WO2005078427A1 - Dispositif de mesure instantanee et continue de substances en phase aqueuse - Google Patents

Dispositif de mesure instantanee et continue de substances en phase aqueuse Download PDF

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WO2005078427A1
WO2005078427A1 PCT/FR2005/000309 FR2005000309W WO2005078427A1 WO 2005078427 A1 WO2005078427 A1 WO 2005078427A1 FR 2005000309 W FR2005000309 W FR 2005000309W WO 2005078427 A1 WO2005078427 A1 WO 2005078427A1
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biological fluid
sensitive
isfet
sensor
fluid
Prior art date
Application number
PCT/FR2005/000309
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English (en)
Inventor
Pierre Montoriol
William Sant
Pierre Temple-Boyer
Nicole Jaffrezic
Original Assignee
Hemodia
Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.)
Ecole Centrale De Lyon
Centrale Lyon Innovation
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Publication date
Application filed by Hemodia, Centre National De La Recherche Scientifique (C.N.R.S.), Ecole Centrale De Lyon, Centrale Lyon Innovation filed Critical Hemodia
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS
    • G01N27/4145—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS specially adapted for biomolecules, e.g. gate electrode with immobilised receptors

Definitions

  • the present invention relates to a device for instantaneous and continuous measurement of the constituents of a biological fluid, using integrated electro-chemical sensors, and more particularly sensors derived from the technology of field effect transistors sensitive to an ionic species. (ISFET).
  • ISFET ionic species.
  • periodic hemodialysis treats more than 30,000 patients with renal failure, and more than 300,000 in the United States. It consists in purifying the blood of nitrogenous metabolic waste (in particular urea and creatinine) and in regulating the hemodynamic balance of the patient.
  • nitrogenous metabolic waste in particular urea and creatinine
  • the control of the hydro-sodium balance and the urea-creatinine balance are generally carried out on two samples, at the beginning and at the end of the dialysis session, by blood test or on plasma water containing ions (H +, K + , Na +) and small molecules (urea, creatinine, glucose).
  • the aim of the present invention is to propose a system making it possible to adapt the session to each particular patient, by means of the continuous measurement of the blood concentrations during dialysis in order to quantify with precision the effectiveness of the dialysis by measuring the purification of urea and crealitiin. This measure giving access to the efficiency indexes linked to purification appears to be essential for the good long-term conduct of dialysis treatments.
  • An electrochemical sensor for instantly detecting urea in a fluid obtained from dialysis is described in patent application WO 98/28613.
  • This device consists of an electrode comprising an oxide layer sensitive to variations in pH and covered with a sensitive layer incorporating a urease.
  • the urea contained in a sample of the fluid to be analyzed brought into contact with the sensitive layer, reacts with the purease and causes a variation in the pH which is detected by the oxide layer.
  • This device requiring the collection of a drop of blood, performs a discreet measurement and is not suitable for continuous measurement.
  • the device according to the present invention provides a particularly advantageous solution because it allows the direct and continuous measurement of the chemical and biochemical parameters directly on the biological fluid during a treatment during a dialysis session.
  • the device according to the invention for the quantitative measurement of substances present in a biological fluid comprises - a sealed enclosure delimiting a measurement chamber, provided with an inlet orifice and with an outlet orifice allowing the circulation of said biological fluid through said measurement chamber,
  • Biological fluid means any liquid or viscous medium of biological origin or containing substances of biological origin. Such a fluid has a consistency such that it can circulate in a conduit under the effect of a pump. It can be a natural biological fluid such as blood, a treated biological fluid (for example plasma, a dialysis effluent) or a synthetic fluid containing biological elements.
  • the substances can be a natural biological fluid such as blood, a treated biological fluid (for example plasma, a dialysis effluent) or a synthetic fluid containing biological elements.
  • ions such as sodium, potassium, or small organic molecules such as urea, creatinine, glucose.
  • the pH measurement is also frequently carried out.
  • the enclosure 25 forming the device of the basic structure of the invention may have any shape, for example cylindrical or parallelepipedal. Preferably its section is substantially constant so as to allow a regular flow of the biological fluid in the measurement chamber.
  • This enclosure can be manufactured by any means available to those skilled in the art according to the rules of the art and the regulations in force, for example
  • the inlet and outlet ports allow the circulation of said biological fluid through the measurement chamber.
  • they are arranged vis-à-vis on two opposite walls of the enclosure, so as to facilitate the smooth flow and without turbulence of the biological fluid in the measurement chamber.
  • the inlet orifice must be connected to a conduit for supplying biological fluid and the outlet orifice must be connected to a conduit for discharging said fluid.
  • the device according to the invention comprises means for sealingly connecting the inlet orifice and the outlet orifice to the fluid circuit of an apparatus for treating a biological fluid.
  • the measurement chamber is the space defined by the interior volume of the enclosure. It contains at least one conventional sensor of the ISFET type sensitive to at least one substance present in said biological fluid, the concentration of which it is desired to measure, and during the operation of the device according to the invention, it is continuously traversed by the biological fluid at analyze. Said chemical sensor is therefore constantly swept by said fluid.
  • ISFET type chemical sensor designates an electronic component comprising a printed circuit comprising metal tracks (often also called PCB for Printed Circuit Board) and serving as a support for at least one ISFET. Said at least one ISFET is connected to the metal tracks by connection pads and electrical conductors, the assembly ensuring the polarization and the conduction of the electrical signal appearing at the level of the ISFET towards the means of transmitting the signal to a reader. data.
  • PCB Printed Circuit Board
  • ISFET Ion Sensitive Field Effect Transistor
  • the use of ISFET for ion measurement is well known. This technique was developed on the basis of the classic MOSFET transistor (field effect transistor voltage controlled by a metal grid) in which the metal grid is replaced by a system composed of a reference electrode, of the electrolyte to be analyzed. and an insulating grid sensitive to the concentration of an ionic species, generally H +.
  • the insulating grid can also be functionalized by a layer sensitive to a given chemical or biochemical species. This layer, covering the insulating grid, contains a compound reacting with said chemical or biochemical species by inducing a variation in pH which is detected by the insulating grid. We then say that the ISFET is "functionalized”. ISFETs functionalized with biochemical compounds (antibodies, enzymes, ...) are called BioFET.
  • ISFETs are for example described in "Thirty years of ISFETOLOGY (P. Bergveld,
  • ISFET is used to designate all the ISFETs, whether they are functionalized or not.
  • the means of transmitting the signal emitted by said chemical sensor essentially comprise a pin ensuring the connection between the printed circuit and an electrical cord 1 f) connected to the data reader.
  • a standard connector can be used without inconvenience.
  • the enclosure has a part whose shape allows the connection of said connector.
  • the function of the data reader is to transform the signals from said chemical sensor into 1 _ digital values which can be used directly by the medical profession.
  • Such systems for reading information from a measuring device have been known and used for a long time.
  • said sensor j . chemical comprises a first ISFET sensitive to a first substance present in said biological fluid and a second ISFET sensitive to a second substance present in said biological fluid.
  • a single sensor is in this case provided with two neighboring ISFETs on a printed circuit, each of the ISFETs being connected by suitable metal tracks to the signal transmission means. It is thus possible to measure the concentrations of ry - two substances present in the biological fluid using a single device.
  • the choice of reactive compounds used to functionalize the first and second ISFETs will therefore be determined by the nature of the chemical or biochemical species to be assayed.
  • the ISFET used is specifically an ENFET (Enzymatic Field Effect Transistor), that is to say an ISFET whose sensitive area has a layer comprising an enzyme.
  • ENFET Enzymatic Field Effect Transistor
  • This particular type of ISFET exploits the fact that the enzyme which it contains causes the hydrolysis of the substrate to be assayed and, consequently, a modification of the pH of the assay solution in the vicinity of the sensitive surface of the ISFET.
  • the variations of ⁇ c pH are thus directly related to the concentration of the substrate to be assayed.
  • said first and second ISFETs are ENFET sensitive to substances capable of constituting the substrate for an enzymatic reaction present in said biological fluid.
  • said first and second ISFETs are ENFETs sensitive respectively to urea and to CTeatinine.
  • the device can include a reference ISFET (REFET).
  • REFET reference ISFET
  • a measuring device as described above is claimed in which said chemical sensor comprises a) at least one ISFET comprising a sensitive zone
  • said sensor can comprise two or even several ISFETs, each one being provided with means ensuring the n electrical contacts with the means. transmission of the transmitted signal.
  • said chemical sensor comprises a) at least one ENFET having a sensitive area to pH variations covered with a layer comprising an enzyme capable of catalyzing a reaction with a substance present j, in the biological fluid by producing or consuming a species inducing a variation in pH, said enzymatic layer being capable of being in contact with said biological fluid, b) means for ensuring electrical contacts between said at least one ENFET and said means of signal transmission, c) an encapsulation layer making it possible to isolate said electrical contact means from the biological fluid.
  • said sensor can comprise two or even several ENFETs, each being provided with means ensuring electrical contacts with the means for transmitting the signal emitted.
  • said enzymatic layer comprises a photosensitive hydrophilic polymer
  • the sensor thus defined will therefore be intended to measure the concentration of urea and creatinine in the biological fluid analyzed.
  • the type and specific activity and amount of the enzyme present in the layer enzymatic will be chosen according to the desired sensitivity of the sensor vis-à-vis the assayed species, different biological fluids that may contain said species in ranges of different concentrations.
  • Commercial preparations of selected or recombinant enzymes of defined activity are available from specialized companies.
  • the chemical sensor as described above is placed in the measurement chamber, and conveniently fixed on the interior wall of the enclosure so that the sensitive areas are in contact with the fluid to be analyzed.
  • the sensitive zones will be placed at the same level with respect to the flow of the biological fluid. In this way the fluid in contact with sensitive areas is likely to have exactly the same characteristics.
  • the products of the enzymatic reaction do not diffuse on the neighboring ENFET and do not
  • said two ISFETs can be placed in the measurement chamber on an axis perpendicular to the direction of circulation of said biological fluid.
  • the senor is the most fragile element and it is also the most expensive, in particular as regards a sensor with two ENFETs.
  • the enzyme layer even when it is produced using non-aggressive methods for the enzyme, has a relatively short lifespan. It should therefore be replaced j,. regularly. It is envisaged for this, either to completely replace the device according to the invention, or to replace only the sensor.
  • said chemical sensor is removable, that is to say that the printed circuit constituting the support of the sensor can be inserted into the measurement chamber and removed r ) later.
  • a window could be provided in the wall of the enclosure, leaving room for the insertion of the sensor, the latter closing said window once in place.
  • the system will be sealed by a seal.
  • This may for example be constituted by an adhesive strip fixed to the periphery of the printed circuit which allows the sensor to be glued to the edge of the insertion window.
  • the operation of the ISFETs involves polarization of the medium in which the measurement is carried out, this polarization being ensured by an electrode of reference.
  • an electrode of reference Taking advantage of the structure of the device according to the invention, it has been imagined to integrate the electrode into the sensor. More precisely, said electrode can be constituted by an additional track on the printed circuit serving as a support for the sensor.
  • the reference electrode ensuring the polarization of the medium is t- an electrode integrated into the chemical sensor.
  • said device comprises means for sealingly connecting the inlet port and the outlet port of said measurement chamber to the fluid circuit of said i Q treatment device.
  • Such an apparatus can in particular be a dialysis generator.
  • the sealed connection means comprise a member supporting at least one reference electrode ensuring the polarization of the medium.
  • the reference electrode For example, one or more gold needles can be used as the reference electrode.
  • a sleeve fixed in a sleeve.
  • the latter can be subjected to the fluid circuit and also ensure the sealed connection with the inlet or outlet of the measurement chamber.
  • the electrode can remain attached to the fluid circuit with the sleeve. It can then be sterilized at the same time as the dialysis line, the metal used being suitable for this type of treatment.
  • the object of the present invention is an apparatus for treating a biological fluid comprising a device as described above for the quantitative measurement of at least one substance present in said fluid.
  • a device as described above for the quantitative measurement of at least one substance present in said fluid.
  • it may be urea and creatinine present in a dialysis effluent after treatment with a dialysis generator.
  • Said processing apparatus may further comprise recording means, storage means and means for processing the data read by said data reader.
  • the methods of collecting and processing data from measurement devices are known and can be implemented according to specifications adapted to the nature of the biological fluid and to the type of analyzes carried out.
  • the storage of the history of events over several days, the possibility of networking, associated with the direct and continuous measurement of the parameters of dialysis offer a
  • the device according to the invention finds an application important for measuring the concentration of substances present in a biological fluid, continuously and in real time.
  • a particularly advantageous application of the device according to the invention is continuous monitoring in real time the concentration of urea and creatinine in a dialysis effluent during a treatment session 5 extrarenal.
  • the device according to the invention can be used for all kinds of assays of a liquid medium comprising at least one substance capable of reacting with, ⁇ a sensor fitted to the device according to the invention.
  • a sensor fitted to the device according to the invention.
  • the evolution of the mineral characteristics can be determined, as well as the microbiological status or the presence of pesticide residues.
  • Figure 1 schematically shows a device for dosing two substances using a chemical sensor comprising two ISFETs.
  • Figure 2 is a schematic view in three dimensions of a chemical sensor comprising two ENFET, before encapsulation ( Figure 2-a) and after encapsulation ( Figure 2-b).
  • Figure 3 shows a three-dimensional view of an enclosure with window for insertion of a sensor.
  • Figure 4 is the response curve of a creatinine-sensitive ENFET, as a function of the ry r concentration of creatinine in the fluid analyzed.
  • Figure 5 is the response curve of an ENFET sensitive to urea, as a function of the urea concentration in the fluid analyzed.
  • the measurement device comprises - a sealed enclosure 1, of parallelepiped shape, delimiting a measurement chamber 2, provided with an inlet orifice 3 and an outlet orifice 4.
  • 5 an ISFET type 5 chemical sensor placed in the measurement chamber 2, - means 6 for transmitting the signal emitted by the ISFET type 5 chemical sensor to a data reader 7.
  • the inlet 3 and outlet 4 openings are arranged opposite two opposite walls of the enclosure 1, so as to facilitate the smooth and turbulence free flow of the biological fluid in the measurement chamber 2.
  • L the inlet 3 is connected to the supply conduit 8 for biological fluid and the outlet 4 is connected to the discharge conduit 9 of said fluid.
  • the measuring device is integrated on a dialysis line 20, at the outlet of the effluent dialysate.
  • the sensor 5 is bonded in the measurement chamber 2 in the axis of the flow of the biological fluid.
  • the sensor 5 comprises two ISFETs 10 and 10 ', presenting the sensitive zones 12 and 12'.
  • the position of the ISFETs 10 and 10 ' defines a straight line perpendicular to the flow of the fluid.
  • the connection pads 17 allow connection with the reader 7 via the pin 18 and the cord 19.
  • Figures 2-a and 2-b illustrate in more detail the structure of a sensor comprising two ENFETs.
  • Figure 2- shows the sensor before encapsulation.
  • Two ISFETs 10 and 10 ' are fixed on a printed circuit 11, the sensitive areas 12 and 12' of which are covered with an enzyme layer 13 and 13 ', thus forming two ENFETs 15 and 15'.
  • the connection wires 14 (here gold wires) connect the ENFETs 15, 15 'to the metal tracks 16 engraved on the printed circuit 11.
  • the metal tracks 16 lead to the connection pads on the rear face of the PCB (not visible here) .
  • the Figure 2-b shows the sensor with the encapsulation layer 23 isolating the electrical connections 14,16, from the liquid medium in which the sensor is intended to operate.
  • a silicone resin or an epoxy resin can be used for the encapsulation layer, or any other insulating material.
  • FIG. 3 represents a three-dimensional view of a device according to the invention.
  • the enclosure 1 has a window 21 into which the sensor 5 is inserted in a fixed or removable manner.
  • the system is sealed by the self-adhesive seal 22, allowing the replacement of the used sensor if desired.
  • EXAMPLE 4 Creatinine-sensitive EFFECT
  • Creatinine is the end product of the metabolism of creatine in mammalian cells. It is an important substance, the measurement of which in biological fluids is widely used as an indicator for the diagnosis of renal, thyroid and muscle functions. It is one of the parameters that is controlled during hemodialysis treatment. In adult humans, the normal creatinine concentration in serum is between 34 and 140 ⁇ M (N.W. Tietz, 1986, Textbook of Clinical Chemistry, Saunders, Philadelphia, 1 Ed., P. 1810). From 140 ⁇ M, it is considered that the renal function is disturbed, and the values above 530 ⁇ M indicate significant renal disorders. The concentration can then reach 1000 ⁇ M (F. S. Sena, D. Syed, R.B. McComb, 1988, Clin. Chem., 34, p. 594)
  • Detection is based on an enzymatic reaction in which creatinine is the substrate for creatine iminohydrolase, which forms N-methylhydantoin with production of ammonia.
  • the ammonia reacts with a proton, modifying the pH in the vicinity of the sensitive zone of the ISFET.
  • creatine deiminase Creatinine + H 2 O ⁇ > N-methylhydantoin + NH 3
  • the enzyme is trapped in a photosensitive polymer.
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PVA polyvinyl alcohol
  • PVA is hydrophilic, compatible with organic materials, it forms very thin layers compatible with the dimensions of microelectronics. It lends itself to the grafting of photosensitive radicals, allowing its use in photolithography, this process being compatible with biological material since it does not use aggressive solvents or at a high temperature.
  • composition of PVA grafted styrylpyridinium containing creatinine deiminase The enzyme used here is creatinine deiminase EC 3.5.4.21, extracted from a microorganism in the form of lyophilized powder. Its specific activity is 41 U / mg of protein. In a PVA / SbQ solution (one volume for one volume H2O), creatinine deiminase is added, up to 10% by mass. This composition is soluble in water, light-curable and photosensitive.
  • the deposition of the enzymatic layer can be carried out by known techniques of photolithography. These techniques make it possible to obtain perfectly defined layers of very small thickness, a condition for having a short response time.
  • the transducer provided with the appropriate masks is exposed to light UN.
  • a bonding layer may be provided, allowing better adhesion of the PVA.
  • Urea is the most common indicator of good cleansing during a dialysis session. In humans, its normal concentration in the blood is between 3 and 10 mmol / 1, but it can rise to several tens of mmol / 1 of plasma in people with renal insufficiency.
  • the detection is based on an enzymatic reaction in which the urea is hydrolysed by the urease with formation of carbon dioxide and production of a hydroxide ion which modifies the pH in the vicinity of the sensitive zone of the ISFET.
  • composition of styrylpyridinium grafted PNA containing urease The enzyme used here is the recombinant urea amidohydrolase EC 3.5.1.5, extracted from E. coli, sounds like lyophilized powder. Its specific activity is 247 U / mg of protein.
  • urease is added in an amount sufficient to carry out the measurement. This composition is soluble in water, light-curable and photosensitive.
  • This example illustrates the use of a device according to the invention for the direct measurement of creatinine and urea, at the outlet of dialysis, at 37 ° C. with a flow rate of 500 ml / min.
  • a sensor as described in Example 2 provided with a first creatinine sensitive E FET prepared as in Example 4, and a second urea sensitive E ⁇ FET prepared as in Example
  • E ⁇ FETs are stuck in the measurement chamber of a device according to the invention.
  • Both E ⁇ FETs have the same composition except for the enzyme.
  • the calibration curves are recorded in the data management system.
  • the supply 8 and discharge 9 conduits are integrated at the outlet of a dialysis line by simple connection.
  • the data reader 7 is connected to the connection pads 17. The values are measured throughout the dialysis session and are read on the reader 7 after processing by a data management system. They can also be saved for long-term medical monitoring.

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Abstract

La présente invention concerne un dispositif de mesure des constituants d’un fluide biologique, à l’aide de capteurs électrochimiques intégrés, comprenant - une enceinte (1) étanche délimitant une chambre de mesure (2), dotée d’un orifice d’entrée (3) et d’un orifice de sortie (4) permettant la circulation dudit fluide biologique à travers ladite chambre de mesure, - des moyens de connexion étanche de l’orifice d’entrée et de l’orifice de sortie de la chambre de mesure au circuit fluidique d’un appareil de traitement d’un fluide biologique, - un capteur chimique de type ISFET (5) sensible à au moins une substance présente dans ledit fluide biologique, ledit capteur étant placé dans la chambre de mesure, - des moyens de transmission (6) du signal émis par ledit capteur chimique de type ISFET à un lecteur de données (7). De préférence, ledit capteur chimique comprend deux ISFET (ion Sensitive Field Effect Transistor) sensibles à deux substances présentes dans ledit fluide biologique. Les ISFET peuvent être des ENFET (Transistor à Effet de Champ Enzymatique) sensibles à des substances constituant le substrat d’une réaction enzymatique, notamment l’urée et à la créatinine. Le dispositif selon la présente invention apporte une solution particulièrement avantageuse car il permet la mesure instantanée et continue des paramètres chimiques et biochimiques directement sur un fluide biologique, par exemple durant une séance d’hémodialyse.

Description

DISPOSITIF DE MESURE INSTANTANEE ET CONTINUE DE SUBSTANCES EN PHASE AQUEUSE
La présente invention se rapporte à un dispositif de mesure instantanée et continue des constituants d'un fluide biologique, à l'aide de capteurs élecfrochimiques intégrés, et plus particulièrement de capteurs issus de la technologie des transistors à effet de champ sensibles à une espèce ionique (ISFET).
Durant ces dernières années, le domaine de la santé a vu une évolution vers une plus grande sûreté de fonctionnement et de prise de décision. L'amélioration des pratiques médicales, cependant, est freinée par les délais existant entre les trois activités complémentaires qui la constituent: le diagnostic, la thérapie et la prévention. Pour résoudre ce problème les technologies de la santé doivent développer des techniques d'analyse médicales in vivo simples, rapides, sûres et peu coûteuses.
En France, Phémodialyse périodique permet de traiter plus de 30 000 patients insuffisants rénaux, et plus de 300 000 aux États-Unis. Elle consiste à épurer le sang des déchets du métabolisme azoté (en particulier l'urée et la créatinine) et à réguler l'équilibre hémodynamique du patient.
Le contrôle de l'équilibre hydro-sodé et le bilan urée-créatinine sont réalisés en général sur deux prélèvements, en début et en fin de séance de dialyse, par prise de sang ou sur l'eau plasmatique contenant des ions (H+, K+, Na+) et de petites molécules (urée, créatinine, glucose).
Bien que des progrès importants aient été réalisés pour concevoir des dispositifs de traitement des fluides biologiques, notamment le traitement du sang par circulation extracorporelle, la surveillance de certains paramètres biologiques en cours de fonctionnement n'est pas possible. De manière générale, on mesure directement sur le circuit des paramètres tels que la pression ou le débit du liquide traité. Pour d'autres paramètres, par exemple des substances telles que l'urée, la créatinine ou les ions K+, Na+ ou H+, un prélèvement de fluide doit être effectué pour analyse par une technique appropriée. Un personnel spécialisé doit être disponible pour effectuer le prélèvement au bon moment, et pour réaliser les manipulations nécessaires sur le dispositif d'analyse adapté. Ceci représente une surcharge de travail importante, alors que le délai pour obtenir le résultat peut être supérieur à la durée du traitement. C'est pourquoi, comme indiqué plus haut, jusqu'à présent le nombre des prélèvements a été limité, par exemple à deux (en début et en fin de séance). Les résultats des analyses servent donc avant tout à définir les conditions présumées les meilleures pour le traitement suivant, mais ne permettent pas l'adaptation du traitement en cours de séance en fonction de ces paramètres.
Pour remédier à cet inconvénient, on a cherché à mettre en relation les paramètres mesurables durant le traitement avec des paramètres calculés reflétant l'efficacité de la dialyse en cours. Des modèles mathématiques essentiellement empiriques ont été développés. Cependant les valeurs obtenues doivent être confirmées par un contrôle sanguin.
La malnutrition est maintenant reconnue comme un facteur de diagnostic et de pronostic important chez les patients sous hémodialyse. Plusieurs études ont montré que deux déterminants majeurs du statut nutritionnel sont l'efficacité de la dialyse et l'apport en protéines. Les paramètres nutritionnels utilisables comme indicateurs de l'état nutritionnel du patient sont notamment l'urée, la créatinine, l'albumine, la préalbumine, le taux de catabolisme des protéines (nPCR) et la perte de masse corporelle.
Le but de la présente invention est de proposer un système permettant d'adapter la séance à chaque patient particulier, grâce à la mesure en continu des concentrations sanguines au cours de la dialyse afin de quantifier avec précision l'efficacité de la dialyse en mesurant l'épuration de l'urée et de la créalitiine. Cette mesure donnant accès aux index d'efficacité liés à l'épuration apparaît comme essentielle à la bonne conduite sur le long terme des traitements de dialyse.
Un capteur électrochimique permettant de détecter l'urée de manière instantanée dans un fluide issu de dialyse est décrit dans la demande de brevet WO 98/28613. Ce dispositif consiste en une électrode comprenant une couche d'oxyde sensible aux variations du pH et recouverte d'une couche sensible incorporant une uréase. L'urée contenue dans un échantillon du fluide à analyser mis en contact de la couche sensible, réagit avec Puréase et provoque une variation du pH qui est détectée par la couche d'oxyde. Ce dispositif, nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang réalise une mesure discrète et n'est pas adapté à une mesure en continu.
Le dispositif selon la présente invention apporte une solution particulièrement avantageuse car il permet la mesure directe et en continu des paramètres chimiques et biochimiques directement sur le fluide biologique au cours d'un traitement durant une séance de dialyse.
Le bon déroulement de la séance peut ainsi être surveillé sans effort supplémentaire du personnel médical, et le traitement peut être modulé de manière quasiment instantanée. Cette solution offre donc un confort amélioré et une grande sécurité pour le patient comme pour le personnel médical. De manière plus détaillée, le dispositif selon l'invention pour la mesure quantitative de substances présentes dans un fluide biologique comprend - une enceinte étanche délimitant une chambre de mesure, dotée d'un orifice d'entrée et d'un orifice de sortie permettant la circulation dudit fluide biologique à travers ladite chambre de mesure,
, 0 - un capteur chimique de type ISFET sensible à au moins une substance présente dans ledit fluide biologique, ledit capteur étant placé dans la chambre de mesure, - des moyens de transmission du signal émis par ledit capteur chimique de type ISFET à un lecteur de données. r Par "fluide biologique" on entend tout milieu liquide ou visqueux d'origine biologique ou contenant des substances d'origine biologique. Un tel fluide a une consistance telle qu'il peut circuler dans un conduit sous l'effet d'une pompe. Il peut s'agir d'un fluide biologique naturel tel que le sang, d'un fluide biologique traité (par exemple du plasma, un effluent de dialyse) ou d'un fluide synthétique contenant des éléments biologiques. Les substances
2Q présentes dans le fluide biologique pour lesquelles des dosages de concentration sont pratiqués sont notamment des ions tels que le sodium, le potassium, ou de petites molécules organiques telles que l'urée, la créatinine, le glucose. La mesure du pH est également fréquemment réalisée.
25 L'enceinte formant la structure de base du dispositif selon l'invention peut avoir une forme quelconque, par exemple cylindrique ou parallélipipédique. De préférence sa section est sensiblement constante de manière à permettre un écoulement régulier du fluide biologique dans la chambre de mesure. Cette enceinte peut être fabriquée par tout moyen à la disposition de l'homme du métier selon les règles de l'art et la réglementation en vigueur, par exemple
30 par moulage ou thermoformage. Elle doit être étanche afin d'éviter les écoulements indésirables du fluide biologique vers l'extérieur du dispositif, mais aussi pour empêcher toute ∞ntamination du fluide par le milieu extérieur ou à l'inverse, du milieu extérieur par le fluide biologique qui peut être porteur de germes pathogènes. Il est également recommandé d'utiliser un matériau opaque, afin de protéger le capteur des effets de la lumière. Tout e matériau rigide compatible avec les fluides biologiques convient, la préférence allant à des matériaux peu onéreux, de mise en œuvre industrielle facile, tels que les matières plastiques. Du fait de la nature des éléments fonctionnels qu'elle comprend, il apparaîtra sans peine que l'enceinte peut adopter des dimensions réduites, ce qui constitue un des avantages notables du dispositif selon l'invention.
Les orifices d'entrée et de sortie permettent la circulation dudit fluide biologique à travers la chambre de mesure. De manière avantageuse, ils sont ménagés en vis-à-vis sur deux parois opposées de l'enceinte, de manière à faciliter l'écoulement régulier et sans turbulence du fluide biologique dans la chambre de mesure. Bien entendu lors de l'utilisation du dispositif, l'orifice d'entrée doit être relié à un conduit d'alimentation en fluide biologique et l'orifice de sortie doit être relié à un conduit d'évacuation dudit fluide. De manière avantageuse, le dispositif selon l'invention comporte des moyens de connexion étanche de l'orifice d'entrée et de l'orifice de sortie au circuit fluidique d'un appareil de traitement d'un fluide biologique.
La chambre de mesure est l'espace défini par le volume intérieur de l'enceinte. Elle contient au moins un capteur clii ique de type ISFET sensible à au moins une substance présente dans ledit fluide biologique dont on souhaite mesurer la concentration, et pendant le fonctionnement du dispositif selon l'invention, elle est en permanence traversée par le fluide biologique à analyser. Ledit capteur chimique est donc en permanence balayé par ledit fluide.
On désigne par "capteur chimique de type ISFET" un composant électronique comprenant un circuit imprimé comportant des pistes métalliques (appelé souvent aussi PCB pour Printed Circuit Board) et servant de support à au moins un ISFET. Ledit au moins un ISFET est relié aux pistes métalliques par des plots de connexion et des conducteurs électriques, l'ensemble assurant la polarisation et la conduction du signal électrique apparaissant au niveau de l' ISFET vers les moyens de transmission du signal à un lecteur de données.
Un ISFET (Ion Sensitive Field Effect Transistor) est un transistor à effet de champ sensible aux ions. L'utilisation d'ISFET pour la mesure d'ions est bien connue. Cette technique a été développée sur la base du transistor classique MOSFET (transistor à effet de champ commandé en tension par une grille métallique) dans lequel la grille métallique est remplacée par un système composé d'une électrode de référence, de l'électrolyte à analyser et d'une grille isolante sensible à la concentration d'une espèce ionique, généralement H+. La grille isolante peut en outre être fonctionnalisée par une couche sensible à une espèce chimique ou biochimique donnée. Cette couche, recouvrant la grille isolante, contient un composé réagissant avec ladite espèce chimique ou biochimique en induisant une variation du pH qui est détectée par la grille isolante. On dit alors que l'ISFET est "fonctionnalisé". Les ISFET fonctionnalisés avec des composés d'origine biochimique (anticorps, enzymes, ...) sont appelés BioFET.
De tels ISFET sont par exemple décrits dans "Thirty years of ISFETOLOGY (P. Bergveld,
, Sensors and Actuators B 6795, 2002, Ed. Elsevier, pp.1-20). Dans la présente demande le terme ISFET est employé pour désigner tous les ISFET, qu'ils soient fonctionnalisés ou pas.
Les moyens de transmission du signal émis par ledit capteur chimique comprennent essentiellement une broche assurant la connexion entre le circuit imprimé et un cordon 1 f) électrique relié au lecteur de données. Un connecteur standard peut être utilisé sans inconvénient. L'enceinte comporte une partie dont la forme permet le branchement dudit connecteur.
Le lecteur de données a pour fonction de transformer les signaux dudit capteur chimique en 1 _ valeurs numériques directement exploitables par le corps médical. De tels systèmes permettant de lire les informations issues d'un dispositif de mesure sont connus et utilisés de longue date.
Selon un mode de réalisation avantageux du dispositif selon l'invention, ledit capteur j . chimique comprend un premier ISFET sensible à une première substance présente dans ledit fluide biologique et un deuxième ISFET sensible à une deuxième substance présente dans ledit fluide biologique. Un capteur unique est dans ce cas pourvu de deux ISFET voisinant sur un circuit imprimé, chacun des ISFET étant relié par des pistes métalliques adéquates aux moyens de transmission du signal. Il est ainsi possible, de mesurer les concentrations de ry - deux substances présentes dans le fluide biologique à l'aide d'un dispositif unique. Le choix des composés réactifs utilisés pour fonctionnaliser les premier et deuxième ISFET sera donc déterminé par la nature des espèces chimiques ou biochimiques à doser.
Lorsque la substance à doser est une espèce biochimique susceptible de constituer le substrat -n d'une réaction enzymatique, l'ISFET utilisé est spécifiquement un ENFET (Transistor à Effet de Champ Enzymatique), c'est-à-dire un ISFET dont la zone sensible est dotée d'une couche comprenant une enzyme. Ce type particulier d'ISFET exploite le fait que l'enzyme qu'il contient entraîne l'hydrolyse du substrat à doser et, par suite, une modification du pH de la solution de dosage au voisinage de la surface sensible de l'ISFET. Les variations du ~ c pH sont ainsi directement reliées à la concentration du substrat à doser.
Dans ce cas, dans le dispositif selon l'invention, lesdits premier et deuxième ISFET sont des ENFET sensibles à des substances susceptibles de constituer le substrat d'une réaction enzymatique présentes dans ledit fluide biologique. Selon un mode préféré de mise en œuvre, lesdits premier et deuxième ISFET sont des ENFET sensibles respectivement à l'urée et à la CTéatinine.
5 Pour éliminer l'influence sur la réponse d'un ISFET des multiples constituants présents dans les milieux complexes tels que les fluides biologiques, notamment les variations de pH, il est connu de mettre en œuvre un système de mesure différentielle à l'aide d'un ISFET de référence (appelé REFET) couplé à l'ISFET de mesure. Dans ce système le REFET est
, 0 identique à l'ISFET de mesure non fonctionnalisé. Ainsi, selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le dispositif peut comprendre un ISFET de référence (REFET).
De manière plus précise, est revendiqué un dispositif de mesure tel que décrit plus haut dans lequel ledit capteur chimique comprend a) au moins un ISFET comportant une zone sensible
- - aux variations de pH, susceptible d'être en contact avec ledit fluide biologique, b) des moyens pour assurer les contacts électriques entre ledit au moins un ISFET et lesdits moyens de transmission du signal, c) une couche d'encapsulation permettant d'isoler lesdits moyens de contact électrique du fluide biologique. Comme indiqué plus haut, ledit capteur peut comporter deux ou même plusieurs ISFET, chacun étant doté de moyens assurant les n contacts électriques avec les moyens de. transmission du signal émis.
Selon une variante de mise en œuvre de l'invention, ledit capteur chimique comprend a) au moins un ENFET comportant une zone sensible aux variations de pH recouverte d'une couche comprenant une enzyme apte à catalyser une réaction avec une substance présente j, dans le fluide biologique en produisant ou en consommant une espèce induisant une variation du pH, ladite couche enzymatique étant susceptible d'être en contact avec ledit fluide biologique, b) des moyens pour assurer les contacts électriques entre ledit au moins un ENFET et lesdits moyens de transmission du signal, c) une couche d'encapsulation permettant d'isoler lesdits moyens de contact électrique du fluide biologique. Comme
» „ indiqué plus haut, ledit capteur peut comporter deux ou même plusieurs ENFET, chacun étant doté de moyens assurant les contacts électriques avec les moyens de transmission du signal émis.
De préférence, ladite couche enzymatique comprend un polymère hydrophile photosensible
~r et une enzyme choisie parmi les uréases et les créatinine-déiminases. Le capteur ainsi défini sera donc destiné à mesurer la concentration en urée et en créatinine dans le fluide biologique analysé. Le type et l'activité spécifique et la quantité de l'enzyme présente dans la couche enzymatique seront choisis en fonction de la sensibilité recherchée du capteur vis-à-vis de l'espèce dosée, différents fluides biologiques pouvant contenir ladite espèce dans des gammes de concentrations différentes. Des préparations commerciales d'enzymes sélectionnées ou recombinantes, d'activité définie, sont disponibles auprès des sociétés „ spécialisées.
Selon la présente invention, le capteur chimique tel que décrit précédemment est placé dans la chambre de mesure, et commodément fixé sur la paroi intérieure de l'enceinte de sorte que les zones sensibles soient en contact avec le fluide à analyser. Lorsque le capteur comporte
. deux ISFET, il est recommandé qu'ils soient soumis aux mêmes conditions. De préférence, les zones sensibles seront placées au même niveau par rapport à l'écoulement du fluide biologique. De cette manière le fluide en contact avec les zones sensibles a toutes les chances d'avoir exactement les mêmes caractéristiques. En outre, dans le cas d'une paire d'ENFET, on évite que les produits de la réaction enzymatique ne diffusent sur l'ENFET voisin et ne
, r viennent perturber la détection.
Selon une caractéristique particulière d'un dispositif à deux- ISFET selon l'invention, lesdits deux ISFET peuvent être placés dans la chambre de mesure sur un axe perpendiculaire au sens de circulation dudit fluide biologique.
20 Dans le présent dispositif le capteur est l'élément le plus fragile et c'est aussi le plus onéreux, en particulier en ce qui concerne un capteur à deux ENFET. En effet, la couche enzymatique, même lorsqu'elle est fabriquée à l'aide de méthodes non agressives pour l'enzyme, a une durée de vie relativement courte. Il convient donc de la remplacer j,. régulièrement. Il est envisagé pour cela, soit de remplacer en totalité le dispositif selon l'invention, soit de remplacer uniquement le capteur.
Dans ce dernier cas, ledit capteur chimique est amovible, c'est-à-dire que le circuit imprimé constituant le support du capteur peut être inséré dans la chambre de mesure et retiré r) ultérieurement. Par exemple, on pourra prévoir une fenêtre dans la paroi de l'enceinte, laissant place à l'insertion du capteur, celui-ci obturant ladite fenêtre une fois en place. L'étanchéïté du système sera assuré par un joint. Celui-ci peut être par exemple constitué par une bande adhésive fixée à la périphérie du circuit imprimé qui permet de coller le capteur sur la bordure de la fenêtre d'insertion.
35 Comme indiqué plus haut, le fonctionnement des ISFET implique une polarisation du milieu dans lequel la mesure est réalisée, cette polarisation étant assurée par une électrode de référence. Mettant à profit la structure du dispositif selon l'invention, il a été imaginé d'intégrer l'électrode au capteur. Plus précisément ladite électrode peut être constituée par une piste supplémentaire sur le circuit imprimé servant de support au capteur. Ainsi, selon une caractéristique intéressante, l'électrode de référence assurant la polarisation du milieu est t- une électrode intégrée au capteur chimique.
Afin de pouvoir adapter facilement le dispositif revendiqué à un appareil de traitement d'un fluide biologique, ledit dispositif comporte des moyens de connexion étanche de l'orifice d'entrée et de l'orifice de sortie de ladite chambre de mesure au circuit fluidique dudit i Q appareil de traitement. Un tel appareil peut être notamment un générateur de dialyse.
Selon une caractéristique avantageuse, les moyens de connexion étanche comprennent un organe supportant au moins une électrode de référence assurant la polarisation du milieu. On peut par exemple utiliser comme électrode de référence une ou plusieurs aiguilles en or
, - fixées dans un manchon. Ce dernier peut être assujetti au circuit fluidique et assurer par ailleurs la connexion étanche avec l'orifice d'entrée ou de sortie de la chambre de mesure. Ainsi, lorsque le dispositif est remplacé, l'électrode peut rester fixée au circuit fluidique avec le manchon. Elle peut alors être stérilisée en même temps que la ligne de dialyse, le métal employé se prêtant à ce type de traitement. Ceci représente un avantage certain, du point de
2 vue sanitaire comme du point de vue économique.
Est objet de la présente invention un appareil de traitement d'un fluide biologique comprenant un dispositif tel que décrit précédemment pour la mesure quantitative d'au moins une substance présente dans ledit fluide. En particulier, il peut s'agir de l'urée et de la 25 créatinine présentes dans un effluent de dialyse après traitement à l'aide d'un générateur de dialyse.
Ledit appareil de traitement peut comprendre en outre des moyens d'enregistrement, des moyens de stockage et des moyens de traitement des données lues par ledit lecteur de ,, A données. Les méthodes de recueil et de traitement de données issues de dispositifs de mesures sont connues et peuvent être mises en œuvre selon un cahier des charges adapté à la nature du fluide biologique et au type d'analyses réalisées. Dans le cas de Phémodialyse, la mise en mémoire de l'historique des événements sur plusieurs jours, la possibilité de mise en réseau, associées à la mesure directe et continue des paramètres de la dialyse offrent une
35 sécurité de traitement inédite.
De par ses caractéristiques techniques, le dispositif selon l'invention trouve une application importante pour la mesure de la concentration des substances présentes dans un fluide biologique, en continu et en temps réel. Une application particulièrement avantageuse du dispositif selon l'invention est la surveillance en continu et en temps réel de la concentration de l'urée et de la créatinine dans un effluent de dialyse au cours d'une séance d'épuration 5 extra-rénale.
De manière générale, au-delà de l'analyse des fluides biologiques tels que définis dans la présente description, le dispositif selon l'invention peut être être utilisé pour toutes sortes de dosages d'un milieu liquide comprenant au moins une substance susceptible de réagir avec , Λ un capteur équipant le dispositif selon l'invention. Citons par exemple l'analyse de l'eau, que ce soit une eau usée ou une eau naturelle. A l'aide d'un capteur selon l'invention, fonctionnalisé par un réactif approprié, l'évolution des caractéristiques minérales pourra être déterminée, ainsi que le statut microbiologique ou la présence de résidus de pesticides.
15 Les exemples de réalisation suivants accompagnés de dessins illustreront des aspects, particuliers de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
• La figure 1 représente schématiquement un dispositif de dosage de deux substances à l'aide d'un capteur chimique comportant deux ISFET.
20 • La figure 2 est une vue schématique en trois dimensions d'un capteur chimique comportant deux ENFET, avant encapsulation (Figure 2-a) et après encapsulation (Figure 2-b). • La figure 3 représente une vue en trois dimensions d'une enceinte avec fenêtre pour insertion d'un capteur. • La Figure 4 est la courbe de réponse d'un ENFET sensible à la créatinine, en fonction de la ry r concentration en créatinine dans le fluide analysé. • La Figure 5 est la courbe de réponse d'un ENFET sensible- à l'urée, en fonction de la concentration en urée dans le fluide analysé.
30 EXEMPLE 1
Dans un premier exemple illustré par la Figure 1, le dispositif de mesure comprend - une enceinte étanche 1, de forme parallélipipédique, délimitant une chambre de mesure 2, dotée d'un orifice d'entrée 3 et d'un orifice de sortie 4. 5 - un capteur chimique de type ISFET 5 placé dans la chambre de mesure 2, - des moyens de transmission 6 du signal émis par le capteur chimique de type ISFET 5 à un lecteur de données 7. Les orifices d'entrée 3 et de sortie 4 sont ménagés en vis-à-vis sur deux parois opposées de l'enceinte 1, de manière à faciliter l'écoulement régulier et sans turbulence du fluide biologique dans la chambre de mesure 2. L'orifice d'entrée 3 est relié au conduit d'alimentation 8 en fluide biologique et l'orifice de sortie 4 est relié au conduit d'évacuation 9 dudit fluide. Dans le présent exemple, le dispositif de mesure est intégré sur une ligne de dialyse 20, en sortie du dialysat efïluent. Le capteur 5 est collé dans la chambre de mesure 2 dans l'axe de l'écoulement du fluide biologique. Dans le présent exemple, le capteur 5 comporte deux ISFET 10 et 10', présentant les zones sensibles 12 et 12'. La position des ISFET 10 et 10' définit une droite perpendiculaire à l'écoulement du fluide. Les plots de connexion 17 permettent le branchement avec le lecteur 7 par l'intermédiaire de la broche 18 et du cordon 19.
EXEMPLE 2
Structure d'un capteur chimique comportant deux ENFET
Les Figures 2-a et 2-b illustrent plus en détail la structure d'un capteur comportant deux ENFET. La figure 2-a fait apparaître le capteur avant encapsulation. Sur un circuit imprimé 11 sont fixés deux ISFET 10 et 10', dont les zones sensibles 12 et 12' sont recouvertes d'une couche enzymatique 13 et 13', formant ainsi deux ENFET 15 et 15'. Les fils de connexion 14 (ici des fils d'or) relient les ENFET 15, 15' aux pistes métalliques 16 gravées sur le circuit imprimé 11. Les pistes métalliques 16 aboutissent aux plots de connexion en face arrière du PCB (non visibles ici).
La Figure 2-b montre le capteur avec la couche d'encapsulation 23 isolant les connexions électriques 14,16, du milieu liquide dans lequel le capteur a vocation à fonctionner. Une résine silicone ou un résine époxy peuvent être utilisées pour la couche d'encapsulation, ou tout autre matériau isolant.
EXEMPLE 3
Dispositif avec fenêtre d'insertion d'un capteur
La figure 3 représente une vue en trois dimensions d'un dispositif selon l'invention. L'enceinte 1 comporte une fenêtre 21 dans laquelle est inséré le capteur 5 de manière fixe ou amovilble. L'étanchéité du système est assuré par le joint autocollant 22, permettant si désiré le remplacement du capteur usagé. EXEMPLE 4 ENFET sensible à la créatinine
La créatinine est le produit final du métabolisme de la créatine dans les cellules des mammifères. C'est une substance importante, dont la mesure dans les fluides biologiques est largement utilisée comme indicateur pour le diagnostic des fonctions rénales, de la thyroïde et du muscle. C'est un des paramètres qui est contrôlé durant le traitement par hémodialyse. Chez l'homme adulte, la concentration normale en créatinine dans le sérum est comprise entre 34 et 140 μM (N.W. Tietz, 1986, Textbook of Clinical Chemistry, Saunders, Philadelphia, 1 Ed., p. 1810). A partir de 140 μM, on considère que la fonction rénale est perturbée, et les valeurs au-dessus de 530 μM indiquent des désordres rénaux importants. La concentration peut alors atteindre 1000 μM (F. S. Sena, D. Syed, R.B. McComb, 1988, Clin. Chem., 34, p. 594)
La détection est basée sur une réaction enzymatique dans laquelle la créatinine est le substrat de la créatine iminohydrolase, qui forme la N-méthylhydantoïne avec production d'ammoniaque. L'ammoniaque réagit avec un proton, modifiant le pH au voisinage de la zone sensible de l'ISFET. créatine déiminase Créatinine + H2O < = > N-méthylhydantoïne + NH3
NH3 + H+ > NH4+
Préparation d'une couche enzymatique sensible à la créatinine
L'enzyme est piégée dans un polymère photosensible. On utilise dans cet exemple le PVA (polyvinylalcool), pour ses propriétés particulièrement adaptées aux techniques de microlithographie et à la fragilité de l'enzyme. En effet, le PVA est hydrophile, compatible avec les matières organiques, il forme des couches très minces compatibles avec les dimensions de la microélectronique. Il se prête au greffage de radicaux photosensibles, permettant son utilisation en photolithographie, ce procédé étant compatible avec la matière biologique puisqu'il ne fait pas appel à des solvants agressifs ni à une température élevée.
Composition de PVA greffée styrylpyridinium contenant la créatinine déiminase: L'enzyme utilisée ici est la créatinine déiminase EC 3.5.4.21, extraite d'un microorganisme sous forme de poudre lyophilisée. Son activité spécifique est de 41 U/mg de protéine. Dans une solution de PVA/SbQ (un volume pour un volume H2O), on ajoute la créatinine déiminase, à hauteur de 10% en masse. Cette composition est soluble dans l'eau, polymérisable à la lumière et photosensible.
Le dépôt de la couche enzymatique peut être réalisé par les techniques connues de photolithographie. Ces techniques permettent d'obtenir des couches parfaitement définies de très faible épaisseur, condition pour avoir un temps de réponse court. Dans le présent exemple, après application d'un couche de la composition ci-dessus, le transducteur muni des masques adéquats, est exposé à la lumière UN. Avant le dépôt de la couche enzymatique, une couche d'accrochage peut être prévue, permettant une meilleure adhésion du PVA.
Sensibilité de l'EΝFET
L'EΝFET sensible à la créatinine ainsi obtenu a été testé sur des solutions contenant différentes concentrations en créatinine. La Figure 4 montre qu'une réponse linéaire est obtenue dans l'intervalle de concentrations à surveiller durant une séance de dialyse.
EXEMPLE 5
EΝFET sensible à l'urée
L'urée est l'indicateur le plus commun de la bonne épuration durant une séance de dialyse. Chez l'homme, sa concentration normale dans le sang est comprise entre 3 et 10 mmol/1, mais elle peut s'élever jusqu'à plusieurs dizaines de mmol/1 de plasma chez les personnes insuffisantes rénales. La détection est basée sur une réaction enzymatique dans laquelle l'urée est hydrolysée par l'uréase avec formation de gaz carbonique et production d'un ion hydroxyde qui modifie le pH au voisinage de la zone sensible de l'ISFET.
uréase Urée + H2O > 2 ΝH4+ + HCO3- HCO3- > CO2 + OH"
La méthode de préparation d'un ISFET sensible à l'urée est similaire à celle décrite ci- dessus pour l'ISFET sensible à la créatinine. Composition de PNA greffée styrylpyridinium contenant l'uréase: L'enzyme utilisée ici est l'urée amidohydrolase recombinante EC 3.5.1.5, extraite d'E. coli, sons forme de poudre lyophilisée. Son activité spécifique est de 247 U/mg de protéine. Dans une solution de PNA/SbQ (un volume pour un volume H2O), on ajoute l'uréase en quantité suffisante pour réaliser la mesure. Cette composition est soluble dans l'eau, polymérisable à la lumière et photosensible.
Sensibilité de l'ΕΝFΕT L'ΕΝFΕT sensible à l'urée ainsi obtenu a été testé sur des solutions contenant différentes concentrations en urée. La Figure 5 montre qu'une réponse proportionnelle est obtenue dans l'intervalle de concentrations à surveiller durant une séance de dialyse.
EXEMPLE 6
Dispositif de surveillance des taux d'épuration de l'urée et de la créatinine dans un effluent de dialyse
Cet exemple illustre l'utilisation d'un dispositif selon l'invention à la mesure directe de la créatinine et de l'urée, en sortie de dialyse, à 37°C avec un débit de 500 ml/mn. Un capteur tel que décrit à l'exemple 2, doté d'un premier E FET sensible à la créatinine préparé comme dans l'exemple 4, et un deuxième EΝFET sensible à l'urée préparé comme dans l'exemple
5, est collé dans la chambre de mesure d'un dispositif selon l'invention. Les deux EΝFET ont la même composition hormis en ce qui concerne l'enzyme.
• Étalonnage en deux points
Les capteurs ayant des réponses linéaires , 2 points suffisent pour l'étalonnage.
On utilise donc uniquement deux solutions étalon SI et S2, par exemple: SI : Urée = 5 mM et Créatinine = 0 M S2 : Urée ≈ 0 mM et Créatinine = 1 mM
Les courbes d'étalonnage sont enregistrées dans le système de gestion des données.
Les conduits d'alimentation 8 et d'évacuation 9 sont intégrés en sortie d'une ligne de dialyse par simple branchement. Le lecteur de données 7 est relié aux plots de connexion 17. Les valeurs sont mesurées durant toute la séance de dialyse et sont lues sur le lecteur 7 après traitement par un système de gestion des données. Elle peuvent également être enregistrées pour un suivi médical à long terme.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Dispositif de mesure quantitative de substances présentes dans un fluide biologique caractérisé en ce qu 'il comprend
- une enceinte (1) étanche délimitant une chambre de mesure (2), dotée d'un orifice d'entrée (3) et d'un orifice de sortie (4) permettant la circulation dudit fluide biologique à travers ladite chambre de mesure,
- des moyens de connexion étanche de l'orifice d'entrée (3) et de l'orifice de sortie (4) de la chambre de mesure (2) au circuit fluidique d'un appareil de traitement d'un fluide biologique,
- un capteur chimique de type ISFET (5) sensible à au moins une substance présente dans ledit fluide biologique, ledit capteur étant placé dans la chambre de mesure (2),
- des moyens de transmission (6) du signal émis par ledit capteur chimique de type ISFET à un lecteur de données (7).
2 - Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit capteur chimique (5) comprend un premier ISFET (10) sensible à une première substance présente dans ledit fluide biologique et un deuxième ISFET (10') sensible à une deuxième substance présente dans ledit fluide biologique.
3 - Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que lesdits premier et deuxième ISFET (10, 10') sont des ENFET sensibles à des substances susceptibles de constituer le substrat d'une réaction enzymatique, présentes dans ledit fluide biologique.
4 - Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que lesdits premier et deuxième ISFET (10, 10') sont des ENFET sensibles respectivement à l'urée et à la créatinine. 5 - Dispositif selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il comprend en outre un capteur de référence (REFET).
6 - Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit capteur chimique (5) comprend a) au moins un ISFET (10) comportant une zone sensible (12) aux variations de pH, susceptible d'être en contact avec ledit fluide biologique, b) des moyens
(14, 16, 17) pour assurer les contacts électriques entre ledit au moins un ISFET et lesdits moyens de transmission du signal, c) une couche d'encapsulation (23) permettant d'isoler lesdits moyens de contact électrique du fluide biologique.
7 - Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit capteur chimique (5) comprend a) au moins un ENFET (15) comportant une zone sensible (12) aux variations de pH recouverte d'une couche (13) comprenant une enzyme apte à catalyser une réaction avec une substance présente dans le fluide biologique en produisant ou en consommant une espèce induisant une variation du pH, ladite couche enzymatique étant susceptible d'être en contact avec ledit fluide biologique, b) des moyens (14, 16, 17) pour assurer les contacts électriques entre ledit au moins un ENFET et lesdits moyens de transmission du signal, c) une couche d'encapsulation (23) permettant d'isoler lesdits moyens de contact électrique du fluide biologique.
8 - Dispositif selon la revendication précédente, caractérisé en ce que la couche enzymatique (13) comprend un polymère hydrophile photosensible et une enzyme choisie parmi les uréases et les créatinine-déiminases.
9 - Dispositif selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisé en ce que lesdits deux ISFET (10, 10') sont placés dans la chambre de mesure (2) sur un axe perpendiculaire au sens de circulation dudit fluide biologique.
10 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit capteur cMmique (5) est amovible.
11 - Dispositif selon l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que au moins une électrode de référence assurant la polarisation du milieu est intégrée audit capteur chimique (5).
12 - Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite au moins une électrode de référence est constituée d'une piste métallique supplémentaire sur le circuit imprimé servant de support au capteur chimique (5).
13 - Dispositif selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce que les moyens de connexion étanche comprennent un organe supportant au moins une électrode de référence assurant la polarisation du milieu, de préférence au moins une aiguille en or.
14 - Application du dispositif selon l'une des revendications 1 à 13 à la mesure en continu et en temps réel de la concentration d'au moins une substance présente dans un fluide biologique.
15 - Application du dispositif selon l'une des revendications 1 à 13 à la surveillance en continu et en temps réel de la concentration d'au moins une substance présente dans un effluent de dialyse, de préférence l'urée et la créatinine, au cours d'une séance d'épuration extra-rénale.
16 - Appareil de traitement d'un fluide biologique caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif selon l'une des revendications 1 à 13 pour la mesure quantitative d'au moins une substance présente dans ledit fluide, de préférence l'urée et la créatinine présentes dans un effluent de dialyse.
17 - Appareil selon la revendication précédente caractérisé en ce qu'il comprend en outre des moyens d'enregistrement, des moyens de stockage et des moyens de traitement des données lues par ledit lecteur de données.
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