WO2004108915A1 - Agregacion especifica de bacterias mediante la expresion en superficie de proteinas de fusion - Google Patents

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culture
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    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)

Definitions

  • Bacteria frequently adhere to molecular targets through the presence of protein structures on their cell surface, with different surface binding capabilities.
  • potent adhesins found in a variety of Gram-negative pathogens can, however, be anchored directly to the outer membrane, therefore the result of this binding is an intimate contact between the target and the cell.
  • a major class of said adhesins are presented on the cell surface by a protein secretion system known as autotransporters (Henderson et al., Trends Microbiol. 1998, 6: 370-8).
  • autotransporters enteric Salmonella proteins - ⁇ hdA, MisL - (Mol. Microbiol. 2002, 43: 895-905; Infect Immunol, 2000, 68: 2720-7), Rickettsia rickettsil - rOmpA - (Microb. Pathol. 1998 , 24: 289-98), Bordetella species - pertactin, Vag8 - (Nature 1996, 381: 90-2; Infect. Immunol.
  • these proteins give the bacteria the ability to stick to surfaces, or interact with other bacteria in biofilms.
  • Three distinct domains can be identified for almost all autotransporters: an amino terminal domain, the protein that will be presented on the cell surface called the passenger domain, and a carboxy-terminal domain called transporter or ⁇ domain, which directs secretion through the outer membrane.
  • Fos and Jun are eukaryotic transcription factors that have the intrinsic ability to heterodimerize through their leucine zippers. It is known that Jun can form both heterodimers and homodimers by joining the Jun-Jun leucine zippers. Many transient polypeptides have been exposed on the cell surface fused to the ⁇ domain of different members of the autotransporter family, such as rat metallothionein (Nat. Biotechnol. 2000, 18: 661-5), the B subunit of the toxin cholera (J. Bacteriol. 1997, 794-704), ⁇ -lactamase (J. Bacteriol. 2000, 182: 3726-33), bovine adrenotoxin (J. Biotechnol.
  • fusion proteins containing the ⁇ -autotransporter domain of the Neissexia gonorxhoeae IgA protease and the leucine zippers of the eukaryotic transcription factors of Jun and Fos have not been described.
  • hybrid proteins When expressed in E. coli cells, they acquired new specific adherent properties resulting from self-association and grouping with other bacteria.
  • the adhesion properties of bacteria have been reprogrammed by exposing on their surface a hybrid protein with potential adherent activity, which binds to its counterpart in another bacterium.
  • a fusion protein which is expressed on the surface of the outer membrane of bacteria characterized in that it comprises a dimerization domain as a passing domain and a transport domain of the autotransporter family.
  • this provides a fusion protein containing the ⁇ -autotransporter domain of the Neissexia gonoxxhoeae IgA protease, and the leucine zippers of the Jun or Fos eukaryotic transcription factors (Jun ⁇ or Fos ⁇ ).
  • a fusion protein comprising the leucine zipper of the eukaryotic Jun transcription factor as a passing domain.
  • a fusion protein comprising the leucine zipper of the eukaryotic Fos transcription factor as a passing domain.
  • the fusion protein provided comprises a signal peptide that transports it to the periplasm, a dimerization domain as a passenger domain and a transporter domain of the autotransporter family.
  • the structure of hybrid proteins derived from the IgA protease of N. Gonorrhoeae is as follows, starting from the N-terminal: the PelB signal peptide (ss), which is who directs the passage of hybrid proteins to the periplasm, the passenger domain, an epitope (E-Tag) that allows immunodetection and the transport domain of the IgA protease of N. Gonoxrhoeae, which directs the secretion of the passenger domain to the medium extracellular
  • this provides a method of targeted bacterial aggregation comprising the expression, on the surface of the outer membrane of these, of a fusion protein comprising a dimerization domain as a passing domain and a transporter domain of the family of autotransporters, achieving bacterial union thanks to the formation of dimers between bacteria that express Jun ⁇ and Fos ⁇ or Jun ⁇ only.
  • this provides a method of directed bacterial aggregation comprising the expression, on the surface of the outer membrane of these, of a fusion protein comprising the ⁇ -autotransporter domain of the Neisseria gonoxxhoea IgA protease and a passenger domain selected from the group consisting of the leucine zipper of the Jun transcription factor and the leucine zipper of the Fos transcription factor, the bacterial binding being achieved thanks to the formation of dimers between bacteria expressing Jun ⁇ and Fos ⁇ or Jun ⁇ only.
  • the directed bacterial aggregation method described above comprises a culture of bacteria expressing Jun ⁇ .
  • the method of targeted bacterial aggregation comprises a culture of a mixed population of bacteria expressing Fos ⁇ and Jun ⁇ .
  • the method of targeted bacterial aggregation is that a different culture expressing Jun ⁇ is added to a culture of bacteria expressing Fos ⁇ .
  • the present invention provides a method of targeted bacterial aggregation which is achieved by the addition of an inducer that activates the expression of the Fos and Jun domains on the surface of the bacteria, these domains joining to its counterpart present in another bacterium.
  • the expression of fusion proteins in the outer membrane is controlled by the E. colj lac operon promoter. (Plac), whereby such induction can be achieved by adding IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) to the culture medium, whereby the present invention provides a method of bacterial aggregation directed by the addition of IPTG (isopropyl-beta- D-thiogalactopyranoside) for the induction of the expression of the Fos and Jun domains on the surface of the bacteria, these domains joining their counterpart present in another bacterium.
  • IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
  • the expression of fusion proteins in the outer membrane is controlled by the Pm promoter, whereby said induction can be achieved by adding 3- methyl benzoate to the culture medium, so that the present invention provides a method of directed bacterial aggregation which is achieved by the addition of 3-methyl benzoate for the induction of domain expression
  • a plasmid which comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO 5, a nucleotide sequence which has an identity greater than 80% to the nucleotide sequence SEQ ID NO 5 and nucleotide fragments of SEQ ID NO 5.
  • the plasmid expresses the fusion of the leucine zipper of fos to the ⁇ domain of the IgA protease under the control of the lac promoter.
  • the plasmid is pFos ⁇ of SEQ ID NO 5.
  • a plasmid which comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO 6, a nucleotide sequence which has an identity greater than 80% to the nucleotide sequence SEQ ID NO 6 and nucleotide fragments of SEQ ID NO 6.
  • the plasmid expresses the fusion of the leucma zipper jun to the ⁇ domain of the IgA protease under the control of the lac promoter.
  • the plasmid is pjun ⁇ of SEO ID NO 6.
  • this provides a method of targeted bacterial aggregation characterized in that a culture of bacteria containing a plasmid selected from the group consisting of plasmid pjun ⁇ , plasmid pFos ⁇ or a mixture of both, is added a sufficient amount of an inductor suitable for induction of Jun ⁇ and / or Fos ⁇ on the membrane surface
  • this provides a method of targeted bacterial aggregation characterized in that a culture of bacteria containing a plasmid selected from the group consisting of plasmid pjun ⁇ , plasmid pFos ⁇ or a mixture of both, is added a sufficient amount of IPIG for the induction of Jun ⁇ and / or Fos ⁇ on the surface of the outer membrane of said bacteria.
  • this provides a method of targeted bacterial aggregation characterized in that a sufficient amount of IPTG is added to a culture of bacteria containing the plasmid p un ⁇ for the induction of Jun ⁇ in the surface of the outer membrane of said bacteria.
  • this provides a method of targeted bacterial aggregation characterized in that a sufficient amount of IPTG is added to a culture containing bacteria containing plasmid pJun ⁇ and bacteria containing plasmid pFos ⁇ . for the induction of Jun ⁇ on the surface of the outer membrane of said bacteria.
  • a possible application of the present invention would be to collect bacteria from a suspension culture by inducing the aggregation of said bacteria in clusters that precipitate at the bottom of the solution from where they would be collected by decantation or by any other appropriate method. Aggregation is achieved by adding an inducer that activates the expression of the Fos and Jun domains on the surface of the bacteria, these domains join together and cause the bacteria to form large clusters that precipitate. This method would be
  • a variant of this method would be to add to a culture of bacteria that express Fos another distinct culture expressing Jun. In this way the precipitation would be instantaneous since it would not be necessary to wait for the expression of the domains because these are already present in the cultures separately .
  • a fusion protein comprising a passenger domain selected from the group consisting of the leucine zipper of the Jun transcription factor and the leucma zipper of the Fos transcription factor and the transporter domain of the Neisse ⁇ a gonorrhoeae igA protease in the collection of bacteria from a suspension culture inducing the aggregation of said bacteria by the addition of an inducer that activates the expression of the Fos ⁇ and Jun ⁇ domains in The surface of the bacteria.
  • the use of said fusion protein is provided where aggregation is achieved by the addition of IPTG which activates the expression of the Fos and Jun domains on the surface of the bacteria, thereby that the formation of heterodimers and / or homodimers between the domains of the leucine zippers of Jun and Fos present in different bacteria is achieved.
  • the use of said fusion protein is provided where aggregation is achieved by the addition of 3-methyl benzoate which activates the expression of the Fos and Jun domains on the surface of the bacteria , which achieves the formation of heterodimers and / or
  • Jun and Fos can be induced with 3-methyl benzoate when these domains are present in plasmids in which their expression is under the control of the Pm promoter, such as in pCNBFos ⁇ and pCNBJun ⁇ .
  • plasmids pFos ⁇ and pJun ⁇ were digested with Notl and the 1620 bp fragments containing the genes of the hybrid proteins Fos ⁇ and Jun ⁇ were cloned into pCNBl (from Lorenzo V. et al., Gene 1993, 123 (1): 17-24) digested with Notl, giving rise to plasmids pCNBFos ⁇ and pCNBJun ⁇ .
  • Fos ⁇ and Jun ⁇ were under the control of the Pm promoter, an adjustable and inducible promoter with 3-methyl benzoate.
  • this provides a method of generating fusion proteins comprising a dimerization domain as a passenger domain and a transport domain of the autotransporter family, which consists of amplification by PCR of DNA segments corresponding to dimerization domains, with suitable primers of said dimerization domains, followed by Sfil digestion and cloning of the resulting PCR products at the same site as plasmid pMT ⁇ -1.
  • a method of preparing fusion proteins comprising a passing domain selected from the group consisting of the leucine zipper of the Jun transcription factor and the leucine zipper of the Fos transcription factor and domain
  • Igiss protease transporter of Neisseria gonorrhoeae consisting of PCR amplification of the corresponding DNA segments to fos and one with the primers of SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4; to subsequently perform the Sfil digestion and cloning of the products resulting from the PCR at the same site as the plasmid pMT ⁇ -1.
  • Fig.l Structure of the Fos ⁇ and Jun ⁇ hybrid proteins.
  • A Organization of plasmid inserts pFos ⁇ and pJun ⁇ encoding the Fos ⁇ and Jun ⁇ hybrids respectively. The position of the PelB signal peptide (ss), the E-Tag epitope, the leucine zippers and the igAfi gene segments are indicated, as well as the lac (plac) promoter.
  • B Putative topology of any of the two Fos ⁇ and Jun ⁇ hybrids in the bacterial outer membrane, with its leucine zippers exposed to the external environment.
  • C Putative interactions between two bacteria expressing the Fos ⁇ and Jun ⁇ proteins.
  • M biotinylated standard proteins
  • Fig 4 Specific cell adhesion given by the interaction of the dimerization domains of leucma A zippers.
  • E colx induced cell samples expressing Fos ⁇ , Jun ⁇ or a mixture of the same number of cells from both populations (Fos ⁇ + Jun ⁇ ) were inoculated to the same DOeoo in three different sterile tubes without agitation. The photo was taken after 90 minutes.
  • the samples examined were E colx cells expressing Fos ⁇ , Jun ⁇ , HE ⁇ or a mixture of cells expressing Jun ⁇ with the same number of cells expressing Fos ⁇ (Jun ⁇ + Fos ⁇ ) or HE ⁇ (Jun ⁇ + HE ⁇ )
  • the OD was measured in samples taken at approx. lcm of the surface.
  • Fig. 5 Graphical representation of the specific adhesion of bacteria cells driven by the diic interaction of leucine zippers exposed on the bacterial surface by the autotransported machinery.
  • the enlarged image represents the self-transporting oligometric complex on the bacterial surface with the passenger domains (leucma zippers) exposed to the extracellular environment and showing adhesion to its counterpart present in another bacterium.
  • Escherxchxa coli UT5600 ( ⁇ ompT proC leu-6 trpE38 entA) containing pFos ⁇ and pJun ⁇ were incubated at 37 D C in LB agar plates containing 2% glucose and Cm (40 ⁇ g mi "1 ) or inoculated in the same liquid medium. the induction, the cultures were adjusted to an OD of 0.5 in LB liquid medium without glucose, 0.5 mM of IPTG was added and incubated for 3h at 37 ° C.
  • sequences of the one and fos leucine zippers were amplified by PCR from plasmid pJUFO, described in Gene 1993, 137: 69-75.
  • the DNA segments corresponding to fos were amplified with primers Fosl and Fos2 of SEQ ID NO 1 and SEQ ID NO 2 respectively. Primers Junl and Jun2 of SEQ ID NO 3 and SEQ ID NO 4 were similarly used for jun amplification.
  • the products resulting from the PCR were digested with Sfil and cloned into the same site of plasmid pMT ⁇ -1 (Cm r ).
  • the plasmids thus originated were called pFos ⁇ and pJun ⁇ . These express, respectively, fusions of the leucine zippers of fos and jun, to the ⁇ domain of the IgA protease under the control of the lac promoter.
  • the pHE ⁇ control plasmid expresses a fusion protein between a 6 histidine peptide and the ⁇ domain of the IgA protease.
  • sequences of plasmids pFos ⁇ and pjun ⁇ are SEQ ID NO 5 (Fig. 6) and SEQ ID NO 6 (Fig. 7), respectively
  • the bacterium was washed with PBS and fixed in the same buffer containing 3% paraformaldehyde. 80 ⁇ l of said cell suspension was placed for 1 hour on glass plates coated with poly-L-lysine (1 mg mi "1 ). The glass slides were blocked for 40 minutes in buffer B (PBS with 3% BSA) The samples were then incubated for 1 hour in the same buffer with an anti-E-tag monoclonal antibody (Amershan Pharmacia Biotech, 10 ⁇ g mi "1 ).
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Figure 2A shows the western blots corresponding to extracts of whole E. colx cells transformed with plasmids pFos ⁇ and pJun ⁇ and induced with IPTG. Bands of the expected size for hybrid proteins were clearly produced when the blots were incubated with anti-E-Tag mAb. These bands were well defined, with no indication of instability or proteolytic degradation.
  • the level of leucine-E-tag zippers on the cell surface was quantified by ELISA as follows. For intact cells, cultures of E. colx were harvested, washed in PBS and resuspended in the same buffer to a final DOgoo of 2.0. Alternatively, the bacteria were resuspended in PBS with 20 mM EDTA and used by sonication. Both intact and used cells were attached to ELISA plates (Maxisorb, Nunc) for 1 hour at room temperature. Samples were then blocked with 3% skim milk in PBS for 1 hour, rinsed in PBS and 1 ⁇ g ml " 1 of anti-E-tag monoclonal antibody was added. Plates were washed 3 times before incubation with peroxidase
  • E. coli anti-peptidoglycan rabbit serum was used at a 1: 1000 dilution, followed by treatment with a 1: 500 dilution of protein A-peroxidase conjugate (Roche).
  • Example 5 Cell aggregation assay. Liquid cultures of E. coli containing plasmids pFos ⁇ and pJun ⁇ were grown separately at a D0 60 or 0.5 and were then induced with 0.5 mM IPTG for 3 hours at 37 ° C with shaking at 180 rpm. After that, 5 ml aliquots of each culture were taken, transferred to 10 ml test tubes, and allowed to grow without stirring. 100 ⁇ l samples were taken at 20 minute intervals from the top of each tube to measure its OD 600 . Additionally, induced samples were taken for microscopic examination.
  • the D0 60 or a culture of bacteria expressing both Jun ⁇ and HE ⁇ decreased only to half of the initial OD, indicating that only part of the culture precipitates, probably corresponding to bacteria expressing Jun ⁇ . While a population of cells expressing Fos ⁇ and Jun ⁇ co-sedimented at the same levels as those corresponding to the culture expressing Jun ⁇ . This data confirmed that the precipitation of the bacteria culture expressing both Fos ⁇ and Jun ⁇ was due to heterodimeric interactions of the leucine zippers domains of Fos and Jun.
  • Figure 4C shows the microscopy images (phase contrast) of the aggregates formed by the population expressing Fos ⁇ , Jun ⁇ , and by the mixed population of cells expressing Fos ⁇ and Jun ⁇ .
  • Example 6 Expression of plasmids pCNBJun ⁇ and pCNBFos ⁇ in both Pseudomonas putxda and E. coli induced by 3- ethyl benzoate.
  • Plasmids pFos ⁇ and pJun ⁇ were digested Notl and the 1620 bp fragments containing the genes of the Fos ⁇ and Jun ⁇ hybrid proteins were cloned into pCNBl (from Lorenzo V. et al., Gene 1993, 123 (1): 17-24) digested with Notl, giving rise to plasmids pCNBFos ⁇ and pCNBJun ⁇ .
  • Fos ⁇ and Jun ⁇ was under the Pm promoter, an adjustable and inducible promoter with 3-methyl benzoate. These constructs were efficiently expressed in E. coli, strain CC118 ⁇ pir.
  • Plasmid pCNBl has a promiscuous origin of replication, R6K, which allows its replication in a wide variety of Gram-negative bacteria. It also has a transfer origin (oriT RP4) which allows its conjugation.
  • this plasmid contains a cassette with resistance to Km, the XylS activator, the Pm promoter and the proteins that are cloned under this promoter. In this case it was Fos ⁇ and Jun ⁇ .
  • the plasmid also codes for the transportase that allows the insertion of the cassette into the chromosome of the recipient bacteria.
  • the plasmid was conjugated in Pseudomonas putida KT2440, where Km and Pir s colonies were obtained. These colonies effectively expressed the Fos ⁇ and Jun ⁇ proteins from the P. putida chromosome.

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Abstract

La presente invenci6n se refiere a proteinas de fusion conteniendo el dominio (3-autotransportador de la IgA proteasa de Neisseria gonorrhoea y las cremalleras de leucina de los factores de transcripci6n eucari6ticos de Jun y de Fos, a un metodo de generacl6n de las mismas y usos de estas.

Description

TITULO
AGREGACIÓN ESPECÍFICA DE BACTERIAS MEDIANTE LA EXPRESIÓN EN
SUPERFICIE DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Las bacterias se adhieren frecuentemente a dianas moleculares mediante la presencia de estructuras proteicas sobre su superficie celular, con distintas capacidades de unión de superficie.
Algunas potentes adhesinas encontradas en una variedad de patógenos Gram-negativos pueden, sin embargo, ser ancladas directamente a la membrana externa, por lo tanto el resultado de esta unión es un íntimo contacto entre la diana y la célula.
Una clase principal de dichas adhesinas son presentadas sobre la superficie celular mediante un sistema de secreción proteica conocido como autotransportadores (Henderson et al., Trends Microbiol . 1998, 6: 370-8). Ejemplos de este tipo incluyen proteínas de Salmonella entérica - ΞhdA, MisL -(Mol. Microbiol. 2002, 43: 895-905; Infect Immunol, 2000, 68: 2720-7), Rickettsia rickettsil - rOmpA - (Microb. Pathol. 1998, 24: 289-98), Bordetella species - pertactin, Vag8 - (Nature 1996, 381: 90-2; Infect. Immunol . 1998, 66: 3985-9), H. nfluenzae - Hap, Hia, Hsf - (Infect. Immunol . 2002, 70: 4902-7; Mol. Microbiol. 2002, 46: 731-43; Microbiology 2001, 147: 250- 2) , entre otros .
Dependiendo del caso, dichas proteínas dotan a la bacteria de la habilidad de pegarse a superficies, o a interactuar con otras bacterias en biofilms. Tres dominios distintos pueden ser identificados para casi todos los autotransportadores: un dominio amino terminal, la proteína que será presentada sobre la superficie celular llamado dominio pasajero, y un dominio carboxi-terminal llamado transportador o dominio β, el cual dirige la secreción a través de la membrana externa.
Fos y Jun son factores de transcripción eucarióticos que tienen la habilidad intrínseca de heterodimerizar a través de sus cremalleras de leucinas . Es conocido que Jun puede formar tanto heterodimeros como homodímeros por unión de las cremalleras de leucinas Jun-Jun. Muchos polipéptidos pasajeros han sido expuestos sobre la superficie celular fusionados al dominio β de diferentes miembros de la familia de autotransportadores, como por ejemplo la metalotioneína de rata (Nat. Biotechnol. 2000, 18: 661-5), la subunidad B de la toxina del cólera (J. Bacteriol. 1997, 794-704), β-lactamasa (J. Bacteriol. 2000, 182: 3726-33), la adrenotoxina bovina (J. Biotechnol. 2002, 95: 257-68), la carboxilesterasa EstA de Burkholderia gladioli (J. Mol. Catal . B: Enzymatic 2002, 18: 89-97), la proteína fimbrial FimH (J. Bacteriol. 2002, 184: 4197-204), entre otros.
Hasta la fecha no han sido descritas proteínas de fusión conteniendo un dominio transportador de la familia de los autotransportadores y un dominio de dimerización.
Y en concreto, no han sido descritas proteínas de fusión conteniendo el dominio β-autotransportador de la proteasa IgA de Neissexia gonorxhoeae y las cremalleras de leucina de los factores de transcripción eucarióticos de Jun y de Fos.
Cuando dichas proteínas híbridas fueron expresadas en células de E. colí , éstas adquirieron nuevas propiedades adherentes específicas resultantes de la auto-asociación y agrupamiento a otras bacterias.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con un modo de realización de la presente invención, se han reprogramado las propiedades de adhesión de bacterias mediante la exposición en su superficie de una proteína híbrida con potencial actividad adherente, la cual se une a su contraparte en otra bacteria.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que se expresa sobre la superficie de la membrana externa de bacterias caracterizada porque comprende un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores .
De acuerdo con un modo de realización particular de la presente invención, ésta proporciona una proteína de fusión conteniendo el dominio β-autotransportador de la proteasa IgA de Neissexia gonoxxhoeae, y las cremalleras de leucina de los factores de transcripción eucarióticos Jun o Fos (Junβ o Fosβ) .
Según un modo de realización preferido de la presente invención se proporciona una proteína de fusión que comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción eucariótico de Jun como dominio pasajero.
En otro modo de realización preferido de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción eucariótico de Fos como dominio pasajero.
De acuerdo con otro modo de realización de la presente invención, la proteína de fusión proporcionada comprende un péptido señal que lo transporta al periplasma, un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores.
De acuerdo con otro modo de realización particular de la presente invención, la estructura de las proteínas híbridas derivadas de la IgA proteasa de N. Gonorrhoeae es la siguiente, empezando desde el N-terminal: el péptido señal de PelB (ss) , que es quien dirige el paso de las proteínas híbridas hacia el periplasma, el dominio pasajero, un epítopo (E-Tag) que permite la inmunodetección y el dominio transportador de la IgA proteasa de N. Gonoxrhoeae, que dirige la secreción del dominio pasajero hacia el medio extracelular .
En otro aspecto de la presente invención, ésta proporciona un método de agregación bacteriana dirigida que comprende la expresión, en la superficie de la membrana externa de éstas, de una proteína de fusión que comprende un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores, consiguiéndose la unión bacteriana gracias la formación de dímeros entre bacterias que expresan Junβ y Fosβ o Junβ únicamente.
Según otro aspecto de la presente invención, ésta proporciona un método de agregación bacteriana dirigida que comprende la expresión, en la superficie de la membrana externa de éstas, de una proteína de fusión que comprende el dominio β-autotransportador de la proteasa IgA de Neisseria gonoxxhoea y un dominio pasajero seleccionado entre el grupo consistente en la cremallera de leucina del factor de transcripción Jun y la cremallera de leucina del factor de transcripción Fos, consiguiéndose la unión bacteriana gracias la formación de dímeros entre bacterias que expresan Junβ y Fosβ o Junβ únicamente .
De acuerdo con un modo de realización preferido de la presente invención, el método de agregación bacteriana dirigida descrito anteriormente comprende un cultivo de bacterias que expresan Junβ.
De acuerdo con otro modo de realización preferido de la presente invención, el método de agregación bacteriana dirigida comprende un cultivo de una población mixta de bacterias que expresan Fosβ y Junβ.
Según otro modo de realización preferido de la presente invención, el método de agregación bacteriana dirigida consiste en que a un cultivo de bacterias que expresan Fosβ se le adiciona otro cultivo distinto expresando Junβ.
De acuerdo con otro modo de realización particular, la presente invención proporciona un método de agregación bacteriana dirigida el cual se logra mediante la adición de un inductor que activa la expresión de los dominios Fos y Jun en la superficie de las bacterias, uniéndose éstos dominios a su contraparte presente en otra bacteria.
En un modo de realización particular de la presente invención, la expresión de las proteínas de fusión en la membrana externa está controlada por el promotor del operon lac de E. colj. ( Plac) , por lo que dicha inducción puede conseguirse añadiendo IPTG (isopropil-beta-D- tiogalactopiranosido) al medio de cultivo, por lo que la presente invención proporciona un método de agregación bacteriana dirigida mediante la adición de IPTG (isopropil- beta-D-tiogalactopiranosido) para la inducción de la expresión de los dominios Fos y Jun en la superficie de las bacterias, uniéndose éstos dominios a su contraparte presente en otra bacteria.
De acuerdo con otro modo de realización particular de la presente invención, la expresión de las proteínas de fusión en la membrana externa está controlada por el promotor Pm, por lo que dicha inducción puede conseguirse añadiendo 3- metil benzoato al medio de cultivo, por lo que la presente invención proporciona un método de agregación bacteriana dirigida el cual se logra mediante la adición de 3-metil benzoato para la inducción de la expresión de los dominios
Fos y Jun en la superficie de las bacterias, uniéndose éstos dominios a su contraparte presente en otra bacteria.
Según otro modo de realización de la presente invención, se proporciona un plásmido el cual comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO 5, una secuencia de nucleótidos la cual tiene una identidad superior al 80% a la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO 5 y fragmentos de nucleotidos de SEQ ID NO 5.
En otro modo de realización particular, el plasmido expresa la fusión de la cremallera de leucina de fos al dominio β de la IgA proteasa bajo el control del promotor lac. En otro modo de realización más preferido, el plasmido es pFosβ de SEQ ID NO 5.
Según otro modo de realización de la presente invención, se proporciona un plasmido el cual comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo consistente en SEQ ID NO 6, una secuencia de nucleotidos la cual tiene una identidad superior al 80% a la secuencia de nucleotidos SEQ ID NO 6 y fragmentos de nucleotidos de SEQ ID NO 6. En otro modo de realización particular, el plásmido expresa la fusión de la cremallera de leucma de jun al dominio β de la IgA proteasa bajo el control del promotor lac.
En otro modo de realización más preferido, el plasmido es pjunβ de SEO ID NO 6.
En otro aspecto de la presente invención, ésta proporciona un método de agregación bacteriana dirigida caracterizado porque a un cultivo de bacterias que contienen un plásmido seleccionado entre el grupo formado por el plásmido pjunβ, el plásmido pFosβ o una mezcla de ambos, se le añade una cantidad suficiente de un inductor adecuado para la inducción de Junβ y/o Fosβ en la superficie de la membrana
externa de dichas bacterias.
En otro aspecto de la presente invención, ésta proporciona un método de agregación bacteriana dirigida caracterizado porque a un cultivo de bacterias que contienen un plásmido seleccionado entre el grupo formado por el plásmido pjunβ, el plásmido pFosβ o una mezcla de ambos, se le añade una cantidad suficiente de IPIG para la inducción de Junβ y/o Fosβ en la superficie de la membrana externa de dichas bacterias.
De acuerdo con un modo de realización preferido de la presente invención, ésta proporciona un método de agregación bacteriana dirigida caracterizado porque a un cultivo de bacterias que contienen el plásmido p unβ, se le añade una cantidad suficiente de IPTG para la inducción de Junβ en la superficie de la membrana externa de dichas bacterias . De acuerdo con otro modo de realización preferido de la presente invención, ésta proporciona un método de agregación bacteriana dirigida caracterizado porque a un cultivo que contiene bacterias que contienen el plásmido pJunβ y bacterias que contienen el plásmido pFosβ, se le añade una cantidad suficiente de IPTG para la inducción de Junβ en la superficie de la membrana externa de dichas bacterias.
Por lo tanto, una posible aplicación de la presente invención sería recolectar bacterias procedentes de un cultivo en suspensión induciendo la agregación de dichas bacterias en cúmulos que precipitan al fondo de la solución de donde se recogerían por decantación o por cualquier otro método apropiado. La agregación se logra mediante la adición de un inductor que activa la expresión de los dominios Fos y Jun en la superficie de las bacterias, estos dominios se unen entre sí y provocan que las bacterias formen grandes cúmulos que precipitan. Este método seria
una alternativa a los métodos al uso para recolectar bacterias basados en centrifugación o filtración.
Una variante de este método sería añadir a un cultivo de bacterias que expresan Fos otro cultivo distinto expresando Jun. De esta manera la precipitación sería instantánea ya que no habría que esperar a la expresión de los dominios porque estos están ya presentes en los cultivos por separado.
Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, ésta proporciona el uso de una proteína de fusión que comprende un dominio pasajero seleccionado entre el grupo consistente en la cremallera de leucina del factor de transcripción de Jun y la cremallera de leucma del factor de transcripción de Fos y el dominio transportador de la igA proteasa de Neisseπa gonorrhoeae en la recolección de bacterias procedentes de un cultivo en suspensión induciendo la agregación de dichas bacterias mediante la adición de un inductor que activa la expresión de los dominios Fosβ y Junβ en la superficie de las bacterias .
En un modo de realización preferido de la presente invención, se proporciona el uso de dicha proteína de fusión donde la agregación se logra mediante la adición de IPTG el cual activa la expresión de los dominios Fos y Jun en la superficie de las bacterias, con lo que se consigue la formación de heterodímeros y/o homodímeros entre los dominios de las cremalleras de leucina de Jun y de Fos presentes en bacterias distintas .
En un modo de realización preferido de la presente invención, se proporciona el uso de dicha proteína de fusión donde la agregación se logra mediante la adición de 3-metil benzoato el cual activa la expresión de los dominios Fos y Jun en la superficie de las bacterias, con lo que se consigue la formación de heterodímeros y/o
homodímeros entre los dominios de las cremalleras de leucina de Jun y de Fos presentes en bacterias distintas.
La expresión de Jun y Fos puede ser inducida con 3-metil benzoato cuando estos dominios están presentes en plásmidos en los que su expresión queda bajo el control del promotor Pm, como por ejemplo en pCNBFosβ y pCNBJunβ.
En el método de generación de dichos plásmidos se siguió el siguiente protocolo: los plásmidos pFosβ y pJunβ se digirieron con Notl y los fragmentos de 1620 pb que contienen los genes de las proteínas híbridas Fosβ y Junβ se clonaron en pCNBl (de Lorenzo V. et al., Gene 1993, 123 (1) :17-24) digerido con Notl, dando lugar a los plásmidos pCNBFosβ y pCNBJunβ.
Así, la expresión de Fosβ y Junβ quedó bajo el control de promotor Pm, un promotor regulable e inducible con 3-metil benzoato.
De acuerdo con otra forma de realización preferida de la presente invención, ésta proporciona un método de generación de proteínas de fusión que comprende un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores, el cual consiste en la amplificación por PCR de segmentos de ADN correspondientes a los dominios de dimerización, con cebadores adecuados de dichos dominios de dimerización, seguido de la digestión con Sfil y clonación de los productos resultantes del PCR en el mismo sitio que el plásmido pMTβ-1.
Según otra forma de realización aún más preferida de la presente invención, se proporciona un método de preparación de proteínas de fusión que comprende un dominio pasajero seleccionado entre el grupo consistente en la cremallera de leucina del factor de transcripción de Jun y la cremallera de leucina del factor de transcripción de Fos y el dominio
transportador de la IgA proteasa de Neisseria gonorrhoeae que consiste en la amplificación por PCR de los segmentos de ADN correspondiente a fos y un con los cebadores de SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4; para posteriormente realizar la digestión con Sfil y clonación de los productos resultantes del PCR en el mismo sitio que el plásmido pMTβ-1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Fig.l. Estructura de las proteínas híbridas Fosβ y Junβ. A. Organización de los insertos de plásmidos pFosβ y pJunβ codificando los híbridos Fosβ y Junβ respectivamente. La posición del péptido señal PelB (ss) , el epítopo E-Tag, las cremalleras de leucina y los segmentos del gen igAfi son indicados, así como el promotor lac (plac) . B. Topología putativa de cualquiera de los dos híbridos Fosβ y Junβ en la membrana externa bacteriana, con sus cremalleras de leucina expuestas al medio externo. C. Interacciones putativas entre dos bacterias expresando las proteínas Fosβ y Junβ.
Fιg.2. Expresión de Fosβ y Junβ en la cepa de E. coli
UT5600.
A. Jmmunoblot de extractos proteicos de células enteras de cultivos inducidos expresando Fosβ (1) o Junβ (2) o no transformados (3) . El £>lot fue incubado con anticuerpos monoclonales anti E-Tag. Conjugado de Streptavidina- peroxidasa fue también añadido para detectar las proteínas estándar biotiniladas (M) . B. Accesibilidad del peptidoglicano de las mismas células inducidas de E. colx . Las señales obtenidas sobre células intactas, usando un suero anti-peptidoglicano, se presentan de forma comparativa con aquellas obtenidas sobre células usadas tomado como 100%. Células de E. colx no transformadas fueron tomadas como control .
Fιg.3. Localización externa de los dominios pasajeros Fosβ y Junβ.
A. Bacteria intacta expresando Fosβ y Junβ, o no transformadas (control) fueron incubadas con anticuerpos onoclonales anti E-tag por inmunofluorescencia indirecta. La unión del anticuerpo monoclonal anti E-Tag a los epitopos de superficie expuestos fue detectada usando como anticuerpo secundario un suero anti-IgG de ratón conjugado con Cy3 (en rojo) . Esta imagen es el resultado de la superposición de la imagen de contraste, en la cual se detectan todas las bacterias, y de la imagen de inmunofluorescencia en la cual solo aquellas que expresan el antigeno sobre su superficie fueron detectadas. B. Células de E. colx expresando Fosβ y Junβ fueron incubadas (+) o no (-) con tripsina (1 μg/ml) . La digestión de los módulos expuestos de Fosβ y Junβ fue seguida por Western blots usando el anticuerpo monoclonal anti E-Tag. C. Cuantificacion de presencia de Fosβ y Junβ sobre la superficie de células intactas de E. Colx mediante ELISA. Los valores mostrados son la media de tres experimentos independientes y representan el porcentaje de la señal producida por células intactas (lavadas en PBS) con respecto al valor obtenido con un numero idéntico de células lisadas.
Fig 4 Adhesión celular especifica dada por la interacción de los dominios de dimerizacion de cremalleras de leucma A Las muestras de células inducidas de E colx que expresan Fosβ, Junβ o una mezcla del mismo numero de células de ambas poblaciones (Fos β + Junβ) fueron inoculadas a la misma DOeoo en tres tubos estériles diferentes sin agitación. La foto fue tomada después de 90 minutos. B. Cinética de Densidad Óptica (DO) de muestras tratadas como en A. Las muestras examinadas fueron células de E colx que expresan Fosβ, Junβ, HE β o una mezcla de células que expresan Jun β con el mismo numero de células que expresan Fos β (Junβ + Fosβ) o HE β (Junβ + HEβ) La DO fue medida en muestras tomadas a aprox. lcm de la superficie. La DO inicial de los cultivos, justo antes de la inducción, fue tomada como 100%. C. Las imágenes de microscopía de
contraste de fase de células inducidas de E. coli colocadas sobre el portaobjetos del microscopio sin agitación después de 90 minutos.
Fig. 5. Representación gráfica de la adherencia específica de células de bacteria conducidas por la interacción di érica de las cremalleras de leucina expuestas sobre la superficie bacteriana por la maquinaria del autotransportado .
La imagen ampliada representa el complejo oligoméπco autotransportador en la superficie bacteriana con los dominios pasajeros (cremalleras de leucma) expuestos al medio extracelular y mostrando adherencia a su contraparte presente en otra bacteria.
Fig. 6. Secuencia de pFosβ.
Fig. 7. Secuencia de pJunβ.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos ilustran un modo de realización de la presente invención, no considerándose en modo alguno limitativos de la misma.
Ejemplo 1. Preparación de los plásmidos.
Escherxchxa coli UT5600 (ΔompT proC leu-6 trpE38 entA) conteniendo pFos β y pJunβ fueron incubadas a 37 DC en placas de agar LB conteniendo glucosa 2% y Cm (40 μg mi"1) o inoculado en el mismo medio líquido. Para la inducción, los cultivos fueron ajustados a una DO^oo de 0.5 en medio líquido LB sin glucosa, se añadió 0.5 mM de IPTG y se incubó durante 3h a 37 °C.
Las secuencias de las cremalleras de leucina de un y de fos fueron amplificadas mediante PCR a partir del plásmido pJUFO, descrito en Gene 1993, 137: 69-75.
Los segmentos de ADN correspondientes a fos fueron amplificados con los cebadores Fosl y Fos2 de SEQ ID NO 1 y SEQ ID NO 2 respectivamente. Los cebadores Junl y Jun2 de SEQ ID NO 3 y SEQ ID NO 4 fueron similarmente utilizados para la amplificación de jun.
Los productos resultantes de la PCR fueron digeridos con Sfil y clonados en el mismo sitio del plásmido pMTβ-1 (Cmr) . Los plásmidos así originados fueron llamados pFos β y pJun β. Estos expresan, respectivamente, fusiones de las cremalleras de leucina de fos y de jun, al dominio β de la IgA proteasa bajo el control del promotor lac. El plásmido control pHEβ expresa una proteína de fusión entre un péptido de 6 histidinas y el dominio β de la proteasa IgA.
Las secuencias de los plásmidos pFosβ y pjunβ son SEQ ID NO 5 (Fig. 6) y SEQ ID NO 6 (Fig. 7), respectivamente
Ejemplo 2. Microscopía de Inmunofluorescencia .
Para la detección del epítopo E-Tag sobre la superficie de células de E. colx , la bacteria fue lavada con PBS y fijada en el mismo tampón conteniendo 3% de paraformaldehído. 80 μl de dicha suspensión celular fue colocado durante 1 hora sobre placas de cristal recubiertas con poli-L-lisina (1 mg mi"1). Los portaobjetos de cristal fueron bloqueados durante 40 minutos en tampón B (PBS con 3% de BSA) . Las muestras fueron entonces incubadas durante 1 hora en el mismo tampón con un anticuerpo monoclonal anti-E-tag (Amershan Pharmacia Biotech, 10 μg mi"1) Cada espécimen fue entonces lavado 5 veces con PBS y posteriormente incubado durante 1 hora con un suero anti-IgG de ratón conjugado con Cy3 (Amershan Pharmacia Biotech) diluido a 1:100 en tampón B. Las células fueron entonces examinadas con microscopio de epifluorescencia como se describe en Mol. Microbiol. 1999, 33: 1232-43.
Ejemplo 3. Western-blot
Para la monitorización de la presencia de las proteínas híbridas en extractos celulares, muestras de proteínas desnaturalizadas fueron empleadas como muestra para SDS- PAGE. Después de la electroforesis, las proteínas fueron añadidas sobre membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Immobilon-P, Millipore) e incubadas con un anticuerpo monoclonal anti-E-Tag conjugado con peroxidasa (Amershan Pharmacia) . Las membranas fueron reveladas con una reacción de quimioluminiscencia y expuestas a un film de rayos X. El análisis de accesibilidad de proteasa fue llevado a cabo como se indica en EMBO J. , 2002, 2122-31.
La figura 2A muestra los western blots correspondientes a extractos de células completas de E. colx transformadas con los plásmidos pFosβ y pJunβ e inducidas con IPTG. Bandas del tamaño esperado para las proteínas híbridas fueron claramente producidas cuando los blots fueron incubados con mAb anti E-Tag. Estas bandas eran bien definidas, sin indicación de inestabilidad o degradación proteolítica .
Ejemplo 4. ELISA
El nivel de las cremalleras de leucina-E-tag sobre la superficie celular fue cuantificado mediante ELISA del siguiente modo. Para células intactas, cultivos de E. colx fueron cosechados, lavados en PBS y resuspendidos en el mismo tampón a una DOgoo final de 2.0. Alternativamente, las bacterias fueron resuspendidas en PBS con EDTA 20 mM y Usadas por sonicación. Tanto las células intactas como las usadas fueron unidas a las placas de ELISA (Maxisorb, Nunc) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras fueron entonces bloqueadas con leche desnatada al 3% en PBS durante 1 hora, aclaradas en PBS y se añadió 1 μg mi"1 de anticuerpo monoclonal anti-E-tag. Las placas fueron lavadas 3 veces antes de la incubación con peroxidasa
conjugada con anti-ratón IgG (0.3 unidades mi"1, Boheringer Mannheim) . Los ELISA fueron revelados usando o-fenil-N- diamina (OPD, Sigma) .
Un protocolo similar fue utilizado para ensayar la accesibilidad del peptidoglicano en E. coli expresando proteínas híbridas. En este caso, un suero de conejo anti- peptidoglicano de E. coli fue utilizado a una dilución 1:1000, seguido de tratamiento con una dilución 1:500 de conjugado proteína A-peroxidasa (Roche) .
Tal y como se muestra en la Figura 2B, el mismo nivel de detección de peptidoglicano fue observado en células control de E. colx (no transformadas) que en aquellas expresando los híbridos Fosβ y Junβ. Este resultado indica que la producción de los híbridos no altera la integridad de la membrana externa.
Ejemplo 5. Ensayo de agregación celular. Cultivos líquidos de E. coli conteniendo los plásmidos pFosβ y pJunβ se crecieron separadamente a una D060o de 0.5 y entonces fueron inducidos con IPTG 0.5 mM durante 3 horas a 37 °C bajo agitación a 180 rpm. Después de ello, se tomaron alícuotas de 5 mi de cada cultivo, se transfirieron a tubos de ensayo de 10 mi, y se dejaron crecer sin agitación. Muestras de 100 μl fueron tomadas a intervalos de 20 minutos de la parte superior de cada tubo para medir su DO600. Adicionalmente, se tomaron muestras inducidas para su examen en microscopio. Al final, 15 μl de cultivos fueron depositados sobre la superficie de una placa de microscopio cubierta con una fina capa de agarosa 1% en tampón tris 50 mM pH 7.5 con el fin de inmovilizar las bacterias y se incubaron a 37 °C durante 1 hora en atmósfera saturada de agua, para posteriormente ser observados por microscopía (contraste de fase) . Tal y como se observa en la Figura 4A, 90 minutos después de la inducción células de E. colx expresando Fosβ permanecieron en suspensión, mientras que las mismas células conteniendo el plásmido pJunβ sedimentaron espontáneamente, disminuyendo rápidamente el DO600 del cultivo de 2.2 a 0.3 (Figura 4B) . Esta disminución del D060o se acompañó de un precipitado bacteriano. Precipitado que desapareció al agitar, recuperando la misma D060o que la del cultivo expresando Junβ.
Para la determinación de si la agregación observada en una mezcla de bacterias expresando tanto Junβ como Fosβ, fue debida a interacciones específicas entre las cremalleras de leucina de Fos y de Jun y no a un efecto inespecífico de las bacterias expresando Junβ, se llevó a cabo un experimento similar usando como control una proteína de fusión desprovista de cremalleras de leucina (HEβ) . Esta proteína de fusión consiste en un segmento de poli-His fusionado a un dominio β de la proteasa IgA. Las células que expresaban este control, permanecieron en un estado planctónico al igual que aquellas que expresaban Fosβ (Figura 4B) . La D060o de un cultivo de bacterias expresando tanto Junβ como HEβ disminuyó tan solo a la mitad de la DO inicial, indicando que solo una parte del cultivo precipita, probablemente la correspondiente a las bacterias expresando Junβ. Mientras que una población de células expresando Fosβ y Junβ co-sedimentó a los mismos niveles que los correspondientes al cultivo expresando Junβ. Ese dato confirmó que la precipitación del cultivo de bacterias expresando tanto Fosβ como Junβ fue debido a las interacciones heterodiméricas de los dominios de las cremalleras de leucina de Fos y de Jun.
En la Figura 4C se muestran las imágenes de microscopía (contraste de fase) , de los agregados formados por la población que expresa Fosβ, Junβ, y por la población mixta de células que expresan Fosβ y Junβ.
La información relativa a la identificación de las secuencias peptídicas descritas en la presente invención, que se acompaña a la presente memoria en formato legible por ordenador, es idéntica al listado de secuencias que se presenta acompañando a la memoria.
Ejemplo 6. Expresión de los plásmidos pCNBJunβ y pCNBFosβ tanto en Pseudomonas putxda como en E. coli inducida por 3- etil benzoato.
Los plásmidos pFosβ y pJunβ se digirieron Notl y los fragmentos de 1620 pb que contienen los genes de las proteínas híbridas Fosβ y Junβ se clonaron en pCNBl (de Lorenzo V. et al., Gene 1993, 123 (1) : 17-24) digerido con Notl, dando lugar a los plásmidos pCNBFosβ y pCNBJunβ.
Así, la expresión de Fosβ y Junβ quedó bajo el promotor Pm, un promotor regulable e inducible con 3-metil benzoato. Estas construcciones se expresaron eficientemente en E. coli, estirpe CC118 λpir.
El plásmido pCNBl tiene un origen de replicación promiscuo, R6K, lo que permite su replicación en una gran variedad de bacterias Gram-negativas . Además posee un origen de transferencia (oriT RP4) lo que permite su conjugación. Además este plásmido contiene un cassette con la resistencia a Km, el activador XylS, el promotor Pm y las proteínas que se clonen bajo este promotor. En este caso fueron Fosβ y Junβ. El plásmido también codifica para la transportasa que permite la inserción del cassette en el cromosoma de las bacterias receptoras.
Se conjugó el plásmido en Pseudomonas putida KT2440, donde se obtuvieron colonias Km y Pirs. Estas colonias expresaban eficazmente las proteínas Fosβ y Junβ desde el cromosoma de P. putida .

Claims

REIVINDICACIONES
1. Proteína de fusión que se expresa sobre la superficie de la membrana externa de bacterias caracterizada porque comprende un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores.
2. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación anterior, caracterizada porque comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción eucariótico de Jun como dominio pasaj ero .
3. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción eucariótico de Fos como dominio pasajero.
4. Proteína de fusión de acuerdo con la reivindicaciones 2 a 3, caracterizada porque comprende el dominio transportador de la IgA proteasa de Neisseria gonorrhoeae .
5. Proteína de fusión que se expresa sobre la superficie de la membrana externa de bacterias según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende un péptido señal que la transporta al periplasma.
6. Proteína de fusión según la reivindicación 5, caracterizada porque el péptido señal es el de PelB.
7. Proteína de fusión que se expresa sobre la superficie de la membrana externa de bacterias, según las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque comprende el epítopo E-tag que permite su inmunodetección.
8. Plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 5 o una secuencia de nucleótidos la cual tiene una identidad superior al 80% a dicha secuencia o fragmentos de la misma que codifiquen al menos para la proteína de fusión de la cremallera de leucina de Fos y el dominio beta de la IgA proteasa.
9. Plásmido que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 6 o una secuencia de nucleótidos la cual tiene
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) una identidad superior al 80% a dicha secuencia o fragmentos de la misma que codifiquen al menos para la proteína de fusión de la cremallera de leucina de Jun y el dominio beta de la IgA proteasa.
10. Plásmido según las reivindicaciones anteriores 8 y 9, caracterizado porque la expresión de la proteína de fusión está controlada por el promotor lac o el promotor Pm.
11. Cultivo de bacterias que contiene cualquiera de los plásmidos de las reivindicaciones 8 a 10.
12. Cultivo de bacterias según la reivindicación anterior en el que la bacteria es E. coli .
13. Método de agregación bacteriana dirigida caracterizado porque comprende la expresión, en la superficie de la membrana externa de éstas, de una proteína de fusión que comprende un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores .
14. Método según la reivindicación anterior 13, caracterizado porque comprende un cultivo de bacterias que expresan Junβ .
15. Método según la reivindicación anterior 14, caracterizado porque el cultivo de bacterias contiene el plásmido pJunβ .
16. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque comprende un cultivo de una población mixta de bacterias que expresan Fosβ y Junβ .
17. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque a un cultivo de bacterias que expresan Fosβ se le adiciona otro cultivo distinto expresando Junβ.
18. Método según la reivindicaciones 16 y 17, caracterizado porque las bacterias contienen los plásmidos pFosβ o pJunβ .
19. Método de agregación bacteriana dirigida caracterizado porque dicha agregación se logra mediante la adición de un inductor que activa la expresión de los dominios Fos y/o Jun en la superficie de las bacterias .
20. Método según la reivindicación 19, caracterizado
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) porque el agente inductor es IPTG (isopropil-beta-D- tiogalactopiranosido) .
21. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque el agente inductor es 3-metil benzoato.
22. Uso de una proteína de fusión que comprende un dominio de dimerización como dominio pasajero y un dominio transportador de la familia de los autotransportadores, en la reprogramación de las propiedades de adhesión de bacterias.
23. Uso de una proteína de fusión según las reivindicaciones 2 a 7 en la recolección de bacterias procedentes de un cultivo en suspensión induciendo la agregación de dichas bacterias mediante la adición de un inductor que activa la expresión de los dominios Fos y Jun en la superficie de las bacterias.
24. Uso según la reivindicación anterior 23, caracterizado porque la agregación se logra mediante la adición de IPTG.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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Non-Patent Citations (3)

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