WO2005063994A1 - Puroindoline-a inducible promoter - Google Patents

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WO2005063994A1
WO2005063994A1 PCT/FR2004/003368 FR2004003368W WO2005063994A1 WO 2005063994 A1 WO2005063994 A1 WO 2005063994A1 FR 2004003368 W FR2004003368 W FR 2004003368W WO 2005063994 A1 WO2005063994 A1 WO 2005063994A1
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gene
sequence
pina
expression
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PCT/FR2004/003368
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Alexandre Evrard
Marie-Françoise Gautier
Philippe Joudrier
Donaldo Meynard
Emmanuel Guiderdoni
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Institut National De La Recherche Agronomique
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    • C12N15/8239—Externally regulated expression systems pathogen inducible

Definitions

  • the present invention relates to the use of the promoter of a puroindoline-a gene as an inducible promoter.
  • Puroindolines are proteins found in the grain of many cereal species of the Tri ti ceae and Aveneae tribes. They were initially isolated from Tri ticum aestivum (BLOCHET et al., FEBS Lett, 329, 336-40, 1993). Two proteins, respectively called puroindoline-a and puroindoline-b, and having approximately 55% identity between them have been characterized in T. aestivum (GAUTIER et al., Plant. Mol. Biol., 25, 43-57, 1994 ).
  • the inventors have now isolated the promoter from the Tri ti cum aestivum pinA gene, and have expressed the reporter gene uidA (GUS) in transgenic rice under the control of this promoter. They have then found that, unlike what was expected in view of the results reported in the prior art, the expression of the reporter gene was not limited to the grain, but that it also intervened in the aerial and root vegetative organs as well i only in flowers They also found that the expression observed in the grain was regulated during development. They also observed, unexpectedly, an expression inducible by stress (such as an injury or an attack by a pathogen), manifested mainly in the vegetative organs and flower stalks, and also seeming detectable, in a lesser measure, in grain.
  • stress such as an injury or an attack by a pathogen
  • the Inventors identified putative elements of regulation by injury, and in particular a WUN type box (PASTUGLIA and al. , Plant. Cell. , 9, 49-60, 1997), a box of the type: “methyl jasmonate response box” (ROUSTER et al (Plan t. J., 11, 513-23, 1997), and two boxes of the type “ salicylic acid response box ”(TCA box; PASTUGLIA et al., cited above).
  • WUN type box PASTUGLIA and al. , Plant. Cell. , 9, 49-60, 1997)
  • ROUSTER et al Plant t. J., 11, 513-23, 1997)
  • the -390 / -1 region of the Pin tA gene from Tri ticum aestivum is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1; the -390 / -215 region of said gene is represented under the number SEQ ID NO: 2.
  • the subject of the present invention is an isolated polynucleotide which can be used for the construction of a functional promoter in a plant cell, which polynucleotide is characterized in that : it has at least 70% identity, preferably at least 80% identity and very preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, or with a fragment thereof.
  • ci comprising at least the sequence SEQ ID NO: 2; - It contains a WUN box comprising the TAATTTCCT sequence, a TCA box comprising the TAGAAAAATA sequence, a TCA box comprising the CGAAAAAGCA sequence and a methyl jasmonate response box, comprising a TGACG / GCAGT sequence motif.
  • Said polynucleotide can be used in particular for the construction of a promoter inducible by injury or by infection with a pathogen.
  • said polynucleotide may also contain one or more of the following motifs: - a TTACTTAT sequence motif, a TGACG sequence motif, a CAACA sequence motif, - an AAAG sequence motif, - an AACA sequence motif, - a GATGACG sequence motif and - a GTCAT sequence motif.
  • a polynucleotide in accordance with the invention it has at least 70% identity, preferably at least 80% identity and most preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 3 (-390 / -193), and contains a TCA box comprising the sequence GAGAAAAGGT.
  • a polynucleotide in accordance with the invention can easily be obtained by a person skilled in the art from the promoter of the PinA gene of a Triticeae or of an Aveneae having this gene (cf. for example GAUTIER et al., Plant.
  • a polynucleotide in accordance with the invention can be isolated from the sequences upstream of the ATG of the pinA gene from Tri ticum aestivum described below in the description of the present invention, or available in the databases (AJ302091), as well as from the corresponding sequences of other wheat species, also accessible in the databases ⁇ Tri ticum monococcum, AJ302092 and AJ302093; Tri ti cum urartu, AJ302094 and AJ302095; Aegilops spel toides, AJ302096 and AJ302097; Aegilops tauschii, AJ302098 and AJ302099).
  • the present invention also relates to the use of a promoter comprising a polynucleotide in accordance with the invention, as defined above, for inducing in a plant the expression of a heterologous gene placed under transcriptional control of said promoter, in response to injury or infection by a pathogen.
  • a promoter comprising a polynucleotide in accordance with the invention, as defined above, for inducing in a plant the expression of a heterologous gene placed under transcriptional control of said promoter, in response to injury or infection by a pathogen.
  • the natural promoter of a PinA gene it is also possible to use a chimeric promoter, in which a polynucleotide in accordance with the invention is associated with a minimal promoter, and if necessary with elements for cis-regulation of transcription other than those of the natural promoter PinA.
  • a minimal promoter comprises at least the sequences allowing the binding of RNA polymerase and the initiation of transcription.
  • a minimal promoter for transcription by polymerase II generally comprises, in addition to a transcription initiation site, at least one TATA box located approximately 20 to 40 bp upstream from the transcription initiation site, and / or at least one INR element (INitiatoR) located at the level of the transcription initiation site.
  • the present invention also encompasses a chimeric promoter functional in a plant cell, containing a minimal promoter associated with heterologous elements of transcriptional cis regulation, characterized in that said cis regulatory elements comprise a polynucleotide in accordance with the invention.
  • the present invention also relates to a recombinant expression cassette comprising a promoter containing a polynucleotide in accordance with the invention, and a heterologous gene of interest placed under transcriptional control of said promoter.
  • said heterologous gene of interest is a gene involved in a defense mechanism in plants.
  • R resistance genes
  • Apr avirulence
  • the invention also includes: - the recombinant vectors resulting from the insertion of a promoter or of an expression cassette in accordance with the invention into a host vector, plant cells and transgenic plants, in particular monocots, and in particular cereals, such as rice, wheat, corn, barley, oats, sorghum, transformed by an expression cassette or a recombinant vector in accordance with the invention.
  • the inventors have for example obtained transgenic rice plants, in which a heterologous gene has been placed under transcriptional control of the -390 / -1 region of the promoter and have observed a specific expression of this gene in response to a mechanical injury in these plants; however, this expression was not detected in plants where the heterologous gene was placed under the control of the -214 / -1 region of the promoter of the PinA gene.
  • the inventors have also found that a reporter gene placed under the control of the -214 / - 1 fragment of the promoter of the PinA gene was expressed specifically in the pollen grains, and that this expression was no longer observed when the reporter gene was placed under control of the -136 / -1 fragment.
  • the present invention relates to an isolated polynucleotide usable for the construction of a functional promoter in a plant cell, which polynucleotide is characterized in that: - it has at least 70% identity, preferably at least 80% of identity and most preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 4; it contains an AGGTCA sequence motif, an AGAAA sequence motif and a TCCACCAGT sequence motif.
  • Said polynucleotide can be used in particular for the construction of a promoter allowing the expression of a heterologous gene at the level of the pollen grains.
  • EXAMPLE 1 ISOLATION AND CLONING OF THE PINA GENE PROMOTER A DNA fragment of 1232 bp upstream of the site for initiating translation of the pinA gene was obtained from a genomic DNA library of Tri ticum leaves aestivum. The sequence of this fragment (SEQ ID NO: 5) is shown in Figure 1. The site of translation initiation and the initiator codon are indicated by an arrow and by a codon ATG in bold respectively. Part of this sequence is identical to a fragment of 875 bp, also corresponding to the sequence upstream of the ATG of the PinA gene in T. aestivum, described by LILLEMO et al (cited above accession number AJ302091).
  • FIG. 2 shows the result of the alignment of the promoter of the PinA gene of T. aestivum with the homologous sequences published for these other species of wheat ⁇ Tri ticum monococcum AJ302093, Tri ticum urartu AJ302095, Aegilops spel toides AJ302096, Aegilops tauschii AJ302098). Identical sequences are shown in gray. Table I summarizes the percentages of identities observed.
  • the results show good conservation of the promoter sequences of the pinA gene between the species, with a percentage of identity always greater than 75%.
  • the promoter sequence of the pinA gene of T. aestivum has 90% identity with that of A. tauschii which is consistent with the fact that this species is the donor of the D genome of soft wheat.
  • the first two relate to insertions of sequences into the promoters of the PinA genes of T. urartu and T. monococcum [- 104 / -125 (T. urartu and T. monococcum); -416 / -446 (T. urartu); -416 / -448 (T. monococcum)].
  • T. aestivum has a repeat sequence of microsatellite type (-49 ⁇ / -528) longer than that of the promoters of the other species. Finally, a 72 bp sequence insertion is present only in A. spel toides (-643 / -725J.
  • EXAMPLE 2 STRUCTURAL ANALYSIS OF THE PROMOTER OF THE PINA GENE A search for homology is carried out between the promoter sequences of the PinA and PinB genes (AJ000548, SEQ ID NO: 10). Two sequences are illustrated in Figure 3. The translation initiation codons for the two genes are shown in bold, the sequences which are identical between the two promoters are shown in grey.
  • the putative TATA, CAAT and P-box boxes are framed. The results reveal an identity of 48% between these two sequences, which drops to 66% when we limit our to 400 bp upstream of the ATG. A closer analysis of this alignment shows that the putative TATA boxes are perfectly preserved (position -63).
  • the putative CAAT box (position -97) of the promoter of the PinB gene (DIGEON et al., Cited above) does not seem to be preserved for PinA.
  • a putative CAAT box oriented in the opposite direction has been suggested for the PinA gene (position -120) by LILLEMO et al. (cited above).
  • transgenic plants The transformation of rice plants of the species Oryza sa tiva is carried out by callus cultures in the presence of the different transformed colonies of Agro acteriuiî! tumefaciens, according to the protocol described by HIEI et al. (Plant J., 6 (2), 271-82, 1994). The primary transformants are selected on R2S AND NBS medium (OHIRA et al., Plant. Celi. Physiol., 14, 1113-1121, 1973; CHU, In Proc Symp on Plant Tissue Cuit, May 25-30, Beijing, Science Press , China, 43-50, 1978; GAMBORG et al., Exp. Celi.
  • EXAMPLE 4 PROFILE OF EXPRESSION OF THE UIDA REPORTER GENE IN THE GRAIN
  • the grains were harvested for all the single-copy plants corresponding to each construction, including the control plasmids, at 8, 10, 15, 20 and 30 days after flowering (JAF) ).
  • ⁇ -glucuronidase (GUS) activity is sought by histochemical analysis on sections of freshly harvested grains. Detection is carried out as described by JEFFERSON et al.
  • the histological analysis also revealed a coloration at the level of the embryo for the constructions PinA- ⁇ 1214 and PinA- ⁇ 390, but this only when the latter is sectioned. This coloration does not appear for the PinB- ⁇ 1067 construction.
  • the sequences involved in the expression profile of the reporter gene uidA at the grain level are therefore localized at the level of the segment -390 to -215 of the 5 'region of the pinA gene of Tri ticum aestivum.
  • the sequences potentially involved in the expression at the grain level in the fragment -390 to -1 of the 5 'region of the pinA gene of Tri ticum aestivum are shown in the figure.
  • the putative elements of regulation of the expression at the grain level are underlined.
  • the boundaries of the various constructs of the 5 'region of the pinA gene are indicated by black rectangles.
  • the sequence _ 2 o 4 TTGAGAAAAGG- 194 is a putative expression sequence at the level of the albumen found in many other cereals (MOTTO et al., Cited above).
  • the -390 / —215 region is home to many AACA motifs which are conserved in many promoters of genes encoding grain grain reserve proteins.
  • FIG. 6 The position, at the level of the -390 to -1 fragment of the pin tA gene of Tri ti cum aestivum, of the sequences potentially involved in the expression of the uidA gene in response to stress is illustrated in FIG. 6.
  • the putative elements of regulation of the expression in response to a mechanical injury are shown in gray.
  • the boundaries of the various constructs of the 5 'region of the pinA gene are indicated by black rectangles.
  • the sequence of the UN box present in the promoter sequence of the sfr2 gene (PASTUGLIA et al., Cited above) is relatively well conserved in the 5 'region of the pinA gene (_ 309 TAATTTCCT- 3 oo) • This sequence is not found in the 5 'region of the pinB gene and could explain the lack of induction of the latter in response to an injury.
  • three putative TCA boxes are also present in the 5 'region of the pinA gene (-. 20 ⁇ GAGAAAAGT-. ⁇ 92 / - 326 TAGAAAAATA- 317 and - 3 ggCGAAAAAGCA- 38 o).
  • EXAMPLE 6 EXPRESSION OF THE UIDA REPORTER GENE AT THE FLOWER LEVEL Histochemical tests are also carried out, according to the protocol described in Example 3, on the flower stalks of transgenic rice corresponding to the different constructions. These tests are carried out at the 5 successive stages of flower development. The last stage of "flowering" is reached in 15 days, when the dehiscent anthers have emerged from the lemmas. The results of the histological analysis carried out on the flower stalks of transgenic plants at the various stages of development are summarized in Table VII. Table VII
  • sequence _ 196 AGGTCA_i 9 o present in the promoter sequence of the corn zml3 gene (HAMILTON et al., Cited above) is present identically in the 5 'region of the pinA gene.
  • the corresponding sequence in the 5 'region of the pinB gene is not conserved.
  • two other specific patterns of expression of the t52 gene in tomato pollen grains are not conserved.
  • control seedlings are sprayed with a 0.5% gelatin solution.
  • the leaves of the control seedlings and of the infected seedlings are harvested 36 hours after spraying and the GUS activity is sought by histochemical analysis, according to the protocol described in Example 4.
  • the results reveal an activity of the reporter gene uidA 36 hours after l infection, only with the constructs PinA- ⁇ 1214 and PinA- ⁇ 390.
  • a localized marking is observed at the level of the parenchymal tissues and the stomata.

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Abstract

The invention relates to a puroindoline a gene promoter which induces the expression of genes of interest in a plant in response to a mechanical wound or infection by a pathogen.

Description

PROMOTEUR INDUCTIBLE DE PUROINDOLINE-A La présente invention est relative à l'utilisation du promoteur d'un gène de puroindoline-a en tant que promoteur inductible . Les puroindolines sont des protéines présentes dans le grain de nombreuses espèces de céréales des tribus Tri ti ceae et Aveneae . Elles ont été initialement isolées à partir de Tri ticum aestivum (BLOCHET et al., FEBS Lett, 329, 336-40, 1993) . Deux protéines, respectivement dénommées puroindoline-a et puroindoline-b, et présentant entre elles environ 55% d'identité ont été caractérisées chez T. aestivum (GAUTIER et al . , Plant . Mol . Biol . , 25, 43-57, 1994). Il s'agit de protéines basiques (pl~10), de faible poids moléculaire (13 kDa environ), qui comprennent 10 résidus cysteine, formant 5 ponts disulfures, et un domaine riche en résidus tryptophane. Les études effectuées sur l'expression des gènes de puroindolines ont montré que celle-ci était limitée aux grains. GAUTIER et al . (1994, précité) ont ainsi observé que l'accumulation des transcrits des gènes PinA et PinB n'était détectée que dans les grains et qu'elle était régulée au cours de leur maturation. DUBREIL et al . { Plant . Science, 138, 121- 135, 1998) ont rapporté que la puroindoline-b est présente à la fois dans l'albumen amylacé et la couche à aleurone, et la puroindoline-a uniquement dans l'albumen. DIGEON et al , { Plan t . Mol . Biol . , 39, 1101-1112, 1999) ont analysé le profil d'expression du gène rapporteur uidA (GUS) sous le contrôle du promoteur du gène PinB ou de fragments de celui-ci, dans des riz transgéniques. Ils ont montré que dans tous les cas, l'expression intervenait uniquement dans le grain ; lorsque le promoteur complet (1068 pb) ou un fragment de 388 pb de celui-ci étaient utilisés, l'expression du gène uidA était localisée dans l'albumen, la couche à aleurone et l'épiderme des grains ; dans le cas d'un fragment plus court (210 pb) , l'expression était limitée à l'épithélium du scutellum. LILLEMO et al. {Euphytica . , 126, 321-331, 2002) ont comparé les séquences des gènes PinA et PinB du blé hexaploïde T. aestivum et de blés ancestraux diploïdes ( T. urartu, T. monococcum , A. spel toides r A. tauschii ) qui codent également pour ces puroindolines. Ils ont observé de très fortes homologies de séquences (>95%) des promoteurs pinA entre eux, et des promoteurs pinB entre eux, et une homologie plus faible, mais demeurant toutefois importante, entre le promoteur PinA et le promoteur PinB de T. aestivum (78,4% sur les 400 pb en amont du codon d' initiation de la traduction, 54,8% sur les 400 pb suivantes. Ils ont également identifié des éléments régulateurs putatifs associés à la spécificité d'expression dans le grain, communs aux promoteurs PinA et PinB . Les Inventeurs ont maintenant isolé le promoteur du gène pinA de Tri ti cum aestivum, et ont exprimé le gène rapporteur uidA (GUS) dans des riz transgéniques sous contrôle de ce promoteur. Ils ont alors constaté que, contrairement à ce qui était attendu au vu des résultats rapportés dans l'art antérieur, l'expression du gène rapporteur n'était pas limitée au grain, mais qu'elle intervenait également dans les organes végétatifs aériens et racinaires ainsi que dans les fleurs. Ils ont également constaté que l'expression observée dans le grain était régulée au cours du développement. Ils ont en outre observé, de manière inattendue, une expression inductible par un stress (tel qu'une blessure ou une attaque par un pathogène) , se manifestant principalement au niveau des organes végétatifs et des hampes florales, et semblant également décelable, dans une moindre mesure, au niveau du grain . Ils ont localisé la portion du promoteur pinA essentielle à l'obtention de ce profil d'expression dans la région -390/-214 du gène PinA de Tri ti cum aestivum (les positions sont définies par rapport au codon d'initiation de la traduction) . En analysant cette région du promoteur, les Inventeurs ont identifié des éléments putatifs de régulation par blessure, et notamment une boite de type WUN (PASTUGLIA et al . , Plant . Cell . , 9, 49-60, 1997), une boîte de type : « boîte de réponse au jasmonate de méthyle » (ROUSTER et al { Plan t . J. , 11, 513-23, 1997), et deux boîtes de type « boîte de réponse à l'acide salicylique » (boîte TCA ; PASTUGLIA et al . , précité) . La région -390/-1 du gène PinA de Tri ticum aestivum est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 ; la région -390/-215 dudit gène est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2. La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé utilisable pour la construction d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale, lequel polynucléotide est caractérisé en ce que : il possède au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1, ou avec un fragment de celle-ci comprenant au moins la séquence SEQ ID NO: 2 ; - il contient une boîte WUN comprenant la séquence TAATTTCCT, une boîte TCA comprenant la séquence TAGAAAAATA, une boîte TCA comprenant la séquence CGAAAAAGCA et une boîte de réponse au jasmonate de méthyle, comprenant un motif de séquence TGACG/GCAGT. Ledit polynucléotide est utilisable notamment pour la construction d'un promoteur inductible par une blessure ou par une infection par un pathogène. Avantageusement, ledit polynucléotide peut en outre contenir un ou plusieurs des motifs suivants : - un motif de séquence TTACTTAT, un motif de séquence TGACG, un motif de séquence CAACA, - un motif de séquence AAAG, - un motif de séquence AACA, - un motif de séquence GATGACG et - un motif de séquence GTCAT . Selon un mode de réalisation préféré d'un polynucléotide conforme à l'invention, il présente au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité et de manière tout à fait préférée au moins 90% d' identité avec la séquence SEQ ID NO: 3 (-390/-193), et contient une boîte TCA comprenant la séquence GAGAAAAGGT . Un polynucléotide conforme à 1 ' invention peut facilement être obtenu par l'homme du métier à partir du promoteur du gène PinA d'une Triticeae ou d'une Aveneae possédant ce gène (cf. par exemple GAUTIER et al . , Plant .The present invention relates to the use of the promoter of a puroindoline-a gene as an inducible promoter. Puroindolines are proteins found in the grain of many cereal species of the Tri ti ceae and Aveneae tribes. They were initially isolated from Tri ticum aestivum (BLOCHET et al., FEBS Lett, 329, 336-40, 1993). Two proteins, respectively called puroindoline-a and puroindoline-b, and having approximately 55% identity between them have been characterized in T. aestivum (GAUTIER et al., Plant. Mol. Biol., 25, 43-57, 1994 ). These are basic proteins (pl ~ 10), of low molecular weight (approximately 13 kDa), which comprise 10 cysteine residues, forming 5 disulfide bridges, and a domain rich in tryptophan residues. Studies on the expression of puroindoline genes have shown that it is limited to grains. GAUTIER et al. (1994, cited above) thus observed that the accumulation of transcripts of the PinA and PinB genes was detected only in the grains and that it was regulated during their maturation. DUBREIL et al. {Plant. Science, 138, 121-135, 1998) reported that puroindoline-b is present in both starchy albumin and the aleurone layer, and puroindoline-a only in albumen. DIGEON et al, {Plan t. Mol. Biol. , 39, 1101-1112, 1999) analyzed the expression profile of the reporter gene uidA (GUS) under the control of the promoter of the PinB gene or fragments thereof, in transgenic rice. They have shown that in all cases the expression occurs only in the grain; when the full promoter (1068 bp) or a 388 bp fragment thereof were used, the expression of the uidA gene was localized in the endosperm, the aleurone layer and the epidermis of the grains; in the case of a shorter fragment (210 bp), the expression was limited to the epithelium of the scutellum. LILLEMO et al. {Euphytica. , 126, 321-331, 2002) compared the sequences of the PinA and PinB genes of the hexaploid wheat T. aestivum and ancestral diploid wheats (T. urartu, T. monococcum, A. spel toides r A. tauschii) for these puroindolines. They observed very strong sequence homologies (> 95%) of the pinA promoters between themselves, and of the pinB promoters between them, and a weaker, but still significant, homology between the PinA promoter and the PinB promoter of T. aestivum. (78.4% on the 400 bp upstream of the translation initiation codon, 54.8% on the following 400 bp. They also identified putative regulatory elements associated with specificity of expression in the grain, common to the PinA and PinB promoters. The inventors have now isolated the promoter from the Tri ti cum aestivum pinA gene, and have expressed the reporter gene uidA (GUS) in transgenic rice under the control of this promoter. They have then found that, unlike what was expected in view of the results reported in the prior art, the expression of the reporter gene was not limited to the grain, but that it also intervened in the aerial and root vegetative organs as well i only in flowers They also found that the expression observed in the grain was regulated during development. They also observed, unexpectedly, an expression inducible by stress (such as an injury or an attack by a pathogen), manifested mainly in the vegetative organs and flower stalks, and also seeming detectable, in a lesser measure, in grain. They located the portion of the pinA promoter essential for obtaining this expression profile in the -390 / -214 region of the PinA gene from Tri ti cum aestivum (the positions are defined relative to the translation initiation codon ). By analyzing this region of the promoter, the Inventors identified putative elements of regulation by injury, and in particular a WUN type box (PASTUGLIA and al. , Plant. Cell. , 9, 49-60, 1997), a box of the type: “methyl jasmonate response box” (ROUSTER et al (Plan t. J., 11, 513-23, 1997), and two boxes of the type “ salicylic acid response box ”(TCA box; PASTUGLIA et al., cited above). The -390 / -1 region of the Pin tA gene from Tri ticum aestivum is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 1; the -390 / -215 region of said gene is represented under the number SEQ ID NO: 2. The subject of the present invention is an isolated polynucleotide which can be used for the construction of a functional promoter in a plant cell, which polynucleotide is characterized in that : it has at least 70% identity, preferably at least 80% identity and very preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 1, or with a fragment thereof. ci comprising at least the sequence SEQ ID NO: 2; - It contains a WUN box comprising the TAATTTCCT sequence, a TCA box comprising the TAGAAAAATA sequence, a TCA box comprising the CGAAAAAGCA sequence and a methyl jasmonate response box, comprising a TGACG / GCAGT sequence motif. Said polynucleotide can be used in particular for the construction of a promoter inducible by injury or by infection with a pathogen. Advantageously, said polynucleotide may also contain one or more of the following motifs: - a TTACTTAT sequence motif, a TGACG sequence motif, a CAACA sequence motif, - an AAAG sequence motif, - an AACA sequence motif, - a GATGACG sequence motif and - a GTCAT sequence motif. According to a preferred embodiment of a polynucleotide in accordance with the invention, it has at least 70% identity, preferably at least 80% identity and most preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 3 (-390 / -193), and contains a TCA box comprising the sequence GAGAAAAGGT. A polynucleotide in accordance with the invention can easily be obtained by a person skilled in the art from the promoter of the PinA gene of a Triticeae or of an Aveneae having this gene (cf. for example GAUTIER et al., Plant.
Science . , 153, 81-91, 2000). A titre d'exemples non limitatifs, un polynucléotide conforme à l'invention peut être isolé à partir des séquences en amont de l'ATG du gè ιne pinA de Tri ticum aestivum décrites ci-après dans l'exposé de la présente invention, ou disponibles dans les bases de données (AJ302091) , ainsi qu'à partir des séquences correspondantes d'autres espèces de blés, également accessibles dans les bases de données { Tri ticum monococcum, AJ302092 et AJ302093 ; Tri ti cum urartu, AJ302094 et AJ302095 ; Aegilops spel toides, AJ302096 et AJ302097 ; Aegilops tauschii , AJ302098 et AJ302099) . La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un promoteur comprenant un polynucléotide conforme à l'invention, tel que défini ci-dessus, pour induire chez une plante l'expression d'un gène hétérologue placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur, en réponse à une blessure ou à une infection par un pathogène. On peut utiliser, conformément à l'invention, le promoteur naturel d'un gène PinA. On peut également utiliser un promoteur chimérique, dans lequel un polynucléotide conforme à l'invention est associé à un promoteur minimal, et le cas échéant à des éléments de régulation en cis de la transcription autres que ceux du promoteur naturel PinA. La construction de promoteurs chimériques fonctionnels chez les plantes est connue en elle-même ; on associe un promoteur minimal avec des éléments hétérologues de régulation, choisis en fonction des caractéristiques d'expression (spécificité, inductibilité, niveau d'expression) que l'on souhaite obtenir. Un promoteur minimal comprend au moins les séquences permettant la fixation de l'ARN polymérase et l'initiation de la transcription. Par exemple, un promoteur minimal pour la transcription par la polymérase II comprend, généralement, outre un site d'initiation de la transcription, au moins une boite TATA située à environ 20 à 40pb en amont du site d'initiation de la transcription, et/ou au moins un élément INR (INitiatoR) localisé au niveau du site d'initiation de la transcription. La construction de promoteurs chimériques fonctionnels chez les plantes, par association d'un promoteur minimal avec divers éléments de régulation en cis est décrite par exemple dans le Brevet US 6555673, ou bien dans les publications de RUSHTON et al ( Plant . Cell . , 14, 749-762,Science. , 153, 81-91, 2000). By way of nonlimiting examples, a polynucleotide in accordance with the invention can be isolated from the sequences upstream of the ATG of the pinA gene from Tri ticum aestivum described below in the description of the present invention, or available in the databases (AJ302091), as well as from the corresponding sequences of other wheat species, also accessible in the databases {Tri ticum monococcum, AJ302092 and AJ302093; Tri ti cum urartu, AJ302094 and AJ302095; Aegilops spel toides, AJ302096 and AJ302097; Aegilops tauschii, AJ302098 and AJ302099). The present invention also relates to the use of a promoter comprising a polynucleotide in accordance with the invention, as defined above, for inducing in a plant the expression of a heterologous gene placed under transcriptional control of said promoter, in response to injury or infection by a pathogen. It is possible to use, in accordance with the invention, the natural promoter of a PinA gene. It is also possible to use a chimeric promoter, in which a polynucleotide in accordance with the invention is associated with a minimal promoter, and if necessary with elements for cis-regulation of transcription other than those of the natural promoter PinA. The construction of functional chimeric promoters in plants is known in itself; we associate a minimal promoter with heterologous elements of regulation, chosen according to the expression characteristics (specificity, inducibility, level of expression) that one wishes to obtain. A minimal promoter comprises at least the sequences allowing the binding of RNA polymerase and the initiation of transcription. For example, a minimal promoter for transcription by polymerase II generally comprises, in addition to a transcription initiation site, at least one TATA box located approximately 20 to 40 bp upstream from the transcription initiation site, and / or at least one INR element (INitiatoR) located at the level of the transcription initiation site. The construction of functional chimeric promoters in plants, by association of a minimal promoter with various cis regulatory elements is described for example in US Pat. No. 6,555,673, or in the publications of RUSHTON et al (Plant. Cell., 14 , 749-762,
2002) ou de BHULLAR et al { Plan t . Physiology. , 132, 988-998,2002) or BHULLAR et al {Plan t. Physiology. , 132, 988-998,
2003) . La présente invention englobe également un promoteur chimérique fonctionnel dans une cellule végétale, contenant un promoteur minimal associé à des éléments hétérologues de régulation en cis de la transcription, caractérisé en ce que lesdits éléments de régulation en cis comprennent un polynucléotide conforme à l'invention. La présente invention a également pour objet une cassette d' expression recombinante comprenant un promoteur contenant un polynucléotide conforme à l'invention, et un gène hétérologue d' intérêt placé sous contrôle transcriptionnel dudit promoteur. Avantageusement, ledit gène hétérologue d'intérêt est un gène impliqué dans un mécanisme de défense chez les plantes. A titre d'exemples, on citera : des gènes de résistance (R) , , dont les produits sont impliqués dans la réponse gène pour gène (spécifique d'un couple plante/pathogène) , par interaction spécifique avec le produit du gène d' avirulence { avr) correspondant du pathogène concerné ; des gènes codant pour des protéines de défense à spectre plus large (protéines PR pour « Pathogenesis Related », telles que les défensines, les thionines, les protéines de transfert de lipides (LTP) , les chitinases, les protéines thaumatine-like, etc Il est également possible de placer sous le contrôle d'un promoteur contenant un polynucléotide conforme à l'invention un gène dont on veut évaluer le bénéfice pour la plante consécutivement à une infection par un parasite ou à une blessure mécanique. L' invention englobe également : - les vecteurs recombinants résultant de l'insertion d'un promoteur ou d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur hôte, les cellules végétales et les plantes transgéniques, en particulier des monocotylédones, et notamment des céréales, telles que le riz, le blé, le mais, l'orge, l'avoine, le sorgho, transformées par une cassette d'expression ou un vecteur recombinant conforme à l'invention. Les inventeurs ont par exemple obtenu des plants de riz transgéniques, dans lesquels un gène hétérologue a été placé sous contrôle transcriptionnel de la région -390/-1 du promoteur et ont observé une expression spécifique de ce gène en réponse à une blessure mécanique chez ces plantes ; en revanche cette expression n'a pas été détectée dans les plantes où le gène hétérologue a été placé sous contrôle de la région -214/-1 du promoteur du gène PinA. En outre, les Inventeurs ont également constaté qu'un gène rapporteurplacé sous le contrôle du fragment -214/- 1 du promoteur du gène PinA était exprimé spécifiquement dans les grains de pollen, et que cette expression n'était plus observée lorsque le gène rapporteur était placé sous contrôle du fragment -136/-1. L'analyse du fragment -214/-137 a permis aux inventeurs d' identifier les éléments putatifs d' expression au niveau des grains de pollen, et notamment la séquence AGGTCA (Hamilton et al., Plant . Mol . Biol . , 38, 663-9, 1998) et les séquences AGAAA et TCCACCAGT (BATE and TWELL, Plan t . Mol . Biol . , 37, 859-869, 1998). La région -214/-137 est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 4. La présente invention a pour objet un polynucléotide isolé utilisable pour la construction d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale, lequel polynucléotide est caractérisé en ce que : - il possède au moins 70% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité et de manière tout à fait préférée au moins 90% d'identité avec la séquence SEQ ID NO :4 ; il contient un motif de séquence AGGTCA, un motif de séquence de séquence AGAAA et un motif de séquence TCCACCAGT. Ledit polynucléotide est utilisable notamment pour la construction d'un promoteur permettant l'expression d'un gène hétérologue au niveau des grains de pollen. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant l'obtention du promoteur du gène pinA, et son utilisation pour exprimer un gène hétérologue dans des tissus végétaux en réponse à une blessure (ou à une infection par un agent pathogène) .2003). The present invention also encompasses a chimeric promoter functional in a plant cell, containing a minimal promoter associated with heterologous elements of transcriptional cis regulation, characterized in that said cis regulatory elements comprise a polynucleotide in accordance with the invention. The present invention also relates to a recombinant expression cassette comprising a promoter containing a polynucleotide in accordance with the invention, and a heterologous gene of interest placed under transcriptional control of said promoter. Advantageously, said heterologous gene of interest is a gene involved in a defense mechanism in plants. Examples include: resistance genes (R), the products of which are involved in the gene for gene response (specific to a plant / pathogen pair), by specific interaction with the gene product. avirulence (Apr) corresponding to the pathogen concerned; genes coding for defense proteins with a broader spectrum (PR proteins for "Pathogenesis Related ”, such as defensins, thionines, lipid transfer proteins (LTP), chitinases, thaumatin-like proteins, etc. It is also possible to place under the control of a promoter containing a polynucleotide conforming to the invention a gene whose benefit to the plant is to be evaluated following infection by a parasite or mechanical injury. The invention also includes: - the recombinant vectors resulting from the insertion of a promoter or of an expression cassette in accordance with the invention into a host vector, plant cells and transgenic plants, in particular monocots, and in particular cereals, such as rice, wheat, corn, barley, oats, sorghum, transformed by an expression cassette or a recombinant vector in accordance with the invention. The inventors have for example obtained transgenic rice plants, in which a heterologous gene has been placed under transcriptional control of the -390 / -1 region of the promoter and have observed a specific expression of this gene in response to a mechanical injury in these plants; however, this expression was not detected in plants where the heterologous gene was placed under the control of the -214 / -1 region of the promoter of the PinA gene. In addition, the inventors have also found that a reporter gene placed under the control of the -214 / - 1 fragment of the promoter of the PinA gene was expressed specifically in the pollen grains, and that this expression was no longer observed when the reporter gene was placed under control of the -136 / -1 fragment. Analysis of the -214 / -137 fragment enabled the inventors to identify the putative elements of expression at the level of the pollen grains, and in particular the AGGTCA sequence (Hamilton et al., Plant. Mol. Biol., 38, 663-9, 1998) and the sequences AGAAA and TCCACCAGT (BATE and TWELL, Plan t. Mol. Biol., 37, 859-869, 1998). The region -214 / -137 is represented in the sequence list in the appendix under the number SEQ ID NO: 4. The present invention relates to an isolated polynucleotide usable for the construction of a functional promoter in a plant cell, which polynucleotide is characterized in that: - it has at least 70% identity, preferably at least 80% of identity and most preferably at least 90% identity with the sequence SEQ ID NO: 4; it contains an AGGTCA sequence motif, an AGAAA sequence motif and a TCCACCAGT sequence motif. Said polynucleotide can be used in particular for the construction of a promoter allowing the expression of a heterologous gene at the level of the pollen grains. The present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to nonlimiting examples illustrating the obtaining of the promoter of the pinA gene, and its use for expressing a heterologous gene in plant tissues. response to injury (or infection with a pathogen).
EXEMPLE 1: ISOLEMENT ET CLONAGE DU PROMOTEUR DU GENE PINA Une fragment d'ADN de 1232 pb en amont du site d' initiation de la traduction du gène pinA a été obtenu à partir d'une banque d'ADN genomique de feuilles de Tri ticum aestivum. La séquence de ce fragment (SEQ ID NO : 5) est représentée sur la Figure 1. Le site d'initiation de la traduction et le codon initiateur sont indiqués par une flèche et par un codon ATG en gras respectivement. Une partie de cette séquence est identique à un fragment de 875 pb, correspondant également à la séquence en amont de l'ATG du gène PinA chez T. aestivum, décrit par LILLEMO et al (précité numéro d'accession AJ302091). Cette séquence présente également une identité importante avec les séquences promotrices du gène pinA déterminées chez d'autres espèces de blés. La Figure 2 montre le résultat de l'alignement du promoteur du gène PinA de T. aestivum avec les séquences homologues publiées pour ces autres espèces de blés { Tri ticum monococcum AJ302093, Tri ticum urartu AJ302095, Aegilops spel toides AJ302096, Aegilops tauschii AJ302098). Les séquences identiques sont représentées en grisé . Le tableau I résume les pourcentages d'identités observés .EXAMPLE 1 ISOLATION AND CLONING OF THE PINA GENE PROMOTER A DNA fragment of 1232 bp upstream of the site for initiating translation of the pinA gene was obtained from a genomic DNA library of Tri ticum leaves aestivum. The sequence of this fragment (SEQ ID NO: 5) is shown in Figure 1. The site of translation initiation and the initiator codon are indicated by an arrow and by a codon ATG in bold respectively. Part of this sequence is identical to a fragment of 875 bp, also corresponding to the sequence upstream of the ATG of the PinA gene in T. aestivum, described by LILLEMO et al (cited above accession number AJ302091). This sequence also has an important identity with the promoter sequences of the pinA gene determined in other species of wheat. Figure 2 shows the result of the alignment of the promoter of the PinA gene of T. aestivum with the homologous sequences published for these other species of wheat {Tri ticum monococcum AJ302093, Tri ticum urartu AJ302095, Aegilops spel toides AJ302096, Aegilops tauschii AJ302098). Identical sequences are shown in gray. Table I summarizes the percentages of identities observed.
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Les résultats montrent une bonne conservation des séquences promotrices du gène pinA entre les espèces, avec un pourcentage d'identité toujours supérieur à 75 %. La séquence promotrice du gène pinA de T. aestivum présente 90% d'identité avec celle de A . tauschii ce qui est en accord avec le fait que cette espèce serait le donneur du génome D des blés tendres . Toutefois, il existe 4 différences majeures entre les différentes séquences étudiées (cf. figure 2). Les deux premières concernent des insertions de séquences dans les promoteurs des gènes PinA de T. urartu et T. monococcum [- 104/-125 ( T. urartu et T. monococcum) ; -416/-446 ( T. urartu) ;-416/-448 { T. monococcum) ] . La séquence de T. aestivum présente une séquence répétée de type microsatellite (-49β/-528) plus longue que celle des promoteurs des autres espèces. Enfin, une insertion de séquence de 72 pb est présente uniquement chez A . spel toides (-643/-725J . EXEMPLE 2: ANALYSE STRUCTURELLE DU PROMOTEUR DU GENE PINA Une recherche d' homologie est effectuée entre les séquences promotrices des gènes PinA et PinB (AJ000548, SEQ ID NO : 10) . L' alignement entre ces deux séquences est illustré dans la figure 3. Les codons d'initiation de la traduction pour les deux gènes sont représentés en gras. Les séquences qui sont identiques entre les deux promoteurs sont représentées en grisé. Les boîtes TATA, CAAT et P-box putatives sont encadrées. Les résultats révèlent une identité de 48 % entre ces deux séquences, qui passe à 66% lorsqu'on se limite aux 400 pb en amont de l'ATG. Une analyse plus fine de cet alignement montre que les boîtes TATA putatives sont parfaitement conservées (position -63). En revanche, la boîte CAAT putative (position -97) du promoteur du gène PinB (DIGEON et al . , précité) ne semble pas conservée pour PinA. Une boîte CAAT putative orientée dans le sens inverse a été suggérée pour le gène PinA (position -120) par LILLEMO et al . (précité) . Dans le but d' identifier les éléments de régulation du gène pinA, les inventeurs ont effectué une recherche des séquences putatives de régulation présentes dans sa séquence promotrice. Dans cette analyse, seules les séquences présentant des identités supérieures à 80 % ont été considérées comme significatives. Le tableau II synthétise les résultats de ces analyses in silico . Ces analyses mettent en évidence un nombre important de séquences associées à une expression au niveau du grain. Les inventeurs ont ainsi identifié des séquences potentiellement associées à une expression au niveau de l'albumen (boîtes 02, Skn-1-like et P-box) et plus spécifiquement au cours de la germination du grain (boîtes A- box et TATC-box) . En outre, des séquences potentiellement impliquées dans une expression en réponse à un stress (boîte WUN, boîte de réponse au jasmonate de méthyle TGACG/CGTCA et boîte de réponse à l'acide salicylique TCA), à la lumière (boîtes GAG, GT1, I~box et αhs-unit) , à 1 ' auxine (Aux-RE) , ou à l'éthylène (PERE) ont également été identifiées. Tableau II
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The results show good conservation of the promoter sequences of the pinA gene between the species, with a percentage of identity always greater than 75%. The promoter sequence of the pinA gene of T. aestivum has 90% identity with that of A. tauschii which is consistent with the fact that this species is the donor of the D genome of soft wheat. However, there are 4 major differences between the different sequences studied (see Figure 2). The first two relate to insertions of sequences into the promoters of the PinA genes of T. urartu and T. monococcum [- 104 / -125 (T. urartu and T. monococcum); -416 / -446 (T. urartu); -416 / -448 (T. monococcum)]. The sequence of T. aestivum has a repeat sequence of microsatellite type (-49β / -528) longer than that of the promoters of the other species. Finally, a 72 bp sequence insertion is present only in A. spel toides (-643 / -725J. EXAMPLE 2: STRUCTURAL ANALYSIS OF THE PROMOTER OF THE PINA GENE A search for homology is carried out between the promoter sequences of the PinA and PinB genes (AJ000548, SEQ ID NO: 10). two sequences are illustrated in Figure 3. The translation initiation codons for the two genes are shown in bold, the sequences which are identical between the two promoters are shown in grey. The putative TATA, CAAT and P-box boxes are framed. The results reveal an identity of 48% between these two sequences, which drops to 66% when we limit ourselves to 400 bp upstream of the ATG. A closer analysis of this alignment shows that the putative TATA boxes are perfectly preserved (position -63). On the other hand, the putative CAAT box (position -97) of the promoter of the PinB gene (DIGEON et al., Cited above) does not seem to be preserved for PinA. A putative CAAT box oriented in the opposite direction has been suggested for the PinA gene (position -120) by LILLEMO et al. (cited above). In order to identify the regulatory elements of the pinA gene, the inventors carried out a search for the putative regulatory sequences present in its promoter sequence. In this analysis, only sequences with identities greater than 80% were considered significant. Table II summarizes the results of these in silico analyzes. These analyzes highlight a large number of sequences associated with expression at the grain level. The inventors have thus identified sequences potentially associated with an expression at the albumen level (boxes 02, Skn-1-like and P-box) and more specifically during the germination of the grain (boxes A-box and TATC- box). In addition, sequences potentially involved in expression in response to stress (WUN box, methyl jasmonate response box TGACG / CGTCA and salicylic acid response box TCA), in the light (GAG boxes, GT1, I ~ box and αhs-unit), 1 'auxin (Aux-RE), or ethylene (PERE) have also been identified. Table II
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EXEMPLE 3: CONSTRUCTION DE PLANTES TRANSGENIQUES EXPRIMANT UN GENE RAPPORTEUR SOUS LE CONTROLE DE DIFFERENTS FRAGMENTS DE LA REGION 5'DU GENE PINA :EXAMPLE 3 CONSTRUCTION OF TRANSGENIC PLANTS EXPRESSING A REPORTER GENE UNDER THE CONTROL OF DIFFERENT FRAGMENTS OF THE 5 'REGION OF THE PINA GENE:
1. Construction des vecteurs d'expression: Différents fragments de la région 5' du gène pinA sont amplifiés par PCR à partir d'ADN genomique de Tri ticum aestivum et à l'aide de la polymérase Pfu (PROMEGA) selon le protocole préconisé par le fournisseur. Les produits d'amplification sont ensuite clones, après une double digestion enzymatique EcoRI/SalI, dans le vecteur pCAMBIA 1381Xb (CAMBIA) en amont de la séquence codante uidA (GUS) codant pour la β-glucuronidase (JEFFERSON, Ann. N Y Acad. Sci., 700, 53-73, 1993) . A titre de témoin d' expression positif, une séquence de 1067 pb en 5' de l'ATG du gène pinB est clonée selon le même protocole dans le vecteur pCAMBIA 138 lXb1. Construction of the expression vectors: Different fragments of the 5 'region of the pinA gene are amplified by PCR from genomic DNA of Tri ticum aestivum and using the polymerase Pfu (PROMEGA) according to the protocol recommended by supplier. The amplification products are then cloned, after a double EcoRI / SalI enzymatic digestion, in the vector pCAMBIA 1381Xb (CAMBIA) upstream of the coding sequence uidA (GUS) coding for β-glucuronidase (JEFFERSON, Ann. NY Acad. Sci., 700, 53-73, 1993). As a positive expression control, a 1067 bp sequence 5 ′ of the ATG of the pinB gene is cloned according to the same protocol in the vector pCAMBIA 138 lXb
(CAMBIA) . Le profil d'expression de ce fragment de promoteur chez le riz est décrit dans DIGEON et al . (précité). Enfin, le vecteur pCAMBIA 1381Xb a été utilisé comme témoin négatif. La position des amorces utilisées pour cloner les différents fragments des régions 5' du gène pinA et du gène PinB est indiquée dans la figure 3 par des triangles noirs et gris respectivement. La liste des différentes constructions réalisées et la séquence des amorces correspondantes sont indiquées dans le tableau III ci-après. Ces différentes constructions sont ensuite transférées dans des bactéries de la souche EHA105 d' Agroba cterium tumefaciens (HOOD et al . , Trans . Res . , 2, 208-218, 1993 ; HELLENS et al . , Annu . Rev. Biochem . , 59, 933- 69, 2000) . Tableau III(CAMBIA). The expression profile of this promoter fragment in rice is described in DIGEON et al. (Supra). Finally, the vector pCAMBIA 1381Xb was used as a negative control. The position of the primers used to clone the different fragments of the 5 ′ regions of the pinA gene and of the PinB gene is indicated in FIG. 3 by black and gray triangles respectively. The list of the various constructions carried out and the sequence of the corresponding primers are indicated in Table III below. These different constructions are then transferred into bacteria of the EHA105 strain of Agroba cterium tumefaciens (HOOD et al., Trans. Res., 2, 208-218, 1993; HELLENS et al., Annu. Rev. Biochem., 59 , 933-69, 2000). Table III
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2. Obtention des plantes transgéniques : La transformation des plants de riz de l'espèce Oryza sa tiva est réalisée par des cultures de cals en présence des différentes colonies transformées d'Agro acteriuiî! tumefaciens, selon le protocole décrit par HIEI et al . (Plant J. , 6(2) , 271-82, 1994) . Les transformants primaires sont sélectionnés sur milieu R2S ET NBS (OHIRA et al . , Plant . Celi . Physiol . , 14, 1113-1121, 1973 ; CHU, In Proc Symp on Plant Tissue Cuit, May 25-30, Beijing, Science Press, China, 43-50, 1978 ; GAMBORG et al . , Exp . Celi . Res . , 50, 151-158, 1968) contenant 400 mg/L de céfotaxime (DUCHEFA), 100 mg/L de vancomycine (DUCHEFA) et 50 mg/L d' hygromycine (SIGMA). L'ADN des plants isolés est ensuite analysé par la technique de transfert de Southern, en utilisant une sonde marquée correspondant au promoteur de la puroindoline-a . La sonde utilisée est obtenue par amplification du plasmide pinA-Δ214, selon le protocole décrit précédemment, et en utilisant les amorces ppa3 et Ipuro A. Après analyse, seuls les individus présentant une • seule copie du transgène sont conservés et repiqués en pot avant d'être placés dans une serre confinée jusqu'à la floraison. EXEMPLE 4: PROFIL D'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA DANS LE GRAIN Les grains ont été récoltés pour toutes les plantes monocopies correspondant à chaque construction, y compris les plasmides témoins, à 8, 10, 15, 20 et 30 jours après floraison (JAF) . L'activité β-glucuronidase (GUS) est recherchée par analyse histochimique sur des coupes de grains fraîchement récoltés. La détection est effectuée comme décrit par JEFFERSON et al . {EMBO J. , 6, 3901-3907, 1987), en présence d'acide 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronique (XGluc, BIOSYNTH AG) , dans du tampon phosphate de potassium lOOmM, pH7, contenant 0,1% de TRITON X-100, ainsi que lOmM de K3Fe(CN)6 et lOmM de K4Fe(CN)6 pour éviter la diffusion des produits intermédiaires de la réaction. Les résultats révèlent une activité du gène rapporteur uidA dans l'albumen des grains PinA-Δ1214 et PinA- Δ390 dès le 8eme jour après floraison (JAF), cette activité atteint un maximum à 20 JAF. Ce profil d'expression est similaire à celui obtenu avec la construction PinB-Δ1067, sauf pour le maximum d'expression (30 JAF ; DIGEON et al , précité). Aucune expression dans le grain n'est observée avec les autres constructions. Les résultats obtenus en fonction des différents promoteurs utilisés sont résumés dans le Tableau IV, qui indique pour chaque construction, le nombre de plantes dans lesquelles on détecte une activité β-glucuronidase dans les grains, par rapport au nombre de plantes testées. TABLEAU IV
Figure imgf000014_0001
2. Obtaining transgenic plants: The transformation of rice plants of the species Oryza sa tiva is carried out by callus cultures in the presence of the different transformed colonies of Agro acteriuiî! tumefaciens, according to the protocol described by HIEI et al. (Plant J., 6 (2), 271-82, 1994). The primary transformants are selected on R2S AND NBS medium (OHIRA et al., Plant. Celi. Physiol., 14, 1113-1121, 1973; CHU, In Proc Symp on Plant Tissue Cuit, May 25-30, Beijing, Science Press , China, 43-50, 1978; GAMBORG et al., Exp. Celi. Res., 50, 151-158, 1968) containing 400 mg / L of cefotaxime (DUCHEFA), 100 mg / L of vancomycin (DUCHEFA) and 50 mg / L of hygromycin (SIGMA). The DNA of the isolated plants is then analyzed by the Southern blot technique, using a labeled probe corresponding to the puroindoline-a promoter. The probe used was obtained by amplification of the plasmid PINA-Δ214, according to the protocol described above, and using the primers and PPA3 Ipuro A. After analysis, only individuals with • single copy of the transgene are retained and subcultured pot before being placed in a confined greenhouse until flowering. EXAMPLE 4 PROFILE OF EXPRESSION OF THE UIDA REPORTER GENE IN THE GRAIN The grains were harvested for all the single-copy plants corresponding to each construction, including the control plasmids, at 8, 10, 15, 20 and 30 days after flowering (JAF) ). Β-glucuronidase (GUS) activity is sought by histochemical analysis on sections of freshly harvested grains. Detection is carried out as described by JEFFERSON et al. {EMBO J., 6, 3901-3907, 1987), in the presence of 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronic acid (XGluc, BIOSYNTH AG), in 100 mM potassium phosphate buffer, pH7, containing 0.1% of TRITON X-100, as well as 10 mM K 3 Fe (CN) 6 and 10 mM K 4 Fe (CN) 6 to avoid the diffusion of the intermediate products of the reaction. The results reveal an activity of the reporter gene uidA in the albumen of the PinA-Δ1214 and PinA- Δ390 grains from the 8 th day after flowering (JAF), this activity reaches a maximum at 20 JAF. This expression profile is similar to that obtained with the PinB-Δ1067 construction, except for the maximum expression (30 JAF; DIGEON et al, cited above). No expression in the grain is observed with the other constructions. The results obtained as a function of the various promoters used are summarized in Table IV, which indicates for each construction, the number of plants in which a β-glucuronidase activity is detected in the grains, relative to the number of plants tested. TABLE IV
Figure imgf000015_0001
Les résultats de localisation de l'expression de GUS dans le grain, observée avec les différentes constructions au maximum d'expression, sont résumés dans le tableau V. Tableau V
Figure imgf000015_0001
The results of localization of the expression of GUS in the grain, observed with the different constructions at maximum expression, are summarized in Table V. Table V
Figure imgf000016_0001
Ces résultats révèlent d' importantes différences entre les promoteurs pinA et pinB . Dans le cas de la construction PinB-Δ1067, la coloration du grain est localisée au niveau de l'albumen amylacé et dans une moindre mesure, de la couche à aleurone. En revanche, la coloration du grain se localise essentiellement au niveau de la couche à aleurone et de l'enveloppe du grain pour les constructions PinA-Δ1214 et PinA-Δ390, avec toutefois une faible coloration de l'albumen amylacé. Pour les constructions PinA-Δ214 et PinA-Δl36, on n'observe aucune coloration. En outre, et de façon inattendue, l'analyse histologique a également mis en évidence une coloration au niveau de l'embryon pour les constructions PinA-Δ1214 et PinA- Δ390, mais ceci uniquement lorsque celui-ci est sectionné. Cette coloration n'apparaît pas pour la construction PinB- Δ1067. Les séquences impliquées dans le profil d'expression du gène rapporteur uidA au niveau du grain sont donc localisées au niveau du segment -390 à -215 de la région 5' du gène pinA de Tri ticum aestivum . Les séquences potentiellement impliquées dans l'expression au niveau du grain dans le fragment -390 à -1 de la région 5' du gène pinA de Tri ticum aestivum sont représentées dans la figure . Les éléments putatifs de régulation de l'expression au niveau du grain sont soulignés. Les limites des différentes constructions de la région 5' du gène pinA sont indiquées par des rectangles noirs. La séquence _2o4TTGAGAAAAGG-194 est une séquence putative d'expression au niveau de l'albumen retrouvée chez de nombreuses autres céréales (MOTTO et al . , précité). En outre, la région -390/—215 abrite de nombreux motifs AACA qui sont conservés dans de nombreux promoteurs de gènes codant pour des protéines de réserve de grain de céréales. EXEMPLE 5 : INDUCTION DE L'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA EN REPONSE A UNE BLESSURE Des tests histochi iques ont été réalisés en réponse à des blessures, et selon le protocole décrit à l'exemple 4, sur les racines, les tiges et les feuilles de plants de riz transgéniques correspondant aux différentes constructions . Les résultats de l'analyse histologique effectuée sur les plan s transgéniques à différents stades de développement sont résumés dans le tableau VI. Tableau VI
Figure imgf000016_0001
These results reveal important differences between the pinA and pinB promoters. In the case of the PinB-Δ1067 construction, the color of the grain is localized at the level of the starchy endosperm and, to a lesser extent, of the aleurone layer. On the other hand, the coloring of the grain is mainly localized at the level of the aleurone layer and of the grain envelope for the constructions PinA-Δ1214 and PinA-Δ390, with however a weak coloring of the starchy endosperm. For the constructions PinA-Δ214 and PinA-Δl36, no coloring is observed. In addition, and unexpectedly, the histological analysis also revealed a coloration at the level of the embryo for the constructions PinA-Δ1214 and PinA- Δ390, but this only when the latter is sectioned. This coloration does not appear for the PinB- Δ1067 construction. The sequences involved in the expression profile of the reporter gene uidA at the grain level are therefore localized at the level of the segment -390 to -215 of the 5 'region of the pinA gene of Tri ticum aestivum. The sequences potentially involved in the expression at the grain level in the fragment -390 to -1 of the 5 'region of the pinA gene of Tri ticum aestivum are shown in the figure. The putative elements of regulation of the expression at the grain level are underlined. The boundaries of the various constructs of the 5 'region of the pinA gene are indicated by black rectangles. The sequence _ 2 o 4 TTGAGAAAAGG- 194 is a putative expression sequence at the level of the albumen found in many other cereals (MOTTO et al., Cited above). In addition, the -390 / —215 region is home to many AACA motifs which are conserved in many promoters of genes encoding grain grain reserve proteins. EXAMPLE 5 INDUCTION OF THE EXPRESSION OF THE UIDA REPORTER GENE IN RESPONSE TO INJURY Histochemical tests were carried out in response to wounds, and according to the protocol described in example 4, on the roots, stems and leaves. transgenic rice plants corresponding to the different constructions. The results of the histological analysis carried out on the transgenic planes at different stages of development are summarized in Table VI. Table VI
Figure imgf000017_0001
Les résultats montrent une activité GUS au niveau des feuilles, des tiges, et des racines uniquement pour les plantes correspondant aux constructions PinA-Δ1214 et PinA- Δ390. En revanche, aucune activité n'a été détectée dans les plantes portant les constructions PinA-Δ214, PinA-Δ136, PinB- Δ1067 ou le plasmide seul. Dans les différents organes aériens, la coloration est localisée au niveau des sites de coupure des tiges, des tiges florales et des feuilles. La figure 5 montre le détail d'une coloration obtenue sur un morceau de feuille après cisaillement avec une lame de scalpel . On observe que le profil de coloration est le même au niveau des sites internes de cisaillement (G et détail F) , qu'au niveau des bordures (G et détail H). Une analyse histologique plus fine révèle que la coloration est plus intense au niveau des tissus vasculaires des feuilles blessées . En revanche, les racines primaires et secondaires révèlent une coloration même en l'absence de blessure. Cette coloration se localise dans les tissus vasculaires et s'intensifie dans les zones de ramification. Toutefois, cette coloration n'est pas détectée dans les racines primaires au cours du développement, sauf dans le cas où ces dernières sont sectionnées . Les séquences impliquées dans le profil d'expression du gène rapporteur uidA en réponse à une blessure mécanique sont donc également localisées au niveau du segment
Figure imgf000017_0001
The results show GUS activity at the level of the leaves, stems and roots only for the plants corresponding to the constructions PinA-Δ1214 and PinA- Δ390. On the other hand, no activity was detected in the plants carrying the constructions PinA-Δ214, PinA-Δ136, PinB-Δ1067 or the plasmid alone. In the different aerial organs, the coloration is localized at the cut sites of the stems, flower stems and leaves. Figure 5 shows the detail of a coloration obtained on a piece of sheet after shearing with a scalpel blade. It is observed that the coloring profile is the same at the internal shear sites (G and detail F), as at the edges (G and detail H). A closer histological analysis reveals that the coloration is more intense in vascular tissue of injured leaves. On the other hand, the primary and secondary roots reveal color even in the absence of injury. This coloration is localized in the vascular tissues and intensifies in the branching zones. However, this coloration is not detected in the primary roots during development, except in the case where the latter are cut. The sequences involved in the expression profile of the reporter gene uidA in response to a mechanical injury are therefore also localized at the segment level.
-390 à -215 de la région 5' du gène pinA de Tri ticum aestivum . La position, au niveau du fragment -390 à -1 du gène pinA de Tri ti cum aestivum, des séquences potentiellement impliquées dans l'expression du gène uidA en réponse à un stress est illustrée dans la figure 6. Les éléments putatifs de régulation de l'expression en réponse à une blessure mécanique sont représentés en grisé. Les limites des différentes constructions de la région 5' du gène pinA sont indiquées par des rectangles noirs. La séquence de la boîte UN présente dans la séquence promotrice du gène sfr2 (PASTUGLIA et al . , précité) est relativement bien conservée dans la région 5' du gène pinA (_309TAATTTCCT-3oo) • Cette séquence ne se retrouve pas dans la région 5' du gène pinB et pourrait expliquer l'absence d'induction de ce dernier en réponse à une blessure. En outre, trois boîtes TCA putatives sont également présentes dans la région 5' du gène pinA (-.20ιGAGAAAAGT-.ι92/ -326TAGAAAAATA-317 et - 3ggCGAAAAAGCA-38o) . Toutefois, leur ho ologie avec la séquence de la boîte TCA du promoteur du gène sfr2 (CAGAAAAGGA) se révèle inférieure à celle de la boîte WUN. Enfin, on note également une séquence palindromique correspondant à une boîte de réponse putative au jasmonate de méthyle (_382GCAGT-378/- 366TGACG_362) inversée par rapport à celle décrite par ROUSTER et al Plan t . J. , 11, 513-23, 1997), mais néanmoins bien conservée . La totalité de ces séquences est conservée dans les régions 5' des gènes pinA des blés ancêtres. EXEMPLE 6 : EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA AU NIVEAU DES FLEURS Des tests histochimiques sont également réalisés, selon le protocole décrit à l'exemple 3, sur les hampes florales des riz transgéniques correspondant aux différentes constructions. Ces tests sont réalisés aux 5 étapes successives de développement de la fleur. Le dernier stade de « floraison » est atteint en 15 jours, lorsque les anthères déhiscentes sont sorties des glumelles. Les résultats de l'analyse histologique effectuée sur les hampes florales des plants transgéniques aux différents stades de développement sont résumés dans le tableau VII. Tableau VII-390 to -215 of the 5 'region of the pinA gene of Tri ticum aestivum. The position, at the level of the -390 to -1 fragment of the pin tA gene of Tri ti cum aestivum, of the sequences potentially involved in the expression of the uidA gene in response to stress is illustrated in FIG. 6. The putative elements of regulation of the expression in response to a mechanical injury are shown in gray. The boundaries of the various constructs of the 5 'region of the pinA gene are indicated by black rectangles. The sequence of the UN box present in the promoter sequence of the sfr2 gene (PASTUGLIA et al., Cited above) is relatively well conserved in the 5 'region of the pinA gene (_ 309 TAATTTCCT- 3 oo) • This sequence is not found in the 5 'region of the pinB gene and could explain the lack of induction of the latter in response to an injury. In addition, three putative TCA boxes are also present in the 5 'region of the pinA gene (-. 20 ιGAGAAAAGT-.ι 92 / - 326 TAGAAAAATA- 317 and - 3 ggCGAAAAAGCA- 38 o). However, their homology with the sequence of the TCA box of the promoter of the sfr2 gene (CAGAAAAGGA) appears to be lower than that of the WUN box. Finally, there is also a palindromic sequence corresponding to a putative response box to methyl jasmonate (_ 3 8 2 GCAGT- 3 78 / - 366 TGACG_ 362 ) reversed compared to that described by ROUSTER et al Plan t. J., 11, 513-23, 1997), but nevertheless well preserved. All of these sequences are conserved in the 5 ′ regions of the pinA genes of ancestral wheats. EXAMPLE 6 EXPRESSION OF THE UIDA REPORTER GENE AT THE FLOWER LEVEL Histochemical tests are also carried out, according to the protocol described in Example 3, on the flower stalks of transgenic rice corresponding to the different constructions. These tests are carried out at the 5 successive stages of flower development. The last stage of "flowering" is reached in 15 days, when the dehiscent anthers have emerged from the lemmas. The results of the histological analysis carried out on the flower stalks of transgenic plants at the various stages of development are summarized in Table VII. Table VII
Figure imgf000019_0001
Les résultats montrent ainsi que l'activité GUS est détectée dans les glumelles des plantes portant les constructions PinA-Δ1214 et PinA-Δ390. La coloration histochimique n'apparaît, au cours du développement floral, qu'au stade 2 et à l'extrémité supérieure des glumelles (par rapport à l'axe de la fleur) . L'activité du gène rapporteur progresse ensuite du haut des glumelles vers la base de la fleur, et ceci du stade 2 au stade 5. Ces plantes présentent également une activité au niveau de la base de la fleur, mais uniquement au stade 3. Les résultats révèlent également une activité GUS au niveau des anthères des plantes portant les constructions PinA-Δ214, PinA-Δ1214 et PinA-Δ390. Toutefois, cette activité n'est visible qu'au stade 4 de développement de la fleur. Après expulsion de leur pollen, plus aucune coloration n'est détectée au niveau des anthères au stade 5. Une analyse histologique des anthères fait apparaître une coloration des grains de pollen et de la fente de déhiscence. Aucune coloration n' est détectée au niveau du pistil et ceci quelle que soit la construction étudiée. Les résultats montrent donc que le fragment -214 à
Figure imgf000019_0001
The results thus show that the GUS activity is detected in the glumellae of plants carrying the constructions PinA-Δ1214 and PinA-Δ390. Histochemical coloring appears, during floral development, only in stage 2 and at the upper end of the glumellae (relative to the axis of the flower). The activity of the reporter gene then progresses from the top of the glumella to the base of the flower, and this from stage 2 to stage 5. These plants also exhibit activity at the base of the flower, but only at stage 3. The results also reveal GUS activity at the level of the anthers of the plants carrying the constructions PinA-Δ214, PinA-Δ1214 and PinA-Δ390. However, this activity is only visible at stage 4 of flower development. After expulsion of their pollen, no more coloration is detected in the anthers at stage 5. An analysis histology of the anthers reveals a coloration of the pollen grains and the dehiscence cleft. No coloration is detected at the level of the pistil and this whatever the construction studied. The results therefore show that the fragment -214 to
-137, de la région 5' du gène pinA de Tri ticum aestivum, possède des séquences impliquées dans l'expression, au niveau des grains de pollen, du gène rapporteur uidA. Les séquences potentiellement impliquées dans l'expression du gène uidA au niveau des grains de pollen au niveau de la région -390 à -1 du gène pinA de Tri ticum aestivum sont illustrées dans la figure 7. Les éléments putatifs de régulation de l'expression au niveau des grains de pollen sont représentés en grisé. Les limites des différentes constructions de la région 5' du gène pinA sont indiquées par des rectangles noirs . La séquence _196AGGTCA_i9o présente dans la séquence promotrice du gène zml3 du mais (HAMILTON et al . , précité) est présente à l'identique dans la région 5' du gène pinA. La séquence correspondante dans la région 5' du gène pinB n'est pas conservée. En outre, deux autres motifs spécifiques de l'expression du gène la t52 dans les grains de pollen de tomate-137, of the 5 ′ region of the pinA gene of Tri ticum aestivum, has sequences involved in the expression, at the level of the pollen grains, of the reporter gene uidA. The sequences potentially involved in the expression of the uidA gene at the level of the pollen grains at the level of the region -390 to -1 of the pinA gene of Tri ticum aestivum are illustrated in FIG. 7. The putative elements of regulation of the expression at the pollen grains are shown in gray. The boundaries of the various constructs of the 5 'region of the pinA gene are indicated by black rectangles. The sequence _ 196 AGGTCA_i 9 o present in the promoter sequence of the corn zml3 gene (HAMILTON et al., Cited above) is present identically in the 5 'region of the pinA gene. The corresponding sequence in the 5 'region of the pinB gene is not conserved. In addition, two other specific patterns of expression of the t52 gene in tomato pollen grains
(EYA1 et al . Précité) sont présents dans la région -214/-137 du promoteur du gène pinA (-a.99AGAAA-.195 et -ι54TCCACCAGT_ι46) .(EYA1 et al. Cited above) are present in the region -214 / -137 of the promoter of the pinA gene (-a .99 AGAAA-. 195 and -ι 54 TCCACCAGT_ι 46 ).
L' ensemble de ces boîtes putatives est relativement bien conservé dans les gènes pinA des blés ancêtres.All of these putative boxes are relatively well conserved in the pinA genes of ancestral wheats.
EXEMPLE 7 : INDUCTION DE L'EXPRESSION DU GENE RAPPORTEUR UIDA EN REPONSE A UNE ATTAQUE PAR UN PATHOGENE ; Des plantules de riz transgéniques correspondant aux constructions PinA-Δ1214, PinA-Δ390, PinA-Δ214, PinA-Δ136, PinB-Δ1067 et pCAMBIA-1381Xb sont infectées par le champignon Magnaporthe grisea (souche FR13) selon le protocole suivant : 30 ml d'une solution aqueuse de spores (105 spores/ml) additionnée de 0,5% (p/v) de gélatine sont pulvérisés sur les plantules au stade 4-5 feuilles. A titre de contrôle, des plantules témoins sont pulvérisées avec une solution de gélatine 0,5%. Les feuilles des plantules témoins et des plantules infectées sont récoltées 36 heures après la pulvérisation et l'activité GUS est recherchée par analyse histochimique, selon le protocole décrit à l'exemple 4. Les résultats révèlent une activité du gène rapporteur uidA 36 heures après l'infection, uniquement avec les constructions PinA-Δ1214 et PinA-Δ390. On observe un marquage localisé au niveau des tissus parenchymateux et des stomates . Compte tenu des voies parallèles utilisées par les mécanismes de réponse aux blessures mécaniques et aux infections fongiques, il est très probable que les séquences impliquées dans l'expression en réponse à l'infection par Magnaporthe grisea correspondent aux différents éléments de réponse localisés, dans l'exemple 5, au niveau du segment -390 à -215 de la région 5' du gène pinA de Tri ticum aestivum . EXAMPLE 7 INDUCTION OF THE EXPRESSION OF THE UIDA REPORTER GENE IN RESPONSE TO A PATHOGENIC ATTACK; Transgenic rice seedlings corresponding to the constructions PinA-Δ1214, PinA-Δ390, PinA-Δ214, PinA-Δ136, PinB-Δ1067 and pCAMBIA-1381Xb are infected with the fungus Magnaporthe grisea (strain FR13) according to the following protocol: 30 ml d an aqueous solution of spores (10 5 spores / ml) supplemented with 0.5% (w / v) of gelatin are sprayed on the seedlings at the 4-5 leaf stage. As a control, control seedlings are sprayed with a 0.5% gelatin solution. The leaves of the control seedlings and of the infected seedlings are harvested 36 hours after spraying and the GUS activity is sought by histochemical analysis, according to the protocol described in Example 4. The results reveal an activity of the reporter gene uidA 36 hours after l infection, only with the constructs PinA-Δ1214 and PinA-Δ390. A localized marking is observed at the level of the parenchymal tissues and the stomata. Given the parallel pathways used by the mechanisms of response to mechanical injuries and fungal infections, it is very likely that the sequences involved in expression in response to infection by Magnaporthe grisea correspond to the different localized response elements, in the 'Example 5, at the segment -390 to -215 of the 5' region of the pinA gene of Tri ticum aestivum.

Claims

REVENDICATIONS 1) Polynucléotide isolé caractérisé en ce que : il possède au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 1 ; il contient une boîte WUN comprenant la séquence TAATTTCCT, une boîte TCA comprenant la séquence TAGAAAAATA, une boîte TCA comprenant la séquence CGAAAAAGCA et une boîte de réponse au jasmonate de méthyle, comprenant un motif de séquence TGACG/GCAGT. 2) Polynucléotide isolé selon la revendication 1 caractérisé en ce que : il possède au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3 ; - il contient contient une boîte TCA comprenant la séquence GAGAAAAGGT. 3) Promoteur chimérique fonctionnel dans une cellule végétale, contenant un promoteur minimal associé à des éléments hétérologues de régulation en cis de la transcription, lequel promoteur est caractérisé en ce que lesdits éléments de régulation en cis comprennent un polynucléotide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 4) Cassette d'expression caractérisée en ce qu' elle comprend un promoteur contenant un polynucléotide selon la revendication 1. 5) Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il comprend un promoteur contenant un polynucléotide selon la revendication 1, ou une cassette d'expression selon la revendication 4. 6) Cellule végétale transformée par une cassette d'expression selon la revendication 4 ou un vecteur recombinant selon la revendication 5. 7) Plante transgénique transformée par une cassette d' expression selon la revendication 4 ou un vecteur recombinant selon la revendication 5. 8) Plante transgénique selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une monocotylédone . 9) Utilisation d'un promoteur contenant un polynucléotide selon la revendication 1, d'une cassette d'expression selon la revendication 4, ou d'un vecteur recombinant selon la revendication 5, pour induire l'expression d'un gène d'intérêt dans une cellule végétale en réponse à une blessure ou une infection par un pathogène. CLAIMS 1) Isolated polynucleotide characterized in that: it has at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 1; it contains a WUN box comprising the TAATTTCCT sequence, a TCA box comprising the TAGAAAAATA sequence, a TCA box comprising the CGAAAAAGCA sequence and a methyl jasmonate response box, comprising a TGACG / GCAGT sequence motif. 2) An isolated polynucleotide according to claim 1 characterized in that: it has at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 3; - it contains contains a TCA box comprising the sequence GAGAAAAGGT. 3) Functional chimeric promoter in a plant cell, containing a minimal promoter associated with heterologous elements of cis regulation of transcription, which promoter is characterized in that said cis regulatory elements comprise a polynucleotide according to any one of claims 1 or 2. 4) Expression cassette characterized in that it comprises a promoter containing a polynucleotide according to claim 1. 5) Recombinant vector characterized in that it comprises a promoter containing a polynucleotide according to claim 1, or a cassette d expression according to claim 4. 6) Plant cell transformed by an expression cassette according to claim 4 or a recombinant vector according to claim 5. 7) Transgenic plant transformed by an expression cassette according to claim 4 or a recombinant vector according to claim 5. 8) transgenic plant according to claim 7, because activated in that it is a monocot. 9) Use of a promoter containing a polynucleotide according to claim 1, of an expression cassette according to claim 4, or of a recombinant vector according to claim 5, for inducing the expression of a gene of interest in a plant cell in response to injury or infection by a pathogen.
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