WO2005056048A1 - Verfahren zur spezifischen erhöhung der sensitivität von tumorzellen - Google Patents

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WO2005056048A1
WO2005056048A1 PCT/EP2004/014032 EP2004014032W WO2005056048A1 WO 2005056048 A1 WO2005056048 A1 WO 2005056048A1 EP 2004014032 W EP2004014032 W EP 2004014032W WO 2005056048 A1 WO2005056048 A1 WO 2005056048A1
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catalase
tumor cells
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tumor
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Georg Bauer
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Georg Bauer
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    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
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    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the invention relates to a method for specifically increasing the sensitivity of tumor cells to an apoptosis or ne rose-inducing cellular effector. It further relates to a double-stranded nucleic acid, a use of a substance for the manufacture of a medicament for the treatment of a tumor disease and a medicament for the treatment of a tumor disease.
  • Transformed cells are cells that have been transformed into a transformed state in vitro by the expression of specific oncogenes, by the action of chemical or physical carcinogens or spontaneously and have a potential for tumor formation. In the transformed cells, the inhibition of proliferation by contact with other cells is eliminated. They also have the ability to form colonies.
  • Tumor cells are cells of a tumor or cells that come directly or indirectly from a tumor. These can also be cells from a cell line established from a tumor. The tumor may have arisen after inoculation of cells transformed in vitro.
  • the cells isolated from a tumor or cells of an ex vivo tumor cell line established from the isolated cells are also referred to here as "ex vivo tumor cells". Both tumor cells and transformed cells produce extracellular superoxide anions.
  • transformed hamster cells produce tumors after inoculation in mice.
  • Cells from cell lines established from the tumors showed in comparison with those for the inocular transformed cells used a much higher tumorigenicity.
  • a cell extract from these cells showed that the tumor cells contained more catalase inside than the transformed starting cells.
  • Effector cells also release nitrogen monoxide radicals, which react with the superoxide anions to form highly reactive peroxynitrite in the immediate vicinity of the transformed cell.
  • Peroxynitrite and hydroxyl radicals induce the apoptosis of the transformed cell.
  • the publication discusses various potential possibilities for tumor cells to escape induction of apoptosis.
  • an increased intracellular glutathione concentration could counteract the induction of apoptosis.
  • the production of catalase by transformed cells would lead to the breakdown of hydrogen peroxide and thus interact with the generation of hypochlorous acid.
  • Catalase could also counteract inactivation of NO by hydrogen peroxide and thereby lead to an increase in the peroxynitrite concentration.
  • catalase could lead to an increased apoptosis rate due to a reduced inactivation of NO or a reduced apoptosis rate due to a reduced production of hypochlorous acid and thus hydroxyl radicals which trigger apoptosis; It is also known that hydrogen peroxide reacts with NO radicals to form hydroxyl radicals.
  • the reaction consumes the NO radicals required for the formation of peroxynitrite, so that less peroxynitrite which triggers apoptosis would arise, but on the other hand, hydroxyl radicals which triggers apoptosis may arise.
  • Aminotriazole and mercaptosuccinate as inhibitors of catalase and glutathione peroxidase added to the culture. It was found that catalase causes a reduction in the damage caused by phosphamidone, while glutathione peroxidase protects against damage caused by both phosphamidone and
  • Some of the activated macrophages could protect themselves from destruction. These macrophages have adopted a phenotype that survives even when an apoptosis-inducing dose of the NO donor DETA-NO is added. These cells have an elevated level of superoxide dismutase (SOD), catalase and glutathione.
  • SOD superoxide dismutase
  • catalase catalase
  • glutathione glutathione
  • ROS reactive oxygen species
  • the object of the present invention is to provide a method which allows apoptosis to be triggered in tumor cells, whereas no apoptosis is triggered in cells other than tumor cells and transformed cells. Furthermore, it is an object of the present invention to specify a use of a substance for the manufacture of a medicament for the treatment of a tumor disease and also such a medicament.
  • a method for specifically increasing the sensitivity of tumor cells to a cellular effector which may trigger apoptosis or necrosis in the presence of other cells which are not tumor cells and not transformed cells.
  • the tumor cells and the other cells are treated with an agent which reduces substrate conversion by a catalase of the tumor cells.
  • Treatment with the agent causes tumor cells to die as a result of the action of the cellular effectors, while the other cells remain vital.
  • No glucose oxidase is used in the process.
  • the method can also be used in vitro. It is not based like that from Higuchi et al.
  • the rate of NO-mediated apoptosis can be increased by reducing the substrate conversion of the catalase of the tumor cells. This is very surprising because the rate of NO-mediated apoptosis can also be increased by administering a catalase by lifting the inhibition of NO-mediated apoptosis (Haberstroh et al.).
  • the sensitivity of the other cells is not increased to such an extent that the cellular effectors in these cells trigger apoptosis, even though the cells are not treated differently than the tumor cells.
  • the particular finding on which the invention is based is that the possibility of increasing the sensitivity of tumor cells to cellular effectors by inhibiting substrate conversion by a catalase is a specific property of tumor cells which the other cells do not have.
  • Hydrogen peroxide is formed from the superoxide anions on the surface of the tumor cells in a concentration which is insufficient to trigger apoptosis.
  • the hydrogen peroxide can be converted to HOCl by means of a peroxidase released by effector cells or the tumor cells themselves.
  • the inventor has recognized that after inhibiting the catalase of the tumor cells, hydrogen peroxide is produced in a concentration which, per se, cannot yet trigger apoptosis. He also recognized that the increased hydrogen peroxide concentration due to the inhibition of catalase leads to an increased production of HOCl, which then directly at the Cell membrane with the superoxide anions present there is converted to hydroxyl radicals.
  • This reaction is also a reaction which is specific for tumor cells because, unlike the other cells, tumor cells have extracellular superoxide anions at the location required for this reaction, ie directly on the cell membrane.
  • the increase in the sensitivity of the tumor cells by reducing the substrate conversion by the catalase can be canceled out by the administration of a catalase chemical.
  • the cellular effector can be released by tumor cells or by other cells in the vicinity of the tumor cells.
  • the effector normally secreted by cells, an analogue of this effector or a substance producing the cellular effector or its analogue, in particular an NO donor, can also be added externally.
  • An auto-crine or a paracrine release of apoptosis or necrosis is possible. Perhaps the formation of peroxynitrite is inhibited by catalase, the peroxynitrite formed is degraded by catalase, or the effect of the peroxynitrite formed from the NO radical is canceled by catalase.
  • catalase has an influence on the effect of the cellular effectors acting externally on the tumor cells.
  • the catalase is preferably an extracellularly acting, in particular arranged on the outside of the cell membrane, cellular catalase of the tumor cells.
  • the catalase can act on the cell membrane of the tumor cells.
  • the effector can be an effector secreted by the tumor cells or the other cells, in particular peroxidase or nitrogen monoxide.
  • the substrate conversion by the catalase can be carried out by means of a catalase inhibitor which specifically inhibits the action of the catalase.
  • Inhibitors especially 3-aminotriazole (“3-AT” or “AT”) can be reduced. Furthermore, the substrate conversion by the catalase can be reduced by means of RNA interference.
  • An siRNA is particularly suitable for this purpose, which has an RNA strand which is complementary to at least part of a sequence from a gene of the tumor cells coding for catalase.
  • An siRNA is a ribonucleic acid having less than 25 nucleotide pairs and having a double-stranded structure, which can cause RNA interference and thus the inhibition of the expression of cellular catalase.
  • the strands of the siRNA can be chemically linked to one another or have other modifications, such as those e.g. in Verma, S. and Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. (1998), volume 67, pages 99 to 134 and in Manoharan, M., Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1999), pages 117 to 130.
  • the siRNA preferably consists of a first RNA strand with the sequence SEQ ID NO 1 and a second RNA strand with the sequence SEQ ID NO 2 or a first RNA strand with the sequence SEQ ID NO 3 and a second RNA Strand with the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the catalase the inhibition of which leads to an increase in the sensitivity of the tumor cells
  • a cellular catalase arranged on the outside of the cell membrane of the tumor cell. This catalase is formed intracellularly by the tumor cell and then channeled onto the outside of the cell membrane. The substrate conversion by the catalase can therefore also be reduced by inhibiting its removal from the tumor cell.
  • the sensitivity of the tumor cells can be further increased by additionally lowering the intracellular glutathione level in the tumor cells. This can be done by reducing the effect of glutathione synthetase, which is more necessary for the production of glutathione and whose systematic name is gammaglutamyl-cysteine synthetase.
  • the effect of glutathione synthetase can be reduced by means of buthionine sulfoximine, in particular L-buthionine sulfoximine, or by means of RNA interference.
  • the RNA interference can be brought about by means of an siRNA which has an RNA strand which, at least in sections, is complementary to a sequence of a gene of the tumor cells coding for glutathione synthetase. Furthermore, it is additionally possible to reduce the effect of intracellular glutathione peroxidase, in particular by means of mercaptosuccinic acid or mercaptosuccinate or by means of RNA interference. Glutathione peroxidase catalyzes the reaction of glutathione with a peroxide. This reduces the concentration of peroxide in the cell.
  • the RNA interference can be brought about by means of an siRNA which has an RNA strand which, at least in sections, is complementary to a sequence of a gene of the tumor cell which codes for glutathione peroxidase.
  • the invention further relates to the use of a first substance which reduces substrate conversion by a catalase.
  • the first substance is used in the manufacture of a medicament suitable for the treatment of a tumor in a mammal or human.
  • the drug enhances the effect of an endogenous effector that may trigger apoptosis or necrosis in tumor cells. It does not contain glucose oxidase.
  • Such a first substance can only be used to manufacture a medicament because it specifically increases the sensitivity of the tumor cells and not the sensitivity of all cells to cellular effectors that trigger apoptosis and necrosis. Otherwise, the first substance in the body of a mammal or human would do great harm.
  • the invention relates to a medicament for the treatment of a tumor disease in a mammal or human, containing a first substance which reduces substrate conversion by a catalase, the medicament not containing any glucose oxidase.
  • Advantageous embodiments of the use and of the medicament result from the preceding explanations relating to the method according to the invention.
  • the medicament according to the invention additionally contains a cellular effector, an analogue of a cellular effector or a fourth substance producing a cellular effector or an analogue of a cellular effector. It is also expedient for the cellular effector, the analogue or the fourth substance to be used additionally for the manufacture of the medicament.
  • the fourth substance is preferably an NO donor, such as. B. sodium nitroprusside (SNP), nitroglycerin or S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP).
  • An analogue of a cellular effector is a substance that acts like a cellular effector, for example NO or peroxidase.
  • FIG. 2 shows a focus test with cells of the transformed cell line STHE-C3-p53 175 and the progeny cell line 2sc-STHE-p53 175 obtained from this cell line from a tumor in the presence and absence of the effector cells 208 F,
  • FIG. 3 shows a plaque test in which cells of the transformed cell line STHE or the tumor cell line STHE-83/20 obtained from this cell line were sown as cell clusters in the presence and absence of effector cells 208 F,
  • FIG. 5 shows the percentage of apoptotic STHE and STHE-83/20 cells in isolated culture when treated with L-buthioninsulfoximine (BSO) and 3-aminotriazole as a function of the cell density
  • FIG. 6 shows the percentage of apoptotic cells of the murine fibrosarcoma cell line L-929 in isolated culture after their treatment with a control siRNA K4 and the siRNAs CAT-1 and CAT-2 specifically directed against the catalase gene,
  • FIG. 10 shows the percentage of apoptotic cells of the leukemia / lymphoma cell line DAUDI and the immortalized but not malignant lymphatic cell lines FLO-B and ZH in isolated culture, each with and without treatment with 3-AT depending on the cell density,
  • FIG. 11 shows the percentage of apoptotic cells of the fibrosarcoma cell line L-929 in coculture with the TGF-beta-stimulated effector cells 208 F after their treatment without and with control siRNA K4 and the specific siRNA CAT-1 directed against the expression of the catalase in An - and absence of 3-AT and the catalase chemical EUK-8,
  • FIG. 17 shows the percentage of apoptotic cells of the human breast cancer cell line CAL-51 (FIG. 17a), HCC 1937 (FIG. 17b) and MCF-7 (FIG. 17c), 18 shows the percentage of apoptotic cells of the human neuroblastoma cell line CHP 134 with and without the addition of 3-AT,
  • 25 shows the percentage of apoptotic cells of the transformed hamster cell line STHE and the resulting tumor cell line STHE-83/20 depending on the concentration of the NO donor SNP with and without the addition of 3-AT,
  • 26 shows the percentage of apoptotic cells of the tumor cell line SIHA as a function of the concentration of the NO donor SNP in the presence of various concentrations of 3-AT.
  • FIG. 30 shows the percentage of apoptotic cells of the primary embryonic hamster fibroblast cells HE and of the cell lines STHE and STHE-83/20 with and without the addition of 3-AT,
  • 31 shows the percentage of apoptotic cells of the non-transformed cell line 208 F and the tumor cell line L-929 with and without the addition of 3-AT and
  • Tumor cell lines derived from the transformed embryonic hamster cell lines by inoculation into hamsters Tumor cell lines derived from the transformed embryonic hamster cell lines by inoculation into hamsters:
  • RAW 264.7 Murine macrophage cell line, number from the American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manasas, VA 20108, USA: TIB-71. The cells are referred to here as RAW.
  • DAUDI Human Burkittlymphom cell line, ATCC number: CCL-213;
  • HL-60 Human promyelocyte cell line, number at ATCC: CCL-240.
  • EJ Human bladder carcinoma cell line; The cells are also called T24; ATCC number: HTB-4.
  • L-929 Murine fibrosarcoma cell line; Number at the DSMZ: ACC 2
  • HE Syrian hamster embryonic fibroblasts.
  • the cells are not transformed and have a limited number of possible cell divisions (intact senescence control; formerly called “not immortalized”).
  • intact senescence control formerly called "not immortalized”
  • the recovery of these cells from hamster embryos is described in publications 1 and 2 of the literature list.
  • 208 F src3 Rat fibroblast cell line, which was formed by transforming 208 F cells with the src oncogene, described in Beck E, Shufer R and Bauer G, Exp. Cell Res. 234, pages 47-56, 1997.
  • FLO-B and zH B cell lines, each made from B cells from peripheral blood of healthy donors by transformation with the Epstein-Barr virus. The cells have been immortalized by the transformation.
  • CAL-51 human breast carcinoma cell line; Number at the DSMZ: ACC 302.
  • HCC-1937 human breast carcinoma cell line; Number at the DSMZ: ACC 513.
  • MCF-7 human breast carcinoma cell line; Number at the DSMZ: ACC 115.
  • SISO human cervical carcinoma cell line
  • Number at the DSMZ ACC 327.
  • SIHA human cervical carcinoma cell line
  • ATCC number ATCC HTB-35
  • Fu-OV-1 human ovarian carcinoma cell line; Number at the DSMZ: ACC 444.
  • BG-1 human ovarian carcinoma cell line, described in Stopper, H, Schmitt, E, Gregor, C, Mueller, SO, Fischer, W., Mutagenesis, 18: 243-247, 2003.
  • IPC 298 human melanoma cell line; Number at the DSMZ: ACC 251.
  • CHP 134 human neuroblastoma cell line; described in Fulda, S, Honer, M, Menke-Moellers, I and Berthold, F. European Journal of Cancer, 314: 616-621, 1995.
  • the cell culture medium contained 40 U / ml penicillin, 50 ⁇ g / ml streptomycin, 10 ⁇ g / ml neomycin and 10 U / ml nystatin (Reg. No. 48 453, ICN Pharmaceuticals, Bolongarostrasse 82-84, 65929 Frankfurt , Germany) .
  • the cells were culture in each case in the same cell culture medium in cell culture dishes or cell culture plates. An exception to this is the culture of cells in the Cell line HCC 1937.
  • 3-aminotriazole (3-AT” or "AT”): 25 mmol / 1
  • TGF-beta 20ng / l
  • MnTE-2-PyP Catalog No. 475871
  • MnTBAP Catalog No. 475870
  • FeTPPs Catalog No. 341492
  • Peroxynitrite Catalog No. 516620
  • FeTMPyP Catalog No. 341501
  • Calbiochem Merck Biosciences Ltd., European Distribution Center, Padge Road, Beeston / Nottingham, N69 2JR, Great Britain.
  • Apocynin blocks the NADPH oxidase, MnTM-2PyP, MnTE-2-PyP and MnTBAP are SOD mimetics, ie superoxide anion scavengers.
  • FeTPPS and FeTMPyP are known as potent peroxynitrite scavengers (“peroxynitrite decomposition catalysts”).
  • ABH Aminobenzoylghydrazid, Catalog No. 10320-1000 was purchased from Acros Organics, New Jersey, USA.
  • ABH is a "mechanism-based inhibitor" of peroxidases. ABH is first oxidized by peroxidases and can then inhibit the peroxidase. This two-stage mechanism ensures the selectivity of its action.
  • the NO synthetase inhibitors L-NIL (catalog no. CN-258, 7-nitroindazole (7-NI, catalog no. CN-249) and 3-bromo-7-nitroindazole (3-Br-7-Ni, catalog No. CNN-252) were obtained from Biomol GmbH, Waidmann-Str. 35, 22769 Hamburg, 3-Br-7-Ni has a high selectivity for NO synthetase from neuronal cells (nNOS).
  • TGF-beta was according to Strauss, SC et al. , Int. J. Oncol. (1995) Volume 7, pages 565-572 from an extract of human platelets. SNP and SperminNONOate served as the NO donor. Unless stated otherwise, the percentage of apoptotic cells was determined by means of a transmitted-light phase contrast microscope according to the known apoptosis criteria of membrane blebbing, core condensation and core fragmentation.
  • FIG. 1 shows the result of an experiment in which the inducibility of apoptosis by NO in different cells was investigated under different conditions.
  • the bars from left to right represent the percentage of apoptotic cells in the total number of cells used in the following cell lines: STHE, STHE-83/20, STHE-C3-Ha-ras, 2sc-STHE-Ha-ras, STHE- C3-p53 175 , 2sc-STHE-p53 175 , STHE-C3-bcl-2, 4sc-STHE-bcl-2, HE-wtSV40 and 2sc-HE-wtSV40.
  • the unfilled bars each show the result for transformed cells and the black bars each show the result for the tumor cells derived from these cells after inoculation in mice.
  • SNP sodium nitroprusside
  • SOD superoxide dismutase
  • Tumor cells have been shown to be resistant to the action of the NO donor. The tumor cells can, however, be sensitized by adding the catalase inhibitor 3-AT, so that apoptosis is also induced here. The induction of apoptosis caused by these cells also SNP can inhibit SOD. The results are the same for all examined cells.
  • FIG. 2 shows the result of a so-called focus test, which is carried out in duplicate.
  • the results obtained with cells of the cell line STHE-C3-p53 175 and on the right side the results obtained with cells of the tumor cell line 2sc-STHE-p53 175 obtained therefrom are shown on the left side of FIG. 2.
  • 300 cells of the transformed cell line STHE-C3-p53 175 or 2sc-STHE-p53 175 were sown on an area of 3.8 cm 2 in 1.5 ml cell culture medium. After the cells had grown, there was either no further addition (“NO ADDITION”) or 12,000 cells each of the non-transformed rat fibroblasts 208 F were seeded as effector cells.
  • NO ADDITION no further addition
  • the number of foci was determined in each case.
  • One focus in each case is a colonies of at least 10 of these cells within a confluent layer of the 208F cells which are recognizable on the basis of the morphology of the STHE-C3-p53 175 or 2sc-STHE-p53 175 cells.
  • the height of the bars represents the mean value ⁇ of the standard deviation shown in the form of error bars of the values determined for the double approaches.
  • the clones of the transformed cells are largely eliminated, but that of the tumor cells is not.
  • Stimulation of the effector cells with TGF-beta has a reinforcing effect on the elimination of the transformed cells, but not on the tumor cells.
  • the tumor cells lose their resistance when the catalase inhibitor 3-AT is present.
  • the experiment shows that, in contrast to the transformed starting cells, tumor cells are resistant to elimination mediated by effector cells and that this resistance is based on the action of catalase.
  • FIG. 3 shows the result of a plaque test carried out in each case in duplicate.
  • the transformed cells STHE or the tumor cells STHE-83/20 derived therefrom were sown as cell clusters of 1250 cells each in 10 ⁇ l cell culture medium on an area of 9.6 cm 2 .
  • NO EFFECTOR CELLS 3 ml of cell culture medium without further cells
  • PLUS 208 F 50,000 of the non-transformed cells 208 F as effector cells
  • the left side of the figure shows the results without the addition of effector cells.
  • the result is shown on the right in the presence of the 208 F cells.
  • the effector cells induce apoptosis in the transformed cells, but not in the Tu morzellen.
  • the tumor cells can be sensitized for induction of apoptosis by treatment with 3-AT.
  • the addition of TGF-beta enhances the apoptosis inducing effect of the 208 F cells.
  • FIG. 4 shows the result of a test for autocrine induction of apoptosis, which was carried out in duplicate.
  • the STHE-83/20 tumor cells were each sown with and without 3-AT and the transformed STHE cells without additives in the amount specified in each case on an area of 0.75 cm 2 in 0.2 ml of cell culture medium.
  • the percentage of apoptotic cells was determined after 3 days.
  • the position of the symbols represents the mean value + the standard deviation of the values determined in the double approaches shown in the form of error bars.
  • FIG. 4 shows that the transformed cells can self-destruct while the tumor cells are protected from autocrine self-destruction.
  • FIG. 4 furthermore shows that the resistance of the tumor cells can be eliminated by the catalase inhibitor 3-AT.
  • transformed cells STHE upper illustration
  • tumor cells STHE-83/20 lower illustration
  • Either L-Buthioninsulfoximin (BSO), 3-AT or BSO and 3-AT was added to the cell culture medium.
  • the percentage of apoptotic cells was determined after 60 hours.
  • the position of the symbols represents the mean value ⁇ of the standard deviation of the values determined in the double approaches shown in the form of error bars.
  • FIG. 5 shows that in transformed cells after lowering the glutathione level by adding BSO apoptosis autocrine at lower than the cell densities shown in FIG. 4 is induced. Apoptosis is only induced in the tumor cells when their catalase is inhibited by 3-AT.
  • FIGS. 6 to 10 each show the results of experiments in which tumor cells were sown in a cell density sufficient to trigger autocrine self-destruction.
  • the cells without siRNA, with the unspecific control siRNA K4 or with the siRNAs CAT-1 or CAT-2 specifically inhibiting the expression of the catalase were transfected by means of lipofection.
  • the double-stranded oligoribonucleotides used for transfections have the following sequences, designated in the sequence listing with No. 1 to No. 6:
  • CAT-1 dsRNA, one strand S1 of which is complementary to a section of the human catalase gene: S2: 5'- ACCUGUGAACUGUCCCUACCG -3 '(Sequence No. 1) S1: 3'- UAUGGACACUUGACAGGGAUGGC -5' (Sequence No. 2)
  • CAT-2 dsRNA, one strand S1 of which is complementary to another section of the human catalase gene:
  • S2 5'- AACAUUGCCGGCCACCUGAAG -3 '(sequence No. 3)
  • S1 3'- UCUUGUAACGGCCGGUGGACUUC -5' (sequence No. 4)
  • K4 serving as a control dsRNA, one strand of the bacterial Sl Neomycm resistance gene (Accession Number m of the database GenBank: U55763) to a sequence of 5 ⁇ -untranslat ⁇ erten region is complementary:
  • S2 5'-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3 '(Sequence No. 5)
  • S1 3'-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUACU-5' (Sequence No. 6)
  • RNA single strands were synthesized using an RNA synthesizer (type Expedite 8909, Applied Biosystems, Rothstadt, Germany) and conventional chemical methods. The crude synthesis products were then cleaned using HPLC. NucleoPac PA-100, 9x250 mm from Dionex, were used as columns. 20 mmol / 1 T ⁇ s, 10 mmol / 1 NaCl ⁇ 4, pH 6.8, 10% acetonitrile was used as the low salt buffer and 20 mmol / 1 Tris, 400 mmol / 1 NaC10 4 , pH as the high salt buffer
  • the flow was 3 ml / minute.
  • the hybridization of the single strand (10 ⁇ mol / 1 each) to the double strand was carried out by heating the stochiometric mixture of the single strand to 95 ° C. for 5 minutes with 25 mmol / 1 Tris-HCl, pH 7.5, 100 mmol / 1 NaCl and then cooling to 37 ° C. over 30 minutes.
  • the siRNAs were introduced into the cells as follows: the siRNAs were in a stock solution a concentration of 20 ⁇ mol / 1. Lipofection was carried out using "Lipofectamin 2000" from Invitrogen in accordance with the manufacturer's instructions. For this purpose, 100,000 cells were sown in an area of 9.6 cm 2 in 3 ml of cell culture medium. After 24 hours, the cell culture medium was removed and 1.2 ml
  • TGF-BETA TGF-beta
  • 3-AT 3-AT
  • TGF-beta + 3-AT TGF-BETA + 3-AT
  • the siRNAs were introduced into the cells as follows: 15 ⁇ 10 5 cells of the murine macrophage
  • Leukemia cell lines RAW have been subjected to lipofection in a concentration of 5 ⁇ 10 5 cells per ml in Opti-MEM using 80 nmol / 1 siRNA in lipofectamine as described for the experiments shown in FIGS. 6 and 7.
  • the indicated cell densities were then in Eagles MEM with 5% FCS set.
  • the cells were each sown on a cell culture plate with an area of 2 cm 2 in 1 ml of cell culture medium.
  • the cells were each treated without ("without 3-AT”) and with ("with 3-AT”) 3-AT. After 36 hours, the batches were stained with 1 ⁇ g / ml bisbenzimidine to highlight the core structure.
  • the cells were incubated for 30 min at 37 ° C. Then the percentage of apoptotic cells was determined by means of a reverse fluorescence microscope on the basis of nuclear condensation and / or nuclear fragmentation. The height of the bars represents the mean of double determinations.
  • FIG. 6 shows that with cells of the murine fibrosarcoma cell line L-929 and FIG. 7 that with cells of the human bladder carcinoma cell line EJ after three days (upper illustration, "DAY 3") and four days (lower illustration, "TAG 4" ) achieved result.
  • FIG. 8 shows the result obtained after 36 hours with cells of the murine macrophage leukemia cell line RAW at a cell density of 1.25 ⁇ 10 5 cells / ml (upper illustration) and 5 ⁇ 10 5 cells / ml (lower illustration).
  • the experiments shown in FIGS. 6 to 8 show that
  • FIG. 9 shows the result of an experiment for autocrine self-destruction of cells of the murine macrophage leukemia cell line RAW and of cells of the human promyelocyte cell line HL-60 in the presence and absence of 3-AT. The cell densities stated were set in Eagles MEM with 5% FCS.
  • the cells were each sown on a cell culture plate with an area of 2 cm 2 in 1 ml of cell culture medium. After 48 hours, the batches were stained with 1 ⁇ g / ml bisbenzimidine as indicated above. The percentage of apoptotic cells was determined using a reversing fluorescence microscope on the basis of core condensation and / or core fragmentation. The position of the symbols represents the mean of double determinations.
  • FIGS. 9 and 10 show that the leukemia and lymphoma cells, but not the non-malignant lymphatic cells, are sensitized to autocrine induction of apoptosis by inhibiting the catalase.
  • FIGS. 11 and 12 show the result of experiments for the induction of apoptosis in tumor cells by the effector cells 208 F.
  • 50,000 208 F cells were first sown as effector cells in 3 ml of medium on an area of 9.6 cm 2 and incubated for 2 days at 37 ° C. in the presence of TGF-beta. The cell culture medium was then removed, the batches washed and new cell culture medium without TGF-beta added.
  • Cells of the fibrosarcoma cell line L-929 were treated with the siRNAs CAT-1 or K4 in a final concentration of 80 nmol / 1 as in the experiment shown in FIG. 6 by lipofection. 18 hours after lipofection, the L-929 cells were incubated for 6 hours with and without 3-AT.
  • the treatment with 3-AT was carried out in order to inactivate catalase present on the cells, which came from before the inhibition of the expression of the catalase by siRNA.
  • the L-929 cells were then washed and 50,000 of these cells per batch were added to the 208 F cells, which were morphologically clearly distinguishable from the L-929 cells, with and without 40 ⁇ mol / 1 of the catalase mimetic EUK-8, which was identified by 3-AT is not inactivated, sown.
  • EUK-8 was obtained from Calbiochem, Merck Biosciences Ltd., European Distribution Center, Padge Road, Beeston / Nottingham, N69 2JR, Great Britain, catalog number 341209-25MG.
  • the percentage of apoptotic L-929 cells was determined after 5 days using a transmitted-light phase contrast microscope.
  • the height of the bars represents the mean value ⁇ of the standard deviation of the values determined in the double approaches, shown in the form of error bars.
  • FIG. 12 shows results of each in
  • STHE cells could be increased by transfection with the siRNA CAT-1.
  • the cells of the derived tumor cell line STHE-83/20 were resistant to the elimination by the effector cells in the presence and absence of TGF-beta.
  • Focus formation was shown to the same extent as in the control experiment without effector cells.
  • the focus formation decreased drastically when the effect of catalase was inhibited by 3-AT.
  • the inhibition of the expression of the catalase by transfection with the siRNA CAT-1, but not the transfection with the siRNA K4 also led to an elimination of the tumor cells. This shows that the resistance of the tumor cells to induction of apoptosis by neighboring effector cells can be abolished if the catalase is either inhibited or its expression is prevented by specific siRNA.
  • FIGS. 13a and 13b show the result of experiments carried out in duplicate with cells of the transformed cell line STHE and the tumor cell line STHE-83/20 in the presence and absence of the NO donor SNP.
  • the experiment shown in FIG. 13 a was carried out like the experiment shown in FIG. 1.
  • FIG. 13a shows that cells of the transformed cell line
  • STHE are sensitive to induction of apoptosis by the NO donor SNP, while the cells of the STHE-83/20 tumor cell line are resistant to such induction of apoptosis.
  • the effect of the NO donor in the transformed cells is canceled by SOD.
  • SOD catalyzes the formation of H0 2 from superoxide anions, so that the superoxide anions can no longer react with NO.
  • 3-AT also leads to a sensitization of the
  • FIG. 13b shows the proportion of apoptotic tumor cells STHE-83/20 after induction of apoptosis by means of SNP in cells, which, as in the experiment shown in FIG. 6, were transfected with the control siRNA K4 or the specific siRNAs CAT-1 or CAT-2 in a final concentration of 80 nmol / 1 by lipofection. The cells were trypsinized 24 hours after the transfection. The same experiment as that shown in FIG. 13a was carried out with these cells. It can be seen that transfection with CAT-1 or CAT-2, but not with K4, led to sensitization of the tumor cell. The catalase-specific siRNAs therefore have the same effect as the catalase inhibitor 3-AT.
  • FIGS. 13a and 13b show that tumor cells can use their catalase to protect against NO-mediated induction of apoptosis. Protection can be removed by inhibiting catalase or preventing its expression, thereby increasing the sensitivity of the cells to NO-mediated apoptosis.
  • Apoptosis was induced here by cellular effectors secreted by the STHE-83/20 cells. Glutathione normally protects the cells against induction of apoptosis by hydroxyl radicals, which can arise from a metal-catalyzed Haber-Weiss reaction. 14 shows that the tumor cells lose their resistance to induction of apoptosis by a metal-catalyzed Haber-Weiss reaction by transfection with the siRNA CAT-1, but not with the siRNA K4. The experiment also shows that the effect depends on the concentration of the siRNA used.
  • MERCAPTOSUCCINAT apoptotic cell was added.
  • the percentage of apoptotic cells was determined in each case after the specified times.
  • the position of the symbols in each case represents the mean + the standard deviation, shown in the form of error bars, of the values determined in the double approaches.
  • Fig. 15 shows that the effect of 3-AT is enhanced if the intracellular glutathione level is lowered by BSO or the effect of glutathione peroxidase is inhibited by mercaptosuccinate.
  • FIG. 16 shows the result of a test for autocrine apoptosis induction carried out in each case in duplicate
  • FIG. 16 shows that the human tumor cells are apoptosis-dependent and dependent on the inhibition of catalase.
  • the cell density dependency shows the intercellular signal effect.
  • Cells from more than 50 human tumor cell lines not shown here show an analogous behavior.
  • FIG. 17 shows in three fields the result of a test for autocrine apoptosis induction in cells of the human breast carcinoma cell lines CAL-51 (A., upper field), HCC 1937 (B., middle field) and MCF-7 (C, lower field).
  • 20 ng / ml TGF-beta were added to 25,000 of the cells mentioned in an area of 0.75 cm 2 in 0.2 ml of medium, and 50 mmol / l 3-AT and for the CAL-51 and MCF-7 cells 100 mmol / 1 3-AT added to the HCC 1937 cells.
  • NIT nitrite
  • SOD nitrite plus SOD
  • TAU nitrite plus TAU
  • FeC12 nitrite plus SOD
  • FIG. 17 shows that the cells of the three breast carcinoma cell lines investigated go into apoptosis after inhibition of catalase, the HOCl pathway playing no role. Rather, induction of apoptosis is based on the formation of NO and its reaction with superoxide anions, which leads to the formation of peroxynitrite.
  • FIG. 18 shows in two fields the result of a test for autocrine apoptosis induction in cells of the human neuroblastoma cell line CHP 134, which was carried out in double batches.
  • the experiment was carried out analogously to the experiment shown in FIG. 17, the cell density being 12500 cells per batch and the reaction volume was 400 ⁇ l.
  • the test batches either received no 3-AT (B., "WITHOUT 3-AT") or 50 mmol / 1 3-AT (A., "Plus 3-AT”).
  • no 3-AT B., "WITHOUT 3-AT”
  • A., "Plus 3-AT” 50 mmol / 1 3-AT
  • the HOCl pathway is obviously of no importance because there is no inhibition by the inhibition of peroxidase, the trapping of HOCl and the trapping of hydroxyl radicals. Instead, the induction of apoptosis obviously takes place via the NO / peroxynitrite route.
  • the NO / peroxynitrite pathway is based on the interaction of NO with superoxide anions with subsequent formation of peroxynitrite.
  • FIG. 19 shows the result of an experiment in duplicate for autocrine apoptosis induction in cells of the human ovarian carcinoma cell line BG-1.
  • the experiment was carried out analogously to the experiment shown in FIG. 17.
  • the number of apoptotic cells was determined 23.5 hours after the cells were sown.
  • the experiment shows that the cells of the ovarian carcinoma cell line go into apoptosis in the presence of TGF-beta and 3-AT (50 mmol / 1).
  • the induction of apoptosis cannot be inhibited by the HOCl scavenger taurine.
  • the induction of apoptosis can, however, be inhibited if the NO / peroxynitrite pathway is interrupted.
  • FIG. 20 shows in three fields the result of an experiment, each carried out in duplicate, for autocrine apoptosis induction in cells of the human cervical carcinoma cell line SIHA (upper field), the human breast carcinoma cell line CAL-51 (middle field) and the human ovarian carcinoma cell line FU-OV-1 (lower field).
  • the experiment was carried out analogously to the experiment shown in FIG. 17. No apoptosis was induced without the addition of 3-AT (not shown).
  • the catalase was inhibited by 50 mmol / 1 3-AT.
  • the number of apoptotic Cells were determined 36 hours after the cells were sown.
  • the test result shows that after inhibition of catalase, apoptosis is induced in all three cell lines.
  • apoptosis is induced via the HOCl route and in the cells of the other two cell lines via the NO / peroxynitrite route.
  • FIG. 21 shows in two fields the result of a test for autocrine apoptosis induction in cells of the human melanoma cell line IPC 298, which was carried out in duplicate.
  • the experiment was carried out analogously to the experiment shown in FIG. 18.
  • the test batches received either no 3-AT (lower field) or 50 mmol / 1 3-AT (upper field).
  • the result shows that the cells of the IPC 298 melanoma cell line go into apoptosis if their catalase is inhibited.
  • the HOCl path and the NO / peroxynitrite path play an approximately equivalent role.
  • FIG. 22 shows a result obtained with cells of the human neuroblastoma cell line CHP 134 by autocrine apoptosis induction, the expression of the catalase of these cells having been inhibited by catalase-specific siRNA.
  • the CHP 134 cells were transfected with the siRNAs indicated in FIG. 22, as in the experiment shown in FIG. 6.
  • the final concentration of siRNA was 33 nmol / 1 each.
  • the transfected cells were seeded at a density of 12500 cells per batch in a reaction volume of 400 ⁇ l.
  • the indicated additives have been added to the reaction batches.
  • MnTM-2PyP was used in a concentration of 40 ⁇ mol / 1, L-NAME in a concentration of 2.4 mmol / 1 and 3-Br-7-Ni in a concentration of 10 ⁇ mol / 1.
  • the number of apoptotic cells was determined 30 hours after sowing.
  • the figure shows that the catalase-specific siRNAs CAT1 and CAT2 have an effect analogous to the catalase inhibitor 3-AT compared to the control K4. In the human system, CAT2 is more effective than CAT1.
  • the effect of CAT2 can be effectively inhibited by capturing the superoxide anions using MnTM-2PyP, or preventing NO synthesis using L-NAME or 3-Br-7-Ni. This in turn shows that apoptosis is induced via the NO / peroxynitrite route.
  • FIG. 23 shows the result of a test for autocrine apoptosis induction in cells of the human neuroblastoma cell line CHP 134, which was carried out in duplicate. The experiment was carried out analogously to the experiment shown in FIG. 18. The test batches received the additives indicated in each case. The number of apoptotic cells was determined at the times indicated after the cells had been sown. The result shows
  • FIGS. 24 and 25 show the result of an experiment for the NO-dependent induction of apoptosis. SNP was added to the respective cells in the concentrations indicated.
  • 2000 cells each of the transformed hamster cell line STHE or the tumor cell line STHE 83/20 (“8320”) that resulted therefrom after tumor formation were in an area of 0.75 cm 2 in 0.4 ml cell culture medium been sown.
  • 2000 cells (“STHE (2), STHE 83/20 (2)"
  • 8000 cells STHE (8), STHE 83/20 .
  • FIG. 26 shows the result of an experiment for the NO-dependent induction of apoptosis in cells of the human cervical carcinoma cell line SIHA, which was carried out in duplicate. 5000 of the cells were sown in an area of 0.75 cm 2 in 0.4 ml of cell culture medium. SNP was added in the concentrations indicated. It was either no 3-AT ("SIHA WITHOUT 3-AT”) or 3-AT in a concentration of 50 mmol / 1 (“SIHA Plus 50 mM 3-AT”) or 100 mmol / 1 (“SIHA Plus 100 mM 3- AT ”) added. The percentage of apoptotic cells was determined 24 hours after sowing. FIG. 26 shows that the SIHA cells are largely resistant to the induction of apoptosis by the NO donor SNP, but can be effectively sensitized by the catalase inhibitor 3-AT.
  • FIG. 27 shows the result of an experiment, carried out in duplicate, for the NO-dependent induction of apoptosis in cells of the human cervical carcinoma cell line SIHA.
  • the experiment was carried out analogously to the experiment shown in FIG. 26 using the inhibitors which are mentioned in the experiment shown in FIG. 18.
  • the experiment shows that apoptosis can only be induced by an NO donor if the catalase is inhibited.
  • Apoptosis induction is inhibited by preventing superoxide anion synthesis (by APO), by trapping superoxide anions (by SOD, MnTM2PyP or MnTBAP) or by destroying peroxynitrite (by FeTPPS or FeTMPyP). This shows that apoptosis cannot be directly induced by NO in these cells and the formation of peroxynitrite is necessary to induce apoptosis.
  • FIG. 28 shows the result of a test for apoptosis induction by peroxynitrite in cells of the transformed rat fibroblast cell line 208 F src3, which was carried out in duplicate.
  • 25,000 of the cells were sown in an area of 0.75 cm 2 in 0.2 ml of medium.
  • Peroxynitrite (PON) was either added directly to the cells (50 ⁇ mol / 1) or by interaction of the NO donor SperminNONOate (SPE, 0.5 mmol / 1) with superoxide anions on the Cell membrane. No peroxynitrite or NO donor was added in the control. The specified amount of catalase was added to all cells.
  • the percentage of apoptotic cells was determined after 7 hours and in the case of the SPE added after 8.5 hours.
  • the position of the symbols represents the mean value ⁇ of the standard deviation of the values determined in the double approaches shown in the form of error bars.
  • the result shows that the added catalase effectively abolishes the effect of the peroxynitrite and depends on the concentration. Less catalase is required when peroxynitrite is added directly than when peroxynitrite is formed directly on the cell membrane. For kinetic reasons, when the peroxynitrite is formed on the cell membrane, a higher catalase concentration is necessary for complete inhibition. Overall, this result shows the hitherto unknown ability of catalase to reverse the effects of peroxynitrite.
  • FIGS. 29 a and b each show the result of a test, carried out in duplicate, for the activity of catalase as a function of the H 2 O 2 concentration used (FIG. 29 a) or the peroxynitrite concentration used (FIG. 29 b).
  • Compound I first intermediate product
  • the intermediate can also convert methanol into formaldehyde very effectively.
  • the reaction of the intermediate (Compound I) with methanol is more efficient than the reaction with hydrogen peroxide, so that in the presence of hydrogen peroxide, methanol and catalase the enzyme initially reacts with hydrogen peroxide in the first step, for the second step (catalyzed by Compound I ) but favored methanol over hydrogen peroxide.
  • One unit is defined as the amount of catalase that releases 1 nmol of formaldehyde per minute from methanol.
  • the reaction volume of 170 ⁇ l contains 100 ⁇ l reaction buffer, 30 ⁇ l methanol and the concentration of hydrogen peroxide (FIG. 29 a) or peroxynitrite (FIG. 29 b) shown in FIGS. 29 a and b.
  • the test batches were incubated at room temperature for 20 minutes each. Then 30 ⁇ l of KOH were added to stop the enzyme reaction and 30 ⁇ l of Purpal (4-amino-3-hydrazino-5-mercapto-1,2,4-triazoles). The mixture was then incubated for 10 minutes at room temperature.
  • the experiment shown in FIG. 29 b shows for the first time that not only hydrogen peroxide but also peroxynitrite is accepted as a substrate by the catalase and is implemented in a two-stage reaction.
  • peroxynitrite binds to the catalase as well as hydrogen peroxide with the formation of an intermediate product and thereby forms the enzyme intermediate Compound I required for the later conversion of methanol into formaldehyde
  • catalase is inactivated by peroxynitrite.
  • FIG. 30 shows the result of a test for autocrine apoptosis induction with primary embryonic hamster fibroblast cells HE, cells of the cell line STHE resulting from spontaneous transformation, and cells of the tumor cell line STHE 83/20.
  • the cells seeded 12500 in an area of 0.75 cm 2 in 0.2 ml of Eagle's MEM s 5% FCS. All test batches contained 20 ng / ml TGF-beta and either no 3-AT (“WITHOUT 3-AT”) or 25 mmol / 1 3-AT (“PLUS 25mM 3-AT"). The percentage of apoptotic cells was determined after 87 hours.
  • the experiment shows the difference between the parental, non-transformed HE cells, which are insensitive to autocrine apoptosis induction, the cells of the sensitive trans- formed cell line STHE and the cells of the resistant tumor cell line STHE 83/20, which can be sensitized by 3-AT.
  • Control experiments (not shown) showed that apoptosis induction in STHE and STHE 83/20 cells was caused by the cell's own superoxide anions, peroxidase, HOCl and hydroxyl radicals. Further control experiments showed that all of the cells examined in this experiment have effector functions.
  • the insensitivity of the HE cells is therefore not due to a lack of effector action, but rather to a lack of superoxide anion production, as is typical for non-transformed cells.
  • FIG. 31 shows in two fields the result of a test for autocrine apoptosis induction with cells of the non-transformed cell line 208 F (upper field) and cells of the mouse fibrosarcoma cell line L-929 (lower field) as a positive control for the Effect of the 3-AT.
  • 25,000 of the cells were sown in an area of 0.75 cm 2 in 0.2 ml of medium.
  • the batches received no additives ("control"), or 20 ng / ml TGF-beta ("TGF”), 25 mmol / 1 3-AT (“3-AT”) or 20 ng / ml TGF-beta and 25 mmol / 1 3-AT (“TGF + 3-AT").
  • the percentage of apoptotic cells was determined at the times shown in the graphics.
  • the experiment shows the selectivity of induction of apoptosis for cells that have a transformed state. These are the transformed cells and the tumor cells. It also shows that the tumor cells are largely resistant to induction of apoptosis, but that they can be sensitized by 3-AT.
  • the 3-AT effect is specific for the tumor cells because there is no sensitization of the parental, non-transformed cells 208 F.
  • Another experiment was carried out analogously to the experiments shown in FIGS. 30 and 31. Either no 3-AT or 50 mmol / 1 3-AT was added to the test batches. The percentage of apoptotic cells was determined two days after the cells were sown. The following result was shown:
  • Alpha-1 diploid not ⁇ 0.5 0.5 transformed human fibroblasts
  • 32 is a schematic representation of the apoptosis-inducing signaling pathways in tumor cells mediated by reactive oxygen species (ROS) and the specific inhibition of these signaling pathways by catalase.
  • 32 shows the effect of non-transformed effector cells and the autocrine effect of tumor cells as effector cells. Both effects are based on the release of NO and peroxidase ("P").
  • the tumor cell can only act as a target cell because of superoxide anions are generated on their surface.
  • the resulting signaling pathways can be prevented by a membrane-based catalase.
  • the catalase can convert both hydrogen peroxide and peroxynitrite and thereby interrupt the corresponding signaling pathways.
  • the expression of the catalase protects the tumor cell from triggering apoptosis.
  • This protection of the tumor cell can be eliminated by inhibiting the substrate conversion by the catalase.
  • the substrate conversion can be inhibited by inhibiting the activity of the catalase, by inhibiting the expression of the catalase by means of siRNA or by inhibiting the localization of the catalase on the cell membrane, in particular by preventing the catalase from being removed from the cell.
  • RNA ⁇ 213> Homo sapiens ⁇ 400> 3 aacauugccg gccaccugaa g 21
  • RNA strand that is complementary to a sequence of the 5 'untranslated region of the bacterial neomycin resistance gene (Accession Number in the GenBank database: U55763) ⁇ 400> 6 ucaugcgaaa cgauccucau ccu 23

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber einem potenziell Apoptose oder Nekrose auslösenden zellulären Effektor in Anwesenheit anderer Zellen, welche keine Tumorzellen und keine transformierten Zellen sind, wobei die Tumorzellen und die anderen Zellen mit einem Mittel behandelt werden, welches eine Substratumsetzung durch eine Katalase der Tumorzellen verringert, wobei bei dem Verfahren keine Glucoseoxidase eingesetzt wird.

Description

Verfahren zur spezifischen Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur spezifischen Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber einem Apopto- se oder Ne rose auslösenden zellulären Effektor. Sie betrifft weiterhin eine doppelsträngige Nukleinsäure, eine Verwendung eines Stoffs zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Tumorerkrankung sowie ein Medikament zur Behandlung einer Tumorerkrankung.
Im Folgenden wird zwischen Tumorzellen und transformierten Zellen unterschieden. Transformierte Zellen sind Zellen, die in vitro durch die Expression spezifischer Onkogene, durch die Wirkung von chemischen oder physikalischen Karzinogenen oder spontan in einen transformierten Zustand übergangen sind und ein Potenzial zur Tumorbildung besitzen. Bei den transformierten Zellen ist die Hemmung der Proliferation durch Kontakt mit anderen Zellen aufgehoben. Darüber hinaus besitzen sie die Fähigkeit, Kolonien zu bilden. Tumorzellen sind dagegen Zellen eines Tumors oder Zellen die direkt oder indirekt aus einem Tumor stammen. Es kann sich dabei auch um Zellen einer aus einem Tumor etablierten Zelllinie handeln. Der Tumor kann nach Inokulation von in vitro transformierten Zellen entstanden sein. Die aus einem Tumor isolierten Zellen oder Zellen einer aus den isolierten Zellen etablierten ex- vivo-Tumorzelllinie werden hier auch als "ex-vivo-Tumorzel- len" bezeichnet. Sowohl Tumorzellen als auch transformierte Zellen produzieren extrazelluläre Superoxidanionen.
Aus den Veröffentlichungen Ziff. 1 - 7 der Literaturliste ist es bekannt, dass transformierte Hamsterzellen nach Inokulation in Mäuse Tumore erzeugen. Zellen von aus den Tumoren eta- blierten Zelllinien zeigten im Vergleich mit den zur Inokula- tion verwendeten transformierten Zellen eine wesentlich höhere Tumorigenität . Ein Zellextrakt aus diesen Zellen zeigte, dass die Tumorzellen in ihrem Inneren mehr Katalase enthielten, als die transformierten Ausgangszellen.
Aus Engelmann, I. und Bauer, G., Anticancer Research 20 (2000), Seiten 2297 bis 2306 ist es bekannt, dass mit TGF- beta oder FGF stimulierte nicht transformierte Fibroblasten als Effektorzellen benachbarte transformierte Zellen durch interzelluläre Induktion von Apoptose vernichten können.
Nicht transformierte Zellen bleiben dagegen unbeschadet. Beim Vergleich von ex-vivo-Tumorzellen mit Zellen aus in vitro transformierten Zelllinien zeigte sich, dass die ex-vivo-Tumorzellen eine erhöhte Resistenz gegenüber interzellulärer Induktion von Apoptose aufweisen. Diese Resistenz wird darauf zurückgeführt, dass die Tumorzellen mehr endogene Überlebensfaktoren produzieren als andere Zellen. Aus den von den transformierten Zellen freigesetzten Superoxidanionen kann spontan Wasserstoffperoxid entstehen. Effektorzellen setzen eine Peroxidase frei, welche die Synthese von hypochloriger Säure aus Wasserstoffperoxid und Chlorionen katalysiert. Die hypochlorige Säure reagiert mit Superoxidanionen im Bereich einer transformierten Zelle und bildet dort hochreaktive Hy- droxylradikale. Weiterhin setzen Effektorzellen Stickstoff- monoxidradikale frei, die mit den Superoxidanionen zu hochreaktivem Peroxynitrit in unmittelbarer Nähe der transformierten Zelle reagieren. Peroxynitrit und Hydroxylradikale induzieren die Apoptose der transformierten Zelle. In der Publikation werden verschiedene potenzielle Möglichkeiten von Tu- morzellen erörtert, der Induktion der Apoptose zu entgehen.
Beispielsweise könnte eine erhöhte intrazelluläre Glutathion- Konzentration der Apoptoseinduktion entgegenwirken. Die Erzeugung von Katalase durch transformierte Zellen würde zum Abbau von Wasserstoffperoxid führen und dadurch mit der Er- zeugung hypochloriger Säure wechselwirken. Katalase könnte auch einer Inaktivierung von NO durch Wasserstoffperoxid entgegenwirken und dadurch zu einer Erhöhung der Peroxynitrit- konzentration führen. Katalase könnte also einerseits durch eine verringerte Inaktivierung von NO zu einer gesteigerten Apoptoserate oder durch eine verringerte Erzeugung von hypochloriger Säure und damit von Apoptose auslösenden Hydroxyl- radikalen zu einer verringerten Apoptoserate führen; Weiterhin ist es bekannt, dass Wasserstoffperoxid mit NO-Radikalen zu Hydroxylradikalen reagiert. Bei der Reaktion werden einer- seits die für die Peroxynitrit-Bildung erforderlichen NO- Radikale verbraucht, so dass weniger Apoptose auslösendes Peroxynitrit entstehen würde, andererseits entstehen jedoch möglicherweise Apoptose auslösende Hydroxylradikale .
Insgesamt ist nicht klar, ob die Wasserstoffperoxid abbauende Katalase oder deren Wasserstoffperoxid erzeugender Gegenspieler Superoxiddismutase einen Schutz vor interzellulärer Apop- toseinduktion bietet oder die Apoptoseinduktion fördert.
Aus Cicchetti, R. und Argentin, G., Mutagenesis (2003), Band 18 (2), Seiten 127 bis 132 ist es bekannt, dass die Genotoxi- zität der Pestizide Phosphamidon und Dieldrin Schäden an DNA durch Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies und damit durch oxidativen Stress verursachen. Bei mit Kulturen primärer Maus-Lungenfibroblasten durchgeführten Versuchen wurde 3-
Aminotriazol und Mercaptosuccinat als Inhibitoren von Katalase bzw. Glutathionperoxidase der Kultur zugesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass Katalase eine Verminderung der Schäden durch Phosphamidon verursacht, während Glutathionperoxidase gegen Schäden schützt, welche sowohl durch Phosphamidon und
Dieldrin verursacht werden. Eine gleichzeitige Behandlung mit den Antioxidanz-Inhibitoren und Pestiziden führte zu apopto- tische Zelltod. Die Ergebnisse lassen keine Rückschlüsse auf die Wirkung zellulärer Effektoren zu. Aus Ferret, P. J. et al., BMC Immunology (2002), Band 3 (1), Seite 3 ist es bekannt, dass Makrophagen nach Stimulation durch Zytokine Effektormoleküle erzeugen, welche Mikroorganismen aber auch die Makrophagen selbst zerstören können. In Versuchen wurden Zellen der murinen Makrophagen-Leukämiezell- linie RAW 264.7 in vitro mit Lipopolysacharid (LPS) und/oder Interferon-gamma (IFN-gamma) stimuliert. Dadurch wurde endogene NO-Produktion induziert. Ein Teil der aktivierten Makrophagen konnte sich selbst vor Zerstörung schützen. Diese Ma- krophagen haben einen Phänotyp angenommen, welcher sogar dann überlebt, wenn eine Apoptose induzierende Dosis des NO-Donors DETA-NO zugesetzt wird. Diese Zellen weisen einen erhöhten Pegel an Superoxiddismutase (SOD) , Katalase und Glutathion auf. Die Stimulation der RAW 264.7 Zellen mit LPS und/oder IFN-gamma in Gegenwart von spezifischen Inhibitoren von SOD, Aminotriazol als Katalaseinhibitor und Buthioninsulfoximin (BSO) als Glutathioninhibitor zeigte, dass dadurch das Entstehen des resistenten Phänotyps verhindert werden konnte. Die Autoren schlussfolgern, dass es einen direkten kausalen Zusammenhang zwischen dem Überleben eines Teils von Makrophagen und einer Hochregulation eines autoprotektiven intrazellulären Redox-Puffer-Syste s gibt, welcher gleichzeitig mit der Modulation der Expression von apoptotischen Molekülen der Bcl2-Bcl-XL/Bax-Bad-Familie stattfindet. Die Autoren gehen davon aus, dass das in RAW 264.7-Zellen beobachtete Phänomen ein allgemeines Phänomen bei Makrophagen ist.
Aus Hanada, H. et al., Free Radical Biology & Medicine (1997), Band 23 (2), Seiten 294 bis 301 ist es bekannt, dass in den Zellen des sich durch Apoptose auflösenden Kaulquappenschwanzes die Aktivität von SOD erhöht ist, während gleichzeitig die Aktivität von Katalase verringert ist. Der apoptotische Prozess wurde durch Zusatz von Wasserstoffperoxid und Aminotriazol als Katalaseinhibitor zum Kulturmedium deutlich verstärkt. Die Autoren schlussfolgern, dass apopto- tischer Zelltod im Kaulquappenschwanz zumindest teilweise durch einen Mechanismus ausgelöst werden könnte, der von aktiven Sauerstoffspezies abhängig ist. Rückschlüsse auf die Verhältnisse in Säugerzellen können daraus nicht gezogen wer- den.
Aus Hermann, C. et al., Arteriosclerosis, Thrombosis and Va- scular Biology (1997), Band 17 (12), Seiten 3588 bis 3592 ist es bekannt, dass Scherstress bei humanen Endothelzellen durch oxidativen Stress induzierte Apoptose hemmt. Diese Hemmung der Apoptose konnte teilweise verhindert werden durch Hemmung von Glutathionbiosynthese mittels BSO oder Stickoxidsynthase mittels NG-Monomethyl-L-Argenin, während die Hemmung von Katalase durch Aminotriazol keinen Einfluss auf die hemmende Wirkung von Scherstress hatte.
Aus Haberstroh, K. et al., International Journal of Oncology 21 (2002) , Seiten 145 bis 151 ist es bekannt, dass von transformierten Zielzellen stammende reaktive Sauerstoffspezies (ROS) einen inhibitorischen Effekt auf NO-vermittelte Apoptose haben. Der inhibitorische Effekt kann durch Katalase aufgehoben und durch die Erzeugung von Wasserstoffperoxid mittels Glucoseoxidase verstärkt werden. Die Wirkung der Katalase führt also zu einer gesteigerten Apoptoserate. Transfor- mierte Fibroblasten scheinen sich NO-vermittelter Apoptose durch Wasserstoffperoxid-Bildung zu entziehen. Ursache dafür könnte die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit NO zu Hy- droxylradikalen sein. Die Hydroxylradikale haben vermutlich keinen Apoptose auslösenden Effekt auf die Zellen, weil sie wahrscheinlich entfernt von der Zellmembran entstehen und nur einen freien Diffusionsweg im Bereich von Nanometern haben.
Aus Higuchi, Y. et al . , Jpn. J. Cancer Res. 82 (8) (1991),
Seiten 942 bis 949 ist es bekannt, dass Glucoseoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid führt. In Mäusen verhindert die Verabreichung von Glucoseoxidase das Tumorwachstum. Die Wirkung von Glucoseoxidase wurde durch die kombinierte Verabreichung mit Katalase-Inhibitoren, wie 3-Aminotriazol, Hy- droxylamin und Natriumazid oder dem Glutathionsynthetaseinhi- bitor Buthionin- (S,R) -Sulfoxi in in vivo verstärkt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches es erlaubt, in Tumorzellen eine Apoptose auszulösen, während bei anderen Zellen als Tumorzellen und transformierten Zellen keine Apoptose ausgelöst wird. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Verwendung eines Stoffs zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Tumorerkrankung sowie ein solches Medikament anzugeben.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch die Merkmale der Patentansprüche 1, 11 und 21 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Patentansprüche 2 bis 10, 12 bis 20 und 22 bis 30.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur spezifischen Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber einem potenziell Apoptose oder Nekrose auslösenden zellulären Effektor in Anwesenheit anderer Zellen, welche keine Tumorzellen und keine transformierten Zellen sind, vorgesehen. Dazu werden die Tumorzellen und die anderen Zellen mit einem Mittel behandelt, welches eine Substratumsetzung durch eine Katalase der Tumorzellen verringert. Die Behandlung mit dem Mittel führt dazu, dass durch die Einwirkung der zellulären Effektoren Tumorzel- len absterben, während die anderen Zellen vital bleiben. Bei dem Verfahren wird keine Glucoseoxidase eingesetzt. Das Verfahren ist auch in vitro anwendbar. Es beruht nicht wie das aus Higuchi et al. bekannte Verfahren auf einer Bereitstellung einer erhöhten Wasserstoffperoxid-Menge durch Gluco- seoxidase und der Verringerung des Abbaus dieses Wasserstoff- peroxids durch kombinierte Verabreichung von Glucoseoxidase mit einem Katalase-Inhibitor . Die erhöhte Wasserstoffperoxid- Menge kann auch bei anderen Zellen als Tumorzellen Apoptose auslösen. Higuchi et al . haben nicht erkannt, dass die Kata- lase-Inhibitoren die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber einem potenziell Apoptose oder Nekrose auslösenden zellulären Effektor erhöhen. Sie haben weiterhin nicht erkannt, dass dazu die Verabreichung des Katalaseinhibitors ohne Glucoseoxidase ausreichend ist.
Erstaunlicherweise hat es sich gezeigt, dass die Rate NO-vermittelter Apoptose durch Verringerung der Substratumsetzung der Katalase der Tumorzellen gesteigert werden kann. Das ist sehr überraschend, weil auch durch die Gabe einer Katalase die Rate NO-vermittelter Apoptose gesteigert werden kann, indem die Inhibition der NO-vermittelten Apoptose aufgehoben wird (Haberstroh et al . ) .
Besonders erstaunlich ist es, dass die Sensitivität der ande- ren Zellen nicht so weit erhöht wird, dass die zellulären Effektoren bei diesen Zellen eine Apoptose auslösen, obwohl die Zellen nicht anders behandelt werden als die Tumorzellen. Die besondere der Erfindung zu Grunde liegende Erkenntnis besteht darin, dass die Möglichkeit, die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber zellulären Effektoren durch Hemmung der Substratumsetzung durch eine Katalase eine spezifische Eigenschaft von Tumorzellen ist, welche die anderen Zellen nicht aufweisen.
Es ist, beispielsweise aus Hermann, C. et al. bekannt, dass Wasserstoffperoxid (H202) in Säugerzellen Apoptose auslösen kann. Es liegt daher die Annahme nahe, dass durch Hemmung der Katalase in Säugerzellen die intra- und extrazelluläre Wasserstoffperoxid-Konzentration erhöht und dadurch Apoptose ausgelöst werden kann. Durch Hemmung der Katalase müssten dann sämtliche Zellen sensitiver gegenüber der Auslösung von Apoptose durch H202 sein. Der Erfinder hat jedoch erkannt, dass durch die Hemmung der Katalase ein Signalweg ermöglicht wird, welcher spezifisch bei Tumorzellen Apoptose auslösen kann. Ursächlich dafür scheinen die folgenden zwei Mechanis- en zu sein:
1. Von Tumorzellen auf der Zellaußenseite generierte Superoxidanionen reagieren mit von Effektorzellen oder den Tumorzellen selbst freigesetztem NO zu Peroxynitrit (ONOO") . Pe- rixynitrit ist ein Apoptoseinduktor . Der Erfinder hat erkannt, dass Peroxynitrit durch eine zelluläre Katalase der Tumorzelle so umgesetzt wird, dass es keine Apoptose mehr auslöst. Durch die Hemmung der Katalase kann Peroxynitrit Apoptose in den Tumorzellen auslösen ("NO / Peroxynitrit- Weg") . Aus der zitierten Arbeit von Haberstroh et al . war es jedoch bekannt, dass Katalase die Wirkung des Peroxynitrits durch Abbau von mit NO reagierendem H202 verstärkt, weil dadurch mehr NO-Radikale zur Bildung von Peroxynitrit zur Verfügung stehen. Der Erfinder hat aber erkannt, dass diese Re- aktion fernab der Tumorzelle stattfindet und direkt an der Membran der Tumorzelle die Hemmung des Peroxynitritweges durch Zerstörung des Peroxynitrits durch Katalase dominant ist .
2. Aus den Superoxidanionen an der Oberfläche der Tumorzellen entsteht Wasserstoffperoxid in einer Konzentration, welche zur Auslösung von Apoptose nicht ausreicht. Das Wasserstoffperoxid kann mittels einer von Effektorzellen oder den Tumorzellen selbst freigesetzten Peroxidase zu HOCl umgesetzt werden. Der Erfinder hat erkannt, dass nach Hemmung der Katalase der Tumorzellen Wasserstoffperoxid in einer Konzentration entsteht, welche per se noch keine Apoptose auslösen kann. Er hat weiterhin erkannt, dass die durch die Hemmung der Katalase erhöhte Wasserstoffperoxid-Konzentration zu einer ver- mehrten Entstehung von HOCl führt, welches dann direkt an der Zellmembran mit den dort vorhandenen Superoxidanionen zu Hy- droxylradikalen umgesetzt wird. Diese Hydroxylradikale lösen dann Apoptose bei den Tumorzellen aus ("HOCl-Weg") . Es handelt sich auch bei dieser Reaktion um eine Reaktion, welche spezifisch für Tumorzellen ist, weil Tumorzellen im Gegensatz zu den anderen Zellen extrazelluläre Superoxidanionen an der für diese Reaktion erforderlichen Lokalisation, d. h. direkt an der Zellmembran, aufweisen.
Die Erhöhung der Sensitivität der Tumorzellen durch Verringerung der Substratumsetzung durch die Katalase kann durch die Gabe eines Katalasememetikums wieder aufgehoben werden. Der zelluläre Effektor kann von Tumorzellen oder von anderen Zellen in der Umgebung der Tumorzellen freigesetzt werden. Der normalerweise von Zellen sezernierte Effektor, ein Analogon dieses Effektors oder ein den zellulären Effektor oder dessen Analogon erzeugender Stoff, insbesondere ein NO-Donor, kann auch zusätzlich von außen zugegeben werden. Es ist eine auto- krine oder eine parakrine Auslösung von Apoptose oder Nekrose möglich. Möglicherweise wird die Bildung von Peroxynitrit durch Katalase inhibiert, gebildetes Peroxynitrit durch Katalase abgebaut oder die Wirkung des aus dem NO-Radikal gebildeten Peroxynitrits wird durch Katalase aufgehoben. Keines dieser Phänomene ist aber bisher bekannt. Die Wirkung der Ka- talase ist erstaunlich, weil es beispielsweise aus der obigen Publikation von Engelmann und Bauer bekannt ist, dass das gegenteilig zur Katalase wirkende Enzym Superoxiddis utase die Bildung von Peroxynitrit aufhebt und damit ebenfalls der Auslösung von Apoptose entgegenwirkt. Obwohl es aus den Veröf- fentlichungen Ziff. 1 - 7 der Literaturliste bekannt ist, dass Tumorzellen vermehrt Katalase enthalten, ist es bisher nicht bekannt, dass die Katalase einen Einfluss auf die Wirkung der von außen auf die Tumorzellen wirkenden zellulären Effektoren hat. Bei der Katalase handelt es sich bevorzugt um eine extrazellulär wirkende, insbesondere auf der Außenseite der Zellmembran angeordnete, zelluläre Katalase der Tumorzellen. Die Katalase kann an der Zellmembran der Tumorzellen wirken. Bei dem Effektor kann es sich um einen von den Tumorzellen oder den anderen Zellen sezernierten Effektor, insbesondere Peroxidase oder Stickstoffmonoxid, handeln.
Die Substratumsetzung durch die Katalase kann mittels eines spezifisch die Wirkung der Katalase hemmenden Katalase-
Inhibitors, insbesondere 3-Aminotriazol ("3-AT" oder "AT"), verringert werden. Weiterhin kann die Substratumsetzung durch die Katalase mittels RNA-Interferenz verringert werden. Dazu ist insbesondere eine siRNA geeignet, die einen RNA-Strang aufweist, der komplementär zu zumindest einem Teil einer Sequenz aus einem für die Katalase kodierenden Gen der Tumorzellen ist. Bei einer siRNA handelt es sich um eine weniger als 25 Nukleotidpaare aufweisende Ribonukleinsäure mit dop- pelsträngiger Struktur, welche RNA-Interferenz und dadurch die Hemmung der Expression zellulärer Katalase bewirken kann. Die Stränge der siRNA können chemisch miteinander verknüpft sein oder sonstige Modifikationen aufweisen, wie sie z.B. in Verma, S. und Eckstein, F., Annu. Rev. Biochem. (1998), Band 67, Seiten 99 bis 134 und in Manoharan, M., Biochimica et Biophysica Acta 1489 (1999), Seiten 117 bis 130 beschrieben sind.
Vorzugsweise besteht die siRNA aus einem ersten RNA-Strang mit der Sequenz SEQ ID NO 1 und aus einem zweiten RNA-Strang mit der Sequenz SEQ ID NO 2 oder aus einem ersten RNA-Strang mit der Sequenz SEQ ID NO 3 und einem zweiten RNA-Strang mit der Sequenz SEQ ID NO: 4.
Der Erfinder hat erkannt, dass die Katalase, deren Hemmung zu einer Erhöhung der Sensitivität der Tumorzellen führt, insbe- sondere eine auf der Außenseite der Zellmembran der Tumorzelle angeordnete zelluläre Katalase ist. Diese Katalase wird von der Tumorzelle intrazellulär gebildet und dann auf die Außenseite der Zellmembran geschleust. Die Substratumsetzung durch die Katalase kann daher auch verringert werden, indem deren Ausschleusung aus der Tumorzelle inhibiert wird.
Die Sensitivität der Tumorzellen kann weiter gesteigert werden, indem zusätzlich der intrazelluläre Glutathionspiegel in den Tumorzellen gesenkt wird. Das kann durch Verringerung der Wirkung von Glutathionsynthetase erfolgen, die zur Herstellung von Glutathion erforderlicher ist und deren systematischer Name Gammaglutamyl-Cystein-Synthetase lautet. Die Wirkung der Glutathionsynthetase kann mittels Buthioninsulfoxi- min, insbesondere L-Buthioninsulfoximin, oder mittels RNA- Interferenz verringert werden. Die RNA-Interferenz kann mittels einer siRNA bewirkt werden, die einen RNA-Strang aufweist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionsynthetase kodierenden Gen der Tumorzellen ist. Weiterhin ist es zusätzlich möglich, die Wirkung intrazellulärer Glutathionperoxidase, insbesondere mittels Mercaptobernsteinsäure bzw. Mercaptosuccinat oder mittels RNA-Interferenz, zu verringern. Die Glutathionperoxidase katalysiert die Reaktion von Glutathion mit einem Pero- xid. Sie vermindert dadurch die Konzentration des Peroxids in der Zelle. Die RNA-Interferenz kann mittels einer siRNA bewirkt werden, die einen RNA-Strang aufweist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionperoxidase kodierenden Gen der Tumorzelle ist.
Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung eines ersten Stoffs, der eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringert. Der erste Stoff wird zur Herstellung eines Medikaments verwendet, das zur Behandlung einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen geeignet ist. Das Medikament verstärkt die Wirkung eines endogenen in Tumorzellen potenziell Apoptosen oder Nekrosen auslösenden Effektors. Es enthält keine Glucoseoxidase. Ein solcher erster Stoff kann zur Herstellung eines Medikaments nur eingesetzt werden, weil er spezifisch die Sensitivität der Tumorzellen und nicht die Sensitivität sämtlicher Zellen gegenüber Apoptose und Nekrose auslösenden zellulären Effektoren erhöht. Anderenfalls würde der erste Stoff im Körper eines Säugetiers oder Menschen großen Schaden anrichten.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Medikament zur Behandlung einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen, enthaltend einen eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringernden ersten Stoff, wobei das Medikament keine Gluco- seoxidase enthält. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Verwendung und des Medikaments ergeben sich aus den vorangehenden, das erfindungsgemäße Verfahren betreffenden Ausführungen.
Insbesondere ist es vorteilhaft, wenn das erfindungsgemäße Medikament zusätzlich einen zellulären Effektor, ein Analogon eines zellulären Effektors oder einen einen zellulären Effektor oder ein Analogon eines zellulären Effektors erzeugenden vierten Stoff enthält. Es ist auch zweckmäßig, dass der zelluläre Effektor, das Analogon oder der vierte Stoff zusätz- lieh zur Herstellung des Medikaments verwendet wird. Der vierte Stoff ist vorzugsweise ein NO-Donor, wie z. B. Natri- umnitroprussid (SNP) , Nitroglycerin oder S-Nitroso-N-Acetyl- penicillamin (SNAP) . Ein Analogon eines zellulären Effektors ist ein Stoff, der wie ein zellulärer Effektor, beispielswei- se NO oder Peroxidase, wirkt.
Nachfolgend wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen: Fig. 1 den prozentualen Anteil apoptotischer transformierter Zellen und apoptotischer Tumorzellen nach Behandlung mit verschiedenen Agenzien,
Fig. 2 einen Focus-Test mit Zellen der transformierten Zelllinie STHE-C3-p53175 und der aus dieser Zelllinie aus einem Tumor gewonnenen Nachkommenzell- linie 2sc-STHE-p53175 in An- und Abwesenheit der Effektorzellen 208 F,
Fig. 3 einen Plaque-Test, bei dem Zellen der transformierten Zelllinie STHE oder der aus dieser Zelllinie gewonnene Tumorzelllinie STHE-83/20 als Zellhaufen in An- und Abwesenheit von Effektor- zellen 208 F ausgesät wurden,
Fig. 4 den prozentualen Anteil apoptotischer transformierter Zellen STHE und apoptotischer Tumorzellen STHE-83/20 in isolierter Kultur in Abhängig- keit von der Zelldichte,
Fig. 5 den prozentualen Anteil apoptotischer STHE- und STHE-83/20-Zellen in isolierter Kultur bei Behandlung mit L-Buthioninsulfoximin (BSO) und 3- Aminotriazol in Abhängigkeit von der Zelldichte,
Fig. 6 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der murinen Fibrosarkomzelllinie L-929 in isolierter Kultur nach deren Behandlung mit einer Kontroll- siRNA K4 und den spezifisch gegen das Katalase- Gen gerichteten siRNAs CAT-1 und CAT-2,
Fig. 7 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Zelllinie EJ in isolierter Kultur nach deren Be- handlung mit der Kontroll-siRNA K4 und den spe- zifisch gegen das Katalase-Gen gerichteten siRNAs CAT-1 und CAT-2,
Fig. 8 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der murinen Makrophagen-Leukämiezelllinie RAW in isolierter Kultur nach deren Behandlung ohne siRNA (Kontrolle) , mit der Kontroll-siRNA K4 und den spezifisch gegen das Katalase-Gen gerichteten siRNAs CAT-1 und CAT-2 jeweils mit und ohne Behandlung mit 3-Aminotriazol,
Fig. 9 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Leukämiezelllinie RAW und der Leukämie-/Lymphom- zelllinie HL-60 in isolierter Kultur jeweils mit und ohne Behandlung mit 3~Aminotriazol in Abhängigkeit von der Zelldichte,
Fig. 10 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Leukämie-/Lymphomzelllie DAUDI und der immorta- lisierten aber nicht malignen lymphatischen Zelllinien FLO-B und zH in isolierter Kultur jeweils mit und ohne Behandlung mit 3-AT in Abhängigkeit von der Zelldichte,
Fig. 11 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Fibrosarkomzelllinie L-929 in Kokultur mit den TGF-beta-stimulierten Effektorzellen 208 F nach deren Behandlung ohne und mit Kontroll-siRNA K4 und der spezifischen gegen die Expression der Katalase gerichteten siRNA CAT-1 in An- und Abwesenheit von 3-AT und dem Katalasememetikum EUK-8,
Fig. 12 die Anzahl an Foci von Zellen der Zelllinien STHE und STHE-83/20 nach deren Behandlung je- weils ohne siRNA, mit Kontroll-siRNA K4 und Katalase spezifischer siRNA CAT-1 in An- und Abwesenheit von Effektorzellen der Zelllinie 208 F,
Fig. 13a, b den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der transformierten Zelllinie STHE und der Tumorzelllinie STHE-83/20 nach deren Behandlung mit SNP, SOD und/oder 3-AT (Fig. 13a) und den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Tumor- zelllinie STHE-83/20 nach deren Transfektion mit Kontroll-siRNA K4 und den für Katalase spezifischen siRNAs CAT-1 und CAT-2 in An- und Abwesenheit von SNP oder SNP und SOD,
Fig. 14 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Zelllinie STHE-83/20 in isolierter Kultur nach deren Behandlung mit der Kontroll-siRNA K4 und der spezifischen siRNA CAT-1 in An- und Abwesenheit des Glutathionsynthetase-Inhibitors L- Buthioninsulfoximin (BSO) ,
Fig. 15 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Tumorzelllinie L-929 in isolierter Kultur ohne Zusätze und unter Zusatz von BSO, Mercapto- succinat (MSA) , 3-AT, 3-AT und BSO oder 3-AT und MSA,
Fig. 16 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Mamakarzinomzelllinie CAL-51 nach 44 Stunden in Gegenwart unterschiedlicher 3-AT- Konzentrationen,
Fig. 17 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Mamakarzinomzeillinien CAL-51 (Fig. 17a), HCC 1937 (Fig. 17b) und MCF-7 (Fig. 17c), Fig. 18 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP 134 mit und ohne Zusatz von 3-AT,
Fig. 19 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Ovarialkarzinomzelllinie BG-1,
Fig. 20 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Zervixkarzinomzelllinie SIHA, Mamakarzinomzeillinie CAL-51 und Ovarialcarcinomzelllinie FU-OV-1,
Fig. 21 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Melanomzelllinie IPC 298 mit und ohne Zusatz von 3-AT,
Fig. 22 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP 134 mit und ohne Hemmung der Katalase-Expression durch spezifische siRNAs,
Fig. 23 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP 134 in Abhän- gigkeit von der Zeit in Gegenwart verschiedener Zusätze,
Fig. 24 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der transformierten Hamsterzelllinie STHE und der daraus entstandenen Tumorzelllinie STHE-83/20 in Abhängigkeit von der Konzentration des NO-Donors SNP,
Fig. 25 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der transformierten Hamsterzelllinie STHE und der daraus entstandenen Tumorzelllinie STHE-83/20 in Abhängigkeit von der Konzentration des NO-Donors SNP mit und ohne Zusatz von 3-AT,
Fig. 26 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Tumorzelllinie SIHA in Abhängigkeit von der Konzentration des NO-Donors SNP in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von 3-AT,
Fig. 27 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Tumorzelllinie SIHA in Gegenwart verschiedener Inhibitoren,
Fig. 28 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der Zelllinie 208 F src3-Zellen nach Zugabe von Peroxynitrit oder eines NO-Donors in Abhängigkeit von der zugesetzten Menge an Katalase,
Fig. 29a ,b die Aktivität von Katalase in Abhängigkeit von der eingesetzten H202-Konzentration und der eingesetzten Peroxinitrit-Konzentration,
Fig. 30 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der primären embryonalen Hamsterfibroblastenzellen HE und der Zelllinien STHE und STHE-83/20 mit und ohne Zusatz von 3-AT,
Fig. 31 den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen der nicht transformierten Zelllinie 208 F und der Tumorzelllinie L-929 mit und ohne Zusatz von 3- AT und
Fig. 32 eine Übersicht über die durch reaktive Sauerstoffspezies vermittelten Signalwege an einer Tumorzelle und deren spezifischer Hemmung durch Katalase .
Die dargestellten Experimente wurden mit folgenden Zellen bzw. Zellen der folgenden Zelllinien durchgeführt:
Transformierte embryonale Hamsterzelllinien:
STHE (1, 2), STHE-C3-Ha-ras (3, 5), STHE-C3-p53175 (3), STHE- C3-bcl-2 (3) und HE-wtSV40 (3, 4) .
Von den transformierten embryonalen Hamsterzelllinien durch Inoculation in Hamster jeweils abgeleitete Tumorzelllinien:
STHE-83/20 (1, 2), 2sc-STHE-Ha-ras (3, 5), 2sc-STHE-p53175 (3), 4sc-STHE-bcl-2 (3) und 2sc-HE-wtSV40 (3, 4).
Die Angaben in Klammern bezeichnen jeweils die Ziffer der Veröffentlichung der Literaturliste, in der die jeweilige Zelllinie beschrieben ist. Zellen der Zelllinie STHE sind unter der Nummer DSM ACC2609 und Zellen der Zelllinie STHE- 83/20 unter Nummer DSM ACC2610 bei der DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Deutschland (DSMZ) hinterlegt.
RAW 264.7: Murine Makrophagen-Zelllinie, Nummer bei der American Type Culture Collection (ATCC) , P.O. Box 1549, Manas- sas, VA 20108, USA: TIB-71. Die Zellen werden hier als RAW bezeichnet.
DAUDI: Humane Burkittlymphom-Zelllinie, Nummer bei der ATCC: CCL-213;
HL-60: Humane Promyelozyten-Zelllinie, Nummer bei der ATCC: CCL-240. EJ: Humane Blasenkarzenom-Zelllinie; Die Zellen werden auch als T24 bezeichnet; Nummer bei der ATCC: HTB-4.
L-929: Murine Fibrosarkom-Zelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 2
208 F: Rattenfibroblasten, nicht transformiert, beschrieben in Beck E, Schäfer R und Bauer G, Exp . Cell Res. 234, Seiten 47-56, 1997, hinterlegt bei der DSMZ unter der Nummer DSM ACC2608.
HE: Embryonale Fibroblasten des Syrischen Hamsters. Die Zellen sind nicht transformiert und weisen eine begrenzte Zahl möglicher Zellteilungen auf (intakte Seneszenzkontrolle; früher als "nicht immortalisiert" bezeichnet) . Die Gewinnung dieser Zellen aus Hamsterembryonen wird in den Veröffentlichungen 1 und 2 der Literaturliste beschrieben.
208 F src3: Rattenfibroblastenzellinie, die durch Transformation von 208 F-Zellen mit dem src-Onkogen entstanden ist, beschrieben in Beck E, Schäfer R und Bauer G, Exp. Cell Res. 234, Seiten 47-56, 1997.
FLO-B und zH: B-Zelllinien, jeweils hergestellt aus B-Zellen aus peripherem Blut gesunder Spender durch Transformation mit dem Epstein-Barr-Virus . Durch die Transformation ist eine Im- mortalisierung der Zellen erreicht worden.
CAL-51: humane Mammakarzinomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 302.
HCC-1937: humane Mammakarzinomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 513. MCF-7 : humane Mammakarzinomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 115.
SISO: humane Zervixkarzinomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 327.
SIHA: humane Zervixkarzinomzelllinie; Nummer bei der ATCC: ATCC HTB-35
Fu-OV-1: humane Ovarialkarzinomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 444.
BG-1: humane Ovarialkarzinomzelllinie, beschrieben in Stopper, H, Schmitt, E, Gregor, C, Mueller, SO, Fischer, W. , Mutagenesis, 18: 243-247, 2003.
IPC 298: humane Melanomzelllinie; Nummer bei der DSMZ: ACC 251.
CHP 134: humane Neuroblastomzelllinie; beschrieben in Fulda, S, Honer, M, Menke-Moellers, I and Berthold, F. European Journal of Cancer, 314: 616-621, 1995.
Alle im Folgenden dargestellten Experimenten mit Zellen der Zelllinien DAUDI, RAW 264.7, FLO-B, zH und HL-60 wurden in
RPMI mit 10 % FKS als Zellkulturmedium durchgeführt. Alle im Folgenden dargestellten weiteren Experimente wurden in Eagles MEM mit 5 % fötalem Kälberserum (FKS) als Zellkulturmedium durchgeführt. Wenn nicht anders angegeben enthielt das Zell- kulturmedium 40 U/ml Penicillin, 50 μg/ml Streptomycin, 10 μg/ml Neomycin und 10 U/ml Nystatin (Reg. Nr. 48 453, ICN Pharmaceuticals, Bolongarostrasse 82-84, 65929 Frankfurt, Deutschland) . Die Kultur der Zellen erfolgte jeweils im gleichen Zellkulturmedium in Zellkulturschalen oder Zellkultur- platten. Eine Ausnahme davon bildet die Kultur von Zellen der Zelllinie HCC 1937. Diese wurden in Dulbecco s MEM mit 10 % FKS statt EagleNs MEM mit 5 % FKS kultiviert, aber in den Experimenten in Gegenwart von Eagle's MEM mit 5 % FKS untersucht. Eagle's MEM (Katalog-Nr. T031-50), Dulbecco"s MEM (Katalog-Nr. FG 0435), RPMI (Katalog-Nr. T121-50) und FKS (Katalog-Nr. S0115, Lot Nr. 961 EE) sind von der Firma Biochrom AG, Leonorenstrasse 2-6, 12247 Berlin, Deutschland bezogen worden. Konzentrationsangaben bezeichnen jeweils die Endkonzentration im jeweiligen Versuchsansatz.
Bei den Versuchen sind die folgenden Zusätze jeweils in den angegebenen Endkonzentrationen eingesetzt worden, sofern nichts anderes angegeben ist:
Natriumnitroprussid (SNP): 0,25 mmol/1
Superoxiddis utase (SOD) : 100 U/ml
3-Aminotriazol ("3-AT" oder "AT") : 25 mmol/1
TGF-beta (TGF-BETA) : 20 ng/ l
L-Buthioninsulfoximin (BSO) : 100 μmol/1
SNP (Katalog-Nr. S0501) , SOD (Katalog-Nr. S2515) , 3-AT (Katalog-Nr. A8056, BSO (Katalog-Nr. B2515), AEBSF (4-2- Aminoethylbenzenesulfonylfluroridhydrochlorid, Katalog-Nr. A 8456), Taurine (Katalog-Nr. T-0625) , Mannitol (Katalog-Nr. M 9546), L-NAME (Katalog-Nr. N-5751) , DMTU (Aldrich Katalog-Nr. D18, 870-1), SperminNONOat (Katalog-Nr. S-150) und Terephthalat (Aldrich Nr. 18,536-1) wurden von der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Eschenstrasse 5, 82024 Taufkirchen, Deutschland bezogen. AEBSF hemmt die NADH-Oxidase, Taurin ist ein HOC1- Fänger, Mannitol, Terephthalat und DMTU sind Hydroxylradikal- fänger, L-NAME ist ein genereller Inhibitor von NO- Synthetasen und SperminNONOate generiert bei seinem Zerfall NO.
Apocynin (Katalog-Nr. 178385), MnTM-2PyP (Katalog-Nr.
475873), MnTE-2-PyP (Katalog-Nr. 475871), MnTBAP (Katalog-Nr. 475870), FeTPPs (Katalog-Nr. 341492), Peroxynitrit (Katalog- Nr. 516620) und FeTMPyP (Katalog-Nr. 341501) wurden von Cal- biochem, Merck Biosciences Ltd., European Distribution Cen- tre, Padge Road, Beeston/Nottingham, N69 2JR, Großbritannien bezogen. Apocynin blockiert die NADPH-Oxidase, MnTM-2PyP , MnTE-2-PyP und MnTBAP stellen SOD-Mimetika, also Superoxida- nionenfänger dar. FeTPPS und FeTMPyP sind als potente Peroxy- nitritfänger („peroxynitrite decomposition catalysts" ) be- kannt .
ABH (Aminobenzoylghydrazid, Katalog-Nr. 10320-1000) wurde von Acros Organics, New Jersey, USA bezogen. ABH stellt einen „mechanism-based inhibitor" von Peroxidasen dar. ABH wird von Peroxidasen erst oxidiert und kann dann die Peroxidase hemmen. Dieser Zweistufenmechanismus sichert die Selektivität seiner Wirkung.
Die NO-Synthetasehemmer L-NIL (Katalog-Nr. CN-258, 7- Nitroindazol (7-NI, Katalog-Nr. CN-249) und 3-Bromo-7- Nitroindazol (3-Br-7-Ni, katalog-Nr. CNN-252) wurden von Biomol GmbH, Waidmann-Str . 35, 22769 Hamburg bezogen. 3-Br-7-Ni besitzt eine hohe Selektivität für NO-Synthetase aus neuronalen Zellen (nNOS) .
TGF-beta wurde gemäß Strauss, S. C. et al . , Int. J. Oncol. (1995) Band 7, Seiten 565-572 aus einem Extrakt humaner Thrombozyten gereinigt. SNP und SperminNONOate dienten als NO-Donor. Die Bestimmung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen erfolgte, wenn nicht anders angegeben, mittels eines Durchlicht- Phasenkontrastmikroskops nach den bekannten Apoptosekriterien Membranblebbing, Kernkondensation und Kernfragmentation.
In Fig. 1 ist das Ergebnis eines Experiments dargestellt, bei dem die Induzierbarkeit von Apoptose durch NO bei verschiedenen Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen untersucht worden ist. Die Balken stellen jeweils von links nach rechts den prozentualen Anteil apoptotischer Zellen an der Gesamtzahl der eingesetzten Zellen der folgenden Zelllinien dar: STHE, STHE-83/20, STHE-C3-Ha-ras, 2sc-STHE-Ha-ras, STHE-C3- p53175, 2sc-STHE-p53175, STHE-C3-bcl-2, 4sc-STHE-bcl-2, HE- wtSV40 und 2sc-HE-wtSV40. Die nicht ausgefüllten Balken zeigen jeweils das Ergebnis für transformierte Zellen und die schwarzen Balken jeweils das Ergebnis für die aus diesen Zellen nach Inokulation in Mäuse abgeleiteten Tumorzellen.
Es sind jeweils 4000 Zellen der angegebenen Zelllinien pro Ansatz auf einer Fläche von 2 cm2 in 1 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. Nach dem Anwachsen der Zellen sind jeweils die angegebenen Zusätze zugegeben worden.
Die Zugabe des NO-Donors Natriumnitroprussid (SNP) führt bei den transformierten Zellen zur Apoptoseinduktion. Diese ist durch Superoxiddismutase (SOD) blockierbar. Ein Grund dafür könnte sein, dass Superoxidanionen von SOD zu Hydroperoxid umgesetzt werden und damit nicht mehr zur Verfügung stehen, um mit NO zu Peroxynitrit zu reagieren. Peroxynitrit kann die Apoptose induzieren. Tumorzellen haben sich als resistent gegenüber der Wirkung des NO-Donors erwiesen. Die Tumorzellen können aber durch die Zugabe des Katalase-Inhibitors 3-AT sensitiviert werden, so dass auch hier Apoptose induziert wird. Auch die bei diesen Zellen bewirkte Apoptoseinduktion durch SNP kann durch SOD gehemmt werden. Die Befunde gleichen sich bei allen untersuchten Zellen.
Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten so genannten Focus-Tests. Auf der linken Seite der Fig. 2 sind die mit Zellen der Zelllinie STHE-C3-p53175 und auf der rechten Seite die mit Zellen der daraus gewonnenen Tumorzelllinie 2sc-STHE-p53175 erlangten Ergebnisse dargestellt. Es sind jeweils 300 Zellen der transformierten Zell- linie STHE-C3-p53175 bzw. 2sc-STHE-p53175 auf einer Fläche von 3,8 cm2 in 1,5 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. Nach dem Anwachsen der Zellen erfolgte entweder keine weitere Zugabe ("KEINE ZUGABE") oder das Einsäen von jeweils 12000 Zellen der nicht transformierten Rattenfibroblasten 208 F als Effek- torzellen. Zu den die Rattenfibroblasten 208 F enthaltenden Ansätzen ist jeweils kein weiterer Zusatz erfolgt ("208 F") oder es ist TGF-beta ("208 F + TGF-BETA" ) , 3-AT ("208 F + 3- AT") oder TGF-beta und 3-AT ("208 F + TGF-BETA + 3-AT") zugegeben worden. Nach fünf Tagen wurde jeweils das Zellkulturme- dium entfernt. Die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und für 10 Minuten bei Raumtemperatur mittels 96%igem Ethanol fixiert. Anschließend wurden die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer 5%igen frisch in destilliertem Wasser angesetzten Lösung von Giemsa's Azur-Eosin-Methylenblau- Lösung, bezogen von der Firma Merck KGaA, Frankfurter Strasse 250, D-64293 Darmstadt, Deutschland inkubiert. Nach dem Waschen der Zellen mit Leitungswasser wurden Die Zellen getrocknet. Die Zahl der Foci wurde jeweils bestimmt. Ein Fokus ist dabei jeweils eine auf Grund der Morphologie der STHE-C3- p53175- bzw. 2sc-STHE-p53175-Zellen erkennbare Kolonien von mindestens 10 dieser Zellen innerhalb einer Konfluenten- schicht der 208F-Zellen. Die Höhe der Balken repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermit- telten Werte. In Gegenwart des Überschusses der nicht transformierten Effektorzellen 208 F werden die Klone der transformierten Zellen weit gehend eliminiert, die der Tumorzellen hingegen nicht. Eine Stimulation der Effektorzellen mit TGF-beta hat einen verstärkenden Effekt auf die Elimination der transformierten Zellen, nicht jedoch auf die Tumorzellen. Die Tumorzellen verlieren ihre Resistenz, wenn der Katalase-Inhibitor 3-AT anwesend ist. Das Experiment zeigt, dass Tumorzellen im Gegensatz zu den transformierten Ausgangszellen resistent gegenüber einer durch Effektorzellen vermittelten Elimination sind und dass diese Resistenz auf der Wirkung von Katalase beruht.
Fig. 3 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Plaque-Tests . Dabei wurden auf einer Fläche von 9,6 cm2 die transformierten Zellen STHE oder die davon abgeleiteten Tumorzellen STHE-83/20 als Zellhaufen von je 1250 Zellen in 10 μl Zellkulturmedium ausgesät. Nach dem An- wachsen der Zellen auf einem kleinen Teil der Fläche wurden jeweils entweder 3 ml Zellkulturmedium ohne weitere Zellen ("KEINE EFFEKTORZELLEN") oder mit 50000 der nicht transformierten Zellen 208 F als Effektorzellen ("PLUS 208 F") zugegeben. Zu den Ansätzen ist jeweils entweder kein weiterer Zu- satz ("KEINE ZUGABE") oder TGF-beta ("TGF-BETA"), 3-AT ("3- AT") oder TGF-beta und 3-AT ("TGF-BETA + 3-AT") zugegeben worden. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde nach 3 Tagen bestimmt. Die Höhe der Balken repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Stan- dardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte.
Die linke Seite der Abbildung zeigt die Ergebnisse ohne Zusatz von Effektorzellen. Rechts ist das Ergebnis in Gegenwart der 208 F-Zellen dargestellt. Die Effektorzellen induzieren Apoptose in den transformierten Zellen, nicht aber in den Tu- morzellen. Die Tumorzellen können für die Apoptoseinduktion durch Behandlung mit 3-AT sensitiviert werden. Der Zusatz von TGF-beta verstärkt die Apoptose induzierende Wirkung der 208 F-Zellen.
Fig. 4 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuch zur autokrinen Induktion von Apoptose. Dabei sind die Tumorzellen STHE-83/20 jeweils mit und ohne 3- AT und die transformierte Zellen STHE jeweils ohne Zusätze in der jeweils angegebenen Menge auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde nach 3 Tagen bestimmt. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert + der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte. Fig. 4 zeigt, dass sich die transformierten Zellen autokrin selbst zerstören können, während die Tumorzellen vor autokriner Selbstzerstörung geschützt sind. Fig. 4 zeigt weiterhin, dass die Resistenz der Tumorzellen durch den Katalase-Inhibitor 3-AT auf- gehoben werden kann.
Bei dem in Fig. 5 dargestellten Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs sind jeweils transformierte Zellen STHE (obere Darstellung) und Tumorzellen STHE- 83/20 (untere Darstellung) in den jeweils angegebenen Mengen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. Dem Zellkulturmedium wurde entweder L- Buthioninsulfoximin (BSO), 3-AT oder BSO und 3-AT zugesetzt. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde nach 60 Stunden bestimmt. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte. Fig. 5 zeigt, dass bei transformierten Zellen nach Senkung des Glutathionspiegels durch Zugabe von BSO Apoptose autokrin bei niedrigeren als den in Fig. 4 dargestellten Zelldichten induziert wird. Bei den Tumorzellen wird erst Apoptose induziert, wenn deren Katalase durch 3-AT gehemmt wird.
Die Ergebnisse der in den Figuren 2 bis 5 dargestellten Ver- suche konnten für Zellen aller Zelllinien bestätigt werden, die in dem in Fig. 1 dargestellten Versuch untersucht worden sind. Die Daten der in den Figuren 1 bis 5 dargestellten Versuche zeigen, dass die transformierten Zellen sowohl gegen eine durch Effektorzellen vermittelte als auch gegen eine au- tokrin induzierte Selbstzerstörung sensitiv sind, während
Zellen der aus Tumoren stammenden Nachkommenzelllinien dieser transformierten Zellen regelmäßig resistent gegen eine solche Induktion der Selbstzerstörung sind. Die Resistenz beruht auf der Wirkung einer Katalase. Die Zugabe des Katalase-Inhibi- tors 3-AT führte stets zu einer Erhöhung der Sensitivität der Zellen. Sowohl die transformierten Ausgangszellen als auch die Tumorzellen besitzen Effektorfunktion.
Die Figuren 6 bis 10 zeigen jeweils die Ergebnisse von Versu- chen, bei denen Tumorzellen in einer zur Auslösung einer au- tokrinen Selbstzerstörung ausreichenden Zelldichte ausgesät worden sind. Bei den in den Figuren 6, 7 und 8 dargestellten jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchen sind die Zellen ohne siRNA, mit der unspezifischen Kontroll-siRNA K4 oder den spezifisch die Expression der Katalase hemmenden siRNAs CAT-1 oder CAT-2 mittels Lipofektion transfiziert worden.
Die für Transfektionen eingesetzten doppelsträngigen Oligori- bonukleotide weisen die folgenden, im Sequenzprotokoll mit Nr. 1 bis Nr. 6 bezeichneten, Sequenzen auf:
CAT-1: dsRNA, deren einer Strang Sl zu einem Abschnitt des humanen Katalase-Gens komplementär ist: S2: 5'- ACCUGUGAACUGUCCCUACCG -3' (Sequenz Nr. 1) Sl: 3'- UAUGGACACUUGACAGGGAUGGC -5' (Sequenz Nr. 2)
CAT-2: dsRNA, deren einer Strang Sl zu einem weiteren Ab- schnitt des humanen Katalase-Gens komplementär ist:
S2: 5'- AACAUUGCCGGCCACCUGAAG -3' (Sequenz Nr. 3) Sl: 3'- UCUUGUAACGGCCGGUGGACUUC -5' (Sequenz Nr. 4)
K4 : als Kontrolle dienende dsRNA, deren einer Strang Sl zu einer Sequenz der 5 Λ-untranslatιerten Region des bakteriellen Neomycm-Resistenzgens (Accession Number m der Datenbank GenBank: U55763) komplementär ist:
S2: 5'-GAUGAGGAUCGUUUCGCAUGA-3' (Sequenz Nr. 5) Sl: 3'-UCCUACUCCUAGCAAAGCGUACU-5' (Sequenz Nr. 6)
Die RNA-Emzelstrange wurden mit einem RNA-Synthesizer (Typ Expedite 8909, Applied Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) und herkömmlichen chemischen Verfahren synthetisiert. Anschließend erfolgte die Reinigung der rohen Syntheseprodukte mit Hilfe der HPLC. Als Säulen wurden NucleoPac PA-100, 9x250 mm der Fa. Dionex, verwendet. Als Niedersalz-Puffer diente 20 mmol/1 Tπs, 10 mmol/1 NaClθ4, pH 6,8, 10% Acetonitril und als Hochsalz-Puffer 20 mmol/1 Tris, 400 mmol/1 NaC104, pH
6,8, 10% Acetonitril. Der Fluss betrug 3 ml/Minute. Die Hy- bridisierung der Einzelstrange {j e 10 μmol/1) zum Doppelstrang erfolgte durch Erhitzen des stochiometrischen Gemischs der Einzelstrange auf 95 °C für 5 Minuten m 25 mmol/1 Tris- HCl, pH 7,5, 100 mmol/1 NaCl und anschließendes Abkühlen über 30 Minuten auf 37 °C.
Bei den Versuchen zu den in den Figuren 6 und 7 dargestellten Versuchsergebnissen sind die siRNAs wie folgt in die Zellen eingebracht worden: Die siRNAs lagen m einer Stammlosung m einer Konzentration von 20 μmol/1 vor. Die Lipofektion erfolgte mittels "Lipofectamin 2000" der Firma Invitrogen gemäß Herstellerangaben. Dazu wurden 100000 Zellen auf einer Fläche von 9,6 cm2 in 3 ml Zellkulturmedium eingesät. Nach 24 Stun- den wurde das Zellkulturmedium abgenommen und durch 1,2 ml
Antibiotika-freies Zellkulturmedium ersetzt. Jeweils 6 μl der jeweiligen siRNA-Stammlösung wurden in 150 μl Opti-MEM, Gib- co, bezogen von der Firma Invitrogen GmbH, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether Strasse 10, 76131 Karlsruhe, Deutsch- land (Katalog-Nr. 31985-062, Lot Nr. 1150028), gegeben. Parallel wurden 3 μl Lipofectamin 2000 in 150 μl Opti-MEM gegeben und unter sanftem Schütteln für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die jeweilige siRNA-Lösung und die Lipofec- taminlösung wurden vereinigt und für 20 Minuten bei Raumtem- peratur inkubiert. Dann wurde die Mischung zu den Zellen gegeben und mit den Zellen im Brutschrank bei 37° C inkubiert. Die Endkonzentration an siRNA betrug dabei 80 nmol/1. Nach 24 Stunden wurden die Zellen trypsiniert und jeweils 25000 Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Medium eingesät. Zu den Ansätzen wurde jeweils entweder kein Zusatz ("KEINE
ZUGABE") oder TGF-beta ("TGF-BETA"), 3-AT ("3-AT") oder TGF- beta und 3-AT ("TGF-BETA + 3-AT") zugegeben. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde nach 3 und 4 Tagen bestimmt. Die Höhe der Balken repräsentiert jeweils den Mittelwert von Dop- pelbestimmungen. Fehlerbalken zeigen Standardabweichungen der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte.
Bei den Versuchen zu den in Fig. 8 dargestellten Versuchsergebnissen sind die siRNAs wie folgt in die Zellen eingebracht worden: 15 x 105 Zellen der murinen Makrophagen-
Leukämiezelllinie RAW sind in einer Konzentration von 5 x 105 Zellen pro ml in Opti-MEM mittels 80 nmol/1 siRNA in Lipofectamin wie für die in den Figuren 6 und 7 dargestellten Versuche beschrieben einer Lipofektion unterzogen worden. Die an- gegebenen Zelldichten wurden dann in Eagles MEM mit 5 % FKS eingestellt. Die Zellen wurden jeweils auf einer Zellkulturplatte mit einer Fläche von 2 cm2 in 1 ml Zellkulturmedium ausgesät. Die Zellen sind jeweils ohne ("ohne 3-AT") und mit ("mit 3-AT") 3-AT behandelt worden. Nach 36 Stunden wurden die Ansätze mit 1 μg/ml Bisbenzimidin gefärbt, um die Kernstruktur hervorzuheben. Zur Färbung wurde eine Lösung von 100 μg/ml Bisbenzimidin, bezogen von der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Katalog-Nr. B2261, in 100 mmol/1 Kaliumacetat, 90 mmol/1 Essigsäure mit dem Zellkulturmedium im Verhältnis 1:100 verdünnt. Die Zellen wurden damit für 30 min bei 37 °C inkubiert. Dann wurde der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen mittels eines Fluoreszenzumkehrmikroskops auf Grund von Kernkondensation und/oder Kernfragmentierung bestimmt. Die Höhe der Balken repräsentiert jeweils den Mittelwert von DoppelbeStimmungen.
Fig. 6 zeigt das mit Zellen der murinen Fibrosarkomzelllinie L-929 und Fig. 7 das mit Zellen der humanen Blasenkarzinom- zelllinie EJ jeweils nach drei Tagen (obere Darstellung, "TAG 3") und vier Tagen (untere Darstellung, "TAG 4") erzielte Ergebnis. Fig. 8 zeigt das mit Zellen der murinen Makrophagen- Leukämiezelllinie RAW bei einer Zelldichte von 1,25 x 105 Zellen/ml (obere Darstellung) und 5 x 105 Zellen/ml (untere Darstellung) jeweils nach 36 Stunden erzielte Ergebnis. Die in den Figuren 6 bis 8 dargestellten Versuche zeigen, dass
Tumorzellen, bei denen die Expression der Katalase durch siRNA gehemmt worden ist, für die autokrine Selbstzerstörung sensitiviert werden. Die Kontroll-siRNA K4 hatte jeweils keine derartige Wirkung. Die siRNAs CAT-1 und CAT-2 waren in den verschiedenen Zellsystemen unterschiedlich aktiv. Die Wirkung der Hemmung der Katalaseexpression durch RNA-Interferenz mittels der siRNAs CAT-1 und CAT-2 war analog zur Wirkung des Katalase-Inhibitors 3-AT. Fig. 9 zeigt das Ergebnis eines Versuchs zur autokrinen Selbstzerstörung von Zellen der murinen Makrophagen-Leukämie- zelllinie RAW und von Zellen der humanen Promyelozytenzellli- nie HL-60 in An- und Abwesenheit von 3-AT. Die angegeben Zelldichten wurden in Eagles MEM mit 5% FKS eingestellt. Die Zellen wurden jeweils auf einer Zellkulturplatte mit einer Fläche von 2 cm2 in 1 ml Zellkulturmedium ausgesät. Nach 48 Stunden wurden die Ansätze mit 1 μg/ml Bisbenzimidin wie oben angegeben gefärbt. Der prozentuale Anteil apoptotischer Zel- len wurde mittels eines Fluoreszenzumkehrmikroskops auf Grund von Kernkondensation und/oder Kernfragmentierung bestimmt. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert von Doppelbestimmungen.
Fig. 10 zeigt das Ergebnis eines Versuchs zur autokrinen
Selbstzerstörung von Zellen der Leukämie-/Lymphomzelllinie DAUDI und von Zellen der nicht malignen humanen B-Zelllinien FLO-B und zH jeweils in An- und Abwesenheit von 3-AT. Die angegeben Zelldichten wurden in Eagles MEM mit 5 % FKS einge- stellt. Die Zellen wurden jeweils auf einer Zellkulturplatte mit einer Fläche von 2 cm2 in 1 ml Zellkulturmedium ausgesät. Nach 48 Stunden wurden die Ansätze mit 1 μg/ml Bisbenzimidin wie oben angegeben gefärbt. Der prozentuale Anteil apoptotischer Zellen wurde mittels eines Fluoreszenzumkehrmikroskops auf Grund von Kernkondensation und/oder Kernfragmentierung bestimmt. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert von Doppelbestimmungen.
Die in den Figuren 9 und 10 dargestellten Versuchsergebnisse zeigen, dass zwar die Leukämie- und Lymphomzellen, nicht aber die nicht malignen lymphatischen Zellen durch Inhibition der Katalase für eine autokrine Induktion der Apoptose sensiti- viert werden. Die Figuren 11 und 12 zeigen das Ergebnis von Versuchen zur Induktion von Apoptose in Tumorzellen durch die Effektorzellen 208 F.
Bei den Versuchen zu den in Fig. 11 dargestellten Versuchsergebnissen sind zunächst 50000 208 F Zellen als Effektorzellen in 3 ml Medium auf einer Fläche von 9,6 cm2 ausgesät und in Gegenwart von TGF-beta für 2 Tage bei 37 °C inkubiert worden. Anschließend wurde das Zellkulturmedium abgenommen, die An- Sätze gewaschen und neues Zellkulturmedium ohne TGF-beta zugegeben. Zellen der Fibrosarkomzelllinie L-929 sind mit den siRNAs CAT-1 oder K4 in einer Endkonzentration von 80 nmol/1 wie bei dem in Fig. 6 dargestellten Versuch durch Lipofektion behandelt worden. 18 Stunden nach der Lipofektion sind die L- 929-Zellen für 6 Stunden ohne und mit 3-AT inkubiert worden. Die Behandlung mit 3-AT erfolgte, um an den Zellen vorhandene Katalase zu inaktivieren, welche noch aus der Zeit vor der Hemmung der Expression der Katalase durch siRNA stammte. Anschließend wurden die L-929-Zellen gewaschen und jeweils 50000 dieser Zellen pro Ansatz auf die morphologisch klar von den L-929-Zellen unterscheidbaren 208 F-Zellen mit und ohne 40 μmol/1 des Katalasemimetikums EUK-8, welches durch 3-AT nicht inaktiviert wird, ausgesät. EUK-8 wurde von der Firma Calbiochem, Merck Biosciences Ltd., European Distribution Centre, Padge Road, Beeston/Nottingham, N69 2JR, Großbritannien, Katalognummer 341209-25MG bezogen. Der Prozentsatz apoptotischer L-929-Zellen wurde nach 5 Tagen mittels eines Durchlicht-Phasenkontrastmikroskops bestimmt. Die Höhe der Balken repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte.
Fig. 11 zeigt, dass die Lipofektion mit CAT-1 zur Induzier- barkeit von Apoptose führt, die durch die Vorbehandlung mit 3-AT nicht mehr wesentlich verstärkt wird. Die sensitivieren- de Wirkung der siRNA CAT-1 wird durch EUK-8 wieder aufgehoben. Das belegt, dass es sich bei dem Effekt von CAT-1 um eine Hemmung der Wirkung der Katalase handelt.
Der obere Teil der Fig. 12 zeigt Ergebnisse von jeweils in
Doppelansätzen durchgeführten Versuchen mit Zellen der transformierten Zelllinie STHE und der untere Teil der Fig. 12 von Versuchen mit Zellen der Tumorzelllinie STHE-83/20. Die Zellen sind jeweils nicht oder mit den siRNAs CAT-1 oder K4 in einer Endkonzentration von 80 nmol/1 durch Lipofektion wie bei dem in Fig. 6 dargestellten Versuch behandelt worden. 24 Stunden nach der Lipofektion wurden die Zellen in einem Test auf Focusbildung, wie er bei dem in Fig. 2 dargestellten Versuch beschrieben ist, in einer Kokultur mit den Effektorzel- len 208 F eingesetzt. Als Kontrolle wurde die Koloniebildung der Zellen in Abwesenheit von Effektorzellen gemessen ("KEINE ZUGABE") . Die Zahl der Foci ist 5 Tage nach der Aussaat der Zellen bestimmt worden. Die Höhe der Balken repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken darge- stellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte.
Die Transfektion mit siRNA hatte auf die Focusbildung in Abwesenheit von Effektorzellen keinen Einfluss. Die Kokultur mit einem Überschuss nicht transformierter 208 F-Zellen reduzierte die Zahl der auswachsenden Foci der STHE-Zellen deutlich. Das zeigt, dass diese Zellen von den Effektorzellen eliminiert werden können. Die Elimination war fast vollständig, wenn zusätzlich TGF-beta zur Stimulation der Effektor- zellen anwesend war. Die Wirkung der 208 F-Zellen auf die
STHE-Zellen konnte durch Transfektion mit der siRNA CAT-1 gesteigert werden. Im Gegensatz zu STHE-Zellen waren die Zellen der davon abgeleiteten Tumorzelllinie STHE-83/20 in An- und Abwesenheit von TGF-beta resistent gegenüber der Elimination durch die Effektorzellen. Bei Anwesenheit von Effektorzellen zeigte sich Focusbildung im gleichen Ausmaß wie beim Kontrollversuch ohne Effektorzellen. Die Focusbildung ging aber drastisch zurück, wenn die Wirkung der Katalase durch 3-AT gehemmt wurde. Entsprechend führte auch die Hemmung der Ex- pression der Katalase durch Transfektion mit der siRNA CAT-1, nicht aber die Transfektion mit der siRNA K4, zu einer Elimination der Tumorzellen. Das zeigt, dass die Resistenz der Tumorzellen gegenüber Apoptoseinduktion durch benachbarte Effektorzellen aufgehoben werden kann, wenn die Katalase entwe- der gehemmt oder ihre Expression durch spezifische siRNA unterbunden wird.
Die Figuren 13a und 13b zeigen das Ergebnis von jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchen mit Zellen der trans- formierten Zelllinie STHE und der Tumorzelllinie STHE-83/20 in An- und Abwesenheit des NO-Donors SNP. Der in Fig. 13 a dargestellte Versuch ist wie der in Fig. 1 dargestellte Versuch durchgeführt worden.
Fig. 13a zeigt, dass Zellen der transformierten Zelllinie
STHE sensitiv für eine Apoptoseinduktion durch den NO-Donor SNP sind, während die Zellen der Tumorzelllinie STHE-83/20 resistent gegenüber einer solchen Apoptoseinduktion sind. Die Wirkung des NO-Donors in den transformierten Zellen wird durch SOD aufgehoben. Das zeigt, dass die Interaktion von NO mit Superoxidanionen unter Bildung von Peroxynitrit für die NO-vermittelte Apoptoseinduktion erforderlich ist. SOD katalysiert die Bildung von H02 aus Superoxidanionen, so dass die Superoxidanionen nicht mehr mit NO reagieren können. Der Zusatz von 3-AT führt auch hier zu einer Sensitivierung der
Tumorzellen gegenüber der NO-vermittelten Induktion der Apoptose .
Fig. 13b zeigt den Anteil apoptotischer Tumorzellen STHE- 83/20 nach Induktion der Apoptose mittels SNP bei Zellen, welche wie bei dem in Fig. 6 dargestellten Versuch mit der Kontroll-siRNA K4 oder den spezifischen siRNAs CAT-1 oder CAT-2 in einer Endkonzentration von jeweils 80 nmol/1 durch Lipofektion transfiziert worden sind. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsiniert. Mit diesen Zellen ist der gleiche Versuch wie der in Fig. 13a dargestellte durchgeführt worden. Es zeigt sich, dass die Transfektion mit CAT-1 oder CAT-2, nicht aber mit K4, zur Sensitivierung der Tumorzelle führte. Die Katalase-spezifischen siRNAs haben al- so die gleiche Wirkung wie der Katalase-Inhibitor 3-AT.
Die in den Figuren 13a und 13b dargestellten Versuche zeigen, dass sich Tumorzellen mit Hilfe ihrer Katalase gegen eine NO- vermittelte Induktion der Apoptose schützen können. Der Schutz kann durch die Hemmung der Katalase oder Verhinderung ihrer Expression aufgehoben und die Sensitivität der Zellen gegenüber NO-vermittelter Apoptose dadurch gesteigert werden.
Bei dem in Fig. 14 dargestellten Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs ist der prozentuale
Anteil apoptotischer Zellen der Zelllinie STHE-83/20 nach der Lipofektion mit den siRNAs K4 und CAT-1 gezeigt. Die Lipofektion erfolgte jeweils wie bei dem in Fig. 6 dargestellten Versuch, jedoch mit siRNA in variabler jeweils angegebener Endkonzentration. 24 Stunden nach der Lipofektion wurden jeweils 10000 Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Zellkulturmedium eingesät. Anschließend wurde entweder kein BSO oder BSO in der Endkonzentration von 100 μmol/1 zugegeben. BSO hemmt die Glutathionsynthetase und bewirkt dadurch eine Senkung des intrazellulären Glutathionspiegels. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde nach 52 Stunden bestimmt. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert + der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte. Die Induktion der Apoptose erfolgte hier durch von den STHE- 83/20-Zellen selbst sezernierte zelluläre Effektoren. Glutathion schützt die Zellen normalerweise gegenüber einer Apoptoseinduktion durch Hydroxylradikaie, welche durch eine Metall-katalysierte Haber-Weiss-Rekation entstehen können. Aus Fig. 14 geht hervor, dass die Tumorzellen durch die Transfektion mit der siRNA CAT-1, nicht aber mit der siRNA K4 ihre Resistenz gegenüber Apoptoseinduktion durch eine Metallkatalysierte Haber-Weiss-Reaktion verlieren. Das Experiment zeigt außerdem die Abhängigkeit des Effekts von der Konzentration der eingesetzten siRNA.
Fig. 15 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in L-929 Zellen. Zu jeweils 25000 L-929-Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Medium wurden wie angegeben keine Zusätze ("KEINE ZUGABE") oder 50 μmol/1 BSO ("BSO"), 50 μmol/1 Mercaptosuccinat ( "MERCAPTOSUCCINAT" ) , 25 mmol/1 3-AT ("3- AT"), 25 mmol/1 3-AT und 50 μmol/1 BSO ("3-AT + BSO") oder 25 mmol/1 3-AT und 50 μmol/1 Mercaptosuccinat ("3-AT +
MERCAPTOSUCCINAT") zugegeben. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde jeweils nach den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert + der in Form von Fehlerbalken dargestellten Stan- dardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte.
Fig. 15 zeigt, dass die Wirkung von 3-AT noch verstärkt wird, wenn der intrazelluläre Glutathionspiegel durch BSO gesenkt oder die Wirkung der Glutathionperoxidase durch Mercapto- succinat gehemmt wird.
Fig. 16 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in
Zellen der humanen Mammacarcinomzelllinie CAL-51. Zu jeweils 5000 bzw. 25000 CAL-51-Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Medium wurden bei der Einsaat 20 ng/ml TGF-beta-1 ("5 000 + TGF-beta", "25 000 + TGF-beta") oder kein TGF-beta ("5 000", "25 000") zugesetzt. Zusätzlich wurde AT in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Nach 44 Stunden erfolgte die Bestimmung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte.
Fig. 16 zeigt, dass die humanen Tumorzellen zelldichteabhän- gig und abhängig von der Hemmung der Katalase in Apoptose gehen. Die Zelldichteabhängigkeit zeigt die interzelluläre Signalwirkung. Zellen von mehr als 50 hier nicht dargestellten humanen Tumorzelllinien zeigen ein analoges Verhalten.
Fig. 17 zeigt in drei Feldern jeweils das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in Zellen der humanen Mammacarcinom- zelllinien CAL-51 (A. , oberes Feld), HCC 1937 (B., mittlers Feld) und MCF-7 (C, unteres Feld). Zu jeweils 25000 der genannten Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Medium wurden 20 ng/ml TGF-beta und bei den CAL-51- und MCF-7-Zellen 50 mmol/1 3-AT und bei den HCC 1937-Zellen 100 mmol/1 3-AT zugesetzt. Weiterhin wurden wie angegeben keine Zusätze ("OHNE INHIBITOR") oder die Hemmstoffe der NADPH-Oxidase Apopcynin (50 μg/ml, "APO") und AEBSF (100 μmol/1) zur Verhinderung der Superoxidanionensynthese, die Superoxidanionen- fänger SOD (100 U / ml) und MnTM-2PyP (40 μmol/1) , der Pero- xidasehemmer Aminobenzoylhydrazid (100 μM, "ABH"), der HOC1- Fänger Taurin (50 mM, "TAU"), der Hyxdroxylradikalfänger Mannitol (10 mM, "MANN"), die NO-Synthetasehemmer L-NAME (2,4 mmol/1), L-NIL (0,5 mmol/1) und 7-Nitroindazol (0,5 mM, "7- NI") und der Peroxynitritfänger FeTPPS (40 μmol/1) zugesetzt. Die weiteren Kontrollen (Nitrit ("NIT"), Nitrit plus SOD, Nitrit plus TAU, FeC12) sind in diesem Zusammenhang ohne Relevanz. Die Zahl apoptotischer Zellen wurde jeweils 36 Stunden (bei CAL-51-Zellen) , 30 Stunden (bei HCC 1937-Zellen) und 46 Stunden (bei MCF-7-Zellen) nach der Aussaat der Zellen bestimmt. Kontrollen ohne 3-AT führten lediglich zu einem Back- ground von weniger als 2 Prozent apoptotischer Zellen und sind nicht dargestellt.
Fig. 17 zeigt, dass die Zellen der drei untersuchten Mamma- carcinomzelllinien nach Hemmung der Katalase in Apoptose gehen, wobei der HOCl-Weg keine Rolle spielt. Die Apoptoseinduktion beruht vielmehr auf der Bildung von NO und dessen Reaktion mit Superoxidanionen, die zur Bildung von Peroxynitrit führt.
Fig. 18 zeigt in zwei Feldern jeweils das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in Zellen der humanen Neuroblastomzell- linie CHP 134. Das Experiment wurde analog zu dem in Fig. 17 dargestellten Experiment durchgeführt, wobei die Zelldichte 12500 Zellen pro Ansatz und das Reaktionsvolumen 400 μl betrug. Die Versuchsansätze erhielten entweder kein 3-AT (B., "OHNE 3-AT") oder 50 mmol/1 3-AT (A. , "Plus 3-AT"). Zusätz- lieh zu den Hemmstoffen, welche in dem in Fig. 17 dargestellten Experiment eingesetzt wurden, wurden zwei weitere Supero- xidanionenfänger (MnTE-2PYP und MnTBAP, jeweils 40 μmol/1) , zwei weitere Hydroxylradikalfänger (Terephthalat, 400μmol/l, DMTU, 10 mmol/1) und der für die NO-Synthetase in neuronalen Zellen (nNOS) spezifische Hemmstoff 3-Br-7-Nitroindazol (10 μmol/1, "3-Br-7-NI") eingesetzt. Fig. 18 zeigt, dass die Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP 134 nach Katalasehemmung in die Apoptose gehen. Der HOCl-Weg hat dabei offensichtlich keine Bedeutung, weil keine Hemmung durch die Hemmung der Peroxidase, das Wegfangen von HOCl und das Wegfangen von Hydroxylradikalen eintritt. Statt dessen findet die Induktion der Apoptose offensichtlich über den NO / Peroxynitrit-Weg statt. Der NO / Peroxynitrit-Weg beruht auf der Interaktion von NO mit Superoxidanionen mit nachfolgender Bildung von Peroxynitrit.
Fig. 19 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in Zellen der humanen Ovarialcarcinomzelllinie BG-1. Das Experiment wurde analog dem in Fig. 17 dargestellten Experiment durchgeführt. Die Zahl apoptotischer Zellen wurde 23,5 Stunden nach der Aussaat der Zellen bestimmt. Das Experiment zeigt, dass die Zellen der Ovarialcarcinomzelllinie in Gegenwart von TGF-beta und 3-AT (50 mmol/1) in die Apoptose gehen. Die Induktion der Apoptose kann durch den HOCl-Fänger Taurin nicht gehemmt werden. Die Induktion der Apoptose kann aber gehemmt werden, wenn der NO / Peroxynitrit-Weg unterbrochen wird.
Fig. 20 zeigt in drei Feldern jeweils das Ergebnis eines je- weils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in Zellen der humanen Zervixcarcinom- zelllinie SIHA (oberes Feld) , der humanen Mammacarcinomzell- linie CAL-51 (mittleres Feld) und der humanen Ovarialcarcinomzelllinie FU-OV-1 (unteres Feld) . Das Experiment wurde analog dem in Fig. 17 dargestellten Experiment durchgeführt. Ohne Zugabe von 3-AT erfolgte keine Apoptoseinduktion (nicht gezeigt) . In sämtlichen dargestellten Ansätzen wurde die Katalase durch 50 mmol/1 3-AT gehemmt. Die Zahl apoptotischer Zellen wurde jeweils 36 Stunden nach der Aussaat der Zellen bestimmt. Das Versuchsergebnis zeigt, dass nach Hemmung der Katalase in allen drei Zelllinien Apoptose induziert wird. Bei den Zellen der Zervixcarcinomzelllinie SIHA erfolgt die Induktion der Apoptose über den HOCl-Weg und bei den Zellen der beiden anderen Zelllinien über den NO / Peroxynitrit-Weg.
Fig. 21 zeigt in zwei Feldern jeweils das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokri- nen Apoptoseinduktion in Zellen der humanen Melanomzelllinie IPC 298. Das Experiment wurde analog zu dem in Fig. 18 dargestellten Experiment durchgeführt. Die Versuchsansätze erhielten entweder kein 3-AT (unteres Feld) oder 50 mmol/1 3-AT (oberes Feld) . Das Ergebnis zeigt, dass die Zellen der Me- lanomzelllinie IPC 298 in die Apoptose gehen, wenn ihre Katalase gehemmt wird. Dabei spielen der HOCl-Weg und der NO / Peroxynitrit-Weg eine etwa gleichbedeutende Rolle.
Fig. 22 zeigt ein mit Zellen der humanen Neuroblastomzellli- nie CHP 134 durch autokrine Apoptoseinduktion erzieltes Ergebnis, wobei die Expression der Katalase dieser Zellen durch Katalase-spezifische siRNA inhibiert worden ist. Die CHP 134- Zellen sind dazu wie bei dem in Fig. 6 dargestellten Experiment mit den in Fig. 22 jeweils angegebenen siRNAs transfi- ziert worden. Die Endkonzentration an siRNA betrug dabei jeweils 33 nmol/1. Die transfizierten Zellen sind in einer Dichte von 12500 Zellen pro Ansatz in einem Reaktionsvolumen von 400 μl ausgesät worden. Zu den Reaktionsansätzen sind jeweils die angegebenen Zusätze zugefügt worden. MnTM-2PyP ist dabei in einer Konzentration von 40 μmol/1, L-NAME in einer Konzentration von 2,4 mmol/1 und 3-Br-7-Ni in einer Konzentration von 10 μmol/1 eingesetzt worden. 30 Stunden nach der Aussaat ist die Zahl apoptotischer Zellen bestimmt worden. Die Abbildung zeigt, dass die Katalase-spezifischen siRNAs CAT1 und CAT2 gegenüber der Kontrolle K4 einen zum Katalaseinhibitor 3-AT analogen Effekt haben. CAT2 wirkt im humanen System stärker als CAT1. Die Wirkung von CAT2 kann durch Weg- fangen der Superoxidanionen mittels MnTM-2PyP, oder Verhinderung der NO-Synthese mittels L-NAME oder 3-Br-7-Ni wirkungsvoll gehemmt werden. Das zeigt wiederum, dass die Apoptoseinduktion über den NO / Peroxynitrit-Weg erfolgt.
Fig. 23 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion in Zellen der humanen Neuroblastomzelllinie CHP 134. Das Experiment wurde analog zu dem in Fig. 18 dargestellten Experiment durchgeführt. Die Versuchsansätze erhielten die jeweils ange- gebenen Zusätze. Die Zahl apoptotischer Zellen ist zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Aussaat der Zellen bestimmt worden. Das Ergebnis zeigt,
i) dass Apoptose in den CHP 134-Zellen induziert wird, wenn ihre Katalase durch 3-AT gehemmt wird,
ii) dass die Apoptoseinduktion nach Zusatz von 3-AT durch den nNOS-spezifischen Inhibitor 3-Br-7-NI aufgehoben wird,
iii) dass exogen zugegebenes NO (mittels des NO-Donors SNP, 0,25 mmol/1) nur Wirkung zeigt, wenn die Katalase inhibiert ist und
iv) dass die Wirkung des exogen zugegebenen NOs nach einer Hemmung der Katalase nicht durch die Hemmung der nNOS berührt wird. Die Figuren 24 und 25 zeigen das Ergebnis eines Versuchs zur NO-abhängigen Induktion von Apoptose. Dabei wurde SNP den jeweiligen Zellen in den jeweils angegebenen Konzentrationen zugesetzt. In dem in Fig. 24 dargestellten Versuch sind je- weils 2000 Zellen der transformierten Hamsterzelllinie STHE bzw. der nach Tumorbildung daraus entstandenen Tumorzelllinie STHE 83/20 ("8320") auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,4 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. In den in Fig. 25 dargestellten Versuchen sind jeweils 2000 Zellen ("STHE (2), STHE 83/20 (2)") oder 8000 Zellen ("STHE (8), STHE 83/20. (8)") der Zelllinien STHE und STHE 83/20 auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,4 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. Teilweise wurde zusätzlich 50 mmol/1 3-AT zugesetzt ("... + AT"). Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde 96 Stunden nach der Aus- saat bestimmt. Das obere Feld der Fig. 25 zeigt das mit Zellen der Zelllinie STHE und das untere Feld das mit Zellen der Zelllinie STHE 83/20 erzielte Ergebnis. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der ermittelten Werte. Fig. 24 zeigt, dass die durch das Wachstum des Tumor selektierten Zellen STHE 83/20 resistent gegen eine Induktion der Apoptose durch den NO-Donor SNP sind. Fig. 25 zeigt, dass diese Resistenz durch 3-AT aufgehoben werden kann. Das belegt, dass die Resistenz auf der Wirkung von Katalase beruht. Der Schutz von Tumorzellen vor der Wirkung von NO / Peroxynitrit durch Katalase ist neu und überraschend.
Fig. 26 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur NO-abhängigen Induktion von Apop- tose in Zellen der humanen Zervixcarcinomzelllinie SIHA. Dabei sind jeweils 5000 der Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,4 ml Zellkulturmedium ausgesät worden. SNP wurde jeweils in den angegebenen Konzentrationen zugesetzt. Es wurde entweder kein 3-AT ("SIHA OHNE 3-AT") oder 3-AT in einer Konzentration von 50 mmol/1 ("SIHA Plus 50 mM 3-AT") oder 100 mmol/1 ("SIHA Plus 100 mM 3-AT") zugesetzt. Der Prozentsatz apoptotischer Zellen wurde 24 Stunden nach der Aussaat be- stimmt. Fig. 26 zeigt, dass die SIHA-Zellen weit gehend resistent gegenüber der Auslösung von Apoptose durch den NO-Donor SNP sind, aber durch den Katalaseinhibitor 3-AT wirkungsvoll sensitiviert werden können.
Fig. 27 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur NO-abhängigen Induktion von Apoptose in Zellen der humanen Zervixcarcinomzelllinie SIHA. Das Experiment wurde analog zu dem in Fig. 26 dargestellten Experiment unter Verwendung der Inhibitoren, welche in dem in Fig. 18 dargestellten Experiment genannt sind, durchgeführt. Das Experiment belegt, dass die Apoptoseinduktion durch einen NO-Donor nur erfolgen kann, wenn die Katalase inhibiert ist. Die Apoptoseinduktion wird durch Verhinderung der Superoxida- nionensynthese (durch APO) , Wegfangen von Superoxidanionen (durch SOD, MnTM2PyP oder MnTBAP) oder Zerstören von Peroxynitrit (durch FeTPPS oder FeTMPyP) gehemmt. Das zeigt, dass bei diesen Zellen die Apoptose nicht direkt durch NO induziert werden kann und zur Induktion von Apoptose die Bildung von Peroxynitrit notwendig ist.
Fig. 28 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur Apoptoseinduktion durch Peroxynitrit in Zellen der transformierten Ratten- Fibroblastenzelllinie 208 F src3. Es wurden jeweils 25000 der Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Medium ausgesät. Peroxynitrit (PON) wurde entweder direkt zu den Zellen zugegeben (50 μmol/1) oder durch Interaktion des NO-Donors SperminNONOate (SPE, 0,5 mmol/1) mit Superoxidanionen an der Zellmembran erzeugt. Bei der Kontrolle wurde kein Peroxynitrit und kein NO-Donor zugesetzt. Zu allen Zellen wurde die jeweils angegebene Menge an Katalase zugesetzt. Im Falle des zugesetzten PON erfolgte nach 7 Stunden und im Falle des zu- gesetzten SPE nach 8,5 Stunden die Bestimmung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen. Die Position der Symbole repräsentiert jeweils den Mittelwert ± der in Form von Fehlerbalken dargestellten Standardabweichung der bei den Doppelansätzen ermittelten Werte. Das Ergebnis zeigt, dass die zugegebene Katalase die Wirkung des Peroxynitrits wirkungsvoll und konzentrationsabhängig aufhebt. Dabei ist weniger Katalase notwendig, wenn Peroxynitrit direkt zugegeben wird als bei der Bildung des Peroxynitrits direkt an der Zellmembran. Bei der Bildung des Peroxynitrits an der Zellmembran ist aus kineti- sehen Gründen eine höherer Katalasekonzentration zur vollständigen Hemmung notwendig. Insgesamt zeigt dieses Ergebnis die bisher unbekannte Fähigkeit der Katalase, die Wirkung von Peroxynitrit aufzuheben.
Die Figuren 29 a und b zeigen jeweils das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur Aktivität von Katalase in Abhängigkeit von der eingesetzten H202- Konzentration (Fig. 29 a) oder der eingesetzten Peroxynitrit- Konzentration (Fig. 29 b) . Die in den Figuren 29 a und b dar- gestellten Versuche beruhen darauf, dass die Reaktion der Katalase zweistufig abläuft. Dabei wird in einem ersten Schritt ein Wasserstoffperoxid-Molekül von der Katalase als Substrat akzeptiert und es bildet sich ein erstes Zwischenprodukt ("Compound I"), bei dem im aktiven Zentrum ein Fe=0-Komplex vorliegt. Das Zwischenprodukt kann dann in einem zweiten Schritt ein zweites Molekül Wasserstoffperoxid binden und umsetzen, wobei Sauerstoff, Wasserstoff und die Katalase freigesetzt werden. Im vorliegenden Versuch wurde ausgenutzt, dass das Zwischenprodukt auch sehr effektiv Methanol in Formaldehyd umsetzen kann. Die Reaktion des Zwischenprodukts (Compound I) mit Methanol erfolgt dabei effizienter als die Reaktion mit Wasserstoffperoxid, so dass bei gleichzeitiger Anwesenheit von Wasserstoffperoxid, Methanol und Katalase das Enzym zwar zunächst im ersten Schritt mit Wasserstoffperoxid reagiert, für den zweiten Schritt (katalysiert von Compound I) aber Methanol gegenüber Wasserstoffperoxid favorisiert.
Die Versuche wurden mittel eines kommerziell erhältlichen Kits (Cayman Catalase Assay Kit, Katalog-Nr. 707002, Cayman Chemical Company, 1180 E. Ellsworth Road, Ann Arbor, MI 48108, USA) gemäß der Herstellerangaben mit der folgenden Modifikation durchgeführt: Pro Versuchsansatz mit einem Reakti- onsvolumen von 170 μl wurden 10 Units statt der vom Hersteller als Kontrolle empfohlenen 1 Unit Katalase eingesetzt.
Eine Unit ist als die Katalasemenge definiert, die 1 nmol Formaldehyd pro Minute aus Methanol freisetzt. In dem Reakti- onsvolumen von 170 μl befinden sich neben den 10 Units Katalase 100 μl Reaktionspuffer, 30 μl Methanol und die in Fig. 29 a und b jeweils angegebene Konzentration an Wasserstoffperoxid (Fig. 29 a) oder Peroxynitrit (Figure 29 b) . Die Versuchsansätze wurden bei Raumtemperatur jeweils für 20 Minuten inkubiert. Danach erfolgte eine Zugabe von 30 μl KOH, um die Enzymreaktion zu stoppen und von 30 μl Purpal (4-Amino-3- hydrazino-5-mercapto-l, 2, 4-triazole) . Nachfolgend wurde 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Dabei reagierte Purpal mit dem bei der Enzymreaktion entstandenen Formaldehyd. Da- nach wurde das farblose Purpal durch Zugabe von 10 μl Perio- dat in eine purpurne Form überführt. Deren Extinktion wird sofort bei einer Wellenlänge von 540 nm in einem Photometer gemessen. Eine Eichkurve wird parallel dazu durch direkte Verwendung definierter Konzentrationen von Formaldehyd in Abwesenheit von Katalase in analoger Weise erstellt.
Der in Fig. 29 b dargestellte Versuch zeigt erstmals, dass nicht nur Wasserstoffperoxid, sondern auch Peroxynitrit von der Katalase als Substrat akzeptiert und in einer zweistufigen Reaktion umgesetzt wird. In dem für die Apoptoseinduktion relevanten Konzentrationsbereich von bis zu 0,25 mmol/1 bindet Peroxynitrit ebenso gut unter Bildung eines Zwischenpro- dukts an die Katalase wie Wasserstoffperoxid und bildet dabei die für die spätere Umsetzung von Methanol in Formaldehyd benötigte Enzymzwischenstufe Compound I. Bei höheren Konzentrationen erfolgt eine Inaktivierung der Katalase durch Peroxynitrit. Die Kontroll-Versuche mit PON ohne Katalase ("PON OHNE KATALASE") und PON ohne Methanol ("PON OHNE METHANOL") schließen aus, dass Purpal direkt mit Peroxynitrit in einer Farbreaktion reagiert oder dass Peroxynitrit auch ohne die Anwesenheit von Katalase aus Methanol Formaldehyd generieren kann.
Fig. 30 zeigt das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokrinen Apoptoseinduktion mit primären embryonalen Hamsterfibroblastenzellen HE, Zellen der daraus durch spontane Transformation entstandene Zelllinie STHE und Zellen der Tumorzelllinie STHE 83/20. Es wurden jeweils 12500 der Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Eagless MEM, 5 % FKS ausgesät. Alle Versuchsansätze enthielten 20 ng/ml TGF-beta und entweder kein 3-AT ("OHNE 3- AT") oder 25 mmol/1 3-AT ("PLUS 25mM 3-AT"). Nach 87 Stunden erfolgte die Bestimmung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen. Das Experiment zeigt den Unterschied zwischen den für autokrine Apoptoseinduktion insensitiven parentalen, nicht- transformierten HE-Zellen, den Zellen der sensitiven trans- formierten Zelllinie STHE und den Zellen der resistenten, aber durch 3-AT zu sensitivierenden Tumorzelllinie STHE 83/20. Kontrollexperimente (nicht dargestellt) zeigten, dass die Apoptoseinduktion in STHE- und STHE 83/20-Zellen durch zelleigene Superoxidanionen, Peroxidase, HOCl und Hydroxylra- dikale verursacht wurde. Weitere Kontrollexperimente zeigten, dass alle der in diesem Experiment untersuchten Zellen über Effektorfunktionen verfügen. Die Insensitivität der HE-Zellen beruht also nicht auf fehlender Effektorwirkung, sondern auf fehlender Superoxidanionenproduktion, wie dies für nicht transformierte Zellen typisch ist.
Fig. 31 zeigt in zwei Feldern jeweils das Ergebnis eines jeweils in Doppelansätzen durchgeführten Versuchs zur autokri- nen Apoptoseinduktion mit Zellen der nicht transformierten Zelllinie 208 F (oberes Feld) sowie Zellen der Maus- Fibrosarkomzelllinie L-929 (unteres Feld) als Positivkontrolle für die Wirkung des 3-AT. Es wurden jeweils 25000 der Zellen auf einer Fläche von 0,75 cm2 in 0,2 ml Medium ausgesät. Die Ansätze erhielten, wie in der Graphik angegeben, keine Zusätze ("Kontrolle"), oder 20 ng/ml TGF-beta ("TGF"), 25 mmol/1 3-AT ("3-AT") oder 20 ng/ml TGF-beta und 25 mmol/1 3- AT ("TGF + 3-AT") . Die Bestimmung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen erfolgte zu den aus den Grafiken jeweils er- sichtlichen Zeitpunkten. Das Experiment zeigt die Selektivität der Apoptoseinduktion für Zellen, die einen transformierten Zustand aufweisen. Das sind die transformierten Zellen und die Tumorzellen. Es zeigt weiterhin, dass die Tumorzellen weit gehend resistent gegen Apoptoseinduktion sind, dass sie aber durch 3-AT sensitiviert werden können. Die 3-AT-Wirkung ist spezifisch für die Tumorzellen, denn es erfolgt keine Sensitivierung der parentalen nicht transformierten Zellen 208 F. Ein weiteres Experiment wurde analog zu den in den Figuren 30 und 31 dargestellten Experimenten durchgeführt. Zu den Versuchsansätzen wurde entweder kein 3-AT oder 50 mmol/1 3-AT zugesetzt. Die Bestimmung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen erfolgte zwei Tage nach der Einsaat der Zellen. Es zeigte sich das folgende Ergebnis:
Zelllinie Typ Prozentsatz apoptcutischer Zellen
Kontrolle + 3-AT
CAL-51 Mammacarcinom < 2 23,7 +/- 3,6
SIHA Zervixcarcinom < 1 39,9 +/- 3,4
SISO Zervixcarcinom < 1 45,7 +/- 9,4
FU-OV-1 Ovarialcarcinom < 1 32,3 +/- 1,1
CHP 134 Neuroblastom < 4,5 41,5 +/- 2,6
Alpha-1 diploide, nicht < 0,5 0,5 transformierte humane Fibroblasten
Die in den Fig. 30 und 31 dargestellten Experimente und das obige weitere Experiment belegen, dass die Wirkung von 3-AT selektiv für Tumorzellen ist.
Fig. 32 ist eine schematische Darstellung der durch reaktive Sauerstoffspecies (ROS) vermittelten Apoptose induzierenden Signalwege an Tumorzellen und der spezifischen Hemmung dieser Signalwege durch Katalase. Fig. 32 zeigt die Wirkung von nicht transformierten Effektorzellen und die autokrine Wirkung von Tumorzellen als Effektorzellen. Beide Wirkungen beruhen auf der Freisetzung von NO und Peroxidase ("P") . Die Tumorzelle kann nur deshalb als Zielzelle fungieren, weil an ihrer Oberfläche Superoxidanionen generiert werden. Die daraus resultierenden Signalwege können durch eine membranständige Katalase unterbunden werden. Die Katalase kann sowohl Wasserstoffperoxid als auch Peroxynitrit umsetzen und dadurch die entsprechenden Signalwege unterbrechen. Die Tumorzelle schützt sich durch die Expression der Katalase vor der Auslösung von Apoptose. Dieser Schutz der Tumorzelle kann durch Hemmung der Substratumsetzung durch die Katalase aufgehoben werden. Die Substratumsetzung kann durch eine Hemmung der Ak- tivität der Katalase, durch eine Hemmung der Expression der Katalase mittels siRNA oder durch eine Hemmung der Lokalisation der Katalase auf der Zellmembran, insbesondere durch Verhinderung der Ausschleusung der Katalase aus der Zelle, gehemmt werden.
Literaturliste :
1) Deichman GI und Vendrow EL, Int. J. Cancer 37, 401-409, 1986
2) Deichman GI, Kluchareva TE, Matveeva VA, Kushlinsky NE, Bassalyk LS und Vendrow EL, Int. J. Cancer 44, 904-907, 1989
3) Deichman GI, Mateeva VA, Kaskina LM, Dyakova NA, Uvarova EN, Nikiforov MA und Gudkov AV, Int. J. Cancer 75, 277-283,
1998
4) Deichman GI, Dyakova N, Kashkina L, Matveeva V, und Uvarova E, Immunology Letters 70, 37-42, 1999
5) Deichmann GI, Kashkina LM, Mizenina OA, Gorojanskaya EG, Nififorov MA, Gudkov AV, Dyakova NA, Komelkov AV, Priluskaya MO, Kushlinsky NE und Tatosyan AG, Int. J. Cancer 66, 747- 752, 1996
6) Deichmann GI, Kashleva HA, Kluchareva TE and Matveeva VA, Int. J. Cancer 44, 908-910, 1989.
7) Deichmann GI, Seminars in Cancer Biology 431, 1-10, 2002
SEQUENZPROTOKOLL
<110> Bauer, Georg
<120> Verfahren zur spezifischen Erhöhung der Sensitivität von Tumorzel- len
<130> 443637EH
<160>
<170> Patentin version 3.1
<210> 1
<211> 21 <212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1 accugugaac ugucccuacc g 21
<210> 2
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 2 cgguagggac aguucacagg uau 23
<210> 3
<211> 21
<212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacauugccg gccaccugaa g 21
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4 cuucaggugg ccggcaaugu ucu 23
<210> 5
<211> 21 <212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Sequenz der 5 ' -untranslatierten Region des bakteriellen Neomycin- Resistenzgens (Accession Number in der Datenbank GenBank: U55763)
<400> 5 gaugaggauc guuucgcaug a 21
<210> 6
<211> 23
<212> RNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> RNA-Strang, der zu einer Sequenz der 5 '-untranslatierten Region des bakteriellen Neomycin-Resistenzgens (Accession Number in der Datenbank GenBank: U55763) komplementär ist <400> 6 ucaugcgaaa cgauccucau ccu 23

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur spezifischen Erhöhung der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber einem potenziell Apoptose oder Nekrose auslösenden zellulären Effektor in Anwesenheit anderer Zellen, welche keine Tumorzellen und keine transformierten Zellen sind, wobei die Tumorzellen und die anderen Zellen mit einem Mittel behandelt werden, welches eine Substratumsetzung durch eine Katalase der Tumorzellen verringert, wobei bei dem Verfahren keine Glucoseoxidase eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Katalase eine extrazellulär wirkende zelluläre Katalase der Tumorzellen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Effektor ein von den Tumorzellen oder den anderen Zellen sezernierter Effektor, insbesondere Peroxidase oder Stickstoffmonoxid, ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Substratumsetzung durch die Katalase mittels eines spezifischen Katalase-Inhibitors, insbesondere 3-Aminotriazol, verringert wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Substratumsetzung durch die Katalase mittels RNA-Interferenz verringert wird, insbesondere mittels einer siRNA mit einem RNA-Strang, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Katalase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Substratumsetzung durch die Katalase verringert wird, indem deren Ausschleusung aus der Tumorzelle inhibiert wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zusätzlich der intrazelluläre Glutathionspiegel in den Tumorzellen, insbesondere durch Verringerung der Wirkung von Glutathionsynthetase, bevorzugt mittels Buthioninsulfoximin, insbesondere L-Buthioninsulfoximin, oder mittels RNA- Interferenz, gesenkt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die RNA-Interferenz mittels einer siRNA bewirkt wird, welche einen RNA-Strang auf- weist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionsynthetase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zusätzlich die Wirkung intrazellulärer Glutathionperoxidase, insbesondere mittels Mercaptobernsteinsäure oder mittels RNA- Interferenz, verringert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die RNA-Interferenz mit- tels einer siRNA bewirkt wird, welche einen RNA-Strang aufweist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionperoxidase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
11. Verwendung eines eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringernden ersten Stoffs zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen, wobei das Medikament keine Glucoseoxidase enthält .
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei die Katalase eine extrazellulär wirkende zelluläre Katalase von Tumorzellen ist.
13. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei der erste Stoff ein spezifischer Inhibitor der Aktivität der Katalase, insbesondere 3-Aminotriazol, ist.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der erste Stoff eine die Substratumsetzung durch die Katalase mittels RNA-Interferenz verringernde Ribonukleinsäure mit doppelsträngiger Struktur (dsRNA) ist, insbesondere eine siRNA mit einem RNA-Strang, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Katalase kodierenden Gen ist.
15. Verwendung nach Anspruch 11 oder 12, wobei der erste Stoff ein die Ausschleusung der Katalase aus Tumorzellen in- hibierender Stoff ist.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 15, wobei zusätzlich ein den intrazellulären Glutathionspiegel in Tumorzellen, insbesondere durch Verringerung der Wirkung von Glutathionsynthetase, senkender zweiter Stoff verwendet wird.
17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei der zweite Stoff Buthioninsulfoximin, insbesondere L-Buthioninsulfoximin, oder eine siRNA mit einem RNA-Strang ist, der zumindest ab- schnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionsynthetase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei zusätzlich ein die Wirkung intrazellulärer Glutathionperoxidase in Tumorzellen verringernder dritter Stoff verwendet wird.
19. Verwendung nach Anspruch 18, wobei der dritte Stoff Mer- captobernsteinsäure oder eine siRNA mit einem RNA-Strang ist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionperoxidase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
20. Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 19, wobei zu- sätzlich ein zellulärer Effektor, ein Analogon eines zellulären Effektors oder ein einen zellulären Effektor oder ein Analogon eines zellulären Effektors erzeugender vierter Stoff, insbesondere ein NO-Donor, verwendet wird.
21. Medikament zur Behandlung einer Tumorerkrankung in einem Säugetier oder Menschen, enthaltend einen eine Substratumsetzung durch eine Katalase verringernden ersten Stoff, wobei das Medikament keine Glucoseoxidase enthält.
22. Medikament nach Anspruch 21, wobei die Katalase eine extrazellulär wirkende zelluläre Katalase von Tumorzellen ist.
23. Medikament nach Anspruch 21 oder 22, wobei der erste Stoff ein spezifischer Inhibitor der Aktivität der Katalase, insbesondere 3-Aminotriazol, ist.
24. Medikament nach einem der Ansprüche 21 bis 23, wobei der erste Stoff eine die Substratumsetzung durch die Katalase mittels RNA-Interferenz verringernde Ribonukleinsäure mit doppelsträngiger Struktur (dsRNA) ist, insbesondere eine siRNA mit einem RNA-Strang, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Katalase kodierenden Gen ist.
25. Medikament nach Anspruch 21 oder 22, wobei der erste
Stoff ein die Ausschleusung der Katalase aus Tumorzellen inhibierender Stoff ist.
26. Medikament nach einem der Ansprüche 21 bis 25, wobei zu- sätzlich ein den intrazellulären Glutathionspiegel in Tumor- zellen, insbesondere durch Verringerung der Wirkung von Glutathionsynthetase, senkender zweiter Stoff enthalten ist.
27. Medikament nach Anspruch 26, wobei der zweite Stoff Buthioninsulfoximin, insbesondere L-Buthioninsulfoximin, oder eine siRNA mit einem RNA-Strang ist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionsynthetase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
28. Medikament nach einem der Ansprüche 21 bis 27, wobei zusätzlich ein die Wirkung intrazellulärer Glutathionperoxidase in Tumorzellen verringernder dritter Stoff enthalten ist.
29. Medikament nach Anspruch 28, wobei der dritte Stoff Mer- captobernsteinsäure oder eine siRNA mit einem RNA-Strang ist, der zumindest abschnittsweise komplementär zu einer Sequenz aus einem für die Glutathionperoxidase kodierenden Gen der Tumorzellen ist.
30. Medikament nach einem der Ansprüche 21 bis 29, wobei zusätzlich ein zellulärer Effektor, ein Analogon eines zellulären Effektors oder ein einen zellulären Effektor oder ein Analogon eines zellulären Effektors erzeugender vierter Stoff, insbesondere ein NO-Donor, enthalten ist.
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