WO2004108160A1 - 骨形成促進増強剤及びそのスクリーニング方法 - Google Patents

骨形成促進増強剤及びそのスクリーニング方法 Download PDF

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Kohei Miyazono
Takeshi Imamura
Shingo Maeda
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Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Japanese Foundation For Cancer Research
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Definitions

  • the present invention relates to a bone formation promoting enhancer containing a compound having a TGF-j3 (transforming growth factor-) 3) selective inhibitory activity as an active ingredient, and a bone formation using TGF-j3 inhibitory activity as an index. It relates to a method for screening an acceleration enhancer. Background technology
  • Osteogenesis promoters are one of the desired medicines with the aging of society in recent years.
  • clinical bone marrow bone morphogenetic protein
  • the bone formation effect of BMP has a problem that a sufficient therapeutic effect cannot be obtained due to the action of some self-regulating mechanism.
  • endogenous inhibitors for example, see Non-Patent Documents 1 and 2).
  • BMP was discovered by Urist in 1965 as a factor inducing ectopic bone formation (see, for example, Non-Patent Document 3). After that, DNA cloning of human BMP was successful (for example, see Non-Patent Document 4), and it became possible to produce recombinant human BMP (rhBMP). It has come to be used clinically in hopes of good bone defect repair.
  • BMP is one of the molecules belonging to the TGF-superfamily, and is known to promote cartilage formation, adipogenesis and bone formation, and to inhibit muscle formation from mesenchymal progenitor cells. For example, see Non-Patent Documents 5 to 7.)
  • Ding GF regulates the proliferation and differentiation of various cells, including fibroblasts, the main constituent cell of fibrous tissue, and is an extracellular matrix essential for wound healing. 04008248
  • Patent Document 1 WO 00/61576 pamphlet
  • Patent Document 2 WO 00/172737 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Publication No. 00/162756 Pamphlet
  • Patent Document 4 WO 02/55077 Pamphlet
  • Patent Document 6 WO 02/40468 Pamphlet
  • Patent Document 7 WO 02/066462 pamphlet
  • Patent Document 8 WO 02/062794 brochure
  • Patent Document 9 WO 02/062787 Pamphlet
  • Patent Document 10 International Publication No. 02/062753 pamphlet
  • Patent Document 1 1 WO 02/062776 brochure
  • Patent Document 1 2 WO 02/062793 brochure
  • Patent Document 13 WO 00/240476 brochure
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  • Non-Patent Document 21 Saitoh M et al., "J Biol Chem. J (USA), American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1996, 271, 2769-2775.
  • Non-Patent Document 22 Imamura T et al., “Nature” (UK), published by the nature publishing group, 1997, 389, 622-626.
  • Non-Patent Document 23 I Hidden GJ et al., "Mol Cell. J (USA), American Society for Microbiology II, 2002, 10, 283-94.
  • Non-Patent Document 24 Fujii M et al., "Mol Biol Cell.” (USA), published by American Society for Cell Biology, 1999, 10, 3801-3813.
  • Non-Patent Document 25 Korchynskyi 0 et al., "J Biol Chem.” (USA), American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 277, 4883-4891.
  • Non-Patent Document 26 Ishida W et al., "J Biol Chem.” (USA), American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 275, 6075-6079
  • Non-Patent Document 27 Kusanagi K et al., "Mol Biol Cell. J (USA), American Society for Cell Biology, 2000, 11, 555-565.
  • Patent Document 28 Locklin RM et al., "J Bone Miner Res-" (USA), American Society for Bone and Mineral Research, 2001, 16, 2192-2204
  • Non-Patent Document 29 Gyo Murakami, Tetsuro Watabe, Kunio Takaoka, Kohe i Miyazono, and Takeshi Imamur a, ⁇ Cooperative Inhibition of BMP Signaling by Smurf 1 and Inhibitory Smads.J, MBC in Press, published April 4, 2003 as 10.1091 / mbc.E02-07-0441
  • Non-Patent Document 30 Inraan et al., ⁇ Mol Pharmacol ⁇ ”(USA), The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics ⁇ fT, 2002, 62, 65-74
  • Non-Patent Document 31 Fujii M et al., "Mol Biol Cell.” (US B), American Society for Cell Biology, 1999, 10, 3801-3813 Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on bone formation and found that a compound having a TGF-selective inhibitory action enhances the bone formation promoting action of BMP, thus completing the present invention.
  • Examples of the present invention include the following.
  • Osteogenesis which is administered simultaneously or sequentially with an osteogenesis promoter containing BMP as an active ingredient, and contains a compound having a TGF-j3 selective inhibitory action as an active ingredient Acceleration enhancer,
  • TGF The compound having a selective inhibitory action is 4- (4-benzo [1,3] dioxo-l-5-inole-5-pyridine-2-inole-1H-imidazole-2 —Yl) benzamide (hereinafter, referred to as compound ⁇ ), the bone formation promoting enhancer according to the above (1),
  • the “selective inhibitory action of TGF—] 3 refers to selectively inhibiting signal transduction based on TGF— stimulation.
  • “selective” refers to inhibiting signal transduction based on TGF ⁇ / 3 stimulus more predominantly than signal transduction system based on ⁇ ⁇ ⁇ stimulation.
  • the selectivity of the inhibitory action varies depending on the experimental system, conditions, etc. used, but is preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more, and even more preferably 10 times or more. preferable.
  • an inhibitory effect on a type II receptor or a type I receptor (ALK 2/3/6) involved in BMP signaling, or S Compared to the inhibitory effect of mad 1/5/8 on phosphorylation, the inhibitory effect on the type II receptor and type I receptor (ALK5) involved in TGF-j8 signal transduction or the inhibition on Smad2Z3 This means that the oxidation inhibitory action is superior.
  • both TGF—] 3 and BMP belong to the TGF—j8 superfamily, and their signaling mechanisms are similar.
  • the osteogenesis-promoting enhancer containing a compound having a TGF—] 3 selective inhibitory action exhibits a pharmacological effect by enhancing the osteogenesis-promoting action based on BMP stimulation or the like. Therefore, a compound or drug that also has a TGF-J3 inhibitory action but also has an equivalent BMP inhibitory action cannot achieve the object of the present invention.
  • the “TGF—a compound having a selective inhibitory action” includes any compound having any chemical structure as long as it has the action.
  • the compounds described in Patent Document 1 including Compound A have an action of selectively inhibiting ALK5.
  • triaryl imidazole derivatives for example, see Patent Document 2
  • pyridinyl imidazole derivatives for example, see Patent Document 3
  • imidazole cyclic acetal derivatives for example, Patent Document 4
  • Benzimidazole derivatives for example, see Patent Document 5
  • diaryl imidazole derivatives for example, see Patent Document 6
  • pyrazole derivatives for example, see Patent Documents 7 to 9
  • thiazole derivatives for example, Patent Documents 10 to 12
  • triazole derivatives for example, see Patent Document 13
  • anti-TGF-jS neutralizing antibodies for example, see Non-Patent Document 12
  • BMP refers to various subtypes of BMP and BMP family proteins, including their recombinant proteins.
  • the term “bone formation promoting agent” refers to a drug that promotes osteoblast differentiation and maturation and promotes the formation of bone cells, and examples thereof include BMP such as rhBMP. it can.
  • the term “bone formation promoting enhancer” refers to a drug that enhances the bone formation promoting action.
  • the bone formation promoting enhancer is used for the treatment of various fractures, such as 1) treatment of periodontal disease, 2) open tibia fracture, prolonged healing fracture, fracture with many bone defects, and fracture associated with osteoporosis, which are highly prone to pseudoarthrosis.
  • Bone tumor removal Osteosynthesis accompanying osteotomy such as filling bone defects after delivery, spinal fusion, bone regeneration in osteonecrotic areas such as idiopathic femoral head necrosis, and high tibia osteotomy for osteoarthritis of the knee It can be used as a drug for various operations such as osteogenesis for temporomandibular disorders and occlusion failure, and osteogenesis for skull and facial bone malformations.
  • the “screening method for an osteogenesis-promoting enhancer using TGF-inhibitory activity as an index” refers to an inhibitory activity on a type II receptor and a type I receptor (ALK5) involved in TGF-J3 signaling. All known methods such as a test and a test for examining the phosphorylation inhibitory effect of Smad2Z3 can be used for the screening method according to the present invention.
  • a method for examining TGF-induced collagen production using the amount of [ 3 H] proline taken up into cells as an index for example, see Non-Patent Document 14
  • the promoter of type I procollagen 2 chain gene A reporter assay using a cell line transfected with a chimera plasmid linked to the luciferase gene and the luciferase gene see, for example, Non-Patent Document 15.
  • the cell growth inhibitory effect of TGF-J3 was demonstrated in Mvl Lu cells.
  • Non-Patent Document 16 a method for examining cell growth inhibition by TGF_J3 (for example, see Non-Patent Documents 17 and 18), NmuMG cell differentiation (See, for example, Non-Patent Document 19), Luciferase Atssey using TGF-reporter (for example, see Non-Patent Document 20), and a method for examining the expression of target gene PAI-1 (for example, Non-patent document 21), a method for examining binding to the receptor by the cross-linking method (for example, see non-patent document 22), Western blotting using an anti-phosphorylated Smad2 / 3 antibody
  • a known method for example, see Non-Patent Document 23
  • the present invention is not limited to this.
  • TGF- It is possible to search for a more useful novel bone formation promoting enhancer that has a j3 inhibitory effect and has a low BMP inhibitory effect.
  • the “screening method for an osteogenesis-promoting enhancer using BMP inhibitory activity as an index” refers to an inhibitory activity on a type II receptor and a type I receptor (ALK 2 Z 3/6) involved in BMP signal transduction Any of the known methods, such as a test for examining phosphorylation and a test for examining the phosphorylation inhibitory effect of Smad 1/5/8, can be used for the screening method of the present invention.
  • the technique of differentiation of mesenchymal progenitor cells (such as C2C12 cells) into osteoblasts for example, see Non-Patent Document 24
  • the luciferase assay using the BMP reporter Id-1-Luc
  • Luciferase Atsushi using a BMP reporter 3GC-Luc
  • Luciferase Atsushi using a BMP reporter GCCG_Luc
  • Non-Patent Document 27 a method for examining the mRNA expression level of a target gene (such as Id-1) by real-time PCR (for example, see Non-Patent Document 28), and Xenopus.
  • Secondary axis formation assay used for example, see Non-patent Document 29
  • a method for examining binding to the receptor by the cross-linking method for example, see Non-patent Document 22
  • anti-phosphorylated Smad 1/5/5 Sutanburo Ttei ring e.g., Non-Patent Document 3 0 reference.
  • FIG. 1 is a photograph of each C2C12 cell stained with alkaline phosphatase in Test Example 1.
  • the left column is a group without addition of rhBMP-4, and the right column is a group with addition of rhBMP-4.
  • the upper row is a control group, the middle row is a group to which DMS ⁇ was added, and the lower row is a group to which compound A was added.
  • FIG. 2 shows the alkaline phos- phos of each C2C12 cell in Test Example 1.
  • FIG. 3 is a graph showing the phatase activity. The vertical axis represents argari alkaline phosphatase activity (nmol p-NP / min / mg protein).
  • FIG. 3 is a graph showing the alkaline phosphatase activity of each human mesenchymal progenitor cell in Test Example 2. The vertical axis represents the alkaline phosphatase activity (nmol p-NP / min / mg protein).
  • FIG. 4 is a photograph of human mesenchymal precursor cells stained with von Kossa in Test Example 2.
  • the left column is the group to which BMP-4 was not added, and the right column is the group to which BMP-4 was added.
  • the upper row is a control group, the middle row is a group to which DMSO was added, and the lower row is a group to which compound A was added.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of NIH image measurement of human mesenchymal progenitor cells stained with von Kossa in Test Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the real force rephosphatase activity of each C2C12 cell in Test Example 3.
  • the vertical axis represents the real force of the phospholipase activity (nmol p-NP / min / mg protein).
  • FIG. 7 is a photograph of each C2C12 cell stained with alkaline phosphatase in Test Example 4.
  • the leftmost column is a group to which 10% of FBS was added and BMP-4 was not added, and the left, 2, 3, 4, and 5 columns from the left were 2.5, 5, 10 and 20% of FBS, respectively. This is a group to which BMP-4 was added.
  • the upper row is a control group
  • the middle row is a group to which DMSO was added
  • the lower row is a group to which compound A was added.
  • FIG. 8 is a graph showing the alkaline phosphatase activity of each C2C12 cell in Test Example 4.
  • the vertical axis represents the real force rephosphatase activity (nmol p-NP / min / mg protein).
  • TG F. Among the compounds having a selective inhibitory action, those having an acidic group can be used as a drug as a free acid, but pharmaceutically acceptable salts can be obtained by known methods. It can also be used in the form of. Such salts include, for example, alkali metal salts such as sodium and potassium, and potassium salts. Alkaline earth metal salts such as lucium and the like can be mentioned.
  • TGF- ⁇ selective inhibition compounds having a basic group among compounds having an action can be used as a drug as a free base, but are more pharmaceutically acceptable than known methods It can be used in the form of a salt.
  • salts include salts of mineral acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, and phosphoric acid, acetic acid, citric acid, tartaric acid, maleic acid, succinic acid, fumaric acid, and p-toluene.
  • Salts of organic acids such as sulfonic acid, benzenesulfonic acid and methansnolefonic acid can be mentioned.
  • the compound having a TGF-] 3 selective inhibitory action can be administered simultaneously with BMP or used in combination with BMP.
  • simultaneous administration they can be administered simultaneously as separate drugs.
  • a compound having a selective inhibitory effect on TGF-J3 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and BMP are combined in one preparation. It can also be contained.
  • the term “sequential combination” means that a compound having a TGF-J3 selective inhibitory action or a pharmaceutically acceptable salt thereof and BMP are administered at regular time intervals. In the present invention, any may be administered first. The certain time interval can be determined in consideration of the kinetics of the osteogenesis promoter or the osteogenesis promoter used, and the like.
  • the drug according to the present invention comprises a pharmaceutical composition containing, as it is or in a pharmaceutically acceptable nontoxic and inactive carrier, for example, 0.01 to 99.5%, preferably 0.5 to 90%. And administered to animals, including humans.
  • the carrier one or more solid, semi-solid or liquid diluents, fillers and other prescription auxiliaries are used.
  • the drug is preferably administered in a unit dosage form.
  • the drug can be administered intravenously, orally, intraosseously, topically (eg, transdermally), or rectally, but is not limited thereto. Needless to say, it is administered in a dosage form suitable for these administration methods.
  • the amount of the active ingredient of the drug of the present invention for an adult is usually in the range of 0.1 to 100 mg / day, preferably in the range of 1 to 500 mg / day. Is common.
  • lower doses may be sufficient, and conversely, higher doses may be required. It can also be administered in 2 to 4 divided doses per day.
  • solid or liquid dosage units such as powders, powders, tablets, bran coatings, forceps, granules, suspensions, solutions, syrups, drops, sublingual tablets, etc. It can be performed depending on the dosage form.
  • Powders are manufactured by comminuting the drug to a suitable fineness. Powders are prepared by comminuting the drug to a suitable fineness and then mixing with a similarly comminuted pharmaceutical carrier such as starch, edible carbohydrates such as mannitol, and the like. Flavoring agents, preservatives, dispersing agents, coloring agents, fragrances and other substances may be mixed as necessary.
  • Capsules are prepared by filling powdered powders, powders, or tablets as described above into granules as described in the section on capsules, for example, into a capsule shell such as a gelatin capsule. It is manufactured more. Lubricants and glidants, such as colloidal silica, talc, magnesium stearate, calcium stearate, and solid polyethylene glycol are mixed with the powdered form, and The filling operation can be performed later.
  • Disintegrants and solubilizers such as carboxymethylcellulose, carboxymethyl selenololose calcium, low-substituted hydroxypropyl pilcellulose, closcanoreme rosin sodium, kanoleboxime chinorelestinum sodium, calcium carbonate, sodium carbonate Addition of umium can improve the efficacy of the medicament when the capsule is taken.
  • a fine powder of the drug can be suspended and dispersed in vegetable oil, polyethylene glycol, glycerin, and a surfactant, and this can be wrapped in a gelatin sheet to form a soft capsule. Tablets are mixed with excipients to make a powder mixture, granulated or sluged, and then added with a disintegrant or lubricant to make tablets. It is manufactured by Powder mixtures can be obtained by mixing the appropriately powdered drug with the diluents and bases mentioned above and, if necessary, a binder (eg, carboxymethinoresenorelose sodium, methinoresenorelose, hydroxyprod).
  • a binder eg, carboxymethinoresenorelose sodium, methinoresenorelose, hydroxyprod
  • a binder for example, syrup, starch paste, arabian gum, cellulose solution or polymer solution, stirred and mixed, dried and pulverized into granules.
  • a binder for example, syrup, starch paste, arabian gum, cellulose solution or polymer solution
  • the granules thus produced can be prevented from adhering to each other by adding a lubricant such as stearic acid, stearate, talc, mineral oil or the like.
  • a lubricant such as stearic acid, stearate, talc, mineral oil or the like.
  • the lubricated mixture is then tableted. Film coating and sugar coating can be applied to the uncoated tablets thus produced.
  • the drug may be directly tableted after mixing with a fluid inert carrier without going through the steps of granulation and slag formation as described above.
  • Transparent or translucent protective coatings consisting of shellac hermetic coatings, coatings of sugar or polymeric materials, and polishing coatings made of wax may also be used.
  • oral dosage forms such as solutions, syrups, elixirs and the like can also be made in dosage unit form so that a given quantity contains a fixed amount of the drug.
  • Syrup is produced by dissolving the drug in an appropriate aqueous flavor solution
  • elixir is produced by using a non-toxic alcoholic carrier.
  • Suspensions are formulated by dispersing the drug in a non-toxic carrier.
  • Solubilizers and emulsifiers eg, ethoxylated isostearyl alcohols, polyoxyethylene sorbitol esters
  • preservatives eg, palmit oil, saccharin
  • flavor enhancers eg, palmit oil, saccharin
  • dosage unit formulations for oral administration may be microencapsulated.
  • the formulation can also provide an extended period of action or sustained release by coating or embedding in a polymer, wax, or the like.
  • Intra-tissue administration was intended for subcutaneous, intramuscular or intravenous injection. It can be carried out by using a liquid dosage unit form such as a solution / suspension form. These consist of suspending or dissolving a fixed amount of the drug in a non-toxic liquid carrier suitable for the purpose of injection, such as an aqueous or oily medium, and then sterilizing the suspension or solution. Manufactured. Non-toxic salts or salt solutions may be added to make the injection solution isotonic. Further, stabilizers, preservatives, emulsifiers and the like can be used in combination. .
  • BMP is used as a preparation adsorbed on a carrier such as biodegradable matrix or porous particles and implanted into a treatment site, but the drug according to the present invention is the same. Alternatively, it can be used by adsorbing it on another carrier.
  • the drug may be a solid soluble or insoluble in low melting point water, such as polyethylene glycol, cocoa butter, semi-synthetic fats and oils (such as Witebsol®), higher esters (such as myristyl palmitate). Esters) and suppositories produced by dissolving or suspending them in a mixture thereof can be used.
  • low melting point water such as polyethylene glycol, cocoa butter, semi-synthetic fats and oils (such as Witebsol®), higher esters (such as myristyl palmitate).
  • Esters and suppositories produced by dissolving or suspending them in a mixture thereof can be used.
  • C2C12 cells (American Type Culture Collection) were prepared by adding Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 5% of fetal serum (FBS) (control) and 0.01% dimethylsulfoxide (DMS0) to the same medium (DMSO (DMSO)). 0.01%)) and 50 ng / ml recombinant ⁇ human BM P-4 (rhBM P-4) in the same medium (compound ⁇ (1 ⁇ ⁇ )) supplemented with 1 ⁇ M of compound ⁇ The cells were cultured without addition. After culturing each cell for 9 days, alkaline phosphatase (ALP) staining Then, the cells were stained with No.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal serum
  • DMS0 dimethylsulfoxide
  • rhBM P-4 50 ng / ml recombinant ⁇ human BM P-4
  • hMSCs Human mesenchymal progenitor cells
  • control serum-free medium
  • DMS0 the same medium
  • DMS0 the same medium
  • DMS0 the same medium
  • DMS0 the same medium
  • 1 / M The cells were cultured in the same medium (compound ⁇ (1 ⁇ )) supplemented with compound A, with or without the addition of 50 ng / ml 1-h BMP-4.
  • Quantitative analysis of ALP activity was performed in the same manner as in Test Example 1. Calcium retention was visualized and measured by the von Kossa method.
  • each cell was fixed with phosphate buffered saline (PBS) containing 3% glutaraldehyde, and washed with PBS and distilled water.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the immobilized cells were exposed to 2.5% silver nitrate for 60 minutes while irradiating with light, then washed and developed with 0.5% hydroquinone for 2 minutes. Excess silver was washed away with a 5% sodium thiosulfate solution.
  • Test Example 3 JP2004 / 008248
  • Fig. 6 shows the results.
  • the anti-TGF—] 3 neutralizing antibody (Ab) as in Test Example 1, enhanced the osteogenesis promoting effect of rhBMP-4 stimulation. From the above results, it is clear that inhibition of TGF-] 3 enhances the bone differentiation promoting effect of BMP.
  • This ratio of mixed powder is compressed into tablets by the usual method for internal use.
  • the bone formation promoting enhancer according to the present invention enhances the bone differentiation promoting action by co-administration or concurrent administration with a bone formation promoting agent containing BMP. Better utility can be expected when using a formation promoter.
  • a novel method for screening a bone formation promoting agent it is useful in the search for clinically desired drugs.

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Abstract

ＢＭＰの骨形成促進剤としての効果を向上させる優れた骨形成促進増強剤を提供することにある。また、新規な骨形成促進増強剤の探索を行うためのスクリーニング方法を提供することにある。ＢＭＰを有効成分として含有する骨形成促進剤と同時投与又は逐次投与されるものであって、ＴＧＦ−β選択的阻害作用を有する化合物を有効成分として含有する骨形成促進増強剤に関するものである。また、ＴＧＦ−β阻害作用を指標とする、骨形成促進増強剤のスクリーニング方法に関するものである。

Description

明 細 書 骨形成促進増強剤及びそのスタ リーニング方法 技術分野
本発明は、 T G F - j3 (transforming growth factor- )3 ) 選択的阻害 作用を有する化合物を有効成分と して含有する骨形成促進増強剤、 及び、 T G F — j3阻害作用を指標とする、 骨形成促進増強剤のスク リ ーニング 方法に関する。 . 背景技術
骨形成促進剤は、 近年の社会の高齢化に伴い、 所望されている医薬の 一つであり、 現在、 臨床 ίこおレヽて【ま B M P (bone morphogenet i c protein) 等が用いられている。 しかしながら、 B M Pの骨形成作用には、 なんら かの自己制御機構が働く ため十分な治療効果が得られないという問題が ある。 その原因は明らかではないが、 移植部位からの B M Pの速やかな 消失や負のフィー ドバック機構、 内因性の阻害物質の存在が疑われてい る （例えば、 非特許文献 1 〜 2参照。）。
B M Pは、 1 9 6 5年に Urist によ り異所性の骨形成を誘導する因子 と して発見された （例えば、 非特許文献 3参照。）。 その後、 ヒ ト B M P の D N Aクローエングが成功し （例えば、 非特許文献 4参照。）、 遺伝子 組換え型ヒ ト B M P ( r h B M P ) の製造が可能になったこ とから、 よ り短時間で効率のよい骨欠損の修復を期待して臨床応用されるよ う にな つた。 B M Pは、 T G F — スーパーファ ミ リーに属する分子の一つで あり 、 軟骨形成、 脂肪形成及び骨形成を促進し、 間葉系前駆細胞からの 筋形成を阻害すること等が知られている （例えば、 非特許文献 5〜 7参 照。）
丁 G F — は、 線維組織の主たる構成細胞である線維芽細胞を始めと する各種細胞の増殖分化を調節し、 かつ創傷の治癒に不可欠な細胞外マ 04008248
ト リ ッタ スの産生沈着を調節する作用を有することが知られている。 一 方、 T G F— 0の骨に対する作用に関しては不明な点が多く 、 骨形成に 促進的に働く とする報告 （例えば、 非特許文献 8， 9参照。） と抑制的に 働く とする報告 （例えば、 非特許文献 1 0， 1 1参照。） がある。
特許文献 1 国際公開第 00/61576号パンフ レツ ト
特許文献 2 国際公開第 00/172737号パンフ レツ ト
特許文献 3 ■際公開第 00/162756号パンフ レツ ト
特許文献 4 国際公開第 02/55077号パンフ レツ ト
特許文献 5 - 国際公開第 00/240467号パンフ レツ ト
特許文献 6 国際公開第 02/40468号パンフ レツ ト
特許文献 7 国際公開第 02/066462号パンフ レツ ト
特許文献 8 - 国際公開第 02/062794号パンフ レツ ト
特許文献 9 国際公開第 02/062787号パンフ レツ ト
特許文献 1 0 ； 国際公開第 02/062753号パンフ レツ 卜
特許文献 1 1 国際公開第 02/062776号パンフ レツ 卜
特許文献 1 2 国際公開第 02/062793号パンフ レツ 卜
特許文献 1 3 国際公開第 00/240476号パンフ レツ 卜
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非特許文献 3 1 ： Fujii M ら， 「Mol Biol Cell.」 （米 B ) , American Society for Cell Biology発行， 1999, 10， 3801 - 3813 発明の開示
本発明の目的は、 B M Pの骨形成促進剤と しての効果を向上させる優 れた骨形成促進増強剤を提供することにある。 また、 新規な骨形成促進 増強剤の探索を行うためのスク リーニング方法を提供することにある。
本発明者らは骨形成について鋭意検討したところ、 T G F— 選択的 阻害作用を有する化合物が、 B M Pの骨形成促進作用を増強することを 見出し、 本発明を完成した。
本発明と しては、 例えば、 以下のものを挙げることができる。
( 1 ) B M Pを有効成分と して含有する骨形成促進剤と同時投与又は逐 次投与されるものであって、 T G F— j3選択的阻害作用を有する化合物 を有効成分と して含有する骨形成促進増強剤、
( 2 ) T G F— 選択的阻害作用を有する化合物が 4- (4-ベンゾ [1， 3]ジ ォキソ一ルー 5—ィノレ— 5—ピリ ジン— 2—ィノレ- 1H—ィ ミ ダゾ一ル- 2—ィル）ベン ズアミ ド （以下、 化合物 Αという。） である、 前記 （ 1 ) 記載の骨形成促 進増強剤、
( 3 ) T G F— ]3阻害作用を指標とする、 骨形成促進増強剤のスク リー ニング方法、
( 4 ) T G F— ]3阻害作用及び B M P阻害作用を指標とする、 骨形成促 進増強剤のスク リーニング方法。
以下に本発明を詳述する。
本発明において 「 T G F— ]3選択的阻害作用」 とは、 T G F— 刺激に 基づく シグナル伝達を選択的に阻害するこ とをいう。 ここで 「選択的」 とは、 Β Μ Ρ刺激に基づく シグナル伝達系よ り も優位に T G F— /3刺激 に基づく シグナル伝達を阻害することをいう。 該阻害作用の選択性は、 用いる実験系、 条件、 等によって異なるが、 3倍以上であることが好ま しく、 5倍以上であることがよ り好ましく 、 1 0倍以上であることが更 に好ましい。
より具体的には、 B M Pシグナル伝達に関わるタイプ I I レセプター、 タイプ I レセプター （A L K 2 / 3 / 6 ) に対する阻害作用、 又は、 S m a d 1 / 5 / 8のリ ン酸化抑制作用に比べて、 T G F — j8 シグナル伝 達に関わるタイプ I I レセプター、 タイプ I レセプター （A L K 5 ) に' 対する阻害作用、 又は、 S m a d 2 Z 3に対する リ ン酸化抑制作用の方 が優位であることをいう。
T G F — ]3 と B M Pは共に T G F — j8 スーパーフ ァ ミ リーに属し、 そ のシグナル伝達機構も近似する。 本発明において、 T G F — ]3選択的阻 害作用を有する化合物を含有する骨形成促進増強剤は、 B M P刺激等に 基づく骨形成促進作用を増強することによって薬効を示すものである。 従って、 T G F — J3阻害作用も有しているが、 同等の B M P阻害作用も 有している化合物 · 薬剤は、 本発明の目的を達成し得ない。
本発明において 「 T G F — 選択的阻害作用を有する化合物」 と して は、 該作用を有していれば、 いかなる化学構造の化合物も本発明に含ま れる。 例えば、 化合物 Aを含む特許文献 1記載の化合物は A L K 5 を選 択的に阻害する作用を有することが知られている。 他に、 ト リアリール イ ミダゾール誘導体 （例えば、 .特許文献 2参照。）、 ピ リ ジニルイ ミダゾ ール誘導体 （例えば、 特許文献 3参照。）、 ィ ミダゾールサイク リ ックァ セタール誘導体 （例えば、 特許文献 4参照。）、 ベンズイ ミダゾール誘導 体 （例えば、 特許文献 5参照。）、 ジァリールイ ミダゾール誘導体 （例え ば、 特許文献 6参照。）、 ピラゾール誘導体 （例えば、 特許文献 7〜 9参 照。）、 チアゾール誘導体 （例えば、 特許文献 1 0〜 1 2参照。）、 ト リ ア ゾール誘導体 (例えば、 特許文献 1 3参照。）、 抗 T G F — jS中和抗体 （例 えば、 非特許文献 1 2参照。） を挙げることができる。 更に、 学会発表さ れた化合物 ( 3 - (ピ リ ジン一 2 —ィル） - 4 - ( 7 —エ ト キシキノ リ ンー 4 一ィル） ピラ ゾール、 3 _ ( 2 —プロ ピルピ リ ジン一 6 _ィル） 一 4 一 (キノ リ ン一 4 _ィル) ピラ ゾ一ル、 3 一 ( 2 —メ チルピ リ ジン — 6 —ィル） 一 4 一 ( 7 —エ ト キシキノ リ ンー 4 一ィル） ピラゾ一ル、 3 - (ピリ ジン一 2 —ィル） 一 4 一 (キノ リ ン一 4 一ィル) ピラ ゾ一ル、 3 一 ( 2 —メ チルピ リ ジン一 6 —ィル） - 4 - ( 6 — ト リ フルォロ メ ト キシキノ リ ン一 4 一ィル） ピラゾール、 3 — ( 2 —メ チルピ リ ジン一 6 —ィル） 一 4一 （ 6—ク ロ 口 キノ リ ン一 4—ィル） ピラ ゾール、 3— ( 2 一メ チルピリ ジン一 6—ィル） 一 4— ( 7—ク ロ 口 キノ リ ン一 4—ィル） ピラ ゾール、 3— （ 3—エ ト キシフエニル） 一 4一 （ 7—エ ト キシキノ リ ン一 4一ィル） ピラ ゾール、 5— ヒ ドロ キシメ チルー 3— （ピ リ ジン 一 2—ィル） 一 4— (キノ リ ン一 4—ィ ル） ピラ ゾ一ル、 5 — （ 2— フ エネチル） 一 3— (ピ リ ジン一 2—ィル） 一 4— (キノ リ ン一 4—ィル） ピラ ゾール、 3— （ 3— ト リ フルォロ メ チルフエニル） 一 4一 （キノ リ ン一 4一ィ ル） ピラ ゾーノレ、 3— （ 3—プロモ フ エ 二ノレ） 一 4一 ( 7 - メ チルキノ リ ン _ 4一ィル） ピラ ゾール、 3 — （ 2—メ チルピ リ ジン一 6—ィル） 一 4— ( 4ー ヒ ドロ キシフエニル） ピラ ゾール、 5—メ チル - 3 - ( 2—メ チル.ピ リ ジン一 6—ィノレ） 一 4一 （ 4ーフノレオロ フェニ ル） ピラ ゾール、 3 — （ 2 —ェチルピ リ ジン一 6 —ィル） 一 4一 （ 4 — フルオロ フェニル） ピラ ゾ一ル、 3— ( 2— メ チノレピ リ ジン一 6—ィノレ） — 4一 （ 4一フルオロ フェニル） ピラ ゾ一ル、 3— ( 2—メ チルピ リ ジ ンー 6—ィル) 一 4一 ( 2， 4ージク ロ 口 フエニル） ピラ ゾ一ル、 3 — ( 2—メ チルピ リ ジン一 6 —ィル） — 4一 （ 3 , 4— ジフルオロ フェニ ノレ） ピラ ゾール、 3 一 (ピリ ジン一 2—ィノレ） 一 4一 （ 4一フルオロ フ ェニル） ピラゾール） （例えば、 非特許文献 1 3参照。） も挙げられる。 本発明において 「BM P」 とは、 BM Pの種々のサブタイプ、 及び、 それらの遺伝子組換えタンパク質を含む、 B M Pファ ミ リーのタンパク 質をいう。 例えば、 BM P— 2 / 3 / 4 / 5 Z 6 /, 7 Z 8、 G D F (増殖 分ィ匕因子 ： growth-differentiation factor) - 5 , 6 , 7及ぴそれらの 遺伝子組換えタンパク質等を例と して挙げることができる。
本発明において 「骨形成促進剤」 とは、 骨芽細胞の分化 · 成熟等を促 進し、 骨細胞の形成を促進する薬剤をいい、 例えば、 r h BM P等の B M Pを例に挙げることができる。 また、 「骨形成促進増強剤」 とは、 骨形 成促進作用を増強する薬剤をいう。 骨形成促進増強剤は、 ①歯周病の治 療、 ②偽関節形成の確率が高い脛骨解放骨折、 遷延治癒骨折、 骨欠損の 多い骨折、 骨粗鬆症に伴う骨折、 等の種々の骨折の治療や、 ③骨腫瘍摘 出後の骨欠損の充填、 脊椎固定術、 特発性大腿骨頭壊死症など骨壊死部 の骨再生、 変形性膝関節症に対して行う高位脛骨骨切り術などの骨切り 術に伴う骨接合術、 顎関節症や咬合不全における骨形成術、 頭蓋骨 · 顔 面骨奇形における骨形成術、 等の種々の手術に用いる薬剤と して用いる ことができる。
本発明において 「 T G F— 阻害作用を指標とする、 骨形成促進増強 剤のスク リーニング方法」 とは、 T G F— J3 シグナル伝達に関わるタイ プ I I レセプター、 タイプ I レセプター （A L K 5 ) に対する阻害作用 を調べる試験や S m a d 2 Z 3 のリ ン酸化阻害作用を調べる試験等、 公 知の方法は全て本発明にかかるスク リーユング方法に用いることができ る。 例えば、 [3H]プロ リ ンの細胞内取り込み量を指標と した T G F— 誘発コラーゲン産生を調べる方法 （例えば、 非特許文献 1 4参照。）、 タ ィプ I プロコラーゲンひ 2鎖遺伝子のプロモーター領域とルシフェラー ゼ遺伝子を連結させたキメ ラプラスミ ドを導入した細胞株を用いたレポ 一ターアツセィ (例えば、 非特許文献 1 5参照。）、 T G F— J3 の細胞増 殖抑制作用を Mv l Lu細胞でみる [3H]チミジン取り込みアツセィ （例えば、 非特許文献 1 6参照。）、 T G F _ J3による細胞増殖抑制を調べる方法（例 えば、 非特許文献 1 7、 1 8参照。）、 NmuMG細胞の分化を調べる方法 （例 えば、 非特許文献 1 9参照。）、 T G F— レポーターを用いたルシフェ ラーゼアツセィ （例えば、 非特許文献 2 0参照。）、 標的遺伝子 PAI- 1 の 発現を調べる方法 （例えば、 非特許文献 2 1参照。）、 ク ロ スリ ンキング 法による レセプターへの結合を調べる方法 （例えば、 非特許文献 2 2参 照。）、 抗リ ン酸化 S m a d 2 / 3抗体を用いたウェスタンブロ ッテイ ン グ （例えば、 非特許文献 2 3参照。） が知られているが、 これらに限定さ れるものではない。
これらのスク リーニング方法を用いることによ り、 T G F— 阻害作 用を有する新規骨形成促進増強剤を探索することができる。
さ らに、 これらのスク リーニング方法と、 以下に説明する B M P阻害 作用を指標とするス ク リ一ユング方法と併用することによ り 、 T G F— j3阻害作用を有し、 BM P阻害作用の少ない、 よ り 有用性の高い新規骨 形成促進増強剤を探索する こ とができる。
本発明において 「 B M P阻害作用を指標とする、 骨形成促進増強剤の スク リ ーニング方法」 とは、 B M Pシグナル伝達に関わるタイプ I I レ セプター、 タイプ I レセプター （A L K 2 Z 3 / 6 ) に対する阻害作用 を調べる試験や S m a d 1 / 5 / 8の リ ン酸化抑制作用を調べる試験等、 公知の方法は全て本発明にかかるス ク リ一二ング方法に用いるこ とがで きる。 例えば、 間葉系前駆細胞 （C2C12細胞など） の骨芽細胞への分化の アツセィ （例えば、 非特許文献 2 4参照。）、 B M Pの レポーター （Id- 1- Luc)を用いたルシフェラーゼアツセィ （例えば、非特許文献 2 5参照。）、 BMPのレポーター （3GC- Luc) を用いたルシフェラーゼアツセィ （例え ば、 非特許文献 2 6参照。）、 BM Pの レポーター （GCCG_Luc) を用いた ルシフェラーゼアツセィ （例えば、 非特許文献 2 7参照。）、 標的遺伝子 ( Id- 1など） の mRNA発現量をリ アルタイム P C Rによ り調べる方法 （例 えば、 非特許文献 2 8参照。）、 Xenopus を用いた 2次軸形成検定 （例えば、 非特許文献 2 9参照。）、 ク ロス リ ンキング法による レセプターへの結合 を調べる方法 （例えば、 非特許文献 2 2参照。）、 抗リ ン酸化 S m a d 1 / 5ノ 8抗体を用いたウェスタンブロ ッテイ ング （例えば、 非特許文献 3 0参照。） が知られているが、 これらに限定されるものではない。
本発明にかかるスク リ ーニング方法の実験手法自体は公知であるが、 骨形成促進増強剤の探索のためのスク リ ーニング方法と して利用可能で あることは、 本発明者らが初めて見出した知見である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 試験例 1 において、 各 C2C12 細胞をアルカ リ ホスファタ一 ゼ染色した写真の図である。 左列は r h BM P— 4を添加していない群、 右列は r h B M P— 4を添加した群である。 また、 上段は対照群、 中段 は DM S〇を添加した群、 下段は化合物 Aを添加した群である。
第 2図は、 試験例 1 において、 各 C2C12 細胞のアルカ リ アルカ リ ホス ファターゼ活性をグラフ化した図である。 縦軸はアルガリ アルカ リ ホス ファターゼ活性 ( nmol p-NP/min/mg protein) を表す。 . 第 3図は、 試験例 2 において、 各ヒ ト間葉系前駆細胞のアルカ リ アル 力 リ ホスファターゼ活性をグラフ化した図である。 縦軸はアル力 リ アル カ リ ホスファターゼ活性 (nmol p-NP/min/mg protein) を表す。
第 4図は、 試験例 2において、 ヒ ト間葉系前駆細胞を von Kossa染色 した写真の図である。 左列は B M P— 4 を添加していない群、 右列は B M P— 4 を添加した群である。 また、 上段は対照群、 中段は DM S Oを 添加した群、 下段は化合物 Aを添加した群である。
第 5図は、 試験例 2 において、 von Kossa染色したヒ ト間葉系前駆細 胞を NIH image測定した結果をグラフ化した図である。
第 6図は、 試験例 3 において、 各 C2C12 細胞のアル力 リ アル力 リ ホス ファターゼ活性をグラフ化した図である。 縦軸はアル力 リ アル力 リ ホス ファターセ活 ^ nmol p-NP/min/mg protein) を表す。
第 7図は、 試験例 4において、 各 C2C12 細胞をアル力 リ ホスファタ一 ゼ染色した写真の図である。 最左列は F B S を 1 0 %添加し、 かつ、 B M P— 4 を添加していない群、 左から 2、 3、 4、 5列はそれぞれ F B Sを 2. 5、 5、 1 0、 2 0 %添カ|]し、 力 つ、 B M P— 4 を添加した群 である。 また、 上段は対照群、 中段は DM S Oを添加した群、 下段は化 合物 Aを添加した群である。
第 8図は、 試験例 4において、 各 C2C12 細胞のアルカ リ アルカ リ ホス ファターゼ活性をグラフ化した図である。 縦軸はアル力 リ アル力 リ ホス ファターゼ活性 (nmol p-NP/min/mg protein) を表す。
発明を実施するための最良の形態
T G F.— 選択的阻害作用を有する化合物の中で酸性基を有する もの は、 遊離の酸のまま薬剤と して用いるこ とができるが、 公知の方法によ り 医薬上許容し う る塩の形にして用いる こ と もでき る。 このよ う な塩と しては、 例えば、 ナ ト リ ウム、 カ リ ウム等のアルカ リ金属塩、 及び、 力 ルシゥムなどのアル力 リ土類金属塩などを挙げることができる。
T G F - ^選択的阻害.作用を有する化合物の中で塩基性基を有する も のは、 遊離の塩基のまま薬剤と して用いることができるが、 公知の方法 に'より 医薬上許容しう る塩の形にして用いることもできる。 このよ う な 塩と しては、 例えば、 塩酸、 臭化水素酸、 硫酸、 燐酸などの鉱酸の塩、 酢酸、 クェン酸、 酒石酸、 マレイ ン酸、 コハク酸、 フマル酸、 p — トル エンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 メ タンスノレホン酸などの有機酸 の塩を挙げることができる。
T G F— ]3選択的阻害作用を有する化合物は、 B M P と同時に投与、 あるいは、 逐次的に併用することができる。
同時投与の場合、 別個の薬剤と して同時に投与することもでき、 また、 一つの製剤中に、 T G F— J3選択的阻害作用を有する化合物又はその医 薬上許容しう る塩と B M Pとを含有させること もできる。 逐次的併用と は、 T G F— J3選択的阻害作用を有する化合物又はその医薬上許容しう る塩と B M P とを、 一定の時間間隔をあけて投与することを意味する。 本発明においてはいずれを先に投与してもよい。 一定の時間間隔は、 用 いる骨形成促進剤や骨形成促進増強剤の動態等を考慮して決定すること ができる。
本発明に係る薬物は、 そのまま又は医薬上許容される無毒性かつ不活 性の担体中に、 例えば 0. 01〜99. 5 %、 好ましく は 0. 5〜90 %を含有する 医薬組成物と して、 人を含む動物に投与される。
担体と しては、 固形、 半固形又は液状の希釈剤、 充填剤及びその他の 処方用の助剤一種以上が用いられる。 薬物は投与単位形態で投与するこ とが望ましい。 また、 薬物は、 静脈内投与、 経口投与、 組織内投与、 局 所投与 （経皮投与等） 又は経直腸的に投与することができるが、 これら に限定されるものではない。 これらの投与方法に適した剤型で投与され るのはもちろんである。
骨形成促進増強剤と しての用量は、 疾患 · 傷害の性質と程度、 年齢、 体重などの患者の状態、 投与経路などを考慮した上で設定することが望 ましいが、 通常は、 成人に対して本発明に係る薬物の有効成分量と して、 1 日あたり 、 0. 1〜 l OO Omgノヒ ト の範囲、 好ましく は l〜 500mg /ヒ ト の 範囲が一般的である。
場合によっては、 これ以下で足り る し、 また逆にこれ以上の用量を必 要とすること もある。 また 1 日 2〜 4回に分割して投与すること もでき る。
経口投与は固形又は液状の用量単位、 例えば、 末剤、 散剤、 錠剤、 糠 衣剤、 力プセル剤、 顆粒剤、 懸濁剤、 液剤、 シロ ップ剤、 ドロ ップ剤、 舌下錠その他の剤型によって行う ことができる。
末剤は薬物を適当な細かさにすることによ り製造される。 散剤は薬物 を適当な細かさと成し、 ついで同様に細かく した医薬用担体、 例えば澱 粉、 マンニ トールのよ うな可食性炭水化物その他と混合することによ り 製造される。 必要に応じ風味剤、 保存剤、 分散剤、 着色剤、 香料その他 のものを混じてもよレ、。
カプセル剤は、 まず上述のよ うにして粉末状となった末剤や散剤又は 錠剤の項で述ぺるよ うに顆粒化したものを、 例えばゼラチンカプセルの よ うなカプセル外皮の中へ充填することによ り製造される。 滑沢剤や流 動化剤、 例えばコ ロイ ド状のシリカ、 タルク 、 ステアリ ン酸マグネシゥ ム、 ステアリ ン酸カルシウム、 固形のポリエチレングリ コールのよ う な ものを粉末状態のものに混合し、 然るのちに充填操作を行う こと もでき る。 崩壊剤や可溶化剤、 例えばカルボキシメチルセルロース、 カルボキ シメ チルセノレロースカルシウム、 低置換度ヒ ドロキシプロ ピルセルロー ス、 ク ロ スカノレメ ロースナ ト リ ウム、 カノレボキシメ チノレスターチナ ト リ ゥム、 炭酸カルシウム、 炭酸ナ ト リ ウムを添加すれば、 カプセル剤が摂 取されたときの医薬の有効性を改善することができる。
また、 薬物の微粉末を植物油、 ポ リ エチレングリ コール、 グリ セ リ ン、 界面活性剤中に懸濁分散し、 これをゼラチンシー トで包んで軟カプセル 剤とするこ とができる。 錠剤は賦形剤を加えて粉末混合物を作り 、 顆粒 化も しく はスラグ化し、 ついで崩壊剤又は滑沢剤を加えたのち打錠する ことによ り製造される。 粉末混合物は、 適当に粉末化された薬物を上述 の希釈剤やベース と混合し、 必要に応じ結合剤 （例えば、 カルボキシメ チノレセノレロースナ ト リ ウム、 メ チノレセノレロース、 ヒ ドロ キシプロ ピノレメ チノレセノレロース、 ゼラチン、 ポ リ ビニノレピロ リ ドン、 ポ リ ビニノレアノレコ ールなど）、 溶解遅延化剤 （例えば、 パラ フィ ンなど）、 再吸収剤 （例え ば、 四級塩） や吸着剤 （例えばベン トナイ ト、 カオリ ン、 リ ン酸ジカル シゥムなど） をも併用してもよい。 粉末混合物は、 まず結合剤、 例えば シロ ップ、 澱粉糊、 アラ ビア ゴム、 セルロース溶液又は高分子物質溶液 で湿らせ、 攪拌混合し、 これを乾燥、 粉砕して顆粒とすることができる。 このよ う に粉末を顆粒化するかわり に、 まず打錠機にかけたのち、 得ら れる不完全な形態のスラグを破砕して顆粒にすること も可能である。
このよ うにして作られる顆粒は、 滑沢剤と してステアリ ン酸、 ステア リ ン酸塩、 タルク、 ミネラルオイルその他を添加することによ り、 互い に付着することを防ぐことができる。 このよ うに滑沢化された混合物を ついで打錠する。 こ う して製造した素錠にフィルムコーティ ングや糖衣 を施すことができる。
また薬物は、 上述のよ う に顆粒化ゃスラグ化の工程を経るこ となく 、 流動性の不活性担体と混合したのちに直接打錠してもよい。 シェラック の密閉被膜からなる透明又は半透明の保護被覆、 糖や高分子材料の被覆、 及ぴ、 ワ ッ クスよ り なる磨上被覆の如きも用いう る。
他の経口投与剤型、 例えば溶液、 シロ ップ、 エリ キシルなどもまたそ の一定量が薬物の一定量を含有するよ う に用量単位形態にすることがで きる。 シロ ップは、 薬物を適当な香味水溶液に溶解して製造され、 また エ リ キシルは非毒性のアルコール性担体を用いることにより製造される。 懸濁剤は、 薬物を非毒性担体中に分散させることによ り処方される。 可 溶化剤や乳化剤 （例えば、 エ ト キシ化されたイ ソステア リ ルアルコール 類、 ポリオキシエチレンソルビ トールエステル類）、 保存剤、 風味賦与剤 (例えば、 ぺパミ ン ト油、 サッカ リ ン） その他もまた必要に応じ添加す ることができる。 必要とあらば、 経口投与のための用量単位処方はマイクロカプセル化 してもよい。 該処方はまた被覆をしたり 、 高分子 · ワ ッ ク ス等中にう め こんだりすることにより作用時間の延長や持続放出をもたらすこと もで きる。
組織内投与は、 皮下 · 筋肉又は静脈内注射用と した.と こ ろの液状用量 単位形態、 例えば溶液ゃ懸濁剤の形態を用いることによって行う ことが できる。 これらのものは、 薬物の一定量を、 注射の目的に適合する非毒 性の液状担体、 例えば水性や油性の媒体に懸濁し又は溶解し、 ついで該 懸濁液又は溶液を滅菌することによ り製造される。 注射液を等張にする ために非毒性の塩や塩溶液を添加してもよい。 更に、 安定剤、 保存剤、 乳化剤のよ うなものを併用することもできる。 .
また、 B M Pは、 生分解性マ ト リ ク ッスゃ多孔性粒子等の担体に吸着 させた製剤と して、 治療部位へ移植して使用されているが、 本発明に係 る薬物を同一又は別の担体に吸着させて用いることもできる。
直腸投与は、 薬物を低融点の水に可溶又は不溶の固体、 例えばポリエ チレングリ コール、 カカオ脂、 半合成の油脂 （例えば、 ウイテブゾール、 登録商標）、 高級エステル類 （例えばパルミ チン酸ミ リ スチルエステル） 及ぴそれらの混合物に溶解又は懸濁させて製造した坐剤等を用いること によって行う ことができる。
以下に試験例及び製剤例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、 本 発明はこれらのみに限定されるものではない。
試験例 1
化合物 Aを用いた骨形成促進増強作用 （ 1 )
C2C12 細胞 (American Type Culture Collection) を 5%のゥシ胎児血 清 （FBS) を含むダルベッコ変法イーグル培地 （DMEM) (対照）、 0.01%ジ メチルスルホキシド （DMS0) を加えた同培地 （DMSO(0.01%) ) 及ぴ 1 μ M の化合物 Αを加えた同培地 （化合物 Α (1μ Μ)) で、 50ng/mlの遺伝子組換 ぇヒ ト BM P— 4 ( r h BM P— 4 ) 添加及ぴ無添加で培養した。 それ ぞれの細胞を 9 日間培養した後、 アルカ リホスファターゼ （ALP) 染色キ ッ ト # 85- 3R (Sigma社） によ り染色し、 骨分化の進行度合いを調べた。 ALP活性の定量的解析は、 Fujii らの方法（例えば、非特許文献 3 1参照。） こ従レヽ、 Sigma Fast p— nitropheny 1 phosphate tablet set を用レヽて f了つ た。 各抽出物のタンパク質濃度は、 ゥシ血清アルブミ ンを標準物質と し て DC protein assay (Bio-Rad) により測定した。
その結果を第 1図及び第 2図に示す。
第 1 図に示す通り、 化合'物 Aは、 単独では C2C12 細胞の骨分化促進作 用は認められないが、 r h B M P— 4 (50ng/ml) で誘導した C2C12細胞 においては、 r h B M P— 4刺激による骨分化促進作用を増強した。 試験例 2
化合物 Aを用いた骨形成促進増強作用 （ 2 )
ヒ ト間葉系前駆細胞 ( h MSCs) (Poietics) を ITS supplement (Sigma) を含む無血清培地 （対照）、 0.01%DMS0を加えた同培地 （DMS0(0.01%)) 及 び 1 / Mの化合物 Aを加えた同培地 （化合物 Α (1μ Μ)) で、 50ng/ml の 1- h B M P - 4添加あるいは無添加で培養した。 ALP活性の定量的解析は、 試験例 1 と同様の方法で行った。 カルシウムの貯留は、 von Kossa法に よ り可視化し測定した。 即ち、 それぞれの細胞を 3%グルタルァルデヒ ド を含むリ ン酸緩衝生理食塩水 （ P B S ) で固定化し、 P B Sおよび蒸留 水で洗浄した。 固定化された細胞は、 光照射しながら 60分間 2.5%硝酸銀 を作用させた後、 洗浄し 0.5%ハイ ドロキノ ンで 2分間展開した。 過剰の 銀は 5%チォ硫酸ナト リ ゥム溶液で洗い流した。
その結果を第 3図、 第 4図及び第 5図に示す。
第 3図、 第 4図及び第 5図に示す通り、 r h B M P— 4によ り誘導さ れた ALP 活性及ぴカルシウム貯留の上昇が、 化合物 Aの添加によ り更に 亢進された。 このことからも、 化合物 Aが r h B M P— 4刺激による骨 分化促進作用を増強することは明らかである。
上記試験例 1及び 2における骨分化促進増強作用が、 化合物 A独自の 作用に基づく ものではなく 、 T G F— を選択的に阻害することによ り 生じる作用であることを明らかにすべく 、 以下の試験例 3を行った。 JP2004/008248
16 試験例 3
抗 T G F— jS 中和抗体を用いた骨形成促進増強作用
50ng/ml の r h B M P— 4 と 10 μ g/ml の抗 T G F— j3 1/2/3 中和抗体 を添加した培地、 50ng/ml の r h B M P— 4を添加した培地、 10 μ g/ml の抗 T G F— ）3 1/2/3 中和抗体を添加した培地および無添加の培地で C2C12細胞を 9 日間培養した。それぞれの細胞について試験例 1 と同様の 方法で ALP活性を測定した。
その結果を第 6図に示す。
第 6図に示す通り、 抗 T G F— ]3 中和抗体 （Ab) は、 試験例 1 ど同様、 r h B M P - 4刺激による骨分化促進作用を増強した。 以上の結果よ り 、 T G F— ]3 を阻害することによ り B M Pの骨分化促進作用が増強される ことは明らかである。
試験例 4
骨形成促進増強作用における血清濃度の影響
C2C12細胞を F B S濃度 2. 5 %、 5 %、 1 0 %、 2 0 %に調製した培 地中に、 1 /z Mの化合物 Aと 50ng/ml の で h B M P— 4を添力 Qし 9 日間培 養した。 対照と して化合物 Aの代わり に 0.01%DMS0 あるいは無添加で培 養した。 それぞれの細胞よ り試験例 1 と同様の方法で ALP 活性を測定し た。
その結果を第 7図及び第 8図に示す。
第 7図及び第 8図に示す通り、 F B S濃度が高く なるにつれ、 化合物 Aによる骨分化促進増強作用が減弱された。 この現象は、 試験例 1及ぴ 2で得られた知見よ り 、 F B Sの濃度即ち血清中の T G F— βの濃度の 上昇に伴い、 骨分化促進増強作用が減弱されたと考えられる。 このこ と からも、 化合物 Αが、 T G F— jS のシグナル伝達を選択的に阻害するこ とにより、 B M Pによる骨形成促進作用を増強することは明らかである。 製剤例 1
錠剤 （内服錠）
処方 1錠 80mg 中 化合物 A 5. Omg
トウモロ コシ澱粉 46. 6mg
結晶セノレロース 24. Omg
メ チノレセノレロース 4. Omg
ステア リ ン酸マグネシウム 0. 4mg
この割合の混合末を通常の方法により打錠成形し内服錠とする 製剤例 2
錠剤 （内服錠）
処方 1錠 80mg 中
化合物 A 5. Omg
トウモロ コシ澱粉 46. 6mg
結晶セルロース 24. Omg
メ チノレセノレロース 4. Omg
ステアリ ン酸マグネシウム 0. 4rag
この割合の混合末を通常の方法によ り打錠成形し内服錠とする 産業上の利用可能性
本発明にかかる骨形成促進増強剤は、 B M Pを含有する骨形成促進剤と 同時投与、 又は、 併用投与することによ り 、 骨分化促進作用を増強する ことから、 臨床において B M Pを含有する骨形成促進剤を使用する場合 のより 良好な有用性が期待できる。 また、 新規な骨形成促進剤のスク リ 一ユング方法を提供することにより、 臨床において所望されている医薬 の探索において有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . B M Pを有効成分と して含有する骨形成促進剤と同時投与又は逐次 投与されるものであって、 T G F— ]3選択的阻害作用を有する化合物を 有効成分と して含有する骨形成促進増強剤。
2. T G F— 選択的阻害作用を有する化合物が 4- (4 -べンゾ [1, 3]ジォ キソール- 5-ィル- 5-ピ リ ジン- 2-ィ ル- 1H-ィ ミ ダゾール -2-ィル）ベンズ アミ ドである、 請求項 1記載の骨形成促進増強剤。
3. T G F— ；3阻害作用を指標とする、 骨形成促進増強剤のスク リー二 ング方法。
4. T G F— 阻害作用及び B M P阻害作用を指標とする、 骨形成促進 増強剤のスク リ 一二ング方法。
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