WO2004104201A1 - Antifreezing protein found in fish - Google Patents

Antifreezing protein found in fish Download PDF

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Yoshiyuki Nishimiya
Ai Miura
Sakae Tsuda
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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Abstract

Eleven (11) types of antifreezing proteins obtained from junked fish Brachyopsis or Zoarces among fishes inhabited in the water area within Japan or seas close to Japan or in the water area of climate similar thereto; and their amino acid sequences and base sequences. There are further provided a process for mass production of such antifreezing proteins through genetic engineering technique using the thus obtained genes and provided a freeze concentration inhibitor or freezing-point depressant comprising these antifreezing proteins as an active ingredient.

Description

明 細 書 魚類が有する不凍タンパク質 技術分野  Description Antifreeze protein in fish
本発明は、 日本近海で捕獲される魚種であるナガガジ（Zoarces elongatus Kner)またはシチロウゥォ（Brachyopsi s rostratus (Ti lesius) )の体液及ぴすり 身から新たに調製して得られた不凍タンパク質に関するもので、 さらに該タンパ ク質のアミノ酸配列、 該タンパク質をコードする DNA、 該 DNAを含むベクター、 該 ベクターを含む形質転換体等に関する。 背景技術  TECHNICAL FIELD The present invention relates to an antifreeze protein obtained by newly preparing from body fluids and surimi of a long-tailed fish (Zoarces elongatus Kner) or a wild fish (Brachyopsi s rostratus (Ti lesius)), which are fish species captured in the waters around Japan. The present invention also relates to an amino acid sequence of the protein, a DNA encoding the protein, a vector containing the DNA, a transformant containing the vector, and the like. Background art
凍結温度域においては、 水を含むあらゆる物質 （含水物） の内部では、 自然の 法則に従い、 水分子同士だけが結びついて氷塊を形成する。 このとき水分子以外 のあらゆる物質は氷塊形成に伴う物理的な圧迫を受け移動を強いられ、 含水物中 の氷塊以外の位置に追いやられてしまう （凍結濃縮と呼ばれる） 。 従って、 凍結 濃縮が起こった含水物を解凍すると、 凍結前の内部構造、 生理的活性、 あるいは 風味などが損なわれる。 不凍機能を有するタンパク質、 即ち不凍タンパク質 (Antifreeze protein) (A F P )は、 含水物の凍結濃縮を強く抑制する能力を有 し、 また氷の再結晶阻害や熱ヒステリシスなどの特性を示す。 このため、 A F P の添加は冷凍食品などの品質を保持し凍結に伴う細胞や臓器の生理的活性の消失 を妨げる効果があると考えられている。 また、 氷スラリーを使用する冷熱供給シ ステムあるいは冷熱蓄熱等において、 氷の再結晶による配管系の閉塞を解消し得 る有効な添加剤としての利用も期待されている。 これらの他にも食肉、 野菜、 加 ェ食品、 血液、 細胞、 卵子、 精子、 移植臓器などの冷凍保存耐性の向上に A F P を応用する試みがなされている。  In the freezing temperature range, only water molecules associate with each other to form ice blocks in accordance with the law of nature inside any substance containing water (hydrate). At this time, all substances other than water molecules are forced to move due to physical pressure caused by the formation of ice blocks, and are driven to a position other than the ice blocks in the hydrated substance (called freeze concentration). Therefore, thawing a hydrated substance that has undergone freeze-concentration impairs the internal structure, physiological activity, or flavor before freezing. Antifreeze protein (AFP), which has an antifreeze function, has the ability to strongly suppress freeze-concentration of hydrates, and exhibits properties such as inhibition of ice recrystallization and thermal hysteresis. Therefore, it is considered that the addition of AFP has an effect of maintaining the quality of frozen foods and the like and preventing the loss of the physiological activity of cells and organs due to freezing. It is also expected to be used as an effective additive that can eliminate the clogging of the piping system due to ice recrystallization in cold heat supply systems or cold heat storage using ice slurry. In addition, attempts have been made to apply AFP to improving the cryopreservation resistance of meat, vegetables, processed foods, blood, cells, eggs, sperm, transplanted organs, and the like.
しかし、 現在まで A F Pが探索 ·同定された動物は、 主として南極海や北極海 周辺の極緯度地方あるいは寒帯域にのみ生息する魚種であった。 温帯域である日 本の近海で大量に漁獲される魚種について A F Pを探索、 同定し、 その A F Pを 新たに利用することが望まれていた。 特に、 魚類由来の A F Pの回収と精製に費 やすコストを低減する目的のために、 廃棄魚が有する A F Pの利用が強く望まれ ていた。 発明の開示 However, to date, the animals that AFP has been searched for and identified have been fish species that mainly live only in polar latitudes around the Antarctic and Arctic Oceans or in the cold regions. It was desirable to search for and identify AFP for fish species caught in large quantities in the temperate waters near Japan, and to newly use that AFP. In particular, spending on recovery and purification of fish-derived AFP There was a strong demand for the use of AFP in discarded fish for the purpose of reducing the cost of wastewater. Disclosure of the invention
本発明は、 このような従来の問題を解決しょうとするものであり、 日本近海等 で大量に漁獲することができ、 さらに廃棄の対象となっている魚種について、 A F Pを探索し、 得られる A F Pを精製し、 或いは遺伝子発現、 化学合成などの手 法を用いて年間を通じて安定的に供給し、 不凍能力を有する蛋白質あるいはぺプ チドを新たに提供するものである。  The present invention is intended to solve such a conventional problem, and it is possible to search for AFP for fish species that can be caught in large quantities in the waters near Japan, etc. It purifies AFP or supplies it stably throughout the year using techniques such as gene expression and chemical synthesis to provide a new protein or peptide with antifreeze ability.
北海道の野付漁業協同組合においては野付湾内で捕獲される北海シマエビ等を 中心にした産業振興に勤めているが、 同湾内に生息するナガガジあるいはシチロ ゥゥォが北海シマエビを食い荒らしてしまうことが問題になっている。 ナガガジ あるいはシチロウゥォは、 底引き網を用いて行う漁の際に、 北海シマエビと共に 大量に網にかかり、 分別されて廃棄魚用の力ゴにまとめられ廃棄業者により廃棄 される。 不凍タンパク質を有するワカサギなど他の魚種が 1キログラム当たり 3 0 0円〜 2， 0 0 0円以上の原価で取引きされるのに対して、 ナガガジあるいは シチロウゥォは原価が 0円である。 したがって、 ナガガジあるいはシチロウゥォ は不凍タンパク質を回収し精製するための原材料としてこれを低価格に抑えるた めに最適な魚種であると言える。  The Notsuke Fisheries Cooperative in Hokkaido is engaged in industrial development centered on the North Sea prawns caught in Notsuke Bay. ing. Nagagaji or Shichirou-o is caught in large quantities together with the North Sea prawns when fishing using bottom seine, separated, collected into waste fish rigos and discarded by the disposal company. Other fish species, such as smelt with antifreeze protein, are traded at a cost of more than ¥ 300 to ¥ 2,000 per kilogram, while Nagagazi or Shichirowo costs $ 0 per kilogram. Therefore, Nagagaji or Shichirou-o is the most suitable fish species as a raw material for recovering and refining antifreeze proteins and keeping them at a low price.
かかる状況において、 本発明者は、 日本、 あるいは日本周辺で大量に漁獲され かつ廃棄の対象となっている魚種であるナガガジまたはシチロウゥォの組織液お ょぴ筋肉をすりつぶした液中に存在する不凍タンパク質を見出し、 そのアミノ酸 配列と遺伝子配列を決定して、 本発明を完成させるに至ったものである。  In such a situation, the present inventor has proposed that the antifreeze present in the tissue fluid or muscle-mashed fluid of Nagagashi or Shichirouo, a fish species that has been caught in large quantities in or around Japan and is subject to disposal The present inventors have found a protein, determined its amino acid sequence and gene sequence, and completed the present invention.
すなわち、 本発明は以下のとおりである。  That is, the present invention is as follows.
( 1 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-1  (1) Antifreeze protein Z-1 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 2 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 2 (a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (2) Antifreeze protein Z-2 expressed by the following (a) or (b) (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 3 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 3  (3) Antifreeze protein Z-3 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(b) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 4 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 4  (4) Antifreeze protein Z-4 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8;
(b) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 5 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-5  (5) Antifreeze protein Z-5 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(b) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 6 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 6  (6) Antifreeze protein Z-6 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(b) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 7 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-7  (7) Antifreeze protein Z-7 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(b) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 8 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 8 (a) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (8) Antifreeze protein Z-8 expressed by the following (a) or (b) (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(b) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
( 9 ) 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 9  (9) Antifreeze protein Z-9 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18;
(b) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(10)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 10 (10) Antifreeze protein Z-10 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20;
(b) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(11)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 B - 1 (11) Antifreeze protein B-1 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22;
(b) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(12)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-1をコードする D N A(12) DNA encoding antifreeze protein Z-1 represented by the following (a) or (b):
(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(13)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 2をコードする D N A(13) DNA encoding antifreeze protein Z-2 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(14)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 3をコードする D N A (a) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (14) DNA encoding antifreeze protein Z-3 represented by the following (a) or (b) (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(b) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(15)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 4をコードする D N A(15) DNA encoding antifreeze protein Z-4 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8;
(b) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(16)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 5をコードする D N A(16) DNA encoding antifreeze protein Z-5 represented by the following (a) or (b):
(a) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(b) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(17)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-6をコードする D N A(17) DNA encoding antifreeze protein Z-6 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(b) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(18)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-7をコードする D N A(18) DNA encoding antifreeze protein Z-7 represented by the following (a) or (b):
(a) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(b) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(19)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 8をコードする D N A(19) DNA encoding antifreeze protein Z-8 represented by the following (a) or (b):
(a) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(b) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and which has an antifreeze function;
(20)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 9をコードする D N A (a) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (20) DNA encoding antifreeze protein Z-9 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18;
(b) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(21)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 10をコードする D N A(21) DNA encoding antifreeze protein Z-10 represented by the following (a) or (b):
(a) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20;
(b) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(22)次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 B-1をコードする D N A(22) DNA encoding antifreeze protein B-1 represented by the following (a) or (b):
(a) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。 (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22;
(b) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
(23) 配列番号 1， 3， 5, 7, 9, 11， 13， 15， 17, 19,又は 21で表される塩基配列であって、 それぞれ不凍タンパク質 Z- 1、 Z- 2、 Z- 3、 Z-4、 Z- 5、 Z- 6、 Z_7、 Z- 8、 Z- 9、 Z - 10 又は B-lをコードする D N A。 (23) a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, or 21, and the antifreeze proteins Z-1, Z-2, Z -DNA encoding 3, Z-4, Z-5, Z-6, Z_7, Z-8, Z-9, Z-10 or Bl.
(24) 上記 （12) 〜 （23) のいずれか 1に記載の DNAを含む組換えベクター。  (24) A recombinant vector comprising the DNA according to any one of (12) to (23).
(25) 組換えベクターが発現ベクターである （24) に記載の組換えベクター。 (26) 宿主生物を （25) に記載の組換えベクターによって形質転換した形質転換 体。 (25) The recombinant vector according to ( 24 ), wherein the recombinant vector is an expression vector. (26) A transformant obtained by transforming a host organism with the recombinant vector according to (25).
(27) 宿主生物が大腸菌である（26)に記載の形質転換体。  (27) The transformant according to (26), wherein the host organism is Escherichia coli.
(28) (27)に記載の形質転換体を培地中で培養して不凍機能を有するタンパク質 を産生せしめ、 該タンパク質を採取することを特徴とする不凍機能を有するタン パク質の製造方法。  (28) A method for producing a protein having an antifreeze function, comprising culturing the transformant according to (27) in a medium to produce a protein having an antifreeze function, and collecting the protein. .
(29) (1)〜（11)のいずれか 1に記載のタンパク質をぺプチド合成機により化学 的に合成することを特徴とするタンパク質の製造方法。  (29) A method for producing a protein, which comprises chemically synthesizing the protein according to any one of (1) to (11) using a peptide synthesizer.
(30) (1)〜（11) のいずれか 1に記載のタンパク質を有効成分として含むことを 特徴とする凍結濃縮阻害剤。  (30) A freeze concentration inhibitor comprising the protein according to any one of (1) to (11) as an active ingredient.
(31) (1)〜（11) のいずれか 1に記載のタンパク質を有効成分として含むことを 特徴とする凝固点降下剤。 (31) It is required that the protein according to any one of (1) to (11) be contained as an active ingredient. Characterizing freezing point depressant.
(32) (1)〜（11)に記載のタンパク質を含むことを特徴とする氷スラリ一。  (32) An ice slurry comprising the protein according to (1) to (11).
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。  Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
北極、 南極あるいはその近海などの局地や深海に生息する魚類の体液は、 温度 がマイナス 2°C程度まで下がっても凍結しない。 これに対して普通の魚の体液は マイナス 0. 8 °Cで凍結する。 なお、 海水はマイナス 1. 9 °Cで凍結する。  The body fluids of fish inhabiting the Arctic, Antarctic, or nearby waters and deep waters do not freeze even when the temperature drops to about minus 2 ° C. In contrast, normal fish body fluids freeze at minus 0.8 ° C. Seawater freezes at minus 1.9 ° C.
北極、 南極等に生息する魚類の体液の不凍性は、 これら魚類が自ら生産する不 凍タンパク質あるいは不凍糖蛋白質 （AFGP) に起因するものであることが明 らかになつている。 このうち不凍タンパク質には、 4つのタイプのタンパク質が あり、 それぞれ分子量約 3, 000〜4， 500の AFPI、 分子量約 20, 000 の AF PII、 分子量約 7, 000の A F ΡΙΠ、 および分子量約 1 1， 000の A F PIVに分類されている。 AFGPの分子量は 2, 200力 ら 3 3， 000の間 である。 不凍タンパク質は各々、 タンパク質のアミノ酸組成おょぴその高次構造 において差異があり、 また、 同一タイプに分類されているものであっても、 魚種 によりタンパク質のアミノ酸配列および高次構造はそれぞれ相違する （Garth L Fletcher, Choy L Hew, and Peter L Davies (2001) Antifreeze Proteins of Teleost Fishes" Ann. Rev. Physiol. 63, 359 - 390) 。  It has become clear that the antifreeze of the body fluids of fish that inhabit the Arctic, Antarctic, etc. is due to antifreeze proteins or antifreeze glycoproteins (AFGP) that these fish produce themselves. Among these, there are four types of antifreeze proteins: AFPI with a molecular weight of about 3,000 to 4,500, AF PII with a molecular weight of about 20,000, AFΡΙΠ with a molecular weight of about 7,000, and a molecular weight of about It is classified into 11,000 AF PIV. The molecular weight of AFGP is between 2,200 and 33,000. Antifreeze proteins differ in the amino acid composition of proteins and their higher-order structure, and even if they are classified into the same type, the amino acid sequence and higher-order structure of the protein vary depending on the fish species. (Garth L Fletcher, Choy L Hew, and Peter L Davies (2001) Antifreeze Proteins of Teleost Fishes "Ann. Rev. Physiol. 63, 359-390).
一方、 不凍タンパク質の機能について述べると、 通常の場合、 氷結晶は、 水溶 液中において氷核が表れると、 まず扁平な六角の板状に成長する。 板状平面に対 し垂直方向への成長は、 板状平面方向に対する成長に比べ 1 00倍程度遅い。 こ れに対して、 不凍蛋白質 （AF P) が存在すると円盤平面方向への氷晶の成長は 阻止され、 最初に形成された板状体を基底面として、 この基底面に対し垂直方向 に、 順次、 より小さい板状体が積み重ねられていき、 最終的にはピラミッドを二 つ重ねたバイピラミッド型の氷晶にゆっく りと成長していく。 したがって、 注目 する検体中に A F Pが存在している場合に限り、 検体液を 0°C以下にした場合、 その検体液中には一般にパイビラミッド型氷結晶、 結晶学的には六方偏四角面体 (図 1の左図） あるいは六方両錘体 （図 2の左図） とよばれる氷の単結晶が、 顕 微鏡下に観測される。 AFPが存在する結果、 氷結晶上の 12枚の氷層平面に特異 的な結合が起こり、 このようなパイピラミッド型氷結晶が生成する。 このこと力 巨視的には、 検体の非凍結現象 （不凍活性） として観測される。 この現象は、 浸 透圧計 （ォスモメーター） を用いることにより検体液の凝固点降下あるいは温度 ヒステリシスとして定量化することもできる。 凝固点降下の測定法を用いて不凍 活性を評価する為には、 高純度の AF Pの水溶液を得る必要がある。 これに対し てバイピラミダル氷結晶観測による不凍活性評価法は、 AF Pさえ存在していれ ば観測 さ れる （ Choy L. Hew and Daniel S. C. Yang (1992) "Protein interaction with ice"Eur. J. Biochem. 203, 33 - 42) 。 On the other hand, regarding the function of antifreeze proteins, ice crystals usually grow into flat hexagonal plates when ice nuclei appear in an aqueous solution. Growth in the direction perpendicular to the plate-like plane is about 100 times slower than growth in the direction of the plate-like plane. On the other hand, the presence of antifreeze protein (AFP) prevents the growth of ice crystals in the plane of the disk, with the first formed plate as the basal plane, and perpendicular to this basal plane. In turn, smaller platelets are stacked, eventually growing slowly into a bipyramid ice crystal with two pyramids. Therefore, only when AFP is present in the sample of interest, if the sample solution is kept at 0 ° C or lower, the sample solution will generally contain a pyramid-shaped ice crystal, and crystallographically a hexagonal tetrahedron. A single crystal of ice called a hexagonal pyramid (left figure in Fig. 2) or a bilateral pyramid (left figure in Fig. 2) is observed under a microscope. The presence of AFP results in specific binding of the twelve ice layer planes on the ice crystal to form such a pyramidal ice crystal. This force is macroscopically observed as a non-freezing phenomenon (antifreeze activity) of the specimen. This phenomenon is By using a osmometer, it can be quantified as the freezing point drop or temperature hysteresis of the sample solution. In order to evaluate the antifreeze activity using the freezing point depression measurement method, it is necessary to obtain a high-purity aqueous solution of AFP. On the other hand, the antifreeze activity evaluation method by bipyramidal ice crystal observation can be observed if AFP is present (see Choy L. Hew and Daniel SC Yang (1992) "Protein interaction with ice" Eur. J. Biochem. 203, 33-42).
( 1 ) 本発明によるナガガジ又はシチロウゥォの血液又はすり身から本発明の不 凍タンパク質 Z- 1〜Z- 12の調製法  (1) A method for preparing the antifreeze proteins Z-1 to Z-12 of the present invention from blood or surimi of Nagaji or Shichirozo according to the present invention
ナガガジ魚体 1匹の頭部と内臓を取り除き、 胴体部分をきり身にして 0. 1M 重炭酸アンモニゥム水溶液 （pH= 7. 9) を加え、 ジューサーミキサーに入れ て粉砕した。 このナガガジすり身に対して 0. 1Mの重炭酸アンモニゥム水溶液 を加えてすり身の懸濁液を作製した。 これを 6, 000回転で 30分間遠心して 上澄み液を得た。 この上澄み液を 5 0 mM酢酸ナトリウム緩衝液 （p H= 3. 7) に対して透析した後にこれを 1 2, 000回転で 30分間遠心して沈殿物を 取り除いた。 得られた上澄み液に対して陽イオン交換クロマトグラフィーを行つ た。 この操作には 5 OmMの酢酸ナトリウム緩衝液 （pH= 3. 7) を用い溶出 には 0〜0. 5 Mの塩化ナトリウム勾配を用いた。 この操作で得られる 280 n mの吸収が観測される試料液を逆相クロマトグラフィー （HP LC) により精製 した。 カラムの平衡化と試科液の取り込みには 0. 1 %のトリフルォロ酢酸を用 い溶出にはァセトニトリルの直線勾配を用いた。 これにより、 ナガガジ由来不凍 タンパク質を含む複数の溶出液フラクションを得た。 得られた不凍タンパク質の 活性確認をパイピラミダル氷結晶の観察により行い、 純度の確認を S D S電気泳 動により行った。 得られた試料を凍結乾燥した後に冷凍保存した。  The head and internal organs of one Nagagasi fish were removed, the body was cut off, 0.1 M aqueous ammonium bicarbonate solution (pH = 7.9) was added, and the mixture was ground in a juicer mixer. A 0.1 M aqueous solution of ammonium bicarbonate was added to the surimi and a suspension of the surimi was prepared. This was centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant. The supernatant was dialyzed against 50 mM sodium acetate buffer (pH = 3.7) and centrifuged at 12,000 rpm for 30 minutes to remove a precipitate. Cation exchange chromatography was performed on the obtained supernatant. For this operation, a 5 OmM sodium acetate buffer solution (pH = 3.7) was used, and a gradient of 0 to 0.5 M sodium chloride was used for elution. The sample solution obtained by this operation and having an absorption of 280 nm was observed was purified by reverse phase chromatography (HP LC). The column was equilibrated and the sample solution was taken in using 0.1% trifluoroacetic acid, and a linear gradient of acetonitrile was used for elution. As a result, a plurality of eluate fractions containing Nagaji-derived antifreeze protein were obtained. The activity of the obtained antifreeze protein was confirmed by observing piperamidal ice crystals, and the purity was confirmed by SDS electrophoresis. The obtained sample was lyophilized and then stored frozen.
(2) 上記 （1) で調製した不凍タンパク質のアミノ酸配列の決定法  (2) Method for determining amino acid sequence of antifreeze protein prepared in (1) above
プロテインシーケンサーでスタンダードを解析し、 HP LCによる分離の際の 各アミノ酸に相当する溶出時間を決定した。 上記 （1) で調製した不凍タンパク 質の凍結乾燥粉末を酢酸に溶解し、 一般的なエドマン分解法を用いて、 プロティ ンシーケンサ一により N末端側から順次解析を行った。 具体的には、 （ i ) フヱ 二ルイソチオシアナート （P I TC) をタンパク質の N末端にカップリングしフ ェニルチオ力ルバミルタンパク質 （PTC -タンパク質） を生成した。 次に、 (ii) PTC -タンパク質からトリフルォロ酢酸で 2 -ァニリノ - 5 -チアゾリ ノン誘導体 （ATZ -アミノ酸） として N末端アミノ酸を切り出す。 この ATZ -アミノ酸を酸性下でフ 二ルチオヒダントイン誘導体 （PTH -アミノ酸） に 転換した後に HP LCで分離し、 その溶出時間を基にアミノ酸の種類を決定した。 N末端アミノ酸を切り出された残りのタンパク質を原料として （i) と （ii) の サイクルを繰り返すことで、 アミノ酸配列を決定した。 The standards were analyzed using a protein sequencer, and the elution time corresponding to each amino acid during separation by HP LC was determined. The lyophilized powder of the antifreeze protein prepared in (1) above was dissolved in acetic acid, and analyzed sequentially from the N-terminal side by a protein sequencer using a general Edman degradation method. Specifically, (i) phenylthiothiocyanate (PITC) was coupled to the N-terminus of the protein to generate phenylthio-powered rubamyl protein (PTC-protein). next, (ii) N-terminal amino acid is cut out from PTC-protein as 2-anilino-5-thiazolinone derivative (ATZ-amino acid) with trifluoroacetic acid. The ATZ-amino acid was converted to a thiothiohydantoin derivative (PTH-amino acid) under acidic conditions, separated by HP LC, and the amino acid type was determined based on the elution time. The amino acid sequence was determined by repeating the cycles (i) and (ii) using the remaining protein from which the N-terminal amino acid was cut out as a raw material.
得られたアミノ酸残基からなる蛋白質のアミノ酸配列においそ、 1もしくは複 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたものであっても、 不凍機能を有 する蛋白質は本発明に含まれる。  Even if one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein comprising the obtained amino acid residues, a protein having an antifreeze function is included in the present invention. .
例えば、 各配列番号で示されるアミノ酸配列の：！〜 7個、 好ましくは 1〜5個、 さ らに好ましくは 1〜2個のアミノ酸が欠失してもよく、 又は各配列番号で表される アミノ酸配列の 1〜7個、 好ましくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜2個のアミノ酸 が付加してもよく、 または、 各配列番号で表されるアミノ酸配列の：！〜 7個、 好ま しくは 1〜5個、 さらに好ましくは 1〜2個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されて いてもよレヽ。  For example, in the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO: ~ 7, preferably 1-5, more preferably 1-2 amino acids may be deleted, or 1-7, preferably 1 ~ 7 of the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO. Five, more preferably one to two amino acids may be added, or the amino acid sequence represented by each SEQ ID NO: Up to 7, preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 2 amino acids may be substituted with other amino acids.
( 3 ) 上記で調製した不凍タンパク質の遺伝子のクローニング法及び塩基配列の 決定法  (3) Cloning method and nucleotide sequence of antifreeze protein gene prepared above
ナガガジの肝臓を不凍タンパク質の発現量が増大している厳寒期に生魚から採 取した。 採取した肝臓を 5 mm角に裁断して 1 0倍量の RN A安定化剤中に保存 した。 安定化剤が浸透した肝臓サンプルを素早く低温ですりつぶし RN Aを抽出 した。 この RN Aの溶液からオリゴ d Tマトリックスを用いて mRN Aを分離 · 精製した。 精製した mRNAを錶型にオリゴ dT配列を含むプライマーと逆転写 酵素で c DNA (1 s t s t r a n d) を合成し、 続いて RN a s e Hと D N A p o l yme r a s e Iで c DNA (2 n d s t r a n d) を合成し た。 さらに P f u DNA P o 1 y m e r a s eで c DNAの両末端を平滑化 しアダプター配列を付加した。 こうして構築した c DNAライブラリーを鎊型に、 上記 （2) で決定したアミノ酸配列を元に設計したプライマー、 オリゴ dT配列 — プフイマ一 用レヽて P o l yme r a s e c h a i n r e a c t i o n (PCR) を行い、 増幅した遺伝子断片を T Aクローニングした。 クローニン グした遺伝子断片の配列はオリゴ d T配列を含むプライマーを用い、 Dy e T e r m i n a t o r法により決定した。 その際のサイクルシークェンスの条件は 9 6 °C 1 0秒、 50°C 5秒、 6 0°C 4分、 25サイクルであった。 その結 果、 ナガガジ由来 c DN Aライブラリ一の中でも優位な約 500 b p長の遺伝子 断片群に不凍タンパク質をコードする塩基配列が含まれていることが示された。 この結果を基に、 500 b pの c DNAを铸型に、 付加したアダプター配列にァ ニールするプライマーとオリゴ d T配列を含むプライマーを用いて約 500 b p の遺伝子断片を増幅し、 T Aクローニングした。 クローユングした遺伝子断片の 配列は同様に Dy e T e r m i n a t o r法により決定した。 Nagaji liver was harvested from live fish during the cold season when antifreeze protein expression was increased. The collected liver was cut into 5 mm squares and stored in a 10-fold amount of RNA stabilizer. Liver samples impregnated with the stabilizer were quickly ground at low temperature to extract RNA. MRNA was separated and purified from this RNA solution using an oligo dT matrix. From the purified mRNA, cDNA (1 ststrand) was synthesized with a primer containing oligo dT sequence and reverse transcriptase, and then cDNA (2 ndstrand) was synthesized with RNase H and DNA polimerase I. . Further, both ends of the cDNA were blunted with Pfu DNA Po1 ymerase, and an adapter sequence was added. Using the cDNA library constructed in this manner as a type I, primers and oligo dT sequences designed based on the amino acid sequence determined in (2) above, and performing polymerase chain reaction (PCR) using the primers, the amplified genes The fragment was TA cloned. For the sequence of the cloned gene fragment, use a primer containing an oligo dT sequence. Determined by the rminator method. The cycle sequence conditions at that time were 96 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 5 seconds, 60 ° C for 4 minutes, and 25 cycles. As a result, it was shown that a gene fragment group of about 500 bp, which is superior in one of the Nagana-derived cDNA libraries, contains a base sequence encoding an antifreeze protein. Based on this result, a 500 bp cDNA fragment was amplified into a type II, a gene fragment of about 500 bp was amplified using a primer that anneals to the added adapter sequence and a primer containing an oligo dT sequence, and TA cloned. The sequence of the cleaved gene fragment was similarly determined by the Dye Terminator method.
(4) 組換えベクターの調製法  (4) Preparation of recombinant vector
増幅した遺伝子断片を 0. 8 %ァガロースで電気泳動し、 500 b p長の遺伝 子断片を切り出し、 精製した。 TAクローユング用ベクター 50 n gに対し精 製した遺伝子断片を 20 n g加え、 4°Cでー晚 T4 DNA L i g a s eに よりライゲーシヨン反応を行った。  The amplified gene fragment was electrophoresed on 0.8% agarose, and a 500 bp long gene fragment was cut out and purified. 20 ng of the purified gene fragment was added to 50 ng of the TA cloning vector, and a ligation reaction was carried out at 4 ° C. with 晚 T4 DNALigase.
(5) 形質転換体の調製法  (5) Preparation of transformant
氷上で融解したコンビテントセル （DH5 o;) に組換えベクター溶液を加え、 氷上に 30分間静置した。 これを 42°Cで 1分間熱処理し、 すぐに氷上に移して 2分間静置した。 これに SO C培地を加え、 3 7 °Cで 30分間インキュベートし た。 1 00 μ gZm 1アンピシリン含有 L B寒天培地に広げ、 3 7°Cでー晚イン キュベートしてコロニーを形成させた。 形成された任意のコロニーを 1 00 μ g Zm 1アンピシリン含有 LB液体培地に植菌し、 3 7 °Cで一晩大腸菌を振とう培 養した。 増殖した大腸菌をアルカリ - SD S法で破壊し、 DNA吸着マトリック ス及ぴスピンカラムを用いて組換えベクターを分離 ·精製した。  The recombinant vector solution was added to the competent cells (DH5 o;) melted on ice, and allowed to stand on ice for 30 minutes. This was heat-treated at 42 ° C for 1 minute, immediately transferred to ice and allowed to stand for 2 minutes. To this, SOC medium was added and incubated at 37 ° C for 30 minutes. The cells were spread on an LB agar medium containing 100 μg Zm1 ampicillin, and incubated at 37 ° C. for colony formation. An arbitrary colony formed was inoculated into an LB liquid medium containing 100 μg Zm1 ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight with shaking E. coli. The grown Escherichia coli was destroyed by the alkali-SDS method, and the recombinant vector was separated and purified using a DNA adsorption matrix and a spin column.
(6) 形質転換体を使用して不凍タンパク質を製造する方法  (6) Method for producing antifreeze protein using transformant
プロモーター、 ターミネータ一配列等を含む組換え体発現用ベクターに不凍タ ンパク質をコードする塩基配列を組込み、 この組換えベクターによる形質転換体 を 1 00 g Zm 1アンピシリン含有 L B液体培地 1 0m lで前培養した。 この 培養液 1 0m lを 1 00 μ § /m 1アンピシリン含有 L B液体培地 1 000m l に加え、 さらに培養を続けた。 培養の温度として 28°Cを設定した。 培養液の濁 度 （〇. D. = 600) が 0. 5まで増加した時点でタンパク質の発現誘導物質を 添加した。 発現誘導後一晩で培養液を回収し、 （1)内に記述した陽イオン交換ク 口マトグラフィ一による方法を用いて不凍蛋白質を精製した。 A base sequence encoding an antifreeze protein was incorporated into a recombinant expression vector containing a promoter, a terminator sequence, etc., and a transformant of this recombinant vector was transformed with 100 ml of Zm1 ampicillin-containing LB liquid medium 10 ml. Was pre-cultured. Add this culture 1 0 m l in 1 00 μ § / m 1 ampicillin-containing LB liquid medium 1 000m l, was continued further culture. The temperature of the culture was set at 28 ° C. When the turbidity of the culture (〇.D. = 600) increased to 0.5, a protein expression inducer was added. Collect the culture solution overnight after the induction of expression, and use the cation exchange solution described in (1). The antifreeze protein was purified using a method by oral chromatography.
( 7 ) 不凍タンパク質を凍結濃縮阻害剤及び凝固点降下剤として使用する方法 含水物の凍結濃縮阻害剤又は凝固点降下剤として A F Pを使用する際には、 A F Pを、 含水物中の A F Pの濃度が、 含水物の質量に対して 0 . 0 2重量％濃度 以上となる量を添加する。 特に、 0 . 0 3重量％濃度から 0 . 0 5重量％濃度の範 囲内であるときに A F Pは最大の効果を発揮する。 このとき、 例えば含水物が液 体 （水溶液、 血液など） である場合には、 A F Pの粉末又は水溶液をそのまま混 合すれば良い。 また、 含水物が細胞、 組織である場合には、 注射器などを用いて A F Pの水溶液を含水物内部に注入しても良い。 また、 含水物を A F Pの水溶液 に浸した後に 5 0〜2， 0 0 0 k g Z c m2に加圧する等の手段により、 含水物 内部に A F Pを浸透させても良い。 (7) Method of using antifreeze protein as freeze-concentration inhibitor and freezing-point depressant When using AFP as a freeze-concentration inhibitor or freezing-point depressant for hydrated products, the concentration of AFP in the hydrated product is reduced. And an amount of at least 0.02% by weight based on the weight of the hydrated substance is added. In particular, AFP is most effective when the concentration is within the range of 0.03% by weight to 0.05% by weight. At this time, for example, when the hydrate is a liquid (aqueous solution, blood, etc.), the powder or the aqueous solution of AFP may be mixed as it is. When the hydrate is a cell or tissue, an aqueous solution of AFP may be injected into the hydrate using a syringe or the like. Also, the 5 0-2 Soak hydrate in an aqueous solution of AFP, 0 0 by 0 kg Z cm means such as 2 to pressurize be impregnated with AFP therein hydrous material.
本発明の不凍タンパク質は、 前述したように、 不凍タンパク質には含水物の凍 結濃縮を妨げるはたらきや氷の再結晶化を妨げるはたらきがあるため、 上記各魚 種から得られた不凍タンパク質が A F P I〜 I Vのどのタイプの不凍タンパク質 に分類されるか否かに関わらず、 含水物の凍結濃縮阻害剤ないしは氷の再結晶化 防止剤として使用でき、 例えば冷凍食品あるいは食肉などに混入することにより その品質を持続させるために使用できる。 また、 この品質維持効果は、 細胞 （卵 子や精子） 、 組織、 臓器、 野菜などを長期凍結保存する際にも同様に期待できる。 さらに、 近年、 エネルギー密度が大きい氷スラリーを熱媒体として使用する冷熱 供給システムあるいは冷熱蓄熱等が提案されているが、 これらにおいては、 氷の 再結晶による配管系の閉塞の問題があり、 本発明の不凍タンパク質は氷の再結晶 化を有効に防ぐものであるから、 この問題を解決するために有望な手段となり う る。 このほか不凍蛋白質をコードする遺伝子を植物体に組み込むことにより、 そ の植物に耐寒性を持たせることも応用技術として期待できる。 図面の簡単な説明  As described above, the antifreeze protein of the present invention has a function of preventing freezing and concentration of hydrated substances and a function of preventing recrystallization of ice. Regardless of which type of antifreeze protein is classified into AFPI to IV, it can be used as an inhibitor for freeze-concentration of hydrates or as an inhibitor of ice recrystallization, such as in frozen foods or meat Can be used to maintain its quality. This quality maintenance effect can also be expected when cells (egg and sperm), tissues, organs, vegetables, etc. are stored for a long period of time in a frozen state. Further, in recent years, a cold heat supply system or a cold heat storage system using an ice slurry having a large energy density as a heat medium has been proposed. However, in these systems, there is a problem of clogging of a piping system due to recrystallization of ice. The antifreeze protein effectively prevents the recrystallization of ice, making it a promising solution to this problem. In addition, by incorporating a gene encoding an antifreeze protein into a plant, it is expected that the plant will have cold resistance as an applied technology. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1は、 バイピラミッド型氷結晶の形状を示す模式図および写真である。 この 図において左は六方両錘体の模式図を、 右はナガガジの血液に観測された六方両 錘体の氷結晶の写真を示す。  FIG. 1 is a schematic diagram and a photograph showing the shape of a bipyramid ice crystal. In this figure, the left is a schematic diagram of a hexagonal pyramid, and the right is a photograph of ice crystals of the hexagonal pyramid observed in Nagaji's blood.
図 2は、 パイピラミッド型氷結晶の形状を示す模式図および写真である。 この 図において、 左は六方偏四角面体の模式図を右はシチロゥゥォの血液に観測され た六方偏四角面体の氷結晶の写真を示す。 Figure 2 is a schematic diagram and a photograph showing the shape of a pyramid-shaped ice crystal. this In the figure, the left shows a schematic diagram of a hexagonal tetrahedron, and the right shows a photograph of ice crystals of the hexagonal tetrahedron observed in blood of Sicily.
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 3— 1 4 2 8 5 0号の明細書に記載 された内容を包含する。 This description includes part or all of the contents as disclosed in the description of Japanese Patent Application No. 2003-142850, which is a priority document of the present application.
発明を実施するための最良の形態 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
以下、 本発明の実施例を示すが、 本発明は特にこれにより限定されるものでは ない。  Hereinafter, examples of the present invention will be described, but the present invention is not particularly limited thereto.
(実施例 1 )  (Example 1)
( 1 ) 検体試料  (1) Sample sample
不凍タンパク質の採取源として使用した魚種は以下のとおりである。  The fish species used as sources for collecting antifreeze proteins are as follows.
ナガガジ (Zoarces elongatus kner、 英名 Notched- Fin eelpout) ：北海道野付湾 で漁獲。 Nagagaji (Zoarces elongatus kner, English name Notched- Fin eelpout): Caught in Notsuke Bay, Hokkaido.
シチロウゥォ (Brachyops i s rostratus、 英名 Longsnout poacher) ：北海 ιί野付湾 で漁獲。 Sicirou (Brachyops is rostratus, Longsnout poacher): Caught in the north sea ιίnotsuke bay.
( 2 )不凍活性の観測  (2) Observation of antifreeze activity
採取したナガガジとシチロゥゥォの血液それぞれ 1 /ζ 1をライカ社製 DMLB100型 顕微鏡（Leica DMLB 100 photomicroscope)の直径 16mmのカバーガラス上に滴下し た。 これをそのままもう 1枚の直径 12. 5mmのカバーガラスによりはさみ、 これを DMLB100型顕微鏡のステージ部に設置した冷却箱内にセットした。 冷却箱の上下 には直径 1腿の光取り入れ穴をあけ、 顕微鏡光源からの光は下側の穴から箱内を 通り上側の穴を抜けてレンズに入光させるようにした。 この上下の穴により規定 される光軸上に検体液をセットすることで、 光軸上にある検体液中の物質が顕微 鏡観察される。 検体液がセットされた冷却箱の中の温度は、 リンカム社製 LK600 温度制御装置 （LK600 温度コントローラー） により +/_ 0 . 1 °Cの誤差で制御さ れる。 室温下で検体液をセットした後、 温度制御装置により冷却箱内の温度を毎 秒 0 . 2 °Cでマイナス 2 2 °Cまで下降させた。 およそマイナス 1 . 4 °Cからマイ ナス 4 0 °Cの間の温度のどこかで検体液の全体が凍結する。 凍結の後に毎秒 0 . 1°Cで冷却箱内温度を上昇させ零。 Cで上昇を停止し、 そのまま 1秒〜 1 0秒程度 の間、 零でを維持していると凍結が溶け、 無数のきれつの入つた氷結晶状態を経 たのちに、 数えられる程度の氷の単結晶が水中に浮かんだものが観測された。 そ の瞬間に、 冷却箱内の温度をマイナス 0. 1°C〜マイナス 1. o°c程度に下降さ せて止め、 氷結晶の形状を観察した。 観察結果を図 1に示す。 試験に使用した魚 種のいずれにおいてもバイピラミダル型の氷晶が観察され、 これらの魚種は、 い ずれも不凍タンパク質を有することを確認した。 また、 魚肉すり身懸濁液 1L、 お ょぴ乾物懸濁液 1Lを用いて同様の試験を行ったが、 これらの試験においても、 す ベての魚種について、 バイビラミダル型の氷晶が観察された。 1 / ζ1 each of the collected Nagagaji and Shichiro blood was dropped onto a 16 mm diameter cover glass of a Leica DMLB100 photomicroscope manufactured by Leica. This was directly sandwiched between another cover glass having a diameter of 12.5 mm and set in a cooling box installed on the stage of a DMLB100 microscope. Light intake holes with a diameter of one thigh were made on the upper and lower sides of the cooling box, and light from the microscope light source passed through the inside of the box from the lower hole, passed through the upper hole, and entered the lens. By setting the sample liquid on the optical axis defined by the upper and lower holes, the substance in the sample liquid on the optical axis is observed with a microscope. The temperature in the cooling box in which the sample liquid is set is controlled with an error of +/- 0.1 ° C by the LK600 temperature controller (LK600 temperature controller) manufactured by Linkham. After the sample solution was set at room temperature, the temperature in the cooling box was lowered at 0.2 ° C per second to minus 22 ° C by the temperature controller. At some point between approximately minus 1.4 ° C and minus 40 ° C, the entire sample freezes. 0 per second after freezing. At 1 ° C, the temperature inside the cooling box was raised to zero. Stop climbing at C and keep it at zero for about 1 to 10 seconds.If it freezes, it melts, passes through countless cracked ice crystal states, and becomes countable ice A single crystal floating in water was observed. At that moment, the temperature inside the cooling box was lowered to about 0.1 ° C to minus 1. o ° c and stopped, and the shape of the ice crystals was observed. Figure 1 shows the observation results. Bipyramidal ice crystals were observed in each of the fish species used in the test, confirming that each of these fish species had antifreeze proteins. Similar tests were conducted using 1 L of fish meat surimi suspension and 1 L of dried dried fish suspension.In these tests, biviramidal ice crystals were observed for all fish species. Was.
(3) ナガガジ AF P- Z-1の調製及びアミノ酸配列決定  (3) Preparation of Nagagazi AF P-Z-1 and amino acid sequencing
ナガガジの身を包丁で切断しミキサーを用いてすり身にした。 このすり身 20ml に対して 20mlの 0.1Mの重炭酸アンモユウム水溶液を加えることで、 すり身の懸濁 液 40mlを調製した。 これをプラスチック試験管に入れ、 6, 000回転で 30分間遠心 して、 約 20mlの上澄み液を得た。 この上澄み液を、 50mM酢酸ナトリウム緩衝液 (pH=3.7)に対して透析し、 共雑タンパク質を凝集させた。 これを 12， 000回転で 30 分間遠心して取り除き、 上澄み液を得た。 この上澄み液に対して陽イオン交換ク ロマトグラフィーを行い、 lm 1ずつの溶出液を 280 nmの吸収を検出しなが らフラクションコレクタ一により回収した。 陽イオン交換クロマトグラフィ一に は Amersham Pharmacia Biotechの F P L Cシステムと BIO- RADの High- S力ラムを 用いた。 50mMの酢酸ナトリウム緩衝液 （pH=3.7) を用いてカラムの平衡化と上澄 み液の取り込みをおこない溶出は流速 lml/分で 0〜0.5Mの塩化ナトリゥムの直 線勾配をかけることで行った。 ここまでの操作は全て 4°Cで行った。 次に、 28 0 nmの吸収の観測された試料液を TO S Oの HP LCシステムと OD Sカラム を用いた逆相クロマトグラフィーにより精製した。 0· 1%のトリフルォロ酢酸 を用いてカラムの平衡化と試料液の取り込みを行い、 溶出にはァセトニトリルの 直線勾配を用いた。 溶出試料の吸光度は 2 14 nmと 280 nmで検出し、 単一 のタンパク質を含む溶出液フラクションを得た後にこれを凍結乾燥した。 この凍 結乾燥粉末を 0. 1Mの重炭酸アンモユウム水溶液に溶解し、 そのバイビラミダ ル氷結晶の観測をおこなうことで不凍タンパク質であることを確認し、 不凍タン パク質 Z-1を得た。 こうしてナガガジ AF P-Z - 1のサンプルを精製した後、 これ を凍結乾燥したサンプルを用いたァミノ酸配列の決定を行った。 乾燥状態のサン プルを酢酸に溶解し、 ポリプレン処理したカートリッジフィルターに添加した。The Nagagaji body was cut with a kitchen knife and ground using a mixer. To 20 ml of this surimi, 20 ml of a 0.1 M aqueous solution of ammonium bicarbonate was added to prepare a 40 ml surimi suspension. This was placed in a plastic test tube and centrifuged at 6,000 rpm for 30 minutes to obtain about 20 ml of a supernatant. The supernatant was dialyzed against a 50 mM sodium acetate buffer (pH = 3.7) to aggregate contaminating proteins. This was removed by centrifugation at 12,000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant. The supernatant was subjected to cation exchange chromatography, and the eluate of each lm was collected by a fraction collector while detecting the absorption at 280 nm. Amersham Pharmacia Biotech FPLC system and BIO-RAD High-S force column were used for cation exchange chromatography. Equilibrate the column using 50 mM sodium acetate buffer (pH = 3.7) and take up the supernatant.Elute with a linear gradient of 0 to 0.5 M sodium chloride at a flow rate of 1 ml / min. Was. All operations up to this point were performed at 4 ° C. Next, the sample solution in which the absorption at 280 nm was observed was purified by reverse phase chromatography using a TO SO HP LC system and an ODS column. The column was equilibrated and the sample solution was taken up using 0.1% trifluoroacetic acid, and a linear gradient of acetonitrile was used for elution. The absorbance of the eluted sample was detected at 214 nm and 280 nm, and an eluate fraction containing a single protein was obtained and lyophilized. This freeze-dried powder was dissolved in a 0.1 M aqueous solution of ammonium bicarbonate, and the observation of the viviramidal ice crystals confirmed that it was an antifreeze protein.Thus, antifreeze protein Z-1 was obtained. . After purifying the Nagagazi AF PZ-1 sample, The amino acid sequence was determined using a lyophilized sample. The dried sample was dissolved in acetic acid and added to a polypropylene-treated cartridge filter.
Applied Biosystems 社製 491プロテインシークェンサ一でエドマン分解し、 N末 端側から順次アミノ酸配列を決定した。 この結果、 A F P - Z- 1のアミノ酸配列は 配列表の配列番号 2に示すとおりである。 Edman degradation was performed using Applied Biosystems' 491 protein sequencer, and the amino acid sequence was determined sequentially from the N-terminal side. As a result, the amino acid sequence of AFP-Z-1 is as shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
( 4 ) 全 RNAの単離  (4) Isolation of total RNA
全 RNAの単離に関する基本的な操作はプロ トコール集 （"RneasyR Protect and RNAlater™ Handbook" 及ぴ 〃RNeasyR Mini Handbook" (QIAGEN) ) に従った。 The basic operation relates to the isolation of total RNA was carried out according to the pro-tocol Collection ( "Rneasy R Protect and RNAlater ™ Handbook"及Pi 〃RNeasy R Mini Handbook "(QIAGEN)) .
また、 サンプルとするナガガジの肝臓は不凍タンパク質の発現量が増大してい る厳寒期に生魚から採取した。 採取した l〜2gの肝臓を 5脑角に裁断して 10倍量の RNAlater (QIAGEN)中に保存した。 この肝臓サンプル 60mgを液体窒素中で粉断し 30mgずつ Buffer RLT 600 1に懸濁した後、 QIAshredder (QIAGEN) でさらに粉碎 した。 遠心により回収した上清に等量の 70%エタノールを加え、 スピンカラム'を 通すことで RNAをカラムに吸着させた。 Buffer RW1、 Buffer RPEでカラムを洗浄 後、 RNaseフリ一水 30 μ 1でそれぞれ RNAを溶出した。  In addition, Nagajiji liver, which was used as a sample, was collected from live fish during the severe cold season when the expression level of antifreeze protein was increased. The collected l to 2 g of the liver was cut into 5 脑 corners and stored in a 10-fold amount of RNAlater (QIAGEN). 60 mg of this liver sample was disrupted in liquid nitrogen, suspended in Buffer RLT 600 1 in 30 mg portions, and further disrupted with QIAshredder (QIAGEN). An equal volume of 70% ethanol was added to the supernatant collected by centrifugation, and the RNA was adsorbed to the column by passing through a spin column. After washing the column with Buffer RW1 and Buffer RPE, RNA was eluted with 30 µl of RNase free water.
( 5 ) mRNAの単離  (5) mRNA isolation
mRNAの単離は 01igotexTM_dT30 く Super> mRNA Purification kit (TaKaRa) を 用いて行い、 操作は添付されているプロ トコールに従った。 1· 1 / g/ 1の total RNA 溶液 150 1に対し 2xBinding Buffer 150 μ 1, Oligotex™- dT30 く Super> 15 μ 1を加え 70°Cで 3分間加熱した後、 室温で 10分間放置した。 遠心操作にて Oligotex™- dT30 <Super>を回収後、 Wash Bufferに懸濁しス ピンカラムで Oligotex- dT30 く Super>を洗浄した。 01 igotex™_dT30 く Super〉に吸着した mRNAを 70°Cで加熱しておいた RNaseフリ一水 40 μ 1で溶出した。 mRNA was isolated using 01igotex ™ _dT30 and Super> mRNA Purification kit (TaKaRa), and the operation was performed according to the attached protocol. 2xBinding Buffer 150 μl, Oligotex ™ -dT30 and Super> 15 μl were added to 1.1 / g / 1 total RNA solution 1501, heated at 70 ° C for 3 minutes, and then left at room temperature for 10 minutes. After recovering Oligotex ™ -dT30 <Super> by centrifugation, it was suspended in Wash Buffer and washed with a spin column. The mRNA adsorbed on 01 igotex ™ _dT30oku Super> was eluted with 40 µl of RNase free water heated at 70 ° C.
( 6 ) cDNAライブラリーの構築  (6) Construction of cDNA library
cDNAライブラリーの構築は ZAP- cDNA Synthesis Kit (STRATAGENER) で行った c 基本的操作は 〃cDNA Synthesis Kit, ZAP - cDNAR Synthesis Kit, and ZAP-cDNAR GigapackR III Gold Cloning Kit INSTRUCTION MANUAL" (STRATAGENER) に従った c 上述のように回収した mRNAを錶型としメチル化された dCTPを含む dNTP (dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP) 基質として用い StrataScript RTaseを加え、 42°C 1時間反 応を行うことで first- strand cDNA を逆転写合成した。 次に RNase H、 DNA polymerase, dNTP を加え、 16°C 2. 5時間反応を行い、 second- strand cDNAを合 成した。 Pfu DNA polymerase で cDNA の末端を平滑化した後、 T4 DNA l igase でアダプター配列を結合した。 Construction of cDNA library ZAP- cDNA Synthesis Kit c basic operation performed on the (STRATAGENE R) is 〃CDNA Synthesis Kit, ZAP - cDNA R Synthesis Kit, and ZAP-cDNA R Gigapack R III Gold Cloning Kit INSTRUCTION MANUAL "( STRATAGENE the recovered mRNA as c above in accordance with R) and錶型dNTP containing methylated dCTP (dATP, dCTP, dGTP, the StrataScript RTase used as dTTP) substrate is added, 42 ° C 1 hour reaction The first-strand cDNA was reverse transcribed and synthesized by RNase H and DNA. Polymerase and dNTP were added, and the mixture was reacted at 16 ° C for 2.5 hours to synthesize second-strand cDNA. After blunting the ends of the cDNA with Pfu DNA polymerase, the adapter sequence was ligated with T4 DNA ligase.
( 7 ) 塩基配列の決定  (7) Determination of base sequence
構築した cDNAライブラリーの一部を 0. 8% ァガロースで電気泳動したところ、 500bpの遺伝子断片が主として確認された。 そこで、 プロテインシークェンサ一 により決定されたアミノ酸配列を元に縮重プライマーを設計し、 このプライマー と poly A 配列に相補的なプライマーを用いて 500bpの cDNAを鎳型に Ex Taq™ (TaKaRa) CR (polymerase chain reaction)を行った。 PCR産物を pGEMR - T Easy (Promega)にクローニングし、 このプラスミ ドで大腸菌を形質転換した。 形質転 換体を 100 /i g/mlアンピシリン含有 LB寒天培地上に広げ、 形成された任意のコロ ニーを 100 μ g/mlアンピシリン含有 LB液体培地に植菌し、 37°Cでー晚大腸菌を振 とう培養した。 増殖した大腸菌からアルカリ- SDS 法でプラスミ ドを分離精製し、 T7 promoterフ フ ィマ1 ~と BigDyeR Terminator v3. 1 し ycle sequencing Kit (Appl ied Biosystems)を用いてシークェンス反応を行い ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer及び 3100 Genetic Analyzer (Appl ied Biosystems) で塩 酉己 列を解析した。 この解析結果から分離精製した不凍タンパク質 Z - 1と高い相同性 を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列群が 500bpの cDNAに含まれているこ とが確認された。 そこで、 この 500bpの cDNAを鎳型にリンカ一配列及ぴ poly A 配 歹 IJにァニールするプライマーを用いて Ex Taq™ (TaKaRa)で PCR (polymerase chain reaction)を行い、 不凍タンパク質をコードする塩基配列全長を増幅した。 これら PCR産物を pGEMR- T Easy (Promega)にクローニングし、 遺伝子断片の配列を 前述の方法で解析した。 得られる不凍タンパク質 Z - 1の塩基配列は配列表の配列 番号 1に示すとおりである。 When a part of the constructed cDNA library was electrophoresed on 0.8% agarose, a gene fragment of 500 bp was mainly confirmed. Therefore, a degenerate primer was designed based on the amino acid sequence determined by the protein sequencer. Using this primer and a primer complementary to the polyA sequence, a 500 bp cDNA was transformed into a type II Ex Taq ™ (TaKaRa) CR (polymerase chain reaction) was performed. The PCR product was cloned into pGEM R -T Easy (Promega), and E. coli was transformed with this plasmid. The transformant is spread on an LB agar medium containing 100 / ig / ml ampicillin, and any colony formed is inoculated into an LB liquid medium containing 100 μg / ml ampicillin, and shaken at 37 ° C. Culture was continued. Plasmid is separated and purified from the grown E. coli by the alkali-SDS method, and the sequence reaction is performed using the T7 promoter polymer 1 ~ and BigDye R Terminator v3.1 and the ycle sequencing Kit (Applied Biosystems), and the ABI PRISM ™ The salt line was analyzed using 310 Genetic Analyzer and 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). From this analysis result, it was confirmed that the base sequence group encoding the amino acid sequence having high homology with the antifreeze protein Z-1 separated and purified was included in the 500 bp cDNA. Therefore, PCR (polymerase chain reaction) was performed on this 500 bp cDNA with Ex Taq ™ (TaKaRa) using primers that anneal to the linker sequence and poly A system IJ to form 鎳, and bases encoding the antifreeze protein The entire sequence was amplified. These PCR products pGEM R - was cloned into T Easy (Promega), was sequenced gene fragment in the manner described above. The nucleotide sequence of the obtained antifreeze protein Z-1 is as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
ナガガジ由来の残り 9種類の新規な A F P - Z - 2〜Z - 10のアミノ酸配列を上 記と同様な方法により調製し、 それらの遺伝子の C D S領域の塩基配列を上記と 同様の方法により決定した。 新規な A F P - Z - 2〜Z - 10のアミノ酸配列は配列 表の配列番号 4, 6, 8， 10， 12， 14, 16， 18及ぴ 20に、 塩基配列は配列番号 3，5, 7， 9, 11, 13， 15， 17及ぴ 19に示す。 これらの塩基配列は、 既に塩基配列が明ら かにされているマクロゾアルケルスァメリカヌス由来のタイプ III型不凍タンパ ク質と約 7 5〜 9 0 %の相同性を示した。 このようにして、 ナガガジ由来のタイ プ III型の新規新規な A F P - Z - 2〜 Z -10が得られた。 The amino acid sequences of the remaining nine new AFP-Z-2 to Z-10 derived from Nagaagaji were prepared by the same method as described above, and the nucleotide sequences of the CDS regions of those genes were determined by the same method as described above. . The amino acid sequences of the new AFP-Z-2 to Z-10 are shown in SEQ ID NOS: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 and 20 in the sequence table, and the nucleotide sequences are SEQ ID NOs: 3, 5, 7 , 9, 11, 13, 15, 17 and 19. These nucleotide sequences are the type III antifreeze proteins derived from Macrozoarques americanus whose nucleotide sequences have already been identified. It showed about 75-90% homology with the protein. In this way, new type AFP-Z-2 to Z-10 of type III derived from Nagaji were obtained.
(実施例 2 )  (Example 2)
( 1 ) シチロウゥォ AF P- B-1のアミノ酸配列決定  (1) Amino acid sequence determination of Shichirouwo AF P-B-1
実施例 1のナガガジ A F Pの精製と同様の精製法により、 シチロウゥォのすり 身 40mlから T0S0H HPLC システムと TSK - GEL 0DS - 80TS (4.6mm (ID) x 15. Ocm(L)、 TOSOH) を用いて AF Pを高純度に精製した後、 不凍活性を確認し （図 2参照） 、 その凍結乾燥したサンプルを用いてアミノ酸配列の決定を行った。 乾燥状態のサ ンプルを酢酸に溶解し、 ポリプレン処理したカートリッジフィルターに添加した。 Applied Biosystems 社製 491プロテインシークェンサ一でエドマン分解し、 N末 端側から順次アミノ酸配列を決定した。 この結果、 AF P- B- 1のアミノ酸配列 は配列表の配列番号 2 2に示すとおりである。  According to the same purification method as that of Nagagaji AFP purification in Example 1, 40 ml of Shirochio surimi was used with T0S0H HPLC system and TSK-GEL 0DS-80TS (4.6 mm (ID) x 15.Ocm (L), TOSOH). After AFP was purified to high purity, the antifreeze activity was confirmed (see Fig. 2), and the amino acid sequence was determined using the lyophilized sample. The dried sample was dissolved in acetic acid and added to a polypropylene-treated cartridge filter. Edman degradation was performed using Applied Biosystems' 491 protein sequencer, and the amino acid sequence was determined sequentially from the N-terminal side. As a result, the amino acid sequence of AFP-B-1 is as shown in SEQ ID NO: 22 in the sequence listing.
( 2) 全 RNAの単離  (2) Isolation of total RNA
全 RNAの単離の基本的な操作はプロ トコール集 ( "RNeasyR Protect and RNAlater™ Handbook" 及び RNeasyR Mini Handbook" (QIAGEN) ) に従った。 ま た、 サンプルとする各種魚類の肝臓は不凍タンパク質の発現量が増大している厳 寒期に生魚から採取した。 採取した：！〜 2gの肝臓を 5mm角に裁断して 10倍量の RNAlater (QIAGEN)中に保存した。 この肝臓サンプル 60mgを液体窒素中で粉断し 30mgずつ Buffer RLT 600 1にけん濁した後、 QIAshredder (QIAGEN) でさらに粉 砕した。 遠心により回収した上清に等量の 70%エタノールを加え、 スピンカラム を通すことで RNAをカラムに吸着させた。 Buffer RW1、 Buffer RPEでカラムを洗 浄後、 RNaseフリー水 30 μ 1でそれぞれ RNAを溶出した。 The basic procedure for isolation of total RNA was in accordance with the protocol collection ("RNeasy R Protect and RNAlater ™ Handbook" and RNeasy R Mini Handbook "(QIAGEN)). Collected from live fish during the extremely cold season when the expression of frozen protein is increased .. Collected:! ~ 2 g of liver was cut into 5 mm squares and stored in 10 times the amount of RNAlater (QIAGEN). 60 mg was shredded in liquid nitrogen, suspended 30 mg each in Buffer RLT 600 1. After further grinding with QIAshredder (QIAGEN), an equal volume of 70% ethanol was added to the supernatant collected by centrifugation, and the spin column was added. The column was washed with Buffer RW1 and Buffer RPE, and the RNA was eluted with 30 μl of RNase-free water.
( 3 ) mRNAの単離  (3) mRNA isolation
mRNAの単離は 01igotex™_dT30 <Super> mRNA Purification kit (TaKaRa) を 用いて行い、 操作は添付されているプロ トコールに従った。 1, 1 g/ 1の total RNA 溶液 150 1に対し 2xBinding Buffer 150 μ 1, Oligotex™- dT30 <Super> 15 1を加え 70°Cで 3分間加熱した後、 室温で 10分間放置した。 遠心操作にて 01igotex™-dT30 <Super>を回収後、 Wash Bufferにけん濁しス ピンカラムで ◦ligotex- dT30 く Super>を洗浄した。 Oligotex™- dT30 く Super こ吸着した mRNAを 70°Cで加熱しておいた RNaseフリ一水 40 1で溶出した。 ( 4 ) cDNAライブラリーの構築 mRNA was isolated using 01igotex ™ _dT30 <Super> mRNA Purification kit (TaKaRa), and the operation was performed according to the attached protocol. 2x Binding Buffer 150 µl, Oligotex ™ -dT30 <Super> 151 was added to 1.1 g / 1 total RNA solution 150 1, and the mixture was heated at 70 ° C for 3 minutes and then left at room temperature for 10 minutes. After recovering 01igotex ™ -dT30 <Super> by centrifugation, the suspension was suspended in Wash Buffer, and ligotex-dT30 Super> was washed with a spin column. Oligotex ™ -dT30 and Super mRNA The adsorbed mRNA was eluted with RNase free water 401 heated at 70 ° C. (4) Construction of cDNA library
cDNAライプラリーの構築は ZAP - cDNA Synthesis Kit (STRATAGENER) で行った, 基本的操作は "cDNA Synthesis Kit, ZAP- cDNAR Synthesis Kit, and ZAP- cDNAR GigapackR III Gold Cloning Kit INSTRUCTION MANUAL" (STRATAGENER) に従つ た。 上述のように回収した mRNAを铸型としメチル化された dCTPを含む dNTP (dATP dCTP、 dGTP、 dTTP) 基質として用い StrataScript RTaseを加え、 42°C 1時間反 応を行うことで first- strand cDNA を逆転写合成した。 次に RNase H、 DNA polymerase, dNTP をカロえ、 16。C 2. 5時間反応を行レヽ、 second - strand cDNAを合 成した。 Pfu DNA polymerase で cDNA の末端を平滑化した後、 T4 DNA ligase でアダプター配列を結合した。 The cDNA library was constructed using the ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE R ). The basic procedure was "cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA R Synthesis Kit, and ZAP-cDNA R Gigapack R III Gold Cloning Kit INSTRUCTION MANUAL" R ). Using the mRNA collected as described above as a substrate for dNTP (dATP dCTP, dGTP, dTTP) containing methylated dCTP, add StrataScript RTase and react at 42 ° C for 1 hour to perform first-strand cDNA. Was reverse transcribed and synthesized. Next, RNase H, DNA polymerase, and dNTPs were added. C2. The reaction was performed for 5 hours, and second-strand cDNA was synthesized. After blunting the ends of the cDNA with Pfu DNA polymerase, the adapter sequence was ligated with T4 DNA ligase.
( 5 ) 塩基配列の決定  (5) Determination of base sequence
プロテインシークェンサ一により決定されたアミノ酸配列を元に縮重プライマ 一を設計し、 このプライマーと poly A配列に相補的なプライマーを用いて cDNA を錄型に Ex Taq™ (TaKaRa) で PCR (polymerase chain reaction) を行った ( PCR産物を pGEMR- T Easy (Promega) にクローニングし、 このプラスミ ドで大腸 菌を形質転換した。 形質転換体を 100 z g/ml アンピシリン含有 LB寒天培地上に広 げ、 形成された任意のコロニーを lOO /z g/ml アンピシリン含有 LB液体培地に植菌 し、 37°Cで一晩大腸菌を振とう培養した。 増殖した大腸菌からアルカリ- SDS 法 でプラスミ ドを分離精製し、 T7 promoter プライマーと BigDyeR Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) を用レヽてシークェンス反応 を行い ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer 及ぴ 3100 Genetic Analyzer (Appl ied Biosystems) で塩基配列を解析した。 この解析結果から不凍タンパク 質の C末端をコードする塩基配列を決定し、 この配列に相補的なプライマーとリ ンカー配列にァニールするプライマーを用いて cDNA を錶型に Ex Taq™ (TaKaRa) で PCR (polymerase chain reaction) を行 ヽ、 不凍タンノ ク質を =r一 ドする塩基配列全長を増幅した。 この PCR産物を pGEMR- T Easy (Promega) にク ローニングし、 遺伝子断片の配列を前述の方法で解析した。 この結果、 シチロウ ゥォ由来のの A F P -B-1の塩基配列は配列番号 21に示すとおりである。 シチロゥ ゥォ由来のの A F P - B - 1の塩基配列は配列が明らかにされているリプテルス ァ メリ 7ヌス 、sea raven (Hemitripterus americanus) ) 由来のタイプ丄 I型不凍 タンパク質と約 6 3 %の相同性を示した。 このようにして、 タイプ II型の不凍タ ンパク質がシチロウゥォのすり身から分離、 精製された。 A degenerate primer is designed based on the amino acid sequence determined by the protein sequencer. Using this primer and a primer complementary to the poly A sequence, the cDNA is transformed into Ex-q type by PCR using Ex Taq ™ (TaKaRa). (PCR product was cloned into pGEM R -T Easy (Promega), and E. coli was transformed with this plasmid. The transformant was spread on LB agar medium containing 100 zg / ml ampicillin. The resulting colonies were inoculated into an LB liquid medium containing lOO / zg / ml ampicillin, and cultured by shaking E. coli overnight at 37 ° C. Plasmids were separated from the grown E. coli by alkaline-SDS method purified, base sequence at T7 promoter a promoter primer and BigDye R Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit performs Sequence reaction Te use Rere a (Applied Biosystems) ABI PRISM ™ 310 Genetic Analyzer及Pi 3100 Genetic Analyzer (Appl ied Biosystems) The nucleotide sequence encoding the C-terminus of the antifreeze protein was determined from the results of this analysis, and the cDNA was transformed into a type II Ex Taq ™ using a primer complementary to this sequence and a primer that anneals to the linker sequence. (TaKaRa) was used to carry out PCR (polymerase chain reaction) to amplify the full length base sequence that would block the antifreeze protein.The PCR product was cloned into pGEM R -T Easy (Promega) and the gene was cloned. The sequence of the fragment was analyzed by the method described above, and as a result, the nucleotide sequence of AFP-B-1 derived from Ciceropodium is as shown in SEQ ID NO: 21. The nucleotide sequence is a type II antifreeze from Lipterus americanus (Semi rter (Hemitripterus americanus)) whose sequence has been determined. It showed about 63% homology with the protein. In this way, the type II antifreeze protein was separated and purified from the surimi of Sicily.
本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及ぴ特許出願をそのまま参考として 本明細書中に取り入れるものとする。 産業上の利用の可能性  All publications, patents and patent applications cited in the present specification are incorporated herein by reference as they are. Industrial potential
本発明により日本近海で漁獲される魚であって、 通常廃棄されているナガガシ 或いはシチロウゥォから 1 1種類の新規な不凍タンパク質を採取し、 これらのァ ミノ酸配列及び塩基配列を決定した。 また、 得られる遺伝子を用いて遺伝子工学 的手法により前記不凍タンパク質を多量に生産することを可能とした。  According to the present invention, 11 types of novel antifreeze proteins were collected from Nagasaki or Shichirouho fish, which are fish caught in the waters near Japan, and their amino acid sequences and nucleotide sequences were determined. Further, it has become possible to produce the antifreeze protein in a large amount by a genetic engineering technique using the obtained gene.
これら不凍タンパク質は、 前述のとおり、 例えばアイスクリーム、 冷凍食品等 における氷晶の成長による食味劣化、 組織破壊を防止し、 また、 氷スラリーを使 用する冷熱供給システムあるいは冷熱蓄熱等において、 氷の再結晶による配管系 の閉塞を解消し得る有効な添加剤として期待されているものである。 さらに卵子 や精子、 移植臓器等の低温長期保存冷凍保存においても有望な物質である。  As described above, these antifreeze proteins can prevent the deterioration of taste and tissue destruction due to the growth of ice crystals in ice cream and frozen foods, for example, and can also prevent the use of ice in a cold heat supply system or cold heat storage using ice slurry. It is expected to be an effective additive that can eliminate the clogging of the piping system due to recrystallization. It is also a promising substance for long-term low-temperature storage of eggs, spermatozoa, and transplanted organs.

Claims

請 求 の 範 囲 The scope of the claims
1 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-l 1. Antifreeze protein Z-l represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
2 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 2  2. Antifreeze protein Z-2 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
3 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 3  3. Antifreeze protein Z-3 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(b) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸' が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
4 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-4  4. Antifreeze protein Z-4 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8;
(b) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
5 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 5  5. Antifreeze protein Z-5 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(b) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
6 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-6  6. Antifreeze protein Z-6 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(b) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。 (b) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12; A protein consisting of an amino acid sequence in which an acid has been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function.
7 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 7  7. Antifreeze protein Z-7 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(b) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
8 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-8  8. Antifreeze protein Z-8 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(b) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and which has an antifreeze function;
9 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 9  9. Antifreeze protein Z-9 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18;
(b) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 0 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 10  10. Antifreeze protein Z-10 expressed by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20;
(b) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 1 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 B-1  1 1. Antifreeze protein B-1 represented by the following (a) or (b)
(a) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  (a) a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22;
(b) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 2 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 1をコードする D N A (a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  12. A DNA encoding the antifreeze protein Z-1 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
(b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。 (b) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or more amino acids; A protein consisting of an amino acid sequence in which an acid has been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function.
1 3. 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 2をコードする DNA (a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  1 3. DNA encoding antifreeze protein Z-2 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4;
(b) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
14. 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 3をコードする DNA (a) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  14. DNA encoding antifreeze protein Z-3 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6;
(b) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 5. 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-4をコードする DNA (a) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  1 5. DNA encoding antifreeze protein Z-4 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8;
(b) 配列番号 8で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のアミノ酸 が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有す るタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 6. 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 5をコードする DNA (a) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  1 6. DNA encoding antifreeze protein Z-5 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10;
(b) 配列番号 10で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 7. 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z_6をコードする DNA (a) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  1 7. DNA encoding antifreeze protein Z_6 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12;
(b) 配列番号 12で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
1 8. 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 7をコードする DNA (a) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  1 8. DNA encoding antifreeze protein Z-7 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14;
(b) 配列番号 14で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。 (b) one or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; A protein consisting of an amino acid sequence in which an acid has been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function.
1 9 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z - 8をコードする D N A (a) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  1 9. DNA encoding antifreeze protein Z-8 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16;
(b) 配列番号 16で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 16 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and which has an antifreeze function;
2 0 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z- 9をコードする D N A (a) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  20. A DNA encoding the antifreeze protein Z-9 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18;
(b) 配列番号 18で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
2 1 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 Z-10をコードする D N A (a) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  21. A DNA encoding the antifreeze protein Z-10 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20;
(b) 配列番号 20で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 20 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
2 2 . 次の （a) または （b) で表される不凍タンパク質 B-1をコードする D N A (a) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質。  22. DNA encoding antifreeze protein B-1 represented by the following (a) or (b): (a) a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22;
(b) 配列番号 22で表されるアミノ酸配列において、 1若しくは複数個のァミノ 酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ、 不凍機能を有 するタンパク質。  (b) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 22 with one or more amino acids deleted, substituted or added, and having an antifreeze function;
2 3 . 配列番号 1， 3， 5， 7, 9， 11， 13， 15， 17， 19，又は 21で表される塩基配列であって、 それぞれ不凍タンパク質 Z- 1、 Z- 2、 Z- 3、 Z- 4、 Z- 5、 1 -ら、 Z-7、 Z- 8、 Z- 9、 Z-10 又は B-1をコードする D N A。  2 3. A nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, or 21, and the antifreeze proteins Z-1, Z-2, Z -DNA encoding 3, Z-4, Z-5, 1-, Z-7, Z-8, Z-9, Z-10 or B-1.
2 4 . 請求の範囲第 12項〜第 23項のいずれか 1項に記載の DNAを含む組換えべク タ一。  24. A recombinant vector containing the DNA according to any one of claims 12 to 23.
2 5 . 組換えベクターが発現ベクターである請求の範囲第 24項に記載の組換えべ クタ一。  25. The recombinant vector according to claim 24, wherein the recombinant vector is an expression vector.
2 6 . 宿主生物を請求の範囲第 25項に記載の組換えベクターによって形質転換し た形質転換体。 26. A host organism is transformed with the recombinant vector according to claim 25. Transformants.
2 7 . 宿主生物が大腸菌である請求の範囲第 26項に記載の形質転換体。  27. The transformant according to claim 26, wherein the host organism is Escherichia coli.
2 8 . 請求の範囲第 27項に記載の形質転換体を培地中で培養して不凍タンパク質 を産生せしめ、 該タンパク質を採取することを特徴とする不凍タンパク質の製造 方法。  28. A method for producing an antifreeze protein, comprising culturing the transformant according to claim 27 in a medium to produce an antifreeze protein, and collecting the protein.
2 9 . 請求の範囲第 1項〜第 11項のいずれか 1項に記載のタンパク質をペプチド 合成機により化学的に合成することを特徴とするタンパク質の製造方法。  29. A method for producing a protein, characterized by chemically synthesizing the protein according to any one of claims 1 to 11 using a peptide synthesizer.
3 0 . 請求の範囲第 1項〜第 11項のいずれか 1項に記載のタンパク質を有効成分 として含むことを特徴とする凍結濃縮阻害剤。  30. A freeze-concentration inhibitor comprising the protein according to any one of claims 1 to 11 as an active ingredient.
3 1 . 請求の範囲第 1項〜第 11項のいずれか 1項に記載のタンパク質を有効成分 として含むことを特徴とする凝固点降下剤。  31. A freezing-point depressant comprising the protein according to any one of claims 1 to 11 as an active ingredient.
3 2 . 請求の範囲第 1項〜第 11項のいずれか 1項に記載のタンパク質を含むこと を特徴とする氷スラリー。  32. An ice slurry comprising the protein according to any one of claims 1 to 11.
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