zellen wieder mittels dem Fachmann bekannter Techniken entweder der Person, aus dem das Material entnommen wurde oder, wenn dies von Vorteil ist, einer anderen Person so verabreicht werden, daß die durch Überführen von A10 in A12 erhaltenen Vorteile einen therapeutischen Nutzen für die Empfängerperson hat.
Verabreichung der Substanzen Substanzen, die unter A10 bzw. A12 zusammengefaßt sind, können entweder jeweils als Einzelsubstanz oder als Gemisch in therapeutischen Anwendungen enthalten sein und sollen weiterhin als wirksames Agens bezeichnet werden. Dabei kann es von Vorteil sein, A12 aus A10 während der Therapie durch Substanzaktivierung herzustellen. In Fällen, wo der immunsuppressive Effekt von Verbindungen des Typs A10 gänzlich unerwünscht ist, kann es auch von Vorteil sein, auf die Substanzaktivierung zu verzichten und Verbindungen des Typs A12 therapeutisch zu verabreichen. Die Verabreichungen selbst können oral, topisch oder parenteral in Formulierungen erfolgen. Die Formulierungen können zusätzlich konventionelle nichttoxische pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe, Adjuvanten und Lösungsmittel enthalten. Unter dem Begriff parenteral werden subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intrakranale oder intrastemale Injektionen oder Infusionstechniken verstanden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können den oder die aktiven Wirkstoffe oder gegebenenfalls mit A10 deren Vorstufe in einer für die orale Anwendung geeigneten Form enthalten, z.B. als Aerosol, Tabletten, Pastillen, Bonbons, wäßrige oder ölige Suspensionen, Puder oder Körner, Emulsionen, harte oder weiche Kapseln, in Sirup oder Elixieren.
Aerosole, wobei unter Aerosol eine Dispersion fester oder flüssiger Teilchen in Gasen verstanden wird, lassen sich mittels vielfältiger, dem Fachmann bekannter Methoden herstellen, wobei insbesondere durch Bereitstellung von vom Patienten zu bedienender Gefäße, welche das Therapeutikum und gegebenenfalls weitere Stoffe enthalten können, das therapeutisch anwendbare Aerosol unmittelbar vor der Anwendung erst erzeugt wird. Technische Lösungen, insbesondere zur Herstellung von Aerosolen, die auf Grund ihrer physikalischen Beschaffenheit einer wirksamen Tröpfchengröße gut durch die Lunge aufgenommen werden können sind in großem Umfang beschrieben worden und anwendbar, so z.B.: US06136295, US05985309, US06447753, US06447752, US06436443, US06399102, US06338809, USRE037053, US05855913. Anwendbare Aerosole für die therapeutische Anwendung von Cyclosporinen sind ebenfalls mehrfach der Gegenstand von Patentschriften (wie z.B.: US06241969, US05958378, US06413547, US05693336, US05683714). Zusammensetzungen, die für den oralen Gebrauch bestimmt sind, lassen sich mittels dem Fachmann bekannter Methoden herstellen. Solche Zusammensetzungen können weitere Stoffe enthalten, welche eine pharmazeutisch elegante Herstellung ermöglichen und weiterhin für eine positive Akzeptanz beim Patienten bewirken, wie z.B. eine oder mehrere Substanzen, die aus der Gruppe der Süßmacher, der Aromastoffe oder der Farbstoffe ausgewählt werden können. Tabletten, welche das aktive Agens als Beimischung mit nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen Substanzen enthalten, lassen sich mittels dem Fachmann bekannter Methoden herstellen. Als Arzneiträger oder als für die Tablettenherstellung wichtige Mittel können verschiedene Stoffen genutzt werden. So kann als (a) inerter Stoff z.B. Kalziumkarbonat, Laktose, Kalziumphosphat oder Natriumphosphat; als (b) granulierender Stoff z.B. Stärke oder Alginsäure; als (c) Stützstoff z.B. Gelatine, Stärke oder Gummiarabicum, und als (d) Dispersionsmittel z.B. Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Talkum verwendet werden. Die Tabletten selbst können ungeschützt oder mit einer äußeren Schutzhülle versehen sein, um die Verweilzeit im Verdauungstrakt zu verzögern und damit eine zeitlich längere Wirkung zu erreichen. Materialien, die Einfluß auf die Verweilzeit nehmen, sind z.B. Glycerolmonostearat oder Glyceroldistearat. Mittels bekannter Techniken (z.B.: US4256108, US4160452, US4265874) lassen sich auch Tabletten herstellen, welche das aktive Agens zeitlich kontrolliert oder bezogen auf den Verdauungstrakt in definierten Bereichen aus der Tablette freisetzen.
In einigen Fällen kann es von Vorteil sein, Formulierungen für den oralen Gebrauch in der Form von Gelatinekapseln, in denen das aktive Agens mit einer oder mehreren weiteren inerten Substanzen gemischt ist, bereitzustellen. Solche Substanzen können z.B. Kalziumkarbonat, Kalziumphosphat oder Kaolin sein. Die Gelatinekapseln können aber auch neben dem aktiven Agens Wasser oder Öle, wie z.B. Nußöl, Olivenöl oder auch Paraffinöl enthalten.
Wäßrige Suspensionen enthalten das aktive Agens üblicherweise in Mischungen mit Beimengungen, welche erforderlich für ihre Herstellung sind, wie z.B. (a) Suspensions vermittelnde Stoffe wie Natriumcarboxymethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumalgenat, Polyvinyipyrrolidon, Tragantgummi und Gummiarabikum; (b) Dispergierende oder die Benetzung vermittelnde Stoffe, wie natürlich vorkommende Phosphatide wie z.B. Lecithin; (c) Kondensationsprodukte eines Alkylenoxids mit einer Fettsäure, wie z.B. Polyoxyethylenstearat; (d) Kondensationsprodukte eines Ethylenoxids mit einem langkettigen aliphatischen Alkohol, wie z.B. Heptadekaethyleneoxycetanol; (e) Kondensationsprodukte eines Ethylenoxids mit einem Partialester, der von einer Fettsäure und einem Hexitol, wie z.B. Polyoxyethylensorbitolmonooleat, oder (f) Kondensationsprodukte eines Ethylenoxids mit einem Partialester, welcher von einer Fettsäure und einem Hexitolanhydrid, wie z.B. Polyoxyethylensorbitnamonooleat gebildet wird. Die wäßrigen Suspensionen können auch einen oder mehrere Konservierungsstoffe, wie z.B. Ethyl- oder N-Propyl-p-hydroxybenzoat; einen oder mehrere Farbstoffe, einen oder mehrere Aromastoffe und einen oder mehrere Geschmacksstoffe wie z.B. Saccharose oder Saccharin enthalten.
Ölige Suspensionen können durch Versetzen des aktiven Agens in ein pflanzliches Öl oder Mischungen dieser Öle, wie z.B. Arachisöl, Olivenöl, Sesamöl, Nußöl oder aber in ein mineralisches Öl, wie z.B. flüssiges Paraffin, erhalten werden. Die ölige Suspension kann ein Verdickungsmittel, wie z.B. Bienenwachs, Paraffin oder Cetylalkohol enthalten. Zusätzlich können Süßmittel, Aromastoffe oder Farbstoffe zugesetzt sein, um eine gute Akzeptanz beim Patienten zu erreichen. Zur Verlängerung der Haltbarkeit der Zusammensetzung können Antioxidantien wie z.B. Ascorbinsaure zugesetzt sein. Ebenso kann der Zusatz dispergierender Puder unterschiedlicher Korngröße zur Herstellung der wäßrigen Lösung vorteilhaft sein. Diese Zusätze ermöglichen eine relativ homogene und stabile Mischung zusammen mit allen anderen oben erwähnten vorteilhaften Zusätzen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann auch in Form einer Öl-in-Wasser- Emulsion vorliegen. Dabei kann die ölige Phase ein pflanzliches Öl, wie z.B. Oiivenöl oder Arachisöl, oder aber ein mineralisches Öl, wie z.B. flüssiges Paraffin oder eine Mixtur dieser Öle enthalten. Emulsionsvermittler- oder Stabilisierungszusätze können dabei sein: (1) natürlich vorkommende Gummi, wie z.B. Gummi Arabicum oder Tragantgummi, (2) natürlich vorkommende Phosphatide, wie z.B. aus der Sojabohne oder Lecithin, (3) Ester oder Partialester, die von Fettsäuren und Hexitolanhydriden abgeleitet wurden, wie z.B. Sorbitolmonooleat, (4) Kondensationsprodukte der oben erwähnten Partialester mit Ethylenoxid, z:B. Polyoxyethylensorbitol-monooleat. Die Emulsionen selbst können wiederum Zusätze, wie Süßmittel, Aromastoffe oder Farbstoffe enthalten. Sirupe und Elixiere können mit Süßmitteln, wie z.B. Glyzerin, Propylenglykol, Sorbitol oder Saccharose versetzt sein. Diese Formulierungen können zusätzlich weitere Stoffe, wie ein Demulgator, ein Emulgator, ein Konservierungsmittel, ein Aromastoff ein Farbstoff oder auch mehrere dieser Zusätze enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzung kann sich auch in der Form einer sterilen injizierbaren wäßrigen oder öligen Suspension befinden. Solche Suspensionen lassen sich mittels dem Fachmann bekannten Methoden durch Verwendung dispergierender, emulgierender oder benetzender Zusätze, wie sie oben aufgeführt wurden, herstellen. Die sterile injizierbare Zusammensetzung kann auch in Form einer sterilen injizierbaren Lösung oder Suspension mit einem nicht-toxischen parenteral-verträglichen Lösungsmittel oder Verdünnungsmittel, wie z.B. 1,3- Butandiol bestehen. Zu den akzeptablen Zusatzstoffen zählen auch insbesondere Wasser, Ringerlösung und isotonische Natriumchloridfösung. Auch sterile nichtflüchtige pharmazeutisch allgemein verwendete Öle können als Lösungsmittel oder Suspensionszusatz verwendet werden, einschließlich synthetischer Mono-oder Diglyzeride. Zusätzlich können Fettsäuren, wie z.B. Ölsäure in diesen injizierbaren Zubereitungen enthalten sein.
Ein aktives Agens der Formel 1 kann auch in einem zur rektalen oder intravaginalen Anwendung üblichen Zäpfchen enthalten sein. Solche für die rektale Anwendung üblichen Suppositorien lassen sich mittels dem Fachmann bekannten Methoden und bei Verwendung bekannter Stoffe und Zusätze herstellen. Dabei wird das aktive Agens mit einem gebräuchlichen, nicht-reizenden Arzneistoffträger, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er bei Raumtemperatur fest und bei Körpertemperatur flüssig ist und deshalb im Rektum schmilzt und so das aktive Agens freisetzen kann, gemischt. Gebräuchliche Arzneistoffträger zum Anfertigen von Rektalzäpfchen sind z. B. Kakaobutter und verschiedene Polyäthylenglycole.
Für äußerliche Anwendungen, können z.B. Cremes, Salben, Schäume, Lotions oder Suspensionen, die das wirksame Agens enthalten, verwendet werden. Die Menge des aktiven Agens, welches mit einem oder mehreren der oben aufgeführten Trägermaterialien zusammengeführt wird, um eine der oben aufgeführten Anwendungsformen herzustellen, kann sehr unterschiedlich sein. Die Menge hängt sowohl von der Anwendungsart als auch vom Anwendungsziel ab. So kann z.B. eine Formulierung zur oralen Aufnahme von 5 mg bis zu 1 g des aktiven Agens enthalten, wobei die oben aufgeführten Zusatzstoffe zwischen 5 und 95% der totalen Menge ausmachen können. Es kann aber auch teilweise erforderlich sein, beträchtlich geringere Mengen des aktiven Agens zu verwenden oder aber Mengen, welche 1 g übersteigen. Vorzugsweise Dosisformen können zwischen 25 und 500 mg des aktiven Agens enthalten. Es liegt aber in der Natur medizinischer Anwendungen, daß spezifische Dosismengen des aktiven Agens sowohl von der Art des Agens selbst abhängen aber auch von den individuellen Eigenschaften des zu behandelnden Patienten, wie z.B. Alter, Körpergewicht, allgemeiner Gesundheitszustand, Geschlecht, Ernährung, Zeitpunkt und Art der Verabreichung, Geschwindigkeit der Ausscheidung, der eventuellen Kombination mit anderen Pharmaka, der Therapieart und der spezifischen Erkrankung.
Die Figuren zeigen:
Figur 1
Figur 1 zeigt die Abhängigkeit der Calcineurinaktivität von der Konzentration des
Cyp18/lnhibitorkomplexes. Die Versuchsdurchführung ist in Beispiel 1 beschrieben.
Figur 2
Figur 2 beschreibt die Kompetition der Calcineurininhibition durch CsA und wird in
Ausführungsbeispiel 2 näher erläutert.
Figur 3
Figur 3 zeigt den Einfluss von Photoschaltung und verschiedenen Cyclosporinderivat-Konzentrationen auf transfizierte stimulierte Jurkat-Zellen anhand eines Luciferaseassays. Die Versuchsdurchführung ist in den Beispielen 4 und 5 beschrieben.
Figur 4
Figur 4 zeigt die Photokonversion von Cs10 in Cs12 anhand von HPLC-Trennungen und ist im Beispiel 4 näher erläutert. Figur 5 Figur 5a beschreibt den Einfluss von Cs12 auf die Proliferation stimulierter Blutzellen im Vergleich zu CsA. Figur 5b zeigt den Einfluss von Cs12 auf die Cytokinbildung in stimulierten Blutzellen im Vergleich zu CsA. Die Versuchsdurchführung ist in den Beispielen 3, 5, 11 und 12 beschrieben.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne diese auf die beschriebenen Beispiele einzuschränken.
Beispiel 1: En∑ymaktivitätsassays
Zur Klassifizierung der CsA-Derivate wurde die Inhibition der PPIase-Aktivität der kommerziell verfügbaren humanen PPIase Cyp18 (Sigma:C3805) und die Phosphataseaktivität des kommerziell verfügbaren Calzineurins (Sigma:C1907) verwendet. a) Der PPIase-aktivitätsassay wurde nach Fischer et al. Biomed. Biochim Acta 43(1984)1101 durchgeführt, mit Suc-AFPF-NHNp als Substrat und alpha-Chymotrypsin (Merck, Darmstdt) als Hilfsprotease in 30 mM HEPES- Puffer bei pH 7,8 und 7 °C. Nach 10 min Vorinkubation einer gewünschten Konzentration des Inhibitors mit 2.5 nM Cyp18, wurde die Reaktion durch aufeinanderfolgende Zugabe von Substrat und Chymotrypsin gestartet und bei 390 nm mit einem Spektralphotometer (HP 8452) die Absorption gemessen. Die IC50 -Werte konnten durch Auftragen der nach einer Geschwindigkeitsgleichung 1. Ordnung berechneten Geschwindigkeitskonstanten gegen die Inhibitorkonzentration berechnet werden. b) Die Aktivität der Proteinphosphatase Calzineurin wurde nach Baumgraß et al. J.Biol.Chem. 276(2002)47914 mittels biotinyliertem RH-Peptid bestimmt. Dazu wurde das RH-Peptid mit PKA und gamma33P-ATP phosphoryliert und nachfolgend mittels einer 1 ml RP-C2 Extraktionssäule (Amchro, Sulzbach) bis zur chromatografischen Einheitlichkeit (HPLC, 0 zu 100 % Azetonitril-Gradient) gereinigt. Das so hergestellte Peptid (PRII) wurde im „Scintillation Proximity"-Assay verwendet. Im einzelnen wurden zusammen mit geeigneten Konzentrationen an Inhibitor eine Mischung aus Calmodulin (50 nM) und Calzineurin (1.32 nM) in Assay-Puffer (40 mM Tris/HCI, pH 7.5, 100 mM NaCI, 6 mM MgCI2, 0.5 mM DTT, 1 mM CaC!2, 0.1 mg/ml BSA) für 30 min bei 30 °C inkubiert. Danach wurde PRII bei einer Endkonzentraion von 100 nM bei einem Endvolumen von 100 /! für weitere 30 min bei 30 °C inkubiert. Danach wurden 90 p\ abgenommen und in kommerziellen mit Streptavidin belegten Titerplatten (ScintiStrip) inkubiert. Nach 20 min Inkubation bei 22 °C wurden die Platten gewaschen und das nichtumgesetzte PRII mittels MicroBeta-Counter (Wallac,Turku, Finnland) bestimmt. Abbildung 1 zeigt eine typische Abhängigkeit der CaN-Aktivität von der Inhibitorkonzentration.
Beispiel 2: Kompetition der CaN-Inhibition
Die Phosphataseaktivität von Calzineurin kann durch den Cyp18/CsA Komplex inhibiert werden. So führt die Gabe von 1 p dieses Kompexes zur fast vollständigen Hemmung einer CaN-Konzentration von 1.32 nM, wie dies in Abbildung 1 (Beispiel 1) dargestellt wird. Da nur der Cyp18/CsA-Komplex CaN inhibieren kann, nicht aber der Cyp18/Cs12-KompIex kann die Hemmung der CaN-Aktivität durch CsA in Abhängigkeit von der Konzentration an Cyp18 kompetitiert werden. So zeigt Abbildung 2a bei einer Konzentration von 100 pM Cyp18 erst bei höheren CsA- Konzentrationen eine CaN-lnhibierung, während ein solcher Effekt bei Erhöhung der Cyp18-Konzentration auf 500 nM nicht mehr zu beobachten ist.
Beispiel 3: Irnunsuppression
T-Zellproliferation: Um den Einfluß der Inhibitoren auf die T-Zellproliferation zu bestimmen, wurden 2 x 106 Zellen (periphere mononucleäre Blutzellen, PBMC) je ml mit 5-(6-)Carboxyfluzoresceine-Diacetatsuccinimidyiester markiert und mit anti-CD3 plus anti-CD28 Antikörpern in der Gegenwart geeigneter Inhibitorkonzentrationen (Inhibitorstammlösung: 1 mg/ml DMSO) bei einer DMSO-Endkonzentration von 0.5% für 5 Tage bei 37 °C kultiviert und anschließend einer Durchflußzytometrie (BD FACScalibur) unterzogen. Cytokin-Produktion: Dazu wurden 2 x 106 Zellen (PBMC) mit der gewünschten Inhibitorkonzentration bei 37 °C für 10 min vorinkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 10 ng/ml PMA und 1 μ\ lonomycin (Sigma, Steinheim) für 2 Stunden und nach Zugabe von Brefeldin A (5 /g/mI) für weitere 3 Stunden inkubiert. Nach Fixierung der Zellen mit 2% Paraformaidehyd für 20 min, Permeabilisieren mit einer Lösung aus 0.5% Saponin, und 1% FCS in PBS konnte die Cytokinkonzentration mittels Durchflußzytometrie und Anticytokin PE-conjugierten Antikörpern (BD Biosciences) bestimmt werden. Diese Arbeitweise zum Nachweis der Cytokinproduktion wurde umfassend von Wittmann, B. et al. 1999 in Blood (Vol. 94, Seite 1717-1726) publiziert.
Luciferase Reporter Genassay: Um den Einfluß gewünschter Inhibitorkonzentrationen und der Photoschaltung sichtbar machen zu können, wurden mit NFAT-luc Reporterplasmid (Strategene, Niederlande) durch Elektroporation (Amaxa, Köln) transfizierte Jurkat-Zellen hergestellt. Nach Inkubation dieser Zellen für 20 min und einer weiteren Inkubation mit oder ohne Bestrahlung bei 366 nm für 30 min, wurden die Zellen durch Zugabe von 10 ng/ml PMA und 1 g/ml lonomycin stimuliert und weitere 5 h inkubiert. Danach wurde die Konzentration an Luziferase mittels kommerziellem Luziferaseassay (Promega, Mannheim) bestimmt. Als interner Kontrollstandard wurde die Expression von mit ß-Galaktosidase kotransfizierten Zellen genutzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Abbildungen 5a und 5b zusammengefaßt, die im folgenden erläutert werden: 5a) Jurkat-Zellen werden mit PMA/Ionomycin stimuliert und danach verschiedenen Cyclosporinderivaten ausgesetzt. CsA und Cs10 führen konzentrationsabhängig zur vollständigen Hemmung der Stimulation. Wird Cs11 analog Beispiel 3 bestrahlt und dann den stimulierten Zellen zugesetzt, wird der Inhibitionseffekt konzentrationsabhängig nicht mehr wie für die chemisch hergestellte Substanz Cs12 beobachtet. 5b) Im Unterschied zu Versuch 5a erfolgt jetzt die Bestrahlung der Jurkat- Zellen nach Applikation von Cs10. Es zeigt sich eindeutig, daß auch hier durch die Bestrahlung die Inhibition aufgehoben werden kann.
Beispiel 4: Photoschaltung(I) Die Photokonversion von Cs10 in Cs12 läßt sich leicht mittels RP-HPLC-Trennung und nachfolgender Massenspektrometrie durchführen, wie dies beispielgebend hier dargestellt ist. Dazu wird Licht mit einer Handlampe (Dr. Gröbel UV-Elektronik GmbH, 2-5062, 254/366nm) für 10, 20, 30 oder 60 min auf eine äthanolische Probe von Cs10 (10 mg/ml) bei 23 °C in einer Küvette gerichtet. Unmittelbar nach der Bestrahlung wird die Probe mittels HPLC getrennt. Die Abbildung 4 zeigt ein typisches Laufverhalten der zu unterschiedlichen Zeiten bestrahlten Substanz im Vergleich zur unbehandelten Probe. Die angefertigten Massenspektrogramme der aufgetrennten Proben entsprachen der Verbindung Cs10 (vor Bestrahlung) bzw. Cs12 (nach 60 min. Bestrahlung).
Beispiel 5: Photoschaitung(H)
Der im Beispiel 3 aufgeführte NFAT-Reporter-Gen-Assay ist gut geeignet den Effekt einer Aktivierung der Substanz Cs10 zu Cs12 anhand der NFAT-Translokation sichtbar zu machen. Wie in Abbildung 5 dargestellt und oben ausgeführt, wurden mit Reporterplasmid transfizierte Jurkatzellen mit Cs10 in Konzentrationen von 20 bis 100 nM für 20 min inkubiert, dann für 30 min mit einer Lichtquelle (366nm) bestrahlt und anschließend wurde nach Stimulierung der Zellen mit PMA/Ionomycin über 5 h die Luziferaseaktivität gemessen. Zur Kontrolle der beobachteten Effekte wurde auf eine Bestrahlung verzichtet, bzw. die reine Substanz Cs12 im Vergleich zu Cs10 verwendet. Die Auswertung der in Abbildung 5a zusammengestellten Ergebnisse läßt sich wie folgt zusammenfassen: a) Die Zugabe von PMA/Ionomycin führt zur NFAT Reportergenaktivierung b) Die zusätzliche Gabe zu (a) von Cs10 hemmt diese Aktivierung dosisabhängig c) Die zusätzliche Gabe zu (a) von mit Licht bestrahltem Cs10 hemmt diese Aktivierung nur in hohen Dosen d) Die Bestrahlung der Zellen nach Applikation von Cs10 führt zu ähnlichen Effekten wie die Applikation von Substanz Cs12
Beispiel 6: Aktivierung durch en∑ymatische Spaltung
Durch Herstellung eines Cyclosporinderivates bei dem in 8-Position (entsprechend Formel 1) der Substituent -CH2-0-CH2C(0)NH(CH2)2NHC(0)OC2H5 entsprechend einem Analoga . des Typs A10 eingeführt wurde, wird diese Verbindung nun von Esterasen (EC 3.1.1) als Substrat akzeptiert. Nach Hydrolyse des Ethylesters kommt es zur spontanen C02-Abspaltung und zur Bildung eines A12-AnaIoga, welches hier einem Cyclosporinderivat mit einem Substituent -CH2-0-CH2C(0) H(CH2)2NH2 entspricht. Als Esterase wurde eine kommerzielle Carboxylesterase (Sigma, E3019) aus Schweineleber bei folgenden Reaktionsbedingungen verwendet: 100 μg CsA8--CH2-0-CH2C(0)NH(CH2)2NHC(0)OC2H5 werden in 100 μ\ DMSO gelöst und anschließend zu 2 ml 25 mM Trispuffer (pH 8), welcher 30 Units Esterase enthält gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur (ca. 23 °C) stehen gelassen. Die Trennung des Reaktionsansatzes mittels HPLC zeigt ein Abbildung 4 entsprechenden Reaktionsumsatz mit nahezu vollständiger Bildung der Substanz CsA8-CH2-0-CH2C(0)NH(CH2)2NH2 welche dem Analoga A12 entspricht. Die Umwandlung der Substanz mittels enzymatischer Hydrolyse kann durch Zusatz entsprechender Menge an Esteraseinhibitor, wie z.B. dem humanen Esteraseinhibitor C-1 (Sigma, E0518) verhindert werden.
Beispiel 7: Aktivierung durch Änderung des pH-Wertes
Durch Herstellung eines Cyclosporinderivates bei dem in 8-Position (entsprechend Formel 1) der Substituent -CH2-0-CH2C(0)NH(CH2)3NHC(0)OCH3 entsprechend einem Analoga des Typs A10, eingeführt wurde, wird diese Verbindung empfindlich gegenüber einer Katalyse durch Säuren- oder Basen. Nach Hydrolyse des Methylesters kommt es zur spontanen C02-AbspaItung und zur Bildung eines A12- Analoga, welches hier einem Cyclosporinderivat mit einem Substituenten -CH2-0- CH2C(0)NH(CH2)3NH2 entspricht. Folgende Reaktionsbedingung wurde angewendet: 200 //g CsA8-CH2-0-CH2C(0)NH(CH2)3NHC(0)OCH3 werden in 150 /I DMSO gelöst und anschließend zu 2 ml 50 mM Glycinpuffer (pH 13), gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur (ca. 23 °C) stehen gelassen. Die Trennung des Reaktionsansatzes mittels HPLC zeigt ein der Abbildung 4 entsprechenden Reaktionsumsatz mit nahezu vollständiger Bildung der Substanz CsA8-CH2-0-CH2C(0)NH(CH2)3NH2 welche dem Analoga A12 entspricht.
Beispiel 8: Synthese von [O-carboxymethyl D-Ser f CsA (Cs6) Eine Lösung von 60mg [D-Ser]8 CsA, te/f-butyl Bromoacetat (20mg) und 5mg Benzyltriethylammoniumchlorid in 1 ml CH2CI2 wurde für zwei Stunden bei 23°C mit 2ml 30% NaOH wäßriger Lösung verrührt. Danach wurde die Lösung mit 10 ml Wasser verdünnt und zwei mal mit Äther extrahiert. Danach wurde die organische Phase mit Na2S04 getrocknet. Anschließend wurden ohne weitere Trennschritte 30 ml methanolische KOH-Lösung (60mM) dazugegeben und für weitere drei Stunden gerührt. Nach Zugabe einer äquivalenten Menge Essigsäure, wurde mittels Rotationsverdampfer der größte Teil Essigsäure und Methanol entfernt. Danach wurden 200 ml Äthylazetat hinzugegeben und die Mischung mit Wasser gewaschen. Nach Separation der organischen Phase und Trocknung mit Na2S04, wurde die gesuchte Verbindung mittels RP HPLC (94%) abgetrennt. Das MALDI- Massenspektrum (m/z) von 1276.8 [MH]+ stimmte sehr gut mit dem berechneten von cal. 1275.7 überein.
Beispiel S: Synthese von [Q-(NH2(CH2)5NHC(O)-CH2-) D-Ser]8 CsA (Cs12)
Ein Teil (100mg) Cs6 (Beispiel 8), 3 Teile von NH2(CH2)5NHBoc, 4 Teile von PyBop und 8 Teile von DIPEA werden zu 5 ml CH2CI2 gegeben und bei 23°C über Nacht gerührt. Danach werden 40ml Äthyl acetate hinzugegeben und die organische Phase nacheinander mit 5% NaHS0 > 5% NaHC03 and gesättigter wäßriger NaCI-Lδsung gewaschen, and anschließend mit Na2S0 getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels mittels Vakuumverdampfer konnte das Produkt (Cs9) mittels C8 HPLC (96%) abgetrennt werden. Das MALDI-Massenspektrum (m/z) von 1461.3 [MH]+ stimmte sehr gut mit dem berechneten von 1460.2 überein. Zur Entfernung der Boc-Schutzgruppe wurde Cs9 mit 5ml ZnCI2/Äther in Äther unter Schutzgas (N2) für 3 Stunden versetzt. Danach wurde durch Zugabe von 0.1 ml Wasser and 15ml Acetonitril gefällt und anschließend filtriert. Nach Entfernen des organischen Lösungsmittels mittels Vakuumverdampfer konnte Cs12 mittels C8 HPLC (86%) erhalten werden. Das Produkt konnte mittels 1H NMR: δ: 9.50(m), 8.42(m), 8.08(m), 7.56(m), 6.84(m), 5.62(s), 5.52(s), 5.40(m), 5.28(m), 5.19(s), 4.60(m), 4.10(m), 3.58- 3.40(171), 3.14(m), 3.03(m), 2.84(m), 2.75(m), 2.70(s), 1.81 (171), 1.72(m), 1.59(m), 1.18-1.40(m), 0.70-1.15(m) und MALDl-Massenspektrometrie (m/z) mit 1361.3 [MH]+ bestimmt werden und entsprach damit gut der berechneten Masse von 1360.1 Beispiel 10: Synthese von [0-(NVOCNH(CH2)5WHC(0)CH2-) D-Ser]8 CsA (Cs10)
Ein Teil (30mg) Cs12, 2 Teile von NVOC-CI, 4 Teile von DIPEA werden zu 2 ml DMF gegeben und bei 23°C über Nacht gerührt. Anschließend wurden 40 ml Äthylazetat hinzugegeben und die organische Phase nacheinander mit 5% NaHS04, 5% NaHC03 und gesättigter wäßriger Kochsalzlösung gewaschen und nachfolgend mit Na2S04 getrocknet. Nach einengen mittels Rotationsverdampfer konnte das Produkt mittels C8 HPLC (90%) abgetrennt werden. Das MALDI-Massenspektrum (m/z) von 1601.0 [MH stimmte sehr gut mit dem berechneten von cal. 1599.6 überein.
Beispiel 11: Einfluß von Cs12 auf die Proliferation
Cs12 wird entweder chemisch entsprechend Beispiel 8 synthetisiert oder mittels Bestrahlung aus Cs10 (Beispiel 3) hergestellt. Blutzellen (PBMCs) werden mit CFSE markiert und mit anti-CD3/anti-CD28 stimuliert, wie dies in Beispiel 2 (T- Zellproliferation) angegeben ist. Nach Inkubation mit DMSO (als Kontrolle), Cs12 (1//M) oder CsA (50 nM) über 5 Tage wird die Markierung in Abhängigkeit von der Zellzahl mittels FACS gemessen. In Abbildung 5a ist das Ergebnis dargestellt. Die eingetragenen Prozentsätze entsprechen der Konzentration an proiiferierenden Zellen. Im Gegensatz zu CsA hat Cs12 keinen Einfluß auf die Proliferation dieser Zellen.
Beispiel 12: Einfluß von Cs12 auf die Cytokinbildung
Cs12 wird entweder chemisch entsprechend Beispiel 8 synthetisiert oder mittels Bestrahlung aus Cs10 (Beispiel 4) hergestellt. Eine FACS-Analyse und Stimulationsprozedur mit PMA/Ionomycin, einschließlich der notwendigen Gabe von Brefeldin während der Stimulationsproezdur von PBMC wurde weitgehend analog der in Beispiel 2 (T-Zellproliferation) angegeben Prozedur durchgeführt und stützt sich im wesentlichen auf die in der Literatur üblichen Prozedeuren (wie z.B. Wittmann, B. et al. Blood 94(1999)1717). Die Effektoren werden 10 min vor der oben beschriebenen Stimulierung zu den PBM-Zellen bei 37 °C zugegeben. In Abbildung 5b ist das Ergebnis der Wirkung dargestellt. Die eingetragenen Prozentsätze entsprechen dem prozentualen Anteil an Zellen, die Interleukin 2 (Abbildung 5b oben) oder IFN-gamma (Abbildung 5b unten) produzieren. Im Gegensatz zu CsA hat Cs12 keinen Einfluß auf die Cytokinproduktion und entspricht in seiner Wirkung der Kontrolle, welche nur das Lösungsmittel der Wirkstoffe (DMSO) enthielt.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Cyclosporin-Analogon der allgemeinen Formel (I)
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Rä (0. X R8-R7-R6-R5-R4 wobei R1 für N-Methyl-(4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyi-L-threonin (MeB T) oder Dihydro-MeBMT steht; R2 für α-Aminobuttersäure (Abu) oder ein an einer oder mehreren Positionen der Seitenkette fluoriertes Derivat dieser Aminosäure steht; R3 für N-Methyl-D-alanin (D-MeAla) oder N-Methyl-glycin (Sarkosin (Sar)) oder ein fluoriertes Derivat davon steht; R4, R6, R9 und R10 unabhängig voneinander für N-Methyl-L-Ieucin (L-MeLeu) oder ein fluoriertes Derivat davon stehen; R5 für L-Vaiin (Val) oder ein fluoriertes Derivat davon steht; R7 für L-AIanin (Ala) oder ein fluoriertes Derivat davon steht; R11 für N-Methyl-L-valin (L-MeVal) oder ein fluoriertes Derivat davon steht; und R8 steht für
(a) -NH-CH(CO)- Y-CH-X-(CH2)mC(0)NH(CH2)n-Z wobei X für O oder S steht, Y für H oder Methyl steht, m einen Wert zwischen 0 und 5 hat, n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, Z für N-R12R13 oder NHC(0)OR14 steht, wobei R12 für H, Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl oder eine photolysierbare Gruppe steht und R13 für H oder einen C1 -C8-Alkylrest steht, und R14 für eine säure-/basenlabile oder eine enzymatisch spaltbare Gruppe steht; oder
(b) -NH-CH(CO)- Y-CH-X-(CH2)mNHC(0)(CH2)n-Z wobei X für O, S oder CH2 steht, Y für H oder Methyl steht, m einen Wert zwischen 0 und 5 hat, n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, Z für N-R12R13 oder NHC(0)OR14 steht, wobei R12 für H, Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl oder eine photolysierbare Gruppe steht, und R13 für H oder einen C1-C8-Alkylrest steht, und R14 für eine säure-/basenlabile oder eine enzymatisch spaltbare Gruppe steht.
2. Cyclosporin-Analogon nach.- Anspruch 1 , wobei die photolysierbare Gruppe eine gegebenenfalls substituierte Nitroarylgruppe ist.
3. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 2, wobei die gegebenenfalls substituierte Nitroarylgruppe 2-Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC), α-Carboxy-2- Nitrobenzyl (CNB), 1-(2-NitrophenyI)ethyl (NPE), 1-(4,5-Dimethoxy-2- NitrophenyI)ethyl (DMNPE) oder 5-Carboxymethoxy-2-NitrobenzyI (CMNB) ist.
4. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 1 wobei R12 H ist.
5. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 1 wobei die säure-/basenlabile oder enzymatisch spaltbare Gruppe Methyl, Ethyl, Methoxymethyl (MOM), - CH2CH2F, Methylthiomethyl (MTM), ß-Glucuronid, D-Glucopyranosyl, ß-D- Galactopyranosyl, tetra-O-Acetyl-D-Glucopyranosyl, oder tetra-O-Acetyl-ß-D- Galactopyranosyl ist.
6. Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R2 für Abu steht; R3 für Sar oder D-MeAIa steht; und R7 für Ala steht.
7. Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei R1 für MeBmt steht; R3 für Sar steht; R4, R6, R9 und R10 für L-MeLeu stehen; R5 für L-Val steht; und R11 für L-MeVal steht.
8. Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 7, das Cyclophiiin und Calzineurin hemmt.
9. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 8, wobei die Peptidyl-ProIyl-lsomerase- Aktivität von Cyclophiiin gehemmt wird.
10. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 8 oder 9, wobei die Proteinphosphatase- Aktivität von Calzineurin gehemmt wird.
11. Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der ICso-Wert für die Hemmung von Cyclophiiin kleiner als 10 μM ist, und der ICso-Wert für die Hemmung von Calzineurin kleiner als 10 μM ist.
12. Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 8 bis 11 , wobei die Calzineurin-hemmende Wirkung durch Photolyse, Zugabe eines Enzyms oder Änderung des pH-Wertes reduziert werden kann.
13. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 12, das [0-(NVOCNH(CH2)5NHC(0) CH2-) D-Ser]8 CsA ist.
14. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 4, das Cyclophiiin, nicht aber Calzineurin hemmt.
15. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 14, wobei die Peptidyl-Prolyl-lsomerase- Aktivität von Cyclophiiin gehemmt wird.
16. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 14 oder 15, wobei der ICso-Wert für die Hemmung von Cyclophiiin kleiner als 10 μWΛ ist, und der ICso-Wert für die Hemmung von Calzineurin größer als 10 μM ist.
17. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 16, das [0-(NH2(CH2)5NHC(0)CH2-) D- Ser]8 CsA ist.
18. Verfahren zur Herstellung des Cyclosporin-Analogons nach einem der Ansprüche 4 oder 14 bis 16 unter Verwendung von [D-Ser]8- oder [D-Cys]8- Cyclosporin A, CPG-Bromoacetat und einer Verbindung der Formel NH2(CH2)nNH-APG, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, APG eine Aminoschutzgruppe und CPG eine Carboxylschutzgruppe bedeutet.
19. Verfahren zur Herstellung des Cyclosporin-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 6 bis 13 unter Verwendung von [D-Ser]8- oder [D-Cys]8- Cyclosporin A, CPG-Bromoacetat, einer Verbindung der Formel NH2(CH2)nNH- APG, wobei n eine ganze Zahl zwischen 3 und 10 ist, APG eine Aminoschutzgruppe und CPG eine Carboxylschutzgruppe bedeutet, und einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe umfassend NVOC, CNB, NPE, DMNPE und CMNB.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 oder 19, wobei die Carboxylschutzgruppe tert-Butyl und die Aminoschutzgruppe Boc ist.
21. Verfahren zur Abspaltung des Restes R12 des Cyclosporin-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 6 bis 13, wobei das Cyclosporin-Analogon mit ultraviolettem Licht bestrahlt wird.
22. Verfahren zur Abspaltung der C(0)OR14-Gruppe des Cyclosporin-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 13, wobei das Cyclosporin- ' Analogon mit einem Enzym, einer Säure oder einer Base versetzt wird.
23. Arzneimittel, enthaltend ein Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
24. Arzneimittel, enthaltend ein Cyclosporin-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 13, wobei die Wirkung des Arzneimittels durch Photolyse, Zugabe eines Enzyms oder Änderung des pH-Wertes verändert werden' kann.
25. Arzneimittel nach Anspruch 24, wobei die Wirkung vor oder nach Verabreichung verändert werden kann.
26. Verwendung des Cyclosporin-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 13 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Immunsuppression, und/oder zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, chronischen Entzündungen, HIV-Infektion, Multi-Drug Resistance (MDR) und/oder Asthma und/oder zur Verhinderung der Abstoßung von Transplantaten, zur Sensitivierung von Krebszellen für die Chemotherapie und/oder zum Schutz der Lunge vor hypoxischen Schäden, zur Neuroprotektion oder Neuroregeneration, zur Therapie von bakteriellen oder parasitären Erkrankungen bei Mensch und Tier.
27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei die immunsuppressive Wirkung und/oder Nebenwirkungen des Arzneimitteis durch Photolyse, Zugabe eines Enzyms oder Änderung des pH-Wertes reduziert werden kann.
28. Verwendung nach Anspruch 27, wobei die Photolyse, Zugabe eines Enzyms oder Änderung des pH-Wertes vor oder nach der Verabreichung des Arzneimittels erfolgen kann.
29. Verwendung der Cyclosporin-Analogons nach einem der Ansprüche 4 oder 14 bis 17 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung der Immunsuppression, und/oder zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, chronischen Entzündungen, HIV-Infektion, Multi-Drug Resistance (MDR) und/oder Asthma und/oder zur Verhinderung der Abstoßung von Transplantaten, zur Sensitivierung von Krebszellen für die Chemotherapie und/oder zum Schutz der Lunge vor hypoxischen Schäden, zur Neuroprotektion oder Neuroregeneration, zur Therapie von bakteriellen oder parasitären Erkrankungen bei Mensch und Tier.
30. Verwendung nach Anspruch 26 und 29, wobei die Autoimmunerkrankungen und chronischen Entzündungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend Systemischer Lupus Erythematosus (SLE), Chronische Rheumatoide Arthritis, Typ 1 Diabetes, chronische entzündliche Darmerkrankungen, Gallenzirrhose, Uveitis, multiple Sklerose, Morbus Crohn, Colitis ulzerosa, bullöses Pemphigoid, Sarkosidose, Psoriasis, atopischer Dermatitis, Ichthyosis oder Graves Opthalmopathie.
31. Cyclosporin-Analogon nach Anspruch 12 oder Verfahren nach Anspruch 22 oder Verwendung nach Anspruch 27 oder 28, wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Hydrolasen, Esterasen, Proteasen, Peptidasen und Glycosidasen.
32. Verwendung nach Anspruch 27, 28 oder 31 , wobei die Nebenwirkung des Arzneimittels ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Nephrotoxizität, abnormale Leberfunktion, Hirsutismus, Zahnfleischhypertrophie, Tremor, Hyperästhesie, gastrointestinale Störungen und Zunahme der Inzidenz für unterschiedliche Tumore.
PCT/EP2005/000919 2004-03-11 2005-01-31 An der hydroxylgruppe midifizierte ‘d-ser!8-cyclosporine mit schaltbarer hemmung der proteinphosphatase calzineurin und dadurch gezielter manipulierbarkeit der immunosuppressiven wirkung unter beibehaltung der peptidyl-prolyl-cis-trans-isomerase (ppi) inhibition z.b. zur behandlung von autoimmunerkrankungen WO2005087798A1 (de)

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