WO2005017146A1 - 相互作用阻害剤、相互作用阻害剤検出方法および相互作用阻害剤検出キット - Google Patents

相互作用阻害剤、相互作用阻害剤検出方法および相互作用阻害剤検出キット Download PDF

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WO2005017146A1
WO2005017146A1 PCT/JP2004/011686 JP2004011686W WO2005017146A1 WO 2005017146 A1 WO2005017146 A1 WO 2005017146A1 JP 2004011686 W JP2004011686 W JP 2004011686W WO 2005017146 A1 WO2005017146 A1 WO 2005017146A1
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WO
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kpna1
interaction
inhibitor
pkcθ
detecting
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PCT/JP2004/011686
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Satoshi Hihara
Hirofumi Doi
Original Assignee
Celestar Lexico-Sciences, Inc.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6875—Nucleoproteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a protein interaction inhibitor, a method for detecting an interaction inhibitor, and a kit for detecting an interaction inhibitor in a transmission pathway related to the regulation of T cell activity and the like.
  • the PKC (Protein Kinase C) family is a serine Z threonine kinase that is activated by specific binding to various lipid messengers such as Ca ions, phospholipids, fatty acids, phosphoric esters, and diacylglycerol. And regulates cell growth and proliferation.
  • PKC families are classified into three types: normal (Conventional or Classical), novel (Novel), and atypical (Atypical), depending on the difference in regulatory domains. There are three types of normal types: ⁇ , ⁇ , and ⁇ . There are four new types, ⁇ , ⁇ , ⁇ , and ⁇ . In addition, there are two types of variants, ⁇ and I.
  • PKC ⁇ a member of the PKC family, is a new type of PKC that is independent of Ca ions.
  • One of the functions of PKC ⁇ has been revealed to be T cell activation. The ability to express other PKCs in T cells It is thought that only PKC0 contributes to T cells among PKCs.
  • T cells that recognize an antigen produce IL 2 (interleukin 2) as a growth factor, express an IL-2 receptor, and proliferate in an IL 2-dependent manner.
  • T cells derived from mice knocked out of PKC ⁇ do not activate T cells in response to external stimuli as described above, resulting in reduced production of IL 2 (eg, Non-Patent Document 1). It is known that inflammatory bowel disease and hemolytic anemia occur in IL2 gene knockout mice (for example, Non-Patent Document 2).
  • transcription factors such as NF- ⁇ play an important role in regulating the transcription activity of the IL2 gene.
  • Non-patent document 1 Christopher WA et al., (2002) Current Opinion i n Immunology 12: 323—330
  • Non-Patent Document 2 Horak I., (1995) Clinical Immunology and Immunopatology Sep; 76 (3 Pt 2): SI 72-3
  • T cells, IL2, and the like play an extremely important role in the physiological functions of living organisms, particularly in the immune system.
  • the specific pathways involved in the regulation of T cell activity and the production of IL2 are still elucidated! It is expected that transmission pathways related to T cell activity regulation and production of IL2 are diverse and complex. It is necessary to know at what stage and what substances are involved in the identification of the transmission pathway.However, many substances are involved in the transmission pathway related to the regulation of T cell activity, etc. It is possible, and it is not easy to identify the substances involved in the transduction pathway because they may function in a very small amount or the stability of the substance itself may be low.
  • the first step is to look for new combinations of protein interactions in the transduction pathway, thereby providing new drug targets and promoting the development of new drugs that differ from the conventional mechanism of action. Be expected.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and relates to a protein interaction inhibitor and a method for detecting an interaction inhibitor, which are involved in T cell activity regulation, IL 2 production, and the like. It is an object to provide a method, a kit for detecting an interaction inhibitor, and the like.
  • the present inventors have advanced research on factors predicted to be associated with T cells and IL2, and studied biological information such as regulation of T cell activity or IL2 production.
  • the present inventors have found a new combination of interactions involving PKC ⁇ and NF- ⁇ B, and have completed the present invention based on powerful knowledge.
  • the present invention provides the following interaction inhibitor, an interaction inhibitor detection method and an interaction detection kit, and a drug target.
  • PKC ⁇ and KPNA1 Under conditions in which PKC ⁇ and KPNA1 can interact, PKC ⁇ and KPNA1 coexist with the candidate compound, and it is tested whether or not PKC ⁇ and KPNA1 have interacted with each other.
  • a method for detecting an inhibitor of the interaction between PKC ⁇ and KPN A1, wherein a candidate compound that has been shown to be inhibited is detected as an inhibitor.
  • KPNA1 and NF- ⁇ B coexist with the candidate compound under conditions where KPNA1 and NF- ⁇ B can interact, and whether KPNA1 interacts with NF- ⁇ B And KPNA1 and KPNA1 are detected as inhibitors.
  • NF A method for detecting inhibitors of the interaction with ⁇ B.
  • a kit for detecting an inhibitor of the interaction between PKC ⁇ and KPNA1, comprising a PKC ⁇ supply sample and a KPNA1 supply sample.
  • the kit for detecting the inhibitor according to the above [9] or [10], which is a kinase having a constant phosphorylation activity is a kinase having a constant phosphorylation activity.
  • a kit for detecting an inhibitor of the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ comprising a KPNA1 supply sample and an NF- ⁇ supply sample.
  • a method comprising, in drug development, targeting the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ as a drug discovery target.
  • an inhibitor of an interaction associated with PKC ⁇ and NF- ⁇ a method for detecting the inhibitor, and a detection kit.
  • the present invention also provides a drug discovery target.
  • PKC ⁇ and NF- ⁇ are important factors in biological information transmission such as regulation of ⁇ cell activity and IL2 production, and the present invention contributes to the biotechnology industry including pharmaceuticals etc.
  • FIG. 1 is a view showing that PKC ⁇ and KPNA1 are bound in a cell.
  • FIG. 2 is a view showing that KPNA1 was phosphorylated by PKC ⁇ .
  • FIG. 3 is a diagram showing that KPNA1 and ⁇ - 50 and ⁇ 65, which are constituent proteins of NF- ⁇ , bind intracellularly.
  • FIG. 4 is a schematic view of a part of the left electrophoresis image of FIG. 1.
  • FIG. 5 is a schematic view of a part of the electrophoretic image of FIG. 2.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of a part of lanes 1 and 2 of the left electrophoresis image of FIG. 3.
  • FIG. 7 is a view showing experimental results of Example 4.
  • the interaction inhibitor of the present invention is a substance that inhibits a protein interaction related to the regulation of T cell activity or IL2 production, and includes an inhibitor of an interaction between PKC ⁇ and KPNA1, and an inhibitor of KPNA1 and NF— Includes two forms of inhibitors of interaction with kappa B.
  • One form of the interaction inhibitor of the present invention inhibits the interaction between PKC ⁇ and KPNA1.
  • PKC ⁇ is a factor that affects T cell activation and is required for IL-2 production.
  • transcription of the IL2 gene must be induced by a transcription factor such as NF- ⁇ B.
  • NF- ⁇ B a transcription factor that influences the transcription of the IL2 gene by a transcription factor such as PKC-induced NF- ⁇ B.
  • the activity of NF- ⁇ B as a transcription factor is known to be controlled by translocating its intracellular localization into the nucleus. The pathway for its nuclear translocation is unknown. there were.
  • KPNA1 is a protein that recognizes proteins that function in the nucleus, such as transcription factors, and works to transport them to the nucleus and cytoplasm.
  • the present inventors have proposed PKC ⁇ It was confirmed that KPNA1 interacts, that PKC ⁇ phosphorylates KPNA1 using KPNA1 as a substrate, and that KPNA1 interacts with NF- ⁇ . These results have revealed that KPNA1 responsible for nuclear transport of proteins is involved in the unknown pathway from PKC ⁇ to NF- ⁇ activation.
  • a substance that inhibits the interaction between PKC1 and KPNA1 is a substance that has a high probability of regulating the activity of ⁇ cells and regulating the production of IL2. That is, a substance that inhibits the interaction between ⁇ C ⁇ and KPNA1 is a promising candidate for a drug for preventing and / or treating diseases related to the regulation of cell activity and production of IL2.
  • PKC ⁇ or ⁇ ⁇ -1 is a substance directly related to the transduction pathway. Being a promising candidate for prophylactic and / or Z-therapeutic agents for diseases related to activity regulation or IL-2 production, even its initial idea, has never existed.
  • the present invention also provides a completely new target for drug discovery by finding an entirely new combination of interactions between PKC ⁇ and KPNA1.
  • the inhibitor of the present embodiment may be any substance that inhibits the interaction between PKC ⁇ and KPNA1, and is not particularly limited.
  • the inhibitor of the present embodiment is not limited to a material or the like, but may be a biological substance such as a polynucleotide or a protein, or may be an inorganic or organic chemical.
  • PKCP and KPNA1 are allowed to coexist with a candidate compound under the condition that PKC ⁇ and KPNA1 can interact with each other.
  • Compounds that have been tested for whether or not the interaction has produced a force and that have been shown to inhibit the interaction are exemplified. The test for whether or not a protein interaction has occurred is described in detail below.
  • Another form of the inhibitors of the present invention inhibits the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ .
  • KPNA1 interacts with PKC, which is a factor affecting cell activation, and is a substrate phosphorylated by PKC.
  • NF- ⁇ interacts with KPNA1, which is responsible for nuclear transport of proteins.
  • NF- ⁇ is a factor that activates transcription of the IL 2 gene by translocating into the nucleus.
  • a substance that inhibits the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ ⁇ is a substance that is extremely likely to suppress the production of IL2. That is, a substance that inhibits the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ is a promising candidate for a drug for preventing or treating diseases related to ⁇ cell activity regulation or abnormal IL-2 production.
  • KPNA1 and NF- ⁇ are directly related substances in the transduction pathway. It has become a potential candidate for a prophylactic and / or therapeutic agent for diseases related to the regulation of IL2 activity or IL-2 production, even with no initial idea.
  • the present invention also provides a completely new and specific drug discovery target by finding a completely new combination of interactions between KPNA1 and NF- ⁇ .
  • the inhibitor of the present embodiment may be any substance that inhibits the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ NF, and is not particularly limited.
  • the inhibitor of the present embodiment may be a biological substance such as a polynucleotide or a protein which is not limited by a material or the like, or may be an inorganic or organic chemical.
  • KPNA1 and NF- ⁇ are allowed to coexist with a candidate compound under conditions where KPNA1 and NF- ⁇ Tests whether or not the interaction with 1 has occurred, and shows substances that have been shown to inhibit the interaction.
  • the test for determining whether or not the protein interaction has occurred is described in detail below.
  • the method for detecting an interaction inhibitor of the present invention is for detecting a substance that inhibits a protein interaction related to the regulation of cell activity or IL2 production, and comprises an inhibitor of the interaction between PKC ⁇ and KPNA1.
  • PKCP and KPNA1 are allowed to coexist with a candidate compound under conditions that allow PKC ⁇ and KPNA1 to interact, and whether PKC PK and KPNA1 interact with each other is determined. Perform a test.
  • Providing conditions under which PKC ⁇ and KPNA1 can interact is a prerequisite for accurately detecting that the protein interaction was inhibited by the candidate compound of the inhibitor. Any conditions are possible, for example, in vitro or in vivo. Preferably, conditions that can sufficiently maintain the three-dimensional structure of the mutual contact site in each protein interaction involved in the interaction are suitable.
  • a field in which the protein can interact with a liquid solvent to which the protein can be added is provided.
  • the liquid solvent is an aqueous solution.
  • the temperature of the liquid solvent is preferably room temperature, more preferably 30 to 37 ° C, and the pH is preferably neutral, more preferably 6.5 to 8.5. Adjusted.
  • the liquid solvent thus prepared may contain other auxiliary components such as a suitable buffer for maintaining the above-mentioned pH.
  • PKCP and KPNA1 are already known, and these genes may be transduced by genetic engineering, expressed in a predetermined host cell, and interacted with each other.
  • a probe may be created based on the sequence recorded in a sequence database or the like, and the cDNA library may be extracted as much as possible, or a primer may be prepared and a PCR method, etc. And can be obtained by amplification.
  • a cDNA library containing PKC ⁇ and KPNA1 is also available as a commercial library.
  • PKC exhibits a constant phosphorylation activity.
  • constant phosphorylation activity refers to a normal biochemical activity that can maintain the three-dimensional structure of a protein, which is not such that the phosphorylation switch is turned on or off by an external factor. It means that phosphoric acid is always exhibited under the conditions.
  • the phosphoridation activity as used herein refers to an activity of catalyzing a phosphorylation reaction.
  • the method for detecting an inhibitor of the interaction with PKC ⁇ tK PNA1 the occurrence of the interaction between PKC ⁇ and KPNA1 can be detected as KPNA1 phosphorylated. Therefore, If inactivated PKCII is used, false negatives may occur. Therefore, the reliability as a detection method can be improved by using PKC II that shows a constant phosphorylation activity as described above.
  • Examples of the kinase exhibiting a constant phosphorylation activity include a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing was originally obtained by substituting glutamic acid for the amino acid residue at position 148 from the ⁇ terminus which was alanine. By substituting the 148th amino acid residue with glutamic acid, the state in which the switch for phosphorylation activity is turned on is maintained.
  • a protein that is substantially the same as the protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing can also be used.
  • the 148th position is glutamic acid, and substitution, deletion, insertion, addition and inversion are performed in a region other than the 148th position of glutamic acid.
  • a protein having an amino acid sequence containing one or several amino acid mutations selected from the group and having a constant phosphorylation activity can also be used.
  • “several” means that the permissible mutations are mutations in a range that does not significantly impair the constant phosphorylation activity.
  • Introduction of a mutation that substitutes the amino acid residue at position 148 with glutamic acid for alanine force can also be performed by, for example, site-directed mutagenesis so that the amino acid at a specific site in the gene encoding the present protein is substituted. It can be obtained by modifying the base sequence.
  • PKC ⁇ , KPNA1 and a candidate compound are allowed to coexist. That is, PKCC, KPNA1, and a candidate compound are brought into contact. Specifically, PKC ⁇ , KPNA1 and the candidate compound may be added to the liquid solvent prepared as described above, or the candidate cells may be added to cells expressing PKC ⁇ and KPNA1. The product may be taken in or the candidate conjugate may be expressed in the same cell.
  • an inhibitory effect on the interaction is assayed, and a candidate compound that has been shown to inhibit the interaction is obtained as an inhibitor of the interaction between PKC ⁇ and KPNA1.
  • Identification of whether or not the interaction was inhibited can be easily performed by comparing with appropriate controls. It is identifiable. Appropriate controls include, for example, a system for confirming that the experimental system is functioning normally, and a system in which protein interaction or no protein interaction is set in advance. By doing so, those that can indicate whether or not the unknown candidate compound has the ability to inhibit protein interaction are included.
  • labeling substances such as luminescent substances, fluorescent substances, coloring substances, radioactive substances, marker genes, etc.
  • labeling substances such as luminescent substances, fluorescent substances, coloring substances, radioactive substances, marker genes, etc.
  • protein interaction assay method include an immunoprecipitation method, a far western method, a gel filtration method, a two-hybrid method, an energy transfer method, and a method using surface plasmon resonance.
  • an appropriate control sample may be provided using the above-described method for detecting protein interaction, and an experimental system for detecting an inhibitor may be constructed.
  • KPNA1 and NF- ⁇ may be used instead of the combination of PKC ⁇ and KPNA1. That is, under the condition that KPNA1 and NF- ⁇ can interact with each other, KPNA1 and NF- ⁇ candidate conjugate are allowed to coexist, and whether the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ has occurred.
  • the candidate compound that has been shown to inhibit the interaction is detected as an inhibitor.
  • Other preferable conditions and the like are the same as those in (2-1) the method for detecting an inhibitor of the interaction between PKCII and KPNA1.
  • the method for detecting an interaction inhibitor of the present invention is a test kit for detecting a substance that inhibits a protein interaction related to T cell activity regulation or IL2 production, and comprises an inhibitor of an interaction between PKC ⁇ and PNA1. And a kit for detecting an inhibitor of the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ B.
  • Examples of the supply sample form of PKC ⁇ , KPNA1, and NF- ⁇ include purified proteins as well as polynucleotides encoding these proteins. Incorporating this polynucleotide into an appropriate vector Thus, these proteins can be easily supplied to experiments by genetic engineering techniques. Also, provided that the interaction and function of these proteins is preserved,
  • N- or C-terminal protein with another protein such as j8-galactosidase, daltathione, S-transferase II, or a peptide tag such as His tag, myc tag, or FLAG tag, can be supplied to the experiment. it can.
  • another protein such as j8-galactosidase, daltathione, S-transferase II, or a peptide tag such as His tag, myc tag, or FLAG tag
  • a detection kit includes a PKC II supply sample and a KPNA1 supply sample.
  • the PKC II supply sample include a purified PKC II protein, a polynucleotide encoding PKC II, and the like.
  • One preferred form of the test kit includes a form in which a vector containing a polynucleotide encoding PKC ⁇ is used as a PKC ⁇ supply sample, and a vector containing a polynucleotide encoding KPNA1 is used as a KPNA1 supply sample.
  • the detection kit may employ various components used as an expression vector, such as a parent vector of a vector such as a plasmid, a promoter, a selection marker, and the like. Specific examples are as follows.
  • Examples of the vector include plasmids derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, commercially available products such as pBT Vector and pTRG Vector (manufactured by Stratagene)), and yeast-derived plasmids (eg, YEp24). , YCp50, etc.), butteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus and baculovirus, as well as ⁇ ⁇ -11, ⁇ 1, pRc / CMV, pRc / RSV, pcDNA1ZNeo and the like. Further, examples of plasmids suitably used for Bacillus subtilis include pUB110, pTP5, and PC194.
  • the promoter may be any promoter that is appropriate for the host cell used for gene expression.
  • the host cell is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, 1 pp promoter, T7 promoter, etc. SP02 promoter, penP promoter and the like.
  • yeast examples include a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, and an ADH promoter.
  • the host cell is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like can be mentioned.
  • examples include the SRa promoter, SV40 promoter, HIV 'LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, and HSV- ⁇ promoter.
  • the expression vector preferably has a multicloning site from the viewpoints of recombination operation, handling, and ease.
  • the expression vector may optionally include a selection marker, an enhancer, a splicing signal, a cascade signal with a polymerase, an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori), a terminator, and the like.
  • SV40ori an SV40 replication origin
  • the selectable marker include an ampicillin resistance gene (also a carbe-siline resistance gene; hereinafter may be abbreviated as Amp 1 ”) and a chloramuecole resistance gene (hereinafter abbreviated as Cam 1 ").
  • T et f tetracycline resistance gene
  • DHF dihydrofolate reductase
  • MTX metalhotrexate
  • Neo 1 neomycin resistant gene
  • G418 resistance neomycin resistant gene
  • a signal sequence suitable for the host cell may be added. If the host cell is a bacterium belonging to the genus Escherichia, PhoA ' When the host cell is a bacterium of the genus Bacillus, the ⁇ -amylase signal sequence, subtilisin 'signal sequence, etc. Signal sequence, SUC2 'signal sequence, etc. if the cell is an yeast, Insulin' signal sequence, interferon 'signal sequence, antibody molecule, antibody molecule if the host cell is a animal cell Etc. can be used respectively.
  • the detection kit of the present invention may include a host cell suitable for expressing the expression vector.
  • host cells include bacterial cells such as streptococci, streptococci, staphylococci, Escherichia coli, Streptomyces, and Bacillus subtilis; yeast, Fungal cells such as Aspergillus; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9; CHO, COS, HeLa, C127, 3T3; Animal cells such as BHK, HEK293, Bows melanoma cells and blood cells; and plant cells. More preferably, host cells used in the method for detecting an inhibitor of the present invention include yeast cells, Escherichia coli cells, Bacillus subtilis cells, and mammalian cells.
  • the culture of the host may be adjusted according to the type of the host and the like. There are many types of hosts, but some specific examples are as follows. For example, when culturing a transformant whose host is Escherichia or Bacillus, the culture medium used may be a liquid medium or an agar medium, in which the carbon source necessary for the growth of the transformant is contained. , Nitrogen source, inorganic substances and others.
  • Examples of the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose
  • examples of the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal
  • examples of inorganic or organic substances such as potato extract and inorganic salts include sodium chloride sodium, sodium dihydrogen phosphate, magnesium salt sodium, and the like.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Specific examples of a suitable medium for culturing the genus Escherichia include an LB medium containing a yeast extract, tryptone, and salt (NaCl).
  • an inducing agent such as, for example, isopropyl 1 thio D-galactoside may be added for efficient operation of the promoter.
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and aeration and stirring are applied as necessary.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and / or agitation are added.
  • examples of the medium include a Burkholder minimum medium, an SD medium containing 0.5% casamino acid, and the like. It is preferable to adjust the pH of the medium to about 518! Culture is usually performed at about 20 ° C-35 ° C for about 24-72 hours, with aeration and / or agitation as needed.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium was immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). A mixture obtained by appropriately kneading an additive such as a serum of the strain is used. Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 6.2-6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3-5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • examples of the medium include a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum, a DMEM medium, and an RPMI 1640 medium (The Journal of the American Medical Association, Vol. 199, 519 (1967)), 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, Vol. 73, L: 1950), etc. are used.
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30-40 ° C for about 15-60 hours, and aeration and / or agitation are added as necessary. Also, if necessary, C O
  • the kit of the present invention may be provided with other detection means used for performing the above-described detection method of the present invention.
  • the kit of the present embodiment can also include reagents used for detecting the inhibition of the protein interaction.
  • Reagents include qualitatively or quantitatively measurable labeling substances such as luminescent substances, fluorescent substances, coloring substances, and radioactive substances, antibody reagents for specifically detecting target substances, and experimental systems.
  • Reagents such as a pH adjusting agent, a buffering agent, and an auxiliary agent such as a base material for appropriately adjusting can be appropriately selected and provided.
  • the kit of the present invention may further include a container used for a detection test, a restriction enzyme, a medium for culturing host cells, and the like.
  • Kits for examining the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ K use KPNA1 and NF- ⁇ ⁇ ⁇ instead of the above combination of PKC ⁇ and KPNA1. That is, as another embodiment of the detection kit of the present invention, a KPNA1 supply sample, an NF- ⁇ supply sample, A kit for detecting an inhibitor of the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ , comprising a means for assaying the interaction between KPNA1 and NF- ⁇ B is exemplified.
  • the KPNA1 supply sample is a vector containing a polynucleotide encoding KPNA1
  • the NF- ⁇ supply means is a vector containing a polynucleotide encoding NF- ⁇ .
  • the other components are the same as in the above (3-1) Kit for detecting an inhibitor of the interaction between PKCC and KPNA1.
  • the cDNA encoding the amino acid sequence of human PKC0 (National Center Biotechnology Information: NCBI; Accession No. NP-006248) is obtained by performing PCR on a human skeletal muscle cDNA library (Takara Bio Inc.) using type II PCR. Was.
  • the sequences of the primers theta-N and theta-C used for PCR are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, respectively.
  • the obtained DNA fragment was inserted into a mammalian cell expression vector, pcDNA3.1 / myc-HisB (Invitrogen).
  • PKC ⁇ myc-His a plasmid, PKC ⁇ myc-His / pcDNA3.1, capable of expressing human PKC ⁇ as a C-terminal myc-His-tagged protein (hereinafter, PKC ⁇ myc-His) in mammalian cells was prepared. .
  • the cDNA encoding the amino acid sequence of human KPNA1 (NCBI; Accession No. AAH03009) was obtained by performing PCR using a human thymus cDNA library (manufactured by Takara Bio Inc.) as type II.
  • the sequences of the primers KPNA1-N and KPNA1-C used for PCR are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, respectively.
  • the obtained DNA fragment was inserted into a mammalian cell expression vector, pCMV Tag2C (Stratagene).
  • pCMV Tag2C (Stratagene).
  • human KPNA 1 can be used as an N-terminal FLAG-tagged kamushi protein (hereinafter, FLAG-KPNA1) in mammalian cells.
  • FLAG-KPNA1 N-terminal FLAG-tagged kamushi protein
  • step 2 transfection was performed using FuGENE (Roche Diagnostics). At this time, 2 ⁇ g each of PKC ⁇ -myc-His / pcDNA3.1 and FLAG-KP NAlZpCMV (combination 1) and 2 g each of pcDN A3.1.1 / myc-HisB (vector only) as a negative control FLAG—KPNAlZpCMV (Combination 2) was used.
  • the cells were further cultured in the presence of 5% CO at 37 ° CZ for 2 days.
  • Each protein was transiently expressed in cells. Next, the cells were washed with ice-cooled D-PBS (manufactured by Invitrogen), and then 0.5 ml of Cell Lysis Buffer (20 mM Tris-HC1, pH 7.5 / 150 mM NaCl / ImM Na EDTA / ImM EGTA / 1% Tri
  • a 10 / zl anti-FLAG M2 agarose affinity gel (manufactured by Sigma) was added to the supernatant (immunoprecipitation of FLAG-KPNAl), mixed by inversion at 4 ° C for 2 hours, and centrifuged. Agarose was recovered. The agarose was further washed four times with 0.5 ml of Cell Lysis Buffer, the SDS sample buffer was dried, boiled for 5 minutes, and the supernatant was separated by SDS-PAGE. Thereafter, immunoprecipitation of FLAG-KPNAl was detected by Western blotting using an anti-FLAG M2 monoclonal antibody (anti-FLAG M2 monoclonal antibody, Sigma).
  • c Western blotting using Myc monoclonal antibody (c-Myc (9E10) Monoclonal Antibody, manufactured by SantaCruz) was used to detect whether PKC-myc-His co-precipitated! /. Note that a Hare i ECL plus western blotting kit (manufactured by Amasherm biosciences) was used.
  • FIG. 1 shows the results.
  • FIG. 1 shows left and right electrophoresis images, and the following samples were electrophoresed in lanes M, 1, and 2 in each electrophoresis image.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a part of the left electrophoresis image of FIG.
  • Lane 1 a sample immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody from an extract of cells transfected with combination 1
  • Lane 2 a sample immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody from an extract of cells transfected with combination 2
  • the right electrophoresis image shows that FLAG-KPNA1 was immunoprecipitated (arrow).
  • the left electrophoresis image (WB; FLAG) shows that PKC ⁇ myc-His co-precipitated by immunoprecipitation of FLAG-KPNA1 (arrow in lane 1).
  • the numerical value shown on the left side of each lane on the left and right is the molecular weight of the molecular weight marker (unit: kDa).
  • MSN is known as a phosphorylation substrate of PKC 0 (Salvatore FP et al., (1998) The Journal of Biological Chemistry 273, 13: 7594-7603).
  • PKC II a mammalian cell expression plasmid for human MSN protein, MSN-V5-His / pcDNA3.1 (Invitrogen) was used. This allows MSN to be expressed in cells as a C-terminal V5-His tagged protein (hereinafter, MSN-V5-His).
  • Luciferase was used as a negative control.
  • pCMV Tag2 control (Stratagene) was used. This allows Luciferase to be expressed in cells as an N-terminal FLAG-tagged cascine protein (hereinafter, FLAG-Luc).
  • Proteins as substrates were expressed in cells according to the following procedure and recovered as immune complexes.
  • transfection was performed using FuGENE (Roche Diagnostics).
  • the transfected plasmid DNA is FLAG-KPNAl / pCMV, pCMV Tag2 control, and MSN-V5-His / pcDNA3.1, each of which is 21 each.
  • the cells were further cultured in the presence of 5% CO at 37 ° C for 2 days.
  • Each protein was transiently expressed in cells. Next, the cells were washed with ice-cooled D-PBS (manufactured by Invitrogen), and then 0.5 ml of Cell Lysis Buffer (20 mM Tris-HC1, pH 7.5 / 150 mM NaCl / ImM Na EDTA / ImM EGTA / 1% Tri
  • FIG. 2 shows the results.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of a part of the electrophoresis image of FIG.
  • the positive control, MSN is phosphorylated by PKC ⁇ (open arrowhead), and the negative control, Luciferase, is not phosphorylated by PKC ⁇ .
  • KPNA1 is phosphorylated by PKC ⁇ (solid arrowhead).
  • the arrow indicates the autophosphorylation of PKC0, and the value shown on the left side of the figure is the molecular weight of the molecular weight marker (unit: kDa).
  • an autophosphorylation band of PKC0 was confirmed in all lanes (molecular weight: about 83 kDa).
  • the phosphorylation band was observed in the positive control MSN (molecular weight: about 71 kDa), and the phosphorylation band was not observed in the negative control Luc (molecular weight: about 62 kDa), confirming the validity of the experimental system. .
  • a phosphorylation band of K PNA1 (molecular weight: about 63 kDa) was confirmed. From this, KPNA1 It was confirmed to be a phosphoric acid substrate of PKC II.
  • Human NF- ⁇ is composed of ⁇ 50 and ⁇ 65 heterodimers. Human ⁇ 50 is first expressed as its precursor, pl05 (NCBI; accession number AAA36361), and then cleaved in the cell between methionine at position 436 and aspartic acid at position 437, resulting in p50. It has been known.
  • the cDNA encoding the amino acid sequence of human p50 was obtained by performing PCR on a human skeletal muscle cDNA library (manufactured by TAKARA BIO INC.) With type II.
  • the sequences of the primers p50-N and p50-C used for PCR to obtain p50 are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, respectively.
  • the p50-C sequence was designed so that the termination codon TAA was added after the 436th methionine (ATG) of p105.
  • cDNA encoding the amino acid sequence of human p65 (NCBI; Accession No. AAA36408) was obtained by performing PCR on a human skeletal muscle cDNA library (Takara Bio Inc.) with type III.
  • the sequences of the primers p65-N and p65-C used for PCR to obtain p65 are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, respectively.
  • the obtained DNA fragment was inserted into a mammalian cell expression vector, pCMV Tag2A (Stratagene).
  • human p50 is expressed in mammalian cells as an N-terminal myc-tagged protein (hereinafter, myc-p50), and human p65 is expressed as an N-terminal myc-tagged protein (hereinafter, myc-p65).
  • myc-p50 N-terminal myc-tagged protein
  • myc-p65 N-terminal myc-tagged protein
  • transfection was performed using FuGENE (Roche Diagnostics). At that time, 2; zg each of myc-p50ZpCMV and FLAG-KPNAlZpCMV (combination 1), 2 ⁇ g of myc-p65ZpCMV and FLAG-KPNAlZpCMV (combination 2), and 2; zg each as a negative control pCMV Tag3 control (St ratagene) and FLAG-KPNAlZpCMV (combination 3).
  • the pCMV Tag3 control used in combination 3 is an expression plasmid capable of expressing Luciferase as an N-terminal myc-tagged protein (hereinafter, myc-Luc).
  • the cells are further cultured in the presence of 5% CO at 37 ° C for 2 days.
  • Each protein was transiently expressed in cells. Next, the cells were washed with ice-cooled D-PBS (manufactured by Invitrogen), and then 0.5 ml of Cell Lysis Buffer (20 mM Tris-HC1, pH 7.5 / 150 mM NaCl / ImM Na EDTA / ImM EGTA / 1% Tri
  • the recovered cell extract was mixed with 10 a of agarose conjugated normal mouse IgG (manufactured by SantaCruz), mixed by inversion at 4 ° C for 30 minutes, and the supernatant was collected by centrifugation (Pre-clean). .
  • FIG. 3 shows the results.
  • FIG. 3 shows two electrophoresis images on the left and right, and the following samples were electrophoresed in lanes M, 1, 2, and 3 in each electrophoresis image.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of a part of lanes 1 and 2 of the left electrophoresis image of FIG. Lane M: molecular weight marker
  • Lane 1 a sample immunoprecipitated with anti-myc antibody from an extract of cells transfected with combination 1
  • Lane 2 a sample immunoprecipitated with an anti-myc antibody from an extract of cells transfected with combination 2
  • Lane 3 a sample immunoprecipitated with anti-myc antibody from an extract of cells transfected with combination 3
  • the right electrophoresis image shows that immunoprecipitation of myc-p50 in lane 1, myc-p65 in lane 2, and myc-Luc in lane 3 (arrows in lanes 1, 2, and 3) .
  • the left electrophoresis image shows that FLAG-KPNA1 was co-precipitated by immunoprecipitating myc-p50 in lane 1 and immunoprecipitating myc-p65 in lane 2 ( Arrowheads in lanes 1 and 2).
  • the numerical value shown on the left side of each lane is the molecular weight of the molecular weight marker (unit: kDa).
  • FIG. 3 Right electrophoresis image (Western blotting with c Myc (9E10) Monoclonal Monoclonal Antibody) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ As shown, combinations 1, 2, and 3 show myc-p50 (molecular weight of about 52 kDa) and myc-p65, respectively. (Molecular weight of about 65 kDa) and a band corresponding to myc-Luc (molecular weight of about 62 kDa) were detected, indicating the validity of the immunoprecipitation experiment system. On the other hand, as shown in Fig.
  • Jurkat, Clone E6-1 manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd .; hereinafter, referred to as Jurkat cells
  • Jurkat cells were used as a host cell for the reporter assay.
  • Jukrkat cells are a cell line established from human acute leukemia-derived T cells, and are commonly used as model cells for T cell activation associated with antigen recognition, especially for the analysis of IL2 gene expression. It is something.
  • PKC ⁇ , KPNA1 and NF- ⁇ B are expressed.
  • PKC is composed of two regions, a regulatory domain and a kinase domain.
  • PKC ⁇ is inactivated as a phosphorylating enzyme. This is because the pseudosubstrate region (a region having a sequence similar to the substrate sequence of PKC ⁇ ) in the regulatory domain enters the catalytic cleft of the kinase domain and inhibits kinase activity.
  • the binding of lipid messengers such as diacylglycerol produced by ⁇ -cell activation to the regulatory domain causes a structural change in PKC ⁇ , and the regulatory domain is separated from the kinase domain. As a result, PKC ⁇ becomes activated as a phosphorylation enzyme, and the signal of ⁇ cell activation is transmitted.
  • PKC II has a force of 706 amino acid residues.
  • PKC ⁇ AE PKC ⁇ having this mutation
  • IL-2 transcriptional activation occurs in ⁇ Jurkat cells overexpressing PKC ⁇ AE without stimulation such as antigen recognition (Molecular and Cellular Biology 1996 Apr; 16). (4): 1842—50.).
  • the expression vector was changed from pcDNA3.1 / myc-His to pCI vector (Promega). .
  • This vector incorporates an artificially created intron downstream of the enhancer / promoter of human cytomegalovirus, which allows for more stable and high-level expression of the inserted gene. Can be done.
  • PKC ⁇ AE -myc-His / pcDNA3.1 and PKC0 KR-myc-HisZpcDNA3.1 is treated with restriction enzymes KpnI and PmeI to obtain PKC0AE or C-terminal myc-His-tagged PKC0AE or DNA fragments encoding KR were respectively prepared and inserted between the Kpn I site and the Pme I site of the pCI vector.
  • PKC ⁇ AE-myc-HisZpCI and PKC ⁇ KR-myc-HisZpCI were obtained.
  • PKC ⁇ AE and KR with the myc-His tag fused to the C-terminus were respectively expressed in Jurkat cells.
  • the reporter plasmid for detecting the transcriptional activity of NF- ⁇ B is pNF- ⁇ B-Luc (Stratagen e company). This sequence is repeated 5 times upstream of the DNA encoding firefly luciferase, a sequence required for NF- ⁇ B to act as a transcriptional activating factor (5′-TGGGGAC TTTCCGC-3 ′ SEQ ID NO: 11). Is inserted. That is, the reporter plasmid pNF- ⁇ B-Luc has a sequence site to which NF- ⁇ binds (NF- ⁇ binding region) and a firefly luciferase gene serving as a reporter downstream of the NF- ⁇ binding region. It has been incorporated.
  • NF- ⁇ binds to the NF- ⁇ binding region and acts as a transcriptional activation factor.
  • phRL-TK promega
  • the cells were further cultured for 48 hours, and the firefly luciferase activity and the Pseudomonas luciferase activity were measured using the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Next, a correction value was calculated by dividing the firefly luciferase activity by the Pseudomonas luciferase activity.
  • the correction value when PKC ⁇ 400 ng of KR-myc-His / pCI and 400 ng of pCMV Tag2 are set as 1
  • the relative values of the correction values in the other combinations were calculated, and the change in the firefly luciferase activity expressed depending on the transcriptional activity of NF- ⁇ B was calculated.
  • the experiment was performed independently six times, and the average value and standard deviation were also calculated.
  • Fig. 7 shows the experimental results obtained by graphing the average value and the standard deviation.
  • KPNA1 binds to PKCC and is phosphorylated by PKC ⁇ , and as a result, the function of NF- ⁇ B as a transcriptional activator is enhanced. Became evident.
  • KPNA1 a protein that transports transcription factors, etc. into the nucleus.
  • KPNA1 is more efficiently phosphorylated to form a complex with NF- ⁇ B, which transports NF- ⁇ B into the nucleus. It is thought that there is a pathway to promote the transcription of the NF- ⁇ B L2 gene translocated into the nucleus.
  • the present invention can be used in the biotechnology industry and the like.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is suitable for the development and manufacturing industries of pharmaceuticals, biological reagents, and the like.

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Abstract

　Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生などに関係のある、タンパク質相互作用の阻害剤、相互作用阻害剤の検出方法などを提供することを課題とする。ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤、およびＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を提供する。相互作用の阻害剤は、それぞれの組み合わせにおいて相互作用可能な条件下で、相互作用する２種のタンパク質と候補化合物とを共存せしめ、相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤とする。検出キットには、相互作用する組み合わせのタンパク質を供給する試料が備えられる。

Description

明 細 書
相互作用阻害剤、相互作用阻害剤検出方法および相互作用阻害剤検 出キット
技術分野
[0001] 本発明は、 T細胞の活性調節などに関係のある伝達経路におけるタンパク質の相 互作用阻害剤、相互作用阻害剤の検出方法および相互作用阻害剤の検出キットに 関する。
背景技術
[0002] PKC (プロテインキナーゼ C)ファミリ一は、 Caイオン、リン脂質、脂肪酸、ホスボー ルエステル、ジァシルグリセロールなどの各種脂質メッセンジャーとの特異的結合に よって活性ィ匕されるセリン Zスレオニンキナーゼであり、細胞の成長や増殖を調節し ている。 PKCファミリ一は、調節ドメインの違いにより、通常型（Conventionalもしく は Classical)と新規型（Novel)と異型 (Atypical)の 3種類のファミリーに分類される 。通常型としては、 α、 β、 γの 3種がある。また、新規型としては、 δ、 ε、 η、 Θの 4 種がある。また、異型としては、 ζ、 Iの 2種がある。
[0003] PKCファミリーの 1種である PKC Θは、 Caイオン非依存型の新規型に属する PKC である。 PKC Θの機能として明らかになっているものの 1つに、 T細胞の活性化があ る。 T細胞では他の PKCも発現している力 PKC類で T細胞に寄与しているのは PK C 0のみと考えられている。
[0004] 抗原を認識した T細胞は、増殖因子である IL 2 (インターロイキン 2)を産出し、 IL- 2受容体を発現し、 IL 2依存的に増殖する。 PKC Θをノックアウトしたマウス由来の T細胞では、上記のような外部刺激に応答した T細胞の活性ィ匕が起きず、 IL 2の産 出が低下する（例えば、非特許文献 1)。 IL 2遺伝子のノックアウトマウスでは、炎症 性腸疾患、溶血性貧血の発生が知られている (例えば、非特許文献 2)。
[0005] また、 IL 2遺伝子の転写活性の調節には NF— κ Βなどの転写因子が重要な役割 を果たすことが知られて 、る。
[0006] 非特許文献 1 : Christopher W. A. et al. , (2002) Current Opinion i n Immunology 12 : 323—330
非特許文献 2 :Horak I. , (1995) Clinical Immunology and Immunopat hology Sep ; 76 (3 Pt 2)： SI 72-3
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] T細胞や IL 2などは生体の生理的機能上、特に免疫機構において極めて重要な 役割を果たしている。しかし、 T細胞の活性調節や IL 2の産生などに関連する具体 的な伝達経路にっ 、ては未だに解明されて!、な!、点も多!、。 T細胞の活性調節や I L 2の産生などに関連する伝達経路は多岐にわたり複雑であることが予測される。 伝達経路の特定にはどの段階でどのような物質が関与するかということについての知 見が求められるが、 T細胞の活性調節などに関係する伝達経路には多数の物質が 関与していると考えられ、さらには、ごく微量で機能している可能性や物質自体の安 定性が低い可能性もあることから、伝達経路に関与する物質を特定することすら容易 ではない。
[0008] 他方、 T細胞や IL 2などの何らかの異常に係る疾患の予防や治療、そのための薬 剤の開発にあたっては、 T細胞や IL 2に関係のある伝達経路を解明することが開発 に大きく寄与することとなる。伝達経路を解明することにより、新たな創薬標的 (創薬タ ーゲット）の開拓も期待されるのである。特に伝達経路に係わるタンパク質の相互作 用につ 、て新たな組み合わせを見 、だすことができれば、新たに見 、だされたタン ノ^質の相互作用を阻害する薬剤は、その相互作用の調節を可能ならしめることとな り、その伝達経路に係わる疾患の予防、治療等に利用することが可能となる。すなわ ち、まずは伝達経路におけるタンパク質の相互作用の新たな組み合わせを見 、だす こと〖こよって、新たな創薬標的が提供され、従来の作用機序と異なる新薬の開発を促 進させることが期待される。
[0009] 本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであって、 T細胞の活性調節や IL 2 の産生などに関係のある、タンパク質相互作用の阻害剤、相互作用阻害剤の検出方 法、相互作用阻害剤の検出キット等を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段 [0010] 本発明者らは、上記の課題に鑑み、 T細胞や IL 2との関連が予測される因子につ V、て研究を進め、 T細胞の活性調節あるいは IL 2産生などの生体情報伝達にぉ ヽ て重要な因子である PKC Θ、 NF- κ Bなどに係わる因子についての探求を続けた。 その結果、本発明者らは、 PKC Θや NF— κ Bが係わる相互作用の新たな組み合わ せを見いだし、力かる知見に基づき本発明を完成させるに至った。本発明は、下記 相互作用阻害剤、相互作用阻害剤検出方法および相互作用検出キット、さらには創 薬標的を提供するものである。
[0011] 〔1〕PKC Θと KPNA1との相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
〔2〕KPNAlとNF—κ Bとの相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。 〔3〕PKC Θと KPNA1とが相互作用可能な条件下で、 PKC Θと KPNA1と候補化合 物とを共存せしめ、 PKC Θと KPNA1との相互作用が生じたか否かを検定し、相互 作用を阻害したことが示された候補化合物を選択して得られた、 PKC Θと KPNA1と の相互作用の阻害剤。
〔4〕前記 PKC Θ力 恒常的なリン酸ィ匕活性を示すキナーゼである、上記〔3〕に記載 の阻害剤。
〔5〕KPNA ^NF— κ Bとが相互作用可能な条件下で、 KPNA1と NF— κ Βと候補 化合物とを共存せしめ、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用が生じたカゝ否かを検定し、 相互作用を阻害したことが示された候補ィ匕合物を選択して得られた、 KPNA1と NF κ Βとの相互作用の阻害剤。
〔6〕PKC Θと KPNA1とが相互作用可能な条件下で、 PKC Θと KPNA1と候補化合 物とを共存せしめ、 PKC Θと KPNA1との相互作用が生じたか否かを検定し、相互 作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する、 PKC Θと KPN A1との相互作用の阻害剤を検出する方法。
〔7〕前記 PKC Θ力 恒常的なリン酸ィ匕活性を示すキナーゼである、上記〔6〕に記載 の阻害剤を検出する方法。
〔8〕KPNA1と NF— κ Bとが相互作用可能な条件下で、 KPNA1と NF— κ Βと候補 化合物とを共存せしめ、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用が生じたカゝ否かを検定し、 相互作用を阻害したことが示された候補ィ匕合物を阻害剤として検出する、 KPNA1と NF— κ Bとの相互作用の阻害剤を検出する方法。
〔9〕PKC Θ供給試料と、 KPNA1供給試料とを含む、 PKC Θと KPNA1との相互作 用の阻害剤を検出するキット。
〔10〕前記 PKC Θ供給試料が PKC Θをコードするポリヌクレオチドを含むベクターで あり、前記 KPNA1供給試料が KPNA1をコードするポリヌクレオチドを含むベクター である、上記〔9〕に記載の阻害剤を検出するキット。
前記!^!^ Θ力 恒常的なリン酸ィ匕活性を有するキナーゼである、上記〔9〕また は〔10〕に記載の阻害剤を検出するキット。
〔12〕KPNA1供給試料と、 NF- κ Β供給試料とを含む、 KPNA1と NF— κ Βとの相 互作用の阻害剤を検出するキット。
〔13〕前記 KPNA1供給試料が KPNA1をコードするポリヌクレオチドを含むベクター であり、前記 NF— κ Β供給試料が NF— κ Βをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ 一である、上記〔12〕に記載の阻害剤を検出するキット。
〔14〕医薬品の開発において、 PKC Θと KPNA1との相互作用を創薬標的とすること を特徴とする方法。
〔15〕医薬品の開発において、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用を創薬標的とするこ とを特徴とする方法。
発明の効果
[0012] 本発明によれば、 PKC Θ、 NF- κ Βが関連する相互作用の阻害剤、阻害剤の検 出方法、検出キットが提供される。また、本発明により創薬標的が提供される。 PKC Θ、 NF— κ Βは Τ細胞の活性調節、 IL 2産生などの生体情報伝達において重要な 因子であり、本発明は製薬などを含むバイオテクノロジー産業に寄与するものである
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は PKC Θと KPNA1が細胞内で結合していることを示す図である。
[図 2]図 2は PKC Θにより KPNA1がリン酸化されたことを示す図である。
[図 3]図 3は KPNA1と NF— κ Βの構成タンパク質である ρ50及び ρ65が細胞内で結 合して 、ることを示す図である。 [図 4]図 4は図 1の左側泳動像の一部の模式図である。
[図 5]図 5は図 2の泳動像の一部の模式図である。
[図 6]図 6は図 3の左側泳動像のレーン 1および 2の一部の模式図である。
[図 7]図 7は実施例 4の実験結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発 明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例 えば、 Molecular Cloning : A LABORATORY MANUAL, 第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor, New York (2001)、新遺伝子工学ハンドブック (村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第 3 版、 1999年)、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宫崎香編、羊土社、第 1版、 19 98年)タンパク質実験ノート（岡田雅人、宫崎香編、羊土社、第 2版、 1999年)などの ような種々の実験マニュアルの記載が参照される。
[0015] (1)相互作用阻害剤
本発明の相互作用阻害剤は、 T細胞の活性調節または IL 2産生に関連するタン パク質相互作用を阻害する物質であり、 PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤と 、 KPNA1と NF— κ Bとの相互作用の阻害剤の二形態が含まれる。
[0016] (1-1) PKC Θと KPNA1との相互作用阻害剤
本発明の相互作用阻害剤の一形態は、 PKC Θと KPNA1との相互作用を阻害す るものである。
[0017] PKC Θは T細胞の活性化に影響を与える因子であり、 IL 2産出に必要である。ま た IL 2の産出には、 NF— κ Bなどの転写因子により IL 2遺伝子の転写が誘導され なければならない。しかしながら、如何なる伝達経路により PKC Θ力 NF— κ Bなど の転写因子による IL 2遺伝子の転写を誘導するのかは不明であった。ここで NF— κ Bの転写因子としての活性ィ匕は、その細胞内局在を細胞質力 核内に移行させる ことにより制御されていることが知られている力 その核移行に関する経路は不明で あった。一方 KPNA1は、転写因子などの核内で機能するタンパク質を認識し、これ を細胞質力も核まで輸送するために働くタンパク質である。本発明者らは、 PKC Θと KPNA1とが相互作用すること、および PKC Θが KPNA1を基質とし、 KPNA1をリ ン酸化すること、さらに KPNA1と NF— κ Βが相互作用することを確認した。これらの こと力ら、不明であった PKC Θから NF— κ Βの活性化に到る伝達経路に、タンパク質 の核内輸送を担う KPNA1が関与していることが明らかになった。
[0018] したがって、 PKC Θと KPNA1との相互作用を阻害する物質は、 Τ細胞の活性調 節や IL 2の産生の調節を行うことができる蓋然性が高い物質である。すなわち、 ΡΚ C Θと KPNA1との相互作用を阻害する物質は、 Τ細胞の活性調節や IL 2の産生 に係る疾患の予防および Ζまたは治療薬の有力な候補物質となる。 PKC Θや ΚΡΝ Α— 1が伝達経路において直接的に関連を有する物質どうしであることについては従 来まったく示唆する知見はな力つたため、上記のような本形態の阻害剤が、 T細胞の 活性調節や IL 2の産生に係る疾患の予防および Zまたは治療薬の有力な候補物 質となるということは、その初期的着想すら存在しな力つた。また、本発明は、 PKC Θ と KPNA1というまったく新しい相互作用の組み合わせを見いだすことにより、まった く新たに具体的な創薬標的を提供するものでもある。
[0019] 本形態の阻害剤は、 PKC Θと KPNA1との相互作用を阻害する物質であればよく 、他に特に限定されるものではない。例えば、本形態の阻害剤は材質などによって限 定されるものではなぐ例えばポリヌクレオチド、タンパク質などの生体物質であっても よ!ヽし、あるいは無機または有機の化学薬品などでもよ 、。
[0020] 本形態の阻害剤としてより具体的には、例えば、 PKC Θと KPNA1とが相互作用可 能な条件下で、 PKC Θと KPNA1と候補化合物とを共存せしめ、 PKC Θと KPNA1 との相互作用が生じた力否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された化合物 が例示される。タンパク質の相互作用が生じたか否かの検定については下記にて別 途詳説する。
[0021] (1—2) KPNA ^NF— κ Βとの相互作用阻害剤
本発明の阻害剤の他の一形態は、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用を阻害するも のである。
[0022] 上記のように KPNA1は、 Τ細胞の活性化に影響を与える因子である PKC Θと相 互作用し、 PKC Θによってリン酸ィ匕される基質であることが本発明者らにより明らか にされた。さらに NF— κ Βと、タンパク質の核内輸送を担う KPNA1と相互作用するこ とが本発明者らにより明らかにされた。 NF— κ Βは核内に移行することによって IL 2 遺伝子の転写を活性ィ匕する因子である。
[0023] したがって、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用を阻害する物質は、 IL 2の産生を 抑制する蓋然性が極めて高い物質である。すなわち、 KPNA1と NF—κ Βとの相互 作用を阻害する物質は、 Τ細胞の活性調節または IL-2の産生異常などに係る疾患 を予防または治療薬の有力な候補ィ匕合物である。従来、 KPNA1と NF— κ Βとが伝 達経路において直接的に関連を有する物質どうしであることについてはまったく示唆 する知見はな力つたため、上記のような本形態の阻害剤が、 Τ細胞の活性調節や IL 2の産生に係る疾患の予防および Ζまたは治療薬の有力な候補物質となるというこ とは、初期的着想すら存在しなカゝつた。また、本発明は、 KPNA1と NF— κ Βというま つたく新しい相互作用の組み合わせを見いだすことにより、まったく新たに具体的な 創薬標的を提供するものでもある。
[0024] 本形態の阻害剤は、 KPNA1と NF— κ Βの相互作用を阻害する物質であればよく 、他に特に限定されるものではない。例えば、本形態の阻害剤は材質などによって限 定されるものではなぐポリヌクレオチド、タンパク質などの生体物質であってもよいし 、あるいは無機または有機の化学薬品などでもよ ヽ。
[0025] 本形態の阻害剤としてより具体的には、例えば、 KPNA1と NF— κ Βが相互作用可 能な条件下で、 KPNA1と NF— κ Βと候補化合物とを共存せしめ、 PKC Θと ΚΡΝΑ 1との相互作用が生じた力否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された物質が 例示される。タンパク質の相互作用が生じた力否かの検定については下記にて別途 詳説する。
[0026] (2)相互作用阻害剤検出方法
本発明の相互作用阻害剤検出方法は、 Τ細胞の活性調節または IL 2産生に関連 するタンパク質相互作用を阻害する物質の検出を行うものであり、 PKC Θと KPNA1 との相互作用の阻害剤を検出する方法と、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用の阻害 剤を検出する方法の二形態が含まれる。
[0027] (2-1) PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤を検出する方法 まず、 PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤を検出する方法を例としつつ、本 発明について説明する。
[0028] 本発明の一形態では、 PKC Θと KPNA1とが相互作用可能な条件下で、 PKC Θ と KPNA1と候補化合物とを共存せしめ、 PKC Θと KPNA1との相互作用が生じた か否かの検定を行う。 PKC Θと KPNA1とが相互作用が可能な条件を設けることは、 阻害剤の候補ィ匕合物によってタンパク質の相互作用が阻害されたことを的確に検知 するための前提であり、タンパク質の相互作用が可能な条件であればよぐ例えば in vitroでも in vivoでもよい。好ましくは、相互作用に係るそれぞれのタンパク質相 互作用における相互接触部位の立体構造が十分に保ち得る条件が好適である。
[0029] 一例としては、タンパク質を添加することができる液体溶媒などによってタンパク質 の相互作用が可能な場が提供される。好ま 、液体溶媒としては水溶液があげられ 、液体溶媒の温度は、好ましくは常温、より好ましくは 30— 37°Cで、 pHは、好ましく は中性、より好ましくは 6. 5-8. 5に調整される。このように調製される液体溶媒には 、上記の pHを保つ適当な緩衝剤など、他の補助的成分を配合してもよい。
[0030] また、 PKC Θ、 KPNA1の遺伝子配列は既に公知のものがあり、これらの遺伝子を 遺伝子工学的に形質導入し、所定の宿主細胞内で発現させ、相互作用させてもよい 。 PKC Θや KPNA1の遺伝子の取得は、例えば、配列データベース等に記録された 配列に基づきプローブを作成し、 cDNAライブラリ一力もつり出してもよいし、プライマ 一を作製し cDNAライブラリーから PCR法などにより増幅するなどして得ることができ る。 PKC Θや KPNA1を含有する cDNAライブラリ一は巿販のライブラリ一力も入手 可能である。
[0031] 本実験系にお ヽては、 PKC Θとして、恒常的なリン酸化活性を示すものが好適で ある。恒常的なリン酸化活性を示すとは、外的因子によってリン酸ィ匕活性のスィッチ がオンになったりオフになったりするようなものではなぐタンパク質の立体構造を保 ち得る通常の生化学的条件下において常時リン酸ィ匕活性を発揮することをいう。また 、ここでいうリン酸ィ匕活性とは、リン酸化反応を触媒する活性のことをいう。 PKC Θ tK PNA1との相互作用の阻害剤を検出する方法においては、 PKC Θと KPNA1との 相互作用が生じたことは KPNA1がリン酸ィ匕されたこととして検出できる。したがって、 仮に不活性化した PKC Θを用いてしまうと偽陰性を生じ得る。そのため、上記のよう に恒常的なリン酸化活性を示す PKC Θを用いることにより、検出方法としての信頼性 を向上させることできる。
[0032] 恒常的なリン酸ィ匕活性を示すキナーゼとしては、例えば配列表の配列番号 9に示 すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。配列表の配列番号 9に示すアミノ 酸配列は、元々は Ν末端から 148番目のアミノ酸残基がァラニンであったところを、グ ルタミン酸に置換して得られたものである。 148番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に 置換することにより、リン酸ィ匕活性のスィッチがオンになった状態が保たれる。また、 本発明にお 、ては、配列表の配列番号 9に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と実 質的に同一のタンパク質を用いることもできる。すなわち、配列表の配列番号 9に記 載のアミノ酸配列において、第 148番目がグルタミン酸であり、かつ第 148番目のグ ルタミン酸以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位力 なる群より選ばれ る 1または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、恒常的なリン酸ィ匕 活性を有するタンパク質を用いることもできる。ここで「数個」とは、許容される変異が 恒常的なリン酸ィ匕活性を大きく損なわな 、範囲の変異であることを意味し、数値とし て具体的に例示すると 2— 50個、好ましくは 2— 30個、より好ましくは 2— 10個である
[0033] 第 148番目のアミノ酸残基をァラニン力もグルタミン酸に置換するような変異の導入 は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の 部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変することなどによって得られる。
[0034] PKC Θと KPNA1とが相互作用可能な条件下で、 PKC Θと KPNA1と候補化合物 とを共存させる。すなわち、 PKC Θと KPNA1と候補化合物とを接触させる。具体的 には、上記のように調製した液体溶媒に、 PKC Θ、 KPNA1および候補ィ匕合物を添 カロしてもよいし、あるいは、 PKC Θおよび KPNA1を発現させた細胞に候補ィ匕合物 を取り込ませる若しくは候補ィ匕合物を同細胞内で発現させるなどしてもよい。
[0035] 上記のように相互作用に対する阻害作用を検定し、相互作用を阻害したことが示さ れた候補化合物を、 PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤として得る。相互作用 を阻害したか否かの識別は、適当なコントロールを設けて対比させることにより容易に 識別可能である。適切なコントロールには、実験系が正常に機能していることを確認 するための系の他、タンパク質相互作用が生じること又はタンパク質相互作用が生じ ないことが予め設定された系が例示され、対比することにより、未知の候補化合物が タンパク質の相互作用を阻害する力否かを示すことができるものなどが含まれる。識 別のためには、発光物質、蛍光物質、発色物質、放射性物質、マーカー遺伝子など の各種の標識物質を用い、標識物質を定性的または定量的に測定し、その測定結 果の差力も阻害剤か否かを判断することがきる。
[0036] タンパク質相互作用を検定する方法は既にいくつかの方法が知られている。タンパ ク質の相互作用検定法として具体的には、例えば、免疫沈降法、ファーウェスタン法 、ゲルろ過法、ツーハイブリッド法、エネルギートランスファ一法、表面プラズモン共鳴 を用いた方法などが挙げられる。本発明の検出方法においては、上記のようなタンパ ク質相互作用の検出方法を用い、適切なコントロール試料を設けて、阻害剤を検出 するような実験系を構築すればよい。
[0037] (2— 2) KPNA1と NF— κ Βとの相互作用の阻害剤を検出する方法
KPNA1と NF— κ Βとの相互作用の阻害剤を検出する場合には、上記 PKC Θおよ び KPNA1の組み合わせに変えて、 KPNA1及び NF— κ Βを用いればよい。すなわ ち、 KPNA1と NF— κ Βとが相互作用可能な条件下で、 KPNA1と NF— κ Β候補ィ匕 合物とを共存せしめ、 KPNA1と NF—κ Βとの相互作用が生じたか否かを検定し、相 互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する。他の好ましい 条件等については、上記（2— 1) PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤を検出す る方法と同様である。
[0038] (3)相互作用阻害剤検出キット
本発明の相互作用阻害剤検出方法は、 T細胞の活性調節または IL 2産生に関連 するタンパク質相互作用を阻害する物質の検出を行う試験キットであり、 PKC Θと PNA1との相互作用の阻害剤を検出するキットと、 KPNA1と NF— κ Bとの相互作用 の阻害剤を検出するキットの二形態が含まれる。 PKC Θ、 KPNA1、 NF— κ Βの供 給試料形態としては精製タンパク質の他に、これらのタンパク質をコードするポリヌク レオチドなどが挙げられる。このポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込むことに より、これらのタンパク質を遺伝子工学的な手法により容易に実験に供給することが できる。また、これらのタンパク質の相互作用および機能が保たれるならば、これらの
N末端や C末端に別のタンパク質、例えば j8 -ガラクトシダーゼ、ダルタチオン、 S—ト ランスフェラーゼゃ、ペプチドタグ、例えば Hisタグ、 mycタグ、 FLAGタグを付カ卩した ものを、実験に供給することができる。
[0039] (3-1) PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤を検出するキット
PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤を検出するキットを例としつつ、さらに本 発明のキットについて説明する。本発明の一形態の検出キットは、 PKC Θ供給試料 と、 KPNA1供給試料とを備える。 PKC Θ供給試料は、例えば、 PKC Θの精製タン パク質、 PKC Θをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。試験キットの好ましい 一形態としては、 PKC Θ供給試料として PKC Θをコードするポリヌクレオチドを含む ベクターを、 KPNA1供給試料として KPNA1をコードするポリヌクレオチドを含むベ クタ一を採用する形態が挙げられる。
[0040] 検出キットは、プラスミドなどベクターの母体種類、プロモーター、選択マーカーなど は、発現ベクターとして用いられる種々の構成を採用することができる。具体例を挙 げると次の通りである。
[0041] ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、 pBR322、 pBR325、 pU C12、 pUC13、巿販品として pBT Vectorゝ pTRG Vector (Stratagene社製）な ど）、酵母由来プラスミド（例、 YEp24、 YCp50など）、 λファージなどのバタテリオフ ァージ、レトロウイルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなど の他、 ρΑΙ— 11、 ρΧΤ1、 pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAlZNeoなどが用いら れる。また、枯草菌に好適に用いられるプラスミドとして、例えば、 pUB110、 pTP5、 PC194などが挙げられる。
[0042] プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモ 一ターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシ リヒア属菌である場 合は、 trpプロモーター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 λ PLプロモーター、 1 ppプロモーター、 T7プロモーターなど力 宿主細胞がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモーター、 SP02プロモーター、 penPプロモーターなどが挙げられる。ま た、宿主細胞が酵母である場合は、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモーター、 ADHプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場 合は、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロモーターなどが挙げられる。また、動物細 胞を宿主細胞として用いる場合は、 SR aプロモーター、 SV40プロモーター、 HIV' LTRプロモーター、 CMV (サイトメガロウィルス）プロモーター、 HSV— ΤΚプロモータ 一などが挙げられる。
[0043] 発現ベクターは、組換え操作につ!、ての扱!、やすさの観点からマルチクローユング サイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選 択マーカー、ェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ Α付カ卩シグナル、 SV40複 製オリジン (以下、 SV40oriと略称する場合がある）、ターミネータ一などを組み込む ことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子 (カルべ-シリ ン耐性遺伝子でもある。以下、 Amp1"と略称する場合がある）、クロラムフエ-コール耐 性遺伝子 (以下、 Cam1"と略称する場合がある）、テトラサイクリン耐性遺伝子 (以下、 T etfと略称する場合がある）、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、 dhfと略称する場合がある )遺伝子〔メソトレキセート (MTX)耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、 Neo1"と略 称する場合がある、 G418耐性)等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合 つたシグナル配列を付加する。宿主細胞がェシエリヒア属菌である場合は、 PhoA'シ グナル配列、 ΟπιρΑ·シグナル配列など力 宿主細胞がバチルス属菌である場合は 、 α アミラーゼ ·シグナル配列、サブチリシン'シグナル配列など力 宿主細胞が酵 母である場合は、 MF o; ·シグナル配列、 SUC2'シグナル配列など、宿主細胞が動 物細胞である場合には、インシュリン 'シグナル配列、 ひ インターフェロン 'シグナル 配列、抗体分子 ·シグナル配列などをそれぞれ利用できる。
[0044] また、本発明の検出キットには、発現ベクターを発現させるのに適した宿主細胞を 備えてもよい。宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌（streptococci)、ブドウ球菌（st aphylococci)、ェシエリヒア属菌（Escherichia coli)、ストレプトミセス属菌（Strept omyces)および枯草菌（Bacillus subtilis)などの細菌細胞；酵母、ァスペルギルス 属（Aspergillus)などの真菌細胞；ドロソフイラ S2 (Drosophila S2)およびスポドプ テラ Sf 9 (Spodoptera Sf9)などの昆虫細胞； CHO、 COS, HeLa、 C127、 3T3、 BHK、 HEK293、ボウズ（Bows)黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞； ならびに植物細胞が挙げられる。本発明の阻害剤検出方法において用いられる宿 主細胞として、より好ましくは、酵母細胞、大腸菌細胞、枯草菌細胞、哺乳動物細胞 などが挙げられる。
[0045] 発現ベクターの宿主細胞への導入は、 Davisら、 BASIC METHODS IN MO LECULAR BIOLOGY (1986) ; Sambrookら、 Molecular Cloning : A LA BORATORY MANUAL, 第 3版、 Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss、Cold Spring Harbor, New York (2001)のような、多くの標準的な実験 マ-ユアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸力 ルシゥムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロ インジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、トラ ンスダクシヨン、スクレープ負荷、ノ リスティック導入または感染等がある。
[0046] 宿主の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は多数に 上るが、いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がェシエリヒア属 菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は液体 培地でも寒天培地でもよぐその中には形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源 、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可 溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモ-ゥム塩類、硝酸塩類、コー ンスチープ'リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの 無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩ィ匕カルシウム、リン酸二水素ナトリ ゥム、塩ィ匕マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因 子などを添カ卩してもよい。培地の pHは約 5— 8が望ましい。ェシエリヒア属菌を培養す る際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩 (NaCl)を含む LB培 地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働力せるために、例え ば、イソプロピル 1 チォー D ガラクトシドのような誘導剤を添カ卩してもよい。宿主 がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 15— 43°Cで約 3— 24時間行い、必要に 応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約 30— 40°C で約 6— 24時間行い、必要により通気や撹拌を加える。 [0047] 宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、 Burkholder 最小培地、 0. 5%カザミノ酸を含有する SD培地などが挙げられる。培地の pHは約 5 一 8に調整するのが好まし!/、。培養は通常約 20°C— 35°Cで約 24— 72時間行 ヽ、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
[0048] また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace ' s Insect Medium (Grace, T. C. C. , Nature, 195、 788 ( 1962) ) に非動化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜カ卩えたものなどが用いられる。培地の pHは約 6. 2-6. 4に調整するのが好ましい。培養は通常約 27°Cで約 3— 5日間行 い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
[0049] 宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約 5— 2 0%の胎児牛血清を含む MEM培地、 DMEM培地、 RPMI 1640培地（The Jour nal of the American Medical Association, 199卷、 519 ( 1967) )、 199培 地 (Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine、 73卷、： L ( 19 50) )などが用いられる。 pHは約 6— 8であることが好ましい。培養は通常約 30— 40 °Cで約 15— 60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、 C O
2濃度の調節を行う。
[0050] また、本発明のキットには、上記本発明の検出方法を実施するために用いられる他 の検出手段を備えるようにしてもよい。例えば、本形態のキットには、上記のタンパク 質相互作用の阻害を検出するために用いられる試薬類を備えることもできる。試薬類 としては、定性的または定量的に測定可能な、発光物質、蛍光物質、発色物質、放 射性物質などの標識物質、目的物質を特異的に検出するための抗体試薬類、実験 系を適切に調整するための pH調製剤、緩衝剤、基材などの補助剤などの試薬類を 適宜選択して備えることができる。また、さらに本発明のキットには、検出試験に用い る容器、制限酵素、宿主細胞培養のための培地等を備えるようにしてもよい。
[0051] (3— 2) KPNA1と NF— κ Βとの相互作用の阻害剤を検出するキット
KPNA1と NF— κ Βとの相互作用を検定するキットの場合には、上記 PKC Θおよ び KPNA1の組み合わせに変えて、 KPNA1及び NF— κ Βを用いる。すなわち、本 発明の検出キットの他の一形態として、 KPNA1供給試料と、 NF— κ Β供給試料と、 KPNA1と NF— κ Bとの相互作用の検定手段とを含む、 KPNA1と NF— κ Βとの相 互作用の阻害剤を検出するキットが挙げられる。好ましい一形態としては、 KPNA1 供給試料が KPNA1をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記 NF— κ Β供給手段が NF— κ Βをコードするポリヌクレオチドを含むベクターである。他の構 成については上記（3— 1) PKC Θと KPNA1との相互作用の阻害剤を検出するキット と同様である。
実施例
[0052] 以下、下記実施例を示し、本発明について詳細に説明する。なお、本発明は、下 記実施例により限定されるものではない。
[0053] 実施例 1： PKC Θと KPNA1の相互作用の解析
PKC Θと KPNA1が相互作用するかどうかについて、実験的に確認するために、ィ ンビボ結合試験（in vivo binding assay)を実施した。
[0054] 1-1) PKC Θの哺乳動物細胞発現プラスミドの構築
ヒト PKC 0のアミノ酸配列（National Center Biotechnology Information: NCBI ;ァクセッション番号 NP— 006248)をコードする cDNAは、ヒト骨格筋 cDNA ライブラリー（タカラバイオ社製)を铸型に PCRを行うことにより得た。 PCRに用いたプ ライマー、 theta— Nと theta— Cの配列は、配列表の配列番号 1と配列番号 2にそれ ぞれ示す。得られた DNA断片を、哺乳動物細胞発現用ベクター、 pcDNA3. 1/m yc— HisB (Invitrogen社製）に挿入した。これにより、ヒト PKC Θを、 C末端 myc— Hi sタグ付加蛋白質 (以下、 PKC Θ myc— His)として、哺乳動物細胞内で発現可能な プラスミド、 PKC Θ myc— His/pcDNA3. 1を作製した。
[0055] 1 2) KPNA1の哺乳動物細胞発現プラスミドの構築
ヒト KPNA1のアミノ酸配列（NCBI ;ァクセッション番号 AAH03009)をコードする c DNAは、ヒト胸腺 cDNAライブラリー（タカラバイオ社製)を铸型に PCRを行うことによ り得た。 PCRに用いたプライマー、 KPNA1— Nと KPNA1— Cの配列は、配列表の配 列番号 3と配列番号 4にそれぞれ示す。得られた DNA断片を、哺乳動物細胞発現 用ベクター、 pCMV Tag2C (Stratagene社製）に挿入した。これにより、ヒト KPNA 1を、 N末端 FLAGタグ付カ卩蛋白質（以下、 FLAG-KPNA1)として、哺乳動物細胞 内で発現可能なプラスミド、 FLAG— KPNAlZpCMVを作製した。
[0056] 1— 3) PKC 0と KPNA1のインビボ結合試験（in vivo binding assay)
ヒト胎児腎臓由来の細胞株 HEK293T細胞に、上記発現プラスミド、 PKC Θ myc His/pcDNA3. 1と FLAG— KPNAl/pCMVをトランスフエクシヨンすることによ り実験を行った。
[0057] まず、 4 X 105個の HEK293T細胞を 6cm dishに散種し、 37°C/5%CO存在下
2 にてー晚培養後、 FuGENE (Roche Diagnostics社製）を用いてトランスフエクショ ンを行った。その際、 2 μ gずつの PKC Θ -myc-His/pcDNA3. 1と FLAG—KP NAlZpCMV (組み合わせ 1)および、陰性コントロールとして、 2 gずつの pcDN A3. 1/myc-HisB (ベクターのみ）と FLAG— KPNAlZpCMV (組み合わせ 2)の 2種類のトランスフエクシヨンを行った。
[0058] トランスフエクシヨン後、 37°CZ5%CO存在下でさらに 2日間培養することにより個
2
々の蛋白質を細胞内で一過的に発現させた。次いで、細胞を氷冷した D— PBS (Inv itrogen社製）により洗净後、 0. 5mlの Cell Lysis Buffer (20mM Tris— HC1, pH7. 5/ 150mM NaCl/ ImM Na EDTA/ ImM EGTA/ 1 % Tri
2
ton / 2. 5mM sodium pyrophosphate/ ImM β—glycerophosphate / ImM Na VO / 1 μ g/ml Leupeptin/ ImM PMSF)に懸濁し、氷中
3 4
30分間放置した。その後、 14krpm、 10分間、 4°Cの遠心により上清を回収し、細胞 抽出液を得た。回収した細胞抽出液に 10 ΐの agarose conjugated normal m ouse IgG (SantaCruz社製）を加え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心により 上清を回収した（Pre— clean)。
[0059] この上清に 10 /z lの anti—FLAG M2 agarose affinity gel (Sigma社製）を加 え (FLAG— KPNAlの免疫沈降）、 4°Cにて 2時間転倒混和を行い、遠心にてァガロ ース（agarose)を回収した。さらに agaroseを 0. 5mlの Cell Lysis Bufferにて 4回 洗浄した後、 SDS sample bufferをカ卩え、 5分間煮沸後、上清を SDS— PAGEに て分離した。その後、抗 FLAG M2 モノクローナル抗体（anti— FLAG M2 Mon oclonal Antibody, Sigma社製）を用いたウェスタンブロッテイング法（Western blotting)により、 FLAG— KPNAlが免疫沈降されていることを検出した。また、 c— Mycモノクローナノレ抗体 (c—Myc ( 9E 10) Monoclonal Antibody, SantaCruz 社製）を用いた Western blottingにより PKC Θ myc— Hisが共沈して!/、るかを検 出した。なお、恢出 i ECL plus western blotting kit、Amasherm bioscien ces社製)を使用した。
[0060] その結果を図 1に示す。図 1には左右 2つの泳動像を示しており、各泳動像におけ る各レーン M、 1、 2には以下に示すサンプルを電気泳動した。また、図 4は図 1の左 側泳動像の一部の模式図を示す。
レーン M：分子量マーカー
レーン 1：組み合わせ 1をトランスフエクシヨンさせた細胞の抽出液から、抗 FLAG抗 体により免疫沈降したサンプル
レーン 2 :組み合わせ 2をトランスフヱクシヨンさせた細胞の抽出液から、抗 FLAG抗 体により免疫沈降したサンプル
右側泳動像 (WB； myc)は、 FLAG— KPNA1が免疫沈降されて ヽることを示す（ 矢印）。左側泳動像 (WB ; FLAG)は、 FLAG— KPNA1を免疫沈降することにより、 PKC Θ myc— Hisが共沈したことを示す（レーン 1の矢印）。なお、左右の各レーン の左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である（単位 kDa)。
[0061] まず、図 1右側泳動像（anti— FLAG M2 Monoclonal Antibodyによる Weste rn blotting)に示すように、組み合わせ 1、 2共に FLAG— KPNA1に相当するバン ド (分子量約 63kDa)が検出されており、免疫沈降実験系の妥当性が示された。そし て、図 1左側泳動像（c— Myc (9E10) Monoclonal Monoclonal Antibodyによ る Western blotting)に示すよう〖こ、組み合わせ 1において PKC Θ myc— Hisに 相当するバンド (分子量約 85kDa、レーン 1の矢印部）が検出されている。これは、 F LAG— KPNA1が細胞内で PKC Θ myc— Hisと複合体を形成し供沈した事を示し ている。この結果から、 PKC Θが KPNA1と細胞内で結合していることが確認された
[0062] 実施例 2 : PKC 0による KPNA1リン酸化の解析
PKC Θと KPNA1の相互作用が確認されたことを踏まえ、 KPNA1が PKC 0のリン 酸ィ匕基質となるかどうかを確認するため、インビトロ リン酸化実験 (In vitro kinas e assay)を実施した o
[0063] 2-1) PKC Θによるリン酸ィ匕実験の陽性コントロールおよび陰性コントロール
PKC 0のリン酸化基質としては MSNが公知である（Salvatore F. P. et al. , ( 1998) The Journal of Biological Chemistry 273, 13 : 7594—76 03)。 PKC Θによるリン酸ィ匕実験の陽性コントロールとして用いるため、ヒト MSN蛋 白質の哺乳動物細胞発現プラスミド、 MSN-V5-His/pcDNA3. 1 (Invitrogen 社製)を使用した。これにより細胞内で、 MSNを C末端 V5— Hisタグ付加蛋白質 (以 下、 MSN— V5— His)として発現させることが可能である。
[0064] 一方、陰性コントロールとしては Luciferaseを使用した。 Luciferaseの哺乳動物細 胞発現プラスミドとしては pCMV Tag2 control (Stratagene社製）を用いた。これ により細胞内で、 Luciferaseを N末端 FLAGタグ付カ卩蛋白質（以下、 FLAG— Luc) として発現させることが可能である。
[0065] 2—2)インビトロ リン酸化実験（In vitro kinase assay)
基質となる蛋白質（FLAG— KPNA1、 FLAG— Luc、 MSN— V5— His)は以下の 手順により細胞内で発現後、免疫複合体として回収した。
[0066] まず、 4 X 105個の HEK293T細胞を 6cm dishに散種し、 37°C/5%CO存在下
2 にてー晚培養後、 FuGENE (Roche Diagnostics社製）を用いてトランスフエクショ ンを行った。トランスフエクシヨンしたプラスミド DNAは、 FLAG— KPNAl /pCMV、 pCMV Tag2 control, MSN-V5-His/pcDNA3. 1をそれぞれ 2 1ずつであ る。
[0067] トランスフエクシヨン後、 37°CZ5%CO存在下でさらに 2日間培養することにより個
2
々の蛋白質を細胞内で一過的に発現させた。次いで、細胞を氷冷した D— PBS (Inv itrogen社製）により洗净後、 0. 5mlの Cell Lysis Buffer (20mM Tris— HC1, pH7. 5/ 150mM NaCl/ ImM Na EDTA/ ImM EGTA/ 1 % Tri
2
ton / 2. 5mM sodium pyrophosphate/ ImM β—glycerophosphate / ImM Na VO / 1 μ g/ml Leupeptin/ ImM PMSF)に懸濁し、氷中
3 4
30分間放置した。その後、 14krpm、 10分間、 4°Cの遠心により上清を回収し、細胞 抽出液を得た。回収した細胞抽出液に 10 ΐの agarose conjugated normal m ouse IgG (SantaCruz社製）を加え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心により 上清を回収した（Pre— clean)。
[0068] この上清に FLAG— KPNA1、 FLAG— Lucの場合は、 10 /z lの anti— FLAG M2 agarose affinity gel (Sigma社製）を、 MSN— V5— Hisの場合は、 10 1の anti -V5 agarose affinity gel (Sigma社製）をカ卩え、 4°Cにて 2時間転倒混和を行い 、遠心にて agaroseを回収した。さらに Agaroseを 0. 5mlの Cell Lysis Bufferに て 2回洗浄した後、 kinase buffer (25mM Tris— HC1 pH7. 5/ 5mM β -gl ycerophosphate/ 2mM DTT/ 0. ImM Na VO / lOmM MgCl )に
3 4 2 て 2回洗净した。
[0069] 以上の操作により回収された基質蛋白質に、上記 kinase bufferに ATP (最終濃 度 10 μ Μ)、 MnCl (最終濃度 2mM)、 phosphatidyl serine (最終濃度 50 μ g/
2
ml)、 diacylglycerol (最終濃度 5 μ g/ml)、 phosphatidyl glycerol (最終濃度 0. 2mg/ml)、および 5 μ Ciの γ 32Ρ— ATPをカ卩えた反応液 24. 5 μ 1を加え、更に 精製 PKC 0 (Upstate社製）を 0. 5 1 (約 300ngに相当）を加えた。これを 30°Cに て 30分間反応させ、 SDS sample bufferをカ卩ぇ 5分間煮沸した。このサンプルを SDS PAGEにより分離後、ゲルを X線フィルムに感光しリン酸ィ匕された基質特異的 なバンドの有無を検出した。
[0070] その結果を図 2に示す。また図 5には、図 2の泳動像の一部の模式図を示す。陽性 コントロールである MSNは、 PKC Θによりリン酸化され（白抜き矢頭）、陰性コント口 ールである Luciferaseは、 PKC Θ〖こよりリン酸ィ匕されていない。この同一条件下に おいて、 KPNA1は PKC Θによりリン酸化されている（黒塗り矢頭)。なお、矢印は P KC 0の自己リン酸ィ匕を示しており、図の左側に示した数値は分子量マーカーの分 子量である（単位 kDa)。
[0071] まず全てのレーンに共通して PKC 0の自己リン酸化バンドが確認された（分子量 約 83kDa)。次いで、陽性コントロールである MSNではリン酸化バンドが認められ（ 分子量約 71kDa)、陰性コントロールである Lucではリン酸化バンドが認められない（ 分子量約 62kDa)ことから、実験系の妥当性が確認された。この条件下において、 K PNA1のリン酸化バンド（分子量約 63kDa)が確認された。このことから、 KPNA1は PKC Θのリン酸ィ匕基質であることが確認された。
[0072] 実施例 3 : KPNA1と NF— κ Βの相互作用の解析
本実験では、 KPNA1と NF— κ Βが相互作用するかどうかについて確認するため に、インビボ結合試験（in vivo binding assay)を実施した。
[0073] 3-1) NF— κ Βを構成する ρ50及び ρ65の発現プラスミドの構築
ヒト NF— κ Βは ρ50と ρ65のへテロ 2量体で構成されていることが公知である。またヒ ト ρ50は、最初に前駆体である pl05 (NCBI ;ァクセッション番号 AAA36361)として 発現し、その後細胞内で 436番目のメチォニンと 437番目ァスパラギン酸の間で切 断され、 p50となることが知られている。
[0074] ヒト p50のアミノ酸配列をコードする cDNAは、ヒト骨格筋 cDNAライブラリー（タカラ バイオ社製)を铸型に PCRを行うことにより得た。 p50取得のため PCRに用いたブラ イマ一、 p50— Nと p50— Cの配列は、配列表の配列番号 5と配列番号 6にそれぞれ示 す。なお p50— Cの配列は、 p l05の 436番目のメチォニン (ATG)の後に終止コドン である TAAが付加されるように設計してある。
[0075] ヒト p65のアミノ酸配列（NCBI；ァクセッション番号 AAA36408)をコードする cDN Aは、ヒト骨格筋 cDNAライブラリー（タカラバイオ社製)を铸型に PCRを行うことにより 得た。 p65取得のため PCRに用いたプライマー、 p65— Nと p65—Cの配列は、配列 表の配列番号 7と配列番号 8にそれぞれ示す。得られた DNA断片を、哺乳動物細 胞発現用ベクター、 pCMV Tag2A (Stratagene社製）にそれぞれ挿入した。これ により、ヒト p50を、 N末端 mycタグ付カ卩蛋白質（以下、 myc— p50)として、またヒト p6 5を、 N末端 mycタグ付加蛋白質 (以下、 myc— p65)として哺乳動物細胞内で発現 可能なプラスミド、 myc— p50/pCMVと myc— p65/pCMVを作製した。
[0076] 3— 2) KPNA1と p50および p65のインビボ結合試験（in vivo binding assay)
4 X 105個の HEK293T細胞を 6cm dishに散種し、 37°C/5%CO存在下にて
2
ー晚培養後、 FuGENE (Roche Diagnostics社製）を用いてトランスフエクシヨンを 行った。その際、 2 ;z gずつの myc— p50ZpCMVと FLAG—KPNAlZpCMV (組 み合わせ 1)、 2 μ gずつの myc— p65ZpCMVと FLAG— KPNAlZpCMV (組み 合わせ 2)および、陰性コントロールとして、 2 ;z gずつの pCMV Tag3 control (St ratagene社製）と FLAG— KPNAlZpCMV (組み合わせ 3)の 3種類のトランスフエ クシヨンを行った。
[0077] なお、組み合わせ 3に使用した pCMV Tag3 controlは、 Luciferaseを N末端 m ycタグ付加蛋白質 (以下、 myc— Luc)として発現させることが可能な発現プラスミドで ある。
[0078] トランスフエクシヨン後、 37°CZ5%CO存在下でさらに 2日間培養することにより個
2
々の蛋白質を細胞内で一過的に発現させた。次いで、細胞を氷冷した D— PBS (Inv itrogen社製）により洗净後、 0. 5mlの Cell Lysis Buffer (20mM Tris— HC1, pH7. 5/ 150mM NaCl/ ImM Na EDTA/ ImM EGTA/ 1% Tri
2
ton / 2. 5mM sodium pyrophosphate/ ImM β—glycerophosphate / ImM Na VO / 1 μ g/ml Leupeptin/ ImM PMSF)に懸濁し、氷中
3 4
30分間放置した。その後、 14krpm, 10分間， 4°Cの遠心により上清を回収し、細 胞抽出液を得た。回収した細胞抽出液に 10 ΐの agarose conjugated normal mouse IgG (SantaCruz社製）をカ卩え、 4°Cにて 30分間転倒混和した後、遠心によ り上清を回収した（Pre— clean)。
[0079] この上清に ΙΟ Ιの anti— myc agarose conjugate (SantaCruz社製）をカロえ（ myc— p50、 myc— p65、 myc— Lucの免疫沈降）、 4°Cにて 2時間転倒混和を行い、 遠心にて agaroseを回収した。さらに Agaroseを 0. 5mlの Cell Lysis Bufferにて 4回洗浄した後、 SDS sample bufferをカ卩え、 5分間煮沸後、上清を SDS— PAG Eにて分離した。その後、 c Myc (9E10) Monoclonal Monoclonal Antibody ( SantaCruz社製)を用 ヽた Western blotting【こより、 myc— p50、 myc— p65、 myc Lucが免疫沈降されていることを、また anti— FLAG M2 Monoclonal Antibo dy (Sigma社）を用いた Western blottingにより FLAG— KPNA1が共沈している かを検出した。なお、検出は ECL plus western blotting kit (Amasherm bi ◦sciences社製）を使用した。
[0080] その結果を図 3に示す。図 3には、左右 2つの泳動像を示しており、各泳動像にお けるの各レーン M、 1、 2、 3には以下に示すサンプルを電気泳動した。また、図 6には 図 3の左側泳動像のレーン 1および 2の一部の模式図を示す。 レーン M：分子量マーカー
レーン 1：組み合わせ 1をトランスフヱクシヨンさせた細胞の抽出液から、抗 myc抗体 により免疫沈降したサンプル
レーン 2 :組み合わせ 2をトランスフヱクシヨンさせた細胞の抽出液から、抗 myc抗体 により免疫沈降したサンプル
レーン 3：組み合わせ 3をトランスフヱクシヨンさせた細胞の抽出液から、抗 myc抗体 により免疫沈降したサンプル
右側泳動像（WB ; myc)は、レーン 1で myc— p50、レーン 2で myc— p65、レーン 3 で myc— Lucが免疫沈降されていることを示す（レーン 1、 2、 3における各矢印）。左 側泳動像 (WB ; FLAG)は、レーン 1では myc— p50を免疫沈降することにより、レー ン 2では myc— p65を免疫沈降することにより、 FLAG— KPNA1が共沈したことを示 す（レーン 1および 2における各矢頭)。なお、左右の各レーンの左側に示した数値は 分子量マーカーの分子量である（単位 kDa)。
[0081] まず、図 3右側泳動像（c Myc (9E 10) Monoclonal Monoclonal Antibody による Western blotting)〖こ示すように、組み合わせ 1、 2、 3にそれぞれ myc— p50 (分子量約 52kDa)、 myc— p65 (分子量約 65kDa)、 myc— Luc (分子量約 62kDa) に相当するバンドが検出されており、免疫沈降実験系の妥当性が示された。一方、 図 3左側泳動像（anti— FLAG M2 Monoclonal Antibodyによる Western bio tting)に示すように、組み合わせ 1および 2において KPNAl相当するバンド（分子 量約 63kDa)が検出されている。また陰性コントロールである組み合わせ 3において は、 KPNA1相当するバンド（分子量約 63kDa)が検出されていない。これは FLAG KPNAlが細胞内で myc— p50ならびに myc— p65と複合体を形成している事を示 している。この結果から、 KPNA1は NF— κ Bと細胞内で結合していることが確認さ れた。
[0082] 実施例 4 : KPNA1のリン酸化による NF— κ Βの転写活性の変動
PKC Θにより KPNA1がリン酸化されることで、 NF— κ Βの転写活性が影響をうけ るかどうかを、以下のようにルシフェラーゼレポーターアツセィを用いて検討した。
[0083] 4 1)実験材料 4 - 1 - 1)宿主細胞
レポーターアツセィには、宿主細胞として Jurkat, Clone E6— 1 (大日本製薬株 式会社製、以下 Jurkat細胞と記す)を使用した。 Jukrkat細胞は、ヒト急性白血病由 来の T細胞力ゝら榭立された細胞株であり、抗原認識に伴う T細胞活性化、特に IL 2 の遺伝子発現の解析のモデル細胞として一般的に使用されて ヽるものである。 Jurka t細胞で、 PKC Θ、 KPNA1および NF— κ Bは発現している。
[0084] 4-1-2)活性型 PKC Θおよび不活性型 PKC Θの哺乳動物細胞発現プラスミドの構 築
PKC Θは、調節ドメインとキナーゼドメインの 2つの領域カゝら構成されている。通常 、活性ィ匕されていない T細胞内において PKC Θはリン酸化酵素としては不活性化さ れている。それは、調節ドメインにある偽基質領域 (PKC Θ自身の基質となる配列に 類似した配列を備える領域）がキナーゼドメインの触媒クレフトに入り込み、キナーゼ 活性を阻害しているからである。しかし、 τ細胞活性ィ匕に伴い産出されるジァシルグリ セロールなどの脂質メッセンジャーが調節ドメインに結合することにより PKC Θは構 造変化を起こし、調節ドメインがキナーゼドメインカゝら離れる。これにより PKC Θはリン 酸ィ匕酵素として活性化された状態になり、 τ細胞活性ィ匕のシグナルが伝達されて行く
[0085] PKC Θは、 706アミノ酸残基力 なる力 偽基質領域内の 148番目のァラニンをグ ルタミン酸に変異させると先に述べた構造変化と同等の構造変化を起こす。従って、 この変異を持つ PKC Θ (以下、 PKC θ AEと記す）は、恒常的にリン酸化酵素として 活性ィ匕されている。また、 PKC θ AEを過剰発現させ^ Jurkat細胞では、抗原認識 などの刺激を加えなくても、 IL 2の転写活性ィ匕が起きることが知られている（Molec ular and Cellular Biology 1996 Apr; 16 (4) : 1842— 50. )。
[0086] また、 PKC Θのキナーゼドメイン内の 409番目のリジンをアルギニンに変異させると 、リン酸ィ匕酵素として不活性ィ匕されることが知られている。このリジンは、結合した AT Pの γ位のリン酸基を、リン酸化を受ける基質側水酸基に配向する役割を果たしてい る。このため、この変異を持つ PKC Θ (以下、 PKC Θ KRと記す)では、基質に対して リン酸基の受け渡しがうまく行われないため、リン酸化酵素として不活性化の状態とな り、これを過剰発現させ^ Jurkat細胞では、抗原認識などの刺激を加えても、内在性 の PKC Θがあるにも関わらず、 IL 2の転写活性ィ匕が起きないことが知られている（ Molecular and Cellular Biology 1996 Apr; 16 (4)： 1842— 50. )。
[0087] 本実験では、 PKC Θにより KPNA1がリン酸化されている状態と、リン酸化されてい ない状態それぞれについて NF— κ Bの転写活性を測定する必要があつたので、以 上の知見から PKC θ AEおよび PKC Θ KRの各発現プラスミドを作製した。
[0088] PKC θ AEおよび KRの各発現プラスミドの作製には、上記実施例 1の「PKC Θと PNA1のインビボ結合試験」に使用した PKC Θ -myc-His/pcDNA3. 1を利用し た。野生型 PKC'タンパク質をコードする DNA対し、 QuickChange Site-Direct ed Mutagenesis Kit (Stratagene社製）を用いて変異を導入し、アミノ酸配列 の 148番目のァラニンをグルタミン酸にいれたもの（以下、 PKC Θ AE-myc-His/ pcDNA3. 1と記す）、あるいは 409番目のリジンをアルギニンに変換したもの（以下 、 PKC Θ KR-myc-His/pcDNA3. 1と記す）の 2種を作製した。 PKC θ AEのァ ミノ酸配列を配列表の配列番号 9に、 PKC Θ KRのアミノ酸配列を配列表の配列番 号 10に示す。
[0089] っ 、で、 PKC θ AEおよび KRを哺乳動物細胞内でより安定して発現させることを 目的として、発現ベクターを pcDNA3. 1/myc— Hisから pCIベクター（Promega社 製）に変更した。このベクターはヒトサイトメガロウィルスのェンハンサ一/プロモータ 一の下流に、人工的に作製したイントロンを組み込んであり、これによりその下流に挿 入した遺伝子の発現をより安定かつ高レベルな状態にすることが出来る。 PKC θ AE -myc-His/pcDNA3. 1および PKC 0 KR—myc—HisZpcDNA3. 1を制限酵 素 Kpn Iと Pme Iで処理することにより、 C末端 myc— Hisタグ付きの PKC 0 AEある いは KRをコードする DNA断片をそれぞれ調製し、 pCIベクターの Kpn Iサイトと P me Iサイトの間に組み込んだ。これにより PKC θ AE— myc— HisZpCIならびに PK C Θ KR— myc— HisZpCIを得た。これを用いて C末端に myc— Hisタグが融合した P KC θ AEおよび KRを Jurkat細胞内でそれぞれ発現させた。
[0090] 4-2)トランスフエクシヨンおよびレポーターアツセィ
NF- κ Bの転写活性検出用レポータープラスミドは、 pNF— κ B— Luc (Stratagen e社製）を使用した。これはホタルルシフェラーゼをコードする DNAの上流に、 NF— κ Bが転写活性ィ匕因子として働くために必要なェンノヽンサ一配列（5 '— TGGGGAC TTTCCGC— 3 '配列番号 11)を 5回繰り返して挿入されているものである。すなわち 、レポータープラスミド pNF— κ B— Lucには、 NF- κ Βが結合する配列部位（NF— κ Β結合領域）と、この NF— κ Β結合領域の下流にレポーターとなるホタルルシフェラー ゼ遺伝子が組み込まれている。ホタルルシフェラーゼ活性が検出されれば、 NF— κ Βが NF— κ Β結合領域に結合し、転写活性ィ匕因子として作動していることが示される 。また、内部標準として phRL— TK (Promega社製）を使用した。これは単純へルぺ スウィルスのチミジンキナーゼのプロモーター配列の下流にゥミシィタケのルシフェラ 一ゼが揷入されて 、るレポータープラスミドである。
[0091] KPNA1の哺乳動物細胞内発現プラスミドは、上記「PKC Θと KPNA1のインビボ 結合試験」に使用した FLAG— KPNAlZpCMVを使用した。
[0092] また、トランスフエクシヨンする際の総 DNA量を合わせるため、 PKC θ AEや KRを 組み込むのに用いた pCIベクター、ある!/、は KPNA1をを組み込むのに用いた pCM V Tag2を用いた。なお、 NF- κ Bは細胞に内在するものを利用した。
[0093] lxlO5個の Jurkat細胞を 12ゥエルプレートに散種し、 1晚培養後、 FuGENE6 (Ro che Diagnostics社製） 3 μ 1を用いてトランスフエクシヨンを行った。トランスフエクシ ヨンに用いたプラスミド DNAは、 pNF—κ Β— Lucを 190ng、 phRL— TKを 10ng、 PK C Θ AE—myc—His/pCIあるいは PKC Θ KR— myc— His/pCIを 400ngゝ FLAG —KPNAlZpCMVと pCMV Tag2をあわせて 400ngとし、合計 1 μ gとした。 FLA G—KPNAl/pCMVは 0、 100、 200、 300、 400ngとカロえる量を変動させた。また 400ngの FLAG— KPNAlZpCMV単独の効果を見るときは、 pCIベクターを 400η g加えた。
[0094] トランスフエクシヨン後、さらに 48時間培養し、 Dual— Luciferase Reporter Ass ay System (Promega社製）を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性とゥミシィタケル シフェラーゼ活性を測定した。ついで、ホタルルシフェラーゼ活性をゥミシィタケルシ フェラーゼ活性で除することで補正値を算出した。さら〖こ、 PKC Θ KR-myc-His/ pCIを 400ngと pCMV Tag2を 400ngトランスフエクシヨンした時の補正値を 1として 、その他組み合わせにおける補正値の相対値を算出し、 NF— κ Bの転写活性に依 存して発現するホタルルシフェラーゼ活性の変動を数値ィ匕した。なお、実験は独立 に 6回行い、平均値と標準偏差も算出した。
[0095] 結果
平均値に標準偏差もあわせグラフ化した実験結果を図 7に示す。
[0096] まず、リン酸ィ匕酵素として活性ィ匕して ヽる PKC θ AEを単独で発現させることで NF κ Bの転写活性が PKC θ AE単独と比較して約 6倍にまで上昇しており、系の妥当 性が示された。また、 PKC θ AEと KPNA1を共発現させることにより、 KPNA1の発 現量の増加に伴い NF— κ Bの転写活性が上昇していることが示され、 PKC θ AE単 独に比べさらに約 6. 4倍まで上昇した。さらにこの現象は、リン酸化酵素として不活 性化している PKC Θ KRと KPNA1の共発現、ならびに KPNA1単独において全く 観察されなかった。
[0097] 以上の結果から、 KPNA1は PKC Θと結合し、かつ PKC Θによりリン酸化されるこ とにより、結果として NF— κ Bの転写活性因子としての機能が増強されることになるこ とが明ら力となった。
[0098] 以上の実施例 1から 4の結果に基づくと、 IL 2の発現経路の一つとして、次のよう な経路が存在すると考えられる。まず PKC Θにより、転写因子などを核内へ輸送する タンパク質である KPNA1がリン酸化される。 KPNA1はリン酸化されることにより、よ り効率的に NF— κ Bと複合体を形成し、この複合体によって NF— κ Bが核内へ輸送 される。そして、核内に移行した NF— κ B力 L 2遺伝子の転写を促進するという経 路が存在するものと考えられる。
産業上の利用可能性
[0099] 本発明は、バイオテクノロジー産業などで利用可能である。本発明は、医薬、生物 学的試薬などの開発'製造産業において好適である。
配列表フリーテキスト
[0100] 配列番号 1；プライマー（theta— N)
配列番号 2；プライマー（theta - C)
配列番号 3；プライマー（KPNA1 - N) 配列番号 4；プライマー（KPNA1 - C) 配列番号 5；プライマー（p50 - N) 配列番号 6；プライマー（p50 - C) 配列番号 7；プライマー（p65— N) 配列番号 8；プライマー（p65— C) 配列番号 9 ;PKC Θ AEのアミノ酸配列 配列番号 10 ;PKC Θ KRのアミノ酸配列 配列番号 11 ;NF— κ Bのェンハンサー配列

Claims

請求の範囲
[1] PKC Θと KPNAlとの相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
[2] KPNA1と NF— κ Bとの相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
[3] PKC Θと KPNA1とが相互作用可能な条件下で、 PKC Θと KPNA1と候補化合物 とを共存せしめ、 PKC Θと KPNA1との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作 用を阻害したことが示された候補ィ匕合物を選択して得られた、 PKC Θと KPNA1との 相互作用の阻害剤。
[4] 前記 PKC Θ力 恒常的なリン酸ィ匕活性を示すキナーゼである、請求項 3に記載の 阻害剤。
[5] KPNA1と NF— κ Bとが相互作用可能な条件下で、 KPNA1と NF— κ Βと候補ィ匕 合物とを共存せしめ、 KPNA1と NF—κ Βとの相互作用が生じたか否かを検定し、相 互作用を阻害したことが示された候補ィ匕合物を選択して得られた、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用の阻害剤。
[6] PKC Θと KPNA1とが相互作用可能な条件下で、 PKC Θと KPNA1と候補化合物 とを共存せしめ、 PKC Θと KPNA1との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作 用を阻害したことが示された候補ィ匕合物を阻害剤として検出する、 PKC Θと ΚΡΝΑ
1との相互作用の阻害剤を検出する方法。
[7] 前記 PKC Θ力 恒常的なリン酸ィ匕活性を示すキナーゼである、請求項 6に記載の 阻害剤を検出する方法。
[8] KPNA1と NF— κ Βとが相互作用可能な条件下で、 KPNA1と NF— κ Βと候補ィ匕 合物とを共存せしめ、 KPNA1と NF—κ Βとの相互作用が生じたか否かを検定し、相 互作用を阻害したことが示された候補ィ匕合物を阻害剤として検出する、 KPNA1と Ν
F— κ Βとの相互作用の阻害剤を検出する方法。
[9] PKC Θ供給試料と、 KPNA1供給試料とを含む、 PKC Θと KPNA1との相互作用 の阻害剤を検出するキット。
[10] 前記 PKC Θ供給試料が PKC Θをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり
、前記 KPNA1供給試料が KPNA1をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで ある、請求項 9に記載の阻害剤を検出するキット。
[11] 前記 PKC Θ力 恒常的なリン酸ィ匕活性を有するキナーゼである、請求項 9または 1
0に記載の阻害剤を検出するキット。
[12] KPNA1供給試料と、 NF- κ Β供給試料とを含む、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作 用の阻害剤を検出するキット。
[13] 前記 KPNA1供給試料が KPNA1をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで あり、前記 NF— κ Β供給試料が NF— κ Βをコードするポリヌクレオチドを含むベクタ 一である、請求項 12に記載の阻害剤を検出するキット。
[14] 医薬品の開発において、 PKC Θと KPNA1との相互作用を創薬標的とすることを 特徴とする方法。
[15] 医薬品の開発において、 KPNA1と NF— κ Βとの相互作用を創薬標的とすることを 特徴とする方法。
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