WO2004097377A1 - Procede de preparation d'un reactif de coloration de cellules et reactif obtenu - Google Patents
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Classifications
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Definitions
- the present invention relates to a process for the preparation of a cell staining reagent, in particular for blood and marrow, as well as the reagent obtained.
- These dyes are in the form of two compounds with a known and generally applied composition: - May-Gr ⁇ nwald produced from methylene blue eosin powder with
- the practitioner soaks a slide carrying the cells to be observed in the first solution and then in the reagent diluted with buffered water, generally 1/2.
- the blade is in turn soaked in the second solution, generally diluted between 1/20 and 1/30 with buffered water, then rinsed and dried.
- the aim sought in good coloring is the differentiation of all cellular elements, in particular eosinophilic, basophilic, neutrophilic, nucleus, cytoplasmic granulations.
- cytoplasms which are among the elements whose colors are the least nuanced.
- the red cells appear in gray-beige color instead of a light red, which makes the contrasts less clear, in particular for the detection of parasites, but also less clear vis-à-vis other cell types.
- improving the stability of the solution is an objective of the composition according to the present invention. It is important that decantation does not occur with the reagent according to the present invention when such deposits could appear in the products of the prior art.
- the manufacture of the reagent of the prior art is also generally carried out at temperature, to ensure satisfactory dilution, of the order of 40 ° C.
- This reagent of the prior art also has other drawbacks during manufacture, and in particular that of making final filtration difficult.
- the glycerine can cause clogging of the filters during this operation.
- the presence of glycerin also makes rinsing the slides more difficult.
- FIG. 1A an image of red blood cells with the dyes of the prior art
- FIG. 1B an image of neutrophilic granulations with the dyes of the prior art
- FIG. 1C an image of lymphocyte nuclei with the dyes of the prior art
- FIG. 1D an image of lymphocyte cytoplasms with the dyes of the prior art
- FIG. 1E an image of monocyte cytoplasms with the dyes of the prior art
- FIG. IF an image of eosinophilic polynuclear granulations with the dyes of the prior art
- FIG. IG an image of basophilic polynuclear granulations with the dyes of the prior art
- FIG. 2A an image of red blood cells with the dye according to the present invention
- FIG. 2B an image of neutrophilic granulations with the dye according to the present invention
- FIG. 2C an image of lymphocyte nuclei with the dye according to the present invention
- FIG. 2E an image of monocyte cytoplasms with the dye according to the present invention
- FIG. 2F an image of eosinophilic polynuclear granulations with the dye according to the present invention
- FIG. 2G an image of basophilic polynuclear granulations with the dye according to the present invention.
- the reagent according to the present invention uses as coloring compounds in the blues: Azur I, optionally in addition to methylene blue, and in the reds: eosin, optionally in addition erythrosine.
- the process consists in diluting the powders of each of the blue and red colors in the same volume of solvent, in this case DMSO, dimethylsulfoxide.
- solvent in this case DMSO, dimethylsulfoxide.
- the quantities are given to be diluted in an amount of 62.5 ml of
- composition is prepared in blue with Azur I dosed between 0.400 g and
- 1,500 g more particularly between 0,500 g and 1,000 g
- composition is prepared in red with eosin, the dosage of which is between 0.0100 and 0.1000 g, more particularly 0.0300 and 0.0800 g.
- composition includes erythrosine, disodium salt of tetraiodofluorescein, it is at the rate of 0.0100 to 0.1000 g, more particularly at the rate of 0.05 and 0.08 g.
- erythrosine is added, it is diluted with the same solvent.
- each of these two compositions is then diluted in a volume of methanol in an amount sufficient to produce a volume of a single composition of 500 ml of reagent. It is found that this reagent allows excellent dissolution because there is no phase with glycerine and also leads to excellent stability.
- the composition can be used as and when required for analysis on a large time range without requiring mixing immediately before each use as in the prior art.
- this reagent generally consists of immersing a slide carrying cells in the pure reagent then placing it in reagent diluted with buffered water, rinsing and drying it to allow observation.
- the comparative results which are grouped in the following table show the variations of the different parameters, this for the same cell samples and under the same conditions of analysis and interpretation. Results obtained with MGG prior art reagents
- the measurements are carried out on substantially identical areas.
- the slides carrying the cells as used are produced identically and also used under the same temperature and lighting conditions to allow an objective comparison. Results obtained with the reagent according to the present invention
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Abstract
L'objet de l'invention est un procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, caractérisé en ce que en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - préparer une première composition en diluant au moins un colorant bleu, l'azur I, dans du diméthylsulfoxide - préparer une seconde composition en diluant au moins un colorant rouge, l'éosine dans le même solvant, que celui de la première composition, du diméthylsulfoxide, et - associer ces deux compositions dans du méthanol pour obtenir un réactif unique.
Description
PROCEDE DE PREPARATION D'UN REACTIF DE COLORATION DE CELLULES ET REACTIF OBTENU
La présente invention concerne un procédé de préparation d' un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle ainsi que le réactif obtenu.
On sait que l'observation au microscope nécessite une coloration qui permet de différencier les différentes cellules ou parties de cellules.
Depuis de très nombreuses années, des réactif s sont utilisés de façon continue et commercialisés sans qu' ils aient été modifiés, ce sont les réactifs connus sous les noms de MGG, May-6rϋnwald Gie sa.
De fait, l'analyse devenant de plus en plus pointue, les spécialistes de l' interprétation souhaitent disposer de colorants plus performants en terme de définition, de contraste et de différentiation, plus faciles à utiliser et plus stables.
Ces colorants se présentent sous forme de deux composés avec une composition connue et généralement appliquée : - May-Grϋnwald réalisé à partir de poudre de bleu de méthylène-éosine à
0,30 g dilués dans 100 g de methanol, et - ôiemsa réalisé à partir de poudres de bleu Azur II-éosine 3,0 g et d' Azur II 0,8 g dilué dans 375 g de methanol avec 125 g de glycérine.
Afin de réaliser une analyse, le praticien procède à un trempé d'une lame portant les cellules à observer dans la première solution puis dans le réactif dilué avec de l'eau tamponnée, généralement au 1/2. La lame est à son tour trempée dans la
seconde solution, généralement diluée entre 1/20 et 1/30 avec de l'eau tamponnée, puis rincée et séchée.
On constate qu' il est nécessaire de réaliser deux opérations, ce qui prend du temps et nécessite une certaine application. Quant à la solution diluée avec de eau tamponée, elle reste instable et doit être utilisée rapidement.
On sait aussi que le methanol est un produit dont il est souhaitable de diminuer les quantités utilisées.
On obtient alors des colorations connues de tous les praticiens qui font que ce colorant ΛΛG6 est devenu un standard , ceci afin de permettre des comparaisons.
Il est nécessaire de conserver cette reproductibilité et d'établir un standard.
Néanmoins, il est nécessaire de le faire évoluer afin d'améliorer la praticité mais aussi les performances, ce qui n'a jamais été réalisé.
Le but recherché dans une bonne coloration est la différentiation de tous les éléments cellulaires, notamment granulations éosinophiles, basophiles, neutrophiles, noyaux, cytoplasmes.
Il s'agit aussi d'obtenir le meilleur contraste entre les globules blancs, les globules rouges et les plaquettes afin de faciliter la lecture de la lame.
Il est important qu' il ne persiste pas de dépôts de colorants après le rinçage de la lame.
Ce sont les cytoplasmes qui sont parmi les éléments dont les couleurs sont les moins nuancées. Or, il serait souhaitable de disposer d'une forte différenciation entre les divers types de cytoplasmes de façon à mettre en avant leurs structures. De même, avec le colorant M6G, les hématies apparaissent en couleur gris-beige au lieu d'un rouge clair, ce qui rend les contrastes moins nets, notamment pour la détection de parasites, mais aussi moins nets vis-à-vis des autres types cellulaires.
De plus, l'amélioration de la stabilité de la solution est un objectif de la composition selon la présente invention. Il est important qu' il ne se produise pas de décantation avec le réactif selon la présente invention alors que de tels dépôts pouvaient apparaître dans les produits de l'art antérieur. La fabrication du réactif de l'art antérieur est de plus réalisée généralement en température, pour assurer une dilution satisfaisante, de l'ordre de 40°C. Ce réactif de l'art antérieur présente aussi d'autres inconvénients lors de la fabrication et notamment celui de rendre difficile la filtration finale. La glycérine peut engendrer des colmatages des filtres lors de cette opération. La présence de glycérine rend également plus difficiles les rinçages des lames. Enfin, il convient d'obtenir toujours une même coloration pour les mêmes éléments afin de pouvoir réaliser des comparaisons d' images réalisées à partir de lames colorées. La reproductibilité est essentielle, notamment pour des comparaisons à distance ou par envoi d' images. Des documents connus permettent d' illustrer l'art antérieur et notamment le brevet US qui décrit un réactif du type Giemsa comprenant deux compositions, l'une à partir d'Azur B et l'autre à partir de l'éosine qui sont mélangées au dernier moment. En effet, le mélange ne pouvant pas être stable, il faut le préparer à chaque usage. Ce problème de stabilité inhérent aux composés retenus Azur B, Eosine, Bleu de Méthylène se retrouve dans le brevet US 4 382 075 qui recourt à un additif de stabilisation, en Y occurrence une combinaison complexe d'une première aminé et d'une seconde aminés. Ces documents mettent en exergue le problème soulevé en préambule avec ces type de compositions de coloration de cellules sans apporter de réponse simple et industrielle comme celle proposée par le procédé et le réactif selon la présente invention.
Le procédé et le réactif selon la présente invention sont maintenant décrits et les images annexées permettent de récapituler les résultats montrant les améliorations des paramètres significatifs.
Ainsi, sur les dessins annexés les différentes figures montrent: - figure 1A : une image d'hématies avec les colorants de l'art antérieur,
- figure IB : une image de granulations neutrophiles avec les colorants de l'art antérieur,
- figure 1C : une image de noyaux lymphocytes avec les colorants de l'art antérieur, - figure 1D : une image de cytoplasmes lymphocytes avec les colorants de l'art antérieur,
- figure 1E : une image de cytoplasmes monocytes avec les colorants de l'art antérieur,
- figure IF : une image de granulations polynucléaires éosinophiles avec les colorants de l'art antérieur,
- figure IG : une image de granulations polynucléaires basophiles avec les colorants de l'art antérieur,
- figure 2A : une image d'hématies avec le colorant selon la présente invention , - figure 2B : une image de granulations neutrophiles avec le colorant selon la présente invention ,
- figure 2C : une image de noyaux lymphocytes avec le colorant selon la présente invention ,
- figures 2D '• une image de cytoplasmes lymphocytes avec le colorant selon la présente invention ,
- figure 2E : une image de cytoplasmes monocytes avec le colorant selon la présente invention ,
figure 2F : une image de granulations polynucléaires éosinophiles avec le colorant selon la présente invention, et
- figure 2G : une image de granulations polynucléaires basophiles avec le colorant selon la présente invention. Le réactif selon la présente invention utilise comme composés colorants dans les bleus : l'Azur I, éventuellement en plus le bleu de méthylène, et dans les rouges : l'éosine, éventuellement en plus l'érythrosine.
Le procédé consiste à diluer les poudres de chacune des couleurs bleu et rouge dans un même volume de solvant, en l'occurrence le DMSO, diméthylsulfoxide. Les quantités sont données pour être diluées dans une quantité de 62,5 ml de
DMSO pour chacune des couleurs.
On prépare la composition dans le bleu avec de l'Azur I dosé entre 0,400 g et
1,500 g, plus particulièrement entre 0,500 g et 1,000 g
Si du bleu de méthylène est ajouté, il est dosé dans la même plage avec le même solvant.
On prépare la composition dans le rouge avec de l'éosine, dont le dosage est compris entre 0,0100 et 0,1000 g, plus particulièrement 0,0300 et 0,0800 g.
Si la composition intègre de l'érythrosine, sel disodique de tétraiodofluorescéine, elle l'est à raison de 0,0100 à 0,1000 g, plus particulièrement à raison de 0,05 et 0,08 g.
Si de l'érythrosine est ajoutée, elle est diluée avec le même solvant.
Selon le procédé, chacune de ces deux compositions est diluée ensuite dans un volume de methanol en quantité suffisante pour réaliser un volume d'une composition unique de 500 ml de réactif. On constate que ce réactif permet une excellente dissolution car il n'y a pas de phase avec glycérine et conduit également à une excellente stabilité. La composition peut être utilisée au fur et à mesure des besoins en analyse sur une
plage de temps importante sans nécessiter de mélange immédiatement avant chaque usage comme dans l'art antérieur.
La dissolution de chacun des composés ne pose pas de problème car elle ne génère pas de complexes. Elle se déroule à température ambiante sans nécessiter de mise en température même faible.
On peut donc ainsi réaliser différents produits issus de ce même procédé en utilisant les différents composés dans les plages indiquées notamment à savoir :
Azur I / eosine / DMSO / methanol Azur I - bleu de méthylène / eosine / DMSO / methanol
Azur I - bleu de méthylène / eosine - érythrosine / DMSO / methanol
Azur I / eosine - érythrosine / DMSO / methanol.
Selon un perfectionnement de l' invention, on ajoute une quantité comprise entre
0,05 et 1,000 g pour un volume final de réactif de 500 ml d'un composé appartenant à la famille des thiamines, différent de l'azur I ou du bleu de méthylène, pour augmenter le contraste notamment.
La mise en oeuvre de ce réactif consiste généralement à immerger une lame portant des cellules dans le réactif pur puis à la placer dans du réactif dilué avec de l'eau tamponnée, à la rincer et à la sécher pour en permettre l'observation. Les résultats comparatifs qui sont regroupés dans le tableau suivant montrent les variations des différents paramètres, ceci pour des mêmes échantillons cellulaires et dans des mêmes conditions d'analyse et d' interprétation.
Résultats obtenus avec les réactifs de l'art antérieur MGG
Les mesures sont effectuées sur des zones sensiblement identiques.
Quant au maximum de chaque courbe, il correspond à l' intensité donc à la saturation de la couleur.
Les lames portant les cellules telles qu' utilisées sont réalisées de façon identique et utilisées également dans les mêmes conditions de température et d'éclairage pour permettre une comparaison objective.
Résultats obtenus avec le réactif selon la présente invention
On montre bien là une augmentation des différenciations colorées. On note particulièrement que lorsqu' il y a des polynucléaires basophiles, ils sont de couleur violet foncé, presque noire avec une très bonne définition. De même, la couleur des hématies est rouge clair et non plus beige rose. Le bleu azur des cytoplasmes des lymphocytes est particulièrement discriminant.
Claims
1. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, caractérisé en ce que en ce qu' il comprend les étapes suivantes :
- préparer une première composition en diluant au moins un colorant bleu, l'azur I dans du diméthylsulfoxide,
- préparer une seconde composition en diluant au moins un colorant rouge, l'éosine dans le même solvant que celui de la première composition, du diméthylsulfoide, et
- associer ces deux compositions dans du methanol pour obtenir un réactif unique.
2. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon la revendication 1, caractérisé en ce qu' il consiste à ajouter à la première préparation un second colorant bleu, le bleu de méthylène.
3. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu' il consiste à ajouter à la première préparation un second colorant rouge, l'érythrosine.
4. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon les revendications 2 et 3 , caractérisé en ce que le solvant du second colorant bleu et du second colorant rouge est le diméthylsulfoxide.
5. Procédé de préparation d'un réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'on ajoute au réactif un composé de la famille des thiamines, différent de l'azur I et du bleu de méthylène.
6. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu' il comprend :
- au moins de 0,400 à 1,500 g d'azur I, dilué dans du diméthylsulfoxide, et
- au moins de 0,010 à 0,100 g d'éosine, dilué dans du diméthylsulfoxide, cette composition étant diluée dans le methanol pour une quantité finale de réactif de 500 ml.
7. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon la revendication 6, caractérisé en ce qu' il comprend
- au moins de 0,500 à 1,000 g d'azur I, dilué dans du diméthylsulfoxide et - de 0,030 à 0,080 g d' éosine, dilué dans du diméthylsulfoxide, cette composition étant diluée dans le methanol pour une quantité finale de réactif de 500 ml.
8. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 6 ou 7, caractérisé en ce qu' il comprend :
- de 0,400 à 1,500 g d'azur I, dilué dans du diméthylsulfoxide,
- de 0,400 à 1,500 g de bleu de méthylène, dilué dans du diméthylsulfoxide,
- de 0,010 à 0,100 g d'éosine, dilué dans du diméthylsulfoxide, et - de 0,010 à 1,000 g d' érythrosine, dilué dans du diméthylsulfoxide, cette composition étant diluée dans le methanol pour une quantité finale de réactif de 500 ml.
9. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle, selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend
- de 0,500 à 1,000 g d'azur I, dilué dans du diméthylsulfoxide,
- de 0,500 à 1,000 g de bleu de méthylène, dilué dans du diméthylsulfoxide,
- de 0,030 à 0,080 g d'éosine, dilué dans du diméthylsulfoxide, et
- de 0,050 à 0,080 g d' érythrosine, dilué dans du diméthylsulfoxide, cette composition étant diluée dans du methanol pour une quantité finale de réactif de 500 ml.
10. Réactif de coloration de cellules, notamment pour le sang et la moelle selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend de 0,010 à 1,000 g d'un composé de la famille des thiamines différent de l'azur I ou du bleu de méthylène.
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